RS57739B1 - Kompozicije cftr irnk i postupci i upotrebe u vezi sa njima - Google Patents

Kompozicije cftr irnk i postupci i upotrebe u vezi sa njima

Info

Publication number
RS57739B1
RS57739B1 RS20181158A RSP20181158A RS57739B1 RS 57739 B1 RS57739 B1 RS 57739B1 RS 20181158 A RS20181158 A RS 20181158A RS P20181158 A RSP20181158 A RS P20181158A RS 57739 B1 RS57739 B1 RS 57739B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
mrna
cftr
lung
hcftr
expression
Prior art date
Application number
RS20181158A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Heartlein
Braydon Charles Guild
Frank Derosa
Carsten Rudolph
Christian Plank
Lianne Smith
Original Assignee
Translate Bio Inc
Ethris Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=50513499&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS57739(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Translate Bio Inc, Ethris Gmbh filed Critical Translate Bio Inc
Publication of RS57739B1 publication Critical patent/RS57739B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7115—Nucleic acids or oligonucleotides having modified bases, i.e. other than adenine, guanine, cytosine, uracil or thymine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6935—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being obtained otherwise than by reactions involving carbon to carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamides or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A61K9/0073—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy
    • A61K9/0078—Sprays or powders for inhalation; Aerolised or nebulised preparations generated by other means than thermal energy for inhalation via a nebulizer such as a jet nebulizer, ultrasonic nebulizer, e.g. in the form of aqueous drug solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/02—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with ribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4712—Cystic fibrosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
    • C12Y306/03—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on acid anhydrides; catalysing transmembrane movement of substances (3.6.3)
    • C12Y306/03049—Channel-conductance-controlling ATPase (3.6.3.49)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na transmembranski regulator cistične fibroze (cystic fibrosis transmembrane regulator, CFTR), kompozicije iRNK, upotrebe istih, i postupke za proizvodnju i upotrebu istih.
[0002] Cistična fibroza je autozomalni nasledni poremećaj uzrokovan mutacijom u okviru CFTR gena koji kodira jonski kanal za hlor za koji se veruje da učestvuje u regulaciji mnogobrojnih drugih jonskih kanala i transportnih sistema u epitelijalnim ćelijama. Gubitak funkcije CFTR rezultuje u hroničnoj bolesti pluća, poremećenoj proizvodnji mukusa, i dramatičnoj redukciji u očekivanoj dužini života. Pogledati uopšteno Rowe et al., New Engl. J. Med.352, 1992-2001 (2005).
[0003] Uprkos kloniranju CFTR gena još 1989 godine, još uvek nisu razvijene efikasne terapije za zamenu CFTR i tretiranje cistične fizbroze. Literaturni podaci su dokumentovali mnogobrojne probleme sa kojim se susreće tokom pokušaja da se indukuje ekspresija CFTR u plućima. Na primer, virusni vektori koji sadrže CFTR DNK izazivali su imune odgovore i CF simptomi su i dalje postojali nakon davanja vektora. Conese et al., J. Cyst. Fibros.10 Suppl 2, S114-28 (2011); Rosenecker et al., Curr. Opin. Mol. Ther. 8, 439-45 (2006). Ne-virusno davanje DNK, uključujući CFTR DNK takođe su opisani da indukuju imune odgovore. Alton et al., Lancet 353, 947-54 (1999); Rosenecker et al., J Gene Med. 5, 49-60 (2003). Dalje, ne-virusni vektori se suočavaju sa dodatnim problemom, a to je da se mašinerija kompleks nuklearne pore najčešće ne unosi DNK u jedro, gde bi trebalo da se odigra transkripcija (prepisivanje). Pearson, Nature 460, 164-69 (2009).
[0004] Još jedan izvor problema za indukciju ekspresije CFTR u plućima je samo okruženje u plućima. Prijavljeno je da plućni surfaktant redukuje efikasnost sredstava za davanje za katjonski transfer lipida kao što je lipoektamin (DOSPA:DOPE).
[0005] Ernst et al., J. Gene Med.1, 331-40 (1999). Takođe, Rosenecker et al., 2003, supra, identifikovali su više inhibitornih komponenti koje su prisutne u površinskoj tečnosti disajnih puteva koji mogu da ometaju ili polimerno posredovanu ili lipidima posredovanu transfekciju. Terapija informacionom RNK je predložena kao generalni pristup za indukciju ekspresije terapeutika ili zamenskog proteina. Koncept introdukcije informacione RNK (iRNK) kao načina proizvodnje proteina u domaćinu već je ranije prijavljena (Yamamoto, A. et al. Eur. J. Pharm. 2009, 71, 484-489; Debus, H. et al. J. Control Rel.2010, 148, 334-343). Međutim, očigledne poteškoće koje su specifične za pluća prijavljene su za dostavu iRNK upotrebom određenih lipokompleksnih formulacija. Na primer poređenje in vitro i in vivo preformansi lipokompleksa koji nose iRNK ili DNK otkrili su da, iako kompozicija iRNK daje veću ekspresiju u gajenim ćelijama, ekspresija koja je merljiva bila je detektovana samo sa DNK kompozicijom kada je davana intranazalno u mišija pluća. Andries et al., Mol. Pharmaceut.9, 2136-45 (2012).
[0006] Treba obratiti pažnju takođe na to da je CFTR veliki gen u odnosu na model ili reporter gene kao što je luciferaza svica (FFL). Uporediti dužine dilvjeg (ishodne, wild type-WT) CFTR kodirajuće sekvence (SEQ ID NO: 2) i FFL kodirajuće sekvence (SEQ ID NO: 7). Razlika u dužini može uticati na stabilnost u određenim okolnostima, i samim tim da li će se eksprimirati i kolika je ekspresija bilo koje doze iRNK i proizvodnja proteina. Dalje, iako je poželjnija in vitro sinteza iRNK od strane ćelija usled nedostatka normalne ćelijske iRNK i drugih ćelijskih komponenti koji predstavljaju neželjene kontaminate, in vitro sinteza iRNK sa dugom kodirajućom sekvencom kao što je CFTR iRNK je značajno teža nego in vitro sinteza iRNK sa relativno kratkom kodirajućom sekvencom kao što je FFL.
[0007] Objava PCT patenta WO2007/024708 i US (SAD) patentna objave US2010/0203627 i US2011/0035819 diskutuju terapeutske davanja CFTR iRNK, ali ne obezbeđuju demonstriranu redukciju ka praksi proizvodnje funkscionalnog CFTR u plućima nakon davanja CFTR iRNK ili niti ima dovoljnih uputstava kako da se reše problemi povezani sa indukcijom CFTR ekspresije u plućima upotrebom in vitro transkribovane CFTR iRNK. Oni uključuju teškoće u postizanju in vitro sinteze iRNK i teškoće specifične za interakcije kompozicija iRNK sa supstancama specifičnim za pluća za koje su istraživači kao što je Andries et al., supra, otkrili da čine komoziciju iRNK neefikasnom u indukciji ekspresije čak i dok odgovarajuće kompozicije bazirane na DNK obezbeđuju neki nivo ekspresije. WO 2008/045548 opisuje kodonoptimizovanu osiromašenu za CpG - CFTR RNK.
[0008] Zbog toga, postoji potreba za poboljšanim materijalima, formulacijama, proizvodnim postupcima i postupcima za dostavu CFTR iRNK za indukciju ekspresije CFTR, uključujući pluća sisara za lečenje cistične fibroze.
SUŠTINA PRONALASKA
[0009] Ovaj pronalazak je baziran, jednim delom, na razvoju formulacija CFTR iRNK i CFTR iRNK koje se ne nalaze u prirodi i postupak za njihovu davanje koje mogu indukovati ekspresiju funkcionalnog CFTR in vivo. Kompozicije, postupci, i upotrebe koje su ovde opisane mogu obezbediti ekpresiju CFTR u plućima krupnih sisara sa povoljnim bezbednosnim profilom za efektno lečenje cistične fibroze.
[0010] Specifično, ovaj pronalazak obuhvata in vitro transkribovanu iRNK koja obuhvata kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ
[0011] Pronalazak dalje obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata iRNK i nosač, gde je iRNK in vitro transkribovana iRNK i ima kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 3.

[0012] Ovaj opis takođe obezbeđuje postupak za in vivo proizvodnju CFTR, posebno, u plućima subjekta (na pr. sisara) kome treba dostava putem davanja iRNK koja kodira CFTR protein. iRNK koja kodira CFTR protein može biti odstavljen direktno u pluća subjekta. Kao što se ovde koristi "CFTR protein" obuhvata bilo koji ceo, fragment ili deo CFTR proteina koji se može koristiti da zameni aktivnost prirodnog CFTR proteina i/ili redukuje intenzitet, ozbiljnost, i-ili frekvencu jednog ili više simptoma koji su povezani sa cističnom fibrozom. Na primer, pogodan CFTR protein može imati amino kiselinsku sekvencu identičnu sa prirodnim humanim CFTR proteinom (SEQ ID NO: 1).
[0013] Opis takođe obezbeđuje postupak za indukciju ekspresije CFTR u epitelijalnim ćelijama pluća sisara, postupak koji obuhvata kontaktiranje epitelijalnih ćelija pluća sisara sa kompozicijom, gde: kompozicija je farmaceutska kompozicija koja obuhvata in vitro prepisanu iRNK; in vitro prepisana iRNK obuhvata kodirajuću sekvencu koja kodira SEQ ID NO:1.
[0014] Otkriće takođe obezbeđuje postupak za indukciju ekspresije CFTR u sisarskim ciljnim ćelijama, postupak koja obuhvata kontaktiranje epitelijalnih ćelija pluća sisara sa kompozicijom, kompozicija je farmaceutska kompozicija koja obuhvata in vitro prepisanu iRNK koja kodira SEQ ID NO:1.
[0015] Otkriće obezbeđuje molekul iRNK koji se ne nalazi u prirodi koji obuhvata kodirajuću sekvencu, 5’-UTR, i 3’-UTR, gde je kodirajuća sekvenca najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 3. U jednom primeru kodirajuća sekvenca je oko 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa SEQ ID NO: 3.
[0016] U drugom primeru otkriće obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata polinukleotid u skladu sa pronalaskom, RNK polimerazu, i nukleozid trifosfate.
[0017] U drugom primeru, otkriće obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja obuhvata iRNK na osnovu opisa.
[0018] Otkriće obezbeđuje aparat za raspršivanje ili aerosolizaciju koji je napunjen sa farmaceutskom kompozicijom koja je ovde opisana.
[0019] Otkriće obezbeđuje kutivisnu ćeliju koja obuhvata iRNK kao što je ovde opisano i funkcionalni CFTR eksptrimiran od strane iRNK.
[0020] Otkriće obezbežuje upotrebu farmacautske kompozicije kao što je ovde opisano za indukciju ekspresije funkcionalnog CFTR.
[0021] U drugom primeru otkriće obezbeđuje postupak za indukciju ekspresije CFTR u epitelijalnim ćelijama u plućima sisara, postupak koja obuhvata kontaktiranje epitelijalnih ćelija sa kompozicijom, gde je kompozicija farmaceutska kompozicija koja obuhvata iRNK kao što je ovde opisano.
[0022] U drugom primeru otkriće obezbeđuje postupak za indukciju ekspreisje CFTR u ciljanim sisarskim ćelijama, postupak koja obuhvata kontaktiranje ciljnih sisarskih ćelija sa kompozicijom, kompozicija obuhvata iRNK koja je ovde opisana.
[0023] U drugom apsektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u okviru postupka za tretiranje cistične fibroze putem davanja subjektu, koji ima potrebu za tretmanom, iRNK koja kodira CFTR protein kao što je ovde opisano. U jednom aspektu iRNK se dostavlja plućima subjekta. U jednom aspektu iRNK se dostavlja inhalacijom, raspršivanjem, intranazalnom dostavom ili aerosolizacijom. U različitim aspektima davanja iRNK rezultira u ekspresiji CFTR u plućima subjekta.
[0024] Ovo otkriće obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u okviru postupka za tretiranje cistične fibroze putem davanja preko pluća subjektu, koji ima potrebu za tretmanom, iRNKkoja obuhvata kodirajuću sekvencu koja kodira SEQ ID NO:1. U drugom posebnom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u okviru postupka za tretiranje cistične fibroze putem davanja preko pluća subjektu, koji ima potrebu za tretmanom, iRNK koja obuhvata kodirajuću sekvencu koja kodira SEQ ID NO:3. U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje kompoziciju za upotrebu u okviru postupka za tretiranje cistične fibroze putem davanja preko pluća subjektu, koji ima potrebu za tretmanom, iRNK koja obuhvata kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa SEQ ID NO:3.
[0025] U drugom ostvarenju, otkriće obezbeđuje postupak za pravljenje CFTR iRNK in vitro, koja obuhvata izolovani polinukleotid kao pto je opisano ovde sa RNK polimerazom u prisustvu nukleozid trifosfata, gde: izolovni polinukleotid i RNK polimeraza se ne sadrže u ćeliji; izolovani polinukleotid je matrica za RNK polimerazu; izolovani polinukleotid obuhavta promotor operativno vezan sa sekvencom matrice, i RNK polimeraza sintetiše iRNK koja obuhvatakodirajuću sekvencu koja kodira SEQ ID NO: 1.
[0026] Dodatni predmeti i prednosti pronalaska biće predstavljeni u opisnom delu koji sledi, i delimično će biti očigledni iz opisa, ili se mogu izvesti i naučiti primenom invencije. Predmeti i prednosti pronalaska mogu se realizovati i dostići u smislu elemenata i kombinacija koje su posebno istaknute u patentnim zahtevima.
[0027] Treba razumeti da oba prethodni opis i detalji koji slede su primeri i služe samo za objašnjenje i nisu restriktivni za invenciju kao što se traži u patentnim zahtevima.
[0028] Crteži koji prate tekst, koji su ugraženi u tekst i čine sastavni deo specifikacije, ilustriraju nekoliko aspekata pronalaska i zajedno sa opisom služe za objašnjenje principa pronalaska.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0029] Gore pomenuti aspekti i prednosti ovog pronalaska mogu postati očigledni iz detalnjog opisa koji sledi zajedno sa slikama koje stoje uz njih.
Slika1A. Detekcija zrele "C" trake za humani CFTR protein 24 sata nakon transfekcije sa humanom CFTR iRNK. Uspešna proizvodnja proteina primećena je za obe i nemodofikovanu i modifikovanu (SNIM) iRNK (sadrži 5% 2-tiouridin i 5-metilcitidin). Imuoprecipitacija je izvedena sa R&D Systems MAB25031 antitelom i detekcija je urađena sa Ab570.
Slika 1B. Western Blot analiza CFTR KO mišijih pluća 24 sata nakon izlaganja PEI/nemodifikovanim humanim CFTR iRNK nanopartikulama. Miševi su tretirani pomoću raspršivnja (Pari Boy jet nebulizator) tokom perioda od približno jedan sat. Urađena je imunoprecipitacija humanog CFTR proteina dobijenog na osnovu obezbeđenog postupka. Zrela "C" traka je detektovana kod svih tretiranih miševa ali nije detektovana kod kontrolnih miševa.
Slika 2. Dijagram struja-voltaža 8-Br-cAMP probuđenih struja tretiranih (4 ug hCFTR mRNK) i netretiranih HEK293T ćelija. Velika struja je indukovana u okviru hCFTR iRNK koje su transfektovane ćelije u poređenju sa netretiranim ćelijama. Tretirane ćelije koje su bile izložene specifičnom CFTR proteinskom inhibitoru, CFTRinh-172, pokazuje markiranu redukciju (~89%) u Cl- jonskom strujnom toku.
Slika 3. Histogram dijagrami 8-Br-cAMP probuđenih struja tretiranih (4 ug hCFTR mRNK) i netretiranih HEK293T ćelija nakom primene 80mV membranskog potencijala. Velika struja je indukovana u okviru hCFTR iRNK koje su transfektovane ćelije u poređenju sa netretiranim ćelijama. Tretirane ćelije koje su bile izložene specifičnom CFTR proteinskom inhibitoru, CFTRinh-172, pokazuje markiranu redukciju (~89%) u Cl- jonskom strujnom toku.
Slika 4. Dijagram uporednih profila struja-napon HEK 293 ćelija nativnih, onih izloženih forksolinu i GlyH-101. Ni u jednom scenariju nisu zabeležene bitnije promene u struji.
Slika 5. Dijagram struja-napon struja probuđenih forksolinom tretiranih (4 ug hCFTR mRNK) i netretiranih HEK293T ćelija. Velika struja je indukovana u okviru hCFTR iRNK transfektovanih ćelija u poređenju sa netretiranim ćelijama. Tretirane ćelije koje su bile izložene specifičnom CFTR proteinskom inhibitoru, CFTRinh-172, pokazuje markiranu redukciju (~95%) u Cl- jonskom strujnom toku kao što je prikazano u koraku dijagrama (+100 mV) na desnoj strani grafika.
Slika 6. In situ hibridizacija humanog CFTR iRNK u netretiranim (PBS) (levo) I tretiranim (desno) CFTR KO mišijim plućima. Miševi su izloženi 30 ug inkapsuliranim nemodifikovanim CFTR iRNK u PEI nanopartikulama preko intratrahealne dostave. Značajno pozitivno bojenje je primećeno kroz oba plućna krila 24 sata nakon dostave.
Slika 7. In situ hibridizacija humanom CFTR iRNK tretiranih CFTR KO mišijih pluća pod različitim uveličavanjima (do 20x uveličanja). Miševi su izloženi 30 ug inkapsuliranim nemodifikovanim CFTR iRNK u PEI nanopartikulama preko intratrahealnog davanja.
Slika 8. Visoko uveličanje (40x) representativnih preseka pluća pokazuju in situ hibridizaciju humanih CFTR iRNK tretiranih (desno) CFTR KO mišijih pluća. Humana CFTR iRNK je detektovana u pikalnoj citoplazmi ciljanih bronhijalnih epitelijalnih ćelija 24 sata nakon davanja. Miševi su izloženi 30 inkapsuliranim nemodifikovanim CFTR iRNK u PEI nanopartikulama preko intratrahealnog davanje.
Slika 9. Poređenje in situ hibridizacionog bojenja humanom CFTR iRNK tretiranih CFTR KO mišijih pluća šestog sata (levo) i 24 sata (desno) nakon davanja. Miševi su izlagani 30 ug inkapsuliranim nemodifikovanim CFTR iRNK u PEI nanopartikulama preko intratrahealne dostave. Intenzivno pozitivno bojenje je primećeno u okviru šest sati kroz kompletna pluća u okviru bronhijalnih i alveolarnih regiona dok je značajno pozitivno bojenje i dalje bilo vidljivo 24 sata nakon dostave.
Slika 10. In situ hibridizacija humane CFTR iRNK kod netretiranih (PBS) (gore) i tretiranih (na dnu) CFTR KO mišijih pluća. Miševi su bili izloženi do 15 ug inkapsuliraih nemodifikovanih hCFTR iRNK u C12-200 lipidnim nanopartikulama preko intratrahelane dostave. Značajno pozitivno bojenje je viđeno kroz oba pluća 6 sati nakon davanja.
Slika 11. Visoko uveličanje (40x) reprezentativnih preseka pluća pokazuju in situ hibridizaciju humanih CFTR iRNK tretiranih CFTR KO mišijih pluća. Humana CFTR iRNK je detektovana u apikalnoj citoplazmi ciljanog bronhijalnog epitela (levo) kao i u intracelularnim alveolarnim regionima (desno) šest sati nakon davanja. Miševi su izloženi 15 ug inskapsuliranim nemodifikovanim hCFTR iRNK u C12-200 lipidnim nanopartikulama preko intratrahealne dostave.
Slika 12. Pretraga različitih ćelijskih linija za ekspresiju hCFTR. Immunoblot analiza CHO i COS-7 (A) iBHK i PKC (B)ćelija transfektovanih sa hCFTR kodirajućim konstruktima. Lizat proteina je pripremljen 24 sati nakon trasnfekcije i pregledan pomoću MA1-935 kao primarnog antitela. Strelica ukazuje pretpostavljeni CFTR. Videti u diskusiji MA1-935 specifilnost u primeru 6
Slika 13. Unakrsna reaktivnost različitih anti humanih CFTR antitela. (A) – mišije anti-humano CFTR MA1-935 (Chemicon): (B) - mišije anti-humano CFTR AB570 (Cystic Fibrosis Foundation): (C) - mišije anti-humano CFTR AB596 (Cystic Fibrosis Foundation): (D) zečije anti-humano CFTR G449 (Rockefeller University). Strelica pokazuje CFTR.
Slika 14. Imunoprecipitacija humanog CFTR pomoću tri različita antitela (R29, R66/17 and R66/16) nakon čega je sledila imunodetekcija upotrebom AB596. Kolona 1: T84 ćelije (pozitivna kontrola), Kolona 2: netretirano tkivo pluća svinje (300 mg), Kolona 3: tretirano tkivo pluća svinje (697 mg), Kolona 4: tretirano tkivo pluća svinje (163 mg).
Slika 15. Imunoprecipitacija i Western blot analiza miša 24 sata nakon IT spreja kojim je davano 20 μg hCFTR SNIM RNK/10 μg FFL SNIM RNK svaki u HGT5001 formulaciji iz primera 6. T84 ćelije su služile kao pozitivna kontrola koja pokazuje zrelu glikoziolvanu C traku i manozilovanu B traku hCFTR-a. "supernatant" ostatak ćelijskog ekstrakta frakcije bez imunoprecipitirane frakcije. "IP" imunoprecipitovana frakcija.
Slika 16. Imunoprecipitacija hCFTR iz T84 ćelija pomoću MAB25031 nakon čega je sledila imunodetekcija pomoću AB570 (A) i MAB1660 (B).
Slika 17. Imunoprecipitacija CFTR iz NIH3T3 ćelija 72 sati nakon transfekcije sa različitim konstruktima.
Slika 18. Imunoprecipitacija CFTR iz NIH3T3 ćelija 72 sati nakon transfekcije sa različitim konstruktima pomoću 500 ug proteina i MAB1660 (levi i centralni paneli) i povećane količine ukupnog proteina (8 mg) upotrebom MAB25031 (desni panel).
Slika 19. Imunoprecipitacija CFTR pomoću MAB25031 i dalja imunodetekcija sa AB570 iz uzoraka pluća svinja nakon dostave hCFTR SNIMRNK u PEI formulaciji iz primera 6. Kolona 1: uzorci od levog kaudalnog lobusa svinje negativnog na luciferazu #2, Kolona 2: uzorci od regiona pluća svinje pozitivnih na luciferazu #1.
Slika 20. Raspšivanje je izvršena na svinjama koje su bile pod anestezijom i ventilacijom (levo). Aparat za nebulizaciju je bio povezan u liniji sa ventilacionim sistemom (desno, videti belu strelicu).
Slika 21. Ekpresija luciferaze merena u homogenatima uzoraka svinjskog tkiva iz različitih plućnih područja nakon aerosolne primene 1 mg FFL SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 sa EFlow vazdušnim raspršivačem. Uzorci pluća su ex vivo gajeni preko noći pre merenja luciferaze (pg luciferaze / mg plućnog tkiva).
Slika 22. BLI ekspresija luciferaze u reprezentativnim uzorcima svinjskog tkiva iz različitih regiona pluća nakon aerosolne primene od 1 mg FFL SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6. Primerci pluća su ex vivo gajeni preko noći pre merenja.
Slika 23. BLI prikaz ekspresije luciferaze u reprezentativnim uzorcima svinjskog tkiva iz različitih regiona pluća nakon aerosolne primene 1 mg FFL SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 korišćenjem raspršivača PARI BOI. Primeri pluća su ex vivo gajeni preko noći pre merenja.
Slika 24. BLI prikaz ekspresije luciferaze u reprezentativnim uzorcima svinjskog tkiva iz različitih regiona pluća nakon aerosolne primene svakog od 1 mg FFL SNIM RNK i hCFTR iRNK u PEI Formulaciji Primera 6 korišćenjem Aeroneb vazdušnog raspršivača. Uzorci pluća su ex vivo gajeni preko noći pre merenja.
Slika 25. BLI ekspresije luciferaze u reprezentativnim uzorcima svinjskog tkiva iz različitih regiona pluća nakon aerosolne primene 1 mg FFL SNIM RNK u "SHIRE Formulaciji #3" (HGT5001: DOPE: Chol: DMGPEG2K (50: 25: 20: 5) (mol odnos) korišćenjem vazdušnog raspršivača (nebulizatora) Aeroneb. Uzorci pluća su ex vivo gajeni preko noći pre merenja.
Slika 26. BLI ekspresija luciferaze u uzorcima svinjskog tkiva iz različitih regiona pluća iz jedne netretirane kontrolne svinje. Druga netretirana kontrolna svinja pokazala je isti rezultat (podaci nisu prikazani).
Slika 27. BLI ekspresija luciferaze u uzorcima pluća jednostruko tretiranih svinja #3 i #6. Primena aerosola za svaku 1 mg FFL SNIM RNK i hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 izvršena je korišćenjem Aeroneb vazdušnog raspršivača (nebulizatora). Prikazani su preseci celih svinjskih pluća. Gornja tri reda: svinja #3, donja tri reda: svinja #6.
