ES2665466T3

ES2665466T3 - Aplicaciones relacionadas con productos de membrana coriónica inmunocompatibles

Info

Publication number: ES2665466T3
Application number: ES11745341.5T
Authority: ES
Inventors: Samson Tom; Alla Danilkovitch; Dana Yoo; Timothy Jansen; Jin-Qiang Kuang; Jennifer Michelle Marconi
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Current assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 2010-02-18
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2018-04-25
Anticipated expiration: 2031-02-18
Also published as: EP2536824A1; EP3351622A1; CA2790325A1; US10258650B2; EP2536827A1; CA2790436A1; EP2536824B1; EP2536823A4; EP2536417A1; WO2011103446A1; EP2536417B1; US20180360886A1; US11510947B2; US20200281981A1; US12318408B2; EP2536824A4; EP3351622B1; EP2536826A4; EP2536825B1; US20200230176A1

Abstract

Un producto placentario que comprende: un medio de crioconservación y una membrana coriónica, en donde: a. la membrana coriónica está sustancialmente libre de células del trofoblasto, macrófagos CD14+ o tanto células del trofoblasto como macrófagos CD14+; y b. en donde el medio de crioconservación comprende una cantidad crioconservante de un crioconservante; y c. en donde la membrana coriónica comprende células terapéuticas viables, en donde las células terapéuticas viables son originarias de la membrana coriónica y son una o más de i. células madre mesenquimatosas ("MSC"); ii. fibroblastos; y iii. células estromales.

Description

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aa. comprende además una membrana amniótica,

bb. comprende además una membrana amniótica, en donde la membrana amniótica comprende una capa de células epiteliales amnióticas,

cc. comprende además una membrana amniótica, en donde la membrana amniótica y la membrana coriónica están asociadas entre sí en la configuración natural, dd. comprende además una membrana amniótica, en donde la membrana amniótica y la membrana coriónica no están adheridas entre sí en la configuración natural, ee. comprende además una membrana amniótica en donde la membrana coriónica comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces más células estromales respecto a la membrana amniótica, ff. no comprende una membrana amniótica, gg. la membrana coriónica comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces más células estromales respecto a una membrana amniótica del mismo área derivada de la misma placenta, y hh. es adecuado para aplicación dérmica a una herida.

Células De acuerdo con la presente invención, un producto placentario comprende células terapéuticas originarias de la membrana coriónica. Las células comprenden una o más de células estromales, MSC y fibroblastos.

En una realización, las células terapéuticas originarias comprenden células estromales viables. En una realización, las células terapéuticas originarias comprenden MSC viables. En una realización, las células terapéuticas originarias comprenden fibroblastos viables. En una realización, las

células terapéuticas originarias comprenden MSC viables y fibroblastos viables. En una realización, las células terapéuticas originarias comprenden MSC viables y fibroblastos viables. En una realización, las células terapéuticas originarias comprenden células estromales viables y células epiteliales

viables.

En una realización, las células originarias terapéuticas son células viables que pueden diferenciarse en células de más de un linaje (por ejemplo, linajes osteogénicos, adipogénicos y/o condrogénicos). En una realización, la membrana coriónica comprende de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 360.000

células/cm2 o de aproximadamente 40.000 a aproximadamente 90.000 células/cm2. En una realización, la membrana coriónica comprende al menos: aproximadamente 7.400 o aproximadamente

15.000 o aproximadamente 23.217, o aproximadamente 35.000, o aproximadamente 40.000 o aproximadamente

47.800 de células estromales por cm2 de la membrana coriónica.

En una realización, la membrana coriónica comprende de 5.000 a 50.000 células estromales por cm2 de la membrana coriónica.

En una realización, la membrana coriónica comprende células estromales, en donde al menos: un 40 %, o un 50 %, o un 60 %, o un 70 %, o un 74,3 %, o un 83,4 o un 90 %, o un 92,5 % de las células estromales son viables después de un ciclo de congelación-descongelación.

En una realización, la membrana coriónica comprende células estromales en donde de un 40 % a un 92,5 % de las células estromales son viables después de un ciclo de congelación-descongelación.

En una realización, la membrana coriónica (del producto placentario) comprende fibroblastos en aproximadamente un 50 % a aproximadamente un 90 % de las células totales.

En una realización, la membrana coriónica comprende macrófagos CD14+ en una cantidad de menos de aproximadamente un 5 % o menos de aproximadamente un 1 % o menos de aproximadamente un 0,5 %, opcionalmente como se demuestra por una disminución sustancial en la estimulación por LPS de la liberación de TNFα.

En una realización, el producto placentario comprende de aproximadamente 2 a aproximadamente 4 veces más células estromales respecto a una membrana amniótica del mismo área derivada de la misma placenta.

En una realización, el producto placentario comprende además una membrana amniótica, en donde el producto

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sustancialmente libre de células del trofoblasto. Opcionalmente, el lado materno del producto placentario comprende fragmentos de proteínas de la matriz extracelular en una concentración sustancialmente mayor que la de una membrana coriónica natural. Opcionalmente, el producto placentario se ha tratado con dispasa (por ejemplo, dispasa II) y/o una parte sustancial de los fragmentos proteínicos de la matriz extracelular comprende leucina o fenilalanina terminal.

En una realización, el producto placentario tiene un grosor de aproximadamente 40 μm a aproximadamente 400 μm.

