ES2664128T3 - Anticuerpos anti péptido Beta Amiloide N3pGlu y usos de los mismos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo anti Aß N3pGlu humano diseñado mediante ingeniería genética que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en el que LCDR1 es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEQ ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEQ ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEQ ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEQ ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 8) y HCDR3 es EGX7TVY (SEQ ID NO: 54), en el que X1 es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D y X7 es I, T, E o V.

Description

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utilizar luego para cribar estas secuencias de aminoácidos de la región variable adicionales para identificar secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. De este modo, se pueden identificar secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos humanos diseñados mediante ingeniería genética y porciones de unión a antígeno de los mismos. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de los marcos se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 4 regiones marco de cadena ligera y/o cadena pesada desveladas en el presente documento. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos dentro de las CDR se restringe a una, dos o tres posiciones dentro de una cualquiera o más de las 3 CDR de cadena ligera y/o cadena pesada. También son posibles combinaciones de los diversos cambios dentro de estas regiones marco y CDR descritas anteriormente.

El término "tratamiento" (o "tratar") se refiere a los procedimientos que implican una ralentización, interrupción, detención, control, paralización, reducción o inversión de la progresión o gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente, pero no necesariamente implica una eliminación total de todos los síntomas, afecciones o trastornos relacionados con enfermedades asociadas con el anticuerpo anti Aβ N3pGlu.

Los anticuerpos de la presente invención se pueden utilizar como medicamentos en medicina humana, administrados mediante una diversidad de rutas. Lo más preferentemente, tales composiciones son para administración parenteral. Dichas composiciones farmacéuticas se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª ed. (1995), A. Gennaro y col., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo como el desvelado en el presente documento o un fragmento de unión a antígeno del mismo y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los resultados de los ensayos siguientes demuestran que los anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención son útiles para el tratamiento de una afección asociada con la actividad del péptido Aβ tal como la enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down y AAC.

Ejemplo 1: Producción de anticuerpos

Generación inicial de anticuerpos: Se inmunizan ratones transgénicos FVB con el péptido amiloide β 3-42 humano modificado con piroglutamato y truncado en el extremo N terminal (N3pGlu) pretratado a 37 ºC durante la noche para formar un agregado. Se cosechan células de bazo de los ratones y se reduce el número de células B reactivas frente a Aβ1-40 mediante MACS. Se clasifican las células restantes para unirse al péptido Aβ N3pGlu agregado. Se aísla ARN de las células B seleccionadas y se convierte en ADNc usando oligo dT. Se obtienen regiones variables de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo mediante PCR usando cebadores de secuencia señal de anticuerpo y se clonan en vector de fago mediante mutagénesis de Kunkel para fabricar la biblioteca de Fab. La biblioteca de Fab se criba con respecto a la unión al péptido Aβ N3pGlu agregado mediante ELISA de un solo punto (SPE) y se somete a contra-cribado frente a Aβ1-40. Se caracterizan los clones positivos mediante secuenciación de ADN, expresión de fab y unión al péptido Aβ N3pGlu y falta de unión al péptido Aβ1-42 o Aβ1-40 soluble.

Se construyen y criban bibliotecas mutantes de aminoácidos sencillos mediante SPE para unirse al péptido Aβ N3pGlu agregado, pero no al Aβ1-42. Se combinan mutaciones beneficiosas en bibliotecas combinatorias. Se seleccionan y se convierten las variantes combinatorias optimizadas para la afinidad en IgG1 de ratón para la medición de la afinidad mediante BIACORE® y la unión a la placa Aβ mediante inmunohistoquímica. A partir de un clon identificado, se fabrica la proteína mAb en isotipos IgG1 (mE8) e IgG2a (mE8c) de ratón para estudios de eficacia in vivo. mE8 no se une a la secuencia Aβ N3pGlu de ratón (mpE3-16) o Aβ1-42 humana.

Se utilizan marcos de línea germinal humana VH1-69/JH6 y Vk-A18/JK2 para la humanización inicial. Se injertan CDR del anticuerpo mE8 (con cuatro mutaciones de afinidad) en los marcos humanos, obteniéndose el anticuerpo hE8-C6. Se lleva a cabo una optimización de afinidad adicional en la cadena principal de hE8-C6 y se combinan mutaciones beneficiosas para obtener la variante humanizada de alta afinidad R5, R17, R24 y 2420.