Slika 28. BLI ekspresija luciferaze u uzorcima pluća dvostruko tretiranih svinja #4 i #8. Primena aerosola za svaku 1 mg FFL SNIM RNK i hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 izvršena je korišćenjem Aeroneb vazdušnog raspršivača. Prikazani su preseci celih svinjskih pluća. Gornja tri reda: svinja #4, donja tri reda: svinja #8.
Slika 29. BLI ekspresija luciferaze u uzorcima pluća trostruko tretiranih svinja #1 i #2. Primena aerosola za svaku 1 mg FFL SNIM RNK i hCFTR-mRNA SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 izvedene je korišćenjem Aeroneb vazdušnog raspršivača (nebulizatora). Prikazani su preseci celih svinjskih pluća. Gornji tri reda: svinja #1, donja tri reda: svinja #2.
Slika 30. Luciferaza IHC na plućnom tkivu trostruko tretirane svinje #1. Primena aerosola svake 1 mg FFLSNIM RNK i hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 izvršeno je korišćenjem Aeroneb vazdušnog raspršivača (nebulizatora). Ekspresija luciferaze se detektuje kao pojava crveno-ružičaste boje (Anti-Luciferaze pAb 1: 300, G7451, Promega, Refine AP-Kit, hromogen: Novi fuksin).
Slika 31. Visoko BLI-pozitivno tkivo pluća trostruko tretirane svinje #1 podvrgnuto je hCFTR IP / VB. Linija 1: T84 ćelije (pozitivna kontrola), Linija 2: netretirano tkivo pluća svinje (300 mg), Linija 3: tretirano tkivo pluća svinje (697 mg), Linija 4: tretirano tkivo pluća svinje (163 mg). Zreli kompleks-glikozilovani hCFTR pojavio se kao dispergovana tzv. C-traka. Manozom bogat HCFTR, pojavio se kao mnogo gušći tzv. B-traka. Ekspresija hCFTR-a je primećena u T84 ćelijama i plućnom tkivu hCFTR SNIM RNK tretirane svinje #1, dok kod netretiranih svinja hCFTR ekspresija nije primećena.
Slika 32. Imunoprecipitacija hCFTR pomoću MAB25031 i naknadne imunodetekcija pomoću AB570 iz uzoraka pluća svinja nakon hCFTR SNIM RNA dopremanja u PEI Formulaciju Primera 6. Linija 1: uzorak iz luciferaza-negativnog levog kaudalnog režnja svinje #2, Linija 2: uzorak iz luciferaza-pozitivne regije pluća svinje #1.
Slika 33 A & B. In vitro transfekcija HEK 293T ćelija sa C-terminalno obeleženim His10(CO-CFTR-C-His10) i neobeleženom (CO-CFTR) kodon-optimizovanom humanom CFTR SNIM RNK. Nakon transfekcije, lizat celih ćelija je sakupljen i analiziran pomoću Western blot-a na humanu CFTR ekspresiju koristešćenjem (A) anti-CFTR antitela #217 i (B) anti-His antitela 1187. Transfektovani uzorci su upoređeni sa netransfektovanim HEK 293T kontrolnim lizatom (Linija 3).
Slika 33 C. In vitro transfekcija HEK 293T ćelija sa SNIM RNK koja kodira kodonoptimizovan humani CFTR sa lider sekvencom hormona rasta i (GH-CO-CFTR) ili SNIM RNK koja kodira C-terminalno obeleženi His10kodon optimizovani humani CFTR (CO -CFTR-C-His10). Nakon transfekcije, lizat celih ćelija je prikupljen i analiziran za humanu CFTR ekspresiju pomoću Western blot-a koristešćenjem anti-CFTR antitela #217. Transfektovani uzorci su upoređeni sa netransfekcijom HEK 293T kontrolnim lizatom (Linija 3).
Slika 34. In vivo transfekcija CFTR noktiju miševa sa C-terminalom His10 tagovanim kodonom optimizovanom humanom CFTR SNIM RNK koja je inkapsulirana unutar formulacije lipidnih (cKK-E12) ili polimernih (PEI) nanopartikula. Nakon davanja raspršivanjem svake odgovarajuće formulacije mRNK, lizat levog i desnog krila pluća je sakupljen i analiziran za CFTR ekspresiju pomoću zapadnog blota koristeći antiHis antitelo 1187. Kontrolni CFTR “knockout” plućnog tkiva i CFTR-Hisio HEK293 lizat korišćen su kao negativna i pozitivna kontrola.
Slika 35. Detekcija FFL ekspresije putem bioluminescencije u uzorcima pluća svinja sakupljenih nakon raspršivanja sa vodom za injektiranje.
Slika 36. Bioluminescentna detekcija FFL ekspresije u uzorcima pluća svinje sakupljenih nakon raspršivanja sa 1 mg FFL SNIM RNK 1 mg CO-CFTR SNIM RNK u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji.
Slika 37. Bioluminescentna detekcija FFL ekspresije u uzorcima pluća svinje sakupljenih nakon raspršivanja sa 1 mg FFL SNIM RNK 5 mg CO-CFTR SNIM RNK u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji.
Slika 38. Bioluminescentna detekcija FFL ekspresije u uzorcima pluća svinje sakupljenih nakon raspršivanja sa 1 mg FFL SNIM RNK 10 mg CO-CFTR SNIM RNK u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji.
Slika 39. Relativna kvantifikacija ekspresije CFTR-a u različitim grupama. Intenzitet traka je normalizovan na 150 kDa traku u proteinskoj lestvici.
Slika 40. Reprezentativni primer "CFTR-pozitivnih" bronhija sa najmanje jednom epitelnom ćelijom detektovanom u okviru epitelijalnog ćelijskog sloja i prikazom čistog, u membrani lokalizovanog CFTR signala putem CFTR imunohistohemijskog bojenja, dobijenog korišćenjem anti-CFTR antitela.
Slika 41. Imunohistohemijsko bojenje CFTR-a u plućima svinje nakon aerosolne isporuke kontrole (WFI) ili 5 mg CO-CFTR SNIM RNK.
Slika 42. Predstavlja "nizak" nivo CFTR ekspresije, analiziran u plućima svinje pomoću imunohistohemijskog bojenja sa anti-CFTR nakon aerosolne isporuke 5 mg CO-CFTR SNIM RNA .
Slika 43. Predstavlja "srednji" nivo CFTR ekspresije, analiziran u plućima svinje pomoću imunohistohemijskog bojenja sa anti-CFTR nakon aerosolne isporuke 5 mg CO-CFTR SNIM RNA .
Slika 44. Predstavlja "visok" nivo CFTR ekspresije, analiziran u plućima svinje pomoću imunohistohemijskog bojenja sa anti-CFTR nakon aerosolne isporuke 5 mg CO-CFTR SNIM RNA.
Slika 45. Imunohistohemijsko bojenje CFTR u plućima svinje nakon aerosolne isporuke kontrole (WFI) ili 10 mg CO-CFTR SNIM RNK.
Slika 46. Kvantifikacija relativnih brojeva CFTR-pozitivnih bronhija/bronhiola po životinji. Analiza svake grupe (WFI; i 1mg, 5mg, 10mg humane CFTR SNIM RNK) 24 časa nakon aerosolne primene. CFTR ekspresija normalizovana na intenzitet signala za 150 kDa proteinski standard. (WFI = 9.465.6%, 1MG = 15.266.6%, 5MG = 25.4614.1%, 10MG = 20.963.7%, VFI vs 5MG p = 0.0281, VFI vs 10MG p = 0.0174).
Slika 47. Prikazuje višestruku in situ detekciju nukleinske kiseline (A) ubikvitina C i (B) dap B u plućima svinje, nakon aerosolne isporuke vode za injektiranje pomoću raspršivača (nebulizatora).
Slika 48. Prikazuje višestruku in situ detekciju nukleinske kiseline (A) ubikuitina C i (B) dap B u plućima svinje, nakon aerosolne isporuke 1 mg FFL SNIM RNA 10 mg CO-CFTR SNIM RNA u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji.
Slika 49. Prikazuje višestruku in situ detekciju nukleinske kiseline (A) desnog kranijalnog i (B) levog kranijalnog režanja svinje, nakon aerosolne isporuke vode za injektiranje pomoću raspršivača (nebulizator).
Slika 50. Prikazuje višestruku in situ detekciju nukleinske kiseline (A) desnog kranijalnog i (B) levog kranijalnog režanja svinje, nakon aerosolne isporuke 1 mg FFL SNIM RNA 1 mg CO-CFTR SNIM RNA u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji.
Slika 51. Prikazuje višestruku in situ detekciju nukleinske kiseline (A) desnog kranijalnog i (B) levog kranijalnog režanja svinje, nakon aerosolne isporuke 1 mg FFL SNIM RNA 5 mg CO-CFTR SNIM RNA u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji. .
Slika 52. Prikazuje višestruku in situ detekciju nukleinske kiseline (A) desnog kranijalnog i (B) levog kranijalnog režanja svinje, nakon aerosolne isporuke 1 mg FFL SNIM RNA 10 mg CO-CFTR SNIM RNA u račvastoj 25 kDa PEI formulaciji.
Slika 53. Prikazuje pozitivnu detekciju aktivnog luciferaznog (FFL) proteina svica u tretiranim plućima svinje preko luminescencije a nakon izlaganja lipidnim nanočesticama cKK-E12 sa inkapsuliranim FFL/CO-CFTR-C-His10iRNK. Svinje su tretirane sa 1 mg FFL 9 mg CO-CFTR-C-His10 iRNK inkapsuliranim lipidnim nanočesticama putem raspršivanja (nebulizacija) koristeći Pari jet raspršivač i žrtvovane 24 sata nakon tretmana.
Slika 54. Ilustruje rezultate kao primer ekspresije hCFTR u HEK ćelijama transfektovanim pomoću nebulozovanin kompleksa datih svinjama 10, 11, i 12 (doza 1 mg).
Slika 55. Ilustruje rezultate kao primer ekspresije hCFTR u HEK ćelijama transfektovanim pomoću nebulozovanin kompleksa datih svinjama 13, 14, i 15 (doza 5 mg) i u HEK ćelijama transfektovanim pomoću nebulozovanin kompleksa datih svinjama 19, 20, i 21 (doza 10 mg).
Slika 56. Ilustruje rezultate kao primer ekspresije hCFTR u HEK ćelijama transfektovanim pomoću nebulozovanin kompleksa datih svinjama 16 (5 mg doza), 22 (10 mg doza) i 67 (1 mg doza).
Slika 57. Ilustruje rezultate kao primer ekspresije hCFTR u HEK ćelijama transfektovanim pomoću nebulozovanin kompleksa datih svinjama 17, 18 (5 mg doza), 23, 24 (10 mg doza) i 68, 69 (1 mg doza).
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Definicije
[0030] Kao što se ovde koristi izraz "polinukleotid" se generalno koristi da bi se odnosio na nukleinsku kiselinu (na ili DNK ili RNK). Izrazi polinukleotid, nukleinska kiselina, DNK, RNK i iRNK uključuju takve molekule koji se sastoje od: standardnih ili nemodifikovanih ostataka; nestandardnih ili modifikovanih ostataka; i mešavine standardnih i nestandardnih ostataka.
[0031] Kao što se ovde koristi, izraz "iRNK" ovde se koristi da bi se odnosio na modifikovanu i nemodifikovanu RNK uključujući oba i kodirajući i nekodirajući region.
[0032] Kao što se ovde koristi, izraz "kodirajući region" iRNK generalno se odnosi na deo koji kada se prevede dovodi do proizvodnje ekspresionog proizvoda, kao što je polipeptid, protein, ili enzim.
[0033] "Nestandardna nukleobaza" je baza koja je druga u odnosu na prirodne baze adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T), ili uracil (U). Nestrandardna nukleobaza je analog specifične nukleobaze (A, C, G, T, ili U) kada su njegova svojstva sparivanja u okviru duplog heliksa nukleinskih kiselina i mesto ugradnje DNK ili RNK polimeraza u okviru duplog heliksa nukleinskih kiselina (uključujući lokalni DNK-RNK heliks kao onaj koji se formira tokom transkripcije (prepisivanja) DNK matrice od strane RNK polimeraze) najsličnij jednoj od pet prethodno nabrojanih nukleobaza, sa izuzetkom da će analozi T takođe biti analozi U i vice versa. Za potrebe odreživanja procenta identičnosti prve sekvence u odnosu na drugu sekvencu, analog baze nije pogrešno poklapanje sa prirodnom bazom; na primer, pseudouridin odgovara uridinu, 5-metilcitidin odgoara citidinu, itd.
[0034] Izraz "nestandardna" kada se koristi zajedno sa izrazima uključujući ali bez ograničavanja na "nukleozid", "nukleotid", ili "ostatak" treba da se interpretiraju na isti način kao da se koriste u konjukciji sa "nuklebazom".
[0035] "GC sadržaj" je frakcija ili procenat ukupnih nukleobaznih ostataka u sekvenci nukleinske kiseline koji su gvaninski ostaci, citozinsku ostaci ili njihovi analozi. Na primer, sekvenca od 100 nukleotida koja sadrži tačno 30 citozina, tačno 30 gvanina, tačno jedan analog citozina, i tačno jedan analog gvanina ima GC sadržaj od 62%.
[0036] Kao što se ovde koristi, "manje favorizovan kodon" koji se prevodi manje efikasno ili manje brzo od strane sisarske ćelije nego drugi kodon istog amino kiselinskog ostatka. Manje favorizovani kodoni generalno uključuju kodone sa A ili U na trećoj ili "wobble" poziciji kodona. Za diskusiju o manje favorizovanim kodonima, videti na primer ., U.S. patentnu publikaciju 2009/0069256 A1.
[0037] "RNK molekul koji se ne nalazi u prirodi " je iRNK koja se ne proizvede u toku normalne transkripcije (prepisivanja) i procesa obrade (splajsovanja) u originalnim (wild type) ćelijiama. iRNK se može kvalifikovati kao ona koja se ne može naći u prirodi u smislu njegove sekvence (na primer serije kodona i/ili jedne ili više UTR-ova koji se ne nalaze u prirodnoj CFTR iRNK i/ili jer uključuju nestandardne nukleotidne ostatke. RNK molekul koji se ne nalazi u prirodi se može sintetisati in vitro.
[0038] U svakoj od tabela 1 i 2 koje se nalaze dole, NWT kolona ukazuje na ne-divlju (non wild type) bazu na poziciji (Poz) u CFTR kodirajućoj sevenci (videti na pr: SEQ ID NO: 3), I WT kolona ukazje na bazu divljeg tipa na istoj poziciji (videti na pr. SEQ ID NO: 2 ili RefSeq unos za humani CFTR (broj pristupa NM_000492.3, Feb. 10, 2013, verzija, dostupna u GenBank; obratiti pažnju da sekvenca NM_000492.3 sadrži nekodirajuću sekvencu tako da se kodirajuća sekvenca pojavljuje napoziciji 133 do 4575, tako da na primer, pozicija 7 u tabeli dole odgovara poziciji 139 NM_000492.3).
CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi
[0039] Kao dodatak obezbeđivanju postupaka za proizvodnju CFTR in vivo pomoću prirodne ili divlje (wild type) CFTR iRNK (i kompozijije koje sadrže tu iRNK), otkriće takođe obezbeđuje CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi koja kodira CFTR protein (na primer SEQ ID NO:1). U nekim ostvarenjima CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi je prčišćen ili izolovan.
[0040] U drugim ostvarenjima, CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi je prisutna u ćeliji. U nekim ostvarenjima, ćelija koja sadrži CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi nije sintetisala CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi i/ili ne sadrži DNK komplementarnu CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi i/ili funkcionalan CFTR gen; ćelija opcionalno može da sadrži neaktivan CFTR gen kao što je CFTR gen sa "nonsense", "missense", "frameshift", insercionom ili delecionom mutacijom koja dovodi do nefunkcionalnog proizvoda gena. U nekim ostvarenjima ćelija koja sadrži CFTR iRNK molekul koji se ne nalazi u prirodi dalje sadrži funkcionalan CFTR protein koji je preveden sa CFTR iRNK molekula koji se ne nalazi u prirodi. Ćelija može biti na primer, epitelijalna ćelija, ćelija jetre, ili ćelija bubrega. U nekim ostvarenjima ćelija je ćelijska kultura.
CFTR kodirajuća sekvenca
[0041] CFTR iRNK koja je ovde opisana sadrži kodirajuću sekvencu sa manje komplemenata kriptičkih promotera nego SEQ ID NO: 2 (to jest kodirajuća sekvenca divljeg tipa humanog CFTR), manje direktnih i/ili invertovanih ponovaka nego SEQ ID NO: 2, manje nefavorizovanih kodona nego SEQ ID NO: 2 i/ili GC sadržaj kodirajuće sekvence koji je niži nego GC sadržaj SEQ ID NO: 2.
[0042] Kriptični promotori, direktni i/ili invertovani ponovci i/ili nefavorizovani kodoni sekvence mogu biti prepoznati od strane stručnjaka Iz oblasti upotrebom rutinskih postupaka. Na primer, direktni i/ili invertovani ponovci koji se nalaze u sekvenci mogu se utvrditi analizom sekvenci (Liu et al., JouRNKl of Theoretical Biology (2014) 344: 19-30). Sadržaj kriptičnog promotora u sekvenci takođe se može odrediti analizom sekvence, na primer prisustvo Shine-Dalgarno sekvenci u konstruktu ili sličnom.
[0043] CFTR iRNK na osnovu pronalaska se in vitro transkribuje (prepisuje) to jest iRNK je sintetisana u veštačkoj postavi, a ne u živoj ćeliji (na primer in vitro transkripcioni sistem bez ćelije). Uopšteno in vitro transkripcija uključuje obezbeđivanje DNK matrice koja sadrži promoter i sekvencu komplementarnu željenoj iRNK (koja može biti cirkularna ili linearna), RNK polimerazu, nukleozid trifosfat u pogodnom reakcionom okruženju (soli, puferi, i temperaturu). RNK inhibitori, redukujući agensi, i/ili polifosfati takođe mogu biti prisutni u reakcionoj mešavini. U nekom ostvarenjima, RNK polimeraza je T7 RNK polimeraza.
Tabela 1. Baze nedivljeg tipa koje mogu biti korišćene za kodiranje iRNK sekvence CFTR-a. Pos – pozicija; WT- divlji soj; NWT- ne-divlji soj
Tabela 2. Podset baza ne-divljeg tipa koje mogu biti korišćene za kodiranje iRNK sekvence CFTR-a. Pos – pozicija; WT- divlji soj; NWT- ne-divlji soj
[0044] Ovaj pronalazak obuhvata CFTR iRNK koja se ne nalazi u prirodi koja obuhvata kodirajuću sekvencu SEQ ID NO:3 za upotrebu u tretmanima cistične fibroze u sisarima. Dodatni primeri kodirajućih sekvenci CFTR iRNK koja se ne nalazi u prirodi opisani u Kratkom opisu dela Sekvence, kao, na primer, SEQ ID NOs:9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17. U nekim ostvarenjima ovaj pronalazak obezbeđuje CFTR iRNK koja sadrži kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična bilo kojoj od SEQ ID NO: 3. U nekim ostvarenjima CFTR iRNK koja se ne nalazi u prirodi obuhvata 5’UTR, 3’UTR, kodirajuću sekvencu za signalni peptid ili kapu ili strukturu repa kao što je dole opisano.
[0045] Gore opisana CFTR iRNK koja obuhvata kodirajuću sekvencu koja se razlikuje od CFTR kodirajuće sekvence divljeg tipa može da obezbedi prednosti u smislu efikasnosti i lakoće pripreme. Na primer,reakcije in vitro transkripcije pomoću polinukleotida koji obuhvata sekvencu matricu koja je komplementarna sa CFTR kodirajućom sekvencom može dati veći prinos RNK; polinukleotid koji obuhvata pomenutu sekvencu matricu biti stabilnija (to jest manje sklona mutacijama) tokom rasta u domaćinskoj ćeliji, redukujući količinu prečišćavanja neophodnog za generisanje matrice koja se koristi u reakciji; i in vivo translacija (prevođenje) iRNK koja obuhvata kodirajuću sekvencu može biti veća.
Sekvenca signalnog peptida
[0046] U nekim ostvarenjima, iRNK CFTR proteina ugrađuje nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid. Kao što se ovde koristi izraz "signalni peptid"odnosi se na preptid prisutan u novo sintetisanom proteinu koji može da usmerava protein ka sekretornom putu. U nekom ostvarenjima, signalni peptid se iseca nakon translokacije u endoplazmatični retikulumu nakon translacije iRNK. Signalni peptid se takođe pominje kao signanlna sekvenca, lider sekvenca ili lider peptid. Tipično, signalni peptid je kratak (na pr., 5-30, 5-25, 5-20, 5-15, ili 5-10 amino kiselina dugačak) peptid. Signalni peptid može biti prisutan na N termnusu (kraju) nov sintetisanog proteina. Bez želje da se veže za neku odreženu teoriju, ugradnja kodirajuće sekvence za signani peptid u iRNK koja kodira CFTR može olakšati sekreciju i/ili proizvodnju CFTR proteina in vivo.
[0047] Pogodan signalni peptid za upotrebu u ovom pronalasku može biti heterogena sekvenca izvedena od različitih eukariotskih i prokariotskih proteina, posebno sekretovanih proteina. U nekim ostvarenjima, pogodan signalni peptid je sekvenca bogata leucinom. Videti Yamamoto Y et al. (1989), Biochemistry, 28:2728-2732. Pogodan signalni peptid može biti izveden od humanig hormona rasta (hGH), preproteina serum albumina, prekursora lakog lanca Ig kappa, proprotein azuroricidina, prekursora cistatina-S, prekursora tripsinogena 2, blokatora kalijumovog kanala, alfa konotoksina 1p1.3, alfa konotoksin, alfa galaktozidaze, celilaze, aspartične proteinaze nepentensina-1, kisele hitinaze, K28 prepro toksina, prekursora kiler toksina zigocina, i toksina kolere. Primeri peptidne sekvence opisani su u Kober, et al., Biotechnol. Bioeng., 110: 1164-73, 2012.
[0048] U nekim ostvarenjima iRNK koja kodira CFTR može da obuhvata sekvencu koja kodira signalni peptid koji je izveden od humanig hormona rasta (hGH), ili njegovog dela. Ne limitirajuća kodirajuća nukleotidna sekvenca koja kodira hGH signalni peptid je prikazana dole.
5’ sekvenca humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO:18):
Alternativna sekvenca 5’ humanog hormona rasta (hGH) (SEQ ID NO:19):
[0049] U nekim ostvarenjima iRNK na osnovu ovog pronalaska mogu da ugrade signalni peptid koji kodira sekvencu koja je najmanje 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa SEQ ID NO:18 or SEQ ID NO:19.
5’-UTR, 3’-UTR, Poly-A rep, kappa i nestandardni nukleotidni ostaci
[0050] U nekim ostvarenjima iRNK obuhvata sekvencu na njenom 5’-UTR kraju koji je identičan sa SEQ ID NO: 4 ili najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 4.
[0051] U nekim ostvarenjima iRNK obuhvata sekvencu na njenom 3’-UTR kraju koji je identičan sa SEQ ID NO: 5 ili najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, ili najmanje 99% identičan sa SEQ ID NO: 5.
[0052] U nekim ostvarenjima iRNK obuhvata poli-A rep. U nekim ostvarenjima, poli-A rep ima dužinu od najmanje 70, 100, 120, 150, 200, 250, 300, 400, ili 500 ostataka. U nekim ostvarenjima, poli-A rep ima dužinu u opsegu od 70 do 100, 100 do 120, 120 do 150, 150 do 200, ili 200 do 300, 300 do 400, ili 400 do 500 ostataka. Poli A repovi se mogu dodati pomožu različitih tehnika poznatih u oblasti. Na primer, dugi poli A repovi mogu se dodati na sintetički ili in vitro prepisanu RNK pomoću poli A polimeraze Yokoe, el al. Nature Biotechnology. 1996; 14: 1252-1256). Transkripcioni vektor može takođe da kodira duge poli A repove. Dodatno, poli A repovi mogu se dodati transkripcijom direktno iz proizvoda PCR-a (polymerase chain reaction, lančana reakcija polimeraze). Poli A se mođe povezati (ligirati) za 3’ kraj sense (koja se čita) RNK sa RNK ligazom (videti na primer, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1991 edition)). U nekim ostvarenjima, pol-U ili poli-C rep se može koristiti umesto ili kao dodatak poli-A repu. Na primer, CFTR kodirajuće RNK mogu uključiti 3’ poli(C) strukturu repa. Pogodan poli-C rep na 3’ terminusu iRNK tipično obuhvata oko 10 do 200 citozinskih nukleotida (na primer oko 10 do 150 citozinskih nukleotida, oko 10 do 100 citozinskih nukleotida, oko 20 do 70 citozinskih nukleotida, oko 20 do 60 citozinskih nukleotida, ili oko 10 do 40 citozinskih nukleotida). Poli-C rep se može dodati na poli-A rep ili može zemeniti poli-A rep.
