ES2665016T3 - Anticuerpos modificados y procedimiento de producción de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un procedimiento para modificar una inmunoglobulina donante para su uso en una especie diana, procedimiento que comprende las etapas de: - identificar una inmunoglobulina donante de una especie distinta a la especie diana, en la que la inmunoglobulina donante tiene especificidad de unión a un epítopo diana presente en la especie diana, - determinar una secuencia de aminoácidos de regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante, - comparar cada resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante con un resto de aminoácido presente en una posición correspondiente en una secuencia de aminoácidos de regiones marco conservadas de una pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana para identificar uno o más restos de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante que no está presente en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, y - sustituir el uno o más restos de aminoácidos identificados presentes en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante, pero no presentes en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, con un resto de aminoácido que está presente en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana; - en el que la inmunoglobulina donante modificada no contiene ningún aminoácido en ninguna posición dentro de las regiones marco conservadas que pudiera ser extraño en esa posición en la especie diana; en el que la especie diana se selecciona entre el grupo que consiste en un perro, un gato, un caballo y un ser humano; y en el que la sustitución de un resto de aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante se inicia usando el principio de sustitución conservativa.

Description

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Anticuerpos modificados y procedimiento de producción de los mismos Campo de la divulgación
La presente divulgación se refiere a procedimientos para producir agentes de unión no inmunogénicos, en particular inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas, que se pueden usar en procedimientos terapéuticos. En particular, los procedimientos permiten la modificación de una inmunoglobulina donante de modo que se pueda administrar a una especie diana con un riesgo mínimo de que se generen anticuerpos neutralizantes frente a la misma. La divulgación se extiende adicionalmente a inmunoglobulinas producidas con dichos procedimientos y a su uso en terapia.
Antecedentes de la divulgación
Los avances en tecnología de ADN recombinante han dado como resultado una diversidad de proteínas que se están desarrollando para aplicaciones farmacéuticas. Esto ha dado como resultado un número de fármacos basados en proteína, que se pueden denominar más generalmente agentes biológicos, que son el objeto de ensayos clínicos o aprobación por el mercado. Debido a sus propiedades y estructuras inherentes, los fármacos basados en proteínas son significativamente más grandes y más complejos que las moléculas basadas en moléculas orgánicas e inorgánicas pequeñas más tradicionales. En particular, la estructura terciaria plegada de la proteína es esencial para su función biológica.
Los anticuerpos son una familia de proteínas que se están desarrollando y usando ampliamente en aplicaciones en el ser humano. La popularidad de los anticuerpos en aplicaciones terapéuticas ose ha debido a su versatilidad para ser capaces de unirse de forma específica prácticamente a cualquier molécula diana deseada. La mayoría de los productos terapéuticos basados en proteínas son anticuerpos monoclonales. Sin embargo un inconveniente significativo asociado con el uso de terapias basadas en anticuerpos monoclonales es la producción de anticuerpos neutralizantes frente al anticuerpo monoclonal terapéutico cuando se administra a un sujeto. Estos anticuerpos neutralizantes surgen del sistema inmunológico del sujeto reconociendo como secuencias extrañas de aminoácidos que están presentes en el anticuerpo monoclonal administrado. Como resultado, una respuesta inmunológica aumenta frente al anticuerpo terapéutico administrado. La producción de anticuerpos neutralizantes por el sujeto puede alterar de forma significativa la capacidad para continuar tratando al sujeto con el anticuerpo monoclonal terapéutico. Por lo general, una vez que los anticuerpos neutralizantes se han producido en el sujeto, es necesario aumentar el uso del anticuerpo terapéutico ya que los anticuerpos neutralizantes reducen o anulan de forma eficaz el efecto terapéutico del anticuerpo monoclonal administrado. Esto puede limitar el uso del anticuerpo terapéutico para un tratamiento inicial solamente, con el resultado de que la repetición o dosificación a largo plazo del anticuerpo terapéutico no es una opción. En resumen, la producción de anticuerpos neutralizantes frente a un anticuerpo terapéutico puede limitar de forma significativa el uso terapéutico de este anticuerpo y esto, a su vez limitar de forma significativa, o evitar completamente, el uso del anticuerpo en el tratamiento de una enfermedad crónica o recurrente.
Para intentar reducir la probabilidad de que se produzcan anticuerpos neutralizantes frente a un anticuerpo terapéutico, se ha desarrollado un número de enfoques que están diseñados para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo modificando su estructura. Un enfoque de este tipo es la producción de un anticuerpo quimérico mediante el cual los dominios constantes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se obtienen a partir de un anticuerpo obtenido de la misma especie que el sujeto al que se va a administrar el anticuerpo. Como la mayoría de los anticuerpos terapéuticos se han desarrollado para su uso en seres humanos, los anticuerpos quiméricos de ese tipo por lo general comprenden dominios constantes de cadena pesada y ligera obtenidos a partir de ser humano unidos a regiones variables de cadena pesada y ligera obtenidas a partir de un anticuerpo no humano, lo más generalmente de origen de ratón o rata.
Los enfoques adicionales para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos terapéuticos usan técnicas denominadas humanización. El término humanización refleja el hecho de que los anticuerpos modificados se están haciendo más similares a los anticuerpos que podrían ser producidos por un ser humano, para limitar la posibilidad de un resultado de respuesta inmunológica. Las técnicas de organización se extienden a un número de diferentes enfoques para preparar un anticuerpo más similar al del ser humano.
Una técnica de humanización usada comúnmente es la del injerto de CDR mediante el cual las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) obtenidas a partir de un anticuerpo donante, tal como un anticuerpo obtenido a partir de murino, se combinan con regiones marco conservadas obtenidas a partir de un anticuerpo de origen humano para formar dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras que a continuación se combinan con dominios constantes de cadena pesada ligera obtenidos a partir de anticuerpo humano. Por lo tanto el anticuerpo resultante contiene solamente un número limitado de aminoácidos obtenidos a partir de ser no humano, sirviendo esto para limitar la presencia de epítopos que serán visualizados por el sistema inmunológico humano como extraños.
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Un inconveniente significativo asociado con la humanización es que a menudo da como resultado una reducción significativa de la afinidad de unión del anticuerpo humanizado resultante con respecto a la presentada por el anticuerpo donante no humanizado. Tal como es el caso con la producción de anticuerpos neutralizantes frente a un anticuerpo monoclonal terapéutico, esto puede dar como resultado que el uso terapéutico de ese anticuerpo se vea comprometido de forma significativa. En particular, la reducción de la afinidad de unión da como resultado la necesidad de administrar una dosis más elevada del anticuerpo terapéutico y puede requerir adicionalmente que también se aumente la frecuencia de dosificación. Ambos factores dan como resultado un aumento del coste de la terapia y un aumento de las molestias al paciente. Además, la administración de cantidades más elevadas del anticuerpo a un sujeto da como resultado un aumento del riesgo de que los anticuerpos neutralizantes se generen frente al anticuerpo terapéutico.
En casos en los que los anticuerpos humanizados se unen al epítopo deseado con una afinidad menor que el anticuerpo donante inicial, esto se puede deber al alineamiento estructural incompatible de secuencias de región marco conservada con las secuencias de CDR de unión a epítopo. A través de un proceso repetitivo de retromutación de restos humanos con los aminoácidos en la misma posición en el anticuerpo donante, la afinidad del anticuerpo izado a menudo se puede restablecer. Aunque el proceso de retromutación puede dar como resultado la reintroducción adicional de restos de aminoácidos no humanos en el anticuerpo humanizado, el anticuerpo resultante todavía se denomina humanizado a pesar de la presencia de aminoácidos donantes significativos en la secuencia final.
Mediante analogía directa, la especiación de anticuerpos para su uso en especies distintas a las humanas se ve comprometida del mismo modo mediante el requisito de producir cambios en el marco conservado que mantienen la especificidad de unión del anticuerpo modificado, a la vez que se reduce la inmunogenicidad del anticuerpo resultante en la especie diana de elección. Desde una perspectiva comercial, uso de anticuerpos en especies distintas a las del ser humano es deseable debido al intervalo de procesos de una enfermedad comunes que se podrían tratar de manera útil, en particular, en especies de alto valor tales como animales de compañía (gatos y perros) y animales resistentes (caballos y camellos), o para mejorar la calidad de la carne en animales que producen alimento, tales como vacas, ovejas, cerdos y pollos. En consecuencia, podrían ser altamente deseables procedimientos que permitan una conversión de anticuerpos más sencilla para su uso en estas especies.
Por lo tanto existe una necesidad de mejores procedimientos para modificar un anticuerpo donante para que se pueda administrar a un sujeto diana sin que el anticuerpo resultante presente una pérdida de la afinidad de unión con respecto al antígeno diana, a la vez que se minimizan los cambios de esos de las secuencias de anticuerpo receptor para reducir la probabilidad de que se generen anticuerpos frente al mismo. A continuación podría ser altamente deseable un procedimiento que convierta una secuencia de anticuerpo donante en una secuencia de especie diana con un número mínimo de cambios para conseguir una estructura de marco conservado de especie diana con un impacto mínimo en la estructura de la CDR.
Pelat y Thullier (2009) mAbs 1 (4): 377-381 describen bibliotecas inmunológicas de primate no humano combinadas con humanización de línea germinal.
El documento WO2006/131951 describe moléculas que son capaces de inhibir la unión entre NGF y el receptor TrkA como agentes analgésicos con efecto prolongado.
El documento WO2005/061540 describe un procedimiento para la humanización de anticuerpos y anticuerpos humanizados obtenidos de ese modo.
El documento WO2010/027488 describe anticuerpos heteroquiméricos.
Lazar y col. (2007) Molecular Immunology 44: 1986-1998 describe un enfoque de inmunología molecular para humanización de anticuerpo y optimización funcional. Williams y col. (2010) Capítulo 21 en Antibody Engineering Vol. 1 (Editado por Kontermann y Dübel) describen la humanización de anticuerpos mediante injertos de CDR. Covaceuszach y col. (2012) PLos ONE 7 (3): e32212:1-12 describen una humanización basada en estructura de un ciclo individual de un anticuerpo terapéutico de anti-factor de crecimiento nervioso.
Sumario de la invención
La invención se define con las reivindicaciones. Los aspectos / ejemplos de la presente divulgación que constituyen la invención se definen con las reivindicaciones.
Sumario de la divulgación
La presente divulgación describe procedimientos para modificar un del anticuerpo donante para uso en especies diana de modo que el anticuerpo resultante no contenga ningún aminoácido en ninguna posición dentro de las regiones marco conservadas que pudiera ser extraño en esa posición en esa especie. Por lo tanto el anticuerpo modificado mantendrá la especificidad y afinidad del anticuerpo donante, pero al mismo tiempo se modificará de modo que no se cree ningún epítopo potencialmente extraño. Por lo tanto el anticuerpo modificado no se observará como extraño en la especie diana y por lo tanto no inducirá una respuesta inmunológica que pudiera conducir a una neutralización de su eficacia, especialmente después de administración a largo plazo. El procedimiento mediante el cual se puede conseguir lo mencionado supera todas las desventajas inherentes en procedimientos anteriores y además se caracteriza por una simplicidad y elegancia notables.
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Haciendo grandes esfuerzos, el presente inventor ha desarrollado de forma sorprendente un procedimiento para alterar un anticuerpo donante o un fragmento de unión a antígeno obtenido a partir del mismo de modo que es completa o significativamente no inmunogénico cuando se administra a una especie diana, siendo dicha especie diana una especie diferente a aquella a partir de la que se obtuvo el anticuerpo donante. Por lo general, no se generan anticuerpos neutralizantes frente al anticuerpo resultante después de su administración a un sujeto. Además, la alteración del anticuerpo para hace que sea no inmunogénico podría dar como resultado una reducción de la especificidad o afinidad de unión a la diana pretendida.
De acuerdo con un primer aspecto de la presente divulgación se proporciona un procedimiento para producir una inmunoglobulina no inmunogénica para su administración a una especie diana, procedimiento que comprende las etapas de:
- identificar una inmunoglobulina donante de una especie distinta a la especie diana, en el que la inmunoglobulina donante tiene especificidad de unión a un epítopo diana presente en la especie diana,
- determinar una secuencia de aminoácidos de regiones marco conservadas de dominios variables de cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina donante,
- comparar cada resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina donante con un resto de aminoácido presente en una posición correspondiente en una secuencia de aminoácidos de regiones marco conservadas de una o más inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana para identificar uno o más restos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina donante que no está presente en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la una o más inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, y
- sustituir el uno o más restos de aminoácidos identificados presentes en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina donante, pero no presentes en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la una o más inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, con un resto de aminoácido que está presente en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la una o más inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana.
El procedimiento deja sin alterar (es decir, sin sustituir) cualquier aminoácido que esté presente en una región marco conservada (FW) específica en la inmunoglobulina donante que también esté presente en al menos una de las posiciones correspondientes de la región marco conservada en inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana. En ciertos ejemplos, las secuencias de aminoácidos de las regiones marco conservadas de las inmunoglobulinas de la especie diana comprenden una combinación de restos que se pueden comparar con el resto de aminoácidos presente en la posición correspondiente en la inmunoglobulina donante. Por lo general una combinación de este tipo comprende restos de aminoácidos específicos posicionales obtenidos a partir de una pluralidad inmunoglobulinas de especies diana. Por lo general la combinación comprende datos de secuencia de región marco conservada a partir de tantas inmunoglobulinas de una especie diana como sea posible, y, si fuera viable, todas las secuencias de la región marco conservada de todas las inmunoglobulinas conocidas para una especie en particular que está presente en bases de datos publicadas.
La secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de inmunoglobulinas obtenidas a partir de diferentes especies se puede obtener a partir de un número de bases de datos disponibles al público que serán bien conocidas para la persona con experiencia en la materia. Por ejemplo, las bases de datos contenidas en el National Center for Biotechnology Information (NCBI) contienen información de secuencias de inmunoglobulina para anticuerpos obtenidos a partir de una amplia variedad de especies. Las bases de datos adicionales pueden incluir cualquier base de datos que comprenda secuencias de ADNc de línea germinal y expresado disponibles al público y pueden incluir publicaciones en revistas o bases de datos tales como, pero no limitadas a, la base de datos de secuencias de inmunoglobulina de Kabat (URL:
www.kabatdatabase.com) y V BASE, la base de datos de anticuerpos humanos (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/). Los procedimientos para preparar una tabla de posibles aminoácidos diana es algo rutinario para la persona con experiencia.
Aunque la comparación se puede realizar entre la secuencia donante y un solo miembro de la secuencia diana, Será evidente que la comparación con una combinación de secuencias diana es preferente porque esto ampliará el número de opciones naturales en cada posición de Kabat en la especie diana. Esto no solamente aumentará la posibilidad de un "emparejamiento" entre el donante y la diana, sino que también ampliará las opciones de sustitución cuando no exista un emparejamiento.
Como se define en el presente documento, una inmunoglobulina no inmunogénica es una inmunoglobulina que no tiene una respuesta inmunológica generada frente a la misma cuando se administra a una especie diana. En particular, una respuesta humoral (mediada por anticuerpos) no está mediada frente al anticuerpo, en particular frente a epítopos que comprenden restos de aminoácidos obtenidos a partir de las regiones marco conservadas (FW).
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Cuando los aminoácidos donantes y diana se diferencian en cualquier número de Kabat, el aminoácido se debe elegir entre uno del que se sabe que es natural en esa posición en la diana. Esto conducirá a un número de posibles secuencias, cualquiera de las cuales puede conducir a una secuencia preferente o al menos adecuada de la divulgación. Cuando se requiere la sustitución de un resto de aminoácido presente en una región marco conservada De una inmunoglobulina donante, por lo general esto se asume usando el principio de sustitución conservativa. Por lo general, la sustitución conservativa requiere la sustitución del aminoácido con un resto de aminoácido homólogo, que es un resto que comparte características o propiedades similares. una sustitución de este tipo se puede conocer como sustitución homóloga.
Para determinar si un aminoácido sustituido se puede sustituir con un aminoácido conservado, generalmente se puede realizar una evaluación de factores tales como, pero no limitados a, (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, y/o (c) el volumen de la cadena o cadenas laterales. Si un resto se puede sustituir con un resto que tiene características comunes, tales como una cadena lateral similar o carga o hidrofobia similares, entonces un resto de ese tipo es preferente como un sustituto.
Cuando se considera si un resto obtenido a partir de una inmunoglobulina donante que está presente en la combinación de restos de inmunoglobulina de especies diana presentes en una posición correspondiente puede estar sustituido de forma conservativa, puede ser preferente evaluar si un aminoácido homólogo está disponible en la combinación de restos correspondientes obtenidos a partir de la especie diana para esa posición especifica basándose en los aminoácidos que se están agrupando puntos de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (A. L. Lehninger, en Biochemistry, 2a Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)). Por ejemplo, se pueden determinar los siguientes grupos: (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polares sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácidos: Asp (D), Glu (E); y (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His (H). Por lo tanto la sustitución de un resto de aminoácido con otro presente en el mismo grupo es preferente.
