ES2665681T3 - Preparaciones de ARN que comprenden ARN modificado purificado para reprogramar células - Google Patents

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Gary Dahl
Judith Meis
Anthony Person
Jerome Jendrisak
Katalin Karikó
Drew Weissman
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    • C12Y114/13039—Nitric-oxide synthase (NADPH dependent) (1.14.13.39)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
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Abstract

Un procedimiento de reprogramación de una célula somática humana o de otro mamífero que reside in vitro y que presenta un primer estado o fenotipo diferenciado en una célula madre pluripotente inducida (iPSC), que comprende: a) introducir en dicha célula que presenta un primer estado o fenotipo diferenciado una preparación de ARN purificado que comprende moléculas de ARNm modificadas sintetizadas in vitro que - codifica una pluralidad de 4 o más, 5 o más o 6 factores de inducción de iPSC seleccionados del grupo que consiste en OCT4, SOX2, KLF4, MYC, NANOG y LIN28, - comprende, al menos, un nucleósido modificado seleccionado del grupo que consiste en 1- metilpseudouridina (m1Ψ) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido uridina no modificado homólogo, pseudouridina que no está adicionalmente modificada (Ψ) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido uridina no modificado homólogo, 5-metiluridina (m5U) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido uridina no modificado homólogo, 5-metoxiuridina (mo5U) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido uridina no modificado homólogo, 2-tiouridina (s2U) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido uridina no modificado homólogo y 5-metilcitidina (m5C) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido uridina no modificado homólogo, y - presenta una caperuza 5' y una cola de poli(A) 3'; en el que dichas moléculas de ARNm modificadas que componen dicha preparación de ARN purificado se purifican utilizando un procedimiento que elimina: moléculas contaminantes de ARN que son inmunogénicas y tóxicas para la célula por inducción de una respuesta inmunitaria innata, como puede detectarse midiendo la disminución de la secreción de citoquinas IFN-α o TNF-α a partir de células dendríticas transfectadas con dichas moléculas de ARNm modificadas purificadas en comparación con la secreción de dichas citoquinas a partir de células dendríticas transfectadas con las moléculas de ARNm modificadas no purificadas; de tal forma que dicha preparación de ARN purificado está libre de moléculas contaminantes de ARN que, si están presentes, activarían una respuesta inmunitaria en dicha célula, suficiente para evitar la supervivencia de dicha célula y la generación de una célula reprogramada; y b) repetir dicha introducción de dicha preparación de ARN purificado en múltiples días y cultivar la célula, en el que la célula se reprograma en una iPSC.

Description

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célula normal que proviene de un organismo que está libre de una enfermedad conocida. En algunos ejemplos de cualquiera de los procedimientos anteriores, la célula en la que se introduce el ARNm es una célula que proviene de un organismo que tiene una enfermedad conocida. En algunos ejemplos de cualquiera de los procedimientos anteriores, la célula en la que se introduce el ARNm es una célula que está libre de una patología conocida. En algunos ejemplos de cualquiera de los procedimientos anteriores, la célula en la que se introduce el ARNm es una célula que presenta un estado de enfermedad o una patología conocida (por ejemplo, una célula cancerosa o célula beta pancreática que presenta propiedades metabólicas de una célula diabética).
La descripción no se limita al uso de un tipo de célula específico (por ejemplo, a un tipo específico de célula somática) en los ejemplos de los procedimientos que comprenden la introducción de ARNm que codifica uno o más factores de inducción de iPSC con el fin de generar una célula desdiferenciada (por ejemplo, una célula iPS). Se contempla cualquier célula que es objeto de desdiferenciación utilizando factores de inducción de células iPS. Dichas células incluyen, aunque sin limitación, fibroblastos, queratinocitos, adipocitos, linfocitos, linfocitos T, linfocitos B, células en sangre de cordón mononuclear, células de la mucosa bucal, células hepáticas, HeLa, MCF-7 u otras células cancerosas. En algunos ejemplos, las células residen in vitro (por ejemplo, en cultivo) o in vivo. En algunos ejemplos, cuando se generan en cultivo, se utiliza un medio condicionado libre de células (por ejemplo, un medio condicionado por MEF). Como se demuestra a continuación, dicho medio proporcionó una mejor generación de células iPS. La descripción no se limita, sin embargo, a las condiciones de cultivo utilizadas. Se contempla para su uso cualquier condición de cultivo o medio ahora conocido o identificado posteriormente como útil para los procedimientos de la descripción (por ejemplo, para generar células iPS a partir de células somáticas y mantener dichas células). Por ejemplo, aunque no se prefiere, en algunos ejemplos del procedimiento, se utiliza una capa de células de alimentación en vez de un medio condicionado para cultivar las células que se tratan utilizando el procedimiento.
En algunos ejemplos de cualquiera de estos procedimientos, el paso de introducir ARNm comprende suministrar el ARNm en la célula (por ejemplo, una célula somática humana u otra célula animal) con un reactivo de transfección (por ejemplo, reactivo de transfección de ARNm TRANSIT™, MirusBio, Madison, Wl).
Sin embargo, la descripción no está limitada por la naturaleza del procedimiento de transfección utilizado. De hecho, se contempla cualquier proceso de transfección conocido o identificado en el futuro que sea capaz de suministrar moléculas de ARNm en las células in vivo o in vitro, incluidos procedimientos que suministran el ARNm en células en cultivo o en un medio de soporte de vida, si dichas células comprenden células aisladas o células que constituyen un tejido u órgano eucariota, o procedimientos que suministran el ARNm in vivo en células de un organismo, tal como un ser humano, animal, planta u hongo. En algunos ejemplos, el reactivo de transfección comprende un lípido (por ejemplo, liposomas, micelas, etc.). En algunos ejemplos, el reactivo de transfección comprende una nanopartícula o nanotubo. En algunos ejemplos, el reactivo de transfección comprende un compuesto catiónico (por ejemplo, polietilenimina o PEI). En algunos ejemplos, el procedimiento de transfección utiliza una corriente eléctrica para suministrar el ARNm en la célula (por ejemplo, por electroporación). En algunos ejemplos, el procedimiento de transfección utiliza un procedimiento biolístico para suministrar el ARNm en la célula (por ejemplo, una “pistola génica” o sistema de administración de partículas biolísticas.)
Los datos presentados en el presente documento muestran que, con respecto al ARNm introducido en la célula, ciertas cantidades de los ARNm utilizados en los EJEMPLOS que se describen en el presente documento dieron como resultado una mayor eficacia y una inducción más rápida de células madre pluripotentes a partir de células somáticas concretas utilizadas que otras cantidades de ARNm. Sin embargo, los procedimientos de la presente descripción no se limitan al uso de una cantidad específica de ARNm para introducir en la célula. Por ejemplo, se utilizó un total de tres dosis, comprendiendo cada dosis 18 microgramos de cada uno de los seis ARNm diferentes, codificando cada uno un factor de reprogramación humano diferente, para introducir el ARNm en aproximadamente 3 x 105 células de fibroblastos humanos en una placa de 10 cm (por ejemplo, suministrado utilizando un reactivo de transfección que contiene lípidos), aunque en otros ejemplos, se utilizaron cantidades mayores o menores de los ARNm para introducir en las células.
La descripción no se limita a una forma química concreta del ARNm utilizado, aunque ciertas formas de ARNm pueden producir resultados más eficaces. Sin embargo, en algunos ejemplos preferidos, el ARNm comprende preferentemente, al menos, un nucleósido modificado (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en una pseudouridina (Ψ), 5-metilcitosina (m5C), 5-metiluridina (m5U), 2'-O-metiluridina (Um o m2'-OU), 2-tiouridina (s2U) y N6-metiladenosina (m6A)) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido canónico correspondiente no modificado (por ejemplo, en algunas realizaciones preferidas, al menos, un nucleósido modificado en lugar de sustancialmente todos los nucleósidos canónicos correspondientes A, C, G, o T no modificados). En algunos ejemplos, el ARNm está poliadenilado. En algunos ejemplos preferidos, se prepara el ARNm por poliadenilación de un ARN transcrito in vitro (TIV), comprendiendo el procedimiento poner en contacto el ARN TIV usando una poli(A) polimerasa (por ejemplo, ARN polimerasa de levadura o poli(A) polimerasa de E. coli). En algunos ejemplos, el ARNm se poliadenila durante la TIV usando un molde de ADN que codifica la cola de poli(A). Independientemente de si el ARNm se poliadenila utilizando una poli(A) polimerasa o durante la TIV de un molde de ADN, en algunos ejemplos preferidos, el ARNm comprende una cola de poli-A (por ejemplo, una cola de poli-A que tiene 50-200 nucleótidos, por ejemplo, preferentemente 100-200, 150-200 nucleótidos o más de 150 nucleótidos), aunque en algunos ejemplos, se utiliza una cola de poli(A) más larga o más corta. En algunos ejemplos, se protege con caperuza el ARNm utilizado en los
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procedimientos. Para maximizar la eficacia de la expresión en las células, se prefiere que la mayoría de las moléculas de ARNm contengan una caperuza. En algunos ejemplos preferidos, las moléculas de ARNm utilizadas en los procedimientos se sintetizan in vitro por incubación de ARN primario no protegido con caperuza en presencia de un sistema enzimático de protección con caperuza. En algunos ejemplos preferidos, el ARN primario usado en la reacción enzimática de protección con caperuza se sintetiza por transcripción in vitro (TIV) de una molécula de ADN que codifica el ARN que se va a sintetizar. El ADN que codifica el ARN que se va a sintetizar contiene un promotor de ARN polimerasa, al cual se une una ARN polimerasa e inicia la transcripción a partir del mismo. También se conoce en la técnica que las moléculas de ARNm a menudo tienen regiones de secuencia diferente localizadas antes del codón de inicio de la traducción y después del codón de terminación de la traducción que no se traduce. Estas regiones, denominadas región no traducida cinco prima (5' UTR) y región no traducida tres prima (3' UTR), respectivamente, pueden afectar a la estabilidad de ARNm, a la localización de ARNm y a la eficacia traduccional del ARNm al que se unen. Se sabe que ciertas 5'y 3' UTR, tales como las de las alfa y beta globinas, mejoran la estabilidad del ARNm y la expresión de los ARNm. Por lo tanto, en algunas realizaciones preferidas, los ARNm que codifican factores de reprogramación (por ejemplo, factores de inducción de iPSC) presentan una 5' UTR y/o 3' UTR que dan como resultado una mayor estabilidad de ARNm y una mayor expresión del ARNm en las células (por ejemplo, una alfa globina o una beta globina 5' UTR y/o 3' UTR; por ejemplo, una alfa globina o beta globina 5' UTR y/o 3' UTR de Xenopus o humana, o, por ejemplo, un virus del grabado del tabaco (TEV) 5' UTR).