[0053] U nekim ostvarenjima iRNK obuhvata 5’-kapu, na primer, cap1 strukturu. Za enzime koji dodaju kapu na iRNK I odgovarajuće procedure videti na primer, Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNK cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249; European patent publication 2 010 659 A2; U.S. Patent No. 6,312,926. 5’ kappa se tipično dodaje na sledeći način: prvo RNK terminalna fosfataza uklanja jednu od terminalnih fosfatnih grupa sa 5’ nukleotida, ostavljajući dva terminalna fosfata: gvanozin trifosfat (GTP) se zatim dodaje na terminalne fosfate preko gvanilil transferaze, proizvodeći 5’5’5 trifosfatne veze; I 7-azot gvaninina se zatim metiluje od strane metil transferaze. Primeri structure kape uključuju, ali nisu limitirane na njih m7G(5’)ppp (5’(A,G(5’)ppp(5’)A i G(5’)ppp(5’)G.
[0054] U nekim ostvarenjima iRNK obuhvata jedan ili više nestandardnih nukleotidnih ostataka. Nestandardni nukleotidni ostaci mogu uključiti na primer., 5-metil-citidin ("5mC"), pseudouridin ("�U"), i/ili 2-tio-uridin ("2sU"). Videti na primer U.S. Patent No. 8,278,036 ili WO2011012316 za diskusiju o takvim ostacima I njihovoj ugradnji u iRNK. U nekim ostvarenjima, iRNK može biti SNIM RNK. Kao što se ovde koristi, SNIM RNK je akronim za stabilozovanu neimunogenu informacionu RNK (stabilized nonimunogenic information RNA), određene informacione RNK proizvedene in vitro transkripcijom (IVT) uključujući određene procente modifikovanih nukleotida u ICT reakciji kao što je opisano u PCT Publication WO 2011/012316. SNIM RNK korišćena u primerima koji su ovde otkriveni proizvedena je IVT u kojoj je 25% U ostataka bilo 2-tio.uridin I 25% C ostataka je bilo 5-metilcitidin. Prosustvo nestandardnih nukleotidnih ostataka mož učiniti iRNK stabilnijom i/ili manje imunogenom od kontrolne iRNK sa istom sekvencom ali u sadržaju samo sa standardnim ostacima. U daljim ostvarenjima, iRNK može obuhvatiti jedan ili više nestandardnih nukleotidnih ostataka odabranih od izocitozina, pseudo izocitozina, 5-bromouracial, 5-propiniluracila, 6-aminopurina, 2-aminopurina, inozina, diaminopurina i 2-hloro- 6-aminopurin citozina, kao i kombinacije od ovih modifikacija i drugih nukleobaznih modifikacija. Određena ostvarenja mogu dalje uključiti dodatne modifikacije na furanoznom prstenu ili nukleobazi. Dodotane modifikacije mogu uključiti na primer, modifikacije šećera ili substitucije (na primer, jednu ili više 2’-O-alkil modifikacija, zaključanu nukleinsku kiselinu (locked nucleic acid-LNA)). U nekim ostvarenjima RNK mogu biti u kompleksu ili hibridizovane sa dodanim polinukleotidima i/ili peptidnim polinukleotidima (PNA). U ostvarenjima gde je modifikacija šećera 2’-O-alkil modofikacija, ovakva modifikacija može uključiti ali nije ograničena samo na to, 2’-deoksi-2’-fluoro modifikaciju, a 2’-O-metil modifikaciju, 2’-O- metoksietil modifikaciju i 2’-deoksi modifikaciju. U određenim ostvarenjima ove modifikacije mogu biti prisutni 0-100% nukleotida, na primer više od 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95%, ili 100% od pojedinačnih konstituentnih nukleotida ili u kombinaciji.
Kompozicije koje obuhvataju CFTR iRNK
[0055] U određenim ostvarenjima, molekuli iRNK mogu se davati kao gole ili neupakovane iRNK. U nekim ostvarenjima, davanje iRNK u kompozicijama pronalaska može biti olakšana uključivanjem pogodnog nosača. U određenim ostvarenjima, nosač je odabran na osnovu njegove sposobnosti da olakša transfekciju ciljanih ćelija sa jednom ili više iRNK.
[0056] Kao što se ovde koristi, izraz "nosač" uključuje bilo koje standardne farmaceutske nosače, vozila, razblaživače, ekscipijente i slične koji se generalno koriste u vezi sa davanjem biološki aktivnih agenasa, uključujući iRNK.
[0057] U određenim ostvarenjima, nosaći koji se koriste u kompozicijama pronalaska mogu obuhvatiti lipozomalni nosač ili druge načine koji olakšavaju transfer iRNK do ciljnih ćelija i/ili tkiva. Pogodni nosači uključuju ali nisu ograničeni samo na njih, nosači bazirani na polimeru, kao što je polietilenimin (PEI), i polimeri sa više domesnkih blokova, lipidne nanopartikule i lipozomi, nanolipoomi, nanolipozomi koji sadrže keramid, proteolipozomi, uključujući i prirodne i sintetički dobijene egzozome, prirodna, sintetička i polusinetička lamelarna tela, nanopartikulati, kalcijum-fosforsilikatni nanopartikulati, kalcijum fosfat nanopartikulati, nanopartikulati silicijum dioksida, nanokristalini partikulati, poluprovodni nanopartikulati, suvi puderi, poli (D-arginin), nanodendrimeri, sistemi za dostavu bazirani na skrobu, micele, emulzije, sol gelovi, nizomi, plazmidi, virusi, kalcijum fosfatni nukleotidi, aptameri, peptid, peptidni konjugati, konjugati ciljani malim molekulima, i drugi vektorski dodaci. Takođe detaljno je obrađena i upotreba bionanokapsula i drugih tvorevina viralnih proteina kapsida kao pogodnog nosača. (Hum. Gene Ther.2008 Sep;19(9):887-95).
[0058] U nekim ostvarenjima, nosač obuhvata organski katjon, kao što je katjonski lipid ili katjonski organski polimer. Ukoliko je prisutan, katjonski lipid može biti komponenta lipozomalnih vezikula koje inkapsuliraju iRNK.
[0059] U određenim ostvarenjima pronalaska, nosač je formulisan pomoću polimera kao nosača, samog ili u kombinaciji sa drugim nosačima. Pogodni polimeri mogu uključivati na primer, poliakrilate, polialkicianoakrilat, polilaktid, polilaktid-poliglikolid kopolimere, polikaprolaktone, dekstran, albumin, želatin, alginat, kolagen, hitosan, ciklodekstrine, protamin, PEGilovan protamin, PLL, PEGilovan PLL i polietilenimin (PEI). Kada je PEI prisutan, može biti razgranat PEI molekulske mase u opsegu od 10 do 40 kDa, na primer., 25 kDa razgarant PEI (Sigma #408727). Dodatni primeri polimera pogodnih za ovaj pronalazak uključuju one opisane u PCT Publication WO2013182683.
[0060] Upotreba lipozomalnih nosača u olakšanju dostave polinukleotida do ciljanih ćelija je razmatrana u ovom pronalasku. Lipozomi (na primer lipzoomalne lipidne nanopartikule) su generalno korisne u različitim aplikacijama u istraživanjima, industriji, i medicine, posebno za njihovu upotrebu kao nosača dijagnostičkih ili terapeutskih komponenti in vivo (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998; Drummond et al., Pharmacol. Rev., 51: 691-743, 1999) i najčešće ih karakterišu mikroskopske vezikule koje imaju unutrašnji vodeni prostor koji je od spoljnjeg medijuma odvojen membranom od jednog ili dva sloja. Dvoslojne membrane lipozoma se tipično formiraju od strane amfifiličnih molekula, kao što su lipidi bilo prirodnog ili sintetičkog porekla koji sadrže prostorno odvojene hidrofilne i hidrofobnr domene (Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). Dvoslojne membrane lipozima mogu se takođe formirati od strane amfifiličnih polimera i surfaktnata (na primer polimerozomi, niozomi,..itd).
[0061] U određenim ostvarenjima, iRNK je u kompleksu sa nanopartikulama kako bi se olakšala dostava do ciljne ćelije. U određenim ostvarenjima, kompozicije pronalaska mogu se kombinovati sa multi-komponentskom mešavinom lipida u kojoj se upotrebljava jedan ili više katjonskih lipida, dodatni lipidi kao ne katjonski lipidi (označeni su i kao pomoćni lipidi), lipidi na bazi holesterola, i-ili PEGilovani lipidi za inkapsulaciju iRNK.
Katjonski lipidi
[0062] U nekim ostvarenjima, pogodna nanopartikula sadrži katjonski lipid. Kao što se ovde koristi, fraza "katjonski lipid" odnosi se na bilo koju od brojnih vrsta lipida koji imaju pozitivnu ukupnu šaržu (naelektrisanje) na odbranoj pH, kao što je fiziološka pH. Neki katjonski lipidi, pogotovu, oni poznati kao titrabilni ii pH-titrabilni katjonski lipidi su posebno efektni u dostavi iRNK. Nekoliko katjonskih (na primer titrabilni) lipida je opisano u literature a mnogi od njih su i komercijalno dostupni. Posebno pogodni katjonski lipidi za upotrebu u kompozicijama pronalaska uključuju one opisane u internacionalnoj patentnoj publikaciji WO 2010/053572 (i posebno, C12-200 opisan u paragrafu [00225]) i WO 2012/170930. U nekim ostvarenjima, katjonsku lipid cKK-E12 se koristi (otkriveno u WO 2013/063468). U nekim ostvarenjima, katjonski lipid, N-[1-(2,3-dioleiloksi)propil]-N,N,N-trimetilamonium hlorid ili "DOTMA" se koristi. (Feigner et al. (Proc. Nat’l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); U.S. Pat. No.4,897,355). DOTMA može biti formulisan sam ili u kombinaciji sa neutralnim lipidom, Dioleoilfosfatidil-etanolaminom ili "DOPE" ili drugim katjonskim ili ne katjonskim lipidima u lipozomalnom transfernom sredstvu ili lipidnoj nanopartikuli, i takvi lipozimi mogu se koristiti da pojačaju dostavu nukleinskih kiselina u ciljanu ćeliju. Drugi pogodni katjonski lipidi uključuju, na primer 5karboksispermilglicindioktad-cilamid ili "DOGS,"2,3-dioleiloksi-N-[2(sperminkarboksamido)etil]-N,N-dimetil-1-propanaminium ili "DOSPA" (Behr et al. Proc. Nat.’l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); U.S. Pat. No. 5,171,678; U.S. Pat. No. 5,334,761), 1,2-Dioleoil-3- Dimetilamonium-Propan ili "DODAP", 1,2-Dioleoil-3-Trimetilamonium-Propan ili "DOTAP". Kontemplovani katjonski lipidi takođe uključuju 1,2-disteariloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DSDMA", 1,2-dioleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DODMA", 1,2-dilinoleiloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DLinDMA", 1,2-dilinoleniloksi-N,N-dimetil-3-aminopropan ili "DLenDMA", N-dioleil-N,N-dimetilamonium hlorid ili "DODAC", N,N-distearil-N,N-dimetilarnrnonium bromid ili "DDAB", N-(1,2-dimiristiloksiprop-3-il)-N,N-dimetil-N-hidroksietilamonium bromid ili "DMRIE", 3-dimetilamino-2-(holest-5-en-3-beta-oksibutan-4-oksi)-1-(cis,cis-9,12-oktadekadienoksi) propan ili "CLinDMA", 2-[5’-(holest-5-en-3-beta-oksi)-3’-oxapentoksi)-3-dimeti 1-1-(cis,cis-9’, 1-2’-oktadekadienoksi) propan ili "CpLinDMA", N,N-dimetil-3,4-dioleiloksibenzilamin ili "DMOBA", 1,2-N,N’-dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropane ili "DOcarbDAP", 2,3-Dilinoleoiloksi-N,N-dimetilpropilamin ili "DLinDAP", 1,2-N,N’-Dilinoleilkarbamil 3- dimetilaminopropan ili "DLincarbDAP", 1,2-Dilinoleilkarbamil-3-dimetilaminopropan ili "DLinCDAP", 2,2-dilinoleyl-4-dimetilaminometil-[1,3]-dioksolan ili "DLin- -DMA", 2,2-dilinoleil-4-dimetilaminoetil-[1,3]-dioksolane or "DLin-K-XTC2-DMA", i 2-(2,2-di((9Z,12Z)-oktadeka-9,12-dien-1-yl)-1,3-dioksolan-4-il)-N,N-dimetiletanamin (DLin-KC2-DMA)) (Videti, WO 2010/042877; Semple et al., Nature Biotech. 28: 172-176 (2010)), ilinjihove mešavine. (Heyes, J., et al., J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., et al., Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); PCT Publication WO2005/121348A1).
[0063] U određenim ostvarenjima, kompozicije pronalaska upotrebljavaju lipidne nanopartikule koje obuhvataju jonizujuće katjonske lipide opisane u U.S. proviionalnoj patentnoj prijavi 61/617,468, popunjenoj 29. Marta 2013, kao na primer (15Z, 18Z)-N,N-dimetil-6-(9Z, 12Z)-okta-9, 12-dien-1-il)tetrakoza-15,18-dien-1-amin (HGT5000), (15Z, 18Z)-N,N- dimetil-6-((9Z, 12Z)-oktadeka-9, 12-dien-1-il)tetrakoza-4,15,18-trien-1-amin (HGT5001), i (15Z,18Z)-N,N-dimetil-6-((9Z, 12Z)-oktadeka-9, 12-dien-1-il)tetrakoza-5, 15, 18-trien-1-amin (HGT5002).
[0064] U nekim ostvarenjima, jedan ili više katjonksih lipida koji su prisutni u takvoj kompoziciji sadrži najmanje jedan od imidazola, dialkilamino ili gvanidinijum delova. U poželjnom ostvarenju jedan ili više katjonskih lipida ne sadrži kavterni amin.
Ne-katjonski/pomoćni lipidi
[0065] U nekim ostvarenjima pogodna lipidna nanopartikula sadrži jedan ili više nekatjonskih ("pomoćnih") lipida. Kao što se ovde koristi "ne-katjonksi lipid" odnosi se na bilo koji neutralni, ‘zwitter’ jonski ili anjonski lipid. Kao što se ovde koristi, izraz "anjonski lipid" odnosi se na bilo koji od brojnih lipidnih vrsta koje nose negativno naelektrisanje (šaržu) na odabranoj pH, kao što je fiziološka pH. U nekim ostvarenjima, ne-katjonski lipidi je neutralni lipid to jest lipid koji ne nosi ukupunu šaržu (punjenje) u uslovima u kojima je kompozicija formulisana i-ili davana. Nekatjonski lipidi uključuju ali nisu na njih limitirani, distearoilfosfatidilcholin (DSPC), dioleoilfosfatidilcholin (DOPC), dipalmitoilfosfatidilholin (DPPC), dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG), dipalmitoilfofatidilglicerol (DPPG), dioleoilfosfatidiletanolamin (DOPE), palmitoiloleoilfosfatidilholin (POPC), palmitoiloleoilfosfatidiletanolamin (POPE), dioleoil-fosfatidiletanolamin 4-(N-maleimidometil)-cicloheksan-1-karboksilat (DOPE-mal), dipalmitoil fosfatidil etanolamin (DPPE), dimiristoilfosfoetanolamin (DMPE), distearoiliosfatidiletanolamin (DSPE), 16-O-monometil PE, 16-O-dimetil PE, 18-1-trans PE, 1-stearoil-2-oleoil-fosfatidietanolamin (SOPE), ili za njihovu mešavinu.
Lipidi na bazi holestreola
[0066] U nekim ostvarenjima, pogodne pipidne nanopartikule obuhvataju jedan ili više lipida na bazi holesterola. Na primer, pogodni katjonski lipidi na bazi holesterola uključuju na primer, holesterol, PEGilovan holesterol, DC-Choi (N,N-dimetil-N-etilkarboksamidoholesterol), 1,4-bis(3-N-oleilamino-propil)piperazin (Gao, et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf et al. BioTechniques 23, 139 (1997); U.S. Pat. No.5,744,335), ili ICE.
PEGilovani lipidi
[0067] U nekim ostvarenjima, pogodne lipidne nanopartikule obuhvataju jedan ili više PEGilovanih lipida. Na primer, upotreba polietilen glikolom (PEG) modifiovanih fosfolipida i derivatizovanih lipida kao što su derivatizovani ceramidi (PEG-CER) uključujući N-Oktanoil-Sfingozin-1-[Sukcinil(Metoksi Polietilen Glicol)-2000] (C8 PEG-2000 ceramid) je kontemplirana u ovom pronalasku u kombinaciji sa jednim ili više katjonskih i u nekim ostvarenjima drugim lipidima. U nekim ostvarenjima, pogodni PEGilovani lipidi obuhvatju PEG-ceramid koji imaju kraće acil lance (na primer C14ili C18). U nekim ostvarenjima, može se koristiti PEGilovani lipid DSPE-PEG-Maleimid-Lektin. Drugi kontemplovani PEGom modifikovani lipidi uključuju, ali nisu limitirani na njih polietilenski glikolni lanac dužine do 5 kDa koji je konvencionalno vezan sa lipidom preko alkilnog(ih) lancem (lancima) C6-C20dužine. Bez želje da se veže za bilo koju teoriju, kontemplovano je da dodavanje PEGilovanog lipida može sprečiti agregaciju kompleksa i povećati vreme trajanja kruženja (circulation life time) kako bi se olakšala dostava iRNK inkapsulirane u lipozomu do ciljne ćelije.
[0068] U određenim ostvarenjima kompozicija obuhvata jednu od sledećih kombinacija lipida:
C12-200, DOPE, holesterol, DMG-PEG2K;
DODAP, DOPE, holesterol, DMG-PEG2K;
HGT5000, DOPE, holesterol, DMG-PEG2K;
HGT5001, DOPE, holesterol, DMG-PEG2K;
XTC, DSPC, holesterol, PEG-DMG;
MC3, DSPC, holesterol, PEG-DMG;
ALNY-100, DSPC, holesterol, PEG-DSG;
cKK-E12, DOPE, Chol, PEGDMG2K.
[0069] U nekim ostvarenjima odnosi lipid: iRNK mogu biti 5:1 (mg:mg), 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 i više sve do 30:1 (mg:mg) ili više. N/P odnos može biti u opsegu 1.1:1 do 10:1 ili više. Primer odnosa lipida je 40:30:20:10, 55:20:20:5, 50:25:20:5 (katjonski lipid:pomoćni lipid:hol:PEG lipid).
[0070] U nekim ostvarenjima, farmaceutske kompozicije na osnovu pronalaska ne obuhvataju mukolitičke agense (na primer, N-acetilcistein, erdostein, bromheksin, karbocistein, guiafenezin, ili jodiran glicerol).
Aparature napunjene sa farmaceutskom kompozicijom
[0071] U nekim ostvarenjima, farmaceutska kompozicija na osnovu pronalaska, kao kompozicija bazirana na katjonskom lipidu ili na PEI, obuhvata CFTR iRNK koja se ne nalazi u prirodi, obezbeđene je u aparatu za davanje u respiratorni sistem subjekta. Aparat moće biti na primer, aparat za instilaciju, aerosolizaciju ili raspršivanje. Pogodni aparati uključuju na primer, PARI Boy džet nebulizator, Aeroneb® Lab nebulizator, MicroSprayer®, ili EFlow mesh nebulizator. Alternativno, inhalatori za suvi puder ili aparati za aerosolizaciju kao što su prenosni inhalatori mogu se koristiti.
Upotrebe i postupci
iRNK za primene i postupci na osnovu pronalaska
[0072] Između ostalog, prezentovano otkriće obezbeđuje postupke za in vivo proizvodnju CFTR proteina, posebno u plućima sisara. U nekim ostvarenjima, otkriće pruža postupke za indukovanje ekspresije CFTR u epitelijalnim ćelijama u plućima sisara, koje obuhvata kontakt epitelijalnih ćelija sa farmaceutskim preparatom koji sadrži in vitro transkribovanu iRNK, gde in vitro transkribovana iRNK sadrži kodirajuću sekvencu koja kodira SEQ ID NO: 1. (aminokiselinska sekvenca humanog CFTR–divljeg tipa). Otkriće takođe omogućava upotrebu farmaceutskih preparata koje sadrže in vitro transkribovanu iRNK, pri čemu in vitro transkribovana iRNA sadrži sekvencu kodiranja koja kodira SEQ ID NO: 1., za indukciju CFTR ekspresije u epitelijalnim ćelijama u plućima sisara.
[0073] Opis dalje obezbeđuje postupke indukovanja CFTR ekspresije u sisarskoj ciljnoj ćeliji, postupak koji obuhvata kontakt ciljne ćelije sisara sa preparatom, preparat koji sadrži in vitro transkribovanu iRNK koja kodira sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1. Opis dalje omogućava upotrebu preparata, preparat koja sadrži in vitro transkribovanu iRNK koja kodira sekvencu aminokiselina SEQ ID NO: 1., za indukciju CFTR ekspresije u sisarskim ciljnim ćelijama.
[0074] Zapaženo je da vektori koji sadrže SEQ ID NO:2 često podležu mutacijama tipa insercija/delecija/premeštanja u ćelijama domaćina pod tipičnim uslovima rasta što rezultira heterogenom populacijom vektora koji se ne mogu direktno koristiti za transkripciju in vitro. Utvrđeno je da ćelije domaćina u fazi rasta pod uslovima kao što su niža temperatura, ublažena svetlost i/ili mali broj ćelija kao što je CopiCutter®, smanjuje, ali ne eliminiše pojavu mutacije. Prema tome, može se preporučiti za in vitro transkripcione reakcije sa iRNK koje sadrže kodirajuću sekvencu koja je najmanje 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO:2 da se koristi šablon dobijen rastvaranjem vektora kao što je gore opisano, sakupljanje i linearizovanje vektora i prečišćavanje željenih vrsta za upotrebu u transkripciji. Korak prečišćavanja može biti, na pr., ekskluzionu hromatografiju prema veličini ili slaba anjonska razmena.
[0075] Ovde opisana in vitro transkribovana iRNK za upotrebu i postupci mogu sadržati 5'-UTR, 3'-UTR, poli-A, poli-U i/ili poli-C rep, kapicu i/ili nestandardne nukleotidne ostatke, kao što je navedeno u gore pomenutom delu vezano za te karakteristike.
Farmaceutski preparati za primenu i postupci
[0076] Farmaceutski peparati za korišćenje prema pronalasku mogu da sadrže iRNK za primenu i postupci kao što je razmatrano u prethodnom odeljku i dodatne sastojke kao što je navedeno u prethodnom odeljku u vezi sa preparatima koje sadrže CFTR iRNK. Tako se razmatra upotreba i/ili davanje farmaceutskih preparata koje sadrže bilo koji od nosača koji su gore razmatrani.
[0077] U nekim poželjnim ostavrenjima farmaceutski preparati sadrže PEI, kao što je razgranati PEI koji ima molekulsku težinu u rasponu od 10-40 kDa, na primer, 25 kDa.
[0078]. U drugim poželjnim ostvarenjima, farmaceutski preparati sadrže katjonski lipid, pegilovani lipid i dodatni lipid (kao što je neutralni lipid). Katjonski lipid, PEGilovani lipid i/ili dodatni lipid mogu biti izabrani od onih navedenih u prethodnom odeljku u vezi sa preparatima koje sadrže CFTR iRNK.
Putevi davanja za indukciju ekspresije u plućima
[0079]. U nekim ostvarenjima postupaka i upotreba za indukciju CFTR ekspresije u plućima sisara, farmaceutski preparat, kao što je prethodno opisano, primenjuje se putem intratrahealne instilacije (ukapavanje kap po kap), raspršivanja i aerosolizacije. Aparat za davanje preparata može se izabrati između aparata navedenih u prethodnom odeljku u vezi sa aparatima koji su napunjeni farmaceutskim preparatom.
[0080] U poželjnim ostvarenjima, preparat se daje putem raspršivanja ili aerosolizacije. Neke lipidne formulacije mogu imati tendenciju agregiranja prilikom pokušaja raspršivanja, ali je generalno moguće rešiti probleme agregacije podešavanjem formulacije, npr. zamenom katjonskog lipida.
Tretman cistične fibroze
[0081] Između ostalog, prikazani pronalazak se može koristiti za lečenje cistične fibroze. U nekim ostvarenjima, prikazano otkriće obezbeđuje preparat za upotrebu u postupku lečenja cistične fibroze davanjem subjektu kome je potreban tretiman pomoću iRNK koja kodira CFTR protein kao što je ovde opisano ili farmaceutski preparat koji sadrži iRNK. iRNK ili farmaceutski preparat koji sadrži iRNK može se primenjivati direktno na pluća subjekta. Za prenos do pluća mogu se koristiti različiti putevi. U nekim ostvarenjima mRNA ili preparat koji sadrži iRNK koja je ovde opisana, se primenjuje inhalacijom, raspršivanjem ili aerosolizacijom. U različitim ostvarenjima, primena iRNK rezultira ekspresijom CFTR u plućima subjekta (npr. epitelijalne ćelije pluća).