Segunda ronda de optimización para mejorar la capacidad de desarrollo de fármacos: Dos variantes humanizadas, hE8-C6 y R17, se eligen como cadena principal para una segunda ronda de optimización para mejorar la vida media del suero del anticuerpo mediante la disminución de la unión no específica a células y para aumentar la afinidad del anticuerpo al péptido Aβ N3pGlu soluble. Se sintetiza un péptido soluble biotinilado que consiste en el aminoácido 14 del extremo N terminal de Aβ N3pGlu (pE3-16B) y se evalúa si es equivalente al péptido Aβ N3pGlu para la unión al anticuerpo mE8. Se desarrolla un ensayo de elevación de filtro de alto rendimiento utilizando pE3-16B y se aplica a todos los cribados posteriores de la biblioteca. Se confirman todos los aciertos del cribado de elevación de filtro mediante la unión a Aβ N3pGlu agregado.

Se criban de nuevo bibliotecas de variantes de hE8-C6 usando el ensayo de elevación de filtro y se identifica un conjunto de mutaciones beneficiosas. Se utiliza un subconjunto de éstas para fabricar la biblioteca combinatoria. Se seleccionan cuatro variantes combi (CoII-E10, CoII-G2, CoII-G8 y CoII-E2) de este enfoque.

Se emplea modelado por ordenador para crear modelos estructurales de la región V de hE8-C6, R17, R24 y otras variantes. El análisis de modelo estructural identifica cargas positivas introducidas para la agrupación de optimización de afinidad en el sitio de unión, una causa potencial de unión no específica de anticuerpos a células. Basándose en el modelado, se seleccionan varias posiciones para introducir cambios para equilibrar el potencial

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electrostático de la superficie. Se sintetiza una biblioteca combinatoria mediante la combinación de algunas mutaciones beneficiosas del cribado de bibliotecas y los cambios definidos mediante modelado estructural. Se seleccionan tres variantes (R17m-B4, R17m-A12 y R17m-B12) de este esfuerzo para estudios adicionales.

El análisis de modelo estructural también descubre un choque estérico entre el resto de marco de cadena ligera Y36 y los restos en la CDR3 de cadena pesada. La mutación Y36L se introduce en la cadena ligera de hE8-C6 para producir la variante hE8L. Se encuentra que este cambio de marco solo tiene un impacto significativo tanto en el aumento de la afinidad del anticuerpo como en la reducción de la unión celular no específica.

El otro esfuerzo fue probar un marco humano diferente para la humanización. Se injertan CDR del anticuerpo mE8 en los marcos VH5-51/VKO2 y VH3-23/VKA2. Se determina que el Fab humanizado con VH5-51/VKO2 (hE8-5102) es equivalente, si no mejor, que hE8-C6 en la unión de Aβ N3pGlu. La introducción de mutaciones beneficiosas adicionales en hE8-51O2 genera variantes combi CI-A1, CI-B6, CI-C7 y CI-B8.

Después de pasar todos los ensayos in vitro, incluyendo ELISA y BIACORE® para especificidad y afinidad por antígenos, unión celular no específica y tinción de IHC, se seleccionan cinco variantes de mAbs, B12L, CI-C7, hE8L, R17L y R17.

Se pueden fabricar y purificar anticuerpos esencialmente de la siguiente manera. Una célula hospedadora apropiada, tal como HEK 293 EBNA o CHO, se transfecta de forma estable o transitoria con un sistema de expresión para secretar anticuerpos usando una relación de vector HC:LC óptima predeterminada o un sistema de vector único que codifica tanto HC, tal como la SEQ ID NO: 56 y la SEQ ID NO: 43 y LC, tal como la SEQ ID NO: 55. El medio clarificado, en el que el anticuerpo se ha secretado, se purifica usando cualquiera de las numerosas técnicas utilizadas comúnmente. Por ejemplo, el medio puede aplicarse convenientemente a una columna de Sepharose FF con proteína A o G que se ha equilibrado con un tampón compatible, tal como tampón fosfato salino (pH 7,4). Se lava la columna para eliminar componentes de unión no específicos. Se eluye el anticuerpo unido, por ejemplo, mediante gradiente de pH (tal como tampón fosfato de sodio 0,1 M pH 6,8 a tampón citrato de sodio 0,1 M pH 2,5). Se detectan fracciones de anticuerpo, tal como por SDS-PAGE, y luego se combinan. La purificación adicional es opcional, dependiendo del uso previsto. El anticuerpo se puede concentrar y/o filtrar de forma estéril usando técnicas comunes. Se pueden eliminar eficazmente los multímeros y agregados solubles mediante técnicas comunes, que incluyen cromatografía de hidroxiapatita, de intercambio iónico, de interacción hidrófoba o de exclusión por tamaño. La pureza del anticuerpo después de estas fases de cromatografía es mayor que 99 %. El producto se puede congelar inmediatamente a -70 ºC o se puede liofilizar. Las secuencias de aminoácidos para estos anticuerpos de la presente invención se proporcionan a continuación.

