ES2663843T3 - Utilización de la proteína olfactomedina-4 (OLFM4) en el diagnóstico del cáncer colorrectal - Google Patents

Abstract

Método para determinar la presencia de una mutación de KRAS en un tumor colorrectal metastásico, comprendiendo dicho método las etapas de: (a) determinar a partir de una muestra biológica de un sujeto que padece un tumor colorrectal metastásico el nivel de expresión de OLFM4, (b) comparar el nivel de expresión obtenido con por lo menos un nivel de expresión de referencia y (c) determinar la presencia de una mutación de KRAS en dicho tumor colorrectal metastásico a partir de dicha comparación.

Description

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de microscopía o histoquímica de células individuales utilizando longitudes de onda de excitación individuales o múltiples y la aplicación de cualquiera de los métodos ópticos adaptados, tales como los métodos electroquímicos (técnicas de voltimetría y amperometría), la microscopía de fuerza atómica y los métodos de radiofrecuencia, por ejemplo la espectroscopía de resonancia multipolar, confocal y no confocal, la detección de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia y birrefringencia o índice refractivo (por ejemplo la resonancia de plasmón superficial, la elipsometría, un método de espejo resonante, un método de guías de onda en acoplador por red de difracción o interferometría), ELISA celular, citometría de flujo, radioisótopos, imágenes de resonancia magnética, análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), HPLC-espectroscopía de masas, cromatografía líquida-espectrometría de masas/espectrometría de masas (CL-EM/EM)). La totalidad de dichas técnicas es bien conocida de la técnica y no necesitan detallarse adicionalmente en la presente memoria. Estas diferentes técnicas pueden utilizarse para medir el total de los niveles de olfactomedina-4 aunque también, tal como resultará evidente para el experto en la materia, las diferentes cantidades de las formas glucosiladas y no glucosiladas. Por ejemplo, las formas glucosiladas y no glucosiladas de la proteína olfactomedina-4 pueden evaluarse basándose en su diferente movilidad electroforética respectiva mediante transferencia western con un anticuerpo que reconoce ambas formas. Se muestra un ejemplo de este tipo de ensayo en los ejemplos experimentales. alternativamente, puede evaluarse mediante ELISA la cantidad total de proteína olfactomedina-4 utilizando un anticuerpo que reconoce ambas formas y la fracción de olfactomedina glucosilada, utilizando un anticuerpo específico para esta forma. Resulta inmediatamente evidente que los niveles de proteína pueden medirse directamente en una muestra de cáncer colorrectal ya que permite al experto en la materia someter a ensayo tanto la forma glucosilada como la forma no glucosilada. Sin embargo, tal como se ha explicado anteriormente en la presente memoria, también resulta evidente que el nivel de proteína olfactomedina-4 secretada puede determinarse alternativamente a partir de una muestra de sangre.

La comparación de los niveles de expresión de los genes medidos en dicha muestra de cáncer colorrectal del paciente se lleva a cabo calculando una proporción de niveles de expresión de nivel de expresión del gen OLFM4 a nivel de expresión de un gen de referencia en dicha muestra de cáncer de colon del paciente y mediante la comparación de la proporción de niveles de expresión obtenida con un valor umbral correspondiente. Dicho gen de referencia es un gen que se expresa en todos los tipos celulares. Más específicamente, el gen de referencia es un gen que se expresa en todas las células que constituyen el colon. En otro aspecto, el nivel de expresión del gen de referencia no resulta afectado por el estado de la célula, es decir, el gen de control se expresa al mismo nivel en una célula sana y en una célula tumoral. En un ejemplo específico, el gen de referencia es un gen de mantenimiento. Un gen de mantenimiento es un gen expresado en todos los tipos celulares, que proporciona una función básica necesaria para el sostenimiento de todos los tipos celulares. Puede encontrarse una lista de los genes de mantenimiento humanos en Eisenberg et al. (Trends in Genetics 19:362-365, 2003). Un gen de mantenimiento preferente es un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en B2M, TFRC, YWHAZ, RPLO, 18S, GUSB, UBC, TBP, GAPDH, PPIA, POLR2A, ACTB, PGK1, HPRT1, IPO8 y HMBS.

