ES2664179T3 - Compuestos de ácido nucleico para unión a una proteína de componente 3 del complemento - Google Patents

Compuestos de ácido nucleico para unión a una proteína de componente 3 del complemento Download PDF

Info

Publication number
ES2664179T3
ES2664179T3 ES15729302.8T ES15729302T ES2664179T3 ES 2664179 T3 ES2664179 T3 ES 2664179T3 ES 15729302 T ES15729302 T ES 15729302T ES 2664179 T3 ES2664179 T3 ES 2664179T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
aptamer
deoxyuridine
seq
protein
independently
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15729302.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Daniel W. DROLET
Chi Zhang
Daniel J. O'connell
Shashi Gupta
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Somalogic Inc
Original Assignee
Somalogic Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Somalogic Inc filed Critical Somalogic Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2664179T3 publication Critical patent/ES2664179T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/317—Chemical structure of the backbone with an inverted bond, e.g. a cap structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/318—Chemical structure of the backbone where the PO2 is completely replaced, e.g. MMI or formacetal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)

Abstract

Un aptámero que se une una proteína C3, en donde el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 152) en la que, K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; cada R es independientemente, y cada vez que aparece, A o G; M es C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; cada D es independientemente, y cada vez que aparece, A, C o un espaciador de 3 carbonos; cada V es independientemente, y cada vez que aparece, A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; L es A, U, T o una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; Y es C, U o T; y n es 0 o 1.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Compuestos de ácido nucleico para unión a una proteína de componente 3 del complemento Campo
La presente divulgación se refiere de forma general al campo de ácidos nucleicos y, más específicamente, a aptámeros capaces de unirse al componente 3 del complemento humano (C3 o proteína C3), a composiciones que comprenden un aptámero de unión a C3 y C3 y a métodos de inhibición de la función biológica de c3 y métodos de detección de C3 utilizando dichos aptámeros.
Antecedentes
El sistema del complemento comprende un grupo de proteínas que interaccionan entre sí que incluye proteínas solubles encontradas en la sangre y otros fluidos corporales, así como proteínas de unión a célula (Makrides, Pharmacological Reviews 1998, 50(1): 59-88). Este sistema desempeña un importante papel en la inmunidad innata que requiere el huésped para defenderse contra patógenos y media la lisis celular del patógeno, la quimiotaxis de célula inmune y fagocitosis (Janeway et al. Immunobiology: The Immune System in Health y Disease. 5a edición. Nueva York: Garland Science; 2001.).
La proteína de componente 3 del complemento (C3) (una glucoproteína que se encuentra en la sangre) es un miembro de este sistema y desempeña un papel central en la ruta (Lambris, Immunology Today 1988, 9(12): 387393). Los genes del componente 3 del complemento humano (C3) están localizados en el brazo corto del cromosoma 19 (Lusis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 1986, 83: 3929-3933) y se transcriben, procesan y traducen en pro-C3. Pro-C3 experimenta escisión endo-proteolítica específica de sitio tras la secreción para producir C3. C3 circula como una proteína que contiene dos subunidades (cadena alfa 115 kDa y cadena beta 75 kDa) unidas mediante un enlace disulfuro. La concentración de proteína C3 en el suero humano normal es aproximadamente 1,15 mg/ml (Kasperska-Zajac et al., J. Inflammation 2013, 10:22; doi: 10,1186/1476-9255-10-22).
Tras la activación, la unión covalente de proteína C3 a las superficies inicia muchos efectos del sistema del complemento. La activación puede tener lugar por proteólisis específica de sitio de proteína C3 soluble en dos proteínas denominadas C3a y C3b. C3b se une covalentemente a las superficies en las que actúa en partículas diana por fagocitosis (opsonización) o inicia la ruta del complemento terminal que conduce a la lisis celular del patógeno. C3a también denominada anafilotoxina, es un mediador de diversas funciones fisiológicas, como contracción de células del músculo liso, permeabilidad vascular, degranulación de mastocitos y quimiotaxis de células inmunes. Los inhibidores de C3 que impiden el evento de activación proteolítica específica de sitio son deseables, ya que pueden impedir las funciones biológicas tanto de C3a como C3b, así como la activación de la ruta del complemento terminal.
El sistema del complemento está rígidamente regulado por lo general para prevenir el daño del tejido en el huésped (Thurman et al., J. Immunol. 2006, 176: 1305-1310). Sin embargo, cuando se desregula, tal como puede ocurrir cuando falla uno o más de los mecanismos de control o por modulación del sistema inmune atípico, el exceso de activación del complemento resultante puede conducir a una patofisiología. Por ejemplo, tanto el síndrome hemolítico-urémico atípico como la degeneración macular relacionada con la edad tienen relación con las alteraciones en factor H de proteína de control del complemento que conducen a una mayor actividad de C3- convertasa y, por tanto, a un exceso de la activación del complemento (Ferreira et al., Mol. Immunol. 2010, 47(13): 2187-2197). La sobreactivación del complemento puede entonces atacar las propias células del huésped con el resultado del daño del tejido observado en estas enfermedades. El sistema del complemento puede contribuir también a daños del tejido causados por muchos trastornos inflamatorios y lesiones por isquemia/reperfusión. Por tanto, los agentes terapéuticos que pueden inhibir el sistema del complemento, incluyendo aquellos que inhiben la actividad de C3, pueden ser beneficiosos. La presente divulgación satisface estas necesidades al proporcionar aptámeros que pueden inhibir la bioactividad de la proteína C3 humana e impedir la liberación de C3a.
Determinar la concentración de C3 en los fluidos corporales es útil como prueba de diagnóstico para diversas enfermedades y afecciones, entre las que se incluyen, sin limitarse a ellas, el diagnóstico de estados inflamatorios agudos, infecciones microbianas, deficiencia de C3 congénita, glomerulonefritis aguda, lupus eritematoso sistémico, glomerulonefritis membranoproliferativa y enfermedades por complejos inmunes (Nilsson et al., Clin. Dev. Immunol.. 2012, 2012: Article ID 962702, página 11). En el momento actual, los anticuerpos constituyen la herramienta más común para detectar C3. Sin embargo, presentan varias desventajas, incluyendo la estabilidad (tanto la tolerancia a diversas condiciones de temperatura y pH como la falta de capacidad de recuperación desde condiciones no ideales), lo que equivale a un período de validez limitado, requisitos de almacenamiento especiales (p.ej., refrigeración), agregación y producción relativamente costosa. La presente divulgación aborda estos problemas relacionados con los anticuerpos proporcionando aptámeros que tienen una especificidad de unión a una proteína C3 humana.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Mallik et al (Ácidos nucleicos Research, Vol. 28, No.7, 1 abril 2010, páginas e93-e93 & Datos suplementarios) divulga un aptámero bi-funcional que se une a una proteína fluorescente verde y C3b/iC3b.
La patente internacional WO97/42317 A1 divulga aptámeros que se unen a la proteína del complemento C3b.
Sumario
La presente divulgación describe aptámeros capaces de unirse a la proteína de componente 3 (C39 del complemento humano; se ha demostrado que estos aptámeros son inhibidores de la activación mediada por complemento de C3 y que, por tanto, pueden ser útiles como agentes de diagnóstico y terapéuticos. Se describen composiciones farmacéuticas que comprenden aptámeros que se unen una proteína C3 y métodos para su uso y preparación.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3. En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 152), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; cada D es independientemente, y cada vez que aparece, A, C o un espaciador de 3 carbonos; cada V es independientemente, y cada vez que aparece, A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; L es A, U, T o una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; Y es C, U o T; y n es 0 o 1. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPPM-3' (SEQ ID NO: 153), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3. En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-KPGRMPDVDnLPAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 131), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; cada D es independientemente, y cada vez que aparece, A, C o un espaciador de 3 carbonos; cada V es independientemente, y cada vez que aparece, A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; L es A, U, T o una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; y n es 0 o 1. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPACGPPM-3' (SEQ ID NO: 135), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-
KPGRMPXPAWPSVGPAYRPP-3' (SEQ ID NO: 154), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; Y es C, U o T; y X es un engarce seleccionado entre un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'-
KPGRMPXPAWPSVGPAYRPPM-3' (SEQ ID NO: 155), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-
KPGRMPXPAWPSVGPACGPP-3' (SEQ ID NO: 136), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; y X es un engarce seleccionado entre un engarce de C2-C2o sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPXpAwPSVGpAcGPPM - 3' (SEQ ID NO: 137), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En cualquiera de las realizaciones descritas, K puede ser una pirimidina modificada en C-5, C o G; cada M puede ser independientemente, y cada vez que aparece, C o una pirimidina modificada en C-5; y/o L puede ser A o pirimidina modificada en C-5.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-PAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G o C; Y es C, U o T; y R es G o A.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-PAWPSVGPACGPP
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
-3' (SEQ ID NO: 134), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; y V es A, G o C.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende una secuencia que es idéntica al menos en un 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99 % o 100 % l a una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 130 y 138 a 151, en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende una secuencia que es idéntica en al menos un 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99 % o 100 % a una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 28, 32 a 34, 37 a 75, 78 a 118, 121 a 130 y 139 a 151, en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende una primera región y una segunda región, en las que la primera región comprende la secuencia 5'- PAGPC-3' (SEQ ID NO: 132) y la segunda región comprende la secuencia 5'- GPAYRPP-3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende una primera región y una segunda región, en las que la primera región comprende la secuencia 5'- PAGPC-3' (SEQ ID NO: 132) y la segunda región comprende la secuencia 5'- GPACGPP-3' (SEQ ID NO: 133), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
En algunas realizaciones, el extremo 3' de la primera región está covalentemente unido al extremo 5' de la segunda región. En algunas realizaciones, la primera región y la segunda región están unidas covalentemente mediante al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco engarces, en los que cada uno de los engarces se selecciona independientemente entre un nucleótido, un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol. En algunas realizaciones, cada engarce se selecciona independientemente entre un nucleótido, un espaciador de 3 carbonos y a hexaetilen glicol.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'-PAGPC -3' (SEQ ID NO: 132), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'- GPACGPP -3' (SEQ ID NO: 133), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia 5'- GPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A.
En algunas realizaciones, un aptámero que se une una proteína C3 comprende la secuencia SEQ ID NO: 125, en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
En algunas realizaciones de los aptámeros descritos en el presente documento, cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N- bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (PEdU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (iBudU), 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)- 2'-desoxiuridina (MBndU), 5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU), 5-(N-3- fenilpropilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU), 5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU), 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'- desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)- 2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-
desoxiuridina), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),
5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-
benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-
benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N- 3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-1-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)- 2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
fluorouridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)- 2'-O-metiluridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)- 2'-fluorouridina. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 es 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (NapdU).
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero puede comprender al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo.
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero puede ser de aproximadamente 24 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 28 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 28 nucleótidos de longitud. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero puede ser de 24 a 100 nucleótidos de longitud o de 30 a 60 nucleótidos de longitud o de 28 a 60 nucleótidos de longitud o de 28 a 50 nucleótidos de longitud o de 28 a 40 nucleótidos de longitud o de 40 a 50 nucleótidos de longitud o de 28 a 32 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un aptámero descrito en el presente documento se une una proteína C3 e inhibe la escisión de proteína C3. En algunas realizaciones, la proteína C3 es proteína C3 humana.
En algunas realizaciones, se proporciona una composición, que comprende un aptámero descrito en el presente documento y una proteína de componente 3 (C3) del complemento. En algunas de dichas realizaciones, la proteína de componente 3 (C3) del complemento es una proteína de componente 3 (C3) del complemento humana.
En algunas realizaciones, se divulgan métodos para inhibir la escisión de una proteína de componente 3 (C3) del complemento, que comprenden el contacto de una proteína C3 con un aptámero descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, la proteína C3 está en una muestra in vitro. En algunas realizaciones, la proteína C3 está en un sujeto.
En algunas realizaciones, se divulgan métodos para inhibir al menos una actividad del sistema del complemento, que comprenden el contacto de componentes del sistema del complemento con un aptámero descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, los componentes del sistema del complemento están en una muestra in vitro. En algunas realizaciones, los componentes del sistema del complemento están en un sujeto.
En algunas realizaciones, se divulgan métodos para inhibir la escisión de una proteína de componente 3 (C3) del complemento en un sujeto, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un aptámero descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, se divulgan métodos para inhibir al menos una actividad del sistema del complemento en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una cantidad eficaz de un aptámero descrito en el presente documento.
En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad, una enfermedad autoinmune, un trastorno hematológico, una enfermedad infecciosa, septicemia, una enfermedad inflamatoria o una enfermedad neurodegenerativa, que comprenden administrar a un sujeto una cantidad eficaz de un aptámero, tal como se describen en el presente documento. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune se selecciona entre lupus eritematoso y artritis reumatoide. En algunas realizaciones, el trastorno hematológico es hemoglobinuria paroxismal nocturna. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona entre lesión por isquemia/reperfusión, artritis y nefritis. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona entre enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.
En algunas realizaciones, se divulga el uso de un aptámero descrito en el presente documento para inhibir la escisión de proteína C3. En algunas realizaciones, se divulga el uso de un aptámero descrito en el presente documento para inhibir al menos una actividad del sistema del complemento. En algunas realizaciones, se divulga un aptámero descrito en el presente documento para tratar degeneración macular relacionada con la edad, una enfermedad autoinmune, un trastorno hematológico, una enfermedad infecciosa, septicemia, una enfermedad inflamatoria o a enfermedad neurodegenerativa. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune se selecciona entre lupus eritematoso y artritis reumatoide. En algunas realizaciones, el trastorno hematológico es hemoglobinuria paroxismal nocturna. En algunas realizaciones, la enfermedad inflamatoria se selecciona entre lesión por isquemia/reperfusión, artritis y nefritis. En algunas realizaciones, la enfermedad neurodegenerativa se selecciona entre enfermedad de Huntington y enfermedad de Parkinson.
En algunas realizaciones, se divulgan métodos para seleccionar un aptámero que tiene afinidad de unión con la proteína C3. En algunas realizaciones, un método comprende: (a) contacto de una mezcla candidato con una proteína C3, en el que la mezcla candidato comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno o cada uno de los ácidos nucleicos de la mezcla candidato comprende una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
pirimidina modificada en C-5; (b) exposición de la mezcla candidato a un proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta, en el que los ácidos nucleicos que tienen una velocidad de disociación lenta desde la molécula diana en relación con otros ácidos nucleicos en la mezcla candidato se unen con la proteína C3 formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) división de los ácidos nucleicos de constante de disociación lenta de la mezcla candidato; y (d) amplificación de los ácidos nucleicos de constante de disociación lenta para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con secuencias de ácido nucleico que son capaces de unirse a la proteína C3 con una constante de disociación lenta, en virtud de lo cual se selecciona un aptámero de constante de disociación lenta para la molécula de proteína C3. En algunas realizaciones, la mezcla candidato comprende ácidos nucleicos que comprenden la secuencia 5'- PAGPC -3' (SEQ ID NO: 132), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, la mezcla candidato comprende ácidos nucleicos que comprenden la secuencia 5'- GPACGPP -3' (SEQ ID NO: 133), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, la mezcla candidato comprende ácidos nucleicos que comprenden la secuencia 5'- GPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A. En algunas realizaciones, cada ácido nucleico es independientemente de aproximadamente 24 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 28 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud o aproximadamente 28 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-bencilcarboxiamida)- 2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N- fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-3,4- metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU), 5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU), 5-(N-3-fenilpropilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU), 5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N- triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU), 5-(N- triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3- trimetilamonio) propil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N- naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-[1-(2,3-dihidroxi propil)]
carboxiamida)-2'-desoxiuridina), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2- naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-
benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-3- benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3- benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'- fluorouridina. En algunas
realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-1- naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-1- naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2- naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-
benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-3- benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3- benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'- fluorouridina. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 es 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU). En algunas realizaciones, una pluralidad de ácidos nucleicos en la mezcla comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo. En algunas realizaciones, una pluralidad de ácidos nucleicos en la mezcla comprende un espaciador de C3, un engarce HEG o un engarce PEG. En algunas realizaciones, la proteína C3 es una proteína C3 humana.
Los objetivos, características y ventajas de la invención que se han expuesto se pondrán de manifiesto a partir de la siguiente descripción detallada, en la que se hace referencia a las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1A y 1B. (A) Se muestran las veinticinco secuencias de aptámero de patrón 1 activas y derivadas independientemente. Se muestra el número de veces que se secuenció aptámero idéntico o equivalente (< 5 diferencias de nucleótido) de la agrupación de la Ronda 9 con respecto a 40.00 secuencias. Se resaltan los nucleótidos idénticos al aptámero secuenciado con más frecuencia del patrón 1, 8491-3_3 dentro de cada secuencia. (B) En las dos filas de arriba se muestra la posición de nucleótido y la secuencia de consenso para el patrón 1 del aptámero. Las filas A, C, G y P (en las que A es adenina, C es citosina y G es guanina, P es un NapdU) indican la frecuencia con la que se observan estos nucleótidos en el patrón 1 de aptámero en cada una de las 23 posiciones de nucleótido que definen las secuencias de consenso. En la secuencia de consenso,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
múltiples consensos de nucleótido se indican con el siguiente código de una sola letra. R = A o G; M = P o C, K = C, G o P; L = A o P; D = C o A; V = A, C o G. Se permite la inserción de una sola base entre las posiciones 8 y 9. La inserción tiene lugar con una frecuencia de 0,16. La frecuencia de "no inserción" fue 0,84.