En una realización, el producto placentario comprende además una membrana amniótica. Opcionalmente, la membrana amniótica y la membrana coriónica en el producto placentario están asociadas entre sí en la configuración natural. Como alternativa la membrana amniótica y la membrana coriónica no están adheridas entre sí en la configuración natural.

En una realización, el producto placentario no comprende una membrana amniótica.

Formulación

De acuerdo con la presente invención, el producto placentario puede formularse con un medio de crioconservación.

En una realización, el medio de crioconservación comprende uno o más crioconservantes de penetración celular, uno o más crioconservantes sin penetración celular, o una combinación de los mismos.

Opcionalmente, el medio de crioconservación comprende uno o más crioconservantes de penetración celular seleccionados de DMSO, un glicerol, un glicol, un propilenglicol, un etilenglicol o una combinación de los mismos.

Opcionalmente, el medio de crioconservación comprende uno o más crioconservantes sin penetración celular seleccionados de polivinilpirrolidona, un hidroxietil almidón, un polisacárido, un monosacárido, un alcohol de azúcar, un alginato, una trehalosa, una rafinosa, un dextrano o una combinación de los mismos.

Otros ejemplos de crioconservantes útiles se describen en "Cryopreservation" (BioFiles volumen 5 número 4 hoja de datos de Sigma-Aldrich®).

En una realización, el medio de crioconservación comprende un crioconservante de penetración celular, en donde la mayor parte del crioconservante de penetración celular es DMSO. Opcionalmente, el medio de crioconservación no comprende una cantidad sustancial de glicerol.

En una realización, el medio de crioconservación comprende DMSO. Opcionalmente, el medio de crioconservación no comprende glicerol en una cantidad mayoritaria. Opcionalmente, el medio de crioconservación no comprende una cantidad sustancial de glicerol.

En una realización, el medio de crioconservación comprende componentes adicionales tales como albúmina (por ejemplo, HSA o BSA), una solución de electrolitos (por ejemplo, Plasma-Lyte) o una combinación de las mismas.

En una realización, el medio de crioconservación comprende de un 1 % a aproximadamente un 15 % de albúmina en peso y de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 20 % de crioconservante en volumen (por ejemplo, aproximadamente un 10 %). Opcionalmente, el crioconservante comprende DMSO (por ejemplo, en una cantidad mayoritaria).

En una realización, el producto placentario se formula en más de aproximadamente 20 ml o más de aproximadamente 50 ml de medio de crioconservación. Opcionalmente, el crioconservante comprende DMSO (por ejemplo, en una cantidad mayoritaria). Opcionalmente, el medio de crioconservación no comprende una cantidad sustancial de glicerol.

En una realización, el producto placentario se coloca en papel de nitrocelulosa.

En una realización, la placenta se corta en una pluralidad de secciones. Opcionalmente, las secciones son de menos de aproximadamente 10 cm x 10 cm. Opcionalmente, las secciones son entre aproximadamente 2 cm x 2 cm y5 cm x5cm.

Fabricación

Visión de conjunto

Un producto placentario de la presente invención puede fabricarse a partir de una placenta de cualquier manera adecuada que proporcione las características técnicas mostradas en la presente memoria. De acuerdo con la presente invención, un producto placentario comprende al menos una membrana coriónica inmunocompatible.

En una realización, un producto placentario se fabrica por un método que comprende:

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Eliminación del trofoblasto

En una realización, las células del trofoblasto se reducen o retiran del producto placentario. Sorprendentemente, dicho producto placentario tiene una o más de las siguientes características superiores:

a.: es sustancialmente no inmunógeno;

b.: proporciona un tiempo de cicatrización destacable; y

c.: proporciona eficacia terapéutica potenciada.

Las células del trofoblasto pueden retirarse de cualquier manera adecuada que disminuya sustancialmente el contenido del trofoblasto del producto placentario. Opcionalmente, las células del trofoblasto se retiran de forma selectiva o se retiran de otro modo sin eliminar una parte sustancial de uno o más componentes terapéuticos de la placenta (por ejemplo, MSC, factores placentarios, etc.). Opcionalmente, se retira una mayoría (por ejemplo, sustancialmente todo) de las células del trofoblasto.

Un método de eliminación de las células del trofoblasto comprende tratar la placenta (por ejemplo, corion o amniocorion) con una enzima digestiva tal como dispasa (por ejemplo, dispasa II) y separar las células del trofoblasto de la placenta. Opcionalmente, la etapa de separación comprende la separación mecánica tal como abrasión o raspado. Opcionalmente, el raspado comprende el raspado con un instrumento suave tal como un dedo.

Un método de eliminación de las células del trofoblasto comprende tratar la membrana coriónica con dispasa durante aproximadamente 30 a aproximadamente 45 minutos, lo que separa las células del trofoblasto de la placenta. Opcionalmente, la dispasa se proporciona en una solución de aproximadamente menos de aproximadamente un 1 % (por ejemplo, aproximadamente un 0,5 %). Opcionalmente, la etapa de separación comprende la separación mecánica tal como abrasión o raspado. Opcionalmente, el raspado comprende el raspado con un instrumento suave tal como un dedo.