Tal como se define en la presente memoria, un "valor umbral" pretende referirse a un valor que permite discriminar muestras en las que la proporción de niveles de expresión del gen de interés corresponde a un nivel de expresión de dicho gen de interés en la muestra de cáncer de colon del paciente que es baja o alta. En particular, en el caso de que la proporción de niveles de expresión génica sea inferior o igual al valor umbral, el nivel de expresión de dicho gen en la muestra de cáncer de colon del paciente se considera baja, mientras que en el caso de que la proporción de niveles de expresión génica sea superior al valor umbral, el nivel de expresión de dicho gen en la muestra de cáncer de colon del paciente se considera alta. Para cada gen, y dependiendo del método utilizado para medir el nivel de expresión de los genes, el valor umbral óptimo puede variar. Sin embargo, puede ser fácilmente determinado por el experto en la materia basándose en el análisis de varias muestras de cáncer colorrectal de control en las que el nivel de expresión (bajo o alto) es conocido para dicho gen particular y en la comparación del mismo con la expresión de un gen de control, por ejemplo un gen de mantenimiento.

Se proporciona además una micromatriz dedicada a la implementación de los métodos según la invención, que comprende como máximo 500, preferentemente como máximo 300, como máximo 200, todavía más preferentemente como máximo 150, como máximo 100, todavía más preferentemente como máximo 75, como máximo 50, como máximo 40, como máximo 30, como máximo 20, como máximo 10 sondas diferentes, por lo menos 1 de las cuales se une específicamente al ARNm (o ADNc correspondiente) o proteína de OLFM4.

En un ejemplo particular, dicha micromatriz es una micromatriz de ácidos nucleicos, que comprende como máximo 500, preferentemente como máximo 300, como máximo 200, más preferentemente como máximo 150, como máximo 100, todavía más preferentemente como máximo 75, como máximo 50, como máximo 40, como máximo 30, como máximo 20, como máximo 10 sondas diferentes (excluyendo de esta manera, por ejemplo, las micromatrices pangenómicas), por lo menos 1 de las cuales se hibrida específicamente con el ARNm (o ADNc correspondiente) de OLFM4. Dicha micromatriz puede contener además por lo menos una sonda que se hibrida específicamente con un gen de mantenimiento además de la sonda que se hibrida específicamente con OLFM4. En un ejemplo particular, dicho gen de mantenimiento se selecciona de entre el grupo que consiste en B2M,

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intensa.

Figura 3: OLFM4 se encuentra glucosilado en los tumores KRAS.

A. Se prepararon extractos totales de tejidos normales y tumorales en tampón X. El análisis de transferencia western frente a OLFM4 se llevó a cabo para detectar OLFM4 nativo y glucosilado en tejidos de control, WT y KRAS. B. Análisis de desglucosilación de OLFM4: las células COS-7 secretaron significativamente OLFM4; la forma secretada en 72 kDa se trató con (+) o (-) PNGasa F. El tamaño de OLFM4 desglucosilado concordaba con la masa molecular del producto calculado del gen OLFM4. El tratamiento de la banda de 72 kDa en tumor KRAS conducía a la misma banda en 55 kDa. C. Se calculó la proporción entre las bandas de 72 y 55 kDa para los tejidos normales, los tejidos WT y los tejidos tumorales KRAS. La expresión de OLFM4 glucosilado era significativamente superior en el tumor KRAS que en tejidos normales (p=0,002) y que en tejidos WT (p=0,011).

Figura 4: NF-κB2 regula la expresión de OLFM4 tras la inducción de Ras.