Figura 2. Muestra una representación gráfica de la fracción de moléculas de ADN unidas (eje de las y) representada en el gráfico en función de la concentración de proteína (eje de las x). La concentración de proteína C3 humana osciló entre 1 x 10-7 M y 1 x 10-12 M y se calcularon las constantes de unión en equilibrio (Kd) aplicando y = máximo - mínimo)(Pt)/(Kd + Pt) + mínimo. Los aptámeros 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58) y 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125) se unieron a C3 con una Kd de 3,13 x 10-11 M, 3,34 x 10-11 M y 5,49 x 10-11 M, respectivamente.
Figura 3. Muestra una representación gráfica de la fracción de moléculas de ADN unidas (eje de las y) representadas en el gráfico en función de la concentración de proteína humana C5 de control(eje de las x). La concentración de proteína C5 osciló entre 1 x 10-7 M y 1 x 10-12 M. No se detectó la unión discernible de 8491- 94_53 (SEQ ID NO: 58) o 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125) con proteína C5 humana.
Figura 4. Las secuencias de patrón 1 inhiben la hemólisis mediada por complemento de glóbulos rojos de oveja revestidos con anticuerpo en suero humano. Se llevaron a cabo los experimentos, tal como se describe en el Ejemplo 3 utilizando proteína C3 humana 25 nM y 1 pM del aptámero indicado. Cada barra despliega la mediana del porcentaje de hemolisis de dos experimentos independientes en relación con el “control sin inhibidor”. El control de la osmolisis presenta el porcentaje de absorbancia relativo a 412 nm cuando se lisan todos los glóbulos rojos. Las barras de error indican el intervalo de los dos experimentos. aptámeros sin unión 8491-94_14 (SEQ ID NO: 35); 8491-94_15 (SEQ ID NO: 36); 8491-398_3 (SEQ ID NO: 30) y 8491-401_3 (SEQ ID NO: 29) inhibieron la lisis en menos de un 25 %. aptámeros de unión una proteína C3 8491-3_3 (SEQ ID NO: 4); 8491- 94_3 (SEQ ID NO: 5); 8491-189_3 (SEQ ID NO: 8); 8491-282_3 (SEQ ID NO: 9); 8491-387_3 (SEQ ID NO: 16); 8491-388_3 (SEQ ID NO: 18); 8491-389_3 (SEQ ID NO: 6); 8491-390_3 (SEQ ID NO: 7); 8491-393_3 (SEQ ID NO: 14); 8491-394_3 (SEQ ID NO: 11); 8491-395_3 (SEQ ID NO: 10); 8491-396_3 (SEQ ID NO: 13); 8491- 397_3 (SEQ ID NO: 12); 8491-399_3 (SEQ ID NO: 27); 8491-400_3 (SEQ ID NO: 24); 8491-405_3 (SEQ ID NO: 17); 8491-406_3 (SEQ ID NO :15) y 8491-409_3 (SEQ ID NO: 28) inhibieron la lisis en más de un 50 %.
Figura 5A y 5B. Inhibición de hemolisis mediada por complemento de glóbulos rojos de oveja revestidos con anticuerpo en suero humano por 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5) y sus derivados. Se llevaron a cabo los experimentos, tal como se describe en el Ejemplo 3, utilizando varias concentraciones de aptámeros, tal como se muestra en la figura, con una concentración fija (20 nM) de proteína C3 humana. Se ajustan los datos a una ecuación logística de 4 parámetros para determinar la IC50. Panel (A) muestra que 8491-94_3 inhibe con una IC50 de 14,8 nM mientras que 8491-94_26 (SEQ ID NO: 54), 8491-94_27 (SEQ ID NO: 55), 8491-94_30 (SEQ ID NO: 60), 8491-94_36 (SEQ ID NO: 66), 8491_94_37 (SEQ ID NO: 67) y 8491-94_43 (SEQ ID NO: 73) inhiben con valores IC50 de 15,1 nM, 24,6 nM, 20,9 nM, 25,0 nM, 24,7 nM y 19,2 nM, respectivamente. Panel (B) muestra que el aptámero, 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58), inhibe con una IC50 de 17,1 nM mientras que los aptámeros 8491- 94_90 (SEQ ID NO: 118), 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125) y 8491-94_100 (SEQ ID NO: 128) inhiben con valores IC50 de 18,9 nM, 15,6 nM y 19,7 nM, respectivamente.
Figura 6. Inhibición de liberación de C3a (en suero humano normal al 34 %) mediante 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58) y 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125) tras la activación con complemento inducida por cimosano-A. Se llevaron a cabo experimentos tal como se describe en el Ejemplo 4. Se ajustan los datos a una ecuación logística de 4 parámetros para determinar los valores IC50 de 2 pM, 1,5 pM y 3 pM para 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58) y 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125), respectivamente.
Figura 7A y 7B. Se digirieron aptámeros 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58), 8491-94_90 (SEQ ID NO: 118), 8491- 94_97 (SEQ ID NO: 125), 8491-94_100 (SEQ ID NO: 128) y 8491-94_102 (SEQ ID NO: 130) (250 nM) a 37 °C durante el número de horas indicado con 0,002 unidades/pl ADNasa I (A) tal como se describe en el Ejemplo 5 y se separaron los productos de digestión por electroforesis con gel de poliacrilamida. Se visualizaron las bandas con oro SYBR. Se muestra el tamaño de los aptámeros de longitud completa (FL) y de marcadores de longitud molecular seleccionados en los que N es el número de nucleósidos. (B) El porcentaje que queda de cada banda de aptámero de longitud completa (SOMAmero) frente al tiempo, tal como se determina por densiometría. El prefijo “OH” indica un término 5' sin modificar.
Figura 8A y 8B. Se digirieron aptámeros 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58), 8491-94_90 (SEQ ID NO: 118), 8491- 94_97 (SEQ ID NO: 125), 8491-94_100 (SEQ ID NO: 128) y 8491-94_102 (SEQ ID NO: 130) a 37 °C durante el número de horas indicado con 0,014 unidades/pl ADNasa II tal como se describe en el Ejemplo 5 y se separaron los productos de digestión por electroforesis con gel de poliacrilamida. Se separaron los productos de digestión por electroforesis con gel de poliacrilamida. Se visualizaron las bandas con oro SYBR. Se muestra el tamaño de los aptámeros de longitud completa (FL) y de marcadores de longitud molecular seleccionados en los que N es el número de nucleósidos. (B) El porcentaje que queda de cada banda de aptámero de longitud completa (SOMAmero) frente al tiempo, tal como se determina por densiometría. El prefijo “OH” indica un término 5' sin modificar.
Figura 9 muestra ciertos ejemplos de pirimidina modificada en C-5 (o modificaciones 5-dU), tal como se explica en el Ejemplo 15. Cada estructura de modificación está unida a dU tal como se muestra, p.ej., en la Figura 10. Figura 10 muestra ciertas modificaciones de pirimidina C-5 y cadena principal, tal como se explica en la sección de los Ejemplos.
Figura 11 muestra ciertos ejemplos de pirimidina modificada (o pirimidina modificada en C-5) que puede ser incorporada en aptámeros, como por ejemplo aptámeros de constante de disociación lenta. La Figura 11 proporciona las definiciones para R', R" y R"'.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Figura 12A y 12B. (A) Inhibición de liberación de C3a en suero humano normal al 10 % mediante SOMAmeros de patrón 1 8491-3_3 (SEQ ID NO: 4), 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-189_3 (SEQ ID NO: 8), 8491-387_3 (SEQ ID NO: 16) y 8491-389_3 (SEQ ID NO: 6) tras la activación del complemento inducida con cimosano-A. La concentración de aptámero fue 2 pM y el experimento fue realizado tal como se describe en el Ejemplo 4. Se presentan los datos como porcentaje de la señal obtenida del control sin inhibidor. (B) Experimento de control que demuestra que 8491-3_3 (SEQ ID NO: 4), (8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-189_3 (SEQ ID NO: 8), 8491- 387_3 (SEQ ID NO: 16) y 8491-389_3 (SEQ ID NO: 6) no interfieren materialmente con el ensayo para la liberación de C3a. Se presentan los datos como el porcentaje de la señal obtenida a partir del control sin inhibidor.
Descripción detallada
I. Términos y Métodos
A no ser que se señale de otra forma, los términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de los términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 87-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada por Blackwell Science Ltd., 1994 (IsBn 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology y Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de la presente divulgación, se proporciona la siguiente explicación de los términos específicos:
aptámero: El término aptámero, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un ácido nucleico de origen no natural que tiene una acción deseable en una molécula diana. Las acciones deseables incluyen, pero sin limitarse a ellas, unión de la diana, inhibición de la actividad de la diana, potenciación de la actividad de la diana, alteración de las propiedades de unión de la diana (como por ejemplo aumento o disminución de la afinidad de la diana para un ligando, receptor, cofactor, etc.), inhibición del procesamiento de la diana (como por ejemplo inhibición de la escisión con proteasa de una proteína diana), potenciación del procesamiento de la diana (como el aumento de la velocidad o el grado de escisión con proteasa de una proteína diana) e inhibición o facilitación de la reacción entre la diana y otra molécula. Un aptámero puede referirse también a un “ligando de ácido nucleico”. En algunas realizaciones, un aptámero es un SOMAmero. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “aptámero” incluye aptámeros y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, a no ser que se indique de otra forma específicamente.
En algunas realizaciones, un aptámero se une específicamente a una molécula diana, en la que la molécula diana es una estructura química tridimensional distinta a un polinucleótido que se une al aptámero a través de un mecanismo que es independiente del apareamiento de bases de Watson/Crick o la formación de triple hélice y en el que el aptámero no es un ácido nucleico que tiene la función fisiológica conocida de unirse a través de la molécula diana. En algunas realizaciones, los aptámeros para una diana determinada incluyen ácidos nucleicos identificados a partir de una mezcla candidato de ácidos nucleicos, según un método que comprende: (a) contacto de la mezcla candidato con la diana, en la que los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad con la diana en relación con otros ácidos nucleicos de la mezcla candidato se pueden dividirse del resto de la mezcla candidato; (b) división de los ácidos nucleicos de mayor afinidad desde el resto de la mezcla candidato y (c) amplificación de los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida con ligando, en virtud de lo cual se identifican los aptámeros para la molécula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son cuestión de grado; sin embargo, en este contexto, un aptámero que se “une específicamente” a su diana significa que el aptámero se une a su diana con un grado de afinidad mucho mayor que con el que se une a otros componentes no diana en la mezcla o la muestra. Un “aptámero” o “ligando de ácido nucleico” es un grupo de copias de un tipo o especie de molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos en particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos. “Aptámeros” se refiere a más de un conjunto de moléculas. Los diferentes aptámeros pueden tener el mismo número de nucleótidos o un número diferente de nucleótidos. Los aptámeros pueden comprender ADN, ARN, tanto ADN como ARN, y versiones modificadas de cualquiera de ellos o ambos y pueden ser monocatenarios, bicatenarios o pueden contener regiones bicatenarias o tricatenarias u otras estructuras tridimensionales.
Bioactividad: El término bioactividad, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a uno o más procesos intercelulares, intracelulares o extracelulares (p.ej., unión célula-célula, unión ligando-receptor, señalización de célula, etc.) que puede tener impacto en los procesos fisiológicos o patofisiológicos.
Pirimidina modificada en C-5: pirimidina modificada en C-5, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una pirimidina con una modificación en la posición C-5. Entre los ejemplos de pirimidina modificada en C-5 se incluyen las descritas en las patentes estadounidenses No.. 5.719.273 y 5.945.527. En el presente documento se proporcionan ciertos ejemplos no exhaustivos de pirimidina modificada en C-5.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Aptámero C3: "aptámero C3", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un aptámero que es capaz de unirse a una proteína C3.
Espaciador C3: A "espaciador C3" o "espaciador de 3 carbonos" o "sustitución C3", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un engarce que comprende al menos tres carbonos diseñados para extenderse la misma distancia que el nucleótido, pero que carecen de una fracción azúcar ribosa y purina o base pirimidina. En algunas realizaciones, un espaciador C3 tiene la estructura (CH2)3, en al que está covalentemente unido con los nucleótidos adyacentes u otras fracciones a través de enlaces fosfodiester o fosforotioato.
Componentes del sistema del complemento: Componentes del sistema del complemento, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere una o más de las proteínas que funcionan en la ruta del complemento y que son capaces de iniciar, activar, promover y/o modular la ruta del complemento. Por lo tanto, en el contexto de un reactivo (p.ej., aptámero), que es capaz de inhibir o inhibir sustancialmente el sistema del complemento como resultado del contacto de una muestra que comprende los componentes del sistema del complemento, el reactivo puede por ejemplo interactuar, unirse y/o interferir con la actividad, unión y/o función de una o más de las proteínas en la ruta del complemento.
Inhibir: El término inhibir, tal como se utiliza en el presente documento, significa reducir la actividad biológica de una diana en un grado en el que la diana pierda una cantidad cuantificable de actividad; o reducir la estabilidad y/o reducir la actividad de una diana hasta un grado en el que la diana deja de tener una actividad cuantificable. En otras realizaciones, dicha inhibición puede producirse porque se afecte la interacción de la diana con otra fracción y/o se afecte el procesamiento de la diana. Tal como se describe en el presente documento, la diana que puede inhibirse es C3.
Modificado: Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "modificar", "modificado", "modificación" y cualquier variación de los mismos, cuando se utilizan para referirse a un oligonucleótido significan que el oligonucleótido comprende al menos una fracción no natural, como por ejemplo al menos una fracción de azúcar no natural, al menos una unión de internucleósido no natural, al menos una fracción de base nucleótido no natural y/o al menos una fracción que no se produce de forma natural en oligonucleótidos (como por ejemplo, un espaciador de 3 carbonos o un hexaetilen glicol (HEG)). En algunas realizaciones, al menos una de las cuatro bases de nucleótido constituyentes (es decir, A, G, T/U y C) del oligonucleótido es un nucleótido modificado. En algunas de dichas realizaciones, el nucleótido modificado comprende una fracción de base que es más hidrófoba que la base de origen natural. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado confiere resistencia a la nucleasa al oligonucleótido. En algunas realizaciones, cuando un aptámero comprende uno o más nucleótidos modificados que comprenden fracciones de base hidrófobas, el aptámero se une a su diana, como por ejemplo una proteína, a través de interacciones predominantemente hidrófobas. En algunas realizaciones, dichas interacciones hidrófobas son el resultado de una alta eficiencia de unión y complejos co-cristalinos estables. Una pirimidina con una sustitución en la posición C-5 es un ejemplo de un nucleótido modificado. Las modificaciones pueden incluir también modificaciones 3' y 5', como por ejemplo sellado. Otras modificaciones pueden incluir sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural, con un análogo, modificaciones de internucleótido como por ejemplo aquellas con uniones sin carga (p.ej., metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y aquellas con uniones cargadas (p.ej., fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos con intercaladores (p.ej., acridina, psoraleno, etc)., aquellas que contienen queladores (p.ej., metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellas que contienen alquilantes y las que tienen lugar con uniones modificadas (p.ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Asimismo, puede reemplazarse cualquier grupo hidroxilo presente normalmente en el azúcar de un nucleótido por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; protegerse mediante grupos protectores normales; o activarse para preparar uniones adicionales con nucleótidos adicionales o con un soporte sólido. Los grupos OH 5' y 3' terminales pueden fosforilarse o sustituirse con aminas, fracciones de grupos de sellado orgánicos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, polímeros de polietilen glicol (PEG), en algunas realizaciones, que oscilan entre aproximadamente 10 y aproximadamente 80 kDa, polímeros PEG, en algunas realizaciones, que oscilan entre aproximadamente 20 y aproximadamente 60 kDa u otros polímeros sintéticos o biológicos hidrófilos o hidrófobos. En una realización, las modificaciones están en la posición C-5 de pirimidinas. Estas modificaciones se pueden producir a través de una unión amida directamente en la posición C5- o a través de otros tipos de uniones.