Los métodos útiles de eliminación de células del trofoblasto de una placenta (por ejemplo, corion) se describen por Portmann-Lanz et al. ("Placental mesenchymal stem cells as potential autologous graft for pre-and perinatal neuroregeneration"; American Journal of Obstetrics and Gynecology (2006) 194, 664-73), ("Isolation and characterization of mesenchymal cells from human fetal membranes"; Journal Of Tissue Engineering And Regenerative Medicine 2007; 1: 296-305) y (Concise Review: Isolation and Characterization of Cells from Human Term Placenta: Outcome of the First International Workshop on Placenta Derived Stem Cells").

En una realización, las células del trofoblasto se retiran antes de la crioconservación.

Eliminación de macrófagos

En una realización, los macrófagos funcionales se reducen o retiran del producto placentario. Sorprendentemente, dicho producto placentario tiene una o más de las siguientes características superiores:

a.: es sustancialmente no inmunógeno;

b.: proporciona un tiempo de cicatrización destacable; y

c.: proporciona eficacia terapéutica potenciada.

Los macrófagos funcionales pueden retirarse de cualquier manera adecuada que disminuya sustancialmente el contenido de macrófagos del producto placentario. Opcionalmente, los macrófagos se retiran de forma selectiva o se retiran de otro modo sin eliminar una parte sustancial de uno o más componentes terapéuticos de la placenta (por ejemplo, MSC, factores placentarios, etc.). Opcionalmente, se retira una mayoría (por ejemplo, sustancialmente todo) de los macrófagos.

Un método de retirada de las células inmunitarias tales como los macrófagos comprende eliminar las células inmunitarias por tasas rápidas de congelación, tales como 60-100 ºC/min.

Aunque las células inmunitarias pueden eliminarse por tasas rápidas de congelación, dicho método puede ser también perjudicial para las células terapéuticas, tales como las células estromales (por ejemplo, MSC). Los autores de la presente invención han descubierto un método de eliminación selectiva de los macrófagos CD14+, que pueden eliminarse de forma selectiva refrigerando la placenta durante un periodo de tiempo (por ejemplo, durante al menos aproximadamente 10 min tal como durante aproximadamente 30-60 min) a una temperatura por encima de la congelación (por ejemplo, incubando a 2-8 ºC) y después congelando la placenta (por ejemplo, incubando a -80 ºC ± 5 ºC). Opcionalmente, la etapa de congelación comprende congelar a una tasa de menos de 10 º/min (por ejemplo, menos de aproximadamente 5 º/min tal como a aproximadamente 1 º/min).

En una realización, la etapa de refrigeración comprende impregnar la placenta en un medio de crioconservación

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Tabla 3 Recuento de células después de descongelación por cm2, viabilidad celular y valores derecuperación de células del proceso (crioconservación) para lamembrana coriónica.

Parámetro: Condición ensayada Estadística Recuento de células por cm2 Viabilidad celular Recuperaciónde células del proceso

Refrigerar a 2-8 ºC durante 30-60 min y congelar a -80 ºC ± 5 ºC: Todas las condiciones Promedio 23.217 87,3 % 102,8 %

DE: 9.155 4,1 % 65,5 %

N: 27 27 27

Tratamiento con dispasa: 30 min Promedio 22.354 85,7 % 81,1 % Sin disminución en la recuperación de células del proceso para los 45 min de tratamiento. Se estableció un intervalo de 30-45 min.

DE: 9.505 5,1 % 32,4 %

N: 24 24 24

45 min: Promedio 27.125 90,6 % 172,6 %

DE: 7.963 2,2 % 101,2 %

N: 6 6 6

Intervalo de tiempo de refrigeración: 30 min Promedio 23.815 86,8 % 102,2 % El valor de recuperación del proceso fue > 80 % para el intervalo de tiempo de 60 min. Se estableció un intervalo de 3060 min.

DE: 9681 5,2 % 68,8 %

N: 25 25 25

60 min: Promedio 20.773 85,8 % 84,9 %

DE: 7.356 4,7 % 14,4 %

N: 5 5 5

Temperatura de descongelación: Baño de agua a 37 ºC ± 2 ºC Promedio 33.360 85,9 % 114,7 % No se encontró diferencia significativa en la recuperación de células del proceso. Se seleccionó la condición de temp. ambiente por razones lógicas.

DE: 8497 4,0 % 38,1 %

N: 5 5 5

Baño de agua a temp. ambiente: Promedio 21.298 86,8 % 96,3 %

DE: 8.189 5,3 % 67,2 %

N: 25 25 25

Periodo de retención después de la transferencia a solución salina: 1-15 min Promedio 23.733 86,6 % 100,6 % No se encontró diferencia significativa en la recuperación de células del proceso. Las membranas pueden mantenerse en solución salina durante hasta 1 h.

DE: 9.674 5,1 % 67,0 %

N: 26 26 26

1 h: Promedio 20.550 87,0 % 91,4 %

DE: 6.575 4,8 % 32,0 %

N: 4 4 4

Tamaño del tejido: 5 cm x 5 cm Promedio 23.391 86,1 % 99,6 % Sin disminución en la recuperación de células del proceso del producto de 5 cm x 5 cm al producto de 2 cm x 2 cm. Ambos tamaños fueron aceptables para su uso.