La TIV se puede llevar a cabo utilizando cualquier ARN polimerasa siempre que la síntesis de ARNm a partir del molde de ADN que codifica el ARN se inicie específicamente y suficientemente a partir de un promotor de ARN polimerasa afín y se obtenga ARNm de longitud completa. En algunos ejemplos preferidos, la ARN polimerasa se selecciona entre ARN polimerasa de T7, ARN polimerasa de SP6 y ARN polimerasa de T3. En otros ejemplos, el ARN protegido con caperuza se sintetiza cotranscripcionalmente por el uso de un dinucleótido análogo de caperuza en la reacción de TIV (por ejemplo, utilizando un kit AMPLICAP™ T7 o un kit de transcripción MESSAGEMAX™ T7ARCA-CAPPED MESSAGE; EPICENTRE o CellScript, Madison, Wl, EE. UU.). Si la protección con caperuza se lleva a cabo cotranscripcionalmente, el dinucleótido análogo de caperuza es, preferentemente, un análogo antiinverso de caperuza (ARCA). Sin embargo, se prefiere el uso de una reacción de TIV por separado, seguido por una protección con caperuza con un sistema enzimático de protección con caperuza, que da como resultado que aproximadamente el 100% del ARN se proteja con caperuza, sobre la protección con caperuza cotranscripcional, que normalmente da como resultado que solamente el 80% del ARN se proteja con caperuza. Por lo tanto, en algunos ejemplos preferidos, se protege con caperuza un elevado porcentaje de las moléculas de ARNm utilizadas en un procedimiento de la presente descripción (por ejemplo, se protegen más del 80%, más del 90%, más del 95%, más del 98%, más del 99%, más del 99,5% o más del 99,9% de la población de moléculas de ARNm). En algunos ejemplos preferidos, el ARNm utilizado en los procedimientos de la presente descripción tiene una caperuza con una estructura cap1, lo que significa que el 2'hidroxilo de la ribosa en el penúltimo nucleótido con respecto al nucleótido de caperuza está metilado. Sin embargo, en algunos ejemplos, el ARNm utilizado en los procedimientos tiene una caperuza con una estructura capO, lo que significa que el 2'hidroxilo de la ribosa en el penúltimo nucleótido con respecto al nucleótido de caperuza no está metilado. Con algunos, pero no todos los transcritos, la transfección de células eucariotas con ARNm que tiene una caperuza con una estructura cap1 da como resultado un nivel más alto o una mayor duración de expresión de proteína en las células transfectadas en comparación con la transfección de las mismas células con el mismo ARNm, pero con una caperuza que tiene una estructura capO. En algunos ejemplos, el ARNm utilizado en los procedimientos de la presente invención tiene un nucleótido de caperuza modificado. En algunos experimentos llevados a cabo antes de los experimentos presentados en los EJEMPLOS en el presente documento, los presentes solicitantes encontraron que, cuando se transfectaron células de fibroblastos humanos 1079 o IMR90 con ARNm OCT4 que contenían ya sea uridina o pseudouridina en lugar de uridina, el ARNm que contenía pseudouridina se tradujo a un nivel más alto o durante un periodo mayor que el ARNm que contenía uridina. Por lo tanto, en algunos ejemplos preferidos, una o más o todas las uridinas contenidas en el/los ARNm utilizado(s) en los procedimientos de la presente descripción se reemplaza/n por pseudouridina (por ejemplo, sustituyendo pseudouridina-5’-trifosfato en la reacción TIV para sintetizar el ARN en lugar de uridina-5’-trifosfato). Sin embargo, en algunos ejemplos, el ARNm utilizado en los procedimientos de la descripción contiene uridina y no contiene pseudouridina. En algunos ejemplos preferidos, el ARNm comprende preferentemente, al menos, un nucleósido modificado (por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en una pseudouridina (Ψ), 5-metilcitosina (m5C), 5-metiluridina (m5U), 2'-O-metiluridina (Um o m2'-OU), 2-tiouridina (s2U) y N6-metiladenosina (m6A)) en lugar de, al menos, una porción del nucleósido canónico no modificado correspondiente (por ejemplo, en lugar de sustancialmente todos los nucleósidos canónicos correspondientes A, C, G, o T no modificados). En algunos ejemplos preferidos, el ARNm comprende, al menos, un nucleósido modificado seleccionado del grupo que consiste en una pseudouridina (Ψ) y 5-metilcitosina (m5C). En algunos ejemplos preferidos, el ARNm comprende tanto pseudouridina (Ψ) como 5-metilcitosina (m5C). Además, para lograr objetivos específicos, una base de ácido nucleico, un resto de azúcar o un enlace internucleótido en uno o más de los nucleótidos del ARNm que se introduce en la célula eucariota en cualquiera de los procedimientos de la descripción puede comprender una base de ácido nucleico, un resto de azúcar o un enlace internucleótido modificados.
La descripción tampoco está limitada con respecto a la fuente del ARNm que se suministra en la célula eucariota en cualquiera de los procedimientos de la descripción. En algunos ejemplos, tales como los descritos en los EJEMPLOS, el ARNm se sintetiza por transcripción in vitro de un molde de ADN que comprende un gen clonado en un vector plasmídico linealizado o por transcripción in vitro de un molde de ADN que se sintetiza por PCR o RT-PCR
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igual a 50 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 100 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 150 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 200 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 300 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 400 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 500 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 600 células desdiferenciadas por 3 x 105 células de entrada (por ejemplo, iPSC) en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 700 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 800 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 900 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de este procedimiento, la eficacia de reprogramación para generar células desdiferenciadas es mayor o igual a 1000 células desdiferenciadas (por ejemplo, iPSC) por 3 x 105 células de entrada en las que se introduce el ARNm. Por lo tanto, en algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 2 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 5 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 10 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 20 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 25 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 30 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 35 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus). En algunos ejemplos preferidos, este procedimiento fue más de 40 veces más eficaz que el protocolo publicado que comprende la administración de factores de reprogramación con un vector viral (por ejemplo, un vector de lentivirus).
La presente descripción adicionalmente proporciona composiciones (sistemas, kits, mezclas de reacción, células, ARNm) utilizadas o útiles en los procedimientos y/o generadas por los procedimientos descritos en el presente documento. Por ejemplo, la presente descripción proporciona un ARNm que codifica un factor de inducción de células iPS, teniendo el ARNm pseudouridina en lugar de uridina.
La presente descripción proporciona adicionalmente composiciones que comprenden un reactivo de transfección y un ARNm que codifica un factor de inducción de células iPS (por ejemplo, una mezcla de reactivo de transfección y ARNm). En algunos ejemplos, las composiciones comprenden ARNm que codifica una pluralidad (por ejemplo, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más o 6) de factores de inducción de células iPS, incluyendo, pero sin limitación, KLF4, LIN28, C-MYC, NANOG, OCT4 y SOX2.
Las composiciones pueden comprender adicionalmente cualquier otro reactivo o componente suficiente, necesario o útil para poner en práctica cualquiera de los procedimientos descritos en el presente documento. Tales reactivos o componentes incluyen, aunque sin limitación, reactivos de transfección, medio de cultivo (por ejemplo, medio condicionado por MEF), células (por ejemplo, células somáticas, células iPS), recipientes, cajas, tampones, inhibidores (por ejemplo, inhibidores de RNasa, marcadores (por ejemplo, fluorescentes, luminiscentes, radioactivos, etc.), moléculas de control positivo y/o negativo, reactivos para generar ARNm protegido, hielo seco y otros refrigerantes, instrucciones para su uso, equipo de cultivo celular, equipo de detección/análisis y similares.