[0082] U konkretnom ostvarenju, prikazano otkriće nudi preparat za upotrebu u postupku lečenja cistične fibroze davanjem u pluća subjektu kome je potrebno lečenje pomoću iRNK koja sadrži kodirajuću sekvencu SEQ ID NO: 1. Konkretno, prikazano otkriće obezbeđuje preparat za upotrebu u postupku lečenja cistične fibroze davanjem u pluća subjekta, kome je za lečenje potrebna iRNK koja sadrži kodirajuću sekvencu SEQ ID NO: 3. U drugim ostvarenjima, prikazano otkriće obezbeđuje preparat za upotrebu u postupku lečenja cistične fibroze davanjem u pluća subjektu koji zahteva tretman pomoću iRNK koja sadrži kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95% ili 99% identična sa SEQ ID NO: 3. Dodatni primeri ne-prirodnih CFTR iRNK (koje se ne nalaze u prirodi) koje se mogu koristiti za lečenje cistične fibroze su opisane u odeljku Kratak opis sekvence, kao što su, na primer, SEQ ID NO-jevi: 9, 10, 11, 12, 13 , 14, 15, 16 ili 17.
PRIMERI
[0083] Specifični primeri koji slede služe isključivo kao ilustracija, i nisu limitirajući za ostatak pronalaska ni na koji način. Bez dalje razrade, veruje se da osoba obučena u oblasti može da na osnovu ovog ovde opisa koristi ovaj pronalazak do krajnjih njegovih granica.
[0084] Ukoliko nije drugačije naznačeno, CFTR iRNK I SNIM RNK kopršćeni u primerima koji su ovde otkriveni obuhvatali su 5’ UTR sa sekvencom SEQ ID NO: 4, kodirajuću sekvencu (CDS) sa sekvencom SEQ ID NO: 3, i 3’ UTR sa sekvencom SEQ ID NO: 5.mFFL iRNK i SNIM RNK koji se koriste u primerima ovde otkrivenim obuhcvtaili su 5’ UTR, CDS, i 3’ UTR sa sekvencama SEQ ID NOS: 6, 7, i 8.
Primer 1: In Vitro sintetisana iRNA koja kodira CFTR
[0085] Sinetza informacione RNK. iRNK Humanog transmembranskog regulatora cistične fibroze i iRNK luciferaze svica (FFL) sintetisani su in vitro transkipcijom sa plazmidne DNK matrice koja kodira gen, nakon čega je sledio dodatak 5’ strukture kape (Cap 1) (Fechter, P.; Brownlee, G.G. "Recognition of mRNA cap structures by viral and cellular proteins" J. Gen. Virology 2005, 86, 1239-1249) i 3’ poly(A) repa od oko približno 200 nukleotida u dužini što je određeno elektroforezom na gelu. 5’ i 3’ netranslatirajući regioni su bili prisutniu svakom iRNK proizvodu.
[0086] Primeri CFTR iRNK koja se ne nalazi u prirodi uključuju SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, ili SEQ ID NO:17 opisani u okviru sekcije Kratak opis i Sekvence.
Primer 2: Ekspresija CFTR i aktivnost u HEK ćelijama
[0087] Ovaj primer pokazuje da kompletno funksionalan CFTR protein se eksprimira sa sintetičke CFTR iRNK koja je dostavljena ćelijama.
[0088] Ćelije i CFTR transfekcija. Humane embrionske bubrežne HEK293T ćelije su rasle u DMEM (Invitrogen Cat # 11965-092) sa dodatkom 10% fetanog seruma govečeta, 2 mM L-Glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Dan pre transfekcije, ćelije su zasejana na ploče sa 6 bunarčića u gustini 50-60% konfluentnosti i inkubirane pod normalnim uslovima za kulture tkiva (36°C u vlažnoj atmosferi 5% CO2, 95% vazduha). 60 µl Lipofectamina 2000 (Invitrogen Cat # 11668019) je razblaženo u 900 µl OptiMem redukovanog seruma medijuma (Invitrogen Cat # 31985-062) i lagano vorteksovano. 24 µg CFTR iRNA (4 mg po ploči) razblaženo je sa 900 μl OptiMem medijuma. iRNA je odmah dodata u razblažen Lipofektamin i inkubirana je na sobnoj temperaturi 30 minuta. Medijum za nanošenje na ploče je lagano aspiriran sa HEK293T ćelija i zamenjen sa 1 ml OptiMem Reduced Serum Medium.300 µl iRNA/Lipo- fektamin kompleksa je dodato u svaki bunarčić i ćelije su puštene da se odmore pod normalnim uslovima za gajenje tkiva tokom 24 sata nakon čega su presejane na ploče mehaničkim odvajanjem na poli-L-lizinom obložene staklene pokrovne pločice (BD Biosciences, BD Biocoat) tako da su se ćelije lako mogle prebaciti u komoru za snimanje i elektroforetskom snimanje. Ćelije su inkubirane pod normalnim uslovima za gajenje tkiva tokom minimum 24 sata i upotrebljene su u okviru 48 sati od finalnog zasejavanja na ploče.
[0089] Elektrofizioločko snimanje. Snimanje celih ćelija i ‘patch-clamp’ snimanje izvedeno je na sobnoj temperature pomoću Axopatch 200B pojačivača sa 5-8 M Ω elektroda. Podaci su digitalizovani (50 kHz) i filtrirani (5 kHz) na odgovarajući način. Serijski otpor je kompenzovan (70-80%) kako bi se minimalizovale greške u naponu. ‘Voltage-clamp’ snimanje je izvedeno sa pipetom i rastvorom sledeće kompozicije:140 mM NMDG-Cl; 5 mM EGTA; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES; pH 7.2; 310 mOsm/l. Rastvor za kupanje je sadržao: 140 mM NaCl, 3 mM KCl, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, i 10 mM HEPES; pH 7.3, podešeno na 315 mOsm/l sa D-glucose. ‘Voltage clamp’ snimanja počela su 3-5 minuta nakon uspostavljanja konfiguracije celih ćelija.
[0090] Ćelije su ‘voltage-clamped’ držećem potencijalu od ili -60 mV ili 0 mV I serije pozitivnih I negativnih koraka napona (ili -80 mV do 80 mV ili -100 do 100 mV u 20 mV povećanjima) injektovani u snimljene HEK293T ćelije da se izazovu CFTR indukovane celo-ćelijske (Cl-) hloridne struje. Membranski permeabilan analog cAMPu, 8-Br- cAMP (500 µM, Sigma Aldrich) je primenjen tokom 4 minuta na snimljenim ćeliaja da se olakša CFTR struja. Zlatni standard CFTR blokator, CFTRinh-172 (10 µM, Sigma) je primenjen na kraju svakog snimanja da se blokiraCFTR indukovana Cl- struja. Kontrolna snimanja su izvedena u netransfektovanim HEK293T ćelijama.
[0091] Test jedinjenja. Test jedinjenja su upotrebljena korišćenjem DAD-16VC brzog perfuzionog sistema (ALA Scientific Instruments, USA) sa pipetom za izbacivanje koja je postavljen približno 200 µm od ćelije koja se snima.8-Br-cAMP je napravljen kao 500 mM stok rastvor u DMSOu. Sva jedinjenja su čuvana na -20°C i brzo odmrzavana i rastvorena do finalne željene koncentracije odmah pre upotrebe.
[0092] Analiza. Sve analize su izvršene pomoću Clampfit (MDS Analytical Technologies) i Excel (Microsoft) softvera. Sve vrednosti su bile maksimalne izazvani vrh amplitude struje (evoked-peak current amplitude). Statističke razlike u podacima su proverene Studentovim t testom, uparenim ili neuparenim u skladu sa potrebama i smatrane su značajnim na P < 0.05.
[0093] In Vitro proizvodnja humanog CFTR Proteina. Proizvodnja humanog CFTR proteina via hCFTR iRNA je postignuta preko transfekcije humanih HEK293T ćelija sa CFTR iRNK kao što je ovde opisano. Tretirane i netretirane ćelije su pokupljene i podvrgnute postupcima imunoprecipitacije 24 sata nakon transfekcije. Detekcija humanog CFTR proteina preko Western blot analize demonstrira da je kompletan kompleks glikolizovanog CFTR proteina (označena ka "C" traka) proizveden od sintetičke insfromacione RNK (Slika 1).
[0094] In Vitro aktivnost humanog CFTR proteina. Da bi se odredila aktivnost CFTR proteina dobijenog od sintetičke CFTR iRNK nakon transfekcije ‘patch clamp’ eseji sa kompletnim ćelijama su izvedeni i u HEK 293 i u HEK 293T ćelijama. Tretirane ćelije kao i kontrolne ćelije (netretirane i lažno transfektovane) su podvrgnute aktivatornim (8-Br- cAMP, forskolin) i inhibitornim (CFTRinh-172, GlyH-101) supstratima kako bi se olakšalo određivanje promena u protoku struje (transport hloridnih jona)
[0095] HEK293T su tranfektovane sa 4 ug hCFTR iRNA i analizirane 24 sata nakon trnsfekcije. ‘Clamp’ eseji sa celim ćelijama izvedeni su da se izmeri protok struje kao što je prikazano preko transporta hloridnih jona nakon primene set napona. Dijagram struje vs napona kao rezultat ramp napona od -80 mV do 80 mV (prikazano na Slici 2) demonstrira značajne razlike u struji kada se uporede netretirane ćelije versus ćelije tretirane sa iRNK hCFTR. Ovaj rast u struji nakon izlaganja 8-Br-cAMP, poznatog aktivatora CFTR proteina, ukazuje na to da je humani CFTR protein prisutan u ćelijama. Nakon tretmana ovih prethodno transfektovanih ćelija sa poznatim specifičnim inhibitorom CFTR, CFTRinh-172, odgovarajuća struja pada natrag skoro do kontrolnih nivoa (<89% umanjenje). Ovakvo umanjenje nakon izlaganja inhibitoru jako podržava prisustvo humanog CFTR proteina. Ovi rezultati demonstriraju da sintetičja hCFTR iRNK može da proizvede aktivni humani CFTR protein.
[0096] Odvojeno esej određivanja aktivnosti kompletnih ćelija izveden je pomožu automatizovanog sistema (IonWorks) u HEK293 ćelijama. Kao što je gore opisano, tertirane ćelije kao i kontrolne ćelije (netretirane i lažno tretirane) podvrgnute su aktivatorskim i inhibitrskim supstratima da se odrede promene u protoku struje (transport hlordnih jona). U ovim studijama korišćen je forskolin kao aktivator CFTR proteina i deo hCFTR iRNA transfektovanih ćelija je dalje izlagan specifičnom CFTR inhibitoru GlyH-101. Za GlyH-101 se veruje da deluje kao blokator CFTR pora koji deluje nakon ekstracelularne membraneske strane proteina. Ova akcija i mehanizam je različit od onog od CFTRinh- 172, koji je prijavljen da funkcioniše od intracelularne strane CFTR proteina.
[0097] Slika 4 predstavlja dijagram struje i napona parentalnih (ishodnih) HEK293 ćelisjkih linija koje su tretirane sa forskolinom kao i sa GlyH-101. Nikakva značajna promena u struji nije primećena, što ukazuje na to da ovi specifični CFTR aktivatoriinhibitori nemaju efekat na endogene protein koji su prisutni u ćelijskim linijama.
[0098] Dijagram struja vs. napon kao rezultat naponskog ramp od -100 mV to 100 mV (prikazano na Slici 5) demostrira značajne razlike u struji kada se uporede netretirane HEK293 ćelije sa ćelijama transfektovanim sa hCFTR iRNK. Ovaj porast u struji nakon izlaganja forskolinu, poznatog aktivatora CFTR proteina, ukazuje na to da je humani CFTR protein prisutan u ovim ćelijama. Nakon tretmana ovih prethodno transfektovanih ćelija sa drugim poznatim specifičnim inhibitorom CFTR, GlyH-101, odgovarajuća struja pada natrag skoro do kontrolnih nivoa ( <95% umanjenje). Ovakvo umanjenj nakon izlaganja inhibitoru jako podržava prisustvo humanog CFTR proteina.
[0099] U totalu ovi podaci inhibicije, koji su rezultat dva različita odvojena mehanizma jako podržavaju identičnost kompletno funkcionalnog CFTR proteina koji je dobijen od sintetičke humane CFTR informacione RNK.
Primer 3: In Vivo ekspresija CFTR
[0100] Ovaj primer pokazuej da se CFTR protein efikasno eksprimira in vivo od CFTR kodirajuće iRNK koja je dostavljena preko plućne davanja.
[0101] Formulacioni protokol 1. Alikvoti od 50 mg/mL etenolnih rastvora C12-200, DOPE, Chol i DMG-PEG2K su pomešani i rastvoreni i razblaženi sa etanolom do finalne zapremine od 3 mL. Odvojeno vodeni puferski rastvor (10 mM citrat/150 mM NaCl, pH 4.5) CFTR iRNK pripremljena je od štoka od 1 mg/mL. Lipidni rastvor je injektiran brzo u vodeni rastvor iRNK i mešan do finalne suspenzije u 20% etanolu. Dobijena suspenzija nanopartikula je filtrirana, dijafiltrirana sa1x PBS (pH 7.4), zatim vodom, koncentrovana i čuvana na 2-8°C. Finalna koncentracija = 1.09 mg/mL CFTR iRNA (inkapsulirani). Zave= 80.2 nm (Dv(50)= 55.5 nm; Dv(90)= 99.6 nm).
[0102] Formulacioni Protokol 2. Alikvoti od 2.0 mg/mL vodenog rastvora PEI (razgranat, 25 kDa) pomešani su sa vodenim rastvorom CFTR iRNK (1.0 mg/mL). Dobijena kompleksna mešavina je pipetirana gore dole par purta i sklonjena sastrane 20 minuta pre injektiranja. Finalna koncentracija = 0.60 mg/mL CFTR iRNA (inkapsulirani Zave= 75.9 nm (Dv(50)= 57.3 nm; Dv(90)= 92.1 nm).
[0103] Analiza FFL i CFTR proteina proizvedenih via intratrahealno davanih iRNA-napunjenih nanopartikula. Sve studije su izvedene pomoću ili ženki BALB/C miševa ili CFTR KO miševa. FFL uzorci su uneti preko ili direktne instilacije (MicroSprayer®) ili raspršivanja (PARI Boy ili Aeroneb) odgovarajuće doze inkapsulirane FFL iRNK. CFTR IRNK je ubačena pomoću PARI Boy jet nebulizatora. Miševi su žrtvovani i perfuzija je urađena sa fiziološkim rastvorom nakon vremena ostavljenog za ekspresiju.
[0104] Intratrahealna davanje FFL mRNA. FFL testirani materijali su davani pomoću pojedinačne intratrahealne aerosolne davanja via MicrosprayerTM (50 µL/životinji) dok su životinje anestezirane sa intraperiotonealnom injekcijom mešavine ketamina 50-100 mg/kg i ksilazina 5-15 mg/kg.
[0105] Davanje raspršivanjem (aerosola) FFL iRNA. FFL test materijali su davani pomoću pojedinačne intratrahealne aerosolne davanja via Aeroneb® Lab nebulizera (nominalna zapremina doze do 8 mL/grupi). Test materijal je dostavljen do kutije koja sadrži celu grupu životinja (n=4) I povezana je sa kiseoničnim protokom i scavenger sistemom.
[0106] Davanje CFTR iRNA. CFTR iRNK je propremljena na način koji je opisan na Slici 6 dole. Četiri CFTR ‘knockout’ miša su stavljena u aerosolnu komoru i izložena su 2 mg totalno kodon optimizovanoj nemodifikovanoj huanoj CFTR iRNK (koja obuhvata kodirajuću sekvencu SEQ ID NO: 3) preko nebulizacije (Pari Boy jet nebulizator) tokom perioda od otprilike jednog sata. Miševi su žrtvovani 24 sata nakon izlaganja.
[0107] Eutanazija. Životinje su eutanazirane sa CO2asfiksijacijom u reprezentativnim momentima vremena nakon davanja doze ( ± 5%) nakon toraktomije i puštanja krvi. Kompletna krv (maksimalno dovijena zapremina) je sakupljena preko kardijačne punkture i bačena je.
[0108] Perfuzija. Nakon puštanja krvi sve životinje su podvrgnute kardijačnoj prerfuziji sa fiziološkim rastvorom. Ukratko, intrakardijačna perfuzija celog tela je izvedena insertovanjem 23/21 gavaže igle koja je vezna za šprice od 10 ml koji sadrži fiziološki rastvor podešen na zapreminu leve ventrikule za perfuziju. Desni atrijum je zasečen da bi se obezbedilo mesto odvoda dreniranja za perfuzat. Lagano i nežno i mirno je izvršen pritisak na klip da bi se izvršila perfuzije životinje nakon što je igla postavljena u srce. Adekvatni protok rastvora za ispiranje je obezbeđen kada je postojeći perfuzat postao bistar (bez vidljive krvi) ukazujući na to da je rastvor za ispiranje zasitio telo i procedura je kompletirana.
[0109] Sakupljanje tkiva. Nakon perfuzije životinjama su sakupljeni jetra i pluća (levo i desno krilo). Odabrane grupe su podvrgnute brzom smrzavanju otprilike polovine jetre i oba levog i desnog plućnog krila u tečnom azotu i sačuvane odvojeno nominalno na -70°C. Odabrane grupe su podvrgnute pripremi histoloških kaseta otprilike pola pluća je postavljeno na jednu histološki kasetu po životinji. Dodatno, pluća su naduvana sa 10% NBFpreko kanile koja je ubačena u traheu. Trahea je vezana sa ligaturom i trahea i pluća (levo i desno) su postavljena intaktna na jednu kasetu za hostologiju po životinji. Sve histološke kasete su čuvane na ambijenalnoj temperature u 10% NBF tokom 24 sata i zatim prebačene u 70% etanol.
[0110] Ekspresija FFL u FFL-tretiranim miševima. Nakon analize uzoraka tkiva FFL ekspresija detektovana u FFL-om tretiranim miševima (podaci nisu prikazani).
[0111] Ekspresija CFTR u CFTR ‘knockout’ miševima. Ekspresija CFTR je detektovana imunoprecipitacijom i Western blot analizom CFTR IRNK tertiranih mišijih plića. Zrela "C" traka je detektovana u levom i desnom plućnom krilu kod svih tretiranih miševa dok nije primećena kod netretiranih miševa (Slika 1B). Antitela koja su se koristila su MAB25031 (R&D Systems) za imunoprecipitaciju i SAB4501942 (Sigma) za detekciju via Western blot analizom
[0112] Rezultati koji su ovde pikazani ukazuju na to da CFTR protein može biti uspešno eksprimiran in vivo na osnovu dostave plućima iRNK. Dalje, činjenica da je CFTR iRNK uspešno dostavljena plućima CFTR ‘knockout’ miševa i da je rezultirala u efektnoj proizvodnji proteina u plućima ukazuje na to da se proizvodnja CFTR proteina koja se bazirana iRNK može koristiti za lečenje nedostatka CFTR proteina.
Primer 4: Davanje CFTR iRNK preko pluća pomoću polimernih nanočestica
[0113] Davanje humane CFTR informacione RNK do pluća miša može se postići bilo putem direktne inhalacije kao i raspršivanja. Koristeći in situ hibridizacione postupke, može se uspešno detektovati humana CFTR iRNK nakon intratrahealnog davanja nanočestica napunjenih sa CFTR iRNK miševima. Davanje se može postići upotrebom nanočestica na bazi lipida (npr. C12-200) kao i polimernih nanočestica (npr. Polietilenimin, PEI).
[0114] Davanje CFTR iRNK pomoću polimernih nanočestica. CFTR KO miševi su tretirani sa polietilenimin (PEI) tretiranim CFTR iRNK koji su napunili nanopartikule preko inatratrahealne davanja (30 ug inkapsulirane iRNK). Tretirani miševi su žrtvovani šest sati i 24 sata nakon davanja i pluća su pokupljena i fiksirana u 10% neutralnom puferisanom formalinu (NFB). In situ hibridizacija je upotrebljena za detekciju egzogegnih humanih CFTR iRNK (Slika 6). Značajno bojenje je primećeno nakon 24 sata nakon davanja sa širokom distribucijom u mišijim plućima tertiranih CFTR KO miševa dok se bojenje nije primetilo kod kontrolnih miševa tretiranih sa PBS.
[0115] Analiza tretiranih pluća na većem uvećanju (do 20X uvećanje) otkrilo je jako pozitivno intracelularno bojenje kroz alveolarne i bronhijalne regione oba pluća (slika 7). Nakon daljeg uveličavanja (40x) primećeno je pozitivno bojenje u citoplazmi ciljnih apikalnih bronhijalnih epitelijalnih ćelija (slika 8). Zato, može da se zaključi da je informaciona RNK API uspešno dostavljena do apikalnih bronhijalnih epitelijalnih ćelija. Dalje dok je značajno bojenje primećeno 6 sati nakon davanja. Značajno pozitivno bojenje je primećeno i nakon 24 sata nakon davanja (slika 9).
[0116] Značajno pozitivno intracelularno bojenje je primećeno u oba pluća u bronhijalnim i alveolarnim regionima 24 sata nakon davanja.
Primer 5: Davanje CFTR iRNK preko pluća pomoću nanočestica (nanopartikula) baziranih na lipidima
[0117] Davanje CFTR iRNK pomoću nanonosača baziranih na lipidima. Kao što je već pomenuto, uspešna dostava humane CFTR iRNK do pluća može se postići putem dostave pomoću lipidnih nanočestica. Ovde su otkriveni primeri katjonskih lipidnih nanočestica punjenih hCFTR iRNK koji koriste C12-200 kao katjonsku lipidnu komponentu.
[0118] Uspešna detekcija humane CFTR iRNK u plućima CFTR KO miševa postignuta je in situ hibridizacijom. “Knockout” miševi tretirani su sa 15 ug hCFTR iRNK, inkapsulirani u lipidnim nanočesticama na bazi C12-200 i žrtvovani 6 sati nakon davanja. Pozitivna detekcija hCFTR iRNK je primećena u čitavom bronhijalnom i alveolarnom regionu oba plućna krila u poređenju sa kontrolnim miševima tretiranim sa PBS (Slika 10).
[0119] Pod daljim uvećanjem (40k), pozitivna detekcija humane CFTR iRNK primećena je u apikalnoj citoplazmi bronhijalnih epitelnih ćelija kao i u intracelularnim terminalnim alveolarnim regijama (Slika 11).
[0120] CFTR informacione RNK može se postići korišćenjem oba prenosna sistema – nanočestica na bazi polimera (PEI) i na bazi lipida (C12-200). Ovi sistemi omogućavaju intracelularnu akumulaciju lekovite supstance unutar ciljnih ćelija miševa. Dalje, značajne količine hCFTR iRNK su bile prisutne u ovim ciljnim ćelijama 24 sata nakon primene.
Primer 6: Validacija ekspresije humanog CFTR korišćenjem specifičnog antitela
[0121] Validacija antitela za detekciju humanog CFTR proteina kod miševa, svinja i kultivisanih ćelija. Eksperimenti su izvedeni kako bi se identifikovalo antitelo koje je specifično za hCFTR protein, koji unakrsno ne reaguje sa analogom kod miša i svinje i koji je dostupan u dovoljnoj količini za buduće eksperimente. Ukratko, testiranje različitih anti-hCFTR antitela iz akademskih i komercijalnih izvora dovelo je do identifikacije kombinacije anti-hCFTR antitela koja su bila sposobna da detektuju humani CFTR protein nakon imunoprecipitacije i Western bloting-a (IP/WB) bez unakrsne reaktivnosti bilo na mišije ili svinjske CFTR. Prema tome, na osnovu rezultata IP/WB identifikovana su pogodna anti-hCFTR antitela za detekciju hCFTR proteina bez unakrsne reaktivnosti na mišije ili svinjske CFTR.
[0122] Ćelije su transfektovane sa hCFTR iRNK i proteinski lizati su pripremljeni pomoću ProteoEktract transmembranskog kita (Merck) u 24 h nakon transfekcije, a transmembranska frakcija je pretražena Western blotingom za hCFTR pomoću mišijih anti-human CFTR antitela (MA1-935). Lizati iz 16HBE ćelija su korišćeni kao pozitivna kontrola. Slika 12A prikazuje podatke iz CHO i COS-7 ćelija.
[0123] Ćelije bubrega mladunaca hrčka (BHK), opisane kao CFTR-negativne u literaturi, transfektovane su slično CHO i COS-7 ćelijama i lizati proteina koji su pretraženi Western blot-om. Za razliku od prethodno objavljenih izveštaja, jasan pozitivni signal za CFTR se može videti uz pomoć monoklonalnog anti-CFTR antitela (Slika 12B). Da bi se testirala specifičnost antitela korišćenih u Western blot analizi, Pig Kidney (svinjske bubrežne) ćelije iz CFTR-“knockout” svinje (PKC), ljubazno ustupljene od Prof. Eckhardt Wolf-a (Univerzitet Ludvig Makimilians, Minhen), korišćene su u eksperimentima transfekcije i za pretraživanje proteinskih lizata za CFTR ekspresiju. Kao što se vidi na Slici 12B, u PKC ćelijama ne može se detektovati signal za CFTR. Međutim, transfekcija nije dovela do bilo kakve ekspresije hCFTR. Koristeći luciferazu kao kontrolu transfekcije, ustanovljeno je da PKC ćelije eksprimiraju luciferazu nekoliko puta manje efikasno u poređenju sa CHO ili COS-7 ćelijama. Kako se ne može detektovati značajna razlika u intenzitetu hCFTR traka u bilo kojoj od pretraženih ćelijskih linija nakon transfekcije, izvršena je velika pretraga za druga hCFTR antitela sa većom osetljivošću i specifičnosti prema hCFTR.