Tabla 1-SEQ ID NO de anticuerpos

Anticuerpo

Cadena ligera Cadena pesada LCVR HCVR

I (B12L)

14 15 11 12

II (R17L)

14 16 11 13

III (hE8L)

14 44 11 42

IV (R17)

38 39 36 37

V (CI-C7)

49 50 47 48

VI (mE8)

22 23 20 21

VII (mE8c)

22 24

Ejemplo 2: Afinidad de unión a N3pGlu soluble

Se usa resonancia de plasmón superficial medida con el instrumento BIACORE® 2000 para medir la unión de Aβ N3pGlu a anticuerpos anti N3pGlu. Salvo que se indique lo contrario, todos los reactivos y materiales son de BIACORE® AB (Uppsala, Suecia). Todas las mediciones se realizan a 25 ºC. Se disuelven las muestras en tampón HBS-EP (cloruro de sodio 150 mM, EDTA 3 mM, tensioactivo P-20 al 0,005 % (p/v) y HEPES 10 mM, pH 7,4).

Se sintetiza una serie de péptidos Abeta con cambios posicionales (mutantes de glicina) para evaluar el impacto de un resto dado sobre la unión a anticuerpo y, por lo tanto, identificar las características y la secuencia requeridas para el reconocimiento del anticuerpo:

Nombre del péptido Secuencia Abeta 3-16

pE3-16

Pir-EFRHDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 25

E3-16

EFRHDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 26

pEG4

Pir-EGRHDSGYEVHHQK-biotina SEQ ID NO: 27

mpE3-16

Pir-EFGHDSGFEVHHQK-biotina (roedor) SEQ ID NO: 28

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tales como B12L y R17L (en comparación con el mE8). No se observa un marcado de placa específico para IgG de control humanas ni de ratón. Debido a que la composición y la estructura probable del Aβ depositado es radicalmente diferente en el cerebro EA, se investigan los anticuerpos anti N3pGlu no biotinilados (3 ug/ml) para determinar si se unen a Aβ depositados en secciones cerebrales de un cerebro EA recién congelado. El anticuerpo de control positivo (3D6 biotinilado) marca intensamente muchas placas Aβ en el cerebro EA, mientras que los anticuerpos de control negativos (IgG humano y murino) carecen de cualquier unión apreciable. Varios de los anticuerpos anti N3pGlu no biotinilados tales como B12L y R17L se unen de forma similar a los Aβ depositados. Estos estudios histológicos demuestran que los anticuerpos anti N3pGlu de la presente invención pueden acoplarse a la diana de Aβ depositada ex vivo.