Esta descripción proporciona moléculas de ARN, oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que comprenden pseudouridina o un nucleósido modificado, vectores de terapia génica que comprenden los mismos, procedimientos de terapia génica y procedimientos de silenciamiento de la transcripción génica que comprenden los mismos, procedimientos para reducir la inmunogenicidad de los mismos y procedimientos para sintetizarlos.
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En un ejemplo, la presente descripción proporciona un ARN mensajero que comprende un resto de pseudouridina. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN que codifica una proteína de interés, comprendiendo dicha molécula de ARN un resto de pseudouridina. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN transcrita in vitro, que comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un oligorribonucleótido sintetizado in vitro, que comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado, en el que el nucleósido modificado es m5C, m5U, m6A, s2U, Ψ o 2'-Ometil-U. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un vector de terapia génica, que comprende una molécula de polirribonucleótido sintetizado in vitro, en el que la molécula de polirribonucleótido comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN bicatenario (ARNbc) que contiene, como parte de su secuencia, una pseudouridina o un nucleósido modificado y que comprende adicionalmente un ARNip o un ARNhc. En otro ejemplo, la molécula de ARNbc es mayor de 50 nucleótidos de longitud. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para inducir a una célula de mamífero para producir una proteína recombinante, que comprende poner en contacto la célula de mamífero con una molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica la proteína recombinante, comprendiendo la molécula de ARN sintetizada in vitro una pseudouridina o un nucleósido modificado, induciendo, de este modo, a la célula de mamífero para producir la proteína recombinante.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar anemia en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro eritropoyetina, tratándose, de este modo, la anemia en un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar un vasoespasmo en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), tratándose, de este modo, un vasoespasmo en un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para incrementar la tasa de supervivencia de una célula en un sujeto, que comprende poner en contacto la célula con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro una proteína de choque térmico, mejorando, de este modo, la tasa de supervivencia de una célula en un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para disminuir la incidencia de una reestenosis de un vaso sanguíneo después de un procedimiento que agranda el vaso sanguíneo, que comprende poner en contacto una célula de un vaso sanguíneo con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro una proteína de choque térmico, disminuyendo, de este modo, una incidencia de una reestenosis en un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para aumentar el crecimiento de un cabello a partir de un folículo capilar en el cuero cabelludo de un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del cuero cabelludo con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro una telomerasa o una proteína inmunosupresora, incrementando, de este modo, el crecimiento de cabello a partir de un folículo capilar.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento de inducción de la expresión de una enzima con actividad antioxidante en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro la enzima, induciendo, de este modo, la expresión de una enzima con actividad antioxidante en una célula.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar la fibrosis quística en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro el Regulador de Conductancia Transmembrana de Fibrosis Quística (CFTR), tratándose, de este modo, la fibrosis quística en un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro una tirosina quinasa de Bruton, tratándose, de este modo, la agammaglobulinemia ligada al cromosoma X.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar una inmunodeficiencia combinada grave por déficit de adenosina desaminasa (ADA IDCS) en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro una ADA, tratándose, de este modo, una ADA IDCS.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para producir una proteína recombinante, que
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pero también contiene contaminantes. Esto se visualiza por la aplicación de ARN a una columna de HPLC de fase inversa que separa el ARN en función del tamaño en condiciones de desnaturalización. Se aplicó ARN TEVluciferasa-A51 modificado con Ψ a una columna de HPLC en tampón B al 38% y se sometió a un gradiente lineal creciente de tampón B hasta el 55%. El perfil demostró contaminantes tanto más pequeños de lo esperado como más grandes de lo esperado. La figura 23 muestra los resultados del Ejemplo 37: (A) Se suministró ARNm que codifica EPO con las modificaciones indicadas y con o sin purificación por HPLC a CD murinas y los niveles de EPO en el sobrenadante se midieron 24 horas más tarde. Mientras que el ARNm modificado con m5C/Ψ tenía el mayor nivel de traducción antes de la purificación por HPLC, el ARNm modificado con Ψ tuvo la mayor traducción después de la purificación por HPLC. (B) Las CD Humanas se transfectaron con ARNm que codifica renilla con las modificaciones indicadas con o sin purificación por HPLC. La figura 24 muestra los resultados del Ejemplo 38: (A) Las CD Humanas se transfectaron con ARN complejado con TransIT con las modificaciones indicadas con o sin purificación por HPLC. Los niveles de IFN-α se midieron después de 24 horas. La purificación por HPLC aumentó la inmunogenicidad de ARN no modificado, que es dependiente de la secuencia, ya que otros ARN no modificados tenían niveles similares de IFN-α o niveles reducidos después de la purificación por HPLC. El ARN modificado por Ψ tenía niveles no medibles de IFN-α, similares a los de las CD tratadas de control. (B) El ARN modificado con Ψ antes (-) y después de purificación por HPLC (P1 y P2) se analizó para ARNbc utilizando transferencia puntual con un anticuerpo monoclonal específico para ARNbc (J2). La purificación de ARN eliminó la contaminación por ARNbc. (C) El ARN modificado por Ψ que codifica factores iPS es inmunogénico, que se elimina por purificación del ARN por HPLC. La figura 25 proporciona la secuencia codificante de ARNm para KLF4 (SEQ ID NO:12) y LIN28 (SEQ ID NO: 13). La figura 26 proporciona la secuencia codificante de ARNm para cMYC (SEQ ID NO:14) y NANOG (SEQ ID NO:15). La figura 27 proporciona la secuencia codificante de ARNm para OCT4 (SEQ ID NO:16) y SOX2 (SEQ ID NO: 17). La figura 28 muestra que el ARNm que codifica factores de reprogramación humanos (KLF4, c-MYC, OCT4 e SOX2) produce células iPS en células primarias de queratinocitos humanos. La figura 28 muestra imágenes de contraste de fase de células HEKn a los 2 días (A) y a los 11 días (B) de formación de la colonia de iPS y a los 20 días (C) después de la transfección final con ARNm que codifica 4 factores de reprogramación. Las imágenes tienen un aumento de 10x. La figura 29 muestra que el ARNm que codifica factores de reprogramación humanos (KLF4, LIN28, c-MYC, NANOG, OCT4 y SOX2) produce células iPS en queratinocitos humanos que son positivos para marcadores de células iPS conocidos. La figura 29 muestra imágenes de contraste de fase de colonias derivadas de células HEKn (A, D y G). La misma colonia de iPS que se muestra en (A) es positiva tanto para KLF4 (B) como para LIN28 (C). La colonia que se muestra en (D) es positiva para SSEA4 (E) y positiva para TRA-1-60 (F). La colonia de iPS que se muestra en (A) es positiva para NANOG (H). Todas las imágenes tienen un aumento de 20x. La figura 30 muestra aumentos en la expresión de 3 mensajes asociados a iPS en células HEK transfectadas con 4 ARNm de reprogramación (KLF4, c-MYC, OCT4 y SOX2) que no incluían el factor de reprogramación NANOG. La expresión aumentada de los mensajes se detectó por qPCR y se normaliza a la expresión de GAPDH. El nivel de expresión de cada mensaje se representa en relación con el nivel encontrado en la línea celular original.
Definiciones
La presente invención se entenderá e interpretará basándose en los términos que se definen a continuación.
Como se usa en el presente documento “sustancialmente todos”, en referencia a ARNm monocatenarios completos que comprenden un resto de pseudouridina o 5-metilcitidina, significa que, de todos los ARNm monocatenarios completos presentes en una muestra, al menos el 95% tiene un resto de pseudouridina o de 5-metilcitidina.
Como se usa en el presente documento “sustancialmente todos”, en referencia a ARNm monocatenarios completos que comprenden un resto de pseudouridina o 5-metilcitidina, significa que, de todos los ARNm monocatenarios completos presentes en una muestra, al menos el 99% tiene un resto de pseudouridina o de 5-metilcitidina.
Como se usa en el presente documento “moléculas contaminantes de ARN” son moléculas que comprenden restos de ARN y que pueden activar, al menos parcialmente, una respuesta inmunitaria cuando se transfectan en una célula (por ejemplo, por la activación de sensores tales como proteína quinasa dependiente de ARN (PKR), gen-I inducible por ácido retinoico (RIG-I), receptor de tipo Toll (TLR)3, TLR7, TLR8, y oligoadenilato sintetasa (OAS), o moléculas de ARN que pueden activar, al menos parcialmente, una respuesta de interferencia de ARN (ARNi) (por ejemplo, incluida una respuesta a moléculas grandes de ARN bicatenario o a moléculas pequeñas de ARN bicatenario (ARNip)) en la célula. Las moléculas contaminantes de ARN ejemplares incluyen, pero sin limitación: ARNm de longitud parcial o no completa que codifican solamente una porción de un factor de reprogramación (por ejemplo, un factor de inducción de células iPS de longitud no completa); ARNm monocatenarios que son mayores que el ARNm de longitud completa que codifica un factor de reprogramación (por ejemplo, un factor de inducción de células iPS), por ejemplo, sin pretender quedar vinculados a teoría alguna, por “IVT continua” u otros mecanismos; moléculas de ARNm bicatenario grandes o pequeñas; y moléculas de ARNm sin caperuza.