[0124] Pretraga antitela Western Blot-ovima. Lizati proteina su pripremljeni iz humane bronhijalnie epitelnih ćelijske linije (BEAS-2B), humane embrionalne linije ćelija bubrega (HEK), mišijih pluća i svinjskih pluća pomoću ProteoEktract transmembranskog kita (Merck), i transmembranska frakcija korišćena za imunoobeležavanje pomoću različitih primarnih antitela (MA1- 935 iz Thermo Scientific Pierce Antibodies, Rockford, IL, USA, AB596 iz Konzorcijuma Cistic Fibrosis, Univerziteta Pennsilvania, PA, USA i AB570 iz Konzorcijuma Cistic Fibrosis, Univerziteta Pennsilvania, PA, USA). Podaci su sažeti kao Slika 13.
[0125] Dok MA1-935 detektuje CFTR u sve tri vrste, AB596 detektuje humani i mišiji, ali ne i svinjski CFTR, a antitelo G449 specifično detektuje samo humani CFTR. Sa AB570, nije bilo jasno da li su slabe trake male molekulske težine dobijene od uzoraka glodara i svinja stvarno CFTR ili nespecifični proizvodi. U narednim eksperimentima (podaci nisu prikazani), nađeno je da MA1-935 prepoznaje traku koja nije CFTR. Prema tome, generalno, rezultati za MA1-935 su razmatrani kao potvrđeni rezultati koji se generišu korišćenjem drugih antitela, ali eksperimenti u kojima je samo anti-CFTR antitelo korišćeno bio MA1-935 nisu se smatrali ubedljivim.
[0126] Imunoprecipitacija hCFTR (IP-hCFTR) iz uzoraka tkiva. S obzirom na to da su sva antitela koja su pretražena na produkovala nekoliko nespecifičnih traka, a nijedna od njih nije dala karakterističan položaj traka za hCFTR (C-opseg koji predstavlja potpuno glikozilovani protein i B-opseg koji predstavlja jezgro manozilovanog oblika), imunoprecipitacija (IP) hCFTR i kasnija detekcija Western blot-om je ustanovljena radi povećanja osetljivosti i specifičnosti detekcije, pojačavajući signal iznad nivoa šuma.
[0127] Inicijalni IP eksperimenti su izvedeni u saradnji sa Prof. Burkhard Tummler (Medizinsche Hochschule Hanover) koristeći protokole i antitela objavljena od strane van Barneveld et al. 2012, Immunochemical analysis of Mutant CFTR in Lung explants, Cell Phisiol. Biochem. 30, 587-595 (2012). Ćelije humanog karcinoma kolona (T84) koje su prekomerno eksprimirale hCFTR korišćene su kao pozitivne kontrole za IP eksperimente.
[0128] Imunoprecipitacija hCFTR-a pomoću tri različita antitela (R29, R66/17 i R66/16) praćena imunodekstacijom sa AB596 dovela je do specifične detekcije hCFTR u proteinskim lizatima iz pluća svinja koje su tretirane aerosolom hCFTR SNIM RNK kao što je opisano u Primeru 8 ispod (Slika 14).
[0129] Formulacija HGT5001. Aerosol eksperimenti pomoću hCFTR SNIM RNK u formulaciji HGT5001: DOPE; Chol; PEGDMG2K (relativne količine 50: 25: 20: 5 (mg: mg: mg: mg)) ("HGT5001 formulacija") su izvedene kod miševa i protein lizati iz izolovanih pluća u 24 h post-iRNK isporuci takođe su analizirani IP-om korišćenjem istih antitela i uslova kao i kod svinjskih lizata. Međutim, u mišijim uzorcima nije se mogao detektovati karakterističan zreli CFTR raspored traka (Slika 15).
[0130] Imunoprecipitacija hCFTR (IP-hCFTR) iz in vitro transfektovanih ćelija. Inicijalni rezultati IP-e, koristeći tkivni materijal svinja, pružili su dokaze za tehničku izvodljivost da se hCFTR post-transkript isporuči in vivo. Međutim, pošto nijedno od antitela koja se koriste u imunoprecipitirajciji CFTR (R29, R66 / 17 i R66 / 16) komercijalno nisu dostupna, ostala komercijalno dostupna antitela su prikazana za njihovu efikasnost u IP reakcijama. Ispitivana su dva antitela iz R & D sistema (MAB25031 i MAB1660).
[0131] Proteinski lizati su pripremljeni iz T84 ćelija i 500 mg ukupnih proteina je korišćeno su u reakciji IP koristeći različite koncentracije MAB25031 antitela. Količina imunoprecipitiranog hCFTR proteina je tada detektovana imunoobeležavanjem pomoću AB570 (Fondacija za cističnu fibrozu). AB596 pod ovim uslovima rezultirao je sa mnogo višom pozadinom i nije dalje testiran. Kao što je prikazano na Slici 16A, nije bilo daljeg povećanja količine CFTR proteina precipitiranog kada je koncentracija IP antitela povećana sa 2 mg/ml na 4 mg/ml. Detektovani su i potpuno glikozilovani i oblici sa glikozilovanim jezgromi (C- i B-traka, redom). Isti imunoprecipitati su takođe pretraženi pomoću MAB1660 kao primarnog antitela Western blot-om. Sa ovim antitelom, međutim, vidljiva je jedino C-traka (Slika 16B).
[0132] Posle uspešne detekcije endogenog hCFTR iz T84 imunoprecipitata korišćenjem MAB25031 antitela, eksperimenti su izvedeni u NIH3T3 ćelijama sa ciljem otkrivanja hCFTR proteina posle transfekcije. NIH3T3 ćelije su transfektovane sa hCFTR SNIM RNK. Proteinski lizati su pripremljeni 72 sata posle transfekcije i količine proteina kvantifikovane pomoću BCA postupka. Humani CFTR protein je imunoprecipitiran iz 500 μg ukupnog proteinskog lizata pomoću antitela MAB25031 od 2 μg/ml, praćeno imunobeležavanjem korišćenjem AB570 (Slika 17). Međutim, CFTR nije mogao biti detektovan. Ćelije transfektovane sa LacZ kodiranom sa iRNK su analizirane kao kontrolne same transfekcije na količinu CFTR proteina.
[0133] Povećanje količine ukupnih proteina korišćenih u imunoprecipitaciji, od 500 μg do 8 mg, nije rezultiralo nikakvim detektabilnim hCFTR proteinom nakon imunodetekcije sa AB570. Još jedno hCFTR specifično antitelo, MAB1660 (R & D sistem), takođe je primenjeno za imunoprecipitaciju (Slika 18). Međutim, ovo antitelo ne taloži (precipitira) CFTR uspešno kao MAB25031. Zbog toga su sve buduće imunoprecipitacije obavljene sa MAB25031.
[0134] Nedostatak hCFTR detekcije u mRNA transfektovanim uzorcima ne mora nužno značiti nedostatak funkcionalnosti testiranih mRNA-a jer su kinetički eksperimenti koji koriste luciferazu kao markerski gen pokazali da je maksimalni izraz sa mRNKom primećen u transfekciji posle 24 sata. Nedostatak hCFTR detekcije je prilično zbog nedovoljne koncentracije hCFTR u testiranim uzorcima ili nedostatkom specifičnosti primijenjenih antitela.
[0135] PEI Formulacija. Uspostavljeni uslovi su testirani na njihovu mogućnost (izvodljivost) da detektuju hCFTR posle hCFTR SNIM RNK isporuke u svinjama (videti Primer 7) formulaciju nanočestica sa 25 kDa razgranatim PEI ("PEI Formulacija") pripremljenim na sledeći način. Zahtevana količina SNIM RNK je razblažena neposredno pre primene u vodi za injekciranje (Braun, Melsungen) do ukupne zapremine od 4 ml i brzo se dodata u 4 ml vodenog rastvora razgranatog PEI 25 kDa pomoću pipete u odnosu N/P od 10. Rastvor je pomešan pipetiranjem gore dole deset puta i raspršen kao dve odvojene frakcije od 4,0 ml jedna za drugom u svinjska pluća pomoću naznačenog nebulizatora. Jedan uzorak iz regiona pluća gde se eksprimira luciferaza iz svinje #1, a drugi iz kaudalnog režnja svinje #2, gde nije bilo moguće otkriti aktivnost luciferaze, što ukazuje na nedostatak isporuke iRNK i/ili ekspresije, izabrani su kao pozitivne i negativne kontrole. Lizati proteina, pripremljeni od ovih uzoraka, su imunoprecipirani korišćenjem MAB25031 (R & D sistemi), a hCFTR protein detektovan korišćenjem AB570. Kao što je prikazano na Slici 19, ekspresija luciferaze je u korelaciji sa ekspresijom hCFTR iRNK. Uzorak iz levog kaudalnog režnja svinje #2, gde nije bilo detektibilne aktivnosti luciferaze, bio je negativan i za hCFTR (traka 1) dok je hCFTR mogao biti otkriven u uzorcima iz svinje #1, koja su bila pozitivna za luciferazu (traka 2).
Primer 7: Aerosol isporuka iRNK
[0136] Uspostavljanje aerosolne isporuke inkapsulirane iRNK do pluća svinja. Aerosolna davanje svetleće luciferaze (FFL) SNIM RNK do svinjskih pluća ustanovljena je postupnom eksperimentalnom procedurom. U prvom koraku FFL SNIM RNK formulacije su bile raspršene u anestezirane svinje tokom kontrolisane ventilacije. U drugom koraku, pluća su odstranjena sečenjem odmah po završetku aerosolne davanja, a uzorci pluća su inkubirani u medijumu za ćelijsku kulturu preko noći pre ex vivo luciferaznog merenja na uzorcima pluća pomoću BLI.
[0137] Svinje nemačke rase (German Landrace) dobijene su od Tehničkog Univerziteta u Minhenu, Veihenstephan, Nemačka. Svinje su imale telesnu težinu od 35-90 kg. Svaki tretman je obavljen na jednoj svinji. Ukupno 5 svinja je tretirano. Prva svinja (težina 90 kg) tretirana je sa FFL SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6 koristeći EFlow vodeni nebulizator i merenjem luciferazne aktivnosti u homogenatima pluća. Druga svinja (težina 60 kg) tretirana je sa FFL SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6 koristeći EFlow vazdušni nebulizator i merenje aktivnosti luciferaze u uzorcima pluća od strane BLI. Treća svinja (težina 80 kg) tretirana je sa FFL SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 koristeći mlazni nebulizator PARI BOY i merenje aktivnosti luciferaze u plućnim uzorcima od strane BLI. Četvrta svinja (težina od 60 kg) tretirana je sa mRNA SNIM RNA / hCFTR mFNA u PEI Formulaciji Primera 6 korišćenjem nebulizatora mreže Aeroneb i merenjem aktivnosti luciferaze u uzorcima pluća od strane BLI. Peta svinja (težina 35 kg) tretirana je sa FFL SNIM RNK u HGT5001 formulaciji Primera 6 korišćenjem nebulizatora mreže Aeroneb i merenjem aktivnosti luciferaze u plućnim uzorcima od strane BLI.
[0138] Umirivanje svinja započelo je premedikacijom azaperonom 2 mg/kg telesne težine, ketaminom 15 mg/kg telesne težine, atropinom 0,1 mg/kg telesne težine praćeno ubacivanjem intravenoznog katetera u bočnu aurikularnu venu. Svinje su anestezirane intravenskom injekciranjem propofola 3-5 mg/kg telesne težine, po potrebi. Anestezija je održavana izofluranom (2-3%) sa 1% propofol “bolus” injekciranjem od 4 do 8 mg/kg telesne težine kako bi se poboljšala anestezija, po potrebi. Trajanje anestezije bilo je približno 1-3 sata. Svinje su ubijene “bolus” ubrizgavanjem pentobarbitala (100 mg/kg telesne težine) i kalijum hlorida preko bočne vene uha. Pluća su odstranjena i uzorci tkiva su sakupljeni iz različitih regiona pluća, nakon čega je usledila inkubacija u medijumu za ćelijsku kulturu preko noći. Za merenje luciferazne aktivnosti uzorci tkiva su ili homogenizovani i analizirani u cevnom luminometru ili inkubirani u medijumu koji sadrži D-luciferin substrat i podvrgnuti ex vivo BLI luciferazi.
[0139] Detalji i rezultati za svinju #1. Eksperimentalna postavka je ilustrovana na Slici 20. Za davanje aerosola, EFlow vazdušni nebulizator je povezan linijski na ventilacionu cevčicu respiratora. Davanje aerosola trajala je oko 60 minuta i bila je duža od očekivanog kod kontrolnih eksperimenata sa otvorenim sistemom. Ovo je očigledno uzrokovano povećanim povratnim pritiskom tokom raspršivanja, što dokazuje aerosolni odliv u rezervoaru vazdušnog nebulizatora. Osam mililitara PEI formulacije Primera 6 koja sadrži 1 mg FFL SNIM RNK u vodi za injekciranje je pripremljeno kao što je opisano u WP5 i raspoređeno u dve odvojene porcije od po 4 ml jedan za drugim. Merenje luciferaze izvršeno je u tkivnim homogenizatima kod odstranjenih plućnih uzoraka iz različitih regiona pluća nakon inkubacije preko noći u medijumu za ćelijsku kulturu. Ekspresione vrednosti su mapirane prema poreklu plućnih uzoraka (Slika 21).
[0140] Rezultati su pokazali uspešnu ekspresiju luciferaze u tkivu pluća svinja. Ekspresija luciferaze bila je najviši u centralnim delovima pluća i opadala je prema distalnijim regionima pluća. Raspored ekspresije koreliran je sa očekivanim rasporedom inhalaliranih FFL SNIM RNK-PEI nanočestica prema izabranim ventilacionim parametrima. Nivoi ekspresije luciferaze su bili u istom opsegu kao kod uočenih u eksperimentima sa miševima u WP5 korišćenjem iste PEI Formulacije Primera 6.
[0141] Detalji i rezultati za svinju #2. Aerosolna davanje FFL SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6 kod svinje #2 izvedena je kao kod svinje # 1, ali je aktivnost luciferaze merena u uzorcima pluća pomoću bioluminiscentnog prikaza (BLI). Ovaj eksperiment je izveden da bi se uspostavilo ex vivo merenje luciferaze gajenih uzoraka pluća organa pomoću BLI. Merenje luciferaze je jasno uočeno u pojedinačnim uzorcima tkiva različitih regiona pluća tretirane svinje (Slika 22). Eksperiment je potvrdio rezultate dobijene kod svinje #1.
[0142] Detalji i rezultati za svinju #3. Davanje aerosola u svinji #1 i #2 korišćenjem EFlow vazdušnog nebulizatora otkrilo je neke tehničke teškoće i neadekvatno vreme nebulizacije. Zbog toga je svinja #3 tretirana korišćenjem PARI BOY mlaznog nebulizatora koji je povezan sa ventilacionom cevčicom preko T-konektora. Davanje aerosola trajala je duže (otprilike 80 minuta) nego sa EFlow vazdušnim nebulizatrom i aerosol davanje je bila nezadovoljavajuća. Vrlo niska luciferazna aktivnost detektovana je u izrezanim uzorcima pluća iz različitih regiona pluća tretirane svinje (Slika 23).
[0143] Detalji i rezultati za svinju # 4. Rezultati prethodnih eksperimenata pokazali su da je vazdušni nebulizator pogodniji za davanje aerosola do pluća svinja u izabranoj postavci u odnosu na mlazni nebulizator. Iz tog razloga, za ovu namenu je testiran još jedan vazdušni nebulizator koji je zadovoljavajuće raspršio PEI formulaciju Primera 6 prilikom testiranja u otvorenom sistemu. Svinja #4 je tretirana korišćenjem Aeroneb vazdušnog nebulizatora koji je povezan llinijski sa cevi respiratora. U ovom eksperimentu 1 mg hCFTR iRNK zajedno je isporučen sa 1 mg FFL SNIM RNK u PEI formulaciji iz Primera 6. Ovo je učinjeno da bi se testirala stabilnost formulacije i nebulabilnost ko-formulisane FFL SNIM RNK/hCFTR iRNA-PEI nančestica u odnosu na ponovljeno doziranje koje treba obaviti u Primeru 8. Formulacija je stabilna i nije otkrila nekompatibilnost sa raspršivanjem. Aktivnost luciferaze je bila jasno uočena u pojedinačnim uzorcima tkiva različitih regiona pluća tretirane svinje (Slika 24).
[0144] Eksperiment je potvrdio rezultate dobijene za svinju #1 i svinju #2, iako su dobijeni veći nivoi ekspresije. Eksperiment je pokazao da je Aeroneb vazdušni nebulizator najpogodniji za isporuku PEI Formulacije Primera 6 do pluća svinja. Štaviše, eksperiment je pokazao da je FFL SNIM RNK i dalje bila aktivna kada je dopremljena zajedno sa hCFTR iRNK.
[0145] Detalji i rezultati za svinju #5. Svinja # 5 je tretirana sa 1 mg FFL SNIM RNK u formulaciji HGT5001 iz Primera 6 aerosolizovanim sa Aeroneb vazdušnim nebulizatorom. Formulacija se može aerosolizovati bez tehničkih poteškoća. Aktivnost luciferaze je bila očigledno uočena u pojedinačnim uzorcima tkiva iz različitih regiona pluća tretirane svinje (Slika 25).
[0146] Eksperiment je pokazao da je aerosolizovana FFL SNIM RNK u formulaciji HGT5001 u Primeru 6 aktivna u tkivu svinjskih pluća, iako su nivoi ekspresije približno 15-20 puta niži nego kod svinja tretiranih sa PEI Formulacijom Primera 6.
[0147] Zaključak. Uspešni rezultati su dobijeni korišćenjem Aeroneb vazdušnog nebulizatora sa PEI Formulacijom Primera 6. Četiri svinje su tretirane PEI Formulacijom Primera 6 kako bi se identifikovala optimalna eksperimentalna postavka za isporuku aerosola. Rezultati su pokazali da se ekspresija luciferaze može detektovati kod homogenatima pluća svinje i sa BLI. Ekspresija luciferaze bila je najviša u centralnim delovima pluća i jedva se videla u distalnim delovima pluća. Pronađeno je da Aeroneb vazdušni nebulizator daje najbolje rezultate zajedno sa najkraćim vremenom isporuke. Na osnovu ovih eksperimentima, druga svinja je tretirana sa FFL SNIM RNK koja je inkapsulirana u formulaciji HGT5001 u Primeru 6. Iako je ekspresija luciferaze bila jasno primećena u nekim delovima svinjskih pluća, nivoi ekspresije su bili niži nego kod FFL SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6. Rezultati ovog radnog paketa jasno su pokazali da je isporuka SNIM RNK u pluća svinja kao veliki pretklinički model životinja izvodljiva korišćenjem različitih formulacija kao što je formulacija na bazi polimera (npr., PEI) i formulacija na bazi lipida (npr., HGT5001). Rezultati ovog primera dokazuju koncept za uspešnu isporuku SNIM RNK u pluća velike životinje koja blisko oponaša situaciju kod ljudskih pacijenata pomoću nebulizatora koji se koristi u kliničkoj praksi.
Primer 8: In vivo dopremanje iRNK (nedeljna doza)
[0148] Izvedena je studija da se proceni praktičnost primene aerosola jednom nedeljno kod svinja. Praktičnost je definisana kao izvođenje tri aerosolne primene modifikovane iRNK u intervalima od jedne nedelje bez indukcije plućne bolesti (odsustvo neželjenih događaja viših od stepena 2). Dodatni ciljevi bili su procena i) stepena stresa životinja, ii) neželjenih događaja koji su se javili tokom laboratorijske ili kliničke procene svinja, i iii) merenja indukovanih proteina (luciferaze i hCFTR).
[0149] Uspostavljena je ponovljena aerosolna davanje SNIM RNK u PEI Formulaciji do pluća svinja. Grupe od dve svinje tretirane su jedan, dva ili tri puta u slabim intervalima sa FIM SNIM RNK/hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6. Dve netretirane svinje služile su kao kontrole. Pluća su izvađena 24 časa nakon tretmana, a ex vivo aktivnost luciferaze je merena u izolovanim uzorcima pluća pomoću BLI. Ekspresija hCFTR proteina analizirana je korišćenjem IP/VB. Imunohistohemija (IHC) je primenjena za detekciju ekspresije luciferaze na nivou ćelije. Toksikologija je ispitana merenjem inflmatornih citokina u serumu i odrađivanjem hemijskih parametara u krvi. Histopatologija je rađena na uzorcima pluća. Protokol istraživanja "Pilot projekat: Ponovljena primena modifikovane mRNK za uspostavljanje životinjskog modela za aerosolnu terapiju cistične fibroze kod svinja" odobrili su lokalni organi pre početka eksperimenata (Licenca za eksperimente za životinje br .: 0-045-12 ).
[0150] Nacrt eksperimenta. Svinje, nemačke rase (German Landrace), ženke stare oko 6 nedelja (~ 25 kg telesne mase u proseku) pri raspršivanju, nabavljene su od Tehničkog Univerziteta u Minhenu, Veihenstephan, Njemačka. Svinje su nasumično raspoređene i tretirane u skladu sa šemom ispod (Tabela 3). Grupe za tretman, dve svinje svaka, su bile sledeće:
Grupa 0 - Kontrolna grupa bez tretmana
Grupa I - Aerosolna davanje SNIM RNK od 1 mg FFL i 1 mg hCFTR SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6 na dan 1.
Grupa II - Aerosolna davanje 2 mg hCFTR SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6 na dan 1 i 1 mg FFL SNIM RNK i 1 mg hCFTR SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6 na dan 8.
Grupa III - Aerosolna davanje 2 mg hCFTR SNIM RNK (6379-186) u PEI formulaciji Primera 6 na dan 1 i dan 8, aerosolna davanje 1 mg FFL SNIM RNK i 1 mg hCFTR SNIM RNK u PEI Formulacija Primera 6 na dan 15.
Tabela 3. Vremenski dijagram grupa na različitim tretmanima.
[0152] Eksperimentalni postupak. Umirivanje je kod svinja započelo premedikacijom azaperonom 2 mg/kg telesne težine, ketaminom 15 mg/kg telesne težine, atropinom 0,1 mg/kg telesne težine praćeno ubacivanjem intravenoznog katetera u bočnu aurikularnu venu. Svinje su anestezirane intravenskom injekcijom propofola 3-5 mg/kg telesne težine, po potrebi. Anestezija je održavana kontinuiranom intravenskom infuzijom sa 1% propofola, po potrebi. Parametri ventilacije su usklađeni sa endekpiratornim ugljen dioksidom i prilagođeni, ako je potrebno. Anestezija, respiratorni i kardiovaskularni parametri kontinuirano su praćeni pulsnom oksimetrijom, kapnografijom, merenjem rektalne temperature i refleksnog statusa. Životinje su primale infuziju uravnoteženog rastvora elektrolita 10 ml/kg/h. Trajanje anestezije je bilo oko 80-120 min. Svinje su ekstubirane nakon početka zadovoljavajućeg spontanog disanja. Svinje su ubijene bolusnim injekciranjem pentobarbitala 100 mg/kg telesne težine preko bočne vene uha, nakon sedacije. Pluća su izvađena i izrezana na približno 1 cm debljine uzoraka tkiva sakupljena iz različitih regiona pluća I kasnije inkubirana u ćelijskoj kulturi. Za merenje luciferazne aktivnosti uzorci tkiva su inkubirani u medijimu koji sadrži supstrat D-luciferin i podvrgnuti ex vivo BLI luciferazi.
Ekspresija luciferaze u tretiranim grupama pomoću BLI.
[0153] Za Grupu 0 (kontrolna grupa bez tretmana) u isečcima pluća nije zabeležena aktivnost luciferaze (Slika 26).
[0154] Za Grupu I (aerosolno davanje 1 SNF RNL SNIM RNK i 1 mg hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6) aktivnost Luciferaze je jasno otkrivena u uzorcima pluća jednogodišnje tretirane svinje 3 i 6 (Slika 27). Izraz Luciferaze bio je najviši u centralnim delovima pluća.