DE: 8.865 5,0 % 58,7 %

N: 23 23 23

2 cm x 2 cm: Promedio 23.036 88,4 % 98,7 %

DE: 11.362 5,0 % 81,3 %

N: 7 7 7

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Notas: cm = centímetro; min = minutos; temp. = temperatura; h = hora, DE = desviación estándar; N = número

Tabla 4 Recuento de células después de descongelación por cm2, viabilidad celular y valores derecuperación de células del proceso (crioconservación) para lamembrana amniótica

Parámetro: Condició n ensayada Estadístic a Recuent o de células por cm2 Viabilida d celular Recuperación de células del proceso Comentarios/conclusion es

Refrigerar a 2-8 ºC durante 30-60 min y congelar a -80 ºC ± 10 ºC: Todas las condicione s Promedio 55.709 83,4 % 64,2 % Evaluación global

DE: 45.210 4,4 % 22,5 %

N: 32 32 32

Intervalo de tiempo de refrigeración: 30 min Promedio 52.173 83,1 % 63,7 % No se encontró diferencia significativa en la recuperación de células del proceso. Se estableció un intervalo de 30-60 min.

DE: 39.750 4,5 % 21,4 %

N: 26 26 26

60 min: Promedio 71.033 85,0 % 66,5 %

DE: 66.525 3,9 % 29,3 %

N: 6 6 6

Temperatura de descongelació n: Baño de agua a 37 ºC ± 2 ºC Promedio 48.524 83,3 % 64,0 % No se encontró diferencia significativa en la recuperación de células del proceso. Se seleccionó la condición de temp. ambiente por razones lógicas.

DE: 27.804 1,7 % 34,4 %

N: 7 7 7

Baño de agua a temp. ambiente: Promedio 57.721 83,5 % 64,3 %

DE: 49.271 4,9 % 19,0 %

N: 25 25 25

Periodo de retención después de la transferencia a solución salina: 1-15 min Promedio 50.873 83,1 % 65,0 % No se encontró diferencia significativa en la recuperación de células del proceso. Las membranas pueden mantenerse en solución salina durante hasta 1 h.

DE: 38.969 3,9 % 24,2 %

N: 26 26 26

1 h: Promedio 76.667 85,1 % 61,0 %

DE: 66.565 6,2 % 14,3 %

N: 6 6 6

Tamaño del tejido: 5 cm x 5 cm Promedio 58.431 83,3 % 62,8 % Sin disminución en la recuperación de células del proceso del producto de 5 cm x 5 cm al producto de 2 cm x 2 cm. Ambos tamaños fueron aceptables para su uso.

DE: 47.603 4,5 % 21,7 %

N: 28 28 28

2 cm x 2 cm: Promedio 36 656 84,4 % 73,9 %

DT: 13 175 3,4 % 29,5 %

N: 4 4 4

Estos datos son coherentes con ciertas realizaciones de la presente invención que proporcionan un producto placentario que comprende una membrana coriónica que contiene de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 60.000 o a aproximadamente 200.000 células/cm2.

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Tabla 5

Descripción del sistema experimental: Niveles de TNF-α asociados con la ausencia/reducción de respuesta inmunitaria Comentarios Referencias

Inhibición inducida por IL-10 de MLR in vitro. El TNF se midió en sobrenadante de cultivo tisular por ELISA.: Media 260 pg/ml Wang et al., Transplantation, 2002, 74:772

La MLR usando explantes tisulares de piel (0,02 cm2 por pocillo) como estimuladores en presencia o ausencia de IL-10 (ensayo de explante de piel). Se evaluó la destrucción de tejido de piel al microscopio, y la gravedad se asignó basándose en el daño tisular histopatológico.: Media 100 pg/ml

Producción endógena de TNF: ~0,04 U/ml para el control No se Shalaby et al., J

en MLR en presencia o: negativo y MLR en proporciona la Immunol, 1988,

ausencia de anticuerpos anti: presencia de anticuerpos actividad TNF 141:499

TNF. Se evaluaron los niveles: anti-TNF, que se por mg.

de TNF usando el ensayo de: correlacionaron con

citotoxicidad de WEHI-164.: ausencia de inhibición o inhibición significativa de proliferación de linfocitos

Niveles de TNF en líquido BAL de isoinjertos de pulmón, aloinjerto no modificado y aloinjerto con macrófagos alveolares (AM) reducidos en ratas.: Isoinjerto: por debajo de la detección; aloinjerto con AM reducidos: ~15 pg/ml de BAL (total 75 pg/5 ml de BAL) Aloinjerto no modificado: ~45 pg/ml (inmunógeno) Sekine et al., J Immunol, 1997, 159:4084

Niveles de TNF en MLR: ~<200 pg/ml de TNF Ohashi et al., Clin

después de 48 horas en: correlacionado con una Immunol, 2010,

presencia o ausencia de: inhibición completa de 134:345

productos finales de glucación: MLR

avanzada (inhibidores de MLR).