A. Se sometieron o no a tratamiento las líneas celulares colorrectales HT29-H-RasV12 con doxiciclina durante el tiempo indicado; se prepararon extractos de células completas y se analizaron utilizando anticuerpos dirigidos contra Ras, NF-κB2, OLFM4 y HSP70. B. Las células se trataron tal como se ha indicado anteriormente y se evaluaron las expresiones de ARNm de OLFM4 y RPLPO mediante RT-PCR semicuantitativa. C. Representación esquemática de los potenciales sitios de unión de NF-κB del promotor de OLFM4. El marco de lectura del sitio de unión se indica mediante + para 5'-3' y mediante -para 3'-5'. D-E. Se transfectaron líneas celulares colorrectales HCT116 con oligonucleótidos de ARN de interferencia pequeño (ARNip) específico de NF-κB2 o de control tal como se indica. Se procesaron los extractos de ARNm (D) y los extractos de células completas (E) y se analizó la expresión de OLFM4 48 h después de la transfección con ARNip. F. Se preparó la cromatina soluble a partir de células HCT116 en crecimiento y se inmunoprecipitó con anticuerpos dirigidos contra NF-κB2, BcI3 y ARN polimerasa II. Se amplificó el ADN utilizando una pareja de cebadores que cubría el sitio de unión proximal de NF-κB del promotor de OLFM4. A continuación, se cuantificaron ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) mediante RT-PCR en tiempo real en comparación con la señal obtenida en una secuencia de control con una IgG de control.

Figura 5: OLFM4 secretado induce resistencia a oxaliplatino y sn38 en células colorrectales.

La influencia de OLFM4 tras los tratamientos genotóxicos en células HCT116 inducibles por OLFM4 se evaluó mediante un ensayo clonogénico. Las células se incubaron con 50 ng/ml de doxiciclina y seguidamente, 24 h después, fueron tratadas con oxaliplatino o sn38 a la concentración indicada durante 10 días. Se tiñeron las colonias con cristal violeta y se contaron utilizando el software QuantityOne (Biorad). B. Se añadió OLFM4 sobreexpresado en células COS7 a razón de aproximadamente 3 ng/ml al tratamiento de oxaliplatino y sn38 en las células HCT116 de tipo salvaje durante 10 días. Se tiñeron las colonias y se contaron tal como anteriormente. Los histogramas mostrados son representativos de tres experimentos individuales.

Ejemplos experimentales

Materiales y métodos

Línea celular:

La línea celular de adenocarcinoma de colon humano HCT116 (American Type Culture Collection, ATCC) se mantuvo en medio RPMI 1640 sin antibióticos (Lonza). Los cultivos se complementaron con suero de feto bovino al 10%. Las líneas celulares se mantuvieron a 37ºC con 5% de CO2 y se sometieron a ensayo para descartar la contaminación por micoplasmas.

Cultivo celular y transfección estable:

El plásmido pCMV/OLFM4 (Imagenes) se cotransfectó establemente con pcDNA6/TR utilizando el reactivo LipofectAMINE 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron las líneas de células HCT116 estables con 100 µg ml-1 de blasticidina (Sigma Aldrich, Deisenhofen, Alemania) y 800 µg ml-1 de G418 durante 1 mes y se mantuvieron en medio RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 10% que contenía 5 µg ml-1 de blasticidina y 200 µg ml-1 de G418. Se indujo la expresión de OLFM4 con 50 ng ml-1 de doxociclina durante 48 h. Se confirmó la expresión de la proteína OLFM4 en dichas líneas celulares estables mediante transferencia western tal como se ha indicado anteriormente.

Ensayo clonogénico de supervivencia celular:

Se sembraron células HCT116 estables con OLFM4 a razón de 300 células en placas de cultivo celular de 6

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pocillos con medio RPMI 1640 complementado con suero de feto bovino al 3% y se incubaron a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO2. A continuación se indujeron las células con 50 ng ml-1 de doxiciclina (Sigma) durante 24 h. Después las células se trataron con SN38 y oxaliplatino y se incubaron a 37ºC en una atmósfera con 5% de CO2 durante 10 días, se lavaron dos veces con PBS y se tiñeron con cristal violeta al 0,1%. Se visualizó el número de colonias que excedían 50 células con un dispositivo de imagen Bio-Rad Chemi Doc XRS y se contaron utilizando software de imágenes Quantity One (Bio-Rad). Se determinó la fracción de supervivencia como la proporción entre el número de colonias observadas con doxiciclina y el número de células observado con doxiciclina, ajustado para la eficiencia de la siembra en placa.