[0155] Za Grupu II (aerosolna davanje 2 mg hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 na dan 1 i 1 mg FFL SNIM RNA i 1 mg hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 na dan 8) aktivnost Luciferaze detektovane u uzorcima pluća dvostruko tretiranih svinja 4 i 8 (slika 28). Izraz Luciferaze bio je najviši u centralnim delovima pluća. Treba uzeti u obzir da su uzorci bili skladišteni još 10 časova u medijumu ćelijske kulture pre merenja zbog zatamnjenja električne energije na dan merenja i rezultirajućih tehničkih problema sa BLI sis
[0156]. Za Grupu III (Aerosol davanje 2 mg hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 na dan 1 i 8 dana, aerosolna primjena 1 mg FFL SNIM RNK i 1 mg hCFTR SNIM RNK u PEI Formulaciji Primera 6 na dan 15 ), Aktivnost luciferaze je jasno otkrivena u uzorcima pluća tri puta tretiranih svinja # 1 i # 2 (slika 29). Izraz Luciferaze bio je najviši u centralnim delovima pluća.
[0157] Svojstva SNIM RNK-PEI nanočestica. Veličina čestica i zeta potencijal su mereni za SNIM RNA-PEI formulacije pre raspršivanja (Tabela X1). Nanočestice SNIM RNK-PEI mogu se reproducibilno formirati s veličinom u rasponu od 25-37 nm i zeta potencijalima u rasponu od 30-49 mV.
[0158] Ekspresija luciferaze u grupama tretiranim sa IHC. IHC za FFL je urađen na tkivnim uzorcima isečaka pluća (Sophistolab AG, Eglisau, Švicarska), koji su bili pozitivni od strane BLI i upoređivani sa tkivom pluća netretiranih svinja i luciferazapozitivnim tumorskim tkivom miša kao pozitivne kontrole. Kao što se očekivalo, u luciferaza-pozitivnom tumorskom tkivu miša vidljiv je jak signal, dok plućno tkivo netretirane svinje nije pokazalo specifično bojenje. Jasno obojeni detektabilni signali mogu se uočiti u plućnom tkivu svinja # 1, koja je primila tri tretmana. FFL ekspresija bila je najistaknutija u bronhijalnom epitelu velikih i malih disajnih puteva (slika 30).
[0159] Detekcija hCFTR proteina u plućnom tkivu tretirane svinje pomoću IP/VB. Visoko BLI-pozitivno plućno tkivo trostruko tretirane svinje # 1 podvrgnuto je hCFTR IP/VB prema protokolu koji je opisao van Barneveld A et al., Cell Phisiol Biochem.
30, 587-95 (2012) (Slika 31). Zreli složeni-glikozilovani hCFTR pojavljuje se kao dispergovana (raspršena) tzv. C-traka. Manozom bogati hCFTR pojavljuje se kao kompaktnija tzv. B-traka. Jasna ekspresija hCFTR primećena je u T84 pozitivnim kontrolnim ćelijama i plućnom tkivu svinja # 1 tretiranim sa hCFTR SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6. Ekspresija hCFTR proteina nije primećena kod netretiranih svinja. Poređenje ekspresije hCFTR proteina u humanom plućnom tkivu iz objavljene studije, korišćenjem identičnog protokola (van Barneveld A i sar., Supra) sugeriše da je ekspresija hCFTR u tkivu pluća svinja, nakon tretiranja hCFTR SNIM aerosola, slična ekspresiji hCFTR u zdravim plućima čoveka.
[0160] Ovaj nalaz je dalje potvrdjen korišćenjem drugačijeg seta antitela za detekciju hCFTR proteina pomoću IP/VB u tretiranim plućima svinje (videti Primer 6). Jedan uzorak iz regije u kojoj se luciferaza eksprimira od svinje #1, a drugi iz kaudalnog režnja svinje #2, gde se ne može detektovati aktivnost luciferaze, ukazuje na nemogućnost iRNK isporuke i/ili ekspresije, izabrane kao pozitivne i negativne kontrole. Proteinski lizati, pripremljeni od ovih uzoraka su imunoprecipirani korišćenjem MAB25031 (R & D sistemi), a hCFTR protein detektovan korišćenjem AB570. Kao što je prikazano na Slici 32, ekspresija luciferaze korelirana je sa ekspresijom hCFTR iRNK. Uzorak iz levog kaudalnog režnja iz svinje #2, gde nije bilo detektibilne aktivnosti luciferaze, bilo je negativno i za hCFTR (traka 1), dok je hCFTR mogla biti detektovana u uzorcima od svinje #1, koja su bila pozitivna za luciferazu (traka 2).
[0161] Toksikologija: Preliminarna histološka procena uzoraka pluća. Urađena je histološka procena uzoraka pluća uzetih nakon eutanazije tri životinje. Nakon unošenja u parafinske kalupe uzorci pluća su obojeni hematoksilin-eozinom za morfološku procenu. Nalazi su bili dosledni na uzorcima iz tri svinje, od kojih su dva (svinja #1 i svinja #2) primile tri aerosolne aplikacije, a treća (svinja #7) je netretirana kontrola bez primenjene aerosolizacije.
[0162] Toksikologija: Stres. Samo svinja #2 i svinja #1 pokazale su blage znake stresa 2-4 dana posle prvog tretmana. Prema tome, tri aerosolne aplikacije u trajanju od tri nedelje uzrokovale su samo blagi stres.
[0163] Toksikologija: Neželjeni događaji. Vrsta i učestalost neželjenih događaja (AE) su analizirani laboratorijskim parametrima (krv, MBS i BAL) i medicinskim pregledom svinja (definisanih kao sekundarni cilj u ovom ispitivanju).
[0164] Serum i uzorci cele krvi uzeti su u vremenskim tačkama definisanim protokolom studije. Dvanaest reprezentativnih parametara (hemoglobin, hematokrit, AP, ALT, AST, CK, bilirubin, kreatinin, glukoza, kalijum, trombociti i bela krvna zrnca) koji su indikativni da pokažu organ-specifičnu patologiju (krv, koštana srž i bubreg) su izabrani i rezultati ispitivanja dobijeni od VetMedLab-a, Ludvigsburg, Nemačka klasifikovani prema VCOG-u, verzija 2011.
[0165] Rezultati pokazuju da u svinjama nisu primećeni nikakvi ozbiljni neželjeni događaji (AE) (AE stepena 3., 4. i 5. bi se kvalifikovali kao ozbiljni). Nije bilo pogoršanja laboratorijskih parametara nakon aerosolne aplikacije SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6. Za male promene u nekim parametrima (npr. CK ili enzimi jetre), verovatnije je da su promene uzrokovane eksperimentalnom procedurom per se (na pr. injekcije i anestezije). Takođe, nije otkriven nikakav negativan efekat od ponovljene aplikacije - tokom treće primjene, svinje grupe 3 ne pokazuju AE više od AE stepena 2. Čak i stepeni AE 1 ili 2 su retki i nisu pokazali nikakvu korelaciju sa aerosolnom aplikacijom SNIM RNK u PEI formulaciji Primera 6.
[0166] Pored ponavljenih uzoraka krvi, dva druga parametra su procenjena kako bi se ocenili patološki procesi u plućima: i) Brocho-Alveolar-Lavage tečnost (BALF) uzeti posle eutanazije, ii) mikrobiološki uzorci (MBS) (bris iz traheje - uziman tokom anestezije). BALF je uzet iz svake svinje tokom autopsije i čuvan na -80°C za dalje ispitivanje. Trahealni brisevi su uzimani pre svake aplikacije aerosola i mikrobiološki pregledani. Ovi pregledi otkrili su širok spektar patogena uključujući Bordetella bronchiospectica (čest patogen respiratornog trakta svinje) i Escherichia coli. Svinje su jednom tretirane injekcijom tulatromicinom u mišić gluteus (1 ml Drakkin® 10%).
[0167] Medicinski pregled. Pored laboratorijskih parametara, medicinski pregledi svinja su obavljeni u periodima posmatranja između aerosolnih aplikacija (za više detalja pogledati 1.1.2 Aneksa 1 i Aneksa 4 protokola studije). Kako nema sistema za dokumentovanje, ocenjivanje i pripisivanje AE-a, bilo za intervenciju ili nešto drugo što je definisano za svinje, korišten je sistem zajedničkog toksikološkog kriterijuma (CTC) koji je uspostavljen za pse i mačke (objavio VOCG 2011. godine). Za ocenjivanje laboratorijskih parametara korišćene su specifične vrste ULN (gornje granice normale) i LLN (donje granice normale). Kliničke procene su izvršene usledećih šest kategorija AE: (1) alergijski/imunološki događaji; (2) plućno/respiratorno; (3) strukturalni (bitni) klinički znaci; (4) dermatološki/kožni; (5) gastrointestinalni; i (6) plućni/respiratorni.
[0168] Rezultati pokazuju da u svinjama nisu primećeni nikakvi ozbiljni AE (nema stepena 3, 4 ili 5). Nije bilo pogoršanja parametara procijenjenih medicinskim ispitivanjem nakon aerosolne aplikacije SNIM RNK u PEI formulaciji. Dve svinje iz grupe 3 su pokazale nivo AE 1 i 2 u slučaju tri respiratorna parametra (bronhospazem/šištanje, edem larinksa i dispneja), ali ovi blagi ili umereni nalazi su ograničeni na jedan ili dva dana. S obzirom da su se ova opažanja jedino javljala posle prve anestezije/intubacije /aerosol aplikacije u ove dvije svinje, ali ne i nakon druge ili treće aerosol aplikacije u istim ili bilo kojoj drugoj svinji, malo je verovatno da su ovi nalazi uzrokovani ispitivanom supstancom.
[0169] Zaključak. Rezultati ovog primera pokazali su da PEI formulacija koja kodira FFL i hCFTR SNIM RNK može biti uspešno aerosolizovana višestruko u pluća svinja bez gubitka aktivnosti nakon svakog ciklusa tretmana i bez neželjenih događaja. Ekspresija luciferaze je nađena u centralnim delovima plućnog tkiva, ali se teško nalazi u distalnim područjima pluća. Regionalna pojava ekspresije luciferaze korelirala je sa očekivanim rasporedom PEI formulacije Primera 6 na osnovu podešavanja koja se koriste za kontrolisanu ventilaciju. Imunohistohemija na odabranim uzorcima pluća iz tretiranih prašaka pokazala je ekspresiju luciferaze pretežno u bronhijalnom epitelu velikih i malih disajnih puteva. IP/VB je jasno pokazao ekspresiju kompleks-glikozilovane C-trakte zrelog CFTR-a u tretiranim plućima svinja koja je bila odsutna u netretiranim svinjskim plućima i luciferaznonegativnim uzorcima pluća. Ekspresija hCFTR u tkivu pluća svinje nakon hCFTR SNIM RNK aerosolnog tretmana bio je uporediv sa ekspresijom hCFTR u zdravim ljudskim plućima u poređenju sa objavljenim izveštajima korišćenjem identičnog protokola za detekciju hCFTR proteina. Neželjeni događaji ocenjeni sa 1 ili 2 su bili veoma retki i nisu pokazali nikakvu korelaciju sa aerosolnom aplikacijom SNIM RNK u PEI formulaciji. Prema tome, ekspresija hCFTR proteina uspešno je dokazana u plućima svinja, tretiranim SNIM hCFTR iRNK.
Primer 9: CFTR koja kodira iRNK koja sadrži signalni peptid
[0170] Ovaj primer pokazuje da CFTR protein može biti efektivno eksprimiran iz CFTR kodirane od strane iRNK sa signalnom peptidnom kodirajućom sekvencom.
[0171] Sinteza informacione RNK. Za eksperiment, C-terminalno His10obeleženi kodon optimizovani humani cističnofibrozni transmembranski regulator provodljivosti (CO-CFTR-C-His10), kodon optimizovan humani CFTR sa signalnom liderom sekvencom za hormon rasta (GH-CO -CFTR) (SEQ ID NO: 16) i kodon optimizovana humana CFTR (CO-CFTR) (SEQ ID NO: 17) SNIM RNK sintetisani su in vitro transkripcijom sa plazmidnih DNK obrazaca pomoću standardnih postupaka.
Ćelije i CFTR transfekcija. Humane embrionalne bubrežne HEK293T ćelije su gajene u DMEM (Invitrogen Cat br.# 11965-092) uz dodatak 10% goveđeg fetalnog seruma, 2 mM L-glutamina, 100 U/ml penicilina i 100 mg/ml streptomicina. Dan pre transfekcije, ćelije su kultivisane u pločama sa 6 bunara na 50-60% gustine i inkubirane pod normalnim uslovima za kultivaciju tkiva (36°C u vlažnost atmosfere od 5% CO2, 95% vazduha). U pripremi za transfekciju, 60 ml lipofektamina 2000 (Invitrogen Cat br. # 11668019) je razblažen u OptiMem Reduced Serum medijumu (Invitrogen Cat br # 31985-062) i blago vorteksovan. Za eksperiment 4 mg bilo CO-CFTR, GH-CO-CFTR ili CO-CFTR-C-His10SNIM RNK je razblaženo u 900 μlOptiMem medijuma. iRNK je odmah dodata u razblaženi Lipofectamine® i inkubirana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Medijum za kultivaciju je lagano pokupljen i zamenjen sa 1 ml OptiMem Reduced Serum medijumom i 300 μl svakog od odgovarajućeg kompleksa iRNK/Lipofectamine®. Ćelije su inkubirane pod standardnim uslovima za kultivaciju tkiva.
[0172] Western analiza. Približno 48 post transfekcija, ćelije su uklonjene sa odgovarajućih ploča i lizirane. Lizat celih ćelija bio je podvrgnut razdvajanju na SDS-PAGE i ispitan Western blot-om. Kao što je prikazano na Slici 33, robusna ekspresija humanog CFTR proteina detektovana je nakon transfekcije sa CO-CFTR, GH-CO-CFTR i humanom CO-CFTR-C-His10iRNK, anti-CFTR (A i B) ili anti-His (C) antitelima (Slika 33).
Primer 10: In vivo dopremanje CO-CFTR-C-His10 iRNK u CFTR “Knockout” (ciljano inaktiviran) miša
[0173] Analiza humanog CFTR proteina produkovanog putem nanopartikula koje su sadržale intratrahealno dopremljenu upakovanu iRNK. Sve studije su izvedene pomoću CFTR KO miševa. CFTR iRNK formulacija ili kontrola nosač je uneta pomoću inhalatora PARI Boy. Miševi su žrtvovani i perfuzirani fiziološkim rastvorom, nakon predodređenog vremenskog perioda, kako bi se omogućilla ekspresija proteina sa iRNK.
[0174] Sinteza informacione RNK. U ovom primeru, C-terminalno His10obeleženi kodon optimizovani humani cističnofibrozni transmembranski regulator provodljivosti (CO-CFTR-C-His10) SNIM RNK i optimizovana FFL SNIM RNK sintetisani su in vitro transkripcijom isa plazmidnih DNK obrazaca.
[0175] PEI Formulacija. Za ovaj pristup, dopremanje i ekspresija CO-CFTR-C-His10 iRNK u pluća CFTR “knockout” miševa je evaluirano primenom obe polimernih i na bazi lipida napravljenih formulacija nanopartikula. Polimerne formulacije nanočestica sa 25 kDa razgranatim PEI pripremljene su na sledeći način. Potrebna količina SNIM RNK je razblažena neposredno pre primene u vodi za injekciranje (Braun, Melsungen) do ukupne zapremine od 4 ml i dodata brzo u 4 ml vodenog rastvora 25 kDa razgranatog PEI pomoću pipete u N/P odnosu 10. Rastvor je pomešan pipetiranjem gore dole deset puta i inhaliran (raspršen) kao dve zasebne 4,0 ml frakcije jedan za drugim u mišija pluća miša korišćenjem naznačenog inhalatora (nebulizatora).
[0176] cKK-E12 formulacija. Za eksperiment sa nanopartikulama zasnovanih na lipidu napravljena je lipidna formulacija korišćenjem CO-CFTR-C-His10 SNIM RNK u formulaciji cKK-E12: DOPE: Chol: PEGDMG2K (relativni iznosi 50: 25: 20: 5 (mg: mg: mg: mg). Rastvor je raspršen u mišija pluća pomoću naznačenog nebulizatora.
[0177] Davanje raspršene (aerosolne) humane CO-CFTR-C-His10 iRNK. CFTR testirani materijali su davani jednom inhalacijom aerosola preko PARI Boy jet nebulizera (nominalna zapremina doze do 8 mL/grupa). Ispitivani materijal je isporučen u boks koji sadrži celu grupu životinja (n = 4) i koji je povezan sa sistemom za protok kiseonika i sistemom za čišćenje.
[0178] Davanje humane CO-CFTR-C-His10 iRNK. CFTR iRNK je pripremljena na način opisan gore. Četiri CFTR “knockout” miša postavljena su u aerosolnu komoru i izložena dejstvu od ukupno 2 mg kodon optimizovane nemodifikovane humane HRTR iRNK (koja sadrži kodirajuću sekvencu SEQ ID NO: 3) pomoću raspršivanja (nebulizator Pari Boy jet) tokom perioda od približno jednog sata. Miševi su žrtvovani 24 sata nakon izlaganja.
[0179] Eutanazija. Životinje su eutanazirane gušenjem sa CO2 u reprezentativnom periodu nakon primene doze (6 5%), praćeno torakotomijom i eksangvinacijom (iskrvarenjem). Celokupna krv (maksimalna količina koja se može dobiti) je sakupljena preko srčane punkcije i odbačena.
[0180] Perfuzija (ubrizgavanje). Nakon eksangvinacije, sve životinje su podvrgnute srčanoj perfuziji fiziološkim rastvorom. Ukratko, perfuzija celokupnog tkiva obavljena je ubacivanjem igle promera 23/21 pričvršćene na špric od 10 ml koji sadrži fiziološki rastvor u lumen leve komore za perfuziju. Desni atrijum je urezan da obezbedi izlaz za drenažu perfuzata. Na klip je primenjen blag i stalan pritisak da da bi se obezbedilo ubrizgavanje u životinju nakon što je igla postavljena u srce. Adekvatan protok rastvora za ispiranje je obezbeđen kada je izlazni perfuzat čist (bez vidljive krvi) što ukazuje na to da je rastvor za ispiranje zasitio telo i postupak je bio kompletiran.
[0181] Kolekcija tkiva. Nakon perfuzije, od svih životinja su sakupljena pluća (desno i levo). Oba (desna i leva) plućno krilo su zamrznuta u tečnom azotu i čuvana odvojeno označena na -70°C.
[0182] Ekspresija humanog CFTR iz CO-CFTR-C-His10iRNK u CFTR “knockout” miševima. CFTR ekspresija je detektovana Wester blot analizom lizata tkiva sakupljenih iz mišijih pluća tretiranih sa CFTR iRNK. Zrela "C" traka je detektovana u levom i desnom plućnom krilu svih tretiranih miševa, i u slučaju formulacije zasnovane na lipidima i u slučaju formulacije zasnovane polimerima (Slika 34). Ekspresija zrele "C" trake verifikovana je poređenjem sa lizatom sakupljenim iz HEK 293T humanih CO-CFTR-C-His10pozitivnih ćelija kako je opisano u Primeru 9. Za razliku od toga, nema uočljivog signala u lizatu prikupljenom od netretiranih kontrolnih miševa divljeg soja (Slika 34). Sveukupno, ovi podaci ukazuju na to da su i formulacije na bazi polimera i lipida (kao što je formulacija cKK-E12 navedena gore) efikasne za isporuku CFTR iRNK u pluća, npr. putem inhalacije, a kada je jednom isporučena, kodon optimizovana CFTR iRNK može efikasno eksprimirati CFTR protein.
<Primer 11:>In vivo studija povećanja doze
[0183]Povećanje doze PEI inkapsulirane iRNK i aerosol isporuka do pluća svinja. Aerosolna isporuka kombinacije svetleće luciferaze (FFL) SNIM RNK i kodon optimizovane CFTR (CO-CFTR) SNIM RNK u različitim koncentracijama do pluća svinja utvrđena je postupnom eksperimentalnom procedurom. U prvom koraku formulacija FFL/CO-CFTR 35 SNIM RNK bila je raspršena anesteziranim svinjama tokom kontrolisane ventilacije. U drugom koraku, životinje su žrtvovane “bolus” ubrizgavanjem pentobarbitala (100 mg / kg telesne težine) i kalijum hlorida preko bočne vene uha posle sedacije, a 24 sata nakon isporuke aerosola. Pluća su izvađena i izrezana na približno 1 cm široke uzorke tkiva. Za merenje aktivnosti luciferaze, uzorci tkiva su inkubirani u medijumu koji sadrži supstrat D-luciferin i ponuđeni ex vivo BLI luciferazi. Nakon BLI, uzorci iz luciferaza-pozitivnih i luciferazanegativnih regiona uzeti su za histopatologiju, imunohistokemiju i in situ hibridizaciju. Preostali uzorci su zamrznuti u tečnom azotu i kasnije ukladišteni na -80 ° C do analize od strane IP/VB i “Elisa”-e.
[0184] Sinteza informacione RNK. U primeru, kodon optimizovani humani cističnofibrozni transmembranski regulator provodljivosti (CO-CFTR) SNIM RNK, kodon optimizirana FFL iRNK SNIM RNK sintetisana je in vitro transkripcijom iz plazmidnih DNK obrazaca korišćenjem standardnih postupaka.
[0185] Eksperimentalni dizajn. Svinje nemačke rase (German Landrace) su dobijene od Tehničkog Univerziteta u Minhenu, Weihen- stephan, Nemačka. Svinje su imale telesnu težinu od 35-90 kg. Studija je dizajnirana tako da se starost i težina svinja slažu kako bi se kontrolisala varijabilnost. Pojedinačne grupe od 6 svinja (3 mužijaka I 3 ženke) su izabrane za svaku eksperimentalnu grupu ove četvorostruke studije. Prva grupa tretirana je samo vodom za injekciranje (WFI), koja je davana pomoću mrežnog inhalatora Aeroneb. Druga grupa je tretirana rastvorom koji je sadržao 1 mg FFL SNIM RNK i 1 mg kodon optimizovanog humanog CFTR (CO-CFTR) SNIM RNK u PEI formulaciji koja je opisana dole, korišćenjem mrežnog inhalatora Aeroneb. Treća grupa je dobila 1 mg SNF RNK FFL i 5 mg optimizovane HRTR CFR (CO-CFTR) SNIM RNK u PEI formulaciji opisanoj u nastavku. Četvrta grupa tretirana je sa 1 mg FFL SNIM RNK i 10 mg optimizovane kodne CFIM (CO-CFTR) SNIM RNK u PEI formulaciji koja je opisana u nastavku. Šema tretmana i procene svake grupe prikazana je u Tabeli 4, u daljem tekstu
Tabela 4. Eksperimentalni dizajn za ispitivanje povećanja doze.
[0186] iRNK - PEI formulacija. Dole opisani primeri standardizovanog postupka formulacije pripremljeni su neposredno pre tretmana životinja.
Materijal
[0187]
Pumpa za ušpricavanje (uređaj za mešanje):
Proizvođač:KD Scientific
Tip:KDS-210-CE
Špric
[0188]
Proizvođač:B. Braun
<Tip:>Omnifix, 20mL ili 30 mL / Luer Lock Solo
<Ref:>4617207V
Crevo
[0189]
Proizvođač:B. Braun
<Tip:>“Safeflow” Extenzioni Set
<Ref:>4097154
Igla
[0190]
Proizvođač:B. Braun
<Tip:>Sterican, 20G x 11/2 "
<Ref:>4657519
Miksni ventil
[0191]
Proizvođač:B. Braun
<Tip:>Discofix C 3SC
<Ref:>16494C
Voda za injektiranje
[0192]
Proizvođač:B. Braun
Tip:Voda
<Ref:>82423E
[0193] Primer postupka za pripremu polipeksa (kompleks polimera i RNK) koji sadrži 1mg hCFTR SNIM RNK i 1 mg FFL SNIM RNK N/P 10 u zapremini od 8 ml: 3 mL vode za injekciranje i 3 mL osnovnog rastvora RNK (c: 1 mg / mL u vodi; 1,5 mL FFL iRNK 1.5 mL CFTR iRNK) su sipani u 15 mL “falcon” epruvete. U drugoj “falcon” epruvete, 5,61 mL vode za injekciranje je pomešano sa 0.39 mL baznog rastvora brPEI (c: 10 mg/mL u vodi). Dva šprica od 20 ml bila su fiksirana u uređaju za mešanje. Svaki od njih su bili povezani iglom preko creva. Jedan špric ispunjen je RNK-, a drugi sa PEI-rastvorom, povlačenjem pumpe na špricevima. (Postavke: Prečnik: 20.1mm, Protok: 5mL / min, Zapremina: 5.9mL). Igle su uklonjene a cevi povezane sa ventilom za mešanje. Važno je povezati špric koji sadrži RNK-rastvor u odgovarajućim položajem ugla ventila. Radi kontrole izlaznog prečnika priključena je igla. Mešanje je vršeno korišćenjem infuzione funkcije pumpe na špricu (Postavke: Prečnik: 20.1mm, Protok: 40mL/min, Zapremina: 5.8mL). Da bi se postigao reproduktivni polidisperzioni indeks, uzorci su bili frakcionisani ručno tokom mešanja. Prvih nekoliko mL dok je protok bio stabilan (100-200mL) i poslednjih nekoliko mL koje su ponekad sadržale vazdušne mehuriće sakupljani su u zasebnom crevu. Smeša je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi kako bi se formirao polipeks i nakon toga se skladišti na ledu. Za različite doze parametri su modifikovani i prilagođeni kao što je prikazano u Tabeli 5.