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protegido con caperuza por m7G" tiene una estructura designada m7G(5')ppp(5')N1(pN)xOH(3') o, más simplemente, m7GpppN1(pN)x o m7G[5'] ppp[5']N, en el que m7G representa el nucleósido de caperuza 7-metilguanosina, ppp representa el puente trifosfato entre los carbonos 5' del nucleósido de caperuza y el primer nucleótido del transcrito de ARN primario, N1(PN)x-OH(3') representa el transcrito de ARN primario, de los cuales N1es el nucleótido más 5', "p" representa un grupo fosfato, "G" representa un nucleósido de guanosina, "m7" representa el grupo metilo en la posición 7 de guanina y "[5']" indica la posición en la que el "p" se une a la ribosa del nucleótido de caperuza y al primer nucleósido del transcrito de ARNm (" N"). Además de esta "caperuza patrón", una variedad de otros análogos de caperuza de origen natural y sintético son conocidos en la técnica. El ARN que tiene cualquier nucleótido de caperuza se conoce como "ARN protegido con caperuza." El ARN protegido con caperuza puede ser de origen natural de una muestra biológica o se puede obtener por protección con caperuza in vitro de ARN que tiene un grupo 5’ trifosfato o de ARN que tiene un grupo 5’ difosfato con un sistema enzimático de protección con caperuza (por ejemplo, sistema enzimático de protección con caperuza de vaccinia o sistema de enzima de protección con caperuza de Saccharomyces cerevisiae). Como alternativa, el ARN protegido con caperuza puede obtenerse por transcripción in vitro (IVT) de un molde de ADN que contiene un promotor de ARN polimerasa, en el que, además del GTP, la reacción IVT también contiene un dinucleótido análogo de caperuza (por ejemplo, un análogo de caperuza m7GpppG o un análogo de caperuza N7-metil, 2'-O-metil-GpppG ARCA o un análogo de caperuza N7-metil, 3'-O-metil-GpppG ARCA) utilizando procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, usando un kit de protección con caperuza AMPLICAP ™ T7 o un kit de transcripción MESSAGEMAX ™ T7 ARCA-CAPPED MESSAGE, EPICENTRE o CellScript).
La protección con caperuza de un transcrito de ARNm primario 5'-trifosforilado in vivo (o usando un sistema enzimático de protección con caperuza in vitro) se produce a través de varios pasos enzimáticos (Higman y col., 1992, Martin y col., 1975, Myette y Niles 1996).
Las siguientes reacciones enzimáticas están involucradas en la protección con caperuza de ARNm eucariota:
(1) La ARN trifosfatasa escinde el 5'-trifosfato de ARNm a un difosfato,
PPPN1(P)Nx-OH(3') → PPN1(PN)x-OH(3') + Pi;
y a continuación
(2) la ARN guaniltransferasa cataliza la unión de GTP al 5’-difosfato de la mayoría de los nucleótidos 5’ (N1) del ARNm,
PpN1(PN)x-OH(3') + GTP → G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + PPi;
y, por último,
(3) la guanina-7-metiltransferasa, utilizando S-adenosil-metionina (AdoMet) como un co-factor, cataliza la metilación del nitrógeno 7 de guanina en el nucleótido de caperuza,
G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoMet → m7G(5')ppp(5')N1(pN)x-OH(3') + AdoHyc.
El ARN que resulta de la acción de la ARN trifosfatasa y de las actividades enzimáticas de la ARN guaniltransferasa, así como el ARN que se metila adicionalmente por la actividad enzimática de la guanina-7metiltransferasa, se conoce en el presente documento como "ARN protegido con caperuza 5'" o "ARN protegido con caperuza" y un "sistema enzimático de protección con caperuza" o, más simplemente, una “enzima de protección con caperuza” en el presente documento significa cualquier combinación de uno o más polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas que dan como resultado "ARN protegido con caperuza." Los sistemas enzimáticos de protección con caperuza, incluidas las formas clonadas de dichas enzimas, se han identificado y purificado a partir de muchas fuentes y se conocen bien en la materia. (Banerjee 1980, Higman y col. 1992, Higman y col. 1994, Myette y Niles 1996, Shuman 1995, Shuman 2001, Shuman y col. 1980, Wang y col., 1997). Cualquier sistema enzimático de protección con caperuza que puede convertir ARN no protegido con caperuza que tiene un 5' polifosfato en ARN protegido con caperuza se puede utilizar para proporcionar un ARN protegido con caperuza para cualquiera de las realizaciones de la presente invención. En algunos ejemplos, el sistema enzimático de protección con caperuza es un sistema enzimático de protección con caperuza de poxvirus. En algunos ejemplos preferidos, el sistema enzimático de protección con caperuza es una enzima de protección con caperuza de virus vaccinia. En algunos ejemplos, el sistema enzimático de protección con caperuza es una enzima de protección con caperuza de Saccharomyces cerevisiae. También, en vista del hecho de que los genes que codifican ARN trifosfatasa, ARN guaniltransferasa y guanina-7-metiltransferasa a partir de una fuente pueden complementar deleciones en uno o todos estos genes de otra fuente, el sistema enzimático de protección con caperuza puede originarse a partir de una fuente, o una o más de las actividades de ARN trifosfatasa, ARN guaniltransferasa y/o guanina-7-metiltransferasa pueden comprender un polipéptido de una fuente diferente.
Un "nucleótido de caperuza modificado" de la presente descripción significa un nucleótido de caperuza en el que el azúcar, la base de ácido nucleico o el enlace internucleósido está químicamente modificado en comparación con el correspondiente nucleótido de caperuza canónico 7-metilguanosina. Los ejemplos de un nucleótido de caperuza modificado incluyen nucleótidos de caperuza que comprenden: (i) un 2'-o 3'-desoxiguanosina-5'-trifosfato modificado
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se introduce en la célula, generando de este modo una célula que muestra un estado cambiado de diferenciación en comparación con la célula en la que se introdujo el ARNm. En algunos ejemplos preferidos de los procedimientos de la presente descripción, el factor de reprogramación es un factor de transcripción. Un ejemplo de factor de reprogramación utilizado en un procedimiento de la presente descripción es un "factor de inducción de células iPS."
Un "factor de inducción de células iPS" o "factor de inducción de iPSC” es una proteína, polipéptido u otra biomolécula que, cuando se usa solo o en combinación con otros factores de reprogramación, produce la generación de células iPS a partir de células somáticas. Ejemplos de factores de inducción de células iPS incluyen OCT4, SOX2, c-MYC, KLF4, NANOG y LIN28. Los factores de inducción de células iPS incluyen secuencias de polipéptidos de longitud completa o fragmentos biológicamente activos de los mismos. Del mismo modo, un ARNm que codifica un factor de inducción de células iPS puede codificar un polipéptido de longitud completa o fragmentos biológicamente activos del mismo. La secuencia codificante de ARNm para factores de inducción de iPS ejemplares se muestran en las Figuras 25 (KLF4 y LIN28), 26 (cMYC y NANOG) y 27 (OCT4 y SOX2). En ciertos ejemplos, se emplean las secuencias o secuencias similares que se muestran en estas figuras, incluidas las moléculas de ARNm que comprenden adicionalmente, unidos a estas secuencias de ARNm, oligorribonucleótidos que presentan cualquiera de las secuencias UTR 5’ o 3’, secuencias de Kozak, secuencias IRES, nucleótidos de caperuza y/o secuencias de poli(A) usadas en los experimentos descritos en el presente documento o que son comúnmente conocidos en la técnica y que se pueden utilizar en lugar de los usados en el presente documento uniéndolos con estas secuencias de ARNm que codifican proteínas con el fin de optimizar la traducción de las respectivas moléculas de ARNm en las células y mejorar su estabilidad en la célula para lograr los procedimientos descritos en el presente documento.
"Diferenciación" o "diferenciación celular" significa el proceso biológico que ocurre de forma natural por el que una célula que presenta un estado de diferenciación o un tipo celular menos especializado (por ejemplo, un óvulo fertilizado, una célula de un embrión o una célula en un organismo eucariota) da lugar a una célula que presenta un estado de diferenciación o tipo celular más especializado. Los científicos, incluidos biólogos, biólogos celulares, inmunólogos y embriólogos, utilizan una variedad de procedimientos y criterios para definir, describir o caracterizar diferentes células según su “tipo celular”, “estado diferenciado” o “estado de diferenciación.” En general, una célula se define, describe o categoriza respecto a su “tipo celular”, “estado diferenciado” o “estado de diferenciación” en función de uno o más fenotipos presentados por esa célula, pudiendo incluir dichos fenotipos la forma, una actividad
o función bioquímica o metabólica, la presencia de ciertas biomoléculas en la célula (por ejemplo, basándose en manchas que reaccionan con biomoléculas específicas), o en la célula (por ejemplo, basándose en la unión de uno o más anticuerpos que reaccionan con biomoléculas específicas en la superficie celular). Por ejemplo, diferentes tipos de células se pueden identificar y clasificar utilizando un clasificador de células o un instrumento clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS). La "diferenciación" o "diferenciación celular” se puede producir también en células en cultivo.