Como alternativa, los aminoácidos se pueden agrupar como sigue a continuación: (1) aromáticos: Phe (F), Trp (W), Tyr (Y); (2) apolares: Leu (L), Val (V), Ile (I), Ala (A), Met (M); (3) alifáticos: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I); (4) Ácidos: Asp (D), Glu (E); (5) básicos: His (H), Lys (K), Arg (R); y (6) polares: Gln (Q), Asn (N), Ser (S), Thr (T), Tyr (Y). De nuevo, la sustitución de un resto de aminoácido con otro presente en el mismo grupo es preferente.
Como alternativa, los restos de aminoácidos se pueden dividir en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: Met (M), Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (i); (2) hidrófilos neutros: Cys (C), Ser (S), Thr (T), Asn (N), Gin (Q); (3) ácidos: Asp (D), Glu (E); (4) básicos: His (H), Lys (K), Arg R); (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly (G), Pro (P); y (6) aromáticos: Trp (W), Tyr (Y), Phe (F). De nuevo, la sustitución de un resto de aminoácido con otro presente en el mismo grupo podría ser preferente.
En consecuencia, las sustituciones conservativas implicarán el intercambio (sustitución) de un miembro de una de estas clases por otro de esa misma clase. En ciertos ejemplos, el resto de aminoácido que se introduce en la secuencia de la región marco conservada de la inmunoglobulina donante es el aminoácido consenso definido en esa posición específica de la combinación de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana. El aminoácido consenso es el aminoácido que se encuentra más comúnmente en esa posición en inmunoglobulinas que comprenden la colección de inmunoglobulinas de especies diana que contribuyen a la combinación.
Por lo general la sustitución de los restos de la región marco conservada no dan como resultado una reducción de la unión de la inmunoglobulina a su ligando pretendido. En particular, no existe reducción en la afinidad su especificidad de unión.
En ciertos ejemplos el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de sustituir al menos uno y preferentemente todos los dominios constantes de cadena pesada y/o ligera de la inmunoglobulina donante con cadenas pesadas y/o ligeras equivalentes obtenidas a partir de una inmunoglobulina obtenida a partir de la especie diana. En ciertos ejemplos, los dominios constantes obtenidos a partir de la especie diana son del anticuerpo de subtipo Inmunoglobulina G (IgG).
En ciertos ejemplos, la combinación de secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina donante usada para evaluar los restos de aminoácidos de las regiones marco conservadas se puede limitar a subtipos de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, por ejemplo, de cadenas ligeras kappa o lambda.
Sin desear quedar ligado por la teoría, el procedimiento da como resultado solamente un número mínimo de cambios esenciales (soluciones de aminoácidos) que se realizan en las secuencias de la región marco conservada de la inmunoglobulina donante, a la vez que se asegura que todos los aminoácidos en la secuencia de la región marco conservada resultante se alinean con los de la especie diana. En consecuencia esto minimiza los cambios estructurales resultantes de la modificación del anticuerpo de una inmunoglobulina donante a un anticuerpo que será completa o sustancialmente no inmunogénico cuando se administre a un sujeto diana. Debido al procedimiento que implica la sustitución del menor número posible de restos, el procedimiento se puede denominar Traducción Esencial Escasa (PET). Por extensión, los cambios realizados en una inmunoglobulina donante para permitir que sea no
inmunogénica cuando se administra a una especie animal diana, se puede denominar PETización y se puede hacer referencia a que el anticuerpo resultante se ha PETizado. Este procedimiento puede, por ejemplo, dar como resultado la especiación de un anticuerpo humano, de ratón o de rata existente de modo que se pueda administrar a otra especie diana, en particular una especie animal, tal como ser humano, perro, gato, o caballo sin neutralizar 5 anticuerpos que se generan frente al mismo.
En ciertos ejemplos, la especie diana es una especie diana de mamífero. En un ejemplo, la especie de mamífero diana es un animal, en particular un animal de compañía tal como, pero no limitado a, un perro, gato o caballo o un animal de ganadería. En ejemplos adicionales, la especie diana de mamífero es un ser humano.
En ciertos ejemplos, el epítopo diana es el factor del crecimiento nervioso (NGF) o factor de necrosis tumoral (TNF).
10 En diversos ejemplos adicionales se proporciona una composición que contiene una inmunoglobulina proporcionada por el procedimiento con un aspecto de la divulgación mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de la misma. La composición puede comprender adicionalmente al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Además un aspecto adicional proporciona el uso de una inmunoglobulina producida por el procedimiento de un aspecto de la divulgación mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno 15 del mismo, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad. En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se extiende al uso de las inmunoglobulinas mencionadas anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de las mismas, en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico. La divulgación se extiende adicionalmente a una inmunoglobulina producida de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, para su uso en el tratamiento o prevención 20 de una enfermedad.
Además un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la administración de una inmunoglobulina producida de acuerdo con cualquiera de los procedimientos que se definen en el presente documento, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, a un sujeto, en particular un sujeto mamífero, para el tratamiento o prevención de una enfermedad.
25 Desinmunización
En diversos aspectos adicionales, la divulgación se extiende a la modificación de una inmunoglobulina terapéutica para hacerla no inmunogénica cuando se administra a una especie específica. Dicha modificación se puede aplicar a un anticuerpo quimérico, un anticuerpo producido con una técnica de injerto de CDR o un anticuerpo humanizado.
En un aspecto adicional, la divulgación proporciona por lo tanto un procedimiento para modificar una 30 inmunoglobulina terapéutica para hacerla no inmunogénica, procedimiento que comprende las etapas de:
- proporcionar una inmunoglobulina terapéutica donante,
- determinar una secuencia de aminoácidos de al menos una región marco conservada de dominios variables de cadenas ligeras y/o pesadas de la inmunoglobulina donante
- obtener una combinación de secuencias de aminoácidos con respecto a al menos una región marco conservada
35 de dominios variables de cadenas ligeras y/o pesadas de inmunoglobulinas obtenidas a partir de una especie
diana a la que se va a administrar la inmunoglobulina,
- comparar restos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la al menos una región marco conservada de las cadenas ligeras y/o pesadas de la inmunoglobulina donante con restos de aminoácidos que tienen la misma numeración de Kabat en la combinación de secuencias de aminoácidos, y
40 - sustituir cualquier resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de al menos una región marco
conservada de las cadenas ligeras y/o pesadas de la inmunoglobulina donante con un resto de aminoácido que tiene la misma numeración de Kabat en la combinación de secuencias de aminoácidos en las que el resto de aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos de la al menos una región marco conservada de las cadenas ligeras y/o pesadas de la inmunoglobulina donante se diferencia de los restos de aminoácidos que 45 tienen la misma numeración de Kabat en la combinación de secuencias de aminoácidos.
Por lo general las inmunoglobulinas terapéuticas rehumanizadas que usan esta metodología dan como resultado una inmunoglobulina que es menos inmunogénica que el anticuerpo terapéutico donante no alterado. Además, el anticuerpo modificado retiene su afinidad y especificidad de unión. por lo tanto, el anticuerpo modificado resultante es más terapéuticamente útil.
50 En ciertos ejemplos, el anticuerpo PETizado resultante, o fragmento de unión del mismo, se une al epítopo diana deseado con una afinidad de unión Kd de 1 x 10'8 o inferior.
Además un aspecto adicional de la divulgación se extiende a la provisión de al menos una región marco conservada para su uso en un dominio variable de cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina. El procedimiento de este aspecto de la divulgación puede tener utilidad en particular en un procedimiento tal como humanización de un 55 anticuerpo, o un procedimiento equivalente usado para modificar un anticuerpo para deshumanizarlo antes de su administración ha una especie distinta a un ser humano. Las regiones marco conservadas proporcionadas con este aspecto de la divulgación se pueden introducir en un anticuerpo que está a punto de experimentar humanización o
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un proceso de especiación similar, o de modo retroactivo se puede introducir en un anticuerpo que previamente ha experimentado especiación. De forma específica, las regiones marco conservadas modificadas se pueden introducir en un anticuerpo que ha experimentado, o que está a punto de experimentar, modificación en virtud de un procedimiento tal como injerto de CDR, o que es un anticuerpo quimérico en el que la región Fab del anticuerpo se obtiene a partir de una primera especie y la región Fc el anticuerpo se obtiene a partir de una segunda especie.
En consecuencia, este aspecto adicional proporciona un procedimiento para modificar una secuencia de aminoácidos de al menos una región marco conservada de un dominio variable de cadena pesada y/o ligera de una inmunoglobulina donante, procedimiento que comprende las etapas de:
- determinar la secuencia de aminoácidos de la al menos una secuencia de la región marco conservada de la inmunoglobulina donante;
- en un resto de base de resto, comparar restos de aminoácidos específicos en cada posición de la al menos una región marco conservada de la inmunoglobulina donante con una base de datos que comprende una combinación de restos de aminoácidos encontrada en una posición del aminoácido correspondiente en secuencias de región marco conservada encontrada en anticuerpos obtenidos a partir de una especie a la que se va a administrar la inmunoglobulina fuente modificada;
- sustituir cualquier resto de aminoácido que este presente en una posición específica en la al menos una región marco conservada de la inmunoglobulina donante, pero no en la combinación de restos de aminoácidos encontrados en la correspondiente posición del aminoácido, con un resto de aminoácido que está presente en la combinación de restos de aminoácidos encontrados en la corresponden de posición del aminoácido; y
- dejar sin alterar cualquier resto de aminoácido que esté presente en una posición específica en la al menos una región marco conservada de la inmunoglobulina donante y también que esté presente en la combinación de restos de aminoácidos encontrados en la correspondiente posición del aminoácido.
Por lo general, cualquier resto de aminoácido reemplazado está sustituido con un resto de aminoácido que es el más homólogo para el resto de aminoácido que se está reemplazando. Como se ha definido anteriormente en el presente documento, se conocen grupos homólogos de restos de aminoácidos. Si un resto de aminoácido homólogo no está presente en la combinación, entonces el aminoácido se puede sustituir con el resto de aminoácido que se produce con más frecuencia en esa posición específica, el denominado resto de aminoácido consenso.
En ciertos ejemplos, el procedimiento se extiende a un procedimiento para producir un anticuerpo modificado que comprende las etapas de expresar la secuencia de la región marco conservada modificada junto con regiones determinantes de la complementariedad (CDR) y dominios constantes de cadena pesada y/o ligera de modo que se produce un anticuerpo heterotetramérico que comprende dichas secuencias de región marco conservada modificadas.
Ciertos aspectos adicionales de la presente divulgación se extienden a la provisión de un oligonucleótido que expresa la secuencia de aminoácidos de la secuencia de región marco conservada modificada a la expresión de la misma en una célula huésped.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para producir un anticuerpo terapéutico con secuencias de región marco conservada no inmunogénica, procedimiento que comprende las etapas de:
- identificar restos de aminoácidos de región marco conservada que se van a sustituir por comparación de secuencias de aminoácidos de regiones marco conservadas con combinaciones de los correspondientes restos de aminoácidos presentes en las correspondientes posiciones del aminoácido en una pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de una especie a la que se va a administrar el anticuerpo terapéutico para identificar uno o más restos de aminoácidos que se diferencian en una posición específica; y
- sustituir el uno o más restos de aminoácidos identificados con un resto de aminoácido presentes en la combinación de los correspondientes puestos de aminoácido.
En ciertos ejemplos la identificación de si un resto de aminoácido de región marco conservada está presente en la correspondiente combinación posicional de restos de aminoácidos de la especie a la que se administrará el anticuerpo se consigue realizando un alineamiento de la secuencia y los restos de la combinación. Esencialmente, los restos que están sustituidos no reducen la actividad de unión del anticuerpo modificado resultante. Es decir, el aminoácido que está sustituido se puede sustituir por un aminoácido diferente sin influir de forma significativa en las características de unión del anticuerpo. Esto se consigue principalmente sustituyendo el aminoácido con un aminoácido homólogo, es decir, un aminoácido que tiene características similares o relacionadas, tales como tamaño, polaridad/carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o el volumen de la cadena lateral. Como alternativa, el resto se puede sustituir con el resto consenso que se produce en la especie diana en una posición correspondiente.
Los restos de aminoácidos que se sustituyen (o se pueden sustituir) están presentes en posiciones que se pueden conocer como posiciones tolerantes variables. Es decir, la sustitución de ese resto por otro resto no altera la especificidad de unión de las regiones determinantes de la complementariedad que se interponen entre las regiones
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marco conservadas. Se puede considerar que una sustitución de este tipo es necesaria debido al hecho de que un resto presente en una posición específica de una región marco conservada en una especie puede estar ausente en una posición correspondiente en las secuencias de región marco conservada de una segunda especie. Por lo tanto, el aminoácido puede producir una respuesta inmunogénica generada frente al mismo debido a la formación de un epítopo que es visualizado como extraño por el sistema inmunológico de una especie en la que ese resto de aminoácido no está normalmente presente en esa posición de una secuencia de región marco conservada. Usando la metodología solución de ese resto atípico o un resto homólogo o un resto consenso que está presente en la especie diana, el epítopo potencialmente extraño se puede alterar para formar un epítopo que no se reconocerá como extraño. Por lo tanto la retirada de todos los epítopo de ese tipo de la región marco conservada de un anticuerpo puede prevenir una respuesta humoral que se está generando frente a esa porción del anticuerpo cuando se administra a un sujeto que es de una especie diferente a la especie a partir de la que se obtuvo inicialmente el anticuerpo.
Producción de región marco conservada específica de especie ubicua
El inventor ha definido adicionalmente una serie de regiones marco conservadas (FR) que se pueden combinar con reacciones determinantes de la complementariedad (CDR) para formar dominios de cadena pesada y ligera variable PETizados no inmunogénicos. Cada uno de los dominios de cadena pesada y ligera tiene 4 regiones marco conservadas, denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4. Esta metodología se puede aplicar para desinmunizar cualquier anticuerpo (inmunoglobulina) con el fin de que se pueda administrar a una especie deseada. Sin embargo, para los fines de ejemplificación solamente, los ejemplos que se indican a continuación ilustran la producción y uso de regiones marco conservadas de ese tipo en anticuerpos basados en ser humano, canino, felino y equino.
Estructura del anticuerpo
Una molécula de anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena pesada que comprende regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y regiones marco conservadas interpuestas asociadas. Las CDR de dominio variable de cadena pesada (VH) se conocen como las VHCDR, con estas CDR siendo encontradas en las siguientes posiciones de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat: VHCDR1 - restos de Kabat 31-35, VHCDR2 - restos de Kabat 50-65 y VHCDR3 - restos de Kabat 95-102 (Kabat EA y col. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5a edición de. Bethesda: US Department of Health and Human Services).
Además, un anticuerpo comprende adicionalmente un dominio variable de cadena ligera que comprende regiones CDR1, CDR2 y CDR3 y regiones marco conservadas interpuestas asociadas. Las CDR del dominio variable de cadena ligera (VL) se conocen como VLCDR, con estas CDR siendo encontradas en las siguientes posiciones de resto de aminoácido de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat: VLCDR1 - restos de Kabat 24-34, VLCDR2
- restos de Kabat 50-56 y VLCDR3 - restos de Kabat 89-97.
Un dominio variable de cadena ligera o pesada comprende cuatro regiones marco conservadas, FR1, FR2, FR3 y FR4, interpuestas con las CDR en la siguiente disposición: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona una inmunoglobulina para su administración a una especie diana, que comprende:
- dominios constantes de cadena ligera y pesada obtenidos a partir de una inmunoglobulina de la especie diana,
- regiones determinantes de la complementariedad (CDR) obtenidas a partir de una inmunoglobulina donante en las que la inmunoglobulina donante se une de forma específica a un ligando que está presente la especie diana,
y
- regiones marco conservadas obtenidas a partir de la inmunoglobulina donante en las que cualquier resto de aminoácido que tampoco está presente en una posición correspondiente en cualquier inmunoglobulina de la especie diana está sustituido por un aminoácido que se encuentra en la posición correspondiente en la especie diana.
Por lo general no se realizan sustituciones de aminoácidos para las regiones CDR del anticuerpo. Además, en ciertos ejemplos las regiones marco conservadas comprenden normas de 7 restos de aminoácidos consecutivos que se están sustituyendo con restos de la especie diana. Además, en ciertos ejemplos las regiones marco conservadas comprenden no más de 5 restos de aminoácidos consecutivos que se están sustituyendo con restos de la especie diana. Además, en ciertos ejemplos las regiones marco conservadas comprenden no más de 3 restos de aminoácidos consecutivos que se están sustituyendo con restos de la especie diana.
Además, en ciertos ejemplos no más de 10 restos de aminoácidos de la región marco conservada de la inmunoglobulina donante (FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena pesada y FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena ligera) están sustituidos con restos de la especie diana. Además, en ciertos ejemplos no más de 7 restos de aminoácidos de la región marco conservada de la inmunoglobulina donante (FR1, fR2, FR3 y FR4 de cadena pesada y FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena ligera) están sustituidos con restos de la especie diana. Además, en ciertos ejemplos no más de 5 restos de aminoácidos de la región marco conservada de la inmunoglobulina donante (FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena pesada y FR1, FR2, FR3 y FR4 de cadena ligera) están sustituidos con restos de la especie diana.
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En ciertos ejemplos la especie diana es una especie de mamífero. En particular la especie diana puede ser un ser humano, canino, felino o equino.
En consecuencia, en ciertos ejemplos en los que la inmunoglobulina se va a administrar a un canino como la especie diana, la inmunoglobulina comprende regiones de dominio constante obtenidas a partir de un anticuerpo o anticuerpos obtenidos a partir de canino, y los restos sustituidos en las regiones marco conservadas de la inmunoglobulina donante se obtienen a partir de los correspondientes restos de aminoácido de las regiones marco conservadas de canino.