Los polinucleótidos pueden contener también formas análogas de azúcares de ribosa o desoxirribosa conocidos generalmente en la técnica, incluyendo 2'-O-metilo-, 2'-O-alil, 2'-flúor- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcares carbocíclicos, azúcares a-anoméricos, azúcares epiméricos como azúcares arabinosa, xilosas o lixosas, piranosa, azúcares furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y anicíclicos y análogos de nucleósido abásicos, como ribosida. Tal como se ha señalado anteriormente, puede reemplazarse una o más uniones fosfodiester mediante grupos de unión alternativos. dichos grupos de unión alternativos incluyen realizaciones en las que el fosfato está sustituido por P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o álcali sustituido o sin sustituir (1-20 C) que contiene opcionalmente una unión éter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o aralquilo. No es necesario que todas las uniones de un polinucleótido sean idénticas. La sustitución de las formas análogas de azúcares, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa para diseñar un producto final, como lo pueden ser estructuras de cadena principal alternativas, como una cadena principal de poliamina, por ejemplo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Modulado: Tal como se utiliza en el presente documento, "modulado" significa alterar, ya sea aumentando o disminuyendo el nivel de estabilidad, procesamiento y/o actividad de una diana.
Ácido nucleico: Tal como se utiliza en el presente documento, "ácido nucleico," "oligonucleótido," y "polinucleótido" se emplean indistintamente para referirse a un polímero de nucleótidos e incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN y versiones modificadas de dichas entidades. Los términos "polinucleótido," "oligonucleótido," y "ácido nucleico" incluyen moléculas de mono o doble cadena, así como moléculas triples-helicoidales. El término ácido nucleico incluye aptámeros, pero no se limita a ellos (es decir, el término incluye otros polímeros de nucleótidos.
Nucleasa: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "nucleasa" se refiere a una enzima capaz de escindir un enlace fosfodiester entre subunidades de nucleótido de un oligonucleótido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "endonucleasa" se refiere a una enzima que escinde el (los) enlace(s) fosfodiester en un sitio interno del oligonucleótido. Tal como se utiliza en el presente documento, el término “exonucleasa” se refiere a una enzima que escinde el (los) enlace(s) fosfodiester que unen los nucleótidos del extremo de un oligonucleótido. Los fluidos biológicos contienen normalmente una mezcla tanto de endonucleasas como exonucleasas.
Resistente a nucleasa: Tal como se utiliza en el presente documento, las expresiones "resistente a nucleasa" y "resistencia a nucleasa" se refieren a una menor capacidad de un oligonucleótido para servir como sustrato para una endo-o o exonucleasa, de manera que cuando entra en contacto con dicha enzima, el oligonucleótido o bien no se degrada o se degrada con mayor lentitud o en un menor grado que el oligonucleótido de control de una longitud y secuencia similar pero que carece de una o más modificaciones del oligonucleótido cuya resistencia a la nucleasa se está midiendo.
Nucleótido: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "nucleótido" se refiere a un ribonucleótido o un desoxirribonucleótido o una forma modificada de los mismos. Los nucleótidos incluyen especies que incluyen purinas (p.ej., adenina, hipoxantina, guanina y similares) así como pirimidinas (p.ej., citosina, uracilo, timina y similares). Cuando una base se indica como "A", "C", "G", "U" o "T", se pretende que abarque tanto ribonucleótidos como desoxirribonucleotidos y formas modificadas de los mismos.
Farmacéuticamente aceptable: Farmacéuticamente aceptable, tal como se utiliza en el presente documento, significa aprobado por una agencia reguladora de una administración federal o estatal o enumerada en la Farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en animales y, más en particular, en seres humanos.
Sal farmacéuticamente aceptable: Sal farmacéuticamente aceptable del compuesto (p.ej. aptámero) tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un producto que contiene el compuesto y uno o más átomos o grupos farmacéuticamente aceptables adicionales unidos al compuesto a través de un enlace(s) iónico(s). En algunas realizaciones, una sal farmacéuticamente aceptable se produce por contacto del compuesto con un ácido o una base. Una sal farmacéuticamente aceptable puede incluir, pero sin limitarse a ellas, sales de adición de ácido, incluyendo clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, hidrógeno sulfatos, alquilsulfonatos, arilsulfonatos, arilalquilsulfonatos, acetatos, benzoatos, citratos, maleatos, fumaratos, succinatos, lactatos y tartartos; cationes de metal alcalino como Li, Na, K, sales de metales alcalinotérreos como Mg o Ca o sales de amina orgánica. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "aptámero" incluye aptámeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, a no ser que se indique específicamente de otro modo.
Composición farmacéutica: Composición farmacéutica, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una formulación que comprende un compuesto (como por ejemplo un aptámero) en una forma adecuada para su administración a un individuo. Una composición farmacéutica se formula normalmente para que sea compatible con la ruta de administración pretendida. Entre los ejemplos de rutas de administración se incluyen, pero sin limitarse a ellas, intravitrea, enteral y parenteral, incluyendo, p.ej., inyección o infusión subcutánea, inyección o infusión intravenosa, inyección intra-articular, inyección e infusión intraarterial, inyección e implantación intra-humor acuoso e inyección e implantación intra-vitrea.
Proteína: Tal como se utiliza en el presente documento, "proteína" es se utiliza como sinónimo de "péptido," "polipéptido," o "fragmento de péptido." Un polipéptido, proteína, péptido o fragmento de péptido “purificado” está sustancialmente desprovisto de material celular u otras proteínas contaminantes derivadas de la fuente de células, tejido o fuente desprovista de células desde la que se obtiene la proteína purificada o está sustancialmente desprovisto de precursores químicos y otras sustancias químicas cuando se sintetiza químicamente.
SELEX: El término SELEX, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere generalmente a la selección de ácidos nucleicos que interactúan con una molécula diana de manera deseable por ejemplo por unión con alta afinidad con una proteína; y la amplificación de dichos ácidos nucleicos seleccionados. SELEX puede utilizarse para identificar aptámeros con alta afinidad a una molécula diana específica. El término SELEX y "proceso SELEx " pueden utilizarse indistintamente. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos de selección de aptámeros que se unen a una molécula diana que comprenden: (a) preparación de una mezcla candidato de ácidos nucleicos,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
en la que la mezcla candidato comprende ácidos nucleicos modificados en los que al menos una pirimidina en al menos un ácido nucleico o en cada ácido nucleico de la mezcla candidato está químicamente modificado en la posición C5; (b) contacto de la mezcla candidato con la molécula diana, en la que ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad con la molécula diana en relación con otros ácidos nucleicos de la mezcla candidato se unen a la molécula diana formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) división de los ácidos nucleicos de mayor afinidad desde el resto de la mezcla candidato; y (d) amplificación de los ácidos nucleicos de mayor afinidad para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácido nucleico que son capaces de unirse a la molécula diana con una mayor afinidad, en virtud de lo cual se identifica el aptámero para la molécula diana. En ciertas realizaciones, el método incluye además la realización de un proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta.
Identidad de secuencia: Identidad de secuencia, tal como se utiliza en el presente documento, en el contexto de dos o más secuencias de ácido nucleico es una función del número de posiciones de nucleótido idénticas compartidas por las secuencias (es decir % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones en la más corta de las dos secuencias que se comparan x100), teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco que debe introducirse para optimizar el alineamiento de dos o más secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos o más secuencias puede llevarse a cabo utilizando un algoritmo matemático como los programas BLAST y Gapped BLAST en sus parámetros por defecto (p.ej. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990; véase también BLASTN en

www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para las comparaciones de secuencia, normalmente una secuencia actúa como secuencia de referencia con la que se comparan las secuencias de ensayo. Cuando se utiliza un algoritmo de comparación de secuencias, se introducen las secuencias de ensayo y de referencia en un ordenador, se designan las coordenadas de secuencia, si es necesario, y se designan los parámetros del programa de algoritmos de secuencia. A continuación, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para una secuencia(s) de ensayo en relación con la secuencia de referencia, sobre la base de los parámetros de programa designados. El alineamiento de secuencias óptimo para la comparación puede llevarse a cabo, p.ej. con un algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, 1981, con el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443, 1970, a través del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. Estados Unidos 85:2444, 1988, a través de implementaciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics, Grupo Genetics Computer, 575 Science Dr., Madison, Wis.) o a simple vista (véase de forma general, Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. de Greene Publishing Assoc. y Wiley- Interscience (1987)). Tal como se utiliza en el presente documento, cuando se describe el porcentaje de identidad de un ácido nucleico, como pueda ser un aptámero, cuya secuencia que es idéntica por ejemplo en al menos aproximadamente 95 % con respecto a la secuencia de nucleótido de referencia, se pretende que la secuencia de ácidos nucleicos sea idéntica a la secuencia de referencia salvo que la secuencia de ácidos nucleicos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de ácidos nucleicos de referencia. Dicho de otra forma, para obtener la secuencia de ácidos nucleicos deseada, pueden estar suprimidos o sustituidos hasta un 5 % de los nucleótidos en la secuencia de referencia en la secuencia que es idéntica en aproximadamente un 95 % con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de referencia por otro nucleótido o puede insertarse en la secuencia de referencia una serie de nucleótidos en hasta un 5 % del número total de nucleótidos en la secuencia de referencia (denominado en el presente documento inserción). Estas mutaciones de la secuencia de referencia para generar la secuencia deseada pueden tener lugar en las posiciones terminales 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier lugar entre dichas posiciones terminales, intercalada o individualmente entre nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.
SOMAmero: Tal como se utiliza en el presente documento, un "SOMAmero" o aptámero modificado de constante de disociación lenta se refiere a un aptámero (incluyendo aptámeros que comprenden al menos un nucleótido con una modificación hidrófoba) con una constante de disociación (t1/2) de > 30 minutos, > 60 minutos, > 90 minutos, > 120 minutos, > 150 minutos, > 180 minutos, > 210 minutos o > 240 minutos. En algunas realizaciones, los SOMAmeros se generan utilizando los métodos SELEX mejorados descritos en la patente estadounidense 7.947.447, titulada "Método para generar aptámeros con una mejor Constante de disociación".
Espaciador: Un espaciador, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una molécula(s) pequeña(s) que no es un nucleósido que forma parte de un oligonucleótido modificado y que normalmente ocupa el lugar de un nucleósido en el oligonucleótido modificado. Entre los ejemplos de secuencias de espaciador se incluyen, pero sin limitarse a ellas, polietilen glicoles, cadenas de hidrocarburos (como por ejemplo un espaciador de 3 carbonos) y otros polímeros o copolímeros. En algunas realizaciones, un espaciador proporciona un andamio molecular covalente que conecta dos regiones (como por ejemplo dos regiones de consenso o conservadas) de un aptámero al mismo tiempo que preserva la actividad del aptámero. En ciertos aspectos, la secuencia de espaciador puede estar unida covalentemente a un nucleótido adyacente a través de la posición 3' o 5' de la fracción de azúcar (incluyendo la fracción de azúcar modificada) del nucleótido)
Inhibe(n) sustancialmente: Inhibe(n) sustancialmente, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un bloqueo parcial o completo, por ejemplo, cualquier reducción cuantificable o al menos una inhibición o reducción de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
la actividad o efecto en relación con el control de un 10 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 % o 90 %. En algunas realizaciones, inhibición de la actividad de una diana o un efecto sobre una diana (por ejemplo escisión de la diana) se mide en presencia de un aptámero y el control en condiciones sustancialmente similares en ausencia del aptámero. En algunas realizaciones, la actividad medida es la actividad del sistema del complemento. Las personas especializadas en la técnica podrán apreciar los diferentes ensayos y métodos que se pueden emplear para medir el nivel de actividad y, por tanto, la inhibición del sistema del complemento. Un ejemplo de método que se puede emplear para determinar el grado de inhibición del sistema del complemento incluye cualquier ensayo para determinar la hemolisis mediada por complemento, descrita con mayor detalle en el Ejemplo 3. Otro ejemplo de método incluye la medición del grado de escisión proteolítica de la proteína C3 en C3a y C3b tal como se describe con mayor detalle en el Ejemplo 4.
Diana molecular: Diana molecular (o diana), tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a cualquier compuesto o molécula que tiene una estructura química tridimensional distinta a la de un polinucleótido con la que puede actuar un aptámero en una manera deseable. Entre los ejemplos no exhaustivos de molécula diana se incluyen una proteína, péptido, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, polisacárido, glucoproteína, hormona, receptor, antígeno, anticuerpo, virus, patógeno, sustancia tóxica, sustrato, metabolito, análogo de estado de transición, cofactor, inhibidor, fármaco, colorante, nutriente, factor de crecimiento, célula, tejido, cualquier porción o fragmento de cualquiera de los anteriores, etc., Prácticamente, puede ser una diana adecuada cualquier efector químico o biológico. Pueden servir como dianas moléculas de cualquier tamaño. Se puede modificar también una diana de diferentes maneras para potenciar la probabilidad o intensidad de una interacción entre la diana y el ácido nucleico. Una diana puede incluir asimismo cualquier variación menor de un compuesto o molécula en particular, como por ejemplo en el caso de una proteína, por ejemplo, variaciones menores en su secuencia de aminoácidos, formación de un enlace disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, incluyendo conjugación con un componente marcador que no altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una “molécula diana” o “diana” es un conjunto de copias de un tipo o especie de molécula o estructura multimolecular capaz de unirse a un aptámero. “Moléculas diana” o “dianas” se refieren a más de uno de dichos conjuntos de moléculas.
Cantidad terapéuticamente eficaz: Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa generalmente la cantidad necesaria para mejorar al menos un síntoma de un trastorno o una afección que se previene, reduce o trata tal como se ha descrito en el presente documento. La expresión “cantidad terapéuticamente eficaz” en relación con los aptámeros de la presente divulgación significa la dosis de aptámero que proporciona la respuesta farmacológica específica para la que se administra el aptámero en un número significativo de individuos que necesitan dicho tratamiento. Debe subrayarse que la cantidad terapéuticamente eficaz de un aptámero que se administra a un individuo en particular en un caso concreto no siempre será la eficaz para el tratamiento de las afecciones/enfermedades descritas en el presente documento, aunque dicha dosis se considere como terapéuticamente eficaz entre las personas especializadas en la técnica.
Los artículos “un”, “él/la” en singular incluyen los referentes en plural a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. “Que comprende A o B” significa que incluye A o B o A y B. Asimismo ha de entenderse que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos y todos los pesos moleculares o valores de masa molecular dados para los ácidos nucleicos y polipéptidos son aproximados y se proporcionan con fines descriptivos.
Asimismo, los intervalos proporcionados en el presente documento han de entenderse como una forma abreviada de todos los valores que entran en el intervalo. Por ejemplo, se entiende que un intervalo de 1 a 50 incluye cualquier número, o combinación de números o sub-intervalo del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 (así como fracciones de los mismos, a no ser que el contexto indique claramente lo contrario). Ha de entenderse que cualquier intervalo de concentración, intervalo de porcentaje, intervalo de relaciones o intervalo de números enteros incluye el valor de cualquier número entero dentro del intervalo citado y, cuando sea apropiado, fracciones del mismo (como por ejemplo la décima parte o la centésima parte de un número entero), a no ser que se indique lo contrario. Asimismo, ha de entenderse que cualquier intervalo de números citado en el presente documento en relación con cualquier característica física, como puedan ser subunidades de polímero, tamaño o grosor incluye cualquier número entero dentro del intervalo citado, a no ser que se indique lo contrario. Tal como se utiliza en el presente documento, "aproximadamente" o "que consiste esencialmente en media ± 20 % del intervalo, valor o estructura indicados a no ser que se indique lo contrario. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos “incluye” y “comprende” son abiertos y se utilizan como sinónimos. Debe entenderse que los términos “un” y “uno/a”, tal como se utilizan en el presente documento se refieren a “uno o más” de los componentes enumerados. Ha de entenderse que el uso de la alternativa (p.ej., “o”) significa uno, ambos o cualquier combinación de las alternativas.
A continuación, se describen métodos y materiales, si bien en la práctica o análisis de la presente divulgación es posible utilizar otros métodos o materiales similares o equivalentes a los descritos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las explicaciones de los términos. Por otra parte, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se pretende que sean exhaustivos.
II. Descripción general
La presente invención proporciona aptámeros que se unen específicamente a proteína C3 (a veces se ha referencia a ellos como "aptámeros C3"). En algunas realizaciones, un aptámero inhibe la escisión de proteína C3.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 152), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; cada D es independientemente, y cada vez que aparece, A, C o un espaciador de 3 carbonos; cada V es independientemente, y cada vez que aparece, A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; L es A,
U, T o una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; Y es C, U o T; y n es 0 o 1. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPPM -3' (SEQ ID NO: 153), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a una proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 131), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; cada D es independientemente, y cada vez que aparece, A, C o un espaciador de 3 carbonos; cada V es independientemente, y cada vez que aparece, A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; L es A,
U, T o una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; y n es 0 o 1. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPACGPPM -3' (SEQ ID NO: 135), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPXPAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 154), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; Y es C, U o T; y X es un engarce seleccionado entre un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'-KPGRMPXPAWPSVGPAYRPPM -3' (SEQ ID NO: 155), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a la proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPXPAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 136), en la que K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos; cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; R es A o G; M es C, U, T una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G, C o un espaciador de 3 carbonos; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; y X es un engarce seleccionado entre un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol. En algunas realizaciones, el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPXPAWPSVGPACGPPM-3' (SEQ ID NO: 137), en la que cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos.
