ES2664092T3

ES2664092T3 - Variante de L-aspartato oxidasa y procedimiento para la producción de quinolinato o ácido nicotínico utilizando la misma

Info

Publication number: ES2664092T3
Application number: ES14178598.0T
Authority: ES
Inventors: So Young Kim; Yong Uk Shin; In Kyung Heo; Ju Eun Kim; Kwang Ho Na; Chang Il Seo; Sung Kwang Son; Jae Hee Lee
Original assignee: CJ CheilJedang Corp
Current assignee: CJ CheilJedang Corp
Priority date: 2013-07-25
Filing date: 2014-07-25
Publication date: 2018-04-18
Anticipated expiration: 2034-07-25
Also published as: WO2015012641A1; RU2016106171A; KR101634582B1; JP6211191B2; KR20150014006A; BR102014018364A2; US20150031093A1; EP2829602B1; MY172675A; RU2648167C2; CN104450638B; JP2016525353A; EP2829602A1; CN104450638A; BR102014018364B1; US9290743B2

Abstract

Una variante de L-aspartato oxidasa que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en la SEQ ID NO: 1 de la cual una posición 302ª de la SEQ ID NO: 1 se ha sustituido con otro aminoácido, en la que el otro aminoácido se selecciona de entre el grupo que consiste en arginina, glicina, alanina, serina, treonina, cisteína, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, asparagina, glutamina e histidina.

Description

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noche a 37 ºC para obtener colonias resistentes a la kanamicina. Se seleccionaron aleatoriamente diez clones de entre ellas, seguido por secuenciación. Como resultado, la tasa de error del gen nadB se estimó que era de 4,5 nucleótidos/1 kb. El número de cepas con una variante del gen nadB obtenido era aproximadamente de 3 x 105 o más.

[Tabla 2]

Secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO

5’ CTCGAGCATAGCATTTTTATCC 3’: 4

5’ CAGTGAGCGAGGAAGCGG 3’: 5

<1-3> Selección de variantes de L-aspartato oxidasa que presentan regulación de retroalimentación con NAD liberado

<1-3-1> Construcción de una cepa deficiente en L-aspartato oxidasa

El gen nadB afecta negativamente la producción de quinolinato bajo la regulación de retroalimentación por NAD (J Biol Chem. 25 de Ene de 1982; 257(2):626-32.). Por esta razón, es importante descubrir la regulación por retroalimentación del gen nadB con liberación de NAD. Para seleccionar eficazmente mejor las variantes del gen nadB, se retiró un gen nadB endógeno de una cepa. Basándose en la secuencia de nucleótidos del gen nadB (Registro de NCBI Nº "GI:89109380") representada por la SEQ ID NO: 24 obtenida del Gen Bank del Instituto Nacional de Salud (Gen Bank NIH), los cebadores de SEQ ID NO: 6 y 7 capaces de amplificar la región corriente abajo del gen nadB, y los cebadores de SEQ ID NO: 8 y 9 capaces de amplificar la región corriente arriba del gen nadB, y los cebadores de SEQ ID NO: 10 y 11 capaces de amplificar loxpCm.

[Tabla 3]