En los casos en los que la inmunoglobulina se va a administrar a un felino como la especie diana, la inmunoglobulina comprende regiones de dominio constante obtenidas a partir de un anticuerpo o anticuerpos obtenidos a partir de felino, y los restos sustituidos en las regiones marco conservadas de la inmunoglobulina donante se obtienen a partir de los correspondientes restos de aminoácidos de regiones marco conservadas de felino.
En los casos en los que la inmunoglobulina se va a administrar a un equino como la especie diana, la inmunoglobulina comprende regiones de dominio constante obtenidas a partir de un anticuerpo o anticuerpos obtenidos a partir de equino, y los restos sustituidos en las regiones marco conservadas de la inmunoglobulina donante se obtienen a partir de los correspondientes restos de aminoácidos de regiones marco conservadas de regiones marco conservadas equino.
En los casos en los que la inmunoglobulina se va a administrar a un ser humano como la especie diana, la inmunoglobulina comprende regiones de dominio constante obtenidas a partir de un anticuerpo o anticuerpos obtenidos a partir de ser humano, y los restos sustituidos en las regiones marco conservadas de la inmunoglobulina donante se obtienen a partir de los correspondientes restos de aminoácidos de regiones marco conservadas de regiones marco conservadas de ser humano.
En diversos ejemplos adicionales se proporciona una composición que contiene una inmunoglobulina del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de la misma. La composición puede comprender adicionalmente al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Además un aspecto adicional proporciona el uso de una inmunoglobulina del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad. En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se extiende al uso de las inmunoglobulinas mencionadas anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de las mismas, en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico. La divulgación se extiende adicionalmente a una inmunoglobulina del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, para su uso en el tratamiento o prevención de una enfermedad.
Además un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la administración de una inmunoglobulina del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, a un sujeto, En particular un sujeto mamífero, para el tratamiento o prevención de una enfermedad.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir una inmunoglobulina que comprende las etapas de:
- introducir nucleótidos que codifican cadenas pesadas y ligeras en una célula, en las que los nucleótidos codifican dominios variables de cadena ligera y pesada que comprenden regiones marco conservadas producidas de acuerdo con los procedimientos que se definen en el presente documento, y
- expresar los nucleótidos en una célula para producir la inmunoglobulina.
Además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para producir una inmunoglobulina que es sustancialmente no inmunogénica cuando se administra a una especie diana, procedimiento que comprende las etapas de:
(1) comparar secuencias de regiones marco conservadas de cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina donante a una colección de secuencias de regiones marco conservadas de cadena pesada y/o ligera de inmunoglobulina de especie diana;
(2) sustituir cualquier resto de aminoácido que esté presente en una posición específica en las secuencias de la región marco conservada de de la inmunoglobulina donante, pero no presente en una posición correspondiente en la colección de secuencias de región marco conservada de inmunoglobulina de especie diana, con un resto de aminoácido que está presente en una posición correspondiente en la colección de secuencias de región marco conservada de inmunoglobulina de especie diana;
(3) sintetizar un segmento de ADN que codifica regiones variables de cadena pesada y/o ligera, que comprende las CDR de las regiones variables de la inmunoglobulina donante y las regiones marco conservadas sustituidas, junto con dominios constantes de cadena pesada y/o ligera apropiados para la especie;
(4) introducir el segmento de ADN en una célula; y
(5) expresar el segmento de ADN en la célula para producir y la inmunoglobulina.
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En ciertos ejemplos, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de secuenciación de la región variable de cadena ligera y cadena pesada de la inmunoglobulina donante. En ciertos ejemplos, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de purificar la inmunoglobulina.
En ciertos ejemplos, el procedimiento comprende adicionalmente la etapa de formular la inmunoglobulina en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un anticuerpo neutralizante o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse de forma específica al factor de crecimiento nervioso humano (NGF) en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma y/o una región variable de cadena pesada que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
El anticuerpo se puede preparar usando un procedimiento de la divulgación.
En ciertos ejemplos, la cadena ligera comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
En ciertos ejemplos, la cadena pesada comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
El inventor ha definido adicionalmente una serie de regiones marco conservadas (FR) que se pueden combinar con regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para formar dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras humanizados. Cada uno de los dominios de cadenas pesadas y ligeras humanas tiene 4 regiones marco conservadas, denominadas FR1, FR2, FR3 y FR4.
En consecuencia, también se proporciona un anticuerpo neutralizante o un fragmento de unión a antígeno Del mismo que es capaz de unirse de forma específica al factor de crecimiento nervioso humano (NGF) en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende al menos una de:
una región marco conservada FR1 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60,
una región marco conservada FR2 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61,
una región marco conservada FR3 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, y
una región marco conservada FR4 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63,
y/o una región variable de cadena pesada que comprende al menos una de:
una región marco conservada FR1 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 64,
una región marco conservada FR2 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65,
una región marco conservada FR3 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 66, y
una región marco conservada FR4 que consiste en o que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67.
En ciertos ejemplos, la cadena ligera comprende todas las cadenas ligeras de FR1, FR2, FR3 y FR4 y/o la cadena pesada comprende todas las cadenas pesadas de FR1, FR2, FR3 y FR4.
En ciertos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente se une de forma específica al NGF humano con una afinidad de unión que tiene una constante de disociación en equilibrio (Kd) de 1 x 10-8 o inferior.
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En ciertos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente inhibe la capacidad del NGF humano para unirse al p75 o los receptores de NGF humano de TrkA.
De preferencia, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente es no inmunogénico en seres humanos.
Por lo general el anticuerpo de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente comprende dominios constantes de cadena ligera y/o pesada obtenidos a partir de una inmunoglobulina obtenida a partir de un ser humano.
En ciertos ejemplos, el fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente se selecciona entre el grupo que consiste en un fragmento de anticuerpo de Fv de una sola cadena (scFv), un fragmento de anticuerpo Fab, un fragmento de anticuerpo Fab' y un fragmento de anticuerpo F(ab')2.
En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se extiende a un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la divulgación.
En consecuencia, además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente.
En ciertos ejemplos, el polinucleótido codifica el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
En ciertos ejemplos, el polinucleótido codifica el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
En ciertos ejemplos, el ácido nucleico aislado comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica una o más secuencias reguladoras unidas al mismo de forma operativa.
En un aspecto adicional se proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o ligera o una cadena pesada y/o ligera de la divulgación. En ciertos ejemplos el vector de expresión comprende adicionalmente una o más secuencias reguladoras. En ciertos ejemplos el vector es un plásmido o un vector retroviral.
Además un aspecto adicional proporciona una célula huésped que incorpora el vector de expresión del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente. Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una célula huésped que produce el anticuerpo de cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente.
Además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante del NGF humanizado, procedimiento que comprende la etapa de cultivar la célula huésped del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente para permitir que la célula exprese el anticuerpo neutralizante del NGF humanizado.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante del NGF caninizado de acuerdo con la divulgación que comprende las etapas de expresar uno o más de los polinucleótidos / ácidos nucleicos o vectores de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente que expresan las cadenas ligeras y/o pesadas de los anticuerpos de la divulgación en una célula huésped adecuada, recuperar los polipéptidos expresados, que se pueden expresar juntos en una célula huésped, o por separado en diferentes células huésped, y aislar anticuerpos.
En ciertos ejemplos, se proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación y al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona el uso del anticuerpo o fragmento de unión, ácido nucleico, composición farmacéutica o vector de expresión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad, tales como artritis, o para el tratamiento, prevención de la mejora del dolor, tal como dolor asociado con enfermedad (por ejemplo, dolor neuropático, dolor post-operatorio, dolor crónico, dolor oncológico, etc). En diversos aspectos
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adicionales, la presente divulgación se extiende al uso del anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico.
Además un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la administración del anticuerpo o fragmento de unión, ácido nucleico, composición farmacéutica o vector de expresión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente a un sujeto, en particular un sujeto mamífero, para el tratamiento o prevención de una enfermedad (por ejemplo, artritis) o dolor.
En ciertos ejemplos, la enfermedad es una afección causada por, asociada con o que da como resultado un aumento de la sensibilidad con respecto al factor de crecimiento nervioso (NGF). En ciertos ejemplos, la enfermera se refiere a un tumor inducido para proliferar por NGF (por ejemplo, un osteosarcoma).
En ciertos ejemplos, los procedimientos de la divulgación mencionados anteriormente comprenden adicionalmente la etapa de coadministrar al menos un agente adicional que puede aumentar y/o complementar la eficacia del anticuerpo anti-NGF de la divulgación. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede coadministrar junto con al menos un analgésico, AINE, opioide, corticosteroide, esteroide, hialuronano o ácido hialurónico.
Además en un aspecto adicional se proporciona una línea celular, o un derivado o célula de progenie de la misma, que produce anticuerpos monoclonales neutralizantes de anti-NGF humano, o fragmentos del mismo de acuerdo con la divulgación.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un kit para el tratamiento del dolor en seres humanos, o para el tratamiento de una afección asociada con dolor, o para el tratamiento, mejora o inhibición del dolor asociado con osteoartritis, artritis reumatoide e inflamación, que comprende un anticuerpo anti-NGF de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente e instrucciones para uso del mismo.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un kit de diagnóstico para la detección de un anticuerpo monoclonal anti-NGF humano en fluidos in vitro, ex vivo y in vivo, para uso en la determinación de la concentración de dicho anticuerpo. El kit puede comprender cualquiera de los anticuerpos de la divulgación o un fragmento de unión del mismo. El kit puede comprender instrucciones para uso del mismo.
Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un anticuerpo neutralizante o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse de forma específica al factor de necrosis tumoral canino (TNF) en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma Y/o una región variable de cadena pesada que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
El anticuerpo se puede preparar usando un procedimiento de la divulgación. Por lo general el anticuerpo de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente comprende dominios constantes de cadena ligera y/o cadena pesada obtenidos a partir de una inmunoglobulina obtenida a partir de un canino. En ciertos ejemplos, la cadena pesada comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, 19, 20 o 21, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % , un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
En ciertos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente se une de forma específica al TNF canino con una afinidad de unión que tiene una constante de disociación en equilibrio (Kd) de 1 x10'8 o inferior. De preferencia, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente es no inmunogénico en caninos.
En ciertos ejemplos, el fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente se selecciona entre el grupo que consiste en un fragmento de anticuerpo de Fv de una sola cadena (scFv), un fragmento de anticuerpo Fab, un fragmento de anticuerpo Fab' y un fragmento de anticuerpo F(ab')2.
En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se amplía un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la divulgación.
En consecuencia, además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente.
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En ciertos ejemplos, el polinucleótido codifica el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-TNF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
En ciertos ejemplos, el ácido nucleico aislado comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica una o más secuencias reguladoras unidas al mismo de forma operativa. En un aspecto adicional se proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o ligera o una cadena pesada y/o ligera de la divulgación. En ciertos ejemplos el vector de expresión comprende adicionalmente una o más secuencias reguladoras. En ciertos ejemplos el vector es un plásmido o un vector retroviral. Además un aspecto adicional proporciona una célula huésped que incorpora el vector de expresión del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente. Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una célula huésped que produce el anticuerpo de cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente.
Además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante de TNF caninizado, procedimiento que comprende la etapa de cultivar la célula huésped del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente para permitir que la célula exprese el anticuerpo neutralizante de TNF caninizado.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante de TNF de acuerdo con la divulgación que comprende las etapas de expresar uno o más de los polinucleótidos / ácidos nucleicos o lectores de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente que expresan las cadenas ligeras y pesadas de los anticuerpos de la divulgación en una célula huésped adecuada, recuperando los polipéptidos expresados, que se pueden expresar juntos en una célula huésped, o por separado en diferentes células huésped, y aislar anticuerpos.
En ciertos ejemplos, se proporciona un anticuerpo o fragmento de unión de la divulgación y al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona el uso del anticuerpo o fragmento de unión, ácido nucleico, composición farmacéutica o vector de expresión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad, en particular cualquier afección causada por, asociada con o que da como resultado un aumento de la expresión del TNF canino o un aumento de la sensibilidad hacia TNF en un canino. En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se extiende al uso del anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico.
Además un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la administración del anticuerpo o fragmento de unión, ácido nucleico, composición farmacéutica o vector de expresión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente a un canino, para el tratamiento o prevención de una enfermedad.
Además en un aspecto adicional se proporciona una línea celular, o un derivado o célula de progenie de la misma, que produce anticuerpos monoclonales neutralizantes de anti-TNF canino, o fragmentos del mismo de acuerdo con la divulgación.
Un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un anticuerpo neutralizante o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse de forma específica al factor de crecimiento nervioso (NGF) canino, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma y/o una región variable de cadena pesada que comprende, que consiste en o que consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
El anticuerpo se puede preparar usando un procedimiento de la divulgación.
En ciertos ejemplos, la cadena ligera comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
En ciertos ejemplos, la cadena pesada comprende, consiste en o consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma. En ciertos ejemplos dicha identidad es con respecto a una longitud de al menos aproximadamente 15 aminoácidos, preferentemente aproximadamente 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 25 aminoácidos.
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En ciertos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente se une de forma específica al NGF canino con una afinidad de unión que tiene una constante de disociación en equilibrio (Kd) de 1 x 10-8 o inferior. En ciertos ejemplos, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente inhibe la capacidad del NGF canino para unirse al p75 o a los receptores de NGF canino TrkA. De preferencia, el anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente es no inmunogénico en caninos.
Por lo general el anticuerpo de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente comprende dominios constantes de cadena ligera y/o cadena pesada obtenidos a partir de una inmunoglobulina obtenida a partir de un canino.
En ciertos ejemplos, el fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente se selecciona entre el grupo que consiste en un fragmento de anticuerpo de Fv de una sola cadena (scFv), un fragmento de anticuerpo Fab, un fragmento de anticuerpo Fab' y un fragmento de anticuerpo F(ab')2.
En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se extiende a un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo o fragmentos de unión a antígeno de la divulgación.
En consecuencia, además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente.
En ciertos ejemplos, el polinucleótido codifica el dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la cadena ligera de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
En ciertos ejemplos, el polinucleótido codifica el dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
También se proporciona un ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada de un anticuerpo anti-NGF o fragmento de unión a antígeno que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 70, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % con la misma.
En ciertos ejemplos, el ácido nucleico aislado comprende adicionalmente un ácido nucleico que codifica una o más secuencias reguladoras unidas al mismo de forma operativa.
En un aspecto adicional se proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o ligera o una cadena pesada y/o ligera de la divulgación. En ciertos ejemplos el vector de expresión comprende adicionalmente una o más secuencias reguladoras. En ciertos ejemplos el vector es un plásmido o un vector retroviral.
Además un aspecto adicional proporciona una célula huésped que incorpora el vector de expresión del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente. Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una célula huésped que produce el anticuerpo de cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente.
Además un aspecto adicional de la divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante del NGF caninizado, procedimiento que comprende la etapa de cultivar la célula huésped del aspecto de la divulgación mencionado anteriormente para permitir que la célula exprese el anticuerpo neutralizante del NGF caninizado.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un procedimiento para producir un anticuerpo neutralizante del NGF caninizado de acuerdo con la divulgación que comprende las etapas de expresar uno o más de los polinucleótidos / ácidos nucleicos o vectores de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente que expresan las cadenas ligeras y/o pesadas de los anticuerpos de la divulgación en una célula huésped adecuada, recuperar los polipéptidos expresados, se pueden expresar juntos en una célula huésped, o por separado en diferentes células huésped, y aislar los anticuerpos.
En ciertos ejemplos, se proporciona un anticuerpo un fragmento de unión de la divulgación y al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona el uso del anticuerpo o fragmento de unión, ácido nucleico, composición farmacéutica o vector de expresión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad, tal como artritis, o para el tratamiento, prevención o mejora de dolor, tal como dolor asociado con una enfermedad (por
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ejemplo, dolor neuropático, dolor post-operatorio, dolor crónico, dolor oncológico, etc) en un canino. En diversos aspectos adicionales, la presente divulgación se extiende al uso del anticuerpo o fragmento de unión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente en procedimientos terapéuticos y de diagnóstico.
Además un aspecto adicional de la divulgación se refiere a la administración del anticuerpo o fragmento de unión, ácido nucleico, composición farmacéutica o vector de expresión de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente a un canino para el tratamiento o prevención de una enfermedad (por ejemplo artritis) o dolor.
En ciertos ejemplos, la enfermedad es una afección causada por, asociada con lo que da como resultado un aumento de la sensibilidad al factor del crecimiento nervioso (NGF). En ciertos ejemplos, la enfermera se refiere a un tumor inducido para proliferar por NGF (por ejemplo, un osteosarcoma).
En ciertos ejemplos, los procedimientos de la divulgación mencionados anteriormente comprenden adicionalmente la etapa de coadministración de al menos un agente adicional que puede aumentar y/o complementar la eficacia del anticuerpo anti-NGF de la divulgación. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo se puede coadministrar junto con al menos un analgésico, AINE, opioide, corticosteroide, esteroide, hialuronano o ácido hialurónico.