En cualquiera de las realizaciones descritas, K puede ser una pirimidina modificada en C-5, C o G; cada M puede ser independientemente, y cada vez que aparece, C o una pirimidina modificada en C-5; y/o L puede ser A o pirimidina modificada en C-5.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- PAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G o C; Y es C, U o T; y R es G o A.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- PAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 134), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; y S es C o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G o C.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a proteína C3, en el que el aptámero comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
% o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 130 y 138 a 151, en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, cada P es NapdU. En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a proteína C3 en el que el aptámero comprende una secuencia que es al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 28, 32 a 34, 37 a 75, 78 a 118, 121 a 130 y 139 a 151, en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, cada P es NapdU.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3, en el que el aptámero comprende una primera región y una segunda región, en la que la primera región comprende la secuencia 5'- PAGPC-3' (SEQ ID NO: 132) y la segunda región comprende la secuencia 5'-GPAYRPP-3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A. En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a proteína C3, en el que el aptámero comprende una primera región y una segunda región, en la que la primera región comprende la secuencia 5'- PAGPC -3' (SEQ ID NO: 132) y la segunda región comprende la secuencia 5'-GPACGPP -3' (SEQ ID NO: 133), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
En algunas realizaciones, el extremo 3' de la primera región está covalentemente unido al extremo 5' de la segunda región. En algunas realizaciones, la primera región y la segunda región están unidas covalentemente mediante al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco engarces, en la que cada engarce se selecciona independientemente entre un nucleótido, un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol. En algunas realizaciones, se selecciona cada engarce independientemente entre un nucleótido, un espaciador de 3 carbonos y un hexaetilen glicol.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- PAGPC -3' (SEQ ID NO: 132), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- GPACgPp -3' (SEQ ID NO: 133), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une una proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia 5'- GPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A.
En algunas realizaciones, se proporciona un aptámero que se une a proteína C3, en el que el aptámero comprende la secuencia de SEQ ID NO: 125, en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5. En algunas realizaciones, cada P es NapdU.
En algunas realizaciones de los aptámeros descritos en el presente documento, cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N- bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (PEdU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (iBudU), 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)- 2'-desoxiuridina (MBndU), 5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU), 5-(N-3- fenilpropilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU), 5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU), 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'- desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)- 2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-
desoxiuridina), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O- metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU),
5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-
benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-
benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N- 3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-1-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-
naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)- 2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'- fluorouridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)- 2'-O-metiluridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
2'-fluorouridina. En algunas realizaciones, cada pirimidina modificada en C-5 es 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'- desoxiuridina (NapdU).
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero puede comprender al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo.
En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero puede ser de aproximadamente 24 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 28 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud o aproximadamente 28 nucleótidos de longitud. En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero puede ser de 24 a 100 nucleótidos de longitud o de 30 a 60 nucleótidos de longitud o de 28 a 60 nucleótidos de longitud o de 28 a 50 nucleótidos de longitud o de 28 a 40 nucleótidos de longitud o de 40 a 50 nucleótidos de longitud o de 28 a 32 nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, un aptámero descrito en el presente documento se une una proteína C3 e inhibe la escisión de proteína C3. En algunas realizaciones, la proteína C3 es proteína C3 humana.
En algunas realizaciones, el aptámero C3 puede incluir hasta aproximadamente 100 nucleótidos, hasta aproximadamente 95 nucleótidos, hasta aproximadamente 90 nucleótidos, hasta aproximadamente 85 nucleótidos, hasta aproximadamente 80 nucleótidos, hasta aproximadamente 75 nucleótidos, hasta aproximadamente 70 nucleótidos, hasta aproximadamente 65 nucleótidos, hasta aproximadamente 60 nucleótidos, hasta aproximadamente 55 nucleótidos, hasta aproximadamente 50 nucleótidos, hasta aproximadamente 45 nucleótidos, hasta aproximadamente 40 nucleótidos, hasta aproximadamente 35 nucleótidos, hasta aproximadamente 30 nucleótidos, hasta aproximadamente 25 nucleótidos o hasta aproximadamente 20 nucleótidos. En algunas realizaciones, el aptámero C3 puede consistir en hasta 100 nucleótidos, hasta 95 nucleótidos, hasta 90 nucleótidos, hasta 85 nucleótidos, hasta 80 nucleótidos, hasta 75 nucleótidos, hasta 70 nucleótidos, hasta 65 nucleótidos, hasta 60 nucleótidos, hasta 55 nucleótidos, hasta 50 nucleótidos, hasta 45 nucleótidos, hasta 40 nucleótidos, hasta 35 nucleótidos, hasta 30 nucleótidos, hasta 25 nucleótidos o hasta 20 nucleótidos.
En otro aspecto de la presente divulgación, el aptámero C3 puede ser al menos 99 % idéntico, al menos 95 % idéntico, al menos 90 % idéntico, al menos 85 % idéntico, al menos 80 % idéntico o al menos 75 % idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO: 4 a 151. En otro aspecto de la presente divulgación, el aptámero C3 puede ser al menos 95 % idéntico, al menos 90 % idéntico, al menos 85 % idéntico, al menos 80 % idéntico o al menos 75 % idéntico a cualquiera de las SEQ ID NO: SEQ ID NO: 4 a 28, 32 a 34, 37 a 75, 78 a 118, 121 a 130 y 139 a 151. En algunas realizaciones, un aptámero que se une a C3 es 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntico a una secuencia seleccionada entre las SeQ ID NO: SEQ ID NO: 4 a 28, 32 a 34, 37 a 75, 78 a 118, 121 a 130 y 139 a 151. En un aspecto relacionado, los fragmentos de las mismas son de 25 a 49 nucleótidos de longitud (o de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud a 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud). En algunas realizaciones, un aptámero que se une a C3 es de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 o 49 nucleótidos de longitud.
En otro aspecto de la presente divulgación, el aptámero C3 puede tener una constante de disociación (Kd) para C3 de aproximadamente 10 nM o menos. En otra realización ilustrativa, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 de aproximadamente 15 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 de aproximadamente 20 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 de
aproximadamente 25 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de
disociación (Kd) para la proteína C3 de aproximadamente 30 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 de aproximadamente 35 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 de
aproximadamente 40 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de
disociación (Kd) para la proteína C3 de aproximadamente 45 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 de aproximadamente 50 nM o menos. En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 en un intervalo de aproximadamente 2pM a aproximadamente 10 nM (o 2pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM, 35 pM, 40 pM, 45 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 150 pM, 200 pM, 250 pM, 300 pM, 350 pM, 400 pM, 450 pM, 500 pM, 550 pM, 600 pM, 650 pM, 700 pM, 750 pM, 800 pM, 850 pM, 900 pM, 950 pM, 1000 pM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM o 10 nM). En otra realización ilustrativa más, el aptámero C3 tiene una constante de disociación (Kd) para la proteína C3 en el intervalo de al menos 2pM (o al menos 2pM, 3 pM, 4 pM, 5 pM, 6 pM, 7 pM, 8 pM, 9 pM, 10 pM, 15 pM, 20 pM, 25 pM, 30 pM, 35 pM, 40 pM, 45 pM, 50 pM, 60 pM, 70 pM, 80 pM, 90 pM, 100 pM, 150 pM, 200 pM, 250 pM, 300 pM, 350 pM, 400 pM, 450 pM, 500 pM, 550 pM, 600 pM, 650 pM, 700 pM, 750 pM, 800 pM, 850 pM, 900 pM, 950 pM, 1000 pM, 2 nM, 3 nM, 4 nM, 5 nM, 6 nM, 7 nM, 8 nM, 9 nM o 10 nM). Se puede determinar una constante de disociación adecuada a través de un ensayo de unión utilizando una titulación de varios puntos y aplicando la ecuación y = (max - min)(Proteína)/( Kd +Proteína) + min tal como se describe en el Ejemplo 2. Ha de entenderse que la determinación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
de las constantes de disociación depende en gran medida de las condiciones en las que se miden y por lo tanto, estos números pueden variar significativamente según factores como tiempo de equilibrio, etc., En cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento, el aptámero, molécula de ácido nucleico comprende nucleótidos de ADN, ARN o una combinación de los mismos.
SELEX
SELEX incluye generalmente la preparación de una mezcla candidato de ácidos nucleicos, la unión de la mezcla candidato a la molécula diana deseada para formar un complejo de afinidad, la separación de los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos sin unir, separación y aislamiento del ácido nucleico desde el complejo de afinidad, purificación del ácido nucleico e identificación de la secuencia de aptámeros específica. El proceso puede incluir varias rondas para refinar aún más la afinidad del aptámero seleccionado. El proceso puede incluir etapas de amplificación en uno o más puntos de este proceso. Véase, p.ej., la patente estadounidense No. 5.475.096, titulada "Ligandos de ácido nucleico". Puede utilizarse el proceso SeLeX para generar un aptámero que se une covalentemente a su diana, así como un aptámero que no se une covalentemente a su diana. Véase, p.ej., patente estadounidense No. 5.705.337 titulada “Evolución sistemática de ligandos de ácido nucleico por enriquecimiento exponencial: Chemi-SELEX”.
Puede utilizarse el proceso SELEX para identificar aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren mejores características al aptámero, como por ejemplo una mejor estabilidad in vivo o mejores características de administración. Entre los ejemplos de dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en las posiciones de base y/o ribosa y/o fosfato. Los aptámeros identificados a través de un proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la patente estadounidense No. 5.660.985, titulada "Ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados” que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótido químicamente modificados en las posiciones 5'- y 2'- de pirimidinas. La patente estadounidense No. 5.580.737, consúltese lo anterior, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH2), 2'-flúor (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). Véase también la publicación de solicitud de patente estadounidense 20090098549, titulada "SELEX y FOTOSELEX", que describe bibliotecas de ácidos nucleicos que tienen propiedades físicas y químicas expandidas y su uso en SELEX y FotoSELEX.
Asimismo, puede utilizarse SELEX para identificar aptámeros que tienen las características de constante de disociación deseadas. Véase la publicación de solicitud de patente estadounidense 20090004667, titulada "Método para generar aptámeros con mejores constantes de disociación", que describe métodos SELEX mejorados para generar aptámeros que pueden unirse a moléculas diana. Tal como se ha mencionado, dichos aptámeros de constante de disociación baja son conocidos como “SOMAmeros”. Se describen métodos para producir aptámeros o SOMAmeros y fotoaptámeros o SOMAmeros que tienen constantes de disociación más bajas desde sus moléculas diana correspondientes. Los métodos implican el contacto de la mezcla candidato con la molécula diana, permitir que tenga lugar la formación de complejos ácido nucleico-diana y realizar un proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta en el que se disociarán los complejos de ácido nucleico-diana con constantes de disociación rápida y no se volverán a formar, al mismo tiempo que los complejos con constantes de disociación lenta permanecerán intactos. Asimismo, los métodos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas de ácidos nucleicos candidato para generar aptámeros o SOMAmeros con un mejor comportamiento de disociación.
Una variación de este ensayo emplea aptámeros que incluyen grupos funcionales fotorreactivos que permiten la unión covalente de aptámeros o “fotorreticulación” con sus moléculas diana. Véase, p.ej., Patente estadounidense No. 6.544.776 titulada "Biochip de diagnóstico de ligando de ácido nucleico”. Puede hacerse referencia a estos aptámeros fotorreactivos también como fotoaptámeros. Véase, p.ej., patente estadounidense No. 5.763,.77, patente estadounidense No. 6.001.577 y patente estadounidense No. 6.291.184, tituladas cada una de ellas "Evolución sistemática de ligandos de ácido nucleico por enriquecimiento exponencial: Fotoseleccion de ligandos de ácido nucleico y solución SELEX”. Véase también p.ej., patente estadounidense No. 6.458.539, titulada "Fotoselección de ligandos de ácido nucleico”. Una vez que se pone en contacto la micromatriz con la muestra y que los fotoaptámeros han tenido la oportunidad de unirse a sus moléculas diana, se fotoactivan los fotoaptámeros y se lava el soporte sólido para eliminar cualquier molécula que no se haya unido específicamente. Es posible utilizar condiciones de lavado rigurosas, ya que por lo general las moléculas diana que se unen a los fotoaptámeros no se eliminan debido a los enlaces covalentes creados por el (los) grupo(s) funcional(es) fotoactivado(s) en los fotoaptámeros.
En estos dos formatos de ensayo, se inmovilizan los aptámeros o SOMAmeros en el soporte sólido antes de ponerlos en contacto con la muestra. En estas circunstancias, sin embargo, es posible que la inmovilización de los aptámeros o SOMAmeros antes del contacto con la muestra no proporcione un ensayo óptimo. Por ejemplo, la preinmovilización de los aptámeros o SOMAmeros puede tener como resultado un mezclado deficiente de los aptámeros o SOMAmeros con las moléculas diana en la superficie del soporte sólido, que quizá conduzca a períodos de reacción prolongados y, por lo tanto, a extensos períodos de incubación para dar cabida a la unión de los aptámeros o SOMAmeros a sus moléculas diana. Por otra parte, cuando se emplean fotoaptámeros o fotoSOMAmeros en el ensayo, y dependiendo del material utilizado como soporte sólido, el soporte sólido puede
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
tender a dispersar o absorber la luz utilizada para llevar a efecto la formación de enlaces covalentes entre los fotoaptámeros o fotoSOMAmeros y sus moléculas diana. Además, dependiendo del método empleado, la detección de las moléculas diana unidas a sus aptámeros o fotoSOMAmeros puede ser susceptible de imprecisión, ya que puede que la superficie del soporte sólido quede expuesta o afectada por cualquiera de los agentes marcadores utilizados. Finalmente, la inmovilización de los aptámeros o SOMAmeros en el soporte sólido implica generalmente una etapa de preparación de aptámero o SOMAmero (es decir, inmovilización) antes de la exposición de los aptámeros o SOMAmeros a la muestra y esta etapa de preparación puede afectar a la actividad o funcionalidad de los aptámeros o SOMAmeros.
Se han descrito también ensayos de SOMAmero que permiten que el SOMAmero capture su diana en solución y que emplean después etapas de separación destinadas a eliminar los componentes específicos de la mezcla SOMAmero-diana antes de la detección (véase, la publicación de solicitud de patente estadounidense 20090042206, titulada "Análisis multiplexados de muestras de ensayo”). Los métodos de ensayo de SOMAmero descritos permiten la detección y cuantificación de una diana que no es ácido nucleico (p.ej., una diana proteína) en una muestra de ensayo detectando y cuantificando un ácido nucleico (es decir, SOMAmero). Los métodos descritos crean un ácido nucleico sustituto (es decir, el SOMAmero) para detectar y cuantificar una diana que no es ácido nucleico, permitiendo así la aplicación de una amplia gama de tecnologías de ácido nucleico para una gama más amplia de dianas deseadas, incluyendo dianas de proteína.
Las realizaciones del proceso SELEX en el que la diana es un péptido se describen en la patente estadounidense No. 6.376.190, titulada "Procesos SELEX modificados sin proteína purificada." En este caso, la diana es la proteína C3.
Proteína componente 3 (C3) del complemento
Se purificó la proteína C3 circulante humana nativa utilizada en el proceso SELEX desde la sangre y obtenida de Quidel® Corporation, San Diego, California (número de catálogo a401). Para los estudios de unión y actividad, se utilizó la proteína C3 nativa circulante de Quidel como proteína C3 humana circulante obtenida de COMPLEMENT TECHNOLOGY, Inc., Tiler, Texas (número de catálogo A113).
Modificaciones químicas en aptámeros
Los aptámeros pueden contener nucleótidos modificados que mejoran las propiedades y características. Entre los ejemplos no exhaustivos de dichas mejores se incluyen estabilidad in vivo, estabilidad frente a la degradación, afinidad de unión para su diana y/o mejores características de administración.
Entre los ejemplos de dichas modificaciones se incluyen sustituciones químicas en las posiciones de base y/o ribosa y/o fosfato de un nucleótido. Los aptámeros identificados a través del proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describen en la patente estadounidense No. 5.660.985, titulada "Ligandos de ácido nucleico de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados”, que describe oligonucleótidos que contienen derivados de nucleótido químicamente modificados en las posiciones 5' y 2' de pirimidinas. La patente estadounidense No. 5.580.737, consúltese lo anterior, describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino(2'-NH2), 2'-flúor (2'-F), y/o 2'-O-metilo (2'-OMe). Véase también, publicación de solicitud de patente estadounidense No. 20090098549, titulada "SELEX y FOTOSELEX," que describe bibliotecas de ácidos nucleicos que tienen propiedades físicas y químicas expandidas y su uso en SELEX y fotoSELEX.