Ejemplo 5: Estudios de acoplamiento con la diana in vivo

Se mide la capacidad de los anticuerpos anti N3pGlu para acoplarse con la diana depositada in vivo. Se realiza un estudio subcrónico de 4 semanas con anticuerpos murinos biotinilados 3D6 y mE8c a 40 mg/kg administrados por vía intraperitoneal (IP) semanalmente. Se recogen los cerebros al término del experimento y el nivel de acoplamiento con la diana se determina mediante examen histológico del cerebro. Los animales inyectados con el 3D6 biotinilado tienen un marcado de placa solo a lo largo de la fisura del hipocampo, mientras que los ratones inyectados con mE8c biotinilado expresan un marcado de placas fuerte en el hipocampo y las regiones corticales. Se observan patrones de acoplamiento con la diana muy similares en un ensayo de 3 días más agudo (tinción de fisura de hipocampo 3D6 y marcaje de mE8 en hipocampo y regiones corticales). Estos resultados sugieren fuertemente que el anticuerpo 3D6, que se une tanto a Aβ soluble como insoluble, se satura con Aβ soluble y, por lo tanto, no puede acoplarse con la diana depositada deseada. En marcado contraste, el anticuerpo murino anti N3pGlu mE8c se acopla consistentemente con la diana prevista en ambas regiones críticas del cerebro. Se evalúan dosis altas y bajas de los anticuerpos anti N3pGlu R17L y B12L en un estudio in vivo de 3 días similar. Se inyectan los anticuerpos IP a 10 mg/kg (dosis baja) o 40 mg/kg (dosis alta). Al final del estudio, se recogen el plasma y los cerebros y se determina la PK del plasma. Se seccionan los cerebros y se realiza la inmunohistoquímica en secciones hermanas con un anticuerpo antihumano (para detectar el anticuerpo anti N3pGlu unido) y 3D6 (para detectar la cantidad total de diana depositada en la sección). A fin de una mejor cuantificación del nivel acoplamiento con la diana in vivo, el porcentaje de área unida por el anticuerpo anti N3pGlu se normaliza frente al % de área total de posible diana (Aβ depositado total visualizado mediante inmunohistoquímica 3D6 exógena). Adicionalmente, el porcentaje global de acoplamiento con la diana se normaliza frente a los valores farmacocinéticos del plasma (PK) para cada ratón individual, ya que se detectan exposiciones significativas al término del estudio. Se encuentra que los anticuerpos anti N3pGlu tanto R17L como B12L se acoplan con la placa depositada con una distribución similar a la observada con el anticuerpo anti N3pGlu murino (mE8). Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti N3pGlu R17L y B12L, cuando se administran periféricamente, pueden cruzar la barrera sangre-cerebro y acoplarse con la diana prevista del Aβ depositado, mientras que un anticuerpo que se une tanto a Aβ soluble como insoluble se satura con el soluble y no puede acoplarse con la diana depositada prevista.

Ejemplo 6: Estudios de reducción de placas terapéuticas

Se realiza un estudio de reducción de placas terapéuticas en ratones PDAPP de 23 meses de edad con los anticuerpos siguientes: anticuerpo de control negativo (IgG2a), 3D6, mE8 (IgG1) y mE8c (IgG2a). Se inyectan subcutáneamente los ratones PDAPP envejecidos con 12,5 mg/kg de cada anticuerpo semanalmente durante tres meses. Se realiza una necropsia a un grupo de ratones al principio del estudio (tiempo cero) a fin de determinar la carga de placa inicial a los 23 meses de edad. Al final del estudio, se obtiene plasma y se procesan los cerebros para obtener resultados bioquímicos e histológicos (un hemisferio cada uno). Se homogeneizan el hipocampo y las regiones corticales en guanidina 5 M y se mide el contenido Aβ mediante geles de urea ácida seguido por transferencia de Western. Un análisis de los lisados de guanidina del hipocampo de las cohortes de tiempo cero de 23 meses de edad y anticuerpo de control negativo (de 26 meses de edad) muestran un aumento no significativo en Aβ1-42 depositado; confirmando así que los cerebros de los ratones PDAPP están en la meseta de placa. De forma similar a los estudios previos en ratones PDAPP envejecidos, el tratamiento con el anticuerpo comparador 3D6 no tiene efecto sobre la reducción de placa. El tratamiento con anticuerpo N3pGlu, mE8 o mE8c, da como resultado una reducción de placa significativa comparado con el anticuerpo de control negativo IgG2a (p<0,01 y p<0,001 respectivamente) (Tabla 2). El mE8 y mE8c reduce el Aβ1-42 del hipocampo en ~38 %y ~53 %, respectivamente. El anticuerpo N3pGlu mE8c con función efectora máxima tiende a ser más eficaz que el anticuerpo con función efectora mínima mE8 (en comparación con el control), sin embargo, esta diferencia no alcanza significación estadística. También, el anticuerpo mE8c tiene una disminución significativa de ~30 % de Aβ1-42 en el hipocampo comparado con los ratones de tiempo cero (prueba t; p<0,0066), por lo tanto indica la eliminación de placa depositada previamente. Los análisis de los lisados de guanidina cortical producen resultados muy similares con la excepción de que solo el mE8c con función efectora máxima disminuye significativamente la deposición de Aβ1-42. Estos resultados demuestran que el tratamiento crónico con anticuerpos N3pGlu de este ejemplo disminuye significativamente la deposición de placa en ratones PDAPP envejecidos de una forma dependiente de la función efectora. Adicionalmente, estos resultados apoyan la hipótesis de que el acoplamiento con la diana deficiente para anticuerpos Aβ que se unen tanto a Aβ solubles como insolubles (en oposición a la senescencia) fue el factor causante de su falta de eficacia cuando se usa en paradigmas terapéuticos.

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Claims (1)

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