Secuencia de nucleótidos: SEQ ID NO

5’ CATTATACGAACGGTACCCCAAAGCCTGGGTCAGCGCCGT 3’: 6

5’ GGCGGATATTCAGCAGTGG 3’: 7

5’ CCCAAACCAAATTTCCACG 3’: 8

5’ CGGTAGGTACCGAGCTCGAATTTCTTTGTTTAATTTACTA 3’: 9

5’ TAGTAAATTAAACAAAGAAATTCGAGCTCGGTACCTACCG 3’: 10

5’ ACGGCGCTGACCCAGGCTTTGGGGTACCGTTCGTATAATG 3’: 11

Se llevó a cabo una PCR utilizando el ADN cromosómico de E. coli K12 W3110 (ATCC Nº 23257) como matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 8 y 9 como cebadores para amplificar las regiones corriente abajo del gen nadB de 0,4 kb y 0,4 kb, respectivamente. Además, se llevó a cabo una PCR utilizando el vector plásmido que contenía loxpCm, el vector pLoxpCat2, como una matriz y los oligonucleótidos de las SEQ ID NO: 10 y 11 como cebadores para amplificar el gen loxpCm que tiene la secuencia homóloga al gen nadB en ambos extremos de 1,0 kb. La polimerasa que se utilizó era la ADN polimerasa PfuUltra® (Stratagene, EE.UU.), y se llevó a cabo la PCR repitiendo 30 veces un ciclo que comprende la desnaturalización a 96 ºC durante 30 segundos, hibridación a 53 ºC durante 30 segundos, y extensión a 72 ºC durante 1 minuto, seguido por elución en gel de agarosa para obtener un fragmento corriente arriba de nadB, un fragmento corriente abajo de nadB y un fragmento loxpCm. Se llevó a cabo la PCR utilizando estos fragmentos obtenidos como matrices en condiciones de PCR repitiendo 10 veces del ciclo que comprende desnaturalización a 96 ºC durante 60 segundos, desnaturalización a 50 ºC durante 60 segundos, y extensión a 72 ºC durante 1 minuto, y 20 repeticiones del ciclo después de la adición de cebadores de las SEQ ID NO: 7 y 8. Como resultado, se obtuvo un casete deficiente en nadB que contenía la región corriente arriba del gen nadB -loxpCm – región corriente abajo del gen nadB de 1,8 kb.

La cepa K12 W3110 de E. coli que contenía el vector de expresión lambda red recombinasa pKD46 se transformó con el casete deficiente en nadB por electroporación, y entonces se sembró en frotis la cepa sobre un medio LB en placa (Triptona 10 g, extracto de levadura 5 g, NaCl 10 g, cloranfenicol 15 µg, y agar al 1,5 %) que contenía cloranfenicol como marcador selectivo. Entonces se cultivó a 37 ºC durante una noche para seleccionar las cepas de microorganismo que presentaba resistencia contra el cloranfenicol.

Las cepas seleccionadas se utilizaron directamente como matrices para llevar a cabo la PCR utilizando cebadores de SEQ ID NO: 7 y 8 en las mismas condiciones. Los tamaños del gen de la cepa silvestre y la cepa deficiente en nadB se identificaron como 2,4 kb y 0,8 kb, respectivamente en gel de agarosa al 1,0 %, confirmando de esta manera la eliminación del gen nadB en E. coli K12 W3110. La construcción de la cepa deficiente en nadB, llamada W3110-ΔnadB, se completó.

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segundos, hibridación a 50 ºC durante 30 segundos, y extensión a 72 ºC durante 1 minuto. Como resultado, se obtuvo un fragmento amplificado de aproximadamente 0,3 kb que incluía el promotor pCJ1 y los sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción BamHI y ApaI.

El gen nadA obtenido mediante la PCR se trató con las enzimas de restricción ApaI y NotI, y el fragmento de

5 promotor pCJ1 se trataron con las enzimas de restricción ApaI y BamHI. En último término se construyó el vector recombinante pPro-nadB-pCJ1-nadA de 5,9 kb, en el que la expresión del gen nadB se regula por el promotor pPro como un promotor constitutivo, y la expresión del gen nadA se regula por el promotor pCJ1. El pPro-nadB-pCJ1nadA tenía la secuencia representada en la SEQ ID NO: 27. Además, mediante los procedimientos descritos anteriormente, se construyó también un vector recombinante pPro-nadB67-pCJ1-nadA que incluía la variante nadB y

10 el gen nadA silvestre. El pPro-nadB67-pCJ1-nadA construido tenía la secuencia representada por la SEQ ID NO: 28.

<2-2-1> Construcción de un vector en el que el aminoácido 302º del gen nadB de pPro-nadB67-pCJ1-nadA se ha sustituido por un aminoácido excepto lisina y arginina

Para confirmar la resistencia contra la regulación de retroalimentación por NAD de la variante del gen nadB67, que incluye arginina en vez de lisina en el aminoácido 302º de L-aspartato oxidasa que comienza con metionina, se 15 sustituyó el aminoácido 302º del gen nadB con cada uno de los 18 aminoácidos diferentes excepto lisina y arginina. Se llevó a cabo una mutagénesis rápida utilizando el vector recombinante pPro-nadB67-pCJ1-nadA como matriz. La polimerasa era el ADN polimerasa PfuUltra™ (Stratagene, EE. UU.). Se llevó a cabo una PCR repitiendo 18 veces un ciclo que comprende la desnaturalización a 96 ºC durante 30 segundos, hibridación a 55 ºC durante 30 segundos, y extensión a 68 ºC durante 15 minutos. El producto de la PCR resultante se trató con la enzima de restricción DpnI 20 (NEB, EE. UU.), y entonces se transformó en la cepa DH5α de E. coli (Invitrogen, EE. UU.) mediante el procedimiento de CaCl2. La cepa DH5α de E. coli se sembró en frotis sobre un medio LB-Km en placa (extracto de levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, triptona 10 g/l, kanamicina 25 µg/l), y se cultivó durante una noche a 37 ºC para seleccionar las colonias resistentes a kanamicina. Las colonias resultantes se sometieron a extracción de plásmidos y se secuenciaron para identificar la sustitución del aminoácido 302º con los 18 aminoácidos diferentes. Las 18