Entre los ejemplos específicos de modificación en C-5 se incluyen sustitución de desoxiuridina en la posición C-5 con un sustituyente seleccionado independientemente entre bencilcarboxiamida (alternativamente bencilaminocarbonilo) (Bn), naftilmetilcarboxiamida (alternativamente, naftilmetilaminocarbonilo) (Nap), triptaminocarboxiamida (alternativamente, triptaminocarbonilo) (Trp) y isobutilcarboxiamida (alternativamente,
imagen1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Las modificaciones químicas de una pirimidina modificada en C-5 también se combinan con modificaciones de azúcar en la posición 2’ simples o en cualquier combinación, modificaciones en aminas exocíclicas y sustituciones de 4-tiouridina, y similares.
Entre las pirimidinas modificadas de C-5 representativas se incluyen: 5-(N-bencilcarboxiamida)- 2’-desoxiuridina (BndU), 5-(Nbencilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2’- desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2’-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-
triptaminocarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2’-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3- trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NapdU), 5-(N- naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-fluorouridina o 5-(N-[1-(2,3- dihidroxipropil)]carboxiamida)-2’-desoxiuridina).
En algunas realizaciones, cada X, Y, y/o Z se selecciona independientemente entre 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’- desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N- fenetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (PedU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (ThdU), 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2’-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-
triptaminocarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2’-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3- trimetilamonio) propil]carboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NapdU), 5-(N- naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-fluorouridina y 5-(N-[1 -(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2’-desoxiuridina). En algunas realizaciones, cada Z es 5-(N-bencilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (BndU).
Si está presente, puede impartirse una modificación de la estructura de nucleótido antes o después del ensamblaje del polinucleótido. Una secuencia de nucleótidos puede interrumpirse también con componentes que no son nucleótido. Un polinucleótido puede modificarse además tras la polimerización, como por ejemplo conjugación con un componente marcador.
Asimismo, los nucleótidos de pirimidina modificada en C-5 incluyen lo siguiente:
imagen2
En algunas realizaciones, el nucleótido modificado confiere resistencia a la nucleasa al oligonucleótido. Una pirimidina con una sustitución en la posición C-5 es un ejemplo de nucleótido modificado. Las modificaciones pueden incluir modificaciones de la cadena principal, metilaciones, combinaciones de apareamiento de bases inhabituales, como por ejemplo, isobases isocitidina e isoguanidina y similares. Las modificaciones pueden incluir también modificaciones 3’ y 5’ como sellado. Otras modificaciones pueden incluir sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones de internucleótido, como por ejemplo aquellas que tienen lugar uniones sin carga (p.ej. metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y las que tienen lugar con uniones con carga (p.ej. , fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que tienen lugar con intercaladores (p.ej., acridina, psoraleno, etc.), las que contienen queladores (p.ej., metales, metales radioactivos, boro, metales oxidantes, etc.), las que contienen alquilantes y las que tienen lugar con uniones modificadas (p.ej., ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Asimismo, puede remplazarse cualquiera de los grupos hidroxilo presentes habitualmente en el azúcar de un nucleótido por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; protegerse con grupos protectores convencionales o activarse para preparar uniones adicionales para nucleótidos adicionales o para un soporte sólido. Los grupos OH terminales 5’ y 3’ pueden fosforilarse o sustituirse con aminas, fracciones de un grupo de sellado orgánico de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, polímeros de polietilen glicol (PEG) en
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
una realización en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 kDa, polímeros PEG en otra realización en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 60 kDa u otros polímeros sintéticos o biológicos hidrófilos o hidrófobos. En una realización, las modificaciones son en la posición C-5 de pirimidinas. Dichas modificaciones pueden producirse a través de una unión amida directamente en la posición C-5 o a través de otros tipos de uniones.
Los polinucleótidos pueden contener asimismo formas análogas de azúcares ribosa o desoxirribosa conocidos generalmente en la especialidad, incluyendo 2'-O-metilo-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos, azúcares, a-anoméricos, azúcares epiméricos como arabinosa, xilosas o lixosas, azúcares de piranosa, azúcares de furanosa, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósico abásicos, como metil ribosida. Tal como se ha señalado, puede reemplazarse una o más uniones fosfodiester por grupos de unión alternativos. Dichos grupos de unión alternativos incluyen realizaciones en las que el fosfato está reemplazado por P(0)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato"), P(0)R, P(0)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que R o R' es independientemente H o alquilo sustituido o sin sustituir (1-20 C) que contiene opcionalmente una unión éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo y, cicloalquenilo o aralquilo. No todas las uniones en un polinucleótido han de ser idénticas. La sustitución de formas análogas de azúcares, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa para diseñar un producto final, al igual que estructuras de cadena principal alternativas como la cadena principal de poliamida, por ejemplo.
La presente divulgación proporciona además una formulación que comprende dos o más secuencias de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4-130 y 138-151, en las que P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
En otro aspecto, la pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre: 5-(N-bencilcarboxiamida)- 2'- desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N- fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU), 5-(N-tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N- isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N-tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-3,4- metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU), 5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU), 5-(N-3-fenilpropilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU), 5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N- triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(N-R-treoninilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (ThrdU), 5-(N- triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2’-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3- trimetilamonio)propil] carboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’- desoxiuridina (NapdU), 5-(N- naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]
carboxiamida)-2’-desoxiuridina), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2- naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-3-
benzofuraniletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-3- benzofuraniletilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3- benzotiofeniletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2’- fluorouridina.
En otro aspecto, la pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre:
5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-1-naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N- 1-naftilmetilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-
naftilmetilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2’- fluorouridina, 5-(N-1- naftiletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NEdU), 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-1-
naftiletilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-
naftiletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2’- fluorouridina, 5-(N-3-
benzofuraniletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina, 5- (N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2’-fluorouridina, 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2’-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2’-fluorouridina.
En otro aspecto, la pirimidina modificada en C-5 es 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina (NapdU).
En otro aspecto, las dos o más moléculas de ácido nucleico de la formulación comprenden además al menos una modificación adicional seleccionada del grupo que consiste en nucleótido modificado con 2’-O-metilo, espaciador C3 y una combinación de los mismos.
En otro aspecto, las dos o más moléculas de ácido nucleico de la formulación comprenden además al menos una posición de nucleótido sustituida con un engarce HEG o un engarce PEG y/o que comprende además un engarce EG o un engarce PEG.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En otro aspecto, las dos o más moléculas de ácido nucleico de la formulación son cada una de ellas independientemente de aproximadamente 24 a aproximadamente 100 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 30 a aproximadamente 60 nucleótidos de longitud o de aproximadamente 40 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud; o comprenden además al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 nucleótidos adicionales.
En otro aspecto, la proteína de componente 3 (C3) del complemento es una proteína de componente 3 (C3) del complemento humana.
Composiciones farmacéuticas que comprenden aptámeros
En algunas realizaciones, se proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable. En "Remington: The Science y Practice of Pharmacy, 21a edición," publicada por Lippincott Williams & Wilkins se describen vehículos adecuados.
Las composiciones farmacéuticas que incluyen al menos un aptámero descritas en el presente documento y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden incluir también uno o más agentes activos que no son un inhibidor C3.
Los aptámeros descritos en el presente documento pueden utilizarse en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable, incluyendo, pero sin limitarse a ellas, formas farmacéuticas inyectables, dispersiones líquidas, geles, aerosoles, pomadas, cremas, formulaciones liofilizadas, polvos deshidratados, comprimidos, cápsulas, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de fundido rápido, formulaciones de liberación sostenida, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación intermitente, formulaciones de liberación controlada y de liberación inmediata mixtas, etc. Concretamente, los aptómeros descritos en el presente documento pueden formularse: (a) para administración seleccionada entre administración intravítrea, oral, pulmonar, intravenosa, intraarterial, intratecal, intra-articular, rectal, oftálmica, colónica, parenteral, intracisternal, intravaginal, intraperitoneal, local, bucal, nasal y tópica; (b) en una forma farmacéutica seleccionada entre cualquiera entre dispersiones líquidas, geles, aerosoles, pomadas, cremas, comprimidos, sobrecitos y cápsulas; (c) en una forma farmacéutica seleccionada entre formulaciones liofilizadas, polvos deshidratados, formulaciones de fundido rápido, formulaciones de liberación controlada, formulaciones de liberación sostenida, formulaciones de liberación prolongada, formulaciones de liberación intermitente y formulaciones mixtas de liberación controlada y liberación inmediata; o (d) cualquier combinación de ellas.
Las soluciones o suspensiones utilizadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden comprender uno o más de los siguientes componentes: (1) un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol y otros disolventes sintéticos; (2) agentes antibacterianos como alcohol bencílico o metil parabenos; (3) antioxidantes como ácido ascórbico o bisulfito sódico; (4) agentes quelantes como ácido etilendiaminotetraacético; (5) tampones como acetatos, citratos y fosfatos; y (6) agentes para ajustar la tonicidad como cloruro sódico o dextrosa. Puede ajustarse el pH con ácidos o bases, como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. Se puede encerrar una preparación parenteral en ampollas, jeringuillas desechables o viales multidosis fabricados de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable pueden incluir soluciones acuosas estériles (cuando son hidrosolubles) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición deberá ser estéril y deberá ser fluida en un grado en el que se pueda administrar con jeringuilla. La composición farmacéutica deberá ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y deberá conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, como bacterias y hongos.
El término “estable”, tal como se utiliza en el presente documento significa que permanece en un estado o condiciones en las que es adecuado para su administración a un sujeto.
El vehículo puede ser un medio disolvente o de dispersión, incluyendo por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilen glicol, y polietilen líquido, y similares) y mezclas adecuados de los mismos, La fluidez apropiada puede mantenerse por ejemplo utilizando un revestimiento, como por ejemplo lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismo puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y anti-fúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferente incluir agentes isotónicos, como por ejemplo azúcares, polialcoholes como manitol o sorbitol y sales inorgánicas como cloruro sódico, en la composición. La absorción prolongada de composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el reactivo activo (p.ej., un aptámero) en una cantidad apropiada en un disolvente apropiado, con uno o una combinación de los ingredientes enumerados, según se desee, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando al menos un aptámero en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y cualquier otro ingrediente deseado. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, entre los ejemplos de métodos para la preparación se incluyen secado al vacío y liofilización, que producirán ambos un polvo de un aptámero junto con cualquier otro ingrediente adicional deseado a partir de una solución filtrada para su esterilización previa.
En algunas realizaciones, se formula un aptámero para inyección intravítrea. En "Remington: The Science y Practice of Pharmacy, 21a edición" publicado por Lippincott Williams & Wilkins se describen formulaciones adecuadas para administración intravítrea, por ejemplo en Rawas-Qalaji et al. (2012) Curr. Eye Res. 37: 345; Bochot et al. (2012) J. Control Release 161:628; Yasukawa et al. (2011) Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 5: 1; y Doshi et al. (2011) Semin. Ophthalmol. 26: 104 se explica la administración de fármaco ocular. En algunas realizaciones, se administra una composición farmacéutica que comprende un aptámero por inyección intravítrea una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez cada cinco semanas, una vez cada seis semanas, una vez cada siete semanas, una vez cada ocho semanas, una vez cada nueve semanas, una vez cada 10 semanas, una vez cada 11 semanas, una vez cada 12 semanas o menos, frecuentemente una vez cada 12 semanas.
Las composiciones orales incluyen generalmente un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar por ejemplo en cápsulas de gelatina o comprimirse para formar comprimidos. Para los fines de una administración terapéutica oral, pueden incorporarse en el aptámero excipientes y utilizarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales pueden prepararse también utilizando un vehículo fluido para su uso como enjuague bucal, aplicándose el compuesto en el vehículo fluido oralmente por enjuague, expectoración o tragándolo. Los agentes de unión y/o materiales adyuvantes farmacéuticamente compatibles pueden incluirse como parte de la composición.
Para administración por inhalación, se administran los compuestos en forma de un pulverizador de aerosol desde un envase presurizado o dispensador que contiene un propelente adecuado, p.ej., un gas como pueda ser dióxido de carbono, un líquido nebulizado o un polvo seco desde un dispositivo adecuado. Para administración transmucosa o transdérmica, se utilizan agentes de penetración de barrera apropiados en la formulación. Dichos agentes de penetración son conocidos de forma general en la especialidad e incluyen por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa puede llevarse a cabo a través del uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, se formulan los reactivos activos en pomadas, geles o cremas, tal como se conoce de forma general en la especialidad. Pueden prepararse los reactivos en forma de supositorios (p.ej., con bases para supositorio convencionales, como mantequilla de cacao u otros glicéridos) o enemas de retención para administración rectal.
En algunas realizaciones, se prepara un aptámero con un vehículo que lo protege contra la rápida eliminación desde el organismo. Por ejemplo, puede utilizarse una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulada. Pueden utilizarse polímeros biodegradables, biocompatibles, como vinil acetato de etileno, polianhídridos, poliácido glicólico, colágeno, poliortoésteres y poliácido láctico. Los métodos de preparación de dichas formulaciones serán evidentes para las personas especializadas en la técnica. Asimismo, es posible obtener los materiales de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc.
Como vehículos farmacéuticamente aceptables, pueden utilizarse también suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales). Éstos se preparan de acuerdo con los métodos conocidos entre las personas especializadas en la técnica, como por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense No. 4.522.811.
Por otra parte, pueden prepararse suspensiones de un aptámero, como puedan ser suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Entre los disolventes o vehículos lipófilos adecuados se incluyen ácidos grasos, como aceite de sésamo o ésteres de ácido graso sintéticos, como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Pueden utilizarse asimismo polímeros amino policatiónicos que no son lípidos para la administración. Opcionalmente, la suspensión puede incluir también agentes o estabilizantes adecuados para aumentar la solubilidad de los compuestos y dar cabida a la preparación de soluciones muy concentradas.
En algunos casos, puede ser especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en formas de dosis unitaria para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. Forma de dosis unitaria, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades físicamente separadas adecuadas como dosis unitarias para el sujeto en tratamiento, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de un aptámero calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación de las formas de dosis unitaria de aptámeros que se describe en el presente documento está dictada y depende directamente de las características de un aptámero en particular y el efecto terapéutico en particular que se vaya a conseguir, así como las limitaciones inherentes propias de la especialidad de composición, tales como el agente
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
activo para el tratamiento de individuos.
Las composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un aptámero pueden incluir uno o más excipientes farmacéuticos. Entre los ejemplos de dichos excipientes se incluyen pero sin limitarse a ellos, agentes aglutinantes, agentes de carga, agentes lubricantes, agentes de suspensión, edulcorantes, agentes aromatizantes, conservantes, tampones, agentes de humectación, disgregantes, agentes efervescentes y otros excipientes. Dichos excipientes son conocidos en la especialidad. Entre los ejemplos de excipie3ntes se incluyen: (1) agentes aglutinantes, que incluyen diversas celulosas, polivinil pirrolidona reticulada, celulosa microcristalina como Avicel PH101 y Avicel PHI 02, celulosa microcristalina silicificada (ProSolv SMCC™), goma de tragacanto y gelatina; (2) agentes de carga como diversos almidones, lactosa, monohidrato de lactosa y lactosa anhidra; (3) agentes disgregantes como ácido algínico, Primogel, almidón de maíz, polivinil pirrolidona ligeramente reticulada, almidón de patata, almidón de maíz y almidones modificados, croscarmelosa sódica, cross-povidona, glicolato de almidón sódico y mezclas de los mismos; (4) lubricantes, incluyendo agentes que actúan en la fluidez de un polvo que se va a comprimir y que incluyen estearato de magnesio, dióxido de sílice coloidal, como Aerosil 200, talco, ácido esteárico, estearato de calcio y gel de sílice; (5) deslizantes como dióxido de sílice coloidal; (6) conservantes, como sorbato potásico, metilparabeno, propil parabeno, ácido benzoico y sus sales, otros sales de ácido parahidroxibenzoico, como butilparabeno, alcoholes como alcohol etílico o bencílico, compuestos fenólicos como fenol y compuestos cuaternario como cloruro de benzalconio; (7) diluyentes como cargas inertes farmacéuticamente aceptables como celulosa microcristalina, lactosa, fosfato cálcico dibásico, sacáridos y/o mezclas de cualquiera de los enumerados; entre los ejemplos de diluyentes se incluyen celulosa microcristalina, como Avicel PH101 y Avicel PHI 02; lactosa como monohidrato de lactosa, lactosa anhidra y Pharmatose DCL21 ; fosfato cálcico dibásico, como Emcompress; manitol, almidón; sorbitol; sacarosa y glucosa; (8) agentes edulcorantes, incluyendo cualquier edulcorante natural o artificial, como sacarosa, sacarosa de sacarina, xilitol, sacarina sódico, ciclamato, aspartamo y acesulfamo; (9) agentes aromatizantes como pipermint, salicilato de metilo, aroma de naranja, Magnasweet (nombre comercial MAFCO), sabor de goma de mascar, aromas de fruta, y similares; y (10) agentes efervescentes, incluyendo pares efervescentes como ácido orgánico y un carbonato o bicarbonato. Entre los ácidos orgánicos adecuados se incluyen por ejemplo ácidos cítrico, tartárico, málico, fumárico, adípico, succínico y algínicos y anhídridos y sales de ácido. Entre los carbonatos y bicarbonatos adecuados se incluyen por ejemplo carbonato sódico, bicarbonato sódico, carbonato potásico, bicarbonato potásico, carbonato de magnesio, carbonato de glicina sódica, carbonato de L-lisina y carbonato de arginina. Alternativamente, puede estar presente solamente el componente de bicarbonato sódico en el par efervescente.