El término "reprogramación" como se usa en el presente documento, significa diferenciación o diferenciación celular que se produce como respuesta al suministro de uno o más factores de reprogramación en la célula, directamente (por ejemplo, por suministro de factores de reprogramación de proteínas o polipéptidos en la célula) o indirectamente (por ejemplo, por suministro de la preparación de ARN purificado de la presente invención que comprende una o más moléculas de ARNm, cada una de las cuales codifica un factor de reprogramación) y manteniendo las células en condiciones (por ejemplo, medio, temperatura, niveles de oxígeno y CO2, matriz y otras condiciones ambientales) que sean propicias para la diferenciación. El término "reprogramación" como se usa en el presente documento, no pretende significar o referirse a una dirección específica o ruta de diferenciación (por ejemplo, de un tipo celular menos especializado a un tipo celular más especializado) y no excluye procesos que proceden en una dirección o ruta de diferenciación de lo que normalmente se observa en la naturaleza. Por lo tanto, en diferentes ejemplos de la presente descripción, "reprogramación” significa e incluye todos y cada uno de los siguientes:
(1)
"Desdiferenciación", que significa un proceso de una célula o tipo celular que presenta un estado de diferenciación más especializado (por ejemplo, un fibroblasto de mamífero, un queratinocito, una célula muscular
o una célula neuronal) que va a una célula que presenta un estado de diferenciación o tipo celular menos especializado (por ejemplo, una célula iPS);
(2)
"Transdiferenciación", que significa un proceso de una célula o tipo celular que presenta un estado de diferenciación más especializado (por ejemplo, un fibroblasto de mamífero, un queratinocito o una célula neuronal) que va a otro estado de diferenciación o a otro tipo celular más especializado (por ejemplo, de un fibroblasto o queratinocito a una célula muscular); y
(3)
"Rediferenciación" o "Diferenciación Esperada" o “Diferenciación Natural”, que significa un proceso de una célula que presenta cualquier estado de diferenciación o tipo celular particular que va a otro estado de diferenciación u otro tipo celular como se esperaría en la naturaleza si la célula estuviera presente en su lugar o entorno natural (por ejemplo, en un embrión o un organismo), donde dicho proceso se produce in vivo en el organismo o en cultivo (por ejemplo, en respuesta a uno o más factores de reprogramación).
Descripción de la invención
La invención se expone en las reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones de la descripción que no entran dentro del ámbito de dichas reivindicaciones se proporcionan solo con fines ilustrativos y no forman parte de la presente
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ARNm con una enzima que actúa específicamente (por ejemplo, digiere) uno o más ARN contaminantes o ácidos nucleicos contaminantes (por ejemplo, incluyendo ADN), pero que no actúa sobre (por ejemplo, no digiere) el ARNm deseado. Por ejemplo, el ARNm utilizado en las composiciones y procedimientos de la presente descripción puede purificarse utilizando un proceso que comprende tratar el ARNm con una enzima ribonucleasa III (RNasa III) (por ejemplo, RNasa III de E. coli) y el ARNm se purifica a continuación de los productos de digestión de la RNasa III. Una enzima ribonucleasa III (RNasa III) en el presente documento significa una enzima que digiere ARN bicatenario mayor que aproximadamente doce pares de bases para reforzar fragmentos de ARN bicatenario. En algunos ejemplos, el ARNm utilizado en las composiciones y procedimientos de la presente descripción se purifica utilizando un proceso que comprende tratar el ARNm con una o más enzimas que digieren específicamente uno o más ARN contaminantes o ácidos nucleicos contaminantes (por ejemplo, incluyendo ADN).
Esta descripción proporciona moléculas de ARN, oligorribonucleótidos y polirribonucleótidos que comprenden pseudouridina o un nucleósido modificado, vectores de terapia génica que comprenden los mismos, procedimientos de terapia génica y procedimientos de silenciamiento de la transcripción génica que comprenden los mismos, procedimientos para reducir la inmunogenicidad de los mismos y procedimientos para sintetizarlos. Estas secuencias modificadas están presentes preferentemente en las preparaciones de ARN purificadas descritas en el presente documento.
En un ejemplo, la presente descripción proporciona un ARN mensajero que comprende un resto de pseudouridina. En otro ejemplo, el ARN mensajero codifica una proteína de interés. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN que codifica una proteína de interés, comprendiendo dicha molécula de ARN un resto de pseudouridina. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN transcrita in vitro, que comprende una pseudouridina. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN transcrita in vitro, que comprende un nucleósido modificado.
Como se proporciona en el presente documento, la presente descripción proporciona procedimientos para sintetizar moléculas de ARN transcrito in vitro, que comprenden pseudouridina y/o nucleósidos modificados. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un ARN mensajero que comprende un resto de pseudouridina.
En otro ejemplo, una molécula de ARN transcrita in vitro de los procedimientos y composiciones de la presente descripción se sintetiza por ARN polimerasa del fago T7. En otro ejemplo, la molécula se sintetiza por ARN polimerasa del fago SP6. En otro ejemplo, la molécula se sintetiza por ARN polimerasa del fago T3. En otro ejemplo, la molécula se sintetiza por una polimerasa seleccionada entre las polimerasas anteriores. En otro ejemplo, la molécula de ARN transcrita in vitro es un oligorribonucleótido. En otro ejemplo, la molécula de ARN transcrita in vitro es un polirribonucleótido. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un oligorribonucleótido sintetizado in vitro, que comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado, en el que el nucleósido modificado es m5C, m5U, m6A, s2U, Ψ, o 2'-Ometil-U. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un polirribonucleótido sintetizado in vitro, que comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado, en el que el nucleósido modificado es m5C, m5U, m6A, s2U, Ψ, o 2'-O-metil-U.
En otro ejemplo, el oligorribonucleótido o polirribonucleótido sintetizado in vitro es un ARN de horquilla corta (hc). En otro ejemplo, el oligorribonucleótido sintetizado in vitro es un ARN de interferencia pequeño (ARNip). En otro ejemplo, el oligorribonucleótido sintetizado in vitro es cualquier otro tipo de oligorribonucleótido conocido en la técnica. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción comprende adicionalmente un marco de lectura abierto que codifica una proteína funcional. En otro ejemplo, la molécula de ARN o molécula de oligorribonucleótido funciona sin codificar una proteína funcional (por ejemplo, en silenciamiento transcripcional), como una ARNzima, etc. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido comprende adicionalmente una cola de poliA. En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido no comprende una cola de poliA. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido comprende adicionalmente una caperuza m7GpppG. En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido no comprende una caperuza m7GpppG. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido comprende adicionalmente un potenciador de la traducción independiente de caperuza. En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido no comprende un potenciador de la traducción independiente de caperuza. En otro ejemplo, el potenciador de la traducción independiente de caperuza es un potenciador de la traducción independiente de caperuza del virus del grabado de tabaco (TEV). En otro ejemplo, el potenciador de la traducción independiente de caperuza es cualquier otro potenciador de la traducción independiente de caperuza conocido en la técnica. Cada
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posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un vector de terapia génica, que comprende una molécula de polirribonucleótido sintetizado in vitro, en el que la molécula de polirribonucleótido comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado.