T l . Prim ri z r min i v n z r zli i m z r min .
V (povlačenje) i V (infuzija) označavaju postavku na pumpi špriceva za aspiraciju i disperziju, redom, iRNK i PEI komponenti.
[0194] Transfekcija HEK ćelija za proveru funkcionalnosti kompleksa za raspršivanje. Nakon raspršivanja, alikvot kompleksa (80ml) korišćen je za transfekciju HEK ćelija. Jedan dan pre transfekcije, 1x10<6>ćelija je raspoređeno u 6 ploča. Na dan transfekcije, medijum je uklonjen iz ćelija, ćelije su isprane jednom PBS-om nakon čega je u bunarčić dodato 80ml kompleksa zajedno sa 920 µl MEM medijuma bez seruma. Za svaki kompleks su pripremljeni bunarčići u triplikatu. Ćelije su inkubirane sa kompleksima tokom 4 sata u standardnim uslovima ćelijske kulture. Na kraju inkubacije je uklonjen kompleks koji sadrži medijum i dodat serum koji sadrži MEM medijum (1 ml) po bunarčiću. Ploče su inkubirane u standardnim uslovima ćelijske kulture. Tokom 24 časa posle transfekcije, protein lizati su pripremljeni koristeći isti protokol i puferi koji se koriste za životinjska tkiva uz isključivanje stepena homogenizacije. Ćelije iz tri bunara bile su objedinjene za analizu. Ekspresija humanog CFTR detektovana je korišćenjem imunoprecipitacije sa antitelima R24.1 (R & D Sistems) i Western Blot-om kombinacijom 217, 432 i 596 antitela (sve od Cistic Fibrosis Consortium, Univerzitet u Pensilvaniji, PA, SAD). hCFTR se može otkriti za sve komplekse raspršene kod svinja (vidi Slike 54-57).
[0195] Primena aerosola. Aerosol (sam WFI 44 ml, modifikovana iRNK PEI formulacija u WFI: 8, 24 i 44 ml) je raspršena i inhalirana u anesteteziranu svinju pomoću mrežnog inhalatora Aeroneb®. Sedacija (umirivanje) kod svinja započelo je pretretmanom azaperonom 2 mg/kg telesne težine, ketaminom 15 mg/kg telesne težine, atropinom 0,1 mg/kg telesne težine praćeno ubacivanjem intravenoznog katetera u bočnu aurikularnu venu. Svinje su anestezirane intravenskom injekcijom propofola 3-5 mg/kg telesne težine, po potrebi. Anestezijju je održavo izofluran (2-3%) sa 1% propofola ubrizgavanje “bolusa” od 4 do 8 mg/kg telesne težine kako bi se poboljšala anestezija po potrebi. Trajanje anestezije je oko 1-3 sata. Svinje su žrtvovane “bolusnim” ubrizgavanjem pentobarbitala (100 mg/kg telesne težine) i kalijum hlorida preko bočne vene uha 24 sata nakon završetka aerosolizacije. Pluća su izvađena i uzorci tkiva su sakupljeni iz različitih regiona pluća. Čuvani uzorci su podvrgnuti različitim postupcima procene kao što su bioluminiscencija, histopathologija, IP/”Western Blot” i Elisa.
[0196] Analiza bioluminiscencije. Za merenje luciferazne aktivnosti tkiva su ili homogenizovana i analizirana u cevnom luminometru ili inkubirana u medijumu koji sadrži D-luciferin substrat i podvrgnuti ex vivo BLI luciferazi. Podaci pokazuju da je primećen jak bioluminiscentni signal u grupi od 2-4 (1 mg, 5, mg i 10 mg, redom), u poređenju sa kontrolnim uzorcima plućnog tkiva iz grupe 1 (kontrola nosač WFI) (Slike 35-38 ).
[0197] CFTR ekpresiona analiza pomoću Western Blot-a i imunohistohemije. FFL pozitivni uzorci tkiva su isečeni (minimum 10 uzoraka za svaku svinju u okviru grupe) i analizirani imunoprecipitacijom/Western blot-om (IP-WB) i imunohistohemijom za humani CFTR. Ukratko, proteinski lizati su pripremljeni od pluća svinja na sledeći način: Za analizu je korišćeno između 300-400 mg plućnog tkiva. Tkivo je homogenizovano u bazičnom puferu (20mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0) koji sadrži inhibitore proteaza koristeći LisingMatrikA (MPBiomedicals, Ref: 6910-500) i Homogeniser "FastPrep24" (MP Biomedicals). Celokupan miks tkiva je prebačen u novu epruvetu sa sigurnosnim zatvaračem od 2ml a zatim je dodato 25ml jodoacetamida (Sigma: I6125) i 1 µl “Omni cleave” (enzim) (1: 5 razblaženo u puferu Omni Cleave) (Epicenter: OC7810K). Uzorci su zatim inkubirani 5 minuta na ledu, a zatim je dodato 26ml 10% SDS rastvora. Uzorci su dalje inkubirani mešanjem na 4°C u trajanju od 60 min . Naknadna inkubacija, u uzorke je dodato 260ml pufera za lizu (bazični pufer 850ml 10% TritonKs-100 5% natrijum deoksiholat) i oni su inkubirani mešanjem na 4°C tokom 90 minuta. Finalno, lizati proteina su centrifugirani na 13.000 o/min na 4°C tokom 10-20 min, a supernatant je prebačen u novu Eppendorf epruvetu. Koncentracija proteina je kvantifikovana koristeći BCA Protein Assai (Pierce). Uzorci su podeljeni tako da sadrže po 10 mg ukupnih proteina, a krajnji volumen su prilagođeni bazičnim puferom do 1 ml po uzorku. Na osnovu podataka prikazanih u Primeru 6, CFTR imunoprecipitacija je urađena pomoću antitela R24.1, a zatim je sledila Western Blot imunodetekcija CFTR-a pomoću trostruke kombinacije tri različita antitela dobijena od Cistic Fibrosis Consortium, Univerziteta u Pensilvaniji, PA, USA (antitela 217, 432, 596). Da bi se kontrolisala varijabilnost unutar grupe među različitim životinjama i varijabilnost u ekspresiji CFTR-a, proteinski standard koji odgovara veličini od 150 kDa postavljen je kao referenca, a trake instanci različitih grupa su normalizovane do ove vrednosti. Kao što je prikazano na Slici 39, samo 16% uzorka tkiva analiziranih kod kontrolnih svinja iz grupe 1 pokazivalo je veći nivo ekspresije CFTR-a od osnovne vrednosti. Nasuprot tome rezultati za grupe 3 i 4, koje predstavljaju terapijske grupe od 5 mg i 10 mg, svaki, pokazuju da je u više od 30% uzoraka, pozitivno za nivo ekspresije CFTR-a, viši od osnovne vrednosti (Slika 39). Štaviše, povećanje ekspresije CFTR-a primećeno u okviru grupa 3 i 4 bilo je gotovo dvostruko veće od kontrole.
[0198] Analiza CFTR imunohistohemije urađena je kvantifikacijom CFTR-pozitivnih bronhija i bronhiola. Bronhije/bronhiole se smatraju pozitivnim ako je otkrivena bar jedna epitelijalna ćelija unutar epitelijalnog ćelijskog sloja koji pokazuje jasan CFTR signal lociran na membrani. Reprezentativni prikaz "pozitivnog" uzorka prikazan je na Slici 40. Kodiranja za CFTR imunohistohemiju optimizovana su procenom specifičnosti raspoloživih antitela na CFTR koristećenjem jednog antitela ili kombinacije do tri antitela, respektivno. Jasni CFTR-specifični signali su primećeni nakon inkubacije antitela 596. Podaci pokazuju da su CFTR-pozitivne epitelijalne ćelije otkrivene u delovima plućnog tkiva sve četiri grupe, što pokazuje da imunohistohemijski postupak (procedura) demonstrira detekciju humanog i svinjskog CFTR –a (Slika 41 i 45). Dok su niski (Slika 42), srednji (Slika 43) i visoki (Slika 44) nivoi ekspresije CFTR-a primećeni za grupu 3, ukupni rezultati pokazuju da je tretman sa 5 mg kodon optimizovane CFTR SNIM RNK rezultirala sa većim brojem CFTR pozitivnih ćelija i sveukupno intenziteta CFTR signala u odnosu na kontrolni nosač. Podaci takođe ilustruju još jedno povećanje ekspresije CFTR posle tretmana sa 10 mg, što pokazuje jasan efekat reakcije na dozu (Slika 45). Kvantifikacija apsolutnih i relativnih brojeva CFTR-pozitivnih bronhija / bronhiola dalje podržava ove nalaze, otkrivajući značajno veći broj kod životinja koje su tretirane sa 5 ili 10 mg humanog CFTR SNIM RNK u poređenju sa kontrolom vozila (slika 46). Pokazujući ukupnu elevaciju nivoa ekspresije CFTR posle tretmana sa humanim CFTR SNIM RNA.
[0199] CFTR ekspresiona analiza pomoću in situ hibridizacije (ISH). FFL pozitivni uzorci tkiva su isečeni (minimum 10 uzoraka za svaku svinju u okviru grupe) i podvrgnuti ručnoj in situ hibridiznoj analizi pomoću RNAscope® (Advanced Cell Diagnostic) "ZZ" tehnologije. Probe su napravljene na osnovu kodon optimizovane sekvence kodon optimizovane humane CFTR SNIM RNK (SEK ID NO: 17). Ukratko, RNAscope® test je in situ hibridacioni test dizajniran da vizualizuje pojedinačne molekule RNK po ćeliji u formalin fiksiranom, u parafin utisnutom (FFPE) tkivu montiranom na slajdove. Svaki uzorak utisnutog tkiva je pretretiran prema uputstvu proizvođača i inkubiran sa ciljno specifičnom humanom CFTR specifičnom RNK probom. hCFTR proba vezuje CFTR, a pokazuje i unakrsnu reaktivnost prema humanim, mišjim, pacovskim, svinjskim i majmunskim. Jednom vezana, proba je hibridizovana sa kaskadom signal umnoženih molekula, kroz seriju od 6 uzastopnih krugova umnožavanja. Uzorak je zatim tretiran pomoću HRP-obeležene probe specifične za signal umnoženu kasetu i analiziran pomoću hromatske vizuelizacije korišćenjem 3,3'-diaminobenzidina (DAB). Ubikuitin C specifična proba je korišćena kao pozitivna kontrola (Slike 47A i 48A), dok je dapB korišćen kao negativna kontrola (Slike 47B i 48B). Pozitivan CFTR signal upoređen je sa signalom tkiva pluća svinja kako netretiranih tako i tretiranih sa kontrolnim nosačem (Slika 49A i B). Bojeni uzorci su vizualizovani pod standardnim svetlosnim mikroskopom. Podaci pokazuju da je tretman sa 1 mg kodon optimizovane humane CFTR SNIM RNK rezultovao dramatičnim porastom CFTR ekspresije u desnom (A) i levom (B) plućnom tkivu grupe 2, u poređenju sa kontrolom (Slika 49 i 50 A & B) Štaviše, dodatno povećanje CFTR ekspresije je uočeno za grupe tretirane sa 5 mg i 10 mg, što je uočeno dramatičnim povećanje boje u okviru desnih (A) i levih (B) uzoraka pluća analiziranih kod grupa3 i 4 (Slike 51 i 52 A & B). Sve zajedno, ovi podaci snažno podržavaju efikasno isporuku iRNK putem inhalacije i ekspresije humanog CFTR-a u oba režnja pluća i njihovih različitih tkiva.
[0200] Zaključak. Rezultati su pokazali da obe, luciferaza i CFTR iRNK mogu efikasno biti isporučene in vivo do plućnog tkiva. Izraz Ekspresija luciferaze je primećena u različitim uzorcima tkiva koji su sakupljeni iz različitih regiona unutar desnog i levog režnju pluća. Tako sugeriše da je rasprešivanje efikasan način za davanje iRNK i rezultira prilično jednakom raspodelom. Dalje, pored luciferaze, CFTR iRNK je takođe efikasno isporučena u pluća, što dovodi do povećane ekspresije proteina. Ekspresija i aktivnost proteina potvrđena je pomoću IP-WB, imunohistohemijom i in situ hibridizacijom. Svaki pristup jasno je pokazao dozno zavisno povećanje u dopremanju iRNK i CFTR ekspresiju i/ili aktivnost u zavisnosti od doze, unutar tkiva pluća. Sve zajedno, eksperimenti ističu ukupnu praktičnost i izvodljivost isporučivanja CFTR iRNK do pluća ljudskog subjekta i pokazuju efikasnost in vivo proizvodnje CFTR proteina za terapeutsku upotrebu.
Primer 12: In vivo ekspresija u plućima
[0201] Ovaj primer pokazuje uspešnu in vivo ekspresiju u plućima nakon aerosolne dostave nanočestica napunjenih sa iRNK. Sve studije su izvedene korišćenjem svinja nemačke rase (German Landrace), dobijene od Tehničkog univerziteta u Minhenu, Veihenstephan, Nemačka. Svinje su imale telesnu težinu od 35-90 kg. Formulacija iRNK FFL / CO-CFTR-C-His10 ili kontrolnog nosača uneto je pomoću nebulizera Pari jet. Svinje su žrtvovane i perfuzirane fiziološkim rastvorom, nakon unapred utvrđenog vremenskog perioda, kako bi se omogućila ekspresija proteina sa iRNK.
[0202] Sinteza informacione RNK. U primeru, kodon optimizovana iRNK svetleća luciferaza (CO-FFL) sintetisana je in vitro transkripcijom sa plazmidnih DNK obrazaca.
[0203] cKK-E12 formulacija. Za eksperiment sa nanopartulama na bazi lipida kreirana je lipidna formulacija korišćenjem 1 mg FFL 9 mg CO-CFTR-C-His10 iRNK inkapsuliranih u formulaciji cKK-E12: DOPE: Chol: PEGDMG2K (relativni odnosi 40:30:25:5 (molarni odnos). Rastvor je raspršen do pluća svinja korišćenjem naznačenog inhalatora.
[0204] Primena aerosola. Aerosol (Fiziološki rastvor ili CO-FFL cKK-E12 formulacija) je bio raspršen i inhaliran u anesteziranu svinju. Sedacija (umirivanje) kod svinja započelo je pretretmanom korišćenjem azaperona 2 mg/kg telesne težine, ketamina 15 mg/kg telesne težine, atropina 0,1 mg/kg telesne težine praćeno ubacivanjem intravenoznog katetera u bočnu aurikularnu venu. Svinje su anestezirane intravenskom injekcijom propofola 3-5 mg/kg telesne težine, po potrebi. Anesteziju je održavao izofluran (2-3%) sa 1% propofol bolus injekcijom od 4 do 8 mg/kg telesne težine kako bi se poboljšala anestezija po potrebi. Trajanje anestezije bilo je približno 1-3 sata. Svinje su ubijene “bolusom” injekciranjem pentobarbitala (100 mg/kg telesne težine) i kalijum hlorida preko bočne vene uha. Urađena je ekscizija pluća i uzorci tkiva su sakupljeni iz različitih regiona pluća, nakon čega je sledila inkubacija u medijumu za ćelijsku kulturu preko noći. Sauvani uzorci su podvrgnuti detekciji bioluminiscencije.
[0205] Analiza bioluminiscencije. Za merenje aktivnosti luciferaze tkiva su ili homogenizovana i analizirana u cevnom luminometru ili inkubirana u medijumu koji sadrži substrat D-luciferin i podvrgnuti ex vivo BLI luciferazi. Jak bioluminiscirajući signal je primećen kod svih (A) svinja tretiranih FFL/CO-CFTR-C-His10 iRNK, u poređenju sa (B) kontrolnim uzorcima tkiva pluća od kontrolnih svinja (fiziološki rastvor dopremljen kao kontrola) (Slika 53 A&B).
[0206] Ovi podaci ilustruju da je FFL/CFTR iRNK uspešno isporučena i eksprimirana u plućima primenom aerosola.
[0228] Upotreba jednine kada se koristi zajedno sa izrazom obuhvata ‘sadrži’ u patentnim zahtevima i/ili specifikacija može značiti "jedan" ali može biti i u skladu sa značenjem "jedan ili više", " najmanje jedna", i "jedan ili vise od jedan". Upotreba izraza "ili" u patentnim zahtevima znači "i/ili" osim ako nije eksplicitno ukazano da se odnosi na alternative samo ili alternative u međusobno islkjučive, iako otkrivanje podržava definiciju da se odnosi na jedine alternative i "i/ili".
[0229] Ukoliko nije drugačije naglašeno, izraz "najmanje koji prethodi seriji elemenata treba da se razume da se odnosi na svaki pojedinačni element u seriji.
[0230] Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje kao oni koji se koriste u oblasti od strane običnih naučnika iz oblasti na koju se pronalazak odnosi.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. In vitro prepisana iRNK obuhvata kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80% identična SEQ ID NO: 3 za upotrebu u lečenju cistične fibroze kod sisara.
2. iRNK za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 1, što je kodirajuća sekvenca najmanje 90% ili 100% identična sa SEQ ID NO:
3. iRNK za upotrebu na osnovu patentnih zahteva 1 ili 2, što iRNK obuhvata 5’ netranslatirani region (UTR), 3’ UTR, kodirajuću skevencu za signalni peptid, strukturu kape i/ili strukturu repa.
4. iRNK za upotrebu na osnovu patentnog zahteva 3,što 5’-UTR sadrži SEQ ID NO: 4 i/ili 3’-UTR sadrži SEQ ID NO:5.
5. iRNK za upotrebu prema patentnim zahtevima 3 ili 4, što je struktura repa poli-A rep dužine od najmanje 70, 100, 120, 150, 200, ili 250 ostataka.
6. iRNK za upotrebu na osnovu bilo kojeg od patentnih zahteva 3-5, što je struktura kape cap1 struktura.
7. iRNK za upotrebu na osnovu bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, što iRNK obuhvata jedan ili više nestandardnih nukleotida, opcionalno gde jedan ili više nestandardnih nukleotida je/su odabrani od 5- metil-citidina, pseudouridina, i 2-tio-uridina.
8. iRNK za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, što se kompozicija daje preko pluća sisara putem inhalacije, intranazalne davanja, aerosolizacije ili raspršivanja.
9. iRNK za upotrebu na osnovu bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, što iRNK sadrži kodirajuću sekvencu koja kodira humani protein regulator transmembranske provodljivosti cistične fibroze (CFTR) koji ima sekvencu SEQ ID NO:1, opcionalno kada se humani CFTR eksprimira u epitelijalnim ćelijama pluća.
10. iRNK za upotrebu na osnovu bilo kojeg od prethodnih patentnih zahteva, što se iRNK daje sa nosačem.
11. Kompozicija koja sadrži iRNK i nosač, što je iRNK prepisana iRNK i ima kodirajuću sekvencu koja je najmanje 80% identična sa SEQ ID NO: 3.
12. iRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 10 ili kompozicija iz patentnog zahteva 11, što nosač sadrži organski katjon kao katjonski lipid ili katjonski organski polimer.
13. iRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 12 ili kompozicija iz patentnog zahteva 12, što je katjonski organski polimer odabran iz grupe koja se sastoji od polietilenimina (PEI), protamina, PEGilovanog protamina, poli-L-lizina (PLL), i PEGilovanog PLL.
14. iRNK za upotrebu prema patentnom zahtevu 13 ili kompozicija iz patentnog zahteva 13, što je PEI razgranat PEI sa molekulskom težinom u opsegu od 10 kDa do 40 kDa.
15. iRNK za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 10 i 12-14 ili kompozicija iz bilo kog od patentnih zahteva11-14, što je nosač lipozom.
RS20181158A 2013-03-14 2014-03-14 Kompozicije cftr irnk i postupci i upotrebe u vezi sa njima RS57739B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361783663P 2013-03-14 2013-03-14
EP14718284.4A EP2968586B1 (en) 2013-03-14 2014-03-14 Cftr mrna compositions and related methods and uses
PCT/US2014/028849 WO2014153052A2 (en) 2013-03-14 2014-03-14 Cftr mrna compositions and related methods and uses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS57739B1 true RS57739B1 (sr) 2018-12-31

Family

ID=50513499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181158A RS57739B1 (sr) 2013-03-14 2014-03-14 Kompozicije cftr irnk i postupci i upotrebe u vezi sa njima

Country Status (29)

Country Link
US (5) US9181321B2 (sr)
EP (2) EP3446712A1 (sr)
JP (5) JP6316930B2 (sr)
KR (3) KR102248744B1 (sr)
CN (2) CN115154620A (sr)
AU (3) AU2014236305B2 (sr)
BR (1) BR112015022868B1 (sr)
CA (1) CA2904151C (sr)
CL (1) CL2015002675A1 (sr)
CY (1) CY1120790T1 (sr)
DK (1) DK2968586T3 (sr)
EA (2) EA202190410A1 (sr)
ES (1) ES2689523T3 (sr)
HK (1) HK1218068A1 (sr)
HR (1) HRP20181580T1 (sr)
HU (1) HUE042640T2 (sr)
IL (5) IL290953B2 (sr)
LT (1) LT2968586T (sr)
MX (2) MX365409B (sr)
NZ (1) NZ751462A (sr)
PE (1) PE20151773A1 (sr)
PL (1) PL2968586T3 (sr)
PT (1) PT2968586T (sr)
RS (1) RS57739B1 (sr)
SG (2) SG11201507391VA (sr)
SI (1) SI2968586T1 (sr)
SM (1) SMT201800546T1 (sr)
UA (1) UA117008C2 (sr)
WO (1) WO2014153052A2 (sr)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ME03091B (me) 2009-12-01 2019-01-20 Translate Bio Inc Isporuka irnk za povećanje ekspresije proteina i enzima u humanim genetskim oboljenjima
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
US8853377B2 (en) * 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
EP3998064A1 (en) 2011-06-08 2022-05-18 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
PT2717893T (pt) 2011-06-08 2019-08-20 Translate Bio Inc Composições de nanopartículas lipídicas e métodos para transferência de arnm
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
KR20150128687A (ko) 2013-03-14 2015-11-18 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 정제 방법
CA2904151C (en) 2013-03-14 2023-09-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cftr mrna compositions and related methods and uses
CN105658800A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 Mrna的cns递送及其用途
WO2015061467A1 (en) 2013-10-22 2015-04-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipid formulations for delivery of messenger rna
EA201992208A1 (ru) 2013-10-22 2020-07-31 Транслейт Био, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
BR112016009014B1 (pt) 2013-10-22 2024-02-06 Translate Bio, Inc USO DE COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO mRNA PARA DEFICIÊNCIA DE ARGININOSSUCINATO SINTETASE
KR102739894B1 (ko) 2014-04-25 2024-12-05 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna 의 정제 방법
US10172924B2 (en) 2015-03-19 2019-01-08 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for pompe disease
DE112016002962T5 (de) 2015-06-30 2018-05-24 Ethris Gmbh Familie der ATP-bindenden Kassetten-codierende Polyribonucleotide und Formulierungen derselben
EP3405579A1 (en) 2016-01-22 2018-11-28 Modernatx, Inc. Messenger ribonucleic acids for the production of intracellular binding polypeptides and methods of use thereof
CN109072223B (zh) * 2016-04-08 2022-10-21 川斯勒佰尔公司 多聚体编码核酸及其用途
PT3377637T (pt) * 2016-04-08 2020-06-17 Krystal Biotech Inc Composições para uso em métodos para o tratamento de ferimentos, transtornos e doenças da pele
EP3442590A2 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
EP3458083B1 (en) 2016-05-18 2022-11-02 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-12 (il12) and uses thereof
EP3458108A4 (en) * 2016-05-18 2020-04-22 ModernaTX, Inc. POLYNUCLEOTIDES ENCODING A CYSTIC FIBROSIS TRANSMEMBRANE CONDUCTANCE REGULATOR FOR THE TREATMENT OF CYSTIC FIBROSIS
WO2017205739A1 (en) 2016-05-26 2017-11-30 University Of Iowa Research Foundation cis AND trans REQUIREMENTS FOR TERMINAL RESOLUTION OF HUMAN BOCAVIRUS 1
CN110114058B (zh) 2016-11-10 2023-05-26 川斯勒佰尔公司 用于递送mrna的改进的基于ice的脂质纳米颗粒制剂
KR102476709B1 (ko) 2016-11-21 2022-12-09 나노스트링 테크놀로지스, 인크. 화학적 조성물 및 이것을 사용하는 방법
CA3051136A1 (en) * 2017-01-27 2018-08-02 The Methodist Hospital Core/shell structure platform for immunotherapy
MX2019010155A (es) 2017-02-27 2020-12-10 Translate Bio Inc Arnm de cftr optimizado por codón novedoso.