En varias realizaciones, las formulaciones descritas en el presente documento son sustancialmente puras. Tal como se utiliza en el presente documento, “sustancialmente puro” significa que el principio activo (p.ej., un aptámero) es la especie presente predominante (es decir, sobre una base molar, es más abundante que las demás especies individuales en la composición. En algunas realizaciones, la fracción sustancialmente purificada es una composición en la que el principio activo comprende al menos un 50 por ciento (sobre la base molar) de todas las especies macromoleculares presentes. Generalmente, una composición sustancialmente pura incluirá más de aproximadamente un 80 % de todas las especies presentes en la composición. En varias realizaciones, una composición sustancialmente pura incluirá al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 95 % o al menos aproximadamente 99 % de todas las especies macromoleculares presentes en la composición. En diversas realizaciones, se purifica el principio activo a homogeneidad (no han de detectarse especies contaminantes en la composición a través de los métodos de detección convencionales), en el que la composición consiste esencialmente en una sola especie macromolecular.
Kits que comprenden aptámeros
La presente divulgación proporciona kits que comprenden cualquiera de los aptámeros descritos en el presente documento. Dichos kits pueden comprender por ejemplo (1) al menos un aptámero; y (2) al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, como pueda ser un disolvente o solución. Los componentes de kit adicionales pueden incluir por ejemplo (1) cualquiera de los excipientes farmacéuticamente aceptables identificados en el presente documento, como por ejemplo estabilizantes, tampones, etc., (2) al menos un envase, vial o aparato similar para guardar y/o mezclar los componentes del kit; y (3) aparato de administración.
Métodos de tratamiento
La presente divulgación proporciona métodos de prevención o tratamiento (p.ej., alivio de uno o más síntomas) de afecciones médicas a través del uso de un aptámero descrito en el presente documento. Los métodos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de dichos aptámeros a un sujeto que lo necesita. Los aptámeros descritos pueden utilizarse también para terapia profiláctica. En algunas realizaciones, se administra el aptámero intravitrealmente. En algunas realizaciones se administra el aptámero por vía oral o intravenosa.
El aptámero utilizado en los métodos de tratamiento puede ser un aptámero descrito en el presente documento, una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, un profármaco del mismo o una sal farmacéuticamente aceptable de un profármaco del mismo.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
El individuo o sujeto puede ser cualquier animal (doméstico, ganado o salvaje), incluyendo, pero sin limitarse a ellos, gatos, perros, caballos, cerdos y ganado, preferentemente seres humanos. Tal como se utiliza en el presente documento, los términos paciente, individuo y sujeto pueden utilizarse indistintamente.
Tal como se utiliza en el presente documento, "tratamiento" describes la atención y asistencia a un paciente para tratar una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un aptámero para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones de una enfermedad, una afección o un trastorno; aliviar los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno; o eliminar la presencia de la enfermedad, afección o trastorno en el paciente. Más específicamente, “tratamiento” incluye invertir, atenuar, aliviar, reducir al mínimo, suprimir o detener al menos un síntoma dañino del efecto de un estado patológico (trastorno), progresión de la enfermedad, agente causante de la enfermedad y otros estados anormales. El tratamiento se continúa por lo general hasta que mejoran los síntomas y/o la patología.
Tal como se utiliza en el presente documento, "prevención" significa evitar total o en parte; mejorar o controlar; reducir, disminuir o hacer descender; o retardar o detener.
En varias realizaciones, las composiciones y los métodos divulgados se utilizan para tratar degeneración macular relacionada con la edad, enfermedades autoinmunes, trastorno hematológicos, enfermedad infecciosas, septicemia, enfermedad inflamatorias o enfermedad neurodegenerativas.
En algunas realizaciones, los compuestos divulgados, o las sales farmacéuticamente aceptables o profármacos de los mismos, se pueden administrar en combinación con otros tratamientos que mejoran o erradican la patología, tal como se ha descrito. Las composiciones que incluyen los aptámeros divulgados pueden contener por ejemplo más de un aptámero. En algunos ejemplos, se administra una composición que contiene uno o más aptámeros en combinación con otro agente útil para el tratamiento de la enfermedad (p.ej., un agente útil para el tratamiento de degeneración macular relacionada con la edad, una enfermedad autoinmune, un trastorno hematológico, una enfermedad infecciosa, septicemia, una enfermedad inflamatoria o a enfermedad neurodegenerativa). En algunas realizaciones, serán adecuadas las formas farmacéuticas actualmente disponibles de los agentes terapéuticos conocidos para su uso en dichas combinaciones.
"Terapia de combinación" (o "co-terapia") incluye la administración de una composición de aptámero y al menos un segundo agente como parte de un régimen de tratamiento específico para proporcionar el efecto beneficioso de la acción conjunta de estos agentes terapéuticos. El efecto beneficioso de la combinación incluye, pero sin limitarse a ellos, una acción conjunta farmacocinética o farmacodinámica que es el resultado de la combinación de agentes terapéuticos. La administración de estos agentes terapéuticos en combinación se lleva a cabo normalmente a lo largo de un período de tiempo definido (normalmente, minutos, horas, días o semanas, dependiendo de la combinación seleccionada).
Puede pretenderse, aunque generalmente no, que “terapia de combinación” abarque la administración de dos o más de estos agentes terapéuticos como parte de regímenes de monoterapias por separado que tienen como resultado finalmente y de forma arbitraria combinaciones de la presente divulgación. Se pretende que “terapia de combinación” abarque la administración de estos agentes terapéuticos de forma secuencial, es decir, en la que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos o al menos dos de los agentes terapéuticos, de manera sustancialmente simultánea. La administración sustancialmente simultánea se puede llevar a cabo por ejemplo administrando al sujeto una dosis única que tiene una relación fija de cada uno de los agentes terapéuticos en una única dosis o varias dosis para cada uno de los agentes terapéuticos.
La posología con la utilización de aptámeros se selecciona de acuerdo con diversos factores, incluyendo por ejemplo tipo, especie, edad, peso, género, estado médico del sujeto; gravedad de la afección que se va a tratar; ruta de administración; la función hepática y renal del sujeto y el aptámero o sales del mismo empleado en particular. Por lo general, un médico o veterinario especializado puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad eficaz de la composición requerida para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.
En general, la dosis, es decir, la cantidad terapéuticamente eficaz oscila entre aproximadamente 1 pg y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal del sujeto que se está tratando, al día.
Los ejemplos que se exponen a continuación sirven para ilustrar determinadas características y/o realizaciones. No debe interpretarse que dichos ejemplos limitan la divulgación a las características y realizaciones que se describen en particular.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Selección o identificación de aptámeros que tienen especificidad de unión a proteína C3
Este ejemplo proporciona el método representativo para la selección y producción de aptámeros de ADN para proteína C3 humana
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Preparación de mezcla candidato
Se preparó una mezcla candidato de oligonucleótidos de ADNss aleatorizados parcialmente por extensión de la polimerasa de un cebador de ADNss hibridado con una matriz de ADNss biotinilada (se muestra en la Tabla 1 a continuación). La mezcla candidato contenía un casete aleatorizado de 40 nucleótidos que contenía dATP, dGTP, dCTP y 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina trifosfato (NapdUTP).
Tabla 1. Secuencias de matriz y cebadores
Designación de Oligonucleótido
Secuencia (5’—> 3’) SEQ ID NO:
Matriz 1
AB'ABTTT TTT TTGTG TCT GTC TGT GTC CTC- (NWGGAGTGGTAGAGGACTGG 1
Cebador 1
ATATATATCCAGTCCTCTACCACTCC 2
Cebador 2
AB'AB'TT TTT TTT GTG TCT GTC TGT GTC CTC 3
B' = biotina
Se lavaron 5 ml de una suspensión espesa al 50 % de resina Streptavidin Plus UltraLink Resin (PIERCE) una vez con 2,5 ml de tampón SB18T0.05 (40 mM HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina- 1-etanesulfónico) ajustado a pH 7,5 con NaOH, 102 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCh y 0,05% TWEEN 20) y tres veces con 2,5 ml de 16 mM NaCl. Se añadieron 20 nmoles de matriz 1 (SEQ ID NO: 1) que tenía dos restos biotina (designados como B' en la secuencia) y 40 posiciones aleatorizadas (designadas N40 en la secuencia) a las perlas UltraLink SA lavadas y se hicieron rotar a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, se lavaron las perlas tres veces con 16 mM NaCl. Entre lavado y lavado, se recuperaron las perlas por centrifugación. Se suspendieron las perlas, que contenía ahora la matriz capturada, en 1,25 ml de tampón de reacción de extensión [que contenía 24 nmoles de cebador (SEQ ID NO: 2), tampón IX SQ20 (120 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM KCl, 7 mM MgSO4, 6 mM (NH4)2SO4, 0,001 % BSA y 0,1 % Triton X-100), 187,5 unidades de ADN polimerasa KOD XL (EMD MILLIPORE) y 0,5 mM de dATP, dCTP, dGTP y NapdUTP. Se dejó incubar las perlas a 68 °C durante 2 horas. A continuación, se lavaron las perlas tres veces con 16 mM NaCl. Se eluyó la biblioteca de aptámeros desde las perlas con 1 ml de 20 mM NaOH. La biblioteca eluida se neutralizó inmediatamente con 15 pl de 1N HCl y 10 pl hEpES pH 7,5 y 1 pl 10 % TWEEN-20. Se concentró la biblioteca con filtro AMICON Ultracel YM-10 a aproximadamente 0,2 ml y se determinó la concentración de la biblioteca por espectroscopia de absorción ultravioleta
Marcado de proteína diana para inmovilización
Marcado con Alexa488 de proteína diana
Se marcó proteína C3 humana sin marcar purificada desde suero normal (QUIDEL, número de catálogo A401) por acoplamiento covalente de Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes™) con aminas primarias. Se mezcló proteína C3 (263 pmol en 68 pl) con un exceso molar de 137 más de colorante reactivo Alexa Fluor® 488 y se dejó incubar la reacción a temperatura ambiente durante 2 horas. Se eliminó el marcador sin reaccionar utilizando una columna de centrifugación y desalinización Zeba™ (PIERCE) y se intercambió el tampón en SB18T0.05.
Marcado con biotina de proteína C3 humana
Se biotiniló proteína C3 humana sin marcar purificada desde suero normal (QUIDEL, número de catálogo A401) por acoplamiento covalente de NHS-PEO4-biotina (PIERCE, EZ-LinkNHS-PEG4-Biotina) con restos que contenían aminas primarias. Se mezcló la proteína (200 pmoles en 75 pl) con un exceso molar 7 veces mayor de NHS-PEG4- biotina y se dejó incubar la reacción a 4 °C durante 16 horas. Una vez completada la reacción, se intercambió el tampón y se eliminó NHS-PEG4-biotina sin reaccionar por ultrafiltración utilizando filtros YM3 (MILLIPORE). El tampón de intercambio fue SB18T0.05.
Inmovilización de Proteína diana
Se inmovilizó proteína diana marcada con Alexa-Fluor® 488 en perlas magnéticas de proteína G (Dynabeads®, LIFE TECHNOLOGIES o tal como se denominan en adelante perlas de proteína G) para la Ronda 1 a Ronda 4 del proceso SELEX. Se prepararon perlas revestidas con anticuerpo mezclando 10 mg de las perlas con 70 pg de IgG de conejo anti-Alexa Fluor® 488 (INVITROGEN, MOLECULAR PROBES, A11094) en 1 ml de tampón SB18T0.05. Se dejó incubar la mezcla a 37 °C durante 30 minutos. Para eliminar el anticuerpo sin unir, se lavaron tres veces las perlas con 14 ml de SB18T0.05. Finalmente, se suspendieron las perlas en 1 ml (10 mg/ml) de SB18T0.05 y se almacenaron a 4°C hasta su uso.
Se inmovilizó la proteína diana marcada sobre perlas paramagnéticas de MIONE-SA (MYONE SA, INVITROGEN o denominadas en adelante perlas SA) para la Ronda 5 a Ronda 9 del proceso SELEX. Se prepararon perlas (50 mgs) lavando tres veces con 14 ml de SB18T0.05. Finalmente, se suspendieron las perlas a 10 mgs/ml en SB18T0.05 y se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Selección de aptámero con proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta
Se completó un total de nueve rondas del proceso SELEX con selección en cuanto a la afinidad y la constante de disociación lenta. Antes de cada una de las rondas, se llevó a cabo una contra-selección para reducir la contaminación de fondo y reducir la probabilidad de obtener aptámeros con unión no específica a proteína. Las contra-selecciones se realizaron del siguiente modo:
Para la Ronda 1, se calentaron 100 pl de mezcla candidato de ADN que contenía aproximadamente 1 nmol de ADN en SB18T0.05 a 95 °C durante 5 minutos y después se enfrió a 70 °C durante 5 minutos, a continuación a 48 ° C durante 5 minutos y después se transfirió a un bloque a 37 °C durante 5 minutos. A continuación, se combinó la muestra con 10 pl de mezcla competidora de proteína (0,1 % HSA, 10 pM caseína y 10 pM protrombina en SB18T0.05) y 1 mg (100 pl) de perlas de proteína G y se incubó a 37 °C durante 10 minutos con mezclado. Se eliminaron las perlas por separación magnética.
Para las rondas 2-9, se mezclaron partes alícuotas de 65 pl de la mezcla candidato de ADN obtenida en la ronda anterior (65 % de ADN obtenido de la ronda anterior) con 16 pl de 5x SB18T0.05. Se calentó la mezcla a 95 % durante 3 minutos y se enfrió a 37 °C a una velocidad de 0,1 °C /segundo. A continuación, se combinó la muestra con 9 pl de mezcla competidora de proteína (0,1% HSA, 10 pM caseína y 10 pM protrombina en SB18T0.05) y 0,1 mg (10 pl) de perlas de proteína G (Rondas 2-4) o Perlas SA (Rondas 5-9) y se incubó a 37 °C durante 10 minutos con mezclado. Se eliminaron las perlas por separación magnética.
Después de la primera contra-selección, se pre-inmovilizó la proteína diana sobre perlas de proteína G para el proceso de selección de la Ronda 1. Para llevarlo a cabo, se mezclaron 2 mg de perlas de proteína G con anticuerpo anti-Alexa Fluor® 488 inmovilizado con 50 pmoles de proteína diana marcada con Alexa-Fuor® 488 y se incubó durante 30 minutos a 37 °C. Se eliminó la diana sin unir por lavado de las perlas con SB18T0.05. Se añadió mezcla candidato de ADN contra-seleccionada (100 pl) a las perlas y se incubó a 37 °C durante 60 minutos con mezclado. No se empleó ningún proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta en la Ronda 1 y simplemente se lavaron las perlas 5 veces con 100 pl de SB18T0.05. Tras los lavados, se eluyó el aptámero de las perlas por adición de 170 pl de 20 pM NaOH y se incubó a 37 °C durante 5 minutos con mezclado. Se transfirió el eluato que contenía aptámero (165 pl) a un tubo nuevo tras la separación magnética de las perlas y se neutralizó la solución por adición de 41 pl de 25 mM Tris-HCl pH 7,5 que contenía 80 mM HCl.
Para las rondas 2-9, se llevaron a cabo selecciones con la mezcla candidato de ADN y proteína diana tal como se describe a continuación, al mismo tiempo que, de forma paralela, se llevaba a cabo una selección idéntica con la mezcla candidato de ADN, pero sin la proteína diana. La comparación de los valores Ct obtenidos de la PCR para la muestra con la proteína diana (señal S) y la muestra sin proteína diana (fondo B) fueron utilizados como guía para reducir la concentración de diana en la siguiente ronda. Cuando el valor delta Ct fue superior a 4, pero inferior a 8, se redujo la proteína diana a la tercera parte en la siguiente ronda. Cuando el valor delta Ct fue superior a 8, se redujo la diana a la 10 parte en la siguiente ronda.