Además en un aspecto adicional se proporciona una línea celular, o un derivado o célula de progenie de la misma, que produce anticuerpos monoclonales neutralizantes de anti-NGF canino, o fragmentos del mismo de acuerdo con la divulgación.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un kit para el tratamiento de dolor en caninos, o para el tratamiento de una afección asociada con dolor, o para el tratamiento, mejora o inhibición del dolor asociado con osteoartritis, artritis reumatoide e inflamación, que comprende un anticuerpo anti-NGF de acuerdo con cualquiera de los aspectos de la divulgación mencionados anteriormente e instrucciones para el uso del mismo.
Además un aspecto adicional de la presente divulgación proporciona un kit de diagnóstico para la detección de un anticuerpo monoclonal anti-NGF canino en fluidos in vitro, ex vivo y in vivo, para uso para determinar la concentración de dicho anticuerpo. El kit puede comprender cualquiera de los anticuerpos de la divulgación o un fragmento de unión de los mismos. El kit puede comprender instrucciones para uso del mismo.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un alineamiento de las secuencias de región marco conservada FR1 a FR4 de la cadena ligera del anticuerpo aD11 de rata con versiones específicas de especies canina, felina y equina (SEQ ID NO: 28 a 43).
La Figura 2 muestra un alineamiento de las secuencias de región marco conservada FR1 a FR4 de la cadena pesada del anticuerpo aD11 de rata con versiones específicas de especies canina, felina y equina (SEQ ID NO: 44 a 59).
La Figura 3 muestra secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada (SEQ ID NO: 2) y ligera (SEQ ID NO: 1) de una versión canina del MAb anti-NGF aD11 y de la cadena ligera (SEQ ID NO: 7) y cadena (SEQ ID NO: 8) completas.
La Figura 4 muestra secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada (SEQ ID NO: 4) y ligera (SEQ ID NO: 3) de una versión felina del MAb anti-NGF aD11 y de las cadenas ligera (SEQ ID NO: 9) y pesada (SEQ ID NO: 10) completas.
La Figura 5 muestra secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada (SEQ ID NO: 6) y ligera (SEQ ID NO: 5) de una versión equina del MAb anti-NGF aD11 y de las cadenas ligera (SeQ ID NO: 11) y pesada (SEQ ID NO: 12) completas.
La Figura 6 muestra un gel con la expresión de versiones de formación de especies de canino, felino y equino del MAb de aD11.
La Figura 7A es un gráfico que muestra que los MAb de canino expresados y purificados con respecto al NGF canino son biológicamente activos.
La Figura 7B es un gráfico que muestra que los MAb de felino expresados y purificados con respecto al NGF felino son biológicamente activos, mientras que la Figura 7C es un gráfico que muestra que los MAb de equino expresados y purificados con respecto al NGF equino son biológicamente activos. La Figura 7D es un gráfico que compara la capacidad de los MAb de canino, felino y equino para neutralizar la actividad biológica del NGF.
La Figura 8A es un alineamiento de aminoácidos que muestra una comparación de modificaciones de la región marco conservada de cadena ligera entre una versión humanizada conocida del anticuerpo alfa D11 de rata (Pavone y col., documento WO 06/131951) y una nueva variante humanizada de aD11 (Hu Nueva - SEQ ID NO: 60-63). La Figura 8B es una comparación de modificaciones de la región marcó conservada de cadena pesada entre la versión humanizada conocida del anticuerpo alfa D11 de rata (Pavone y col., documento WO
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06/131951) y la nueva variante humanizada de aD11 (Hu Nueva - SEQ ID NO: 64-67).
La Figura 9A muestra las secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 13) y cadena pesada (SEQ ID NO: 14) del nuevo anticuerpo alfa D11 humanizado de la Figura 8 - las CDR están subrayadas. La Figura 9B muestra las cadenas pesada y ligera completas (SEQ ID NO: 24 y 25) diseñadas usando los dominios variables de la cadena ligera y de la cadena pesada que se muestran en la Figura 9A. La Figura 9C muestra un ensayo de ELISA que compara un anticuerpo preparado a partir de las secuencias en la Figura 9B con un anticuerpo diseñado mediante injerto de CDR, como fue descrita anteriormente por Pavone y colaboradores. La Figura 9D muestra la inhibición de la proliferación del NGF de células TF-1 con las dos variantes humanizadas de anticuerpos monoclonales alfa D11 usados en la Figura 9C.
La Figura 10 muestra secuencias de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 15) y cadena pesada (SEQ ID NO: 16) de un anticuerpo anti-TNF caninizado basado en el humano MAb D2E7 (Salfield y col., documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.090.382).
La Figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de cadena ligera kappa (SEQ ID NO: 17) de un anticuerpo anti-TNF caninizado.
La Figura 12 muestra las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de 4 subtipos (tipos A, B, C y D de cadena pesada) de un anticuerpo anti-TNF caninizado.
La Figura 13 muestran las secuencias de aminoácidos de cadena ligera (SEQ ID NO: 22) y cadena pesada (SEQ ID NO: 23) completas de un anticuerpo anti-TNF humano-canino quimérico.
La Figura 14A muestra los resultados de anticuerpos anti-TNF caninizados (Ca) y quiméricos (Qu) coexpresados purificados usando Proteína A y analizados con SDS-PAGE, mientras que la Figura 14B muestra los resultados de un ELISA que muestra la unión de proteínas recombinantes expresadas con respecto al TNF-alfa canino. Se muestran resultados con diversas diluciones es de anticuerpos de 5 pg/ml a 0,05 pg/ml.
La Figura 15 muestra la inhibición de la bioactividad del TNF canino usando células 293-HEK transfectadas con la construcción pTRH1 del indicador NF-kB-EGFP. Estas células responden al TNF canino mediante florescencia. Los MAb tanto caninizado (Figura 15A) como quimérico (Figura 15B) inhibían la fluorescencia inducida por el TNF igualmente bien, tal como se cuantifica en la Figura 15C.
La Figura 16 muestra una comparación para un MAb caninizado adicional basándose en el clon 148 del MAb anti-TNF expresado en células CHO y purificado usando cromatografía de Proteína A (Panel A, calle izquierda). El MAb se sometió a ensayo para unión al TNF humano (Panel B) y al TNF canino (Panel C) en comparación con los MAb basados en D2E7 caninizado (Ca) y quimérico (Qu) de la Figura 14 (la unión del negativo de fondo se muestra con las flechas).
La Figura 17 muestran la cadena pesada (SEQ ID NO: 26 - ca148-HCB) y la cadena ligera (SEQ ID NO: 27 - ca148-kLC) del clon 148 del Mab caninizado.
La Figura 18 muestra que los anticuerpos monoclonales del NGF anti-canino preparados con un procedimiento de la presente invención reducen el dolor inflamatorio en perros.
Descripción detallada de la divulgación
La presente divulgación se extiende a nuevos procedimientos para diseñar y preparar una variante de un anticuerpo donante que presenta una reducción de la inmunogenicidad cuando se administra a una especie que es diferente a aquella de la que se obtiene el anticuerpo, mientras que al mismo tiempo mantiene (es decir, no disminuye) la afinidad de unión, avidez o especificidad del anticuerpo para el ligando diana. En particular la secuencia de las regiones marco conservadas del anticuerpo o un fragmento de unión a anticuerpo se evalúan y se modifican para retirar restos que no se encuentran en una posición correspondiente en una combinación de anticuerpos obtenidos a partir de la especie a la que se va a administrar el anticuerpo.
En particular, los procedimientos de la divulgación modifican el marco conservado de un anticuerpo donante (precursor) de modo que es compatible de forma óptima con el receptor pretendido cuando el receptor pretendido es una especie distinta a la del donante.
Hasta el momento en la técnica, el enfoque más comúnmente usado para desinmunizar un anticuerpo ha sido seleccionar un marco conservado compatible de la secuencia de línea germinal de una especie receptora e injertar las regiones CDR en este marco conservado. El problema con este enfoque es que el marco conservado seleccionado casi nunca es un emparejamiento perfecto para las CDR y, como resultado, la afinidad de unión al epítopo diana pretendido se reduce. A continuación se requiere una maduración por afinidad que da como resultado la introducción de aminoácidos que en ocasiones son extraños para el receptor en las posiciones en las que se introducen. La solución es el procedimiento de la presente divulgación en el que la modificación del marco conservado donante solamente se inicia cuando un aminoácido es extraño para el receptor en una posición
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específica. La sustitución se elige del listado de opciones ensamblará como parte de la presente divulgación. Como resultado, que es el punto decisivo de la divulgación, esencialmente no existe modificación estructural del marco conservado donante y por lo tanto esencialmente no hay distorsión de la conformación de las CDR, pero al mismo tiempo no hay "auto" aminoácidos dentro del marco conservado y la inmunoglobulina resultante carece de epítopo este marco conservado que son extraños en la especie diana. La metodología se puede usar para modificar una inmunoglobulina para administración a cualquier especie diana deseada.
En el estudio más amplio de variedad de secuencia de inmunoglobulina hasta la fecha, Glanville y colaboradores (2009) estudiaron la composición de aminoácido de casi 100.000 ADNc de cadena pesada y ligera amplificados a partir de la IgM no tratada previamente de 654 donantes humanos. Un 95 % de las secuencias se diferenciaban de la línea germinal en hasta 30 anulaciones cada una. Se demostró que las CDR 1 y 2 que mutan solamente a través de mutación somática permanecían inalteradas a partir del ADN de la línea germinal solamente un 17% de las veces y un 78 % de las secuencias de CDR 1 y 2 tenían entre 1 y 6 diferencias de aminoácidos. Este estudio no describía a la mutación de restos de marco conservado de no CDR, descritos en las Tablas que se muestran en el presente documento. dado que la hipermutación somática se produce a través de un mecanismo de rectificación de ADN propenso a error, es improbable que la tasa de mutación per se sea diferente entre la observada para CDR 1 o 2 y el resto de las secuencias de marco conservadas y, además, una selección secundaria profunda después de la hipermutación somática en el repertorio experimentado por antígeno durante la maduración de la respuesta inmunológica podría permitir una diversidad de aminoácidos adicionales en regiones marco conservadas. Por estas razones, es probable que la diversidad observada en las colecciones de secuencias de IgG humanas, caninas, equinas y felinas que se describen en el presente documento sea representativa de secuencias de IgG circulante. De forma sorprendente, existe una superposición considerable entre los aminoácidos codificados en posiciones de marco conservadas de "Kabat" homólogos de inmunoglobulinas de cada hipermutación post-somática de la especie y, en consecuencia, esto reduce los cambios necesarios para convertir de una especie a otra de acuerdo con el procedimiento de la presente divulgación.
Como un ejemplo de la presente divulgación y siguiendo una amplia experimentación, el intento ha tomado el anticuerpo del TNF anti-humano D2E7 y el anticuerpo del NGF de rata anti-ratón aD11, que no se sabía que se unían al TNF alfa canino o NGF canino, y de forma sorprendente ha usado estos como una base para producir anticuerpos no inmunogénico es adecuados para su uso en caninos. Se muestra que los anticuerpos no inmunogénicos resultantes, que no se producen usando técnicas convencionales de injerto de CDR, presentan una unión por afinidad elevada al TNF y NGF caninos respectivamente. Además, los anticuerpos se han diseñado de modo que el marco y las regiones constantes incorporan solamente restos presentes en moléculas de IgG de canino de modo que cuando se administran a un canino, es improbable que se produzcan xenoanticuerpos frente a las mismas. En consecuencia, los anticuerpos caninizados de la divulgación son adecuados para administración a largo plazo para el tratamiento de enfermedades en caninos. Del mismo modo, los anticuerpos NGF felinizados, humanizados y equinizados de la divulgación son adecuados para administración a largo plazo para el tratamiento de enfermedades en felinos, seres humanos y equinos respectivamente.
El procedimiento para generar los dominios variables de cadena pesada y ligera para los anticuerpos de la divulgación que ha usado el inventor da como resultado el reemplazo de restos de aminoácidos donantes específicos conocidos por ser extraños para la diana (por ejemplo, caninos) en esa posición con un resto diana (por ejemplo, canino) que, basándose en el análisis del inventor, mantendrá la conformación de las regiones CDR y por lo tanto mantendrá la especificidad y la avidez de unión, a la vez que se reduce la presencia de epítopo se inmunogénico se pueden dar como resultado anticuerpos neutralizantes que se generan frente al anticuerpo si se fuera a administrar a la diana (por ejemplo, caninos) en una forma no alterada. De forma específica, el procedimiento para preparar anticuerpos de la divulgación
(conocido como PETización) comprende la evaluación de la secuencia de las regiones marco conservadas de un anticuerpo donante (por ejemplo, ser humano) para idoneidad para su administración a una diana (por ejemplo, canina) comparando la secuencia de las regiones marco conservadas del anticuerpo donante con la secuencia de un anticuerpo o una combinación de anticuerpos obtenidos a partir de la diana (por ejemplo, canina). Aunque la comparación se puede realizar entre la secuencia donante y un solo miembro de la secuencia diana, será evidente que la comparación con una combinación de secuencias diana es preferente porque esta ampliará el número de opciones naturales en cada posición de Kabat en la especie diana. Esto no solamente aumentará la posibilidad de un "emparejamiento" entre el donante y la diana, sino que también ampliará las opciones para reemplazo cuando no exista emparejamiento. Como resultado, se podrá elegir un reemplazo con características tan similares como sea posible a las del donante. Cuando la secuencia donante y la secuencia canina se diferencian en cualquier número de Kabat o posición correspondiente, la secuencia donante se modifica para sustituir el resto de aminoácido en cuestión con un resto de aminoácido que se sabe que es natural en esa posición en la diana (por ejemplo, caninos).
Cuando se requiere sustitución de un resto de aminoácido presente en una región marco conservada de la inmunoglobulina donante, por lo general esto se inicia usando el principio de sustitución conservativa en la que un resto de aminoácido se reemplaza con un resto de aminoácido que es natural en esa posición de Kabat en la diana (por ejemplo, un canino) y está tan relacionada como sea posible respecto al tamaño, carga e hidrofobia con el aminoácido que se está sustituyendo en la secuencia tonante. La intención es elegir un reemplazo que podría causar ninguna, o al menos solamente mínima, perturbación o alteración en la estructura tridimensional del anticuerpo
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donante. En ciertas situaciones, no habrá una opción evidente y cada elección tendrá beneficios e inconvenientes. Una decisión final puede requerir un modelado tridimensional o incluso la expresión de diversas secuencias alternativas. Sin embargo, generalmente, a la disponibilidad de una preferencia evidente. Como resultado de este procedimiento, un cambio en la secuencia donante solamente se realiza cuando ese resto pudiera ser extraño en la diana y el reemplazo del aminoácido está tan estrechamente relacionado como sea posible con el que reemplaza. Por lo tanto, se evita la creación de epítopos extraños, pero la estructura tridimensional general se conserva y como resultado, también se conservan la afinidad y la especificidad. Los ejemplos usados a modo de ejemplo de este aspecto de la divulgación incluyen:
- secuencias de cadena ligera SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 25, 27 y 71.
- secuencias de cadena pesada SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 24, 26, 68, 69 y 70.
Producción de anticuerpo
Los anticuerpos y miembros de unión de la divulgación se pueden producir de forma completa o parcial mediante síntesis química. Por ejemplo, los anticuerpos y miembros de unión de la divulgación se pueden preparar mediante técnicas que son bien conocidas para la persona con experiencia en la materia, tales como procedimientos de síntesis peptídica en fase líquida convencional, o mediante síntesis peptídica en fase sólida. Como alternativa, los anticuerpos y miembros de unión se pueden preparar en solución usando técnicas de síntesis peptídica en fase líquida, o adicionalmente con una combinación de química de fase sólida, fase líquida y solución.
La presente divulgación se extiende adicionalmente a la producción de los anticuerpos o miembros de unión de la divulgación mediante expresión de un ácido nucleico que codifica al menos un aminoácido que comprende un anticuerpo de la divulgación en un sistema de expresión adecuado, de modo que se puede codificar un péptido o polipéptido deseado. Por ejemplo, se puede expresar un primer ácido nucleico que codifica la cadena ligera del aminoácido y un segundo ácido nucleico que codifica una cadena pesada del aminoácido para proporcionar un anticuerpo de la presente divulgación.
En consecuencia, en ciertos aspectos adicionales de la divulgación, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que forman los anticuerpos o miembros de unión de la presente divulgación.
Por lo general, los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos que forman anticuerpos o miembros de unión de la presente divulgación se pueden proporcionar en una forma aislada o purificada, o se pueden proporcionar en una forma que está sustancialmente libre de material que puede estar asociado de forma natural con los mismos, con la excepción de una o más secuencias reguladoras. Los ácidos nucleicos expresan un anticuerpo o miembro de unión de la divulgación pueden ser total o parcialmente sintéticos y pueden incluir, pero no se limitan a, ADN, ADNc y ARN.