25 variantes de nadB como plásmidos se denominaron como en la Tabla 2.

[Tabla 8] Variantes de L-aspartato oxidasa en la que el aminoácido 302º se sustituyó con otro aminoácido

Nombre: Aminoácido 302º original de nadB Aminoácido sustituido

pPro-nadB67-pCJ1-nadA: Lisina Arginina

pPro-nadB67(G)-pCJ1-nadA: Glicina

pPro-nadB67(A)-pCJ1-nadA: Alanina

pPro-nadB67(S)-pCJ1-nadA: Serina

pPro-nadB67(T)-pCJ1-nadA: Treonina

pPro-nadB67(C)-pCJ1-nadB: Cisteína

pPro-nadB67(V)-pCJ1-nadA: Valina

pPro-nadB67(L)-pCJ1-nadA: Leucina

pPro-nadB67(I)-pCJ1-nadA: Isoleucina

pPro-nadB67(M)-pCJ1-nadA: Metionina

pPro-nadB67(P)-pCJ1-nadA: Prolina

pPro-nadB67(F)-pCJ1-nadA: Fenilalanina

pPro-nadB67(Y)-pCJ1-nadA: Tirosina

pPro-nadB67(W)-pCJ1-nadA: Triptófano

pPro-nadB67(D)-pCJ1-nadA: Ácido Aspártico

pPro-nadB67(E)-pCJ1-nadA: Ácido Glutámico

pPro-nadB67(N)-pCJ1-nadA: Asparagina

pPro-nadB67(Q)-pCJ1-nadA: Glutamina

pPro-nadB67(H)-pCJ-nadA: Histidina

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(continuación)

Cepa: Plásmido QA (mg/l)

NA 0 uM: NA 5 uM NA 10 uM

pPro-nadB67(W)-pCJ-nadA: 4707 3715 3186

pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA: 100 100 100

pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA: 100 100 100

pPro-nadB67(N)-pCJ-nadA: 4552 3939 3171

pPro-nadB67(Q)-pCJ-nadA: 4552 3939 3171

pPro-nadB67(H)-pCJ-nadA: 4891 3751 3255

[Tabla 11] Rendimiento relativo de quinolinato con respecto a la concentración de NAD

Cepa: Plásmido Porcentaje relativo (%)

NA 0 uM: NA 5 uM NA 10 uM

W3110-AnadC: pPro-nadB-pCJ-nadA 100 46 20

pPro-nadB67-pCJ-nadA: 100 85 71

pPro-nadB67(G)-pCJ-nadA: 100 84 67

pPro-nadB67(A)-pCJ-nadA: 100 84 67

pPro-nadB67(S)-pCJ-nadA: 100 84 67

pPro-nadB67(T)-pCJ-nadA: 100 84 67

pPro-nadB67(C)-pCJ-nadA: 100 84 67

pPro-nadB67(V)-pCJ-nadA: 100 89 74

pPro-nadB67(L)-pCJ-nadA: 100 89 74

pPro-nadB67(i)-pCJ-nadA: 100 89 74

pPro-nadB67(M)-pCJ-nadA: 100 89 74

pPro-nadB67(P)-pCJ-nadA: 100 85 89

pPro-nadB67(F)-pCJ-nadA: 100 89 74

pPro-nadB67(Y)-pCJ-nadA: 100 89 74

pPro-nadB67(W)-pCJ-nadA: 100 79 68

pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA: 100 100 100

pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA: 100 100 100

pPro-nadB67(N)-pCJ-nadA: 100 87 70

pPro-nadB67(Q)-pCJ-nadA: 100 87 70

pPro-nadB67(H)-pCJ-nadA: 100 77 67

Para las dos variantes productoras de quinolinato que incluyen los plásmidos pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA y pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA, el gen nadB se destruyó y perdió su actividad. Como resultado, las variantes productoras de

5 quinolinato tenían sobre todo niveles de quinolinato (QA) muy bajos, el nivel se convirtió a un rendimiento residual relativo en porcentaje (%). Se basaba en que el 100 % del nivel de QA producido con ácido nicotínico (NA) es 0 uM.