Para la Ronda 2, se mezcló la proteína diana marcada (5 pmoles en 10 pl) con 40 pl de la mezcla candidato de ADN contra-seleccionada y se incubó a 37°C durante 15 minutos. Se comenzó un proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta añadiendo 50 pl de sulfato de dextrano 10 mM seguido de la adición inmediata de 0,2 mg de perlas de proteína G con anticuerpo anti-Alexa Fluor® 488 inmovilizado. Se dejó incubar durante 15 minutos a 37 °C con mezclado. Se lavaron las perlas una vez con 30 % de glicerol en SB18T0.05 y 5 veces con 100 pl de SB18T0.05. Se eluyó la cadena del aptámero de las perlas por adición de 85 pl de 20 mM NaOH y se incubó a 37 °C durante 5 minutos con mezclado. Se eliminaron las perlas por separación magnética y se transfirieron 80 pl de eluato de aptámero a un nuevo tuvo y se neutralizó con 20 pl de una solución que consistió en 25 mM Tris-HCl pH 7.5 y 80 mM HCl. Se llevaron a cabo las Rondas 3 y 4 tal como se ha descrito para la Ronda 2 salvo que se añadió sulfato de dextrano 15 minutos antes de la adición de perlas de proteína G con anticuerpo anti-Alexa Fluor® 488 inmovilizado. Tampoco se realizó un lavado con glicerol.
Se realizaron las Rondas 5 a 9 utilizando proteína diana marcada con biotina. Para la Ronda 5, se mezcló la diana (1,6 pmoles en 10 pl) se mezcló con 40 pl de mezcla candidato de ADN contra-seleccionada y se incubó a 37 °C durante 15 minutos con mezclado. A continuación, se comenzó un proceso de enriquecimiento de constante de disociación lenta añadiendo 50 pl de sulfato de dextrano 10 mM y se dejó incubar la mezcla durante 15 minutos más con mezclado. Se añadieron perlas SA (0,2 mg) para capturar complejos de la proteína diana aptámero (15 minutos de incubación a 37 °C con mezclado). A continuación, se lavaron las perlas 5 veces con 100 pl de SB18T0.05. Se eluyeron los aptámeros unidos desde las perlas por adición de 85 pl de 20 mM NaOH y se incubó a 37°C durante 5 minutos con mezclado. Se eliminaron las perlas por separación magnética y se transfirieron 80 pl de eluato de aptámero a un nuevo tubo y se neutralizó con 20 pl de una solución que consistió en 25 mM Tris-HCl pH 7,5 y 80 mM HCl.
Se llevó a cabo la Ronda 6 igual que la Ronda 5 salvo que se utilizó un desavío con dextrano de 30 minutos y se capturó la proteína diana marcada con 0,05 mg de Perlas SA. Se realizaron las Rondas 7 y 8 igual que la Ronda 6 salvo que se utilizaron solamente 0,16 pmoles de proteína diana. Se llevó a cabo la Ronda 90 del proceso SELEX
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
como la Ronda 8 salvo que se utilizaron solamente 0,05 pmoles de proteína diana.
Amplificación y purificación de aptámero
Se amplificó y cuantificó el ADN de aptámero seleccionado de cada Ronda por QPCR. Se añadieron 48 pl de ADN a 12 ml de mezcla de QPCR (10X tampón ADN polimerasa KOD; Novagen #71157, diluido a 5X, 25 mM MgCh, 5 pM cebador directo de PCR (Cebador 1, SEQ ID No: 2), 5 pM cebador inverso de PCR biotinilado (Cebador 2, SEQ ID NO: 3), 5X Verde I SYBR, 0,075 U/pl ADN polimerasa KOD XL y 1 mM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y se cicló térmicamente en un instrumento A BIORAD MyIQ QPCR con el siguiente protocolo: 1 ciclo de 96 °C durante 15 segundos, 55 °C durante 10 segundos y 69 °C durante 30 minutos; seguido de 30 ciclos de 96 °C durante 15 segundos, 69 °C durante 1 minuto. Se llevó a cabo la cuantificación con el software del instrumento y se comparó el número de copias de ADN seleccionadas con y sin proteína diana para determinar las relaciones señal/fondo.
Tras la amplificación, se capturó el producto de PCR sobre perlas SA a través de la cadena antisentido biotinilada. Se lavaron 1,25 ml de perlas SA (10 mg/ml) una vez con 14 ml de NaOH 20 mM, dos veces con14 ml SB18T0.05, se resuspendieron en 1,25 ml 3 M NaCl + 0,05% TWEEN y se almacenaron a 4 °C. Se añadieron 25 pl Perlas SA (10 mg/ml en 3 M NaCl) a 50 pl de productos de QPCR bicatenarios y se incubó a 25 °C durante 15 minutos con mezclado. Se lavaron las perlas una vez con 16 mM NaCl y después se eluyó la cadena “sentido” desde las perlas añadiendo 100 pl 20 mM NaOH e incubando a 37 °C durante 1 minuto con mezclado. Se descartó la cadena eluida y se lavaron tres veces las perlas con SB18T0.05 y una vez con 16 mM NaCl.
Se preparó aptámero sentido que contenía NapdU por extensión de cebador desde la cadena antisentido inmovilizada. Se suspendieron las perlas en 40 pl de mezcla de reacción de extensión de cebador (1 x tampón de extensión de cebador (120 mM Tris-HCl pH 7,8, 10 mM KCl, 7 mM MgSO4, 6 mM (NH4)2SO4, 0,1% TRITON X-100 y 0,001 % albúmina de suero bovino), 3 pM cebador directo (Cebador 1, SEQ ID NO: 2), 0,5 mM de dATP, dCTP, dGTP y NapdUTP y 0.015 U/ml AdN polimerasa KOD XL) y se incubó a 68 °C durante 60 minutos con mezclado. Se lavaron las perlas tres veces con SB18T0.05 y se eluyó la cadena del aptámero desde las perlas por adición de 85 pl de 20 mM NaOH y se incubó a 37 °C durante 1 minute con mezclado. Se transfirieron 80 pl de aptámero a un nuevo tubo tras la separación magnética, se neutralizó con 20 pl de 80 mM HCl, tamponado con 5 pl de 0,1 M HEPES, pH 7,5.
Rigurosidad y retroalimentación de selección
Se redujo la concentración de proteína diana relativa de la etapa de selección cada Ronda como respuesta a la señal QPCR (A Ct) Siguiendo la siguiente regla:
Si A Ct < 4, [P]0+1) = [P](0
Si 4 < A Ct < 8, [P]0+1) = [P](0 /3,2
Si A Ct > 8, [P](i+1) = [P](i) /10
en la que [P] = concentración de proteína y i = Número de ronda actual.
Después de cada ronda de selección, se determinó el estado de convergencia de la mezcla de ADN enriquecida. Se diluyeron 10 pl de producto de QPCR de doble cadena hasta 200 pl con 4 mM MgCl2 que contenía verde I IX de SYBr. Se analizaron las muestras en cuanto a la convergencia utilizando un análisis Cüt que mide el tiempo de hibridación para formar mezclas de complejo de oligonucleótidos de doble cadena. Se termociclaron las muestras con el siguiente protocolo: 3 ciclos de 98 °C durante 1 minuto, 85 °C durante 1 minuto; 2 ciclos de 98 °C durante 1 minuto, a continuación, 85 °C durante 30 minutos. Durante los 30 minutos a 85 °C, se midieron las imágenes fluorescentes a intervalos de 5 segundos. Se trazó un gráfico de la intensidad de fluorescencia en función del logaritmo del tiempo y se observó una mayor velocidad de hibridación con cada ronda de SELEX, indicando convergencia de secuencia.
Secuenciación de agrupamiento enriquecido e Identificación de aptámero
Tras nueve rondas del proceso SELEX, se secuenció el agrupamiento en convergencia. Se llevó a cabo la preparación de la secuencia del siguiente modo. Se amplificó el agrupamiento por PCR utilizando cebadores específicos de biblioteca SELEX que contenían una secuencia código de barras/índice única (identificador de secuencia único para cada agrupamiento). Se cuantificaron los productos de PCR individuales utilizando un ensayo de reactivo ADNds QuantiT™ PicoGreen® (LIFE TECHNOLOGIES), se combinaron a concentraciones equimolares y se concentraron/intercambio de tampón utilizando un dispositivo de filtración centrífuga AMICON Ultra-0.5 (MILLIPORE). A continuación, se purificó la mezcla por electroforesis de gel SDS-poliacrilamida (PAGE) y se concentró el eluato utilizando un dispositivo de filtración centrífuga Amicon Ultra-0.5 y se visualizó por PAGE para confirmar el tamaño, la pureza y el rendimiento de la mezcla final. Se entregó la mezcla a SeqWright Genomic Services (GE HEALTHCARE, Houston, TX) para secuenciación PGM por Ion Torrent. A partir de un agrupamiento
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
de secuencias que contenía más de 40.000 secuencias, se seleccionaron aleatoriamente 384 y se analizaron en cuanto a la convergencia utilizando un software adaptado que determina los recuentos de secuencia/número de copias e identifica los patrones de convergencia comunes utilizando un algoritmo de alineamiento local. Se seleccionar las secuencias con la mayor representación/número de copias en el agrupamiento y al menos una secuencia de cada patrón de convergencia para posterior caracterización. El patrón de convergencia 1 se identificó originalmente a partir de las secuencias 8491-3_3 (SEQ ID NO: 4), 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-189_3 (SEQ ID NO: 8) y 8491-282_3 (SEQ ID NO: 9). Se utilizó el dominio de consenso derivado de estas cuatro secuencias para identificar otros miembros del patrón de convergencia 1 dentro de todo el agrupamiento de la secuencia de la Ronda 9 de más de 40.000 secuencias.
Síntesis de aptámero
Para determinar el potencial de unión e inhibidor, se prepararon aptámeros individuales por síntesis en fase sólida. Se preparó el reactivo de desoxiuridina-5-carboxamida amidita modificado utilizado para la síntesis en fase sólida por: condensación de 5'-0-(4,4'-dimetoxitritil)-5-trifluoroetoxicarbonil-2'-desoxiuridina (Nomura et al. (1997) Nucl. Acids Res. 25:2784) con la amina primaria apropiada [1-naftilmetilamina] (RNH2, 1.2 eq; Et3N, 3 eq.; acetonitrilo; 60 °C; 4h); 3'-0-fofitidilación con 2-cianoetil-N,N-diisopropilclorofosforamidita (1,2 eq.; iPr2EtN, 3 eq.; CH2O2; -10 a 0 °C; 4 h); y purificación por cromatografía ultrarrápida sobre gel de sílice neutro. (Still, et al. (1978) J. Org. Chem. 43:2923). Se prepararon aptámeros por síntesis en fase sólida utilizando el método de fosfaramidita (Beaucage y Caruthers (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859) con algunos ajustes en el protocolo para tener en cuenta las modificaciones de base única descritas en el presente documento. Se llevó a cabo la destritilación con 10 % de ácido dicloracético en tolueno durante 45 segundos; se completó el acoplamiento con 0,1 M fosforamiditas en 1:1 acetonitrilo: diclorometano activado por 5-bencilmercaptotetrazol y se dejó reaccionar 3 veces durante 5 minutos; se llevaron a cabo el sellado y la oxidación de acuerdo con las recomendaciones del vendedor del instrumento. Se llevó a efecto la desprotección con amoníaco gaseoso o metilamina en condiciones de presión, tiempo y temperatura optimizados en un reactor de acero inoxidable Parr. Se eluyeron los productos con agua desionizada en placas de 96 pocillos adecuadas, con muestreo estadístico (VN +1) para caracterización LCMS, se cuantificó por espectrofotometría de UV y se analizó en cuanto a la afinidad de unión de proteína en solución acuosa tamponada.
Ejemplo 2: Constante de unión en equilibrio (Kd) para aptámeros a proteína C3
En este ejemplo se proporciona el método utilizado en el presente documento para medir afinidades de unión de aptámero -proteína C3 y determinar Kd. Brevemente, se calentó aptámero de ADN radiomarcado (32P) durante 3 minutos a 95 °C en tampón SB18T0.01 (40 mM HEPES, pH 7,5, 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCh, 0,01 % TWEEN-20) y se enfrió lentamente a 37 °C. Se formaron complejos mezclando ADN radiomarcado a aproximadamente 1x10 M con proteína C3 recombinante a concentraciones de 1x10 M a 1x10 M en tampón SB18T0.01 en un volumen de reacción de 60 pl e incubando a 37 °C durante 60 minutos. Se transfirió una porción de cada reacción (5 pl) a una membrana de nilón y se secó para determinar el recuento total en cada reacción. Se capturaron los complejos en resina ZORBAX (30 ng/pl, AGILENT), se pasó a través de una placa de HV multi- pantalla (MILLIPORE) al vacío y se lavó con 180 pl de tampón SB18T0.01 para separar complejos de unión a proteína de ADN sin unir. Se obtuvieron imágenes de la membrana de nilón y la placa HV multi-pantalla con un FUJI FLA-3000 fosforimager® y se cuantificó la cantidad de radioactividad en cada muestra utilizando un software de análisis ImageQuant™. Se trazó en gráfico la fracción de ADN capturado en función de la concentración de proteína C3 (Pt) y se determinaron las constantes de unión en equilibrio (Kd) utilizando la siguiente fórmula: y = (max-min) (Pt)/(Kd + Pt) + min.
Como ejemplo ilustrado, en la Figura 2 se muestra un gráfico en el que se representan las curvas de unión a proteína C3 humana. Aptámeros de ADN 8491-94_3 (SEQ ID NO: 5), 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58) y 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125) se unen a proteína C3 con una Kd de 3,13 x 10'11 M, 3,34 x 10'11 M y 5,49 x 10'11 M, respectivamente. La Figura 3 presenta un gráfico en el que se representa la unión de los aptámeros 8491-94_53 (SEQ ID NO: 58) y 8491-94_97 (SEQ ID NO: 125) a proteína C5 humana. NO se detecta unión aparente a proteína C5 humana lo que ilustra la especificidad de estos aptámeros para la proteína C3.
En la Tabla 2 se muestran secuencias de aptámero y afinidad para C3 de miembros del patrón de convergencia 1.
Tabla 2: Secuencias representativas de patrón de convergencia 1. Se muestran las secuencias en convergencia en la región aleatoria. Todas las secuencias contienen también 5 bases de cebadores 5'- y 3' (no se muestra) así como una desoxitimidina unida a 3'-3' en el término 3'- (no se muestra).
imagen3

Claims (20)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un aptámero que se une una proteína C3, en donde el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 152)
    en la que,
    K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos;
    cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5;
    cada R es independientemente, y cada vez que aparece, A o G;
    M es C, U, T, una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos;
    cada D es independientemente, y cada vez que aparece, A, C o un espaciador de 3 carbonos;
    cada V es independientemente, y cada vez que aparece, A, G, C o un espaciador de 3 carbonos;
    L es A, U, T o una pirimidina modificada en C-5;
    W es G o un espaciador de 3 carbonos;
    S es C o un espaciador de 3 carbonos;
    Y es C, U o T; y n es 0 o 1.
  2. 2. El aptámero de la reivindicación 1, en donde el aptámero comprende las secuencias:
    5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 131),
    5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPACGPPM -3' (SEQ ID NO: 135) o 5'- KPGRMPDVDnLPAWPSVGPAYRPPM -3' (SEQ ID NO: 153).
  3. 3. Un aptámero que se une una proteína C3, en donde el aptámero comprende la secuencia 5'- KPGRMPXPAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 154)
    en la que,
    K es una pirimidina modificada en C-5, C, U, T, G o un espaciador de 3 carbonos;
    cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5;
    R es A o G;
    M es C, U, T una pirimidina modificada en C-5 o un espaciador de 3 carbonos;
    Y es A, G, C o un espaciador de 3 carbonos;
    W es G o un espaciador de 3 carbonos;
    S es C o un espaciador de 3 carbonos;
    Y es C, U o T; y
    X es un engarce seleccionado entre un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol.
  4. 4. El aptámero de la reivindicación 3, en donde el aptámero comprende las secuencias
    5'- KPGRMPXPAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 136),
    5'- KPGRMPXPAWPSVGPACGPPM -3' (SEQ ID NO: 137) o 5'- KPGRMPXPAWPSVGPAYRPPM -3' (SEQ ID NO: 155).
  5. 5. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que
    K es una pirimidina modificada en C-5, C o G;
    cada M es independientemente, y cada vez que aparece, C o una pirimidina modificada en C-5; y/o L es A o pirimidina modificada en C-5.
  6. 6. Un aptámero que se une una proteína C3, en donde el aptámero comprende la secuencia
    5'- PAWPSVGPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156), o 5'- PAWPSVGPACGPP -3' (SEQ ID NO: 134),
    en las que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; W es G o un espaciador de 3 carbonos; S es C o un espaciador de 3 carbonos; V es A, G o C; Y es C, U o T; y R es G o A.
  7. 7. Un aptámero que se une a una proteína C3, en donde el aptámero comprende una secuencia que es al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 99 % o un 100 % idéntico a una secuencia seleccionada entre las SEQ ID NO: 4 a 28, 32 a 34, 37 a 75, 78 a 118, 121 a 130 y 139 a 151, en las que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
  8. 8. Un aptámero que se une a una proteína C3, en donde el aptámero comprende una primera región y una segunda región, en donde la primera región comprende la secuencia 5'- PAGPC-3' (SEQ ID NO: 132) y la segunda región comprende las secuencias 5'- GPAYRPP-3' (SEQ ID NO: 156) o 5'- GPACGPP-3' (SEQ ID NO: 133), en las que
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A.