En otro ejemplo, una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción comprende una pseudouridina. En otro ejemplo, la molécula de ARN o molécula de oligorribonucleótido comprende un nucleósido modificado. En otro ejemplo, la molécula de ARN o molécula de oligorribonucleótido es una molécula de ARN u oligorribonucleótido sintetizado in vitro. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
"Pseudouridina" se refiere, en otro ejemplo, a m1acp3Ψ (1-metil-3-(3-amino-3-carboxipropil)pseudouridina. En otro ejemplo, el término se refiere a m1Ψ (1-metilpseudouridina). En otro ejemplo, el término se refiere a Ψm (2'-Ometilpseudouridina. En otro ejemplo, el término se refiere a m5D (5-metildihidrouridina). En otro ejemplo, el término se refiere a m3Ψ (3-metilpseudouridina). En otro ejemplo, el término se refiere a un resto de pseudouridina que no está modificado adicionalmente. En otro ejemplo, el término se refiere a un monofosfato, difosfato o trifosfato de cualquiera de las pseudouridinas anteriores. En otro ejemplo, el término se refiere a cualquier otra pseudouridina conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción es un oligorribonucleótido terapéutico.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para administrar una proteína recombinante a un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de poner en contacto el sujeto con una molécula de ARN, oligorribonucleótido, polirribonucleótido o vector de terapia génica de la presente invención, proporcionando de este modo una proteína recombinante a un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona una molécula de ARN bicatenario que comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado y que comprende adicionalmente un ARNip o ARN de horquilla corta (ARNhc). En otro ejemplo, la molécula de ARNbc es mayor de 50 nucleótidos de longitud. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la pseudouridina o un nucleósido modificado está dentro de la secuencia del ARNip. En otro ejemplo, la pseudouridina o un nucleósido modificado esta fuera de la secuencia del ARNip. En otro ejemplo, 1 o más restos de pseudouridina y/o nucleósido modificado están presentes tanto dentro como fuera de la secuencia de ARNip. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, el ARNip o ARNhc está contenido internamente en la molécula del ARNbc. En otro ejemplo, el ARNip o ARNhc está contenido en un extremo de la molécula del ARNbc. En otro ejemplo, uno o más ARNip o ARNhc están contenidos en un extremo de la molécula del ARNbc, mientras que uno o más están contenidos internamente. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la longitud de una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido (por ejemplo, una molécula de ARN monocatenario (ARNmc) o una molécula de ARNbc) de los procedimientos y composiciones de la presente descripción es mayor de 30 nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la molécula de ARN u oligorribonucleótido es mayor de 35 nucleótidos de longitud. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 40 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 45 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 55 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 60 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 60 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 80 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 90 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 100 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 120 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 140 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 160 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 180 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 200 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 250 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 300 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 350 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 400 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 450 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 500 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 600 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 700 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 800 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 900 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1000 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1100 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1200 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1300 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1400 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1500 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1600 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 1800 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 2000 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 2500 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 3000 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 4000 nucleótidos. En otro ejemplo, la longitud es de, al menos, 5000 nucleótidos. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
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En otro ejemplo, una molécula de ARNbc de los procedimientos y composiciones de la presente descripción se fabrica por transcripción in vitro. En otro ejemplo, la etapa de transcripción in vitro utiliza ARN polimerasa del fago T7. En otro ejemplo, la transcripción in vitro utiliza ARN polimerasa del fago SP6. En otro ejemplo, la transcripción in vitro utiliza ARN polimerasa del fago T3. En otro ejemplo, la transcripción in vitro utiliza una ARN polimerasa seleccionada entre las polimerasas anteriores. En otro ejemplo, la transcripción in vitro utiliza cualquier otra ARN polimerasa conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la molécula de ARNbc puede procesarse por una enzima celular para producir el ARNip o ARNhc. En otro ejemplo, la enzima celular es una endonucleasa. En otro ejemplo, la enzima celular es Dicer. Dicer es una nucleasa de la familia RNasa III que comienza la interferencia de ARN (ARNi) y fenómenos relacionados por generación de los ARN pequeños que determinan la especificidad de estas vías de silenciamiento de genes (Bernstein E, Caudy AA y col., Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001; 409(6818): 363-6). En otro ejemplo, la enzima celular es cualquier otra enzima celular conocida en la técnica que es capaz de escindir una molécula de ARNbc. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la molécula de ARNbc contiene dos ARNip o ARNhc. En otro ejemplo, la molécula de ARNbc contiene tres ARNip o ARNhc. En otro ejemplo, la molécula de ARNbc contiene más de tres ARNip o ARNhc. En otro ejemplo, El ARNip y/o el ARNhc se liberan de la molécula de ARNbc por una enzima celular. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para administrar un ARNip o ARNhc a una célula, que comprende administrar una molécula de ARNbc de la presente descripción, en el que la célula procesa la molécula de ARNbc para producir el ARNip o ARNhc, administrando de este modo un ARNip o ARNhc a la célula.
En otro ejemplo, el nucleósido que está modificado en una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción es uridina (U). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es citidina (C). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es adenosina (A). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es guanosina (G). Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, el nucleósido modificado de los procedimientos y composiciones de la presente descripción es m5C (5-metilcitidina). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es m5U (5-metiluridina). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es m6A (N6-metiladenosina). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es S2U (2-tiouridina). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es Ψ (pseudouridina). En otro ejemplo, el nucleósido modificado es Um (2'-Ometiluridina).
En otros ejemplos, el nucleósido modificado es m1A 1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am(2'-Ometiladenosina); ms2mGA (2-metiltio-N6-metiladenosina); iGA(~isopenteniladenosina); mszi6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina); io6A (N6-(cis-hidroxiisopentenil)adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-(Cishidroxiisopentenil)adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonilcarbamoiladenosina); ms2t6A (2metiltio-N6-treonilcarbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A(N6hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalilcarbamoiladenosina); Ar(p) (2'-Oribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); m1l (1-metiltiosina); m1Im (1,2'-O-dimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2'O-metilcitidina); S2C (2tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-formilcitidina); m5Cm (5,2'-O-dimetilcitidina); ac4Cm (N4-acetil-2'-O-metilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1-metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7metilguanosina); Gm(2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-O-ribosilguanosina (fosfato)); yW (wibutosina); o2yW (peroxiwibutosina); OHyW (hidroxiwibutosina); OHyW* (hidroxiwibutosina no modificada); imG (wiosina); mimG (metilwiosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galactosil-queuosina); manQ (manosilqueuosina); preQo (7-ciano-7-desazaguanosina); PreQ1 (7-ammometil-7-desazaguanosina); G+ (archaeosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); S4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); S2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridina 5-oxiacético); mcmo5U (éster metílico de ácido uridina 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (5(carboxihidroximetil)uridina metil éster); mcm5U (5-metoxicarbonilmetiluridina); mcm5Um (5-metoxicarbonilmetil-2'O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxiarbonilmetil-2-tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnmse2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetiluridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil-2'-O-metiluridina); Cmnm5U (5carboximetilaminometiluridina); cmnm5Um (5-carboximetilaminometil-2'-metiluridina); cmnm5S2U (5carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Im (2'-O-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2'-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3-metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina);
m2,2,7G
m6Am (N6,2'-O-dimetiladenosina); m62Am (N6,N6,2'-O-trimetiladenosina); m2,7G(N2,7-dimetilguanosina); (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2'-O-dimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-Ometilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m1 Am (1,2'-O-dimetiladenosina); τm5U (5-taurinometiluridina); τm5s2U (5-taurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-dimetilwiosina); imG2 (isowiosina); o ac6A (N6-acetiladenosina). Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
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En otro ejemplo, una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción comprende una combinación de 2 o más de las modificaciones anteriores. En otro ejemplo, la molécula de ARN o molécula de oligorribonucleótido comprende una combinación de 3 o más de las modificaciones anteriores. En otro ejemplo, la molécula de ARN o molécula de oligorribonucleótido comprende una combinación de más de 3 de las modificaciones anteriores. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, entre el 0,1% y el 100% de los restos en la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción está modificado (por ejemplo, ya sea por la presencia de pseudouridina o una base de nucleósido modificada). En otro ejemplo, el 0,1% de los restos están modificados. En otro ejemplo, el 0,2%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,3%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,4%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,5%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,6%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,8%. En otro ejemplo, la fracción es el 1 %. En otro ejemplo, la fracción es el 1,5%. En otro ejemplo, la fracción es el 2%. En otro ejemplo, la fracción es el 2,5%. En otro ejemplo, la fracción es el 3%. En otro ejemplo, la fracción es el 4%. En otro ejemplo, la fracción es el 5%. En otro ejemplo, la fracción es el 6%. En otro ejemplo, la fracción es el 8%. En otro ejemplo, la fracción es el 10%. En otro ejemplo, la fracción es el 12%. En otro ejemplo, la fracción es el 14%. En otro ejemplo, la fracción es el 16%. En otro ejemplo, la fracción es el 18%. En otro ejemplo, la fracción es el 20%. En otro ejemplo, la fracción es el 25%. En otro ejemplo, la fracción es el 30%. En otro ejemplo, la fracción es el 35%. En otro ejemplo, la fracción es el 40%. En otro ejemplo, la fracción es el 45%. En otro ejemplo, la fracción es el 50%. En otro ejemplo, la fracción es el 60%. En otro ejemplo, la fracción es el 70%. En otro ejemplo, la fracción es el 80%. En otro ejemplo, la fracción es el 90%. En otro ejemplo, la fracción es el 100%.
En otro ejemplo, la fracción es menos del 5%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 3%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 1 %. En otro ejemplo, la fracción es menos del 2%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 4%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 6%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 8%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 10%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 12%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 15%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 20%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 30%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 40%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 50%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 60%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 70%.
En otro ejemplo, el 0,1% de los restos de un nucleótido dado (uridina, citidina, guanosina o adenina) están modificados. En otro ejemplo, la fracción del nucleótido es el 0,2%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,3%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,4%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,5%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,6%. En otro ejemplo, la fracción es el 0,8%. En otro ejemplo, la fracción es el 1 %. En otro ejemplo, la fracción es el 1,5%. En otro ejemplo, la fracción es el 2%. En otro ejemplo, la fracción es el 2,5%. En otro ejemplo, la fracción es el 3%. En otro ejemplo, la fracción es el 4%. En otro ejemplo, la fracción es el 5%. En otro ejemplo, la fracción es el 6%. En otro ejemplo, la fracción es el 8%. En otro ejemplo, la fracción es el 10%. En otro ejemplo, la fracción es el 12%. En otro ejemplo, la fracción es el 14%. En otro ejemplo, la fracción es el 16%. En otro ejemplo, la fracción es el 18%. En otro ejemplo, la fracción es el 20%. En otro ejemplo, la fracción es el 25%. En otro ejemplo, la fracción es el 30%. En otro ejemplo, la fracción es el 35%. En otro ejemplo, la fracción es el 40%. En otro ejemplo, la fracción es el 45%. En otro ejemplo, la fracción es el 50%. En otro ejemplo, la fracción es el 60%. En otro ejemplo, la fracción es el 70%. En otro ejemplo, la fracción es el 80%. En otro ejemplo, la fracción es el 90%. En otro ejemplo, la fracción es el 100%.
En otro ejemplo, la fracción del nucleótido dado es menos del 8%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 10%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 5%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 3%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 1 %. En otro ejemplo, la fracción es menos del 2%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 4%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 6%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 12%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 15%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 20%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 30%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 40%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 50%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 60%. En otro ejemplo, la fracción es menos del 70%.