En referencia a la Tabla 11, el rendimiento de quinolinato era menor del 50 % cuando se utilizaba el plásmido pPronadB-pCJ-nadA que incluía el gen nadB de tipo silvestre, y el medio de cultivo contenía ácido nicotínico, sobre 5 uM

o más. Mientras que el rendimiento de quinolinato era del 70 % o más cuando se utilizaba el plásmido pPro-nadB6710 pCJ-nadA y los plásmidos recombinantes de las variantes del 302º que incluyen la variante del gen nadB. La cepa W3110 –ΔnadC es una auxótrofa a NAD que necesita el suministro de NAD externo para crecer. La cepa W3110 – ΔnadC es incapaz de aceptar NAD directamente, y utiliza el ácido nicotínico (NA) heterogéneo o nicotinamida (Nm)

para producir NAD. Cuando una cantidad de NAD es de 1 mM o mayor, el gen nadB se regula por retroalimentación. Añadiendo NA a un medio de cultivo significa un aumento de NAD en una cepa. En consecuencia, las cantidades de producción de QA se compararon entre las cepas con la adición de NA al medio de cultivo a diferentes concentraciones para identificar el grado de regulación por retroalimentación en las variantes del gen nadB con 5 respecto a la concentración de NAD. Como resultado, se descubrió que las variantes del gen nadB con el aminoácido 302º sustituido se liberaba la regulación por retroalimentación por NAD.

<2-4> Producción de ácido nicotínico mediante la reacción de descarboxilación

Para identificar la capacidad para producir ácido nicotínico de las cepas productoras de quinolinato en las que se introdujeron variantes de nadB, se utilizaron los rendimientos de quinolinato de la Tabla 10. El procedimiento de 10 producción de ácido nicotínico utilizado en el presente documento era la descarboxilación de la solución de cultivo que incluía el quinolinato en condiciones de alta temperatura y alta presión basándose en la divulgación de la Patente coreana Nº 10-1223904, para convertir el quinolinato a ácido nicotínico. Para retirar las células de la solución de cultivo que contiene quinolinato, se llevó a cabo una centrifugación desde aproximadamente 3000 rpm a aproximadamente 4000 rpm durante aproximadamente 10 minutos a 30 minutos. El sobrenadante que contiene

15 quinolinato resultante de la centrifugación se separó y se utilizó como muestra para la reacción de descarboxilación.

La reacción de descarboxilación se llevó a cabo a aproximadamente 135 ºC a aproximadamente 0,2 MPa durante 3 horas. Las muestras que se utilizaron se muestran en la Tabla 12. Una solución acuosa de quinolinato (un producto convencional de Sigma-Aldrich Co.) en agua desionizada se utilizó como el grupo de control. Cada una de las muestras de soluciones acuosas de quinolinato se tituló con hidróxido sódico, agua amoniacada, ácido clorhídrico, o

20 ácido sulfúrica, específicamente la conversión de quinolinato en ácido nicotínico tiene lugar a un pH de 2. La Tabla 12 muestra las cantidades de producción de ácido nicotínico convertido a partir de quinolinato de la Tabla 10 mediante una reacción a alta temperatura y alta presión.

[Tabla 12]

Cepa: Plásmido Quinolinato (mg/l) Ácido nicotínico (mg/l)