  9. 9. El aptámero de la reivindicación 8, en el que el extremo 3' de la primera región está covalentemente unido al extremo 5' de la segunda región.
  10. 10. El aptámero de la reivindicación 9, en el que la primera región y la segunda región están unidas covalentemente mediante al menos uno, dos, tres, cuatro o cinco engarces, en donde cada engarce es independientemente seleccionado entre un nucleótido, un engarce de C2-C20 sustituido o sin sustituir, un alquilen glicol y un polialquilen glicol.
  11. 11. El aptámero de la reivindicación 10, en el que cada engarce se selecciona independientemente entre un nucleótido, un espaciador de 3 carbonos y un hexaetilen glicol.
  12. 12. Un aptámero que se une a C3, en donde el aptámero comprende la secuencia 5'-PAGPC -3' (SEQ ID NO: 132), en la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
  13. 13. Un aptámero que se une a C3, en donde el aptámero comprende las secuencias 5'-GPAYRPP -3' (SEQ ID NO: 156) o GPACGPP -3' (SEQ ID NO: 133), en las que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5; Y es C, U o T; y R es G o A.
  14. 14. Un aptámero que se une a una proteína C3, en donde el aptámero comprende la secuencia SEQ ID NO: 125, en
    la que cada P es independientemente, y cada vez que aparece, una pirimidina modificada en C-5.
  15. 15. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aptámero comprende al menos un nucleótido modificado con 2'-O-metilo.
  16. 16. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aptámero tiene de 24 a 100
    nucleótidos de longitud o de 30 a 60 nucleótidos de longitud o de 28 a 60 nucleótidos de longitud o de 28 a 50
    nucleótidos de longitud o de 28 a 40 nucleótidos de longitud o de 40 a 50 nucleótidos de longitud o de 28 a 32
    nucleótidos de longitud.
  17. 17. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el aptámero inhibe la escisión de la proteína C3.
  18. 18. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que cada pirimidina modificada en C-5 se selecciona independientemente entre:
    5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BndU), 5-(N-bencilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- bencilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-fenetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PEdU), 5-(N-
    tiofenilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (iBudU), 5-(N- tirosilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TyrdU), 5-(N-3,4-metilendioxibencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (MBndU), 5-(N-4-fluorobencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (FBndU), 5-(N-3-fenilpropilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (PPdU), 5-(N-imidizoliletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ImdU), 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5- (N-isobutilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-desoxiuridina (TrpdU), 5-(NR- treoninilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (ThrdU), 5-(N-triptaminocarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N- triptaminocarboxiamida)-2'-fluorouridina, cloruro de 5-(N-[1-(3- trimetilamonio) propil]carboxiamida)-2'- desoxiuridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (NapdU), 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-
    metiluridina, 5-(N-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)-2'-
    desoxiuridina), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NapdU), 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-O-
    metiluridina, 5-(N-2-naftilmetilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina
    (NEdU), 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-1-naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-2- naftiletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (2NEdU), 5-(N-2-naftiletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-2- naftiletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BFdU), 5-(N-3- benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina, 5-(N-3-benzofuraniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina, 5-(N-3- benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina (BTdU), 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-O-metiluridina y 5-(N-3-benzotiofeniletilcarboxiamida)-2'-fluorouridina.
  19. 19. El aptámero de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína C3 es proteína C3 humana.
    A
    Número ID Aptámero
    Número do secuencias equivalentes
    843:1-3 3
    6853
    8433-94_3
    74 5
    3491-359 3
    126
    8432-333 5
    3ÍÍ
    S4&-3S9 .3
    •45
    S433.-232 5
    13
    S49Í-395 3
    ?
  20. 843.1-3.34 3
    5
    3491-397 3
    5
    8431-336 S
    4
    5492-393 3
    ;4
    3451-455 3
    3
    S492-387 3
    3
    3451-455 3
    3
    S432-233_5
    2
    3431-455 3
    1
    8431-335 =
    1
    3491-487 3
    i
    S431-Í02 5
    i
    3492-458 3
    j
    8431-4!>3_3
    i
    3491-4&2 3
    1
    8432-335 =
    1
    3491-5993
    í
    8492-403 3
    Secuencia dentro de la región aleatoria 40 N
    5' 4 r
    ^^^pfj^^fe:COGí?CCSAACGqG AP GPCGSC GI<PPSGCFC&' 2 AC SCGP
    pí^u^csa|^g|í||5¡ pc-gcpc
    AGAC 9GP'^V9G^t¥Cr': CÁCAPPG
    5AC^|^^||^jj||^|Í^^^|^ACGAfcACCCC CCGGpihfc#^ ^á^S^^íE^^^GGCCGGGCAGGG OP pA3AA.GGG P í UPPtOCPíai• APÍKiPÍ ySjsSí SiPPp" CGA
    aicrtíGCP7^i&itó®:íXfSí®)e£»K:i£'iAGGG?Gñp¿A? F^wascsmcaasaí^ciGrfflEStóíap^acsíxa^AayiCA ¿aLCLSíftsaeí'íat ^JtóPmepíSíJí^pGGccc^FPCñ^ass isg-;:"ípsí£;3’í3s i&l&ACcesacspscc - ;:- -- psarcc- ?g ci-Ajyzacsec- :. e as pk^bcí :nsí>se; íjíícís pkcspííp :-c
    APGPCGGCSPSEG&PPíav AS^GPCXÍSffaCEJPSP'MCCGGGCaC-GG ACCGíssasscic íffiíüSgOCC^iiCGppc rosc-^qíiCóc&cc GAG _> PPeftCPCft APftGyOL'ÍJPACÜE'PP PFPE3GGCCGGSGGGGC AS GASCAÍ-pSftCSCfe. &mm^mGCSSm*r PSACCGGGGCMGGS J^i^PCCiíiE^^S^PAC'SCG?
    P CCC AC;'^GACSAP.PEl^:^ISía:::;AP^PÍ^S^pP:í®i A CtóGCCPCPCQGPFPGGCÍAA. JH^EOTSSSeSPm’CKe
    í^^^ai^^^^^^l^GCGEftAfc'ACC&JSCPGAC íkASCPFPI PPGACPCAAPPfeSÍ^Í&GSAeGC'PPS EP SGPCGGG.:' A.C-GG AGCAACPÍÍJfiPPCft ^Ayp^C^SÍiCGPPp.aPGCAAGAACA CEAPi-AGC-viCÍGÍiPPCa P’P^&AZPM&PttGOC.CC&PC ____________________8CCC5^Í^^CÍ^^^GÜ^^^gSGg&iaSCggg______________
    SEQÍGMO.
    4
    5 S ?.
    «
    .3
    14
    ¿5
    13
    25
    '•■. i ¿i
    2¿
    23
    24 ¿5
    25
    ¿a
    imagen1
    B
    Posición
    ¡ 2 '3 4 5 6 7 8 Inserción 5'- 10 11 12 B 14 15 ltf 17 IB 19 20 21 22 23
    Consenso
    K P G R M P t> V de una sola base L . P A G P £ V G' P A C G P P H
    Frecuencias
    A
    0-00 0.00 0.00 0.7S 0.00 0.00 0.C8 o.$e 0.04 0.» 0.00 1.00 0.00 0.00 0.00 0.12 0.00 OOO IDO 0 00 0.00 0.00 0.00 0.00
    C
    OjOO 0-00 0.00 0.00 0-Pí 0.00 052 OJO 0 12 0.0Ó 0.00 0-00 0.00 ooo 100 0-S4 ODO OOO OOO 1 00 0 00 0 00 ooo 0-20
    &
    0.12 0.00 1.00 0.24' 0.00 o.cü 0.00 0 ¡2 0.00 0.M Ü.ÓÜ 0130 1.00 0.00 0.00 0.04 IDO 0.00 ODO 0.00 Í.GO 0.00. 0.00 OOÓ
    P
    ODU 1.00 0.00 0.00 0.04 1.00 000 0.00 0.00 0.08 1.00 ooo 000 1.00 0DC 0.00 0.00 IDO OpO 0D0 0.00 .IDO- 1.00 0-80
    Figura 1
    Fracción unida
    imagen2
    Figura 2
    Fracción unida
    imagen3
    C5], (M)
    Figura 3
    ■fs.
    Figura 4
    Porcentaje de control (sin inhibidor)
    "^8 uuub O M
    O
    Oi o Oí O Os
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    o
    £5
    VI
    ■fs.
    CTQ
    n
    p
    y»
    Tiempo (horas)
    SOMAmeros de longitud completa [%]
    o
    }«"
    o
    o
    /M
    /4
    Sí ^ ¡ '
    /
    \
    :|íi
    í/ !.
    i
    /
    ■4#
    í : i
    w O O
    X
    i
    X
    X
    él
    -8 ¿0 •3>
    *kA
    4*
    :-Í
    i*-'
    ¡Jj.
    “
    ,4“
    •-
    ví i •i Vi
    ©
    O '„<v-
    O
    +¿t
    Ct
    "
    W Ui o C; :•> 7* T.
    imagen7
    imagen8
    <í>
    I 3¿í:
    I
    &■ ■& ■í 3agt¡¡¡fck ? f -Sí
    W &•
    O o
    y.
    C? 2?
    y-*
    O
    K?
    imagen9
    ■fs.
    00
    imagen10
    f
    mm
    w :vi* O Oo
    <¿>
    m
    p,
    $> tJ2
    v<
    <**
    : y*:
    £
    Í-V>
    ! Vi
    ■. ►>> 1 íy-:
    US
    V‘V
    !. O..
    <Jf>
    Ví>
    :• ■ .
    ?
    t-A .
    Vi
    : (í j, :
    -í* { r»
    i
    1
    i
    I
    i
    1
    o
    00
    o
    i#
    V
    Í'A
    #V:
    v>
    o aa
    * «
    V» £
    fv í
    o oo
    ^ X2
    :*
    O?
    3
    r-J
    o
    m
    imagen11
    k> m
    £5
    CO KJ
    ro
    2 o
    i\j
    oo
    Abreviatura
    Modificación 5dU
    Bn
    bencilmetilo
    Nap
    7-naftilmetilo
    PE
    2-feniletilo
    PP
    3-fenilpropilo
    Ib
    ¿so-butilo
    FBn
    4-fluorobencílmetilo
    2Nap
    2-naftilmetiLo
    Tyr
    tirosilo
    NE
    /-naftiletilo
    MBn
    3,4-inetilendioxi bencilo
    MOE
    morfolinoetilo
    BF
    3-benzofuraniletilo
    BT
    3-benzotiofeniletilo
    2NE
    2-naftil-2-etilo
    Trp
    3-indol-2-etilo
    Figura 9
    Estructura química
    imagen12
    imagen13
    imagen14
    Figura 11
    imagen15
    en el que
    R se selecciona del grupo que consiste en un alquilo inferior (C1-C20) lineal o
    ramificado; halógeno (F, Cl, Br, I); nitrilo (CN); ácido borónico (BO2H2); ácido carboxílico (COOH); éster de ácido carboxílico (COOR”); amida primaria (CONH2); amida secundaria (CONHR”), amida terciaria (CONR”R”); sulfonamida (SO2NH2); N- alquilsulfonamida (SONHR”).
    en el que
    R”, R”’ se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un alquilo inferior
    un anillo
    en el que R”” es como se ha definido anteriormente; un ácido carboxílico (COOH); un éster de ácido carboxílico (COOR””); en el que R”” es un alquilo inferior (C1-C20) lineal o ramificado; y cicloalquilo; en el que R” = R”’ = (CH2)n, en el que n es = 2-10.
    Figura 11 (cont.)
    en
    ■fs.
    y.
    (ÍQ1
    £
    K>
    :entaje de
    control (sin
    inhibidor)
    Porcentaje de control (sin inhibidor)
    imagen16
ES15729302.8T 2014-05-30 2015-05-29 Compuestos de ácido nucleico para unión a una proteína de componente 3 del complemento Active ES2664179T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462005300P 2014-05-30 2014-05-30
US201462005300P 2014-05-30
PCT/US2015/033355 WO2015184372A1 (en) 2014-05-30 2015-05-29 Nucleic acid compounds for binding to complement component 3 protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2664179T3 true ES2664179T3 (es) 2018-04-18

Family

ID=53398218

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15729302.8T Active ES2664179T3 (es) 2014-05-30 2015-05-29 Compuestos de ácido nucleico para unión a una proteína de componente 3 del complemento

Country Status (8)

Country Link
US (2) US11466275B2 (es)
EP (1) EP3149173B1 (es)
JP (1) JP6824041B2 (es)
CN (2) CN110643610A (es)
CA (1) CA2949246C (es)
ES (1) ES2664179T3 (es)
NO (1) NO2718257T3 (es)
WO (1) WO2015184372A1 (es)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3478843B1 (en) * 2016-07-01 2021-08-04 Somalogic, Inc. Oligonucleotides comprising modified nucleosides
JP7452549B2 (ja) * 2019-10-18 2024-03-19 富士フイルム和光純薬株式会社 ホスホロアミダイト活性化剤

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6140490A (en) * 1996-02-01 2000-10-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US6395888B1 (en) 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
WO1997042317A1 (en) 1996-05-07 1997-11-13 T Cell Sciences, Inc. APTAMERS FOR COMPLEMENT PROTEIN C3b
US20020082227A1 (en) * 1999-09-30 2002-06-27 Scott Henry Use of oligonucleotides for inhibition of complement activation
US20030219801A1 (en) * 2002-03-06 2003-11-27 Affymetrix, Inc. Aptamer base technique for ligand identification
EP2613147B1 (en) * 2006-01-17 2015-03-11 Somalogic, Inc. Detection methods using aptamers
US8975026B2 (en) * 2007-01-16 2015-03-10 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US7947447B2 (en) * 2007-01-16 2011-05-24 Somalogic, Inc. Method for generating aptamers with improved off-rates
US8927509B2 (en) * 2008-05-20 2015-01-06 The Research Foundation Of State University Of New York Aptamer modulators of complement protein C3 and biologically active proteolytic products thereof
AU2011240774B2 (en) 2010-04-12 2014-04-10 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Aptamers to beta-NGF and their use in treating beta-NGF mediated diseases and disorders
ES2629183T3 (es) * 2011-03-10 2017-08-07 Somalogic, Inc. Aptámeros para diagnóstico de Clostridium difficile
CN104220453B (zh) * 2012-04-03 2018-03-09 诺沃姆德治疗公司 人源化的嵌合抗因子c3抗体及其用途
IL300783B2 (en) * 2016-08-24 2026-03-01 Sangamo Therapeutics Inc Engineered nucleases with target-specific zinc fingers
BR112022000216A2 (pt) * 2019-07-11 2022-05-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticorpos direcionados a dll3 e usos dos mesmos

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017517261A (ja) 2017-06-29
CA2949246A1 (en) 2015-12-03
CN106459979B (zh) 2020-07-21
JP6824041B2 (ja) 2021-02-03
EP3149173B1 (en) 2018-02-07
CN106459979A (zh) 2017-02-22
CN110643610A (zh) 2020-01-03
US11466275B2 (en) 2022-10-11
US20170166895A1 (en) 2017-06-15
US20230093170A1 (en) 2023-03-23
EP3149173A1 (en) 2017-04-05
WO2015184372A1 (en) 2015-12-03
NO2718257T3 (es) 2018-04-14
CA2949246C (en) 2023-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2011223527B2 (en) Aptamers to 4-1BB and their use in treating diseases and disorders
CN102858990B (zh) 针对β-NGF的适体及其在治疗β-NGF介导的疾病和失调中的用途
ES2710723T3 (es) Aptámeros que se unen a IL-6 y su uso en el tratamiento o el diagnóstico de afecciones mediadas por IL-6
US20150105452A1 (en) Aptamers to PDGF and VEGF and Their Use in Treating PDGF and VEGF Mediated Conditions
US20240218374A1 (en) Nucleic Acid Compounds That Bind Coronavirus Proteins
US10544419B2 (en) PDGF and VEGF aptamers having improved stability and their use in treating PDGF and VEGF mediated diseases and disorders
US20220333113A1 (en) Nucleic Acid Compounds that Bind to Retinoic Acid-Inducible Gene I Protein
US20230093170A1 (en) Nucleic Acid Compounds for Binding to Complement Component 3 Protein
US20200181620A1 (en) Inhibitors of dek protein and related methods
HK40018876A (en) Nucleic acid compounds for binding to complement component 3 protein
HK40033269A (en) Pdgf and vegf aptamers having improved stability and their use in treating pdgf and vegf mediated diseases and disorders
HK1204014B (en) Aptamers to pdgf and vegf and their use in treating pdgf and vegf mediated conditions