La persona con experiencia en la materia puede preparar fácilmente las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o miembros de unión de la divulgación usando técnicas que son bien conocidas para los expertos en la materia, tales como las que se describen en Sambrook y col. "Molecular Cloning", A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Volúmenes 1-3, 2001 (ISBN-0879695773), y en Ausubel y col. Short Protocols in Molecular Biology. John Wiley and Sons, 4a Edición, 1999 (ISBN - 0471250929). Dichas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de ácido nucleico, (ii) síntesis química, o (iii) preparación de secuencias de ADNc. Los anticuerpos o miembros de unión que codifican ADN de la divulgación se pueden generar y usar de cualquier modo adecuado conocido por los expertos en la materia, incluyendo tomar ADN codificante, identificar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción de cualquier lado de la porción a expresar, y recortar dicha porción del ADN. A continuación la porción escindida se puede unir de forma operativa a un promotor adecuado y se puede expresar en un sistema de expresión adecuado, tal como un sistema de expresión disponible en el mercado. Como alternativa, las porciones relevantes de ADN se pueden amplificar usando cebadores de PCR adecuados. Las modificaciones a las secuencias de ADN se pueden realizar usando un mutagénesis dirigida al sitio.
Las secuencias de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos o miembros de unión de la divulgación se pueden proporcionar como construcciones en forma de un plásmido, vector, casete de transcripción o expresión que comprende al menos un ácido nucleico como se ha descrito anteriormente. La construcción puede estar comprendida dentro de una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como se ha mencionado anteriormente. La expresión se puede conseguir de forma conveniente mediante cultivo, en condiciones apropiadas, de células huésped recombinantes que contienen secuencias de ácidos nucleicos adecuadas. Después de la expresión, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar y/o purificar usando cualquier técnica adecuada, y a continuación se pueden usar cuando sea apropiado.
Se conocen bien algunos sistemas para clonación y expresión de un polipéptido en una diversidad de células huésped diferentes. Las células huésped adecuadas incluyen sistemas de bacteria, células de mamífero, levadura, insecto y baculovirus. Las líneas de células de mamífero disponibles en la técnica para expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón de cría de hámster y células de mieloma de ratón NS0. un huésped bacteriano común, preferente es E. coli. La expresión de anticuerpos
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y fragmentos de anticuerpo en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia como una opción para producción de un miembro de unión.
Las técnicas generales para la producción de anticuerpos son bien conocidas para la persona con experiencia en la materia, con procedimientos de ese tipo siendo discutidos en, por ejemplo, Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495497; documento de Patente de Estados Unidos N.° 4.376.110; Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor. En las referencias mencionadas anteriormente y también en, por ejemplo, el documento de Patente Europea con Número 0.368.684 se describen técnicas para la preparación de anticuerpo recombinante.
En ciertos ejemplos de la divulgación, se usan ácidos nucleicos recombinantes que comprenden una inserción que codifica un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos o miembros de unión. Por definición, los ácidos nucleicos de ese tipo comprenden ácidos nucleicos monocatenarios, ácidos nucleicos bicatenarios que consisten en dichos ácidos nucleicos codificantes y ácidos nucleicos complementarios con los mismos, o estos propios ácidos nucleicos (monocatenarios).
Además, los ácidos nucleicos que codifican un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena ligera de anticuerpos pueden ser ácidos nucleicos sintetizados por vía enzimática o por vía química que tienen la auténtica secuencia de codificación para un dominio variable de cadena pesada de origen natural y/o para el dominio variable de cadena ligera, o un mutante del mismo.
Un anticuerpo de la divulgación se puede producir con medios recombinantes, no solo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia señal u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N-terminal de la proteína madura o polipéptido. La secuencia señal heteróloga seleccionada es preferentemente una que es reconocida y procesada (Es decir, escindida por una peptidasa señal) por la célula huésped. para células huésped procariotas que no reconocen Ni procesan una secuencia señal de anticuerpo nativo, la secuencia señal se sustituye con una secuencia señal procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp y líderes de enterotoxina II estables al calor.
El término "aislado", cuando se usa en referencia a los anticuerpos de la divulgación, o a miembros de unión obtenidos a partir de los mismos, o polipéptidos que codifican los mismos, se refiere al estado en el que dichos anticuerpos, miembros de unión o ácidos nucleicos (polinucleótidos) se proporcionan en una forma aislada y/o purificada, es decir, que se han separado, aislado o purificado a partir de su entorno natural, y se proporcionan en una forma sustancialmente pura u homogénea, o, en el caso del ácido nucleico, libre o sustancialmente libre de ácido nucleico o genes de un origen distinto al de la secuencia que codifica un polipéptido con la función requerida. En consecuencia, los anticuerpos aislados, miembros de unión y ácidos nucleicos aislados de este estarán libres o sustancialmente libres de material con el que se asocian de forma natural, tal como otros polipéptidos o ácidos nucleicos con los que se encuentran en su entorno natural, o el entorno en el que se preparan (por ejemplo, cultivo celular) cuando una preparación de ese tipo es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo.
Los anticuerpos, miembros de unión y ácidos nucleicos se pueden formular con diluyentes o adyuvantes y además, con fines prácticos, se puede considerar que se proporcionan en una forma aislada. Por ejemplo los anticuerpos y miembros de unión se pueden mezclar con gelatina u otros vehículos si se usan para revestir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclaran con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se usan en diagnóstico o terapia. Los anticuerpos o miembros de unión pueden estar glicosilados, ya sea de forma natural o mediante sistemas de células eucariotas heterólogas (por ejemplo células CHO o NSO), o pueden estar (por ejemplo, si se producen mediante expresión en una célula procariota) sin glicosilar.
Las preparaciones heterogéneas que comprenden anticuerpos de la divulgación también forman parte de la divulgación. Por ejemplo, las preparaciones de ese tipo pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas de longitud completa y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con diversos grados de glucosilación y/o con aminoácidos derivatizados, tal como ciclado de un ácido glutámico N-terminal para formar un resto de ácido piroglutámico.
Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tiene significado que normalmente entiende una persona que tiene experiencia en la materia en el campo de la presente divulgación. El significado y alcance de los términos debería ser evidente, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad, las definiciones que se proporcionan el presente documento prevalecen sobre cualquier definición de diccionario o extrínseca.
A través de la memoria descriptiva, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, se entenderá que los términos "comprender" o "incluir", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", "incluye" o "que incluye" implican la inclusión de un número entero o grupo de números enteros indicados, pero no la exclusión de cualquier
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otro número entero o grupo de números enteros.
Como se usa en el presente documento, los términos tales como "un", "uno" y "el" incluyen referentes en singular y en plural a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un agente activo" o "un agente farmacológicamente activo" incluye un solo agente así como dos o más agentes activos diferentes en combinación, mientras que las referencias a "un vehículo" incluyen mezclas de dos o más vehículos así como un solo vehículo, y similares. además, a menos que el contexto requiera de otro modo, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.
La expresión "aminoácido correspondiente" se refiere a un resto de aminoácido que se encuentra en una posición idéntica (es decir, se encuentran uno frente al otro) cuando dos o más secuencias de aminoácidos se alinean para permitir una identidad de secuencias máxima entre las secuencias. Los restos de aminoácido en posiciones correspondientes tienen la misma numeración de Kabat. En particular, las secuencias de aminoácidos de regiones marco conservadas de diferentes anticuerpos pueden estar alineadas o la secuencia de aminoácidos de una secuencia de región marco conservada de un anticuerpo se puede comparar con una combinación de restos de aminoácidos de región marco conservada específica posicional obtenida a partir de una pluralidad de inmunoglobulinas de una especie en parte una. La persona con experiencia en la materia conoce bien procedimientos para alinear y numerar secuencias de anticuerpos se desvelan en Kabat y col. (Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. y Foeller, C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. Publicación del NIH N.° 91-3242).
La expresión "región determinante de la complementariedad (CDR)", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de aminoácidos que en conjunto definen la afinidad y especificidad de unión de la región Fv natural de un sitio de unión a inmunoglobulina nativa tal como lo describen Kabat y col. (Kabat, E.A., Wu, T.T., Perry, H., Gottesman, K. y Foeller,C. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición. Publicación del NIH N.° 91-3242). La expresión "región marco conservada (FR)", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de aminoácidos interpuestas entre las CDR. Estas porciones del anticuerpo sirven para mantener las CDR en una orientación apropiada (permite que las CDR se unan al antígeno).
La expresión "región constante (CR)" como se usa en el presente documento, se refiere a la porción de la molécula de anticuerpo que proporciona funciones efectoras. En la presente divulgación, las regiones constantes por lo general significan regiones constantes de la especie diana, es decir, de las regiones constantes de los anticuerpos objeto sometidos a especiación se obtienen a partir inmunoglobulinas de la especie diana. Por ejemplo, en anticuerpos de canino la región constante de cadena pesada se puede seleccionar a partir de cualquiera de cuatro isotipos A, B, C o D.
La expresión "anticuerpo quimérico" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo que contiene secuencias obtenidas a partir de dos anticuerpos diferentes, que por lo general son de especies diferentes. Más generalmente, los anticuerpos quiméricos comprenden dominios variables obtenidos a partir de una especie donante que se une de forma específica a un epítopo diana y dominios constantes obtenidos a partir de anticuerpos obtenidos a partir de la especie diana a la que se va a administrar el anticuerpo.
El término "inmunogenicidad" como se usa en el presente documento se refiere a una medición de la capacidad de una proteína de dirección o resto terapéutico para provocar una respuesta inmune (humoral o celular) cuando se administra a un receptor. La presente divulgación está relacionada con la inmunogenicidad de los anticuerpos objeto sometidos a especiación. De preferencia los anticuerpos de la presente divulgación no tienen inmunogenicidad, es decir, que no se generarán anticuerpos neutralizantes frente a los mismos cuando se administran a una especie diana.
La expresión "consiste esencialmente en" o "que consiste esencialmente en" como se usa en el presente documento significa que un polipéptido puede tener características o elementos adicionales más allá de los descritos con la condición de que tales características por elementos adicionales no influyan de forma material en la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para tener especificidad de unión a la diana deseada. Es decir, el anticuerpo o fragmentos de anticuerpo que comprenden los polipéptidos pueden tener características o elementos adicionales que no interfieren con la capacidad del anticuerpo o fragmentos de anticuerpo para unirse a la diana deseada y antagonizar su actividad funcional. Las modificaciones de ese tipo se pueden introducir en la secuencia de aminoácidos para reducir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un polipéptido que consiste esencialmente en una secuencia especificada puede contener uno, dos, tres, cuatro, cinco o más aminoácidos adicionales, con deleción o sustituidos en cualquier extremo o en ambos extremos de la secuencia con la condición de que estos aminoácidos no interfieran con, inhiban, bloqueen o interrumpan el papel del anticuerpo o fragmento en la unión a la diana deseada y que secuestren su función biológica. Del mismo modo, una molécula de polipéptido que contribuye a los anticuerpos antagonistas de la divulgación se puede modificar por vía química con uno o más grupos funcionales con la condición de que tales grupos funcionales no interfieran con la capacidad del anticuerpo o fragmento de anticuerpo para unirse a la diana deseada y antagonicen su función.
La presente divulgación se describirá a continuación con referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan con el fin de ilustración y no se pretende su interpretación como limitantes de la presente divulgación.
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Ejemplos
Ejemplo 1 - Conversión de anticuerpos de murino para anticuerpos caninos, felinos, equinos y humanos
Las secuencias de proteínas de cadena pesada (VH) y ligera (VL) de dominio variable de inmunoglobulina gamma (IgG) de origen humano, felino, canino y equino, obtenidas a partir de bases de datos y publicaciones de secuencias de ADNc expresados disponibles al público, se alinearon en grupos de acuerdo con especies usando el programa ClustalW que usa la Matriz de Costo BLOSUM y el costo abierto de Hueco de 10 y el costo extendido de Hueco de 0,1. Las secuencias de mala calidad de baja homología se sometieron a deleción a partir del alineamiento para evitar huecos engañosos en regiones marco conservadas. Las regiones marco conservadas y CDR se identificaron de acuerdo con la nomenclatura de Kabat y los restos de aminoácidos en cada posición de la región marco conservada de Kabat se identificaron y se tabularon de acuerdo con la cadena ligera y pesada (Tablas 1-8). Aunque la tabla de la cadena ligera se construye a partir de una colección de cadenas ligeras kappa, se pueden construir tablas similares a partir de cadenas ligeras lambda para usó en la conversión de cadenas ligeras lambda De una especie a otra de acuerdo con los procedimientos que se describen en la presente patente.
La conservación de la secuencia entre las secuencias de IgG de las cuatro especies en las posiciones Q6, C23, W35, P44, Y83, C85 y G98 de la región marco conservada de cadena ligera, y en las posiciones G8, C22, W36, R38, D86, Y90, C92 y G106 de la región marco conservada de cadena pesada sugieren que existe una contaminación mínima de los datos de los aminoácidos combinados establecidos mediante errores sencillos de secuencias de nucleótidos en el conjunto de datos de partida. La composición de la combinación de restos presentes En cada región marco conservada en las Tablas 1-8 se determina media de los datos disponibles para cada especie. La determinación de secuencias de aminoácidos adicionales para inmunoglobulinas obtenidas a partir de cualquiera de las especies analizadas podría diversificar adicionalmente la composición de elecciones en cualquiera de las elecciones en las Tablas. Esto es particularmente cierto para las cadenas ligeras variables obtenidas a partir de felino para las que en la actualidad solamente hay disponible un ejemplo en la bibliografía y para las que el inventor Ha generado un nuevo conjunto mediante amplificación con reacción en cadena de la polimerasa cebada con oligonucleótido degenerado de secuencias de cadena ligera de IgG de ARNm de tejido de bazo felino, como se muestra en las Tablas 1-8. Sin embargo, como se demostrará a continuación, las tablas actuales se pueden usar junto con la metodología que se desvela en el presente documento para producir anticuerpos que son adecuados para su administración a un número de diferentes especies.
El procedimiento de acuerdo con la divulgación usa la información que se proporciona en las Tablas 1 a 8 para comparar restos de aminoácidos que están presentes en cada posición de las regiones marco conservadas de las cadenas ligeras y/o pesadas de una inmunoglobulina donante con un resto presente en la combinación de Inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana. Si el resto de aminoácido presente en una posición específica de la región marco conservada donante no fuera un aminoácido que está presente en esa posición en la combinación de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, entonces el resto se sustituye con un aminoácido presente en la combinación como relevante para esa posición. Cuando se determina qué aminoácido debería reemplazar el resto sustituido en la secuencia donante, es preferente sustituir el resto donante con el resto de la combinación que es el resto homólogo más cercano. Es decir, preferentemente la sustitución es una sustitución conservativa. Si no hay disponible ningún resto homólogo, entonces el aminoácido de la combinación consenso (es decir con el aminoácido que se encuentra más comúnmente en esa posición) de la especie diana se puede elegir preferentemente a la sustitución.
Para determinar si un aminoácido sustituido se puede reemplazar con un aminoácido conservado, por lo general se puede realizar una evaluación de factores tales como, pero no limitados a, (a) la estructura de la cadena principal polipeptídica en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, y/o (c) el volumen de la cadena lateral.
Cuando se considera si un resto obtenido a partir de un aminoácido donante que no está presente en la combinación diana puede estar sustituido de forma conservativa, puede ser preferente evaluar si un aminoácido homólogo está presente basándose en los aminoácidos que se agrupan juntos de acuerdo con similitudes en las propiedades de sus cadenas laterales (A. L. Lehninger, en Biochemistry, 2a Ed., 73-75, Worth Publishers, New York (1975)). Por ejemplo, se pueden determinar los siguientes grupos: (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L), lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M); (2) polares sin carga: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q); (3) ácidos: Asp (D), Glu (E); y (4) básicos: Lys (K), Arg (R), His(H).
Como alternativa, los restos de aminoácidos se pueden dividir en grupos basándose en propiedades comunes de la cadena lateral: (1) hidrófobos: Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) restos que influyen en la orientación de la cadena: Gly, Pro; y (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
Las sustituciones conservativas implicarán el intercambio (sustitución) de un miembro de una de estas clases por otro de esa misma clase.
A modo de ejemplo, las secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina donante determinadas a partir de un anticuerpo monoclonal NGF de rata anti-ratón (aD11) se alinearon con estas tablas y se diseñaron variantes caninas, equinas y felinas PETizadas y se construyeron para expresión. Los restos de la región marco conservada seleccionados para cada especie se muestran en la Figura 1 y las diferencias de la secuencia de 5 rata donante se muestran en la Figura 2. Como se puede observar a partir de las Figuras 1 y 2, los cambios necesarios para preparar versiones caninas, felinas o equinas de aD11 son diferentes en número y tipo para cada especie.
Los dominios variables para las versiones caninas, felinas o equinas de aD11 se expresaron como anticuerpos completos mediante fusión C-terminal a dominios constantes de cada especie como se muestra en las Figuras 3, 4 y 10 5 (SEQ ID NO 1-6 de dominios variables, SEQ ID NO 7-12 de anticuerpos completos) y coexpresión de pares de
cadena pesada y ligera en vectores de expresión transfectados en células CHO. Los sobrenadantes que contienen los padres de cadena pesada y ligera expresados como IgG completa se analizaron por SDS-PAGE y se sometieron a ensayo para su capacidad para inhibir la proliferación de células TF-1 con el factor de crecimiento nervioso en cultivo. Las cadenas pesadas y ligeras se observaron en geles de SDS-PAGE teñidos con Azul de Coomassie 15 (Figura 6) y los sobrenadantes eran capaces de inhibir la proliferación de células TF-1 inducida por NGF (Figura 7). A modo de comparación, una muestra purificada de la variante caninizada de aD11 era eficaz para inhibir la actividad de NGF como una versión humanizada (Pavone y col., documento WO 2006/131951) de aD11 (Figura 5a) que ilustra que la técnica de PETización que se describe en el presente documento no conduce a una reducción de la eficacia de la estructura del anticuerpo per se, mediante comparación con el procedimiento convencional de injerto 20 de CDR usado para humanizar el anticuerpo por Pavone y col. La bioactividad similar de las versiones caninas, felinas y equinas de aD11 se ilustra adicionalmente en la Figura 7D.