Microdisección de captura por láser (LCM):

Se cortaron secciones congeladas (12 µm de grosor) de cáncer de colon o mucosa colónica normal en un criostato (Bright Instrument Co. Ltd., St. Margarets Way, Reino Unido). A continuación se tiñeron las secciones con azul de toluidina utilizando un método de tinción rápida. Las secciones teñidas con azul de toluidina también se prepararon para la referencia visual. Las secciones de tejido se introdujeron en el baño de etanol al 70% durante 1 minuto, de etanol al 95% durante 2 minutos, de etanol al 95% durante 2 minutos y finalmente dos veces en un baño de xileno al 100% durante 5 minutos. Se dejó que el xileno se evaporase por completo de las secciones y después se microdiseccionaron utilizando un sistema de microdisección de captura por láser PixCell II (Arcturus Engineering, Mountain View, California, EE.UU.).

El sistema de captura por láser se dotó de software de archivo de imágenes PixCell II (Arcturus Engineering). La configuración del láser era la siguiente: se fijó el diámetro de punto en 7,5 µm, duración del pulso de 70 milisegundos y potencia de 70 mW. Tras la microdisección, se retiró la película plástica que contenía las células microdiseccionadas y todas las películas que contenían material de una única muestra se introdujeron en una extracción de ADN en tubo de microcentrífuga y se añadió solución de lisis de proteínas. Se capturaron aproximadamente 30.000 células a partir de una única sección de tejido o de secciones consecutivas de tejido utilizando hasta 5 "caps" CapSure de LCM (Molecular Devices Corporation), que se transfirieron a un tubo Eppendorf estéril para la extracción de las proteínas (ver a continuación).

Análisis de pirosecuenciación:

Se extrajo ADN genómico procedente de tejido congelado con el kit de extracción de ADN PicoPureTM (Arturus Bioscience, Inc., Mountain View, CA, USA) y se llevó a cabo una amplificación de genoma completo del ADN genómico mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores 15-meros aleatorios.

Se obtuvieron productos de PCR biotinilados con una desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 min seguida de 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante 30 s, hibridación de cebadores a 54ºC durante 30 s y extensión a 72ºC durante 1 min, seguido de una extensión final durante 5 min a 72ºC. Todas las reacciones de amplificación se llevaron a cabo en un ciclador térmico DNAThermal Cycler 480 (Perkin Elmer, Boston, EE.UU.) con 1 unidad de polimerasa Taq (Euroblue Taq-Eurobio, Les Ulis, Francia). Los diferentes juegos de cebadores utilizados para amplificar las secuencias de interés eran: secuencias de cebador de PCR mediante mutación de KRAS para los codones 12-13 (cadena de sentido): 5'-AAC CTT ATG TGT GAC ATG TTC T-3' (SEC ID nº 1), (antisentido): 5'biotín-TCG TCC ACA AAA TGA TTC TGA-3' (SEC ID nº 2) y cebador de secuenciación de sentido: 5'-CTT GTG GTA GTT GGA GC-3' (SEC ID nº 3) codón 61: secuencia de cebador: (sentido): 5'-TTA TGG CAA ATA CAC AAA GAA AGC-3' (SEC ID nº 4), (antisentido): 5'-biotín-CAG ACT GTG TTT CTC CCT TCT CA-3' (SEC ID nº 5) y cebador de secuenciación de sentido 5'-ATA TTC TCG ACA CAG CAG-3' (SEC ID nº 6). Se diseñaron cebadores de secuenciación diferentes para llevar a cabo el análisis de pirosecuenciación del gen KRAS. A continuación, se realizó una selección según su capacidad de proporcionar PyrogramsTM interpretables. Los productos de ADN consistían en ADN genómico amplificado a partir de sujetos de control.