Niveles de TNF en MLR.: <100 pg/ml de TNF en MLR con donantes de HLA coincidente (control, sin estimulación) Toungouz et al., Hum Immunol, 1993, 38:221

Actividad TNF en MLR cuando: Control negativo ~20 U de La unidad de Lomas et al., Cell

se incubaron fragmentos de: actividad TNF; MLR con actividad se Tissue Bank,

aloinjertos de piel: explantes de piel: 0-40 U; calculó como 2004, 5:23.

crioconservados (~0,2 cm2) con: Control positivo: 600 U TNF en ng/ml

hPBMC durante 24 horas.: dividido por la

Control positivo: hPBMC+LPS;: DO a 570 nm

negativo: hPBMC en solitario.: para el mismo pocillo experimental

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Trascurso del tiempo de citocinas en MLR, incluyendo TNF.: TNF óptimo después de 24 horas: ~150 pg/ml Jordan y Ritter, J Immunol Meth, 2002, 260:1

La MLR usando explantes tisulares de piel (0,02 cm2 por pocillo) como estimuladores en presencia o ausencia de anticuerpos anti-TNF (ensayo de explante de piel). Se evaluó la destrucción de tejido de piel al microscopio, y la gravedad se asignó basándose en el daño tisular histopatológico.: Para ausencia de destrucción de piel: 0,5-1,1 pg/ml para respondedores de HLA compatible, y 2,61376 pg/ml o MLR no coincidente Recálculo por 1 cm2 de tejido de piel: el nivel más bajo de TNF no inmunógeno es de 100 pg/cm2 Dickinson et al., Cytokine, 1994, 6:141

Tabla 6

Descripción del sistema experimental: Niveles de TNF secretados pormembranas placentarias frescasen cultivo Comentarios/recálculos de los niveles más bajos de TNF por cm2 Referencias

Secreción de TNF por tejido amniótico y coriónico "fresco" (1,44 cm2) incubado durante 24 horas en presencia o ausencia de LPS (500 ng/ml).: Corion: basal 3,3 ± 0,46 ng/cm2, inducido por LPS: 150-250 ng/cm2 Amnios: basal 2,5 ± 1,3 ng/cm2, inducido por LPS: ~50 ng/cm2 El nivel más bajo de TNF para el amnios es de 1200 pg/cm2 Zaga et al., Biol Reprod, 2004, 71:1296

Secreción de TNF por tejido: Basal ~1-2,5 pg/μg El nivel más bajo de TNF Zaga-Clavellina et

amniótico y coriónico: de proteína total en el para el amnios es de 800 al., Reprod Biol

"fresco" (discos de 1,8 cm: medio tanto para pg/cm2 Endocrinol, 2007,

de diámetro: 2,5 cm2): amnios como para 5:46

incubado durante 24 horas: corion;

en presencia o ausencia de

E. coli en 1 ml de medio.: inducido por E. coli: amnios • 29,2 (14,535,3) pg y corion • 53,15 (40-94,2) pg por μg de proteína total

Secreción de TNF por tejido amniótico y coriónico "fresco" (corion 8-10 mg de tejido/ml; amnios 5-7 mg/ml, 0,02-0,04 cm2) incubado durante 20 horas en presencia o ausencia de LPS (5 μg/ml).: Basal: ~2-64 U/ml para 8-10 mg de corion; <1 U/ml para 5-7 mg de amnios; inducido por LPS: >100 U/10 mg para corion y ~15-17 U/10 mg para amnios 1 unidad = ~100-200 pg/ml; El nivel más bajo de TNF para el amnios es <100 pg/ml correspondiente a <2.500 pg/cm2 Paradowska et al., Placenta, 1997, 18:441

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trofoblasto) y, por lo tanto, son una fuente potencial de inmunogenicidad. Para investigar la composición celular del corion, se realizó análisis FACS.

Ejemplo 11.1 Procedimiento FACS: Preparación de suspensión de célulasindividuales

Se usaron membranas coriónicas purificadas para el análisis fenotípico celular mediante FACS. Las células del

5 corion se aislaron usando 280 U/ml de colagenasa de tipo II (Worthington, n.º cat. 4202). Los tejidos se trataron con enzima durante 60-90 min a 37 ºC ± 2 ºC, y la suspensión celular resultante se filtró a través de un filtro de 100 μm para retirar los desechos tisulares. Entonces se centrifugaron suspensiones de células individuales usando un Beckman TJ-6 a 2000 rpm durante 10 min y se lavaron dos veces con DPBS. El sobrenadante se descartó después de cada lavado, y las células se resuspendieron en 2 ml de tampón de tinción FACS (DPBS + 0,09 % de

10 NaN3+1%deFBS).

Ejemplo 11.2 Inmunomarcaje de células para marcadores celulares específicos

Una vez se preparó la suspensión de células individuales de acuerdo con el ejemplo 10.1, se trató un mínimo de 1 x 105 células en 100 μl de tampón de tinción FACS con anticuerpos marcados con colorante fluorescente. La tabla 7 proporciona descripciones de los anticuerpos y las cantidades usadas. Para los marcadores de superficie celular, 15 las células se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad con anticuerpos, seguido de lavado dos veces con tampón de tinción FACS por centrifugación a 1.300 rpm durante 5 min usando una centrífuga Beckman TJ-6. Las células entonces se resuspendieron en 400 μl de tampón de tinción FACS y se analizaron usando un citómetro de flujo BD FACSCalibur. Para evaluar la viabilidad celular, se añadieron 10 μl de reactivo 7-AAD (BD, n.º cat. 559925) justo después del análisis FACS inicial y se analizaron de nuevo. Para la

20 tinción intracelular, las células se permeabilizaron y se marcaron siguiendo las recomendaciones del fabricante (BD Cytofix/Cytoperm, n.º cat. 554714) y se analizaron usando un citómetro de flujo BD FACSCalibur.

Tabla 7 Descripción de reactivos usados para la caracterización de células placentarias por FACS.