Tabla 1 - Restos de FR1 de dominio variable de cadena lie era
Posición de FR1 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
1
1
DEA DEN DEGKV DEAKY
2
2
ILV VIPT VIFNST IVK
3
3
V VEM VMAGI VQREAL
4
4
ML MLI MLVQ MLC
5
5
MTI T TAI TI
6
6
QE Q Q Q
7
7
TSA TS STF ST
8
8
P P P PA
9
9
LAPRS L EDAPS SGLADFPT
10
10
SP SF STFL STFAL
11
11
L L LSV LVSP
12
12
SA SPA ATESV SAPH
13
13
VLA V VALQT AVLR
14
14
STR TIA SAPT ST
15
15
PQR P LPIR VPLQR
16
16
EDGR G GR GL
17
17
E ED QE DEQGN
18
18
PTLKEAS PSA RSGKT RPGTAS
19
19
AV AV VA VASI
20
20
STF S ETDV T
Posición de FR1 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
21
21
I IF MIVLT IL
22
22
STY SF KSRETNQL TSN
23
23
CY C C C
Tabla 2 - Restos de FR2 de dominio variable de cadena ligera
Posición de FR2 de la Cadena Ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
1
35 W W W W
2
36 FYILS YF YFH YFL
3
37 RQLIM LFR QRS QHLR
4
38 QH Q QHKVCRSY QHEVGR
5
39 KR K KRV KRISQT
6
40 PSA P PSAIL PALSQ
7
41 GD G G GE
8
42 QH QR QE KQNRHT
9
43 SATP S ARSTVP APSTGV
10
44 P P PL P
11
45 QKER R KERIL KRNQES
12
46 RLPGASDTI RL RQLAHGWEK LFRSVM
13
47 LR L LVIFM LV
14
48 ILT IM IFMVT ILVMF
15
49 YFNSEVH YHA YSVFDEQRTWACGHL YFSH
5 _____________________Tabla 3 - Restos de FR3 de dominio variable de cadena ligera
Posición de FR3 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
1
57 GA GR GDF G
2
58 VA V VFA VI
3
59 PS P PLS PST
4
60 DSE D DAESGL SDALEPW
5
61 RG R R RM
6
62 FLVI FI FLY FI
7
63 SIA ST SCFGNRT SGTV
Posición de FR3 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
8
64 GA G GA GAP
9
65 SR S SGRDEKTW SGI
10
66 G G GRAV GERV
11
67 S S SFYTA SAP
12
68 GV G GET GAS
13
69 TA TAS TASW TAP
14
70 DE D DE DEVS
15
71 FC F FY FYH
16
72 TSR TIA TSAVY TSIAN
17
73 LF L LFIP LFHS
18
74 RTKE RTK TISAV TKIAE
19
75 I I IV IMSV
20
76 STG SAGT SNDTG SNTAD
21
77 RGST RG SPTEDNR SRGDNIPT
22
78 VLA VM LVFP LVM
23
79 EVG EQ QER QEKHLR
24
80 APD AVPT AEST PAS
25
81 DEGINA DE ETAGD ED
26
82 DG D DN DN
27
82A AVTGS VIHL VAEGLS FVSI
28
82B GA G AG AG
29
82C VIL V IVTDSMNLEFGY TVSI
30
83 Y Y YC Y
31
84 YHFC YF YFHSTVW YF
32
85 C C C C
Tabla 4 - Restos de FR4 de dominio variable de cadena ligera
Posición de FR4 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
1
95 FLS FS FIL FL
2
96 GS G G GA
3
97 AQPTK QP QAL QGP
Posición de FR4 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VK Canino VK Felino VK Equino VK Humano
4
98 GE G G G
5
99 TPA T TS TA
6
100 KQSNH KHQEST KNRM KRT
7
101 VLW L LVM VLI
8
102 DERVG ED EADK EDP
9
103 LIM IVML ILVFM ITVFM
10
104 KR KRDT KERTAGIQV KRTEN
Tabla 5 - Restos de FR1 de dominio variable de cadena
pesada
Posición de FR1 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH Canino VH Felino VH Equino VH Humano
1
1
EDG QDEH Q QEHL
2
2
VGLEIM VE V VLGIM
3
3
QHRAVEKLP LQR Q QRHIKY
4
4
LVP LV L LV
5
5
VALEM VM KQ VQLEK
6
6
EQA QED E EQDV
7
7
SFLT S S SWP
8
8
GA G G GAE
9
9
GEA GAR P GAPT
10
10
DAGNETW EDN GD GEDARV
11
11
LQRVW LVR LQ LVFPSW
12
12
VAIMK VRSK VM VKLIMRAGT
13
13
KRNQ KTQENR KMNR KQERNT
14
14
PFT PT PIS PALR
15
15
GAETS GE SAG GSER
16
16
GEA GATE QE GESRAQTVD
17
17
STP SA TA STA
18
18
LRV LV L LVRE
19
19
RKTGV RKES ST RKSTHI
20
20
LIV ILP L LVIR
21
21
SY FTS TVIS STFN
Posición de FR1 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH Canino VH Felino VH Equino VH Humano
22
22
C C C C
23
23
VLAIEK VKAMQ TASF AKTEVSIRQD
24
24
ATVGIS ATDV VI AVGITS
25
25
SPGT S ST SYCF
26
26
GDRT GA GA GVAR
27
27
FLIDSTV FYL LFAGIMNQS GDAVY
Tabla 6 - Restos de FR2 de dominio variable de cadena
pesada
Posición de FR2 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH Canino VH Felino VH Equino VH Humano
1
36 WC W W W
2
37 VIAFL VLWFIA VL VILFA
3
38 RQ RCH R RFP
4
39 QLHRE Q Q QHRL
5
40 ASTGPVDC APVTS APSV APSVMLHDGT
6
41 PL P P PSAR
7
42 GERL GAES G GSEQRW
8
43 KREGAMQ KQTE KRW KQRNT
9
44 GERDTV G GR GRK
10
45 LTPFM LFP LPW LHIP
11
46 QEHDLPRK QE E EQVADK
12
47 WLCSYFM WCL FYWEHRSV W
13
48 VLIFM VMI VI VMIL
14
49 ATSGLV AGTS GASD GSA
Tabla 7 - Restos de FR3 de dominio variable de cadena
pesada
Posición de FR3 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH Canino VH Felino VH Equino VH Humano
1
66 RQ RQK R RQHG
2
67 FVL FL AVGCIT FVILMAT
3
68 TAIS TIA SRIDMNT TISAVH
4
69 IVLMT ILVM IV IMVFALT
Posición de FR3 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH Canino VH Felino VH Equino VH Humano
5
70 SAFT ST TSIL STLNV
6
71 RKA RAITKG V KRES RAVLTISPEKW
7
72 DEN D DEN DN
8
73 NDTSIGL TNDAS TSAEIPY NTDEKAMIS
9
74 AGVSDP T ASDTG SEGKT SAVYGT
10
75 KRENQG MT KTRGQ E KELNQR KTRIEQANS
11
76 NDSKHR NDK SNGKR NSKTDAG
12
77 TMIAS TIA QERH TQSIHEFR
13
78 LVMAIQ F LAVG VILSAF LAFVMSIT
14
79 YFSHT YFASV WD YLSTVFR YSFHDTVW
15
80 LIM LM LV LM
16
81 QHEDRA QELRDHV TIQA QEKNRHDST
17
82 ML MLT LMV MLWIV
18
82A NDSTHKPRE NSDTGRH NTDKRS NSTRHD
19
82B SGDRNT SNIRT STADEGKM SRNDGTAIL
20
82C LV L LVM LV
21
83 RTGKSI KRTGQ TS RTKQ
22
84 AVDTSGP STPAIV SGDER ASITPVGDLN
23
85 EDAV EATDGS EDG EADSGK
24
86 D D D DN
25
87 TASM T TA TSA
26
88 AGV AGS AS AGS
27
89 VMILFTKQY TVMIA VD VIMLT
28
90 YH YH Y Y
29
91 YFHAGT YHFC YFWAI YFH
30
92 C CR C C
31
93 AVTGMRSCLPK AITSVG M ATVGEIS AVTGSLM
32
94 KRSNGATPDQVEIM RKSTIVPNG GRAEHIKS RKGTSNVAHIY
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 8 - Restos de FR4 de dominio variable de cadena pesada
Posición de FR4 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH Canino VH Felino VH Equino VH Humano
1
103 WL WRCL W WCISY
2
104 GAS GRA G GLS
3
105 QPHRD QPHVR QP QKRHLAEP
4
106 G GD G GPR
5
107 TASIN AT VIS I TISAEP
6
108 LSQPR LIQMST L LTMVPQACN
7
109 VLIP VI V VICFGLW
8
110 TFIASLPY TAIR T TISADLV
9
111 VA VIG V VGILP
10
112 SACPT STP S SFTW
11
113 SLAP SQPA - SPFGT
Ejemplo 2 - Producción de anticuerpo desinmunizado de NGF anti-humano
La técnica de PETización también se puede usar para convertir anticuerpos para uso humano (denominado "rehumanización" anteriormente en el presente documento) que tienen secuencias de de cadenas pesadas y ligeras de aminoácidos humanos alternativas a las de Pavone y col., usando el procedimiento que se ha descrito anteriormente y la combinación de restos de aminoácidos específicos de la posición de la región marco conservada obtenida a partir de ser humano que se muestran en las Tablas 1-8.
Además de las secuencias de VH y VL resultantes (Figura 9A) se muestra una comparación de las secuencias de la región marco conservada rehumanizadas de la cadena ligera (Figura 8A) y la cadena pesada (Figura 8B). Es evidente que para humanizar el MAb aD11 usando el procedimiento que se desvela en el presente documento (3 cambios de aminoácido para las regiones marco conservadas) es necesario realizar muy pocos cambios con respecto a los usados en el procedimiento convencional de injerto de CDR de Pavone y colaboradores (43 cambios de aminoácidos).
Las secuencias de proteínas de las variantes de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) variables de anticuerpos aD11 rehumanizados (New-Hu aD11, Figura 9A) se diseñaron con secuencias señal N-terminales de aD11 de rata y dominios constantes de IgG humana C-terminal de cadena pesada de IgG4 y cadena ligera kappa humana respectivamente (Figura 9B). Los genes sintéticos que codifican las mismas se prepararon mediante síntesis genética basada en oligonucleótidos y cada uno se subclonó en el vector de expresión de mamífero pcDNA3.1+. La cotransfección en células CHO y la purificación a partir de sobrenadantes celulares usando cromatografía de Proteína A proporcionó anticuerpos purificados. Los anticuerpos se sometieron a ensayo para unión a NGF con ELISA y se compararon con la unión con la variante humanizada de aD11 descrita por Pavone y col., (documento WO 06/131951, diseñado mediante injerto de CDR). Como se puede observar a partir de los resultados de ELISA que se muestran en la Fig 9C, la variante New Hu aD11 de la presente patente se ha unido a NGF que es indistinguible de la descrita por Pavone y col. Los anticuerpos que se describen en la Figura 9C se sometieron a ensayo para inhibición de NGF con el procedimiento que se describe en la Figura 7C. Ambos anticuerpos humanizados presentaban una bioactividad equivalente.
Ejemplo 3 - Producción de anticuerpos caninos que tienen especificidad de unión con respecto al TNF canino
A modo de ejemplo adicional, el procedimiento de PETización de la presente patente se usó con un anticuerpo D2E7 humano que se une al factor de necrosis tumoral como el punto de partida para preparar una variante canina del mismo.
Las Tablas 9-16, que se muestran a continuación, ilustran el alineamiento de las regiones marco conservadas de los dominios de cadena ligera y pesada del anticuerpo monoclonal humano D2E7 con la combinación de los restos de aminoácidos definidos para cada posición de las secuencias de la región marco conservada de inmunoglobulina canina (como se muestra en las Tablas 1-8). Determinados restos (marcados con * en la Tabla 9) de los que
previamente se pensó que eran extraños en la posición de la secuencia de Kabat en la actualidad se consideran naturales para los caninos, por lo tanto en la actualidad los cambios que se muestran en las posiciones marcadas con * ya no se podrían preparar, o se puede elegir un resto alternativo, más conservado (marcado con ** en la Tabla 10). Una base de esta información adicional, tres posiciones de la cadena ligera podrían estar sin cambiar, huyendo 5 Ser9, Ala13 y Gly16 (marcados con * en la Tabla 9). La His42 de la cadena ligera podría ser una elección alternativa del resto en esa posición (marcada con ** en la Tabla 10). Se pretende que las modificaciones de los restos de la región marco conservada de D2E7 caninizado en estas posiciones, y anticuerpos que comprenden modificaciones de ese tipo, estén dentro del alcance de la presente divulgación. Los anticuerpos de ese tipo podrían comprender Un dominio variable de cadena ligera que tiene la secuencia que se muestra en la SEQ ID NO: 15 con la excepción de 10 que un resto de serina se proporciona en la posición 9, un resto de alanina se proporciona en la posición 13 y un resto de glicina se proporciona en la posición 16 en lugar de los restos que se muestran en estas posiciones en la SEQ ID NO: 15. Opcionalmente se puede proporcionar un resto de histidina en la posición 42 de la SEQ ID NO: 15 en lugar de glutamina. Una secuencia modificada que muestra estos cambios se proporciona como SEQ ID NO: 71. La divulgación se extiende a anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena ligera que comprende la 15 SEQ ID NO: 71, y fragmentos de unión a antígeno obtenidos a partir de los mismos.