En otro ejemplo, Los términos "ribonucleótido", "oligorribonucleótido" y "polirribonucleótido" se refieren a una cadena de, al menos, 2 combinaciones de base-azúcar-fosfato. El término incluye, en otro ejemplo, compuestos que comprenden nucleótidos en los que el resto de azúcar es ribosa. En otro ejemplo, el término incluye tanto ARN como derivados de ARN en los que la cadena principal está modificada. "Nucleótidos se refiere, en otro ejemplo, a las unidades monoméricas de polímeros de ácido nucleico. El ARN puede estar, en otro ejemplo, en forma de un ARNt (ARN transferente), ARNnp (ARN nuclear pequeño), ARNr (ARN ribosómico), ARNm (ARN mensajero), ARN no codificante, ARN de interferencia pequeño (ARNip), micro ARN (ARNmi) y ribozimas. Se ha descrito el uso de ARNip y ARNmi ((Caudy AA y col., Genes & Devel 16: 2491-96) y las referencias se citan este documento. Además, estas formas de ARN pueden ser de cadena sencilla, doble, triple o cuádruple. El término también incluye, en otra realización, ácidos nucleicos artificiales que pueden contener otros tipos de cadena principal pero las mismas bases. En otro ejemplo, el ácido nucleico artificial es ANP (ácido nucleico peptídico). El ANP contiene cadenas principales peptídicas y bases de nucleótidos y son capaces de unirse, en otro ejemplo, tanto a moléculas de ADN como de ARN. En otro ejemplo, el nucleótido está modificado con oxetano. En otro ejemplo, el nucleótido se modifica por reemplazo de uno o más enlaces fosfodiéster con un enlace fosforotioato. En otro ejemplo, el ácido nucleico artificial contiene cualquier otra variante de la cadena principal de fosfato de ácidos nucleicos nativos conocidos en la técnica. El uso de ácidos nucleicos de fosfotiorato y ANP es conocido por los expertos en la materia y se describe
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en, por ejemplo, Neilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57 y Raz NK y col Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84. La producción y uso de ácidos nucleicos son conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Molecular Cloning, (2001), Sambrook and Russell, eds. y Methods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells (2003) Purchio y G. C. Fareed. Cada derivado de ácido nucleico representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, El término "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena que comprende menos de 25 nucleótidos (nt). En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 24 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 23 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 22 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 21 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 20 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 19 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 18 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 17 nucleótidos. En otro ejemplo, "oligorribonucleótido” se refiere a una cadena de menos de 16 nucleótidos. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, El término "polirribonucleótido” se refiere a una cadena que comprende más de 25 nucleótidos (nt). En otro ejemplo, "polirribonucleótido” se refiere a una cadena de más de 26 nucleótidos. En otro ejemplo, "polirribonucleótido” se refiere a una cadena de más de 28 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 30 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 32 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 35 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 40 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 50 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 60 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 80 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 100 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 120 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 150 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 200 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 300 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 400 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 500 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 600 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 800 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 1000 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 1200 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 1400 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 1600 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 1800 nucleótidos. En otro ejemplo, se refiere a una cadena de más de 2000 nucleótidos. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para inducir a una célula de mamífero para producir una proteína de interés, que comprende poner en contacto la célula de mamífero con una molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica la proteína recombinante, comprendiendo la molécula de ARN sintetizada in vitro una pseudouridina o un nucleósido modificado, induciendo, de este modo, a la célula de mamífero para producir una proteína de interés. En otro ejemplo, la proteína de interés es una proteína recombinante. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
"Codificante" se refiere, en otro ejemplo, a una molécula de ARN que codifica la proteína de interés. En otro ejemplo, la molécula de ARN comprende un marco de lectura abierto que codifica la proteína de interés. En otro ejemplo, también se codifican una o más proteínas distintas. En otro ejemplo, la proteína de interés es la única proteína codificada. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento de inducción de una célula de mamífero para producir una proteína recombinante, que comprende poner en contacto la célula de mamífero con una molécula de ARN transcrita in vitro que codifica la proteína recombinante, la molécula de ARN transcrita in vitro comprende además una pseudouridina o un nucleósido modificado, induciendo, de este modo, a la célula de mamífero para producir la proteína recombinante.
En otro ejemplo, una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción se traduce en la célula más eficazmente que una molécula de ARN no modificado con la misma secuencia. En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido presenta una capacidad potenciada para ser traducida por una célula diana. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 2 veces en relación con su homólogo no modificado. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 3 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 5 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 7 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 10 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 15 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 20 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 50 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 100 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 200 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 500 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 1000 veces. En otro ejemplo, la traducción se potencia por un factor de 2000 veces. En otro ejemplo, el factor es de 10-1000 veces. En otro ejemplo, el factor es de 10-100 veces. En otro ejemplo, el factor es de 10-200 veces. En otro ejemplo, el factor es de 10-300 veces. En otro ejemplo, el factor es de
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Los procedimientos para determinar la eficacia de traducción son bien conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, medir la actividad de una proteína indicadora codificada (por ejemplo, luciferasa o renilla [Ejemplos en el presente documento] o proteína fluorescente verde [Wall AA, Phillips AM y col., Effective translation of the second cistron in two Drosophila dicistronic transcripts is determined by the absence of in-frame AUG codons in the first cistron. J Biol Chem 2005;280(30): 27670-8]), o medir el marcador radiactivo incorporado en la proteína traducida (Ngosuwan J, Wang NM y col, Roles of cytosolic Hsp70 and Hsp40 molecular chaperones in post-translational translocation of presecretory proteins into the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 2003;278(9): 7034-42). Cada procedimiento representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En algunos estudios de expresión proporcionados en el presente documento, la traducción se midió a partir de un ARN complejado con Lipofectin® (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA) e inyectado en la vena de la cola de ratones. En los lisados de bazo, el ARN modificado con pseudouridina se tradujo significativamente de manera más eficaz que el ARN no modificado (Figura 17B). En las condiciones utilizadas en el presente documento, la eficacia de los procedimientos basados en transfección de la presente descripción se correlaciona con la capacidad del reactivo de transfección para penetrar en los tejidos, proporcionando una explicación del motivo por el que el efecto fue más pronunciado en las células de bazo. El flujo sanguíneo esplénico es un sistema abierto, con contenidos de sangre que entran directamente en contacto con elementos de la pulpa roja y blanca incluidas células linfoides.
En otro experimento, se llevaron a cabo ensayos de fosforilación in vitro utilizando PKR recombinante humana y su sustrato, eIF2α en presencia de ARNm protegido con caperuza que codifica renilla (0,5 y 0,05 ng/µl). El ARNm que contiene pseudouridina (Ψ) no activaba PKR, como se detectó por la falta tanto de autofosforilación de PKR como de fosforilación de eIF2α, mientras que el ARN sin modificación de nucleósidos y el ARNm con modificación m5C activaron la PKR. Se sabe que eIF2α fosforilado bloquea el comienzo de la traducción de ARNm, por lo tanto, la falta de fosforilación permite, en otro ejemplo, potenciar la traducción del ARNm que contiene pseudouridina (Ψ).
En otro ejemplo, la traducción potenciada está en una célula (en relación con la traducción en la misma célula de una molécula de ARN no modificado con la misma secuencia; Ejemplos 13-14). En otro ejemplo, la traducción potenciada está in vitro (por ejemplo, en una mezcla de traducción in vitro o un lisado de reticulocitos; Ejemplos 13
14. En otro ejemplo, la traducción potenciada está in vivo (Ejemplo 13). En cada caso, la traducción potenciada se relaciona con una molécula de ARN no modificada con la misma secuencia, en las mismas condiciones. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido de los procedimientos y composiciones de la presente descripción es significativamente menos inmunogénica que una molécula de ARN no modificado sintetizada in vitro con la misma secuencia. En otro ejemplo, la molécula de ARN modificado es 2 veces menos inmunogénica que su homóloga no modificada. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 3 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 5 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 7 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 10 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 15 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 20 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 50 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 100 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 200 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 500 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 1000 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por un factor de 2000 veces. En otro ejemplo, la inmunogenicidad de reduce por otra diferencia de veces.
En otro ejemplo, "significativamente menos inmunogénica" se refiere a una disminución detectable de la inmunogenicidad. En otro ejemplo, la expresión se refiere a una disminución en veces de la inmunogenicidad (por ejemplo, una de las disminuciones en veces enumeradas anteriormente). En otro ejemplo, la expresión se refiere a una disminución tal que puede administrarse una cantidad eficaz de la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido sin desencadenar una respuesta inmunitaria detectable. En otro ejemplo, la expresión se refiere a una disminución tal que puede administrarse repetidas veces una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido sin provocar una respuesta inmunitaria suficiente para reducir de manera detectable la expresión de la proteína recombinante. En otro ejemplo, la disminución es tal que puede administrarse repetidas veces una molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido sin provocar una respuesta inmunitaria suficiente para eliminar la expresión detectable de la proteína recombinante.