Anticuerpo de marcaje celular y tipo de marcador: N.º cat. Volumen de solución de anticuerpo usado Tipo de marcador celular Especificidad de marcador celular

Isotipo lgG1-PE: BD 559320 5 μl Superficie celular Control de isotipo

CD105-PE: Caltag MHCD10504 20 μl Superficie celular Marcador de MSC

CD166-PE: BD 559263 80 μl Superficie celular Marcador de MSC

CD45-PE: BD 555483 10 μl Superficie celular Marcador de células hematopoyéticas

Isotipo lgG2a-PE: BD 555574 2 μl Superficie celular Control de isotipo

CD14-PE: BD 555398 20 μl Superficie celular Marcador de monocitos

HLA-DR-PE: BD 556644 20 μl Superficie celular HLA de clase II específico para células presentadoras de antígeno

Isotipo lgG1-FITC: BD555748 5 μl Superficie celular Control de isotipo

CD86-FITC: BD 557343 20 μl Superficie celular Marcador coestimulador inmunitario

CD40-FITC: BD 556624 20 μl Superficie celular Marcador coestimulador inmunitario

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(remítase a la tabla 10), se incubaron con el reactivo de ensayo de viabilidad celular 7-AAD, y se analizaron

usando un BD FACSCalibur. La tabla 10 demuestra que la recuperación de cantidades conocidas de células

CD45+ no era correcta (4.ª columna en la tabla). Por ejemplo, aunque se añadió un 12 % de PBMC en una

suspensión de células individuales de membrana amniótica, se recuperó únicamente un 4,26 % de las células

5 CD45+ de acuerdo con el análisis FACS (diferencia de >60 % de la adición real). Para correlacionarlo con la

inmunogenicidad, también se realizó MLR en paralelo. En resumen, se cocultivaron suspensiones de células

individuales de membrana amniótica con adiciones de diversas cantidades de hPBMC vivas con otro donante de

PBMC en la MLR. La figura 10 representa una correlación entre la cantidad de células CD45+ presentes en

suspensiones celulares derivadas de amnios y la inmunogenicidad en MLR in vitro. La tabla 10 y la figura 10 10 muestran que las suspensiones con adiciones de mayores cantidades de células CD45+ vivas produjeron mayor

inmunogenicidad medida por la expresión de IL-2sR en el donante respondedor de hPBMC.

Tabla 10 Experimentos de % de recuperación de CD45+.

Descripción de la muestra (en % de tipos celulares en la mezcla): % de células CD45+ (detectadas por FACS) Adición real (%, basado en un 60 % de células CD45+ en este lote de hPBMC) % de diferencia de la adición real Inmunogenicidad de la suspensión celular (ensayada en MLR y expresada como IL2R en pg/ml)

100 % de amnios: 0,65 N/A N/A 20,23

0 % de PBMC: N/A N/A N/A 15,6 (control negativo)

100 % de PBMC: 61,51 N/A N/A 86,31 (control positivo)

20 % de PBMC + 80 % de amnios: 4,26 12 64,5 % 24,38

10 % de PBMC + 90 % de amnios: 2,24 6 62,7 % 21,17

5 % de PBMC + 95 % de amnios: 1,7 3 43,3 % 16,75

2,5 % de PBMC +97,5 % de amnios: 1,36 1,5 No calculado* 15,9

1,25 % de PBMC + 98,75 % de amnios: 1,06 0,75 No calculado* 12,27

Notas: N/A -no aplicable; *No calculado -los valores están cerca de los límites de detección del método.

Ejemplo 15 Análisis de matrices de proteínas

15 Los perfiles de proteínas de membrana amniótica y coriónica se investigaron usando una matriz de quimioluminiscencia SearchLight Multiplex. Se investigó la presencia de proteínas en extractos de membrana tisular y secretadas por tejidos en medio de cultivo. Por motivos de comparación, se ensayaron dos productos disponibles en el mercado que contienen células vivas, Apligraf y Dermagraft.

Ejemplo 15.1 Dermagraft

20 La membrana Dermagraft se descongeló y se lavó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La membrana Dermagraft se cortó en fragmentos de 7,5 cm2. Para los lisados tisulares, se congeló rápidamente un fragmento de 7,5 cm2 de membrana en nitrógeno líquido, seguido de pulverización usando un mortero y mano de mortero. El tejido triturado se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y se añadieron 500 μl de tampón de lisis (Cell Signaling Technologies, n.º cat. 9803) con inhibidor de proteasa (Roche, n.º cat. 11836153001) y se incubó en

25 hielo durante 30 min con agitación vorticial frecuente. La muestra entonces se centrifugó a 16.000 g durante 10 min. El sobrenadante se recogió y se envió para el análisis de matriz de proteínas por Aushon Biosystems. Para el cultivo tisular, se sembró un fragmento de 7,5 cm2 de membrana en un pocillo de una placa de 12 pocillos y se añadieron 2 ml de DMEM + HSA al 1 % + antibiótico/antimicótico y se incubó a 37 ºC ± 2 ºC durante 3, 7 o 14 días. Después de la incubación, el tejido y el medio de cultivo se transfirieron a un tubo cónico de 15 ml y se

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Grupo de proteínas basado en funcionalidad: Comentarios

Factores angiogénicos: Angiotensina-2 (Ang-2); Factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF); Factor de crecimiento epidérmico unido a heparina (HB-EGF); EGF; FGF-7 (también conocido como factor de crecimiento de queratinocitos-KGF); Factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) AA, AB, y BB; Factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), VEGF-C y VEGF-D; Lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL); Factor de crecimiento de hepatocitos (HGF); Factor de crecimiento placentario (PIGF); Factor derivado de epitelio pigmentado (PEGF); Trombopoyetina (TPO) La mayoría de estos factores también tienen actividades estimuladoras del crecimiento y la migración y pueden colocarse en un grupo de factores de crecimiento.