Tabla 9 - Secuencia de FR1 de cadena ligera caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR1 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
1
1
D DEA D
2
2
I ILV I
3
3
Q V V
4
4
M ML M
5
5
T MTI T
6
6
Q QE Q
7
7
S TSA S
8
8
P P P
9
9
S LAPRS A*
10
10
S SP S
11
11
L L L
12
12
S SA S
13
13
A VLA L*
14
14
S STR S
15
15
V PQR Q
16
16
G EDGR E*
17
17
D E E
18
18
R PTLKEAS K
19
19
V AV V
20
20
T STF T
21
21
I I I
22
22
T STY T
Posición de FR1 de cadena ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
23
23
C CY C
Tabla 10 - Secuencia de FR2 de cadena ligera caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR2 de la Cadena Ligera
Sistema de numeración de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
1
35 W W W
2
36 Y FYILS Y
3
37 Q RQLIM Q
4
38 Q QH Q
5
39 K KR K
6
40 P PSA P
7
41 G GD G
8
42 K QH** Q
9
43 A SATP A
10
44 P P P
11
45 K QKER K
12
46 L RLPGASDTI L
13
47 L LR L
14
48 I ILT I
15
49 Y YFNSEVHW Y
5
Tabla 11 - Secuencia de FR3 de cadena ligera caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR3 de la Cadena Ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
1
57 G GA G
2
58 V VA V
3
59 P PS P
4
60 S DSE S
5
61 R RG R
6
62 F FLVI F
7
63 S SIA S
Posición de FR3 de la Cadena Ligera
Numeración de la posición de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
8
64 G GA G
9
65 S SR S
10
66 G G G
11
67 S S S
12
68 G GV G
13
69 T TA T
14
70 D DE D
15
71 F FC F
16
72 T TSR T
17
73 L LF L
18
74 T RTKE T
19
75 I I I
20
76 S STG S
21
77 S RGST S
22
78 L VLA L
23
79 Q EVG E
24
80 P APD P
25
81 E DEGINA E
26
82 D DG D
27
82A V AVTGS V
28
82B A GA A
29
82C T VIL V
30
83 Y Y Y
31
84 Y YHFC Y
32
85 C C C
Tabla 12 - Secuencia de FR4 de cadena ligera caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR4 de la Cadena Ligera
Posición de FR4 de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
1
95 F FLS F
2
96 G GS G
Posición de FR4 de la Cadena Ligera
Posición de FR4 de cadena ligera de Kabat VL de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VK canino VL de D2E7 PETizado Canino
3
97 Q AQPTK Q
4
98 G GE G
5
99 T TPA T
6
100 K KQSNH K
7
101 V VLW V
8
102 E DERVG E
9
103 I L1M I
10
104 K KR K
Tabla 13 - Secuencia de FR1 de cadena pesada caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR1 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VH canino VH de D2E7 PETizado Canino
1
1
E EDG E
2
2
V VGLEIM V
3
3
Q QHRAVEKLPS Q
4
4
L LVP L
5
5
V VALEM V
6
6
E EQA E
7
7
S SFLT S
8
8
G GA G
9
9
G GEA G
10
10
G DAGNETW G
11
11
L LQRVW L
12
12
V VAIMK V
13
13
Q KRNQ Q
14
14
P PFT P
15
15
G GAETS G
16
16
R GEA G
17
17
S STP S
18
18
L LRV L
19
19
R RKTGV R
Posición de FR1 de cadena pesada
Numeración de la posición de cadena pesada de Kabat VH de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VH canino VH de D2E7 PETizado Canino
20
20
L LIV L
21
21
S SY S
22
22
C C C
23
23
A VLAIEK A
24
24
A ATVGIS A
25
25
S SPGT S
26
26
G GDRT G
27
27
F FLIDSTV F
Tabla 14 - Secuencia de FR2 de cadena pesada caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR2 de cadena pesada
sistema de numeración de cadena pesada de Kabat VH de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VH canino VH de D2E7 PETizado Canino
1
36 W WC W
2
37 V VIAFL V
3
38 R RQ R
4
39 Q QLHRE Q
5
40 A ASTGPVDC A
6
41 P PL P
7
42 G GERL G
8
43 K KREGAMQ K
9
44 G GERDTV G
10
45 L LTPFM L
11
46 E QEHDLPRK E
12
47 W WLCSYFM W
13
48 V VLIFM V
14
49 S ATSGLV S
Tabla 15 - Secuencia de FR3 de cadena pesada caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR3 de cadena pesada
Sistema de numeración de cadena pesada de Kabat Secuencia de VH de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VH canino VH de D2E7 PETizado de Canino
1
66 R RQ R
Posición de FR3 de cadena pesada
Sistema de numeración de cadena pesada de Kabat Secuencia de VH de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VH canino VH de D2E7 PETizado de Canino
2
67 F FVL F
3
68 T TAIS T
4
69 I IVLMT I
5
70 S SAFT S
6
71 R RKA R
7
72 D DEN D
8
73 N NDTSIGL N
9
74 A AGVSDPT A
10
75 K KRENQGMT K
11
76 N NDSKHR N
12
77 S TMIAS S
13
78 L LVMAIQF L
14
79 Y YFSHT Y
15
80 L LIM L
16
81 Q QHEDRA Q
17
82 M ML M
18
82A N NDSTHKPRE N
19
82B S SGDRNT S
20
82C L LV L
21
83 R RTGKSI R
22
84 A AVDTSGP A
23
85 E EDAV E
24
86 D D D
25
87 T TASM T
26
88 A AGV A
27
89 V VMILFTKQY V
28
90 Y YH Y
29
91 Y YFHAGT Y
30
92 C C C
31
93 A AVTGMRSCLPK A
32
94 K KRSNGATPDQVEIM K
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 16 - Secuencia de FR4 de cadena pesada caninizada de anticuerpo monoclonal D2E7 obtenido a partir de ser
humano
Posición de FR4 de cadena pesada
Sistema de numeración de cadena pesada de Kabat VH de MAb D2E7 Humano Secuencias de combinación de aminoácidos de VH canino VH de D2E7 PETizado de Canino
1
103 W WL W
2
104 G GAS G
3
105 Q QPHRD Q
4
106 G G G
5
107 T TASIN T
6
108 L LSQPR L
7
109 V VLIP V
8
110 T TFIASLPY T
9
111 V VA V
10
112 S SACPT S
11
113 S SLAP S
Las Figuras 10, 11 y 12 ilustran secuencias de dominio variable (Figura 10) y anticuerpo completo (Figura 11 (cadena ligera) y Figura 12 (cadena pesada)) que codifican variantes de Mab PETizado canino de D2E7 en la SEQ ID NO: 15 a la SEQ ID NO: 21. Las secuencias se construyeron como ADN usando síntesis de oligonucleótidos y se subclonaron a vectores de expresión y se transfectaron a células CHO como se ha mencionado anteriormente. En particular, las secuencias de SEQ ID NO: 17 (cadena ligera) y las SEQ ID NO: 18-21 (isotipos A, B, C y D de cadena pesada) se diseñaron y construyeron como ADN usando síntesis de oligonucleótidos y se subclonaron a vectores de expresión pcDNA3.1+ y se transfectaron en diversas combinaciones en células CHO.
Los ADNc que codifican anticuerpos monoclonales anti-TNF de canino que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (cadena ligera) y de SEQ ID NO: 19 (cadena pesada, isotipo B) y un anticuerpo monoclonal anti-TNF quimérico que tiene una cadena ligera con el aminoácido de SEQ ID NO: 22 y una cadena pesada de SEQ ID NO: 23 (Figura 13) se subclonaron en pcDNA3.1+ (Invitrogen / Life technologies) con secuencias señal secretoras amino-terminales (no se muestran). Las células CHO se co-transfectaron con combinaciones de cualquiera de secuencias de cadena pesada y ligera de canino (ca-HCB + ca-kLC) o cadenas pesadas y ligeras quiméricas (ch- HCB + ch-kLC). Los sobrenadantes resultantes se purificaron en Proteína A, se analizaron por SDS-PAGE (Figura 14A) y se sometieron a ensayo para unión a TNF alfa canino (revestido a 5 ug/ml; R&D systems) a las concentraciones de anticuerpo indicadas (ug/ml) con ELISA y se detectaron usando conjugado de peroxidasa de rábano picante-anticuerpo policlonal anti-canino (Sigma A9042) (Figura 14B). El control negativo fue el anticuerpo policlonal de detección sobre antígeno revestido solo.
Los anticuerpos purificados se sometieron a ensayo para su capacidad para inhibir la actividad del TNF canino usando células 293-HEK transfectadas con pTRH1 para producir una línea de células indicadoras de NF-kB-EGFP sensibles a TNF que responde al TNF humano con fluorescencia (Vince y col., Cell 131, 682, 2007). En primer lugar se demostró que el TNF canino activa la expresión de GFP en estas células (estimulación máxima de un 50 % a aproximadamente 1 ng/ml) y a continuación los anticuerpos caninos que se muestran en la Figura 14 se sometieron a ensayo para su capacidad para inhibir 1 ng/ml de TNF canino.
Como se muestra en la Figura 15 (A-C), en este ensayo los anticuerpos tanto de canino como los quiméricos eran potentes inhibidores del TNF canino.
En conjunto estos resultados mostraban que los anticuerpos de canino de la divulgación y el anticuerpo quimérico de ser humano-canino se unen al TNF canino y son equipotentes con el ensayo tanto de ELISA como de inhibición, lo que demuestra que el procedimiento de caninización ha producido una versión canina totalmente activa del anticuerpo D2E7 original.
La Figura 16 ilustra una comparación de los anticuerpos monoclonales (MAb) D2E7 caninizados y quiméricos con un anticuerpo caninizado adicional basándose en el clon 148 del MAb del TNF anti-humano. El clon 148 del MAb anti-
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
huTNF caninizado (SEQ ID NO: 26 y SEQ ID NO: 27, Figura 17) se expresó en células CHO se purificó usando cromatografía de Proteína A (Panel A, calle izquierda). El clon 148 del MAb caninizado se sometió ensayo para unión a TNF humano (Panel B) y a TNF canino (Panel C) en comparación con los Mab basados en D2E7 caninizados (Ca) y quiméricos (Ch) de las Figuras 14 y 15 (la unión a control negativo de fondo se muestra con las flechas). A partir de los paneles B y C se puede observar que el 148 clon de MAb caninizado se une al TNF humano, pero no al TNF canino. En consecuencia, los MAb caninizados y quiméricos basados en D2E7 y el objeto de la presente divulgación muestran de forma inesperada una fuerte unión al TNF canino equivalente a la del TNF humano mientras que el clon 148 de MAb caninizado muestra solamente unión al TNF humano. Por lo tanto, los Mab basados en D2E7 caninizado son sorprendentemente útiles para el tratamiento de una enfermedad caninas mediadas por TNF canino.
Tomadas en conjunto, las versiones canina, equina, felina y nuevas versiones humanas del MAb aD11 anti-NGF de rata PETizado y las versiones PETizadas de canino del MAb anti-TNF humano demuestra que la conversión de PETización de regiones marco conservadas de dominio variable con el procedimiento que se describe en la presente es sólida, reproducible y aplicable a conversión de múltiples especies de múltiples MAb.
Ejemplo 4 - Efecto de anticuerpos monoclonales NGF anti-caninos para reducir el dolor inflamatorio in vivo
Terapia con anticuerpos
Los anticuerpos monoclonales NGF anti-caninos obtenidos a partir de vectores de expresión que expresan SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 70 (cadena pesada de tipo HCA canino) se expresaron en células CHO y se purificaron mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión por tamaño y el tampón se intercambió en solución salina tamponada con fosfato.
Modelo canino de inflamación
Todos los experimentos se realizaron con la aprobación previa del Institutional Ethics Committee (CRL, Irlanda). Los perros de raza Beagle fueron inyectados (= día -1) con caolín en la almohadilla de una pata trasera para generar una inflamación de autorresolución que comienza aproximadamente 24 horas más tarde y que hace que los perros comiencen a cojear temporalmente. En este modelo, una vez que la respuesta a la inflamación al caolín disminuye, los perros comienzan a cojear a un ritmo menos constante durante el periodo de tiempo de aproximadamente 1-2 semanas y a continuación presentan una recuperación completa.
Los grupos de 3 perros fueron inyectados por vía intravenosa con cualquiera de anticuerpos monoclonales NGF anticaninos a 200 |jg/kg de peso corporal o solución salina tamponada con fosfato como control de vehículo (= día 0). Los perros se evaluaron para cojera durante aproximadamente 7 días mediante un procedimiento de puntuación visual (puntuación 0, sin cojera (aguante del peso completo); puntuación 1, cojera ligera (no aguantan el peso completo pero caminan bien); puntuación 2, cojera moderada (aguantan el peso ligeramente y no caminan bien), puntuación 3, cojera severa (no aguantan el peso)). A los observadores se les oculto qué inyección recibía cada perro.
Los resultados se muestran en la Figura 18. Las puntuaciones de cojera se redujeron en los perros que recibieron anticuerpos monoclonales anti-NGF el día 3 después de la inyección en comparación con el control de vehículo, lo que indica que los anticuerpos monoclonales anti-NGF presentaban un efecto en la reducción del dolor en los perros con respecto al observado solamente con vehículo. La actividad retardada es coherente con la farmacocinética en plasma de los anticuerpos monoclonales NGF anti-caninos que demostraban una fase de distribución del tejido (alfa) baja de aproximadamente 30 horas y la vascularización relativamente escasa del área de la almohadilla de la pata. Los resultados que se muestran en la Figura 18 muestran que los anticuerpos NGF anti-caninos producidos con el procedimiento de la presente divulgación reducen el dolor inflamatorio en perros con una reducción de la cojera consiguiente.
Diversas modificaciones y variaciones para los ejemplos de las divulgaciones descritos serán evidentes para las personas con experiencia en la materia sin apartarse del alcance de la divulgación. La divulgación se ha descrito en relación con ejemplos preferentes específicos. De hecho, diversas modificaciones de los modos de realización de la divulgación descritos que son evidentes para las personas con experiencia en la materia pretenden ser cubiertos con la presente divulgación.
Listado de secuencias
<110> NVIP Pty Ltd Gearing, David
<120> Anticuerpos modificados y procedimiento para la producción de los mismos <130> P120110.WO.01 <150> US 61/531439
5
10
15
20
25
30
<151> <160> 71
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 107 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> dominio variable de cadena ligera de una versión canina de MAb anti-NGF alfa D11 - VK canino
<400> 1
imagen1
<210>2 <211> 122 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> dominio variable de cadena pesada de una versión canina de MAb anti-NGF alfa D11 - VH canino
<400>2
5
10
imagen2
<210>3 <211> 107 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio variable de cadena ligera de una versión felina de MAb anti-NGF alfa D11 - VK felino <400>3
imagen3
imagen4
<210>4 <211> 122 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> dominio variable de cadena pesada de una versión de MAb anti-NGF alfa D11 - VH felino
10
<400>4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
15 <210>5
<211> 107 <212> PRT

<213> Secuencia artificial 20 <220>
<223> dominio variable de cadena ligera de una versión equina de MAb anti-NGF alfa D11 - VK equino
<400>5
imagen5
5 <210>6
<211> 122 <212> PRT
<213> Secuencia artificial 10 <220>
<223> dominio variable de cadena pesada de una versión equina de MAb anti-NGF alfa D11 - VH equino
<400>6
15
5
10
imagen6
<210>7 <211> 217 <212> PRT
<213> Secuencia artificial <220>
<223> cadena ligera completa de una versión caninizada de MAb anti-NGF alfa D11 - VK canino y constante de cadena ligera kappa de canino
<400>7
Asp lie Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Leu Ser 15 10
Glu Lys Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp lie Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu 35 40 45
Tyr Asn Thr Asp Thr Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu 65 70 75
Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Phe His Tyr 85 90
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Asn Asp 100 105 110
Pro Ala Val Tyr Leu Phe Gln Pro Ser Pro Asp Gln Leu His 115 120 125
Ser Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Ser Phe Tyr Pro Lys 130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Val Asp Gly Val lie Gln Asp Thr Gly 145 150 155
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170
Thr Leu Thr Met Ser Ser Thr Glu Tyr Leu Ser His Glu Leu 180 185 190
Cys Glu lie Thr His Lys Ser Leu Pro Ser Thr Leu lie Lys 195 200 205
Gln Arg Ser Glu Cys Gln Arg Val Asp 210 215
Gln Glu 15
Asn Ala Leu lie Ser Gly
Glu Pro
80
Pro Arg 95
Ala Gln
Thr Gly
Asp lie
lie Gln 160
Ser Ser 175
Tyr Ser
Ser Phe
<210>8 <211> 457 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<223> cadena pesada completa de una versión canina de MAb anti-NGF alfa D11 - VH canino y constante de cadena pesada B de canino
<400>8
5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Asn Pro Gly Gly 15 10 15

Thr Leu Thr Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Asn 20 25 30

Asn Val Asn Trp Val Arg Gln Ala Leu Gly Arg Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Gly Gly Val Trp Ala Gly Gly Ala Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu Thr lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Val Phe Leu 65 70 75 80

Gln Met His Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Gly Gly Tyr Ser Ser Ser Thr Leu Tyr Ala Met Asp Ala Trp 100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Thr Ala Pro 115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Cys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Thr 130 135 140

Val Ala Leu Ala Cys Leu Val Ser Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 145 150 155 160

Claims (8)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    1. Un procedimiento para modificar una inmunoglobulina donante para su uso en una especie diana, procedimiento que comprende las etapas de:
    - identificar una inmunoglobulina donante de una especie distinta a la especie diana, en la que la inmunoglobulina donante tiene especificidad de unión a un epítopo diana presente en la especie diana,
    - determinar una secuencia de aminoácidos de regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante,
    - comparar cada resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante con un resto de aminoácido presente en una posición correspondiente en una secuencia de aminoácidos de regiones marco conservadas de una pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana para identificar uno o más restos de aminoácido dentro de la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante que no está presente en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, y
    - sustituir el uno o más restos de aminoácidos identificados presentes en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante, pero no presentes en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana, con un resto de aminoácido que está presente en la posición correspondiente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de al menos una de la pluralidad de inmunoglobulinas obtenidas a partir de la especie diana;
    - en el que la inmunoglobulina donante modificada no contiene ningún aminoácido en ninguna posición dentro de las regiones marco conservadas que pudiera ser extraño en esa posición en la especie diana;
    en el que la especie diana se selecciona entre el grupo que consiste en un perro, un gato, un caballo y un ser humano;
    y en el que la sustitución de un resto de aminoácido presente en la secuencia de aminoácidos de las regiones marco conservadas de los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina donante se inicia usando el principio de sustitución conservativa.
  2. 2. El procedimiento como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de sustituir al menos un dominio constante de la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina donante con un dominio constante de una cadena pesada y/o ligera obtenida a partir de una inmunoglobulina obtenida a partir de la especie diana.
  3. 3. Un anticuerpo neutralizante humanizado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es capaz de unirse de forma específica al factor de crecimiento nervioso humano (NGF) en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en la que el anticuerpo o el fragmento de unión a antígeno del mismo no contiene ningún aminoácido en ninguna posición dentro de las regiones marco conservadas que pudiera ser extraño en esa posición en una especie diana.
  4. 4. El anticuerpo neutralizante humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 3 en el que la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos un 85 % con la misma.
  5. 5. El anticuerpo neutralizante humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en la reivindicación 3 o en la reivindicación 4 en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24, o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 85 % con la misma.
  6. 6. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo neutralizante humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5 y al menos un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
  7. 7. El anticuerpo neutralizante humanizado o fragmento de unión a antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento o prevención de dolor en un ser humano.