Las mutaciones en el fragmento del exón 1 del gen KRAS se detectaron mediante secuenciación directa del fragmento de PCR sin necesidad de purificación adicional con el sistema Pyrosequencer PyroMark ID (Biotage AB y Biosystems, Uppsala, Suecia). Para la pirosecuenciación, se preparó ADN de cadena sencilla a partir de 40 µl de producto de PCR biotinilado, utilizando sefarosa recubierta con estreptavidina y se utilizaron 1,5 pmoles de cebador de secuenciación para el análisis. La secuenciación se llevó a cabo con el kit de reactivos de SNP (Biotage) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Extracción y digestión de proteínas:

La extracción de las proteínas se llevó a cabo utilizando el kit Liquid Tissue MS Protein Prep siguiendo el protocolo del fabricante (Expression Pathology Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). Brevemente, se retiraron las películas de la cara inferior de los "caps" de cada muestra, se transfirieron a tubos de reacción de baja unión y se incubaron con 20 µl de Liquid Tissue extraction y se calentaron a 95ºC durante 90 minutos. Tras enfriar durante 2 minutos sobre hielo, se añadieron 5 µl de reactivo de tripsina y se incubaron a 37ºC durante una hora bajo agitación vigorosa durante 30 segundos a intervalos de 20 minutos. Las muestras se incubaron adicionalmente durante la noche a 37ºC seguido de calentamiento a 95ºC durante 5 minutos.

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ProteinPilot.

Cuantificación de la expresión relativa de proteínas:

Los presentes inventores utilizaron un paquete de software adaptado, iQuantitator, para inferir la magnitud del cambio en la expresión de proteínas. El software infiere los cambios dependientes del tratamiento en la expresión utilizando métodos estadísticos bayesianos. Básicamente este enfoque se utilizó para generar medias, medianas e intervalos de confianza al 95% (superior e inferior) para cada cambio dependiente del tratamiento en la expresión de proteínas mediante la utilización de datos a nivel de péptido de cada péptido componente y la integración de los datos de los dos experimentos. Para las proteínas con proporciones de iTRAQ reguladas negativamente en los tejidos se consideró adicionalmente el grado de regulación negativa en el caso de que el valor nulo de 1 fuese mayor que el límite superior del intervalo de confianza. A la inversa, para proteínas con proporciones de iTRAQ reguladas positivamente en los tumores se consideró adicionalmente el grado de regulación positiva en el caso de que el límite inferior del intervalo de confianza presentase un valor mayor que 1. La anchura de estos intervalos de confianza depende de los datos disponibles para una proteína dada. Debido a que se considera el número de péptidos observado y el número de espectros utilizado para cuantificar el cambio de expresión para una proteína dada, resulta posible detectar cambios pequeños aunque significativos en la regulación positiva o negativa en caso de que se encuentren disponibles muchos péptidos.

Se consideraron los datos de un total de 468.599 espectros de dos experimentos de 4 iTRAQ utilizando dicho software adaptado. Del total, se utilizaron 84.628 espectros para identificar 9.286 péptidos (2.971 proteínas únicas). Para cada proteína y cada péptido asociado a una proteína dada, se calculó la media, la mediana y los intervalos de confianza al 95% para cada uno de los efectos de tratamiento a nivel de proteína y a nivel de péptido.

Análisis de transferencia western en tejidos normales y CRC:

Se prepararon lisados de células completas a partir de tres tejidos normales, tres tejidos cancerosos con gen KRAS no mutado y tres tejidos cancerosos con gen KRAS mutado. Las muestras de tejido congeladas se homogeneizaron y se lisaron en un tampón que contenía urea 7 M, tiourea 2 M y CHAPS al 4% (p/v) a 4ºC durante 1 h utilizando un agitador giratorio. Se llevó a cabo la lisis mediante sonicación sobre hielo (3x pulsos de 5 s) y los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 14.000 x g a 4ºC durante 15 min. Se determinaron las concentraciones de proteínas utilizando el kit de cuantificación de proteínas FluoroProfile (Sigma-Aldrich Corporation), con BSA como el estándar, y se resolvieron cantidades iguales de proteínas (80 µg/carril) procedentes de los tejidos de muestra en un gel de SDS-poliacrilamida al 10%. A continuación, las proteínas se electrotransfirieron a membranas de VDF. Tras el bloqueo con BSA al 3% en TBS (0,1 m, pH=7,4), las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios respectivos (dilución 1:200) a 4ºC durante la noche. Se utilizó la abundancia proteica de β-tubulina como control para la carga de proteínas y se determinó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-β-tubulina: (H-235) (sc-9104, Santa Cruza Biotechnology Inc.). Las membranas se incubaron con el anticuerpo secundario respectivo, anticuerpo de conejo anti-IgG conjugado con peroxidasa de rábano picante (anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo, 1:5.000, Santa Cruza Biotechnology Inc.) y se diluyeron con albúmina de suero bovino al 1% durante 1 h a temperatura ambiente. Después de cada etapa las membranas se lavaron tres veces con Tween al 0,05%, TBS. La membrana se sondeó con los anticuerpos indicados y se reveló utilizando electroquimioluminiscencia enzimática (ECL).

Inmunohistoquímica:

Entre los anticuerpos primarios utilizados para los estudios de validación se incluyen: anticuerpo de conejo antiolfactomedina-4 (nº de cat. ab78496, Abcam, Cambridge, MA, 1:25), el anticuerpo de conejo anti-β-tubulina (nº de cat., Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, 1:200).

Se obtuvo una puntuación cuantitativa mediante la estimación del porcentaje de células teñidas inmunopositivas: 0, 10% de células; 1: 10% a 30% de células; 2: 30% a 50% de células; 3: 50% a 70% de células y 4: >70% de células. En segundo lugar, se puntuó la intensidad de la tinción mediante la evaluación de la intensidad de tinción media de las células positivas y la secreción (0, nula; 1, débil; 2, intermedia y 3, fuerte). Los datos inmunohistoquímicos se sometieron a análisis estadístico tal como se ha indicado anteriormente para los resultados de EM.

Experimento de desglucosilación y traducción in vitro de OLFM4:

El medio de cultivo purificado y el lisado de células COS-7 se pre-desnaturalizaron en tampón de desnaturalización de glucoproteínas a 100ºC durante 5 min. A continuación, las proteínas desnaturalizadas se trataron con un cóctel enzimático (Sigma-Aldrich Corporation) a 37ºC durante 3 h siguiendo las recomendaciones del fabricante; se separaron en un SDS-PAGE al 6%, seguido de análisis de transferencia western. El constructo pCM-OLFM4 se transcribió y tradujo en presencia.

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A partir de un banco de 49 tumores colorrectales primarios no sometidos a tratamiento, los presentes inventores llevaron a cabo la detección de las mutaciones más comunes en los tumores colorrectales: k-ras, pi3k, b-raf y p53. Se llevaron a cabo ensayos genéticos en tejido tumoral microdiseccionado. De entre estos tumores, 30 se encontraban mutados en por lo menos un oncogén (66%) y 16 tumores (35,5%) mostraban mutaciones en el oncogén K-ras. De estos 19 tumores, 3 también se encontraban mutados en p53 y PI3K. Estos resultados concuerdan con los ya publicados en la literatura. Los tumores mutados en p53, Raf o PI3 quinasa fueron excluidos del presente estudio a fin de comparar las muestras no mutadas con las mutadas en K-ras.