Inhibidor de proteasa/transportador de proteínas: Alfa-2-macroglobulina Inhibe la actividad proteasa; regula la actividad del factor de crecimiento.

Factores de crecimiento: Véase "factores angiogénicos" + factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a) Véase "factores angiogénicos".

Citocinas: Adiponectina (Acrp-30) Afecta a las funciones de los queratinocitos.

Factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF): Protección contra infecciones.

Antagonista del receptor de interleucina 1 (IL-1RA): Regula la actividad de la citocina inflamatoria IL-1.

Factor inhibidor de leucemia (LIF): Respalda los factores de crecimiento angiogénicos.

Quimiocinas: SDF-1beta Atrae células endoteliales y otras células madre desde la circulación hasta le sitio de herida.

Reguladores de IGF: Proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina (IGFBP1, 2, 3) Regula la actividad de IGF.

Ejemplo 15.4 Expresión de proteínas en los presentes productos placentarios

Los análisis de los datos preliminares de la matriz de proteínas mostraron que la mayoría de los factores de ensayo seleccionados (véase la tabla 11) se expresaban en membrana amniótica, membrana coriónica, Apligraf y 5 Dermagraft.

Se identificaron tres proteínas como únicas para la membrana coriónica que son indetectables en Apligraf y Dermagraft. Estas proteínas son EGF, IGFBP1 y adiponectina). La figura 11 representa la expresión de EGF (A), IGFBP1 (B) y adiponectina (C) en membrana amniótica o coriónica. CM75 y CM78 son productos placentarios de la presente invención (por ejemplo, crioconservados), AM75 y AM78 son productos de membrana amniótica

10 crioconservados. Los autores de la invención creen que estas proteínas facilitan la eficacia terapéutica de los presentes productos placentarios para la cicatrización de heridas.

Estos datos son coherentes con ciertas realizaciones de la presente invención que proporcionan un producto

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placentario que comprende una membrana coriónica que contiene EGF, IGFBP1 y/o adiponectina.

Ejemplo 16 Se secretan proteínas de cicatrización de heridas durante unmínimo de 14 días

Los productos placentarios de la presente invención muestran un efecto duradero, deseado para los tratamientos de cicatrización de heridas. La matriz extracelular y la presencia de células viables dentro de la membrana 5 amniótica descrita en esta invención permiten que haya un cóctel de proteínas que se sabe que son importantes para la cicatrización de heridas presentes durante al menos 14 días. Las membranas amnióticas se descongelaron y se sembraron en pocillos de cultivo tisular y se incubaron a 37 ºC ± 2 ºC durante 3, 7 y 14 días. En cada punto temporal, se recogió una muestra del sobrenadante de cultivo y se midió a través de análisis de matriz de proteínas como se describe en el ejemplo 15. La tabla 12 ilustra el nivel de diversos factores secretados en

10 sobrenadantes de cultivo tisular de dos donantes de membranas coriónicas a los 3, 7 y 14 días medido a través de análisis de matriz de proteínas.

Tabla 12 Niveles de proteínas secretadas en sobrenadantes de cultivo de tejido coriónico en diferentespuntos temporales (pg/ml).

Día 3: Día 7

hACRP30: 298,4 614,3

hAlfa2Macroglobulina: 34 480,5 6952,5

hANG2: 0,0 2,0

hEGF: 0,7 0,4

hFGF: 84,3 13,5

hFibronectina: 37.510,9 41.871,4

hHBEGF: 102,6 40,0

hHGF: 1382,9 1715,4

hIGFBP1: 201,6 201,0

hlGFBP2: 62,7 172,9

hlGFBP3: 778,1 812,4

hIL1ra: 30.037,4 556,1

hKGF: 4,2 2,4

hMMP1: 32.388,5 67.665,6

hMMP10: 4016,4 4140,1

hMMP13: 13,3 0,0

hMMP2: 768,8 1230,5

hMMP3: 1294,7 2646,0

hMMP7: 14,7 43,7

hMMP8: 95,9 249,4

hMMP9: 10.034,6 29.201,5

hNGAL: 1968,1 2608,9

hPDGFAA: 18,6 21,8

hPDGFAB: 6,2 55,5

hPDGFBB: 15,1 5,2

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5

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días en DMEM con seroalbúmina humana (HSA) al 1 % en una incubadora de cultivo tisular. El tejido y el medio resultantes entonces se colocaron en tubos Eppendorf y se centrifugaron a alta velocidad en una microcentrífuga. Los sobrenadantes se recogieron y se almacenaron a -80 ºC ± 5 ºC hasta su uso. Para los estudios de migración y cicatrización de heridas, el medio acondicionado de las membranas placentarias se diluyó 1:20 en medio basal antes de añadirse a los pocillos experimentales. Después de 18 horas, se retiró el medio y las células se fijaron durante 20 min en un 4 % de paraformaldehído y se tiñeron con violeta cristal. Entonces se fotografió la zona de herida en cada pocillo. La cicatrización de heridas se determinó por la cantidad de zona de herida aún visible al final del experimento en comparación con las imágenes de control tomadas antes de añadir el medio acondicionado a los pocillos.