  8. 8. El anticuerpo neutralizante humanizado o fragmento de unión a antígeno como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, o la composición farmacéutica como se reivindica en la reivindicación 6, para su uso en el tratamiento de artritis en un ser humano.
    imagen1
    Cadena Pesada
    FRl
    aD11 de Rata VH Canino VH Felino VH Equino
    QVQLKES GPGLVQFS QT LSLT 0 TVSGF EVQLVE S GGDLVN EGGTLTLSCWSGF QVQLVESGGDLVQ FGGS LRLT CAAS GF QVQLKE£ GPGLVNPSQTLSLTCTVSGF
    (SEQ ID NO:44) (SEQ ID NO:45) (SEQ ID NO:46) (SEQ ID NO:4"}
    FR2
    aD11 de Rata VH Canino VH Felino VH Equino
    WVRQATGRG1.EWMG (SEQ ID NO: 46) WVRQALGRGLEWVG (£EQ ID NO:49) WVRQABGKGLEWMG ¡SEQ ID NO:50) WVRQAPGKGLEWVG ¡SEQ ID NO:51)
    FR3
    aD11 de Rata VH Canino VH Felino VH Equino
    RLTITRDTSKSQVFLKMHSLQSEDTATYYCAR (SEQ ID NO:52)
    RLTITRDTSKSTVFLQMHSLRSEDTATYYCAR (SEQ ID NO:53)
    RFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCAR (SEQ ID NO:5 4)
    RATITRDTSKSQVFLQMNSLTSEDTAVYYCAR (SEQ ID NO;55)
    FR4
    aD11 de Rata VH Canino VH Felino VH Equino
    WGQG1 TV TV S S WGQGTLVTVSS WGQGTLVTVSS WGQGILVTVSS
    (SEQ ID NO:56} (SEQ ID NO:57) (SEQ ID NO:5B> (SEQ ID NO:59}
    Figura 2
    DIVMTGSPASLS LSQEEKVTITORAS E DIYN AL A W YQQKPG Q APKLLIYNTDTLHTG VPSRFSGSGSGTEFSLTISSLEPEDVAVYYCQHYFHYPRTFGAGTKVELK
    SEQ ID NO 2 - VH CANINO
    EVQLVESGGDLVNPGGTLTLSCWSGFSLTNNNVNWVRQALGRGLEWVGGVWA GG ATD Y N SALKSR LTITR DTSKSTVFLQM HS LRS ED TATY YC ARDG G YSSSTL YA MDAWGQGTLVTVSS
    SEQ ID NO:7 - VK CANINO Y CONSTANTE DE CADENA LIGERA KAPPA DE CANINO
    DIVMTQSP ASLS LSQEEKVTlTCRAS E DIY NALAWYQQ KPG QAPKLLIYNTDTLHTG VPSRFSGSGSGTEFSLTISSLEPEDVAVYYCQHYFHYPRTFGAGTKVELKRNDAQ P AV Y LFQ PSPD QL H TGS AS WC LL NSF YP KDIN V K WK VDG VIQDTGIQESVTEQDK DSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLIKSFQRSECQRVD
    SEQ ID NO:6 - VH CANINO Y CONSTANTE DE CADENA PESADA B DE CANINO
    EVQLVESGGDLVNPG GTLTLSCWSG FSLTNNNVNWVRQALGRGLEWVGGVWA
    GGATDYN SALKSR.LT ITRDTSKSTVFLQMHSLRSEDTATYYCARDGGYSSSTL YA
    MDAWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVS
    WNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKV
    DKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEMLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCWV
    DLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPREEQFNGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQ
    FTCKVNNKALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPP
    DIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAV
    MHEALHNHYTQESLSHSPGK
    Figura 3
    DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCRASEDIYNALAWYLQKPGQSPRRLIYNTDTLHTGV
    PDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDVGVYFCQHYFHYPRTFGPGTKLEIK
    SEQ ID NO:4 - VH FELINO
    QVQLVESGGDLVQPGGSLRLTCAASGFSLTNNNVNWVRQAPGKGLEWMGGVWA GGATDYNSALKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGGYSSSTLYAM DAW GQGTLVT VSS
    SEQ ID SEQ ID NO:9 - VK FELINO Y CONSTANTE DE CADENA LIGERA KAPPA DE FELINO
    DIVMTQTPLSLSVTPGEPASISCRASEDIYNALAWYLQKPGQSPRRLIYNTDTLHTGV
    PDRFSGSGSGTDFTLRISRVEADDVGVYFCQHYFHYPRTFGPGTKLEIKRSDAQPS
    VFLFQPSLDELHTGSASIVCILNDFYPKEVNVKWKVDGWQTKASKESTTEQNSKDS
    tySlsstltmsrteyqshekfscevthkslastlvksfnrsecqre
    SEQ ID NO: 10 - VH FELINO Y CONSTANTE DE CADENA PESADA DE FELINO
    QVQLVESGGDLVQPGGSLRLTCAASGFSLTNNNVNWVRQAPGKGLEWMGGVWA
    GGATDYNSALKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKTEDTATYYCARDGGYSSSTLYAM
    DAWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGTTSGATVALACLVLGYFPEPVTVSWNS
    galtsgvhtfpavlqasglyslssmvtvpssrwlsdtftcnvahppsntkvd ktvr
    KTDHPPGPKPCDCPKCPPPEMLGGPSIFIFPPKPKDTLSISRTPEVTCLVVDLGPDD
    SDVQITWFVDNTQVYTAKTSPREEQFNSTYRWSVLPILHQDWLKGKEFKCKVNSK
    SLPSPIERTISKAKG Q PH E PQV YVLP P AQE E LSR NKVS VTC LIKSFH P P DI AVE WEIT
    GQPEPENNYRTTPPQLDSDGTYFVYSKLSVDRSHWQRGNTYTCSVSHEALHSHHT
    QKSLTQSPGK
    Figura 4
    DIV MTQSP AS LS AS LGETVTIE CRAS E DIYMALAWYQQ KPGQSP KLLIYNTDT LHTG
    V PSR F SG SGSGTDYSLTIN SLQSE DV AS YFC QH YFHY PRTFGGGT KL ELK
    SEQ ID NO:6 - VH EOUINO
    QVQL KESGPG LVN PSQTLSLT CTVSG FS LTN N NV N WV RQ APG KG L EWVG G V WA GGATD Y NSALKSRATITRDTS KSQV F LQ M NSLTSED TA VY YC AR DG GYSSSTLYA MDAWGQGlLVTVSS
    SEQ ID NO: 11 - VK EOUINO Y CONSTANTE DE CADENA LIGERA KAPPA DE FELINO
    DIV MTQSP AS LS AS LGETVTI E CRAS E DIY N ALA WY QQ KPGQSP K LLIY NTDT LHTG VPSRFSGSGSGTDYSLTINSLQSEDVASYFCQHYFHYPRTFGQGTKLELKRDDAK PSAFIFPPSSEELSSGS AS WC LVYG F YP SGATIN WK VDG LAKTSS F H SSLTEQDS KDNTYSL SSTLTLPKADY E AH N VY AC EVSH KTLSSPL VKSFKRQ DC
    SEQ ID NO: 12 - VH EOUINO Y CONSTANTE DE CADENA PESADA 2 DE EOUINO
    QVQLKESGPGLVNPSQTLSLTCTVSGFSLTNNNVNWVRQAPGKGL EWVG G V WA GGATDYNSALKSRATITRDTSKSGVFLQMNSLTSEDTAVYYCARDGGYSSSTLYA M D AWGQGILVTVSS ASTT APKY FGLTPSC GITS DATVALGC LVS DY YPE P VTVS W N SG ALTSG VHTF PS VLGS S GL Y AL SSM VTVP ASTWTS ETYIC N V AH P ASSTKVD K RIPPCVLSAEGVIPIPSVPKPQCPPYTHSKFLGGPSVFIFPPNPKDALMISRTPWTC
    V WN LS DGYP DVQ FS WYVD N TE VHS AITKQREAGFN STY R WS VLPIGHGD WLS G K E FKCSVTNVGV PGPISRAISRGKGPSRVPQVYVLPPHPDELAKSKVSVTCLVKD FYPPDIS VE WGSNRW PEL EGKYSTTP AQLD GD GSYFL YSKLSL ETS R WGQVES F TCAVM HEALHNHFTKTDISESLGK
    Figura 5
    imagen2
    imagen3
    MAI) <le control negativo
    ívIAIh tonino
    üO-'O
    ívlAh Huí nono
    ■ÍÍJÍKÜ
    1ÍOOO
    í'OOO
    uooa
    :AVÜ
    mm
    ¿ÜGO
    2000 i
    ^Oíf
    Concentración de inAl> inyuil)
    Figura 7 A
    imagen4
    imagen5
    imagen6
    Q¿>01 0,01 0,1
    Concentración de mAb ng/ml
    Figura 7D
    Canino
    Felino
    Equino
    Control
    imagen7
    FRÍ de HC de Kv. Nueva aDil de Rata de Ruberti
    QVQLKE.5GE'GLVQP£QTLSLTCTV3GF SEQ ID NO:64
    Hu-aDli de Pavone
    E V f3 GG3 R £ Añ
    F?2 de HC de Hs Nueva aDil de Rata de Ri-barti
    WVRQASGP.GLEMHG SEQ ID NO:65
    Hit-aDI i de Pavone
    P K V
    F?..j de HC de Ki: Nueva aBU de Rata de Rubert-i
    SEQ ID P.LT I TP.DT SKSOVF1KKHS LüSEI'TATYYCAR N066
    Hit-a DI i de Pavone
    F S N NTAY Q N RA V
    FR4 de ñC de Ha Nueva aDil de Rata de Ri-berti
    WGQGTTVTVSS SEQ ID NO:67 £
    Kit-a DI i de Pavone
    L
    Figura 8B
    SEQ ID N0:13 VL de Hu a D11 Nueva
    DIQ M TQ S P AS L S AS LG ET VTIN C RASEDIYN ALAWYQQKPGKSFQLLIYNTDTLHTGVPS RFSGSGSGTEYSLKINSLQSEDVASYFCQ HYFHYPRTFGGGTKLEIK
    SEQ ID N0:14 VH de Hu a D11 Nueva
    QVQLKESGPGLVQPSQTLSLTCTVSGFSL
    TNNNVNWVRQASGRGLEWMGGVWAGGA
    TDYNSALKSRLTITRDTSKSQVFLKMHSLQ
    SEDTATYYCARDGGYSSSTLYAMDAWGQ
    GTTVTVSS
    Figura 9A
    SEQ ID NO:24 -HC-lgG4 completa deHu
    Oí D11 Nueva
    MAVLVLLLCLVTFPTCVLSQVQLKESGPGLVQPSQTLS
    LTCTVSGFSLTNNNVNWVRQASGRGLEWMGGVWAG
    GATDYNSALKSRLTITRDTSKSQVFLKMHSLQSEDTAT
    YYCARDGGYSSSTLYAMDAWGQGTTVTVSSASTKGP
    SVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNS
    GALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTY
    TCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGP
    SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPEVQFN
    WYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQD
    WLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY
    TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
    PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVF
    SCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK**
    SEQ ID NO:25 - LC kappa completa de Hu Nueva MGVPTQLLGLLLLWITDAICDIQMTQSPASLSASLGE
    TVTINCRASEDIYNALAWYQQKPGKSPQLLIYNTDTL
    HTGVPSRFSGSGSGTEYSLKINSLQSEDVASYFCQH
    YFHYPRTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKS
    GTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQES
    VTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
    QGLSSPVTKSFNRGEC**
    Figura 9B
    110
    imagen8
    Unidades de Fluorescencia
    imagen9
    r-o
    O
    O
    O
    .O
    UJ
    o
    o
    o
    o
    imagen10
    ÍJO
    imagen11
    Hu 0¿ Dll Nueva
    ..♦. Hu 0¿ Dll de Pavone
    MAb de Control
    Figura 9D
    SEQ ID NO 15: Dominio de VK de Mab anti-TNF Caninizado
    DIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCRASQGIRNYLA
    WYQQKPGQAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGS
    GTDFTLTISSLEPEDVAVYYCQRYNRAPYTFGQG
    TKVEIK
    SEQ ID NO 16: Dominio de VH de Mab anti-TNF Caninizado
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDY AM H WVRQAPG KG LE WVS AITWNSG HID Y ADS V EGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCA KVSYLST ASS LD YWGQGTLVTVSS
    Figura 10
    SEQ ID NO 17: Cadena ligera kappa de MAb anti-TNF Caninizado
    DIVMTQSPASLSLSQEEKVTITCRASQGIRNYLA
    WYQQKPGQAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGS
    GTDFTLTISSLEPEDVAVYYCQRYNRAPYTFGQG
    TKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASVVC
    LLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGIQESVTEQDK
    DSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPST
    LIKSFQRSECQRVD*
    Figura 11
    SEQ id no 18: Dominio constante de tipo cadena pesada A de Mal) anti-TNF caninizado
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDY
    ADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS
    SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQS
    SGLHSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNWHPASNTKVDKPVFNECRCTDTPPCPVPEPLGGP
    SVLIFPPKPKDILRITRTPEVTCWLDLGREDPEVQISWFVDGKEVHTAKTQSREQQFNG
    TYRWSVLPIEHQDWLTGKEFKCRVNHIDLPSPIERTISKARGRAHKPSVYVLPPSPKEL
    SSSDTVSITCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPERKHRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS
    RWQQGDPFTCAVMHETLQNHYTDLSLSHSPGK*
    SEQ ID NO 19: Dominio constante de tipo cadena pesada B de Mal) anti-TNF caninizado
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVAIACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQS SGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPE MLGGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVWDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPRE EQFNGTYRWSVLPIGHQDHLKGKQFTCKVNNKALPS PIERTISKARGQAHQPSVYVLPP SREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLS VDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK*
    SEQ id no 20: Dominio constante de tipo cadena pesada C de Mal) anti-TNF caninizado
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS SASTTAPSVFPLAPSCGSQSGSTVALACLVSGYIPEPVTVSWNSVSLTSGVHTFPSVLQS SGLYSLSSMVTVPSSRWPSETFTCNVAHPATNTKVDKPVAKECECKCNCNNCPCPGCGLL GGPSVFIFPPKPKDILVTARTPTVTCVWDLDPENPEVQISWFVDSKQVQTANTQPREEQ SNGTYRWSVLPIGHQDWLSGKQFKCKVNNKALPSPIEEIISKTPGQAHQPNVYVLPPSR DEMSKNTVTLTCLVKDFFPPEIDVEWQSNGQQEPESKYRMTPPQLDEDGSYFLYSKLSVD KSRWQRGDTFICAVMHEA1HNHYTQISLSHSPGK*
    SEQ ID NO 21: Dominio constante de tipo cadena pesada D de Mal) anti-TNF caninizado
    EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDY ADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS SASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQS SGLYSLSSTVTVPSSRWPSETFTCNWHPASNTKVDKPVPKESTCKCISPCPVPESLGGP SVFIFPPKPKDILRITRTPEITCWLDLGRED PEVQISWFVDGKEVHTAKTQPREQQFNS TYRWSVLPIEHQDHLTGKEFKCRVNHIGLPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSPKEL SSSDTVTLTCLIKDFYPPEIDVEWQSNGQPEPESKYHTTAPQLDEDGSYFLYSKLSVDKS RWQQGDTFTCAVMHEALQNHYTDLSLSHSPGK*
    Figura 12
    SEQ ID NO 22 : MAI> anti-TNF quimérico. Cadena ligera kappa <le VK Humano - canino
    DIQMTQS P SS LSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYA ASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQ GTKVEIKRNDAQPAVYLFQPSPDQLHTGSASWCLLNSFYPKDINVKWKV DGVIQDTGIQESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSL PSTLIKSFQRSECQRVD*
    SEQ ID NO 23: MAb anti-TNF quimérico. Dominio constante de cadena pesada de tipo B de VH Humano - canino
    EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSA ITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNS LYLQMNS LRAEDTAVYYCAKVS YLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLV SGYFPEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWPSE T FTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDC PKCPAPEMLGGPSVFIF PPKPKDTLLIARTPEVTCWVDLDPEDPEVQISWFVDGKQMQTAKTQPRE EQFN GTYRWSVL PIGHQDWLKGKQFTCKVNNKALPS PIERTISKARGQA HQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFYPPDIDVEWQSNGQQEPESKY RTT PPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSRWQRGDTFICAVMHEALHNHYTQE SL SHSPGK*
    Figura 13
    imagen12
    DO
    450nrr>
    imagen13
    ca-HC Enea-kLC
    qu-HCB+ control qu-kLC neg
    Figura 14
    imagen14
    imagen15
    imagen16
    SEQ ID NO:26 -Cadena pesada de ca148-HCB
    MGFGLSWVFLVALLRGVQCEVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAAS
    GFIFSSYAMRWVRQAPGKGLEWVAFMSYDGSNKKYADSVKGRFT
    ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMD
    VWGQGTSVTVSSASTTAPSVFPLAPSCGSTSGSTVALACLVSGYF
    PEPVTVSWNSGSLTSGVHTFPSVLQSSGLYSLSSMVTVPSSRWP
    SETFTCNVAHPASKTKVDKPVPKRENGRVPRPPDCPKCPAPEML
    GGPSVFIFPPKPKDTLLIARTPEVTCVVVDLDPEDPEVQISWFVDGK
    QMQTAKTQPREEQFNGTYRWSVLPIGHQDWLKGKQFTCKVNNK
    ALPSPIERTISKARGQAHQPSVYVLPPSREELSKNTVSLTCLIKDFY
    PPDIDVEWQSNGQQEPESKYRTTPPQLDEDGSYFLYSKLSVDKSR
    WQRGDTFICAVMHEALHNHYTQESLSHSPGK**
    SEQ ID NO:27 - Cadena ligera de ca148-kLC MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVMTQSPASLSLSPGEKATISCRAS QSVYSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGVPSRFSGSGSGTD FTLTISSLEPEDVAVYYCQQPSNWPPFTFGPGTKVDIKRNDAQPA VYLFQPSPDQLHTGSASVVCLLNSFYPKDINVKWKVDGVIQDTGI QESVTEQDKDSTYSLSSTLTMSSTEYLSHELYSCEITHKSLPSTLI KSFQRSECQRVD**
    Figura 17
    imagen17
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