Identificación de las proteínas en tumores colorrectales

Se llevaron a cabo cuatro tandas de iTRAQ (3 iTRAQ 4plex y 1 iTRAQ 8plex) en 15 tumores colorrectales microdiseccionados (figura 1). Debido a que los presentes inventores habían encontrado que el enfoque isoeléctrico con tiras de gradiente de pH inmovilizadas resultaba útil para la caracterización de proteomas complejos, separaron en solución el conjunto de péptidos de iTRAQ en un aparato OFFGEL de formato de 24 fracciones. Cada fracción peptídica se sometió a CL-EM/EM. Se adquirió un total de 105.247 espectros de EM/EM (con una puntuación MASCOT>95%) en 4 experimentos de iTRAQ. De ellos, 84.628 espectros se asignaron a 9.286 péptidos únicos, que representaban 2.971 proteínas únicas (tasa de descubrimientos falsos o FDR <0,09%, con por lo menos 2 péptidos). Con el fin de determinar el alcance de la cobertura tumoral de los presentes inventores, se determinó la proporción de proteínas reguladoras tales como quinasas y factores de transcripción. Se identificó un total de 124 quinasas. Ello corresponde a 4,1% de las 2.971 proteínas del proteoma del tumor colorrectal de los presentes inventores con anotaciones de GO ("ontología génica"), que es una proporción equivalente a la esperada para el genoma humano (4,1%). Los presentes inventores identificaron 135 factores de transcripción, que correspondían a 4,5% de las proteínas tumorales y que era ligeramente inferior al 5,4% esperado del genoma. A continuación, se llevó a cabo el análisis de los componentes celulares de GO y se identificaron las proteínas en varios compartimientos subcelulares, tales como la mitocondria, el retículo endoplasmático, la parte nuclear, el citosol, el citoesqueleto de actina, las vesículas citoplasmáticas, la región extracelular y la membrana plasmática. Todas las categorías se encontraban sobreexpresadas con respecto al genoma, lo que sugiere que el análisis de los presentes inventores detectaba preferentemente las proteínas abundantes.

De entre dichas 2.971 proteínas identificadas en el presente estudio, los presentes inventores examinaron inicialmente proteínas que se expresaban diferencialmente en grado estadísticamente significativo en el grupo de tejidos normales y en los tumores. Se identificaron 210 proteínas con un intervalo de confianza (IC en %) superior al 95% en 9 tumores. De entre estas proteínas identificadas, 84 se sobreexpresaban y 126 se encontraban infraexpresadas. Algunas de ellas ya han sido publicadas como candidatos a biomarcador en la literatura. Según la anotación de GO, 58 proteínas (28%) se clasificaron como pertenecientes a la parte extracelular de la célula (GO:0005576). Estas proteínas eran las expresadas más diferencialmente en tumores no mutados y mutados, y de ellas, 25 se sobreexpresaban.

Identificación mediante espectrometría de masas de las proteínas expresadas diferencialmente en tumores KRAS

A partir de los tumores con mutación de KRAS, los presentes inventores caracterizaron 223 proteínas expresadas diferencialmente en comparación con los tejidos normales. 96 proteínas se encontraban sobreexpresadas y 127 se encontraban infraexpresadas. La primera conclusión es que el número de proteínas expresadas diferencialmente era superior en el caso de los tumores KRAS.

Con el fin de caracterizar las proteínas que se expresaban específicamente en los tumores con mutación K-ras en comparación con sus contrapartidas no mutadas, se llevaron a cabo 3 tandas independientes de iTRAQ comparando 6 tumores no mutados con 6 tumores KRAS. Los resultados de los análisis estadísticos realizados en 27 tumores demostraron que dos proteínas se expresaban diferencialmente bajo las dos condiciones (>50%): HLA-DRA, con una proporción KRAS/WT de iTRAQ de 0,54 y OLFM4, con una proporción KRAS/WT de iTRAQ de 1,93.

 HLA-DRA

HLA-DRA (proporción iTRAQ de 0,54) es uno de los parálogos de cadena alfa de HLA de clase II. Desempeña una función crucial en el sistema inmunológico, al presentar antígenos derivados de las proteínas extracelulares. HLA-DRA es un gen inflamatorio que presenta un papel en la carcinogénesis en el colon. Los resultados de los presentes inventores concuerdan con los de un estudio anterior de cuantificación del ARNm de HLA-DRA que mostraba que la expresión de ARNm de HLA-DRA se encontraba significativamente reducida en los tumores colorrectales de varias cohortes. En el caso de los presentes inventores debería indicarse que la expresión de HLD-DRA sólo se encuentra regulada negativamente de manera significativa en tumores con mutación K-ras.

 OLFM4

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Claims (1)

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