El medio acondicionado de membrana placentaria mantiene la migración celular y el cierre de la zona de herida

El medio acondicionado de membranas amnióticas y coriónicas se usó para evaluar el potenciar de estas membranas de promover la migración celular y el cierre de la zona de herida. El medio acondicionado de membranas coriónicas placentarias mantenía la migración de células en la zona de herida experimental. La figura 18 representa las imágenes representativas de HMVEC tratadas con un 5 % de medio acondicionado de tejido amniótico, coriónico o una combinación de tejido amniótico/coriónico, así como controles positivos y negativos. La zona de herida es de 0,9 mm de anchura.

La capacidad de los factores de las membranas placentarias producidas conforme a la presente descripción de promover la migración de HMVEC indicó que estos tejidos tienen la capacidad de potenciar la cicatrización de heridas. Además, basándose en las ideas de los autores de la invención, se ha descubierto sorprendentemente que estos tejidos también potencian la revascularización, ya que la línea celular HMVEC deriva de células de endotelio vascular.

Estos datos demuestran que los productos placentarios de la presente invención producen niveles inesperadamente superiores de factores que promueven los tratamientos de cicatrización de heridas.

Ejemplo 23 Análisis de factores en productos ejemplares de tejido placentario

La tabla 15 representa el perfil bioquímico de productos placentarios ejemplares de la invención (resultados ajustados por cm2 después de sustraer el fondo negativo).

Tabla 15 Factores en producto de tejido placentario (pg/cm2)

Unidades: Apligraf Dermagraft AM75 CM75 AM78 CM78

hMMP1: pg/ml/cm2 1.964.945,37 14.818,20 2..821,85 3531,81 117.326,89 95,46

hMMP7: pg/ml/cm2 911,54 0,00 0,00 0,00 3,96 0,00

hMMP10: pg/ml/cm2 0,00 0,00 113,94 0,00 0,00 0,00

hMMP13: pg/ml/cm2 21,61 0,00 0,00 0,00 0,71 0,00

hMMP3: pg/ml/cm2 208.281,70 180.721,52 170,26 161,52 8.325,17 0,00

hMMP9: pg/ml/cm2 8.872,28 19.321,39 214,78 1.455,11 630,56 57,59

hMMP2: pg/ml/cm2 153.341,77 19.712,21 287,14 37,93 3.823,38 24,44

hMMP8: pg/ml/cm2 36,92 12,19 0,00 0,00 0,00 0,00

hTIMP1: pg/ml/cm2 2.487,18 10.909,84 569,23 883,05 28.743,48 97,94

hTIMP2: pg/ml/cm2 7.285,53 1.796,56 89,29 13,72 424,06 4,83

MMP/TIMP: 239,26 19,72 6,81 6,26 4,50 2,62

Ejemplo 24 Factores en productos placentarios ejemplares medidos a través de análisis de matriz deproteínas por Aushon Biosystems

La tabla 16 representa el perfil bioquímico de los lisados de productos placentarios ejemplares de la invención (resultados ajustados por cm2 después de sustraer el fondo negativo).

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Tabla 16

Lisado AM75: Lisado AM78 Lisado CM75 Lisado CM78

pg/ml
pg/ml
pg/ml
pg/ml

hACRP30: 50,8 1154,6 1213,7 225,3

hAlfa2-Macroglobulina: 1.910,6 426.191,6 8.174,4 9.968,6

hEGF: 127,3 361,4 0,0 0,8

hbFGF: 119,1 821,5 375,0 351,3

hGCSF: 0,7 3,2 1,2 0,7

hHBEGF: 127,5 168,0 15,4 84,5

hHGF: 3.943,7 15.060,0 29.979,6 50.392,8

hIGFBP1: 5.065,0 9.456,6 934,0 1.443,6

hlGFBP2: 12-460,8 5.569,7 135,9 134,6

hlGFBP3: 50.115,7 41.551,4 4.571,5 11.970,2

hIL1ra: 3881,0 32.296,9 5.168,2 525,5

hKGF: 1,4 8,8 3,1 1,5

hLIF: 0,0 4,2 0,0 0,0

hMMP1: 9.144,1 20.641,2 2.882,9 6.582,3

hMMP10: 0,0 15,5 79,3 87,5 1

hMMP2: 2.067,3 4.061,9 949,5 748,8

hMMP3: 0,0 36,2 0,0 0,0

hMMP7: 5,1 11,4 4,5 9,1

hMMP8: 0,0 0,0 0,0 0,0

hMMP9: 92,2 2.878,1 2.676,2 1.259,3

hNGAL: 6.900,1 6.175,9 938,5 229,7

hPDGFAA: 0,0 12,5 39,8 35,2

hPDGFAB: 11,2 31,3 14,4 14,0

hPDGFbb: 4,6 13,4 4,0 1,3

hPEDF: 0,0 652,6 0,0 0,0

hTIMP1: 7.958,1 35.955,6 50.712,3 17.419,9

hTIMP2: 3.821,8 7.443,2 640,7 780,0

hVEGF: 3,3 11,8 125,2 8,4

hVEGFC: 46,5 150,0 123,5 51,7

hVEGFD: 25,7 31,0 15,0 20,4

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Claims

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