W3110-AnadC: pPro-nadB-pCJ-nadA 3500 2555

pPro-nadB67-pCJ-nadA: 4553 3324

pPro-nadB67(G)-pCJ-nadA: 4560 3329

pPro-nadB67(A)-pCJ-nadA: 4560 3329

pPro-nadB67(S)-pCJ-nadA: 4560 3329

pPro-nadB67(T)-pCJ-nadA: 4560 3329

pPro-nadB67(C)-pCJ-nadA: 4560 3329

pPro-nadB67(V)-pCJ-nadA: 4425 3230

pPro-nadB67(L)-pCJ-nadA: 4425 3230

pPro-nadB67(I)-pCJ-nadA: 4425 3230

pPro-nadB67(M)-pCJ-nadA: 4425 3230

pPro-nadB67(P)-pCJ-nadA: 2223 1623

pPro-nadB67(F)-pCJ-nadA: 4241 3096

pPro-nadB67(Y)-pCJ-nadA: 4241 3096

pPro-nadB67(W)-pCJ-nadA: 4707 3436

pPro-nadB67(D)-pCJ-nadA: 100 73

pPro-nadB67(E)-pCJ-nadA: 100 73

pPro-nadB67(N)-pCJ-nadA: 4552 3323

pPro-nadB67(Q)-pCJ-nadA: 4552 3323

pPro-nadB67(H)-pCJ-nadA: 4891 3570

El experimento de conversión de quinolinato en solución acuosa (agua desionizada) en ácido nicotínico (Patente 25 china Nº 101353322) se llevó a cabo a 135 ºC y a 0,2 MPa durante aproximadamente 3 horas. Los niveles de temperatura y la presión eran menores de 150 ºC a 250 ºC. Los resultados se muestran en la Tabla 12.

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[Tabla 14] Comparación de actividad entre las L-aspartato oxidasas con respecto a la concentración de NAD

Actividad relativa

Concentración de NAD (mM): Relativa (%)

nadB tipo silvestre: Variante nadB67 Variante nadB67(V) Variante nadB67(L) Variante nadB67(I) Variante nadB67 (H)

0: 100 100 100 100 100 100

0,05: 95 102 100 100 100 100

0,3: 82 96 95 95 95 95

0,5: 65 75 77 76 76 77

1: 22 74 75 74 75 74

Aplicabilidad industrial

La presente invención se refiere a variantes de la L-aspartato oxidasa que son resistentes contra la regulación de retroalimentación por el ácido nicotínico o NAD, y por lo tanto puede producir eficazmente quinolinato. El quinolinato 5 se puede producir eficazmente cultivando un microorganismo que incluye dicha variante de L-aspartato oxidasa de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. El quinolinato también se puede producir eficazmente utilizando el microorganismo en el que la actividad de la quinolinato sintetasa está aumentada adicionalmente o la actividad de la quinolinato fosforribosil transferasa está adicionalmente debilitada. Mediante dicha transformación del microorganismo, el rendimiento de quinolinato o ácido nicotínico se puede mejorar, lo que es industrial y altamente

10 útil.

[Nº de acceso] Institución depositaria: Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) (Autoridad Depositaria Internacional) Nº de acceso: KCCM11434

15 Fecha del depósito: 20 de Junio de 2013

Aunque la invención se ha mostrado y descrito particularmente en referencia a las realizaciones ejemplares de la misma, se entenderá que se pueden hacer distintos cambios en su forma y detalles.

<110> CJ CheilJedang Corporation

20 <120> VARIANTE DE LA L-ASPARTATO OXIDASA Y UN PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN QUINOLINATO O ÁCIDO NICOTÍNICO UTILIZANDO LA MISMA

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25 <160> 30

<170> KopatentIn 2.0

<210> 1 30 <211> 540

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> secuencia de aminoácidos de nadB

<400> 1

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5: <210> 2 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> cebador para nadB

<400> 2

10

15: <210> 3 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial

<220> <223> cebador para nadB

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<210> 4

<211> 22 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador para nadB 30

<400> 4

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<210> 5 35 <211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 40 <223> cebador para nadB

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45 <210> 6

<211> 40

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

50 <220>

<223> cebador para nadB corriente abajo

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<210> 7

<211> 19

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador para nadB corriente abajo

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<223> cebador para nadC corriente abajo

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<210> 14

<211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador para nadC corriente arriba

<400> 14

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<210> 15

<211> 42

<212> ADN 20 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador para nadC corriente arriba

25 <400> 15

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<210> 16

<211> 21 30 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador para loxpCm 35

<400> 16

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<210> 17 40 <211> 41

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 45 <223> cebador para loxpCm

<400> 17

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50 <210> 18

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

55 <220>

<223> cebador para nadA

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<210> 19

<211> 29

<212> ADN

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<210> 25 5 <211> 894

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> gen nadC

<400> 25

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<210> 26

<211> 1044 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> gen nadA 10

<400> 26

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<223> nadA-quinolinato sintasa

<400> 29

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Claims

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