"Cantidad eficaz" de la molécula de ARN, oligorribonucleótido o polirribonucleótido se refiere, en otro ejemplo, a una cantidad suficiente para ejercer un efecto terapéutico. En otro ejemplo, la expresión se refiere a una cantidad suficiente para provocar la expresión de una cantidad detectable de la proteína recombinante. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
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SYN1; SYP; TAF1; TAZ; TBX22; TDD; TFE3; THAS; THC; TIMM8A; TIMP1; TKCR; TNFSF5; UBE1; UBE2A; WAS; WSN; WTS; WWS; XIC; XIST; XK; XM; XS; ZFX; ZIC3; ZNF261 ; ZNF41; ZNF6; AMELY; ASSP6; AZFI; AZF2; DAZ; GCY; RPS4Y; SMCY; SRY; ZFY; ABAT; AEZ; AFA; AFD1; ASAH1; ASD1; ASMT; CCAT; CECR9; CEPA; CLA3; CLN4; CSF2RA; CTSI; DF; DIH1; DWS; DYT2; DYT4; EBR3; ECT; EEF1A1L14; EYCL2; FANCB; GCSH; GCSL; GIP; GTS; HHG; HMI; HOAC; HOKPP2; HRPT1; HSD3B3; HTC1; HV1S; ICHQ; ICR1; ICR5; IL3RA; KAL2; KMS; KRT18; KSS; LCAT; LHON; LIMM; MANBB; MCPH2; MEB; MELAS; MIC2; MPFD; MS; MSS; MTATP6; MTCOI; MTC03; MTCYB; MTND1; MTND2; MTND4; MTND5; MTND6; MTRNR1; MTRNR2; MTTE; MTTG; MTTI; MTTK; MTTL1; MTTL2; MTTN; MTTP; MTTS1; NAMSD; OCD1; OPD2; PCK2; PCLD; PCOS1; PFKM; PKD3; PRCA1; PR01; PR0P1; RBS; RFXAP; RP; SHOX; SLC25A6; SPG5B; STO; SUOX; THM o TTD.. Cada proteína recombinante representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar anemia en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, la molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica eritropoyetina, tratándose, de este modo, la anemia en un sujeto. En otro ejemplo, la molécula de ARN sintetizada in vitro comprende adicionalmente una pseudouridina o un nucleósido modificado. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción. En otro ejemplo, la célula es una célula de tejido subcutáneo. En otro ejemplo, la célula es una célula de pulmón. En otro ejemplo, la célula es un fibroblasto. En otro ejemplo, la célula es un linfocito. En otro ejemplo, la célula es una célula de músculo liso. En otro ejemplo, la célula es cualquier otro tipo de célula conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para tratar un vasoespasmo en un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del sujeto con una molécula de ARN sintetizada in vitro, la molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica óxido nítrico sintasa inducible (iNOS), tratándose, de este modo, un vasoespasmo en un sujeto.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para incrementar la tasa de supervivencia de una célula en un sujeto, que comprende poner en contacto la célula con una molécula de ARN sintetizada in vitro, la molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica una proteína de choque térmico, mejorando, de este modo, la tasa de supervivencia de una célula en un sujeto.
En otro ejemplo, la célula cuya tasa de supervivencia mejora es una célula isquémica. En otro ejemplo, la célula no es isquémica. En otro ejemplo, la célula se ha expuesto a un ambiente isquémico. En otro ejemplo, la célula se ha expuesto a un estrés ambiental. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para disminuir la incidencia de una reestenosis de un vaso sanguíneo después de un procedimiento que agranda el vaso sanguíneo, que comprende poner en contacto una célula del vaso sanguíneo con una molécula de ARN sintetizada in vitro, la molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica una proteína de choque térmico, disminuyendo, de este modo, una incidencia de una reestenosis en un sujeto.
En otro ejemplo, el procedimiento es una angioplastia. En otro ejemplo, el procedimiento es cualquier otro procedimiento conocido en la técnica que agranda el vaso sanguíneo. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para aumentar el crecimiento de un cabello a partir de un folículo capilar en el cuero cabelludo de un sujeto, que comprende poner en contacto una célula del cuero cabelludo con una molécula de ARN sintetizada in vitro, codificando la molécula de ARN sintetizada in vitro una telomerasa o una proteína inmunosupresora, incrementando, de este modo, el crecimiento de cabello a partir de un folículo capilar.
En otro ejemplo, la proteína inmunosupresora es la hormona estimulante de melanocitos (α-MSH). En otro ejemplo, la proteína inmunosupresora es el factor de crecimiento transformante β 1 (TGF-β 1). En otro ejemplo, la proteína inmunosupresora es el factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I). En otro ejemplo, a proteína inmunosupresora es cualquier otra proteína inmunosupresora conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento de inducción de la expresión de una enzima con actividad antioxidante en una célula, que comprende poner en contacto la célula con una molécula de ARN sintetizada in vitro, la molécula de ARN sintetizada in vitro que codifica la enzima, induciendo, de este modo, la expresión de una enzima con actividad antioxidante en una célula.
En un ejemplo, la enzima es catalasa. En otro ejemplo, la enzima es glutatión peroxidasa. En otro ejemplo, la enzima es fosfolípido hidroperóxido glutatión peroxidasa. En otro ejemplo, la enzima es superóxido dismutasa-1. En otro ejemplo, la enzima es superóxido dismutasa-2. En otro ejemplo, la enzima es cualquier otra enzima con actividad antioxidante conocida en la técnica. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
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dosificación es 40-80 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 50-100 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 50-150 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 100-200 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 200-300 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 300-400 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 400-600 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 500-800 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 800-1000 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 1000-1500 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 1500-2000 µg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-3 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-5 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-10 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-20 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-30 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-50 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-80 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 2-100 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 3-10 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 3-20 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 3-30 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 3-50 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 3-80 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 3-100 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 5-10 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 5-20 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 5-30 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 5-50 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 5-80 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 5-100 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 10-20 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 10-30 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 10-50 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 10-80 mg/dosis. En otro ejemplo, la dosificación es 10-100 mg/dosis.
En otro ejemplo, la dosificación es una dosis diaria. En otro ejemplo, la dosificación es una dosis semanal. En otro ejemplo, la dosificación es una dosis mensual. En otro ejemplo, la dosificación es una dosis anual. En otro ejemplo, la dosis es una en una serie de un número definido de dosis. En otro ejemplo, la dosis es una dosis única. Como se describe a continuación, en otro ejemplo, la ventaja de las moléculas de ARN, oligorribonucleótidos o polirribonucleótidos de la presente descripción es su mayor potencia, que permite el uso de dosis más pequeñas.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para producir una proteína recombinante, que comprende poner en contacto un aparato de traducción in vitro con un polirribonucleótido sintetizado in vitro, comprendiendo el oligorribonucleótido sintetizado in vitro una pseudouridina o un nucleósido modificado, produciéndose, de este modo, una proteína recombinante.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para producir una proteína recombinante, que comprende poner en contacto un aparato de traducción in vitro con una molécula de ARN transcrita in vitro de la presente descripción, la molécula de ARN transcrita in vitro comprende una pseudouridina o un nucleósido modificado, produciéndose, de este modo, una proteína recombinante.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un aparato de transcripción in vitro, que comprende: un nucleótido no modificado, un nucleótido que contiene una pseudouridina o un nucleósido modificado y una polimerasa. En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un kit de transcripción in vitro, que comprende: un nucleótido no modificado, un nucleótido que contiene una pseudouridina o un nucleósido modificado y una polimerasa. Cada posibilidad representa un ejemplo por separado de la presente descripción.
En otro ejemplo, el aparato de traducción in vitro comprende un lisado de reticulocitos. En otro ejemplo, el lisado de reticulocitos es un lisado de reticulocitos de conejo.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para reducir una inmunogenicidad de una molécula de oligorribonucleótido o una molécula de ARN, comprendiendo el procedimiento la etapa de reemplazar un nucleótido de la molécula de oligorribonucleótido o molécula de ARN con un nucleótido modificado que contiene un nucleósido modificado o una pseudouridina, reduciendo, de este modo, una inmunogenicidad de una molécula de oligorribonucleótido o molécula de ARN.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para reducir una inmunogenicidad de un vector de terapia génica que comprende una molécula de polirribonucleótido o una molécula de ARN, comprendiendo el procedimiento la etapa de reemplazar un nucleótido de la molécula de polirribonucleótido o molécula de ARN con un nucleótido modificado que contiene un nucleósido modificado o una pseudouridina, reduciendo, de este modo, una inmunogenicidad de un vector de terapia génica.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para potenciar la traducción in vitro a partir de una molécula de oligorribonucleótido o molécula de ARN, comprendiendo el procedimiento la etapa de reemplazar un nucleótido de la molécula de oligorribonucleótido o molécula de ARN con un nucleótido modificado que contiene un nucleósido modificado o una pseudouridina, potenciando, de este modo, la traducción in vitro a partir de una molécula de oligorribonucleótido o molécula de ARN.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para potenciar la traducción in vitro a partir de un vector de terapia génica que comprende una molécula de polirribonucleótido o molécula de ARN, comprendiendo el procedimiento la etapa de reemplazar un nucleótido de la molécula de polirribonucleótido o molécula de ARN con un nucleótido modificado que contiene un nucleósido modificado o una pseudouridina, potenciando, de este modo, la traducción in vivo a partir de un vector de terapia génica.
En otro ejemplo, la presente descripción proporciona un procedimiento para aumentar la eficacia de la administración de una proteína recombinante mediante un vector de terapia génica que comprende una molécula de
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