WO2018157133A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
DK3585892T3 (da) 2017-02-27 2022-08-22 Translate Bio Inc Fremgangsmåder til oprensning af messenger-rna
WO2018160540A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Sanofi Therapeutic rna
CA3057768A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Accanis Biotech F&E Gmbh & Co Kg Prevention and treatment of non-melanoma skin cancer (nmsc)
EP3398963B1 (en) * 2017-05-04 2021-09-29 Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät Chemically modified mrna for use in the treatment of a disease associated with the cftr gene
WO2018213476A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
WO2018231990A2 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding methylmalonyl-coa mutase
US10034951B1 (en) 2017-06-21 2018-07-31 New England Biolabs, Inc. Use of thermostable RNA polymerases to produce RNAs having reduced immunogenicity
EP3437650A1 (en) 2017-07-31 2019-02-06 Accanis Biotech F&E GmbH & Co KG Treatment of local skin hypotrophy conditions
SG11202000765PA (en) * 2017-09-08 2020-03-30 Generation Bio Co Lipid nanoparticle formulations of non-viral, capsid-free dna vectors
WO2019200163A1 (en) 2018-04-12 2019-10-17 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of autosomal recessive congenital ichthyosis
AU2019260757B2 (en) 2018-04-27 2023-09-28 Krystal Biotech, Inc. Recombinant nucleic acids encoding cosmetic protein(s) for aesthetic applications
EP3794146B1 (en) 2018-05-14 2025-12-10 Bruker Spatial Biology, Inc. Method for identifying a predetermined nucleotide sequence
WO2020023533A1 (en) * 2018-07-23 2020-01-30 Translate Bio, Inc. Dry power formulations for messenger rna
WO2020041793A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
GB2592505B (en) * 2018-09-04 2023-05-03 Univ Texas Compositions and methods for organ specific delivery of nucleic acids
EP3849617A1 (en) * 2018-09-14 2021-07-21 Translate Bio, Inc. Composition and methods for treatment of methylmalonic acidemia
AU2019346549B2 (en) 2018-09-24 2024-09-12 Krystal Biotech, Inc. Compositions and methods for the treatment of Netherton Syndrome
CN113166737A (zh) 2018-10-04 2021-07-23 新英格兰生物实验室公司 提高转录的rna的加帽效率的方法和组合物
US11072808B2 (en) 2018-10-04 2021-07-27 New England Biolabs, Inc. Methods and compositions for increasing capping efficiency of transcribed RNA
AU2019376004B2 (en) 2018-11-08 2025-12-18 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for messenger RNA purification
US12280147B2 (en) 2018-11-09 2025-04-22 Translate Bio, Inc. PEG lipidoid compounds
MX2021005969A (es) 2018-11-21 2021-09-14 Translate Bio Inc Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr nebulizado.
BR112021014400A2 (pt) 2019-02-08 2021-09-21 Krystal Biotech, Inc. Genoma do vírus do herpes recombinante, vírus do herpes, composição farmacêutica, e, métodos para intensificar, aumentar, elevar e/ou suplementar os níveis de um polipeptídeo cftr em uma ou mais células, para reduzir ou inibir a destruição progressiva do pulmão, para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de fibrose cística e para fornecer alívio profilático, paliativo ou terapêutico de um ou mais sinais ou sintomas de copd
CN113396219A (zh) 2019-02-11 2021-09-14 埃泽瑞斯公司 通过切向流过滤纯化mRNA
CA3137015A1 (en) * 2019-04-15 2020-10-22 University Of Iowa Research Foundation Compositions and methods for treatment of cystic fibrosis
CN114340683A (zh) * 2019-04-15 2022-04-12 衣阿华大学研究基金会 用于转基因表达的方法和组合物
US20240197825A1 (en) * 2019-09-20 2024-06-20 Translate Bio, Inc. mRNA Encoding Engineered CFTR
CN116096430A (zh) * 2020-04-27 2023-05-09 衣阿华大学研究基金会 用于治疗囊性纤维化的组合物和方法
EP4143217A4 (en) 2020-05-01 2024-10-02 Arcturus Therapeutics, Inc. NUCLEIC ACIDS AND METHODS FOR TREATING CYSTIC FIBROSIS
CN114787206B (zh) 2020-09-16 2024-07-30 株式会社Lg化学 化合物、包含其的抗菌除臭组合物以及用于制备其的方法
EP4229208A4 (en) 2020-10-14 2024-10-30 George Mason Research Foundation, Inc. METHOD FOR THE PRODUCTION OF LIPID DNANOPARTICLES AND COMPOSITIONS THEREOF
JP2024511437A (ja) 2021-03-23 2024-03-13 リコード セラピューティクス，インク． ポリヌクレオチド組成物、関連製剤、およびその使用方法
CA3213789A1 (en) 2021-04-02 2022-10-06 Krystal Biotech, Inc. Viral vectors for cancer therapy
JP2024515668A (ja) * 2021-04-19 2024-04-10 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド Ｍｒｎａの送達のための改善された組成物
CN117881789A (zh) * 2021-06-09 2024-04-12 瑞科德治疗公司 多核苷酸组合物、相关制剂、及其使用方法
CN120693181A (zh) 2022-12-08 2025-09-23 瑞科德治疗公司 脂质纳米颗粒组合物及其用途
EP4434534A1 (en) 2023-03-22 2024-09-25 ADvantage Therapeutics, Inc. Klotho mrna
CN121712488A (zh) * 2023-08-14 2026-03-20 埃泽瑞斯公司 非全身性mRNA施用
US12364773B2 (en) 2023-12-01 2025-07-22 Recode Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof

Family Cites Families (439)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2647121A (en) 1951-02-02 1953-07-28 Ruth P Jacoby Diamine-bis-acetamides
US2819718A (en) 1953-07-16 1958-01-14 Isidore H Goldman Drainage tube
US2717909A (en) 1953-09-24 1955-09-13 Monsanto Chemicals Hydroxyethyl-keryl-alkylene-ammonium compounds
US2844629A (en) 1956-04-25 1958-07-22 American Home Prod Fatty acid amides and derivatives thereof
US3096560A (en) 1958-11-21 1963-07-09 William J Liebig Process for synthetic vascular implants
GB1072118A (en) 1962-12-01 1967-06-14 Sandoz Ag Amides of aminopropionic acid
JPS5141663B1 (sr) 1966-03-12 1976-11-11
JPS4822365B1 (sr) 1968-10-25 1973-07-05
NL143127B (nl) 1969-02-04 1974-09-16 Rhone Poulenc Sa Versterkingsorgaan voor een defecte hartklep.
US3614955A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Standby defibrillator and method of operation
US3614954A (en) 1970-02-09 1971-10-26 Medtronic Inc Electronic standby defibrillator
JPS5024216B1 (sr) 1970-12-29 1975-08-14
JPS5012146Y2 (sr) 1971-07-27 1975-04-15
US3945052A (en) 1972-05-01 1976-03-23 Meadox Medicals, Inc. Synthetic vascular graft and method for manufacturing the same
US3805301A (en) 1972-07-28 1974-04-23 Meadox Medicals Inc Tubular grafts having indicia thereon
JPS49127908A (sr) 1973-04-20 1974-12-07
JPS5624664B2 (sr) 1973-06-28 1981-06-08
US4013507A (en) 1973-09-18 1977-03-22 California Institute Of Technology Ionene polymers for selectively inhibiting the vitro growth of malignant cells
JPS5123537A (ja) 1974-04-26 1976-02-25 Adeka Argus Chemical Co Ltd Kasozaisoseibutsu
GB1527592A (en) 1974-08-05 1978-10-04 Ici Ltd Wound dressing
US3995623A (en) 1974-12-23 1976-12-07 American Hospital Supply Corporation Multipurpose flow-directed catheter
JPS5813576B2 (ja) 1974-12-27 1983-03-14 アデカ ア−ガスカガク カブシキガイシヤ 安定化された合成高分子組成物
US4281669A (en) 1975-05-09 1981-08-04 Macgregor David C Pacemaker electrode with porous system
DE2520814A1 (de) 1975-05-09 1976-11-18 Bayer Ag Lichtstabilisierung von polyurethanen
JPS5210847A (en) 1975-07-16 1977-01-27 Nippon Steel Corp Pinch roll
US4096860A (en) 1975-10-08 1978-06-27 Mclaughlin William F Dual flow encatheter
CA1069652A (en) 1976-01-09 1980-01-15 Alain F. Carpentier Supported bioprosthetic heart valve with compliant orifice ring
US4134402A (en) 1976-02-11 1979-01-16 Mahurkar Sakharam D Double lumen hemodialysis catheter
US4072146A (en) 1976-09-08 1978-02-07 Howes Randolph M Venous catheter device
US4335723A (en) 1976-11-26 1982-06-22 The Kendall Company Catheter having inflatable retention means
US4099528A (en) 1977-02-17 1978-07-11 Sorenson Research Co., Inc. Double lumen cannula
US4140126A (en) 1977-02-18 1979-02-20 Choudhury M Hasan Method for performing aneurysm repair
US4265745A (en) 1977-05-25 1981-05-05 Teijin Limited Permselective membrane
US4182833A (en) 1977-12-07 1980-01-08 Celanese Polymer Specialties Company Cationic epoxide-amine reaction products
US4180068A (en) 1978-04-13 1979-12-25 Motion Control, Incorporated Bi-directional flow catheter with retractable trocar/valve structure
DE2960875D1 (en) 1978-04-19 1981-12-10 Ici Plc A method of preparing a tubular product by electrostatic spinning
US4284459A (en) 1978-07-03 1981-08-18 The Kendall Company Method for making a molded catheter
US4227533A (en) 1978-11-03 1980-10-14 Bristol-Myers Company Flushable urinary catheter
US4375817A (en) 1979-07-19 1983-03-08 Medtronic, Inc. Implantable cardioverter
DE3010841A1 (de) 1980-03-21 1981-10-08 Ulrich Dr.med. 6936 Haag Uthmann Katheder
US4308085A (en) 1980-07-28 1981-12-29 Jenoptik Jena Gmbh Process for the preparation of high molecular thermoplastic epoxide-amine-polyadducts
US4339369A (en) 1981-04-23 1982-07-13 Celanese Corporation Cationic epoxide-amine reaction products
US4406656A (en) 1981-06-01 1983-09-27 Brack Gillium Hattler Venous catheter having collapsible multi-lumens
US4475972A (en) 1981-10-01 1984-10-09 Ontario Research Foundation Implantable material
US4401472A (en) 1982-02-26 1983-08-30 Martin Marietta Corporation Hydraulic cement mixes and processes for improving hydraulic cement mixes
US4568329A (en) 1982-03-08 1986-02-04 Mahurkar Sakharam D Double lumen catheter
US4546499A (en) 1982-12-13 1985-10-15 Possis Medical, Inc. Method of supplying blood to blood receiving vessels
US4530113A (en) 1983-05-20 1985-07-23 Intervascular, Inc. Vascular grafts with cross-weave patterns
US4550447A (en) 1983-08-03 1985-11-05 Shiley Incorporated Vascular graft prosthesis
US4647416A (en) 1983-08-03 1987-03-03 Shiley Incorporated Method of preparing a vascular graft prosthesis
US5104399A (en) 1986-12-10 1992-04-14 Endovascular Technologies, Inc. Artificial graft and implantation method
US4710169A (en) 1983-12-16 1987-12-01 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4571241A (en) 1983-12-16 1986-02-18 Christopher T Graham Urinary catheter with collapsible urethral tube
US4737518A (en) 1984-04-03 1988-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Lipid derivatives, their production and use
US4562596A (en) 1984-04-25 1986-01-07 Elliot Kornberg Aortic graft, device and method for performing an intraluminal abdominal aortic aneurysm repair
US4782836A (en) 1984-05-24 1988-11-08 Intermedics, Inc. Rate adaptive cardiac pacemaker responsive to patient activity and temperature
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4662382A (en) 1985-01-16 1987-05-05 Intermedics, Inc. Pacemaker lead with enhanced sensitivity
US4762915A (en) 1985-01-18 1988-08-09 Liposome Technology, Inc. Protein-liposome conjugates
US4860751A (en) 1985-02-04 1989-08-29 Cordis Corporation Activity sensor for pacemaker control
US5223263A (en) 1988-07-07 1993-06-29 Vical, Inc. Liponucleotide-containing liposomes
CA1320724C (en) 1985-07-19 1993-07-27 Koichi Kanehira Terpene amino alcohols and medicinal uses thereof
US4701162A (en) 1985-09-24 1987-10-20 The Kendall Company Foley catheter assembly
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
DE3616824A1 (de) 1986-05-17 1987-11-19 Schering Ag Verwendung von haertbaren kunstharzmischungen fuer oberflaechenbeschichtungen und druckfarben und verfahren zu ihrer herstellung
EP0255899B1 (de) 1986-07-31 1992-07-15 Werner Prof. Dr.-Ing. Irnich Frequenzadaptierender Herzschrittmacher
US4960409A (en) 1986-09-11 1990-10-02 Catalano Marc L Method of using bilumen peripheral venous catheter with adapter
JPH0829776B2 (ja) 1986-10-29 1996-03-27 東燃化学株式会社 合成樹脂製容器及びその製造用金型
US4720517A (en) 1986-11-24 1988-01-19 Ciba-Geigy Corporation Compositions stabilized with N-hydroxyiminodiacetic and dipropionic acids and esters thereof
US4920016A (en) 1986-12-24 1990-04-24 Linear Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
JPS63154788U (sr) 1987-03-31 1988-10-11
DE3728917A1 (de) 1987-08-29 1989-03-09 Roth Hermann J Neue lipide mit unsymmetrisch substituierter disulfidbruecke
US4946683A (en) 1987-11-18 1990-08-07 Vestar, Inc. Multiple step entrapment/loading procedure for preparing lipophilic drug-containing liposomes
US5138067A (en) 1987-12-17 1992-08-11 Shionogi & Co. Ltd. Lipid derivatives
US5047540A (en) 1987-12-17 1991-09-10 Shionogi & Co., Ltd. Lipid derivatives
US4892540A (en) 1988-04-21 1990-01-09 Sorin Biomedica S.P.A. Two-leaflet prosthetic heart valve
US5176661A (en) 1988-09-06 1993-01-05 Advanced Cardiovascular Systems, Inc. Composite vascular catheter
US5024671A (en) 1988-09-19 1991-06-18 Baxter International Inc. Microporous vascular graft
US5200395A (en) 1988-10-18 1993-04-06 Ajinomoto Company, Inc. Pharmaceutical composition of BUF-5 for treating anemia
CA2001401A1 (en) 1988-10-25 1990-04-25 Claude Piantadosi Quaternary amine containing ether or ester lipid derivatives and therapeutic compositions
ATE240401T1 (de) 1989-03-21 2003-05-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US6214804B1 (en) 1989-03-21 2001-04-10 Vical Incorporated Induction of a protective immune response in a mammal by injecting a DNA sequence
FR2645866B1 (fr) 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5194654A (en) 1989-11-22 1993-03-16 Vical, Inc. Lipid derivatives of phosphonoacids for liposomal incorporation and method of use
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5101824A (en) 1990-04-16 1992-04-07 Siemens-Pacesetter, Inc. Rate-responsive pacemaker with circuitry for processing multiple sensor inputs
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
EP0549590A1 (en) 1990-07-26 1993-07-07 LANE, Rodney James Self expanding vascular endoprosthesis for aneurysms
US5693338A (en) 1994-09-29 1997-12-02 Emisphere Technologies, Inc. Diketopiperazine-based delivery systems
DE69118083T2 (de) 1990-10-09 1996-08-22 Cook Inc Perkutane Stentanordnung
ATE120971T1 (de) 1990-12-19 1995-04-15 Osypka Peter Herzschrittmacherleitung mit einem inneren kanal und mit einem elektrodenkopf.
US5116360A (en) 1990-12-27 1992-05-26 Corvita Corporation Mesh composite graft
US5405363A (en) 1991-03-15 1995-04-11 Angelon Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5330768A (en) 1991-07-05 1994-07-19 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery using polymer/pluronic blends
US5545449A (en) 1991-10-02 1996-08-13 Weyerhaeuser Company Polyether-reinforced fiber-based materials
US6013638A (en) * 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US5151105A (en) 1991-10-07 1992-09-29 Kwan Gett Clifford Collapsible vessel sleeve implant
JPH0753535B2 (ja) 1992-02-14 1995-06-07 株式会社カワタ 粉粒体の材料供給装置における弁装置
US5284491A (en) 1992-02-27 1994-02-08 Medtronic, Inc. Cardiac pacemaker with hysteresis behavior
US5352461A (en) 1992-03-11 1994-10-04 Pharmaceutical Discovery Corporation Self assembling diketopiperazine drug delivery system
SE9200951D0 (sv) 1992-03-27 1992-03-27 Kabi Pharmacia Ab Pharmaceutical composition containing a defined lipid system
EP0635019B1 (en) 1992-04-06 1999-05-26 Biosite Diagnostics Inc. Opiate derivatives and protein and polypeptide opiate derivative conjugates and labels
US6670178B1 (en) 1992-07-10 2003-12-30 Transkaryotic Therapies, Inc. In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy
CA2141685A1 (en) 1992-08-04 1994-02-17 Koji Naito Antiallergic composition
US5334761A (en) 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
US5461223A (en) 1992-10-09 1995-10-24 Eastman Kodak Company Bar code detecting circuitry
US5300022A (en) 1992-11-12 1994-04-05 Martin Klapper Urinary catheter and bladder irrigation system
US5496362A (en) 1992-11-24 1996-03-05 Cardiac Pacemakers, Inc. Implantable conformal coil patch electrode with multiple conductive elements for cardioversion and defibrillation
US5552155A (en) 1992-12-04 1996-09-03 The Liposome Company, Inc. Fusogenic lipsomes and methods for making and using same
US5716395A (en) 1992-12-11 1998-02-10 W.L. Gore & Associates, Inc. Prosthetic vascular graft
EP0685234B1 (en) 1993-02-19 2000-05-10 Nippon Shinyaku Company, Limited Drug composition containing nucleic acid copolymer
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
US5697953A (en) 1993-03-13 1997-12-16 Angeion Corporation Implantable cardioverter defibrillator having a smaller displacement volume
US5624976A (en) 1994-03-25 1997-04-29 Dentsply Gmbh Dental filling composition and method
US5314430A (en) 1993-06-24 1994-05-24 Medtronic, Inc. Atrial defibrillator employing transvenous and subcutaneous electrodes and method of use
DE4325848A1 (de) 1993-07-31 1995-02-02 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin
EP0875280B1 (en) 1993-10-06 2001-08-22 The Kansai Electric Power Co., Inc. Method for removing carbon dioxide from combustion exhaust gas
US5609624A (en) 1993-10-08 1997-03-11 Impra, Inc. Reinforced vascular graft and method of making same
SE9303481L (sv) 1993-10-22 1995-04-23 Berol Nobel Ab Hygienkomposition
WO1995013033A1 (en) 1993-11-08 1995-05-18 Lazarus Harrison M Intraluminal vascular graft and method
JPH09505593A (ja) 1993-11-24 1997-06-03 メガバイオス・コーポレイション ピペラジンの両親媒性誘導体
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5464924A (en) 1994-01-07 1995-11-07 The Dow Chemical Company Flexible poly(amino ethers) for barrier packaging
US5844107A (en) 1994-03-23 1998-12-01 Case Western Reserve University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
ES2196028T3 (es) 1994-04-12 2003-12-16 Elan Pharm Inc Liposomas fusogenicos y metodos de fabricacion y utilizacion.
US5853717A (en) 1994-07-20 1998-12-29 Cytotherapeutics, Inc. Methods and compositions of growth control for cells encapsulated within bioartificial organs
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5641665A (en) 1994-11-28 1997-06-24 Vical Incorporated Plasmids suitable for IL-2 expression
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US6485726B1 (en) 1995-01-17 2002-11-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Receptor specific transepithelial transport of therapeutics
US5830430A (en) 1995-02-21 1998-11-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Cationic lipids and the use thereof
EP0822835A1 (en) 1995-04-17 1998-02-11 Imarx Pharmaceutical Corp. Hybrid magnetic resonance contrast agents
US5772694A (en) 1995-05-16 1998-06-30 Medical Carbon Research Institute L.L.C. Prosthetic heart valve with improved blood flow
US5783383A (en) 1995-05-23 1998-07-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Method of detecting cytomegalovirus (CMV)
US5705385A (en) 1995-06-07 1998-01-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US5609629A (en) 1995-06-07 1997-03-11 Med Institute, Inc. Coated implantable medical device
US5607385A (en) 1995-08-17 1997-03-04 Medtronic, Inc. Device and algorithm for a combined cardiomyostimulator and a cardiac pacer-carioverter-defibrillator
US5744335A (en) 1995-09-19 1998-04-28 Mirus Corporation Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein
FR2740978B1 (fr) 1995-11-10 1998-01-02 Ela Medical Sa Dispositif medical actif du type defibrillateur/cardioverteur implantable
US5874105A (en) 1996-01-31 1999-02-23 Collaborative Laboratories, Inc. Lipid vesicles formed with alkylammonium fatty acid salts
DE69730218D1 (de) 1996-04-11 2004-09-16 Univ British Columbia Fusogene liposomen
US5935936A (en) 1996-06-03 1999-08-10 Genzyme Corporation Compositions comprising cationic amphiphiles and co-lipids for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5913848A (en) 1996-06-06 1999-06-22 Luther Medical Products, Inc. Hard tip over-the-needle catheter and method of manufacturing the same
US5677124A (en) 1996-07-03 1997-10-14 Ambion, Inc. Ribonuclease resistant viral RNA standards
US5736573A (en) 1996-07-31 1998-04-07 Galat; Alexander Lipid and water soluble derivatives of drugs
US7288266B2 (en) 1996-08-19 2007-10-30 United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Liposome complexes for increased systemic delivery
ES2208936T3 (es) 1996-08-26 2004-06-16 Transgene S.A. Complejos de lipidos cationicos-acidos nucleicos.
CN1138533C (zh) 1996-09-13 2004-02-18 利普森有限公司 脂质体
TW520297B (en) 1996-10-11 2003-02-11 Sequus Pharm Inc Fusogenic liposome composition and method
AU738384B2 (en) 1996-11-04 2001-09-20 Qiagen Gmbh Cationic reagents for transfection
US6887665B2 (en) 1996-11-14 2005-05-03 Affymetrix, Inc. Methods of array synthesis
US5985930A (en) 1996-11-21 1999-11-16 Pasinetti; Giulio M. Treatment of neurodegenerative conditions with nimesulide
US6204297B1 (en) 1996-11-26 2001-03-20 Rhodia Inc. Nonionic gemini surfactants
JPH10197978A (ja) 1997-01-09 1998-07-31 Mitsubishi Paper Mills Ltd ハロゲン化銀写真感光材料
EP0853123A1 (de) 1997-01-10 1998-07-15 Roche Diagnostics GmbH Reinigung von DNA durch Cross-Flow-Filtration
FR2760193B1 (fr) 1997-02-28 1999-05-28 Transgene Sa Lipides et complexes de lipides cationiques et de substances actives, notamment pour la transfection de cellules
US5837283A (en) 1997-03-12 1998-11-17 The Regents Of The University Of California Cationic lipid compositions targeting angiogenic endothelial cells
US5945326A (en) 1997-03-20 1999-08-31 New England Biolabs, Inc. Method for cloning and producing the Spel restriction endonuclease
US6835395B1 (en) 1997-05-14 2004-12-28 The University Of British Columbia Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US20030104044A1 (en) 1997-05-14 2003-06-05 Semple Sean C. Compositions for stimulating cytokine secretion and inducing an immune response
JPH115786A (ja) 1997-06-13 1999-01-12 Pola Chem Ind Inc 新規アミノヒドロキシプロピルピペラジン誘導体
US6067471A (en) 1998-08-07 2000-05-23 Cardiac Pacemakers, Inc. Atrial and ventricular implantable cardioverter-defibrillator and lead system
JPH1180142A (ja) 1997-09-05 1999-03-26 Pola Chem Ind Inc ジフェニルアルキル化合物の製造法
AU9319398A (en) * 1997-09-19 1999-04-05 Sequitur, Inc. Sense mrna therapy
US6165763A (en) 1997-10-30 2000-12-26 Smithkline Beecham Corporation Ornithine carbamoyltransferase
US6096075A (en) 1998-01-22 2000-08-01 Medical Carbon Research Institute, Llc Prosthetic heart valve
US6617171B2 (en) 1998-02-27 2003-09-09 The General Hospital Corporation Methods for diagnosing and treating autoimmune disease
US6271209B1 (en) 1998-04-03 2001-08-07 Valentis, Inc. Cationic lipid formulation delivering nucleic acid to peritoneal tumors
US6176877B1 (en) 1998-04-20 2001-01-23 St. Jude Medical, Inc. Two piece prosthetic heart valve
DE19822602A1 (de) 1998-05-20 1999-11-25 Goldschmidt Ag Th Verfahren zur Herstellung von Polyaminosäureestern durch Veresterung von sauren Polyaminosäuren oder Umesterung von Polyaminosäureestern
NO313244B1 (no) 1998-07-08 2002-09-02 Crew Dev Corp Fremgangsmåte for isolering og produksjon av magnesitt eller magnesiumklorid
US6055454A (en) 1998-07-27 2000-04-25 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac pacemaker with automatic response optimization of a physiologic sensor based on a second sensor
US6312926B1 (en) 1998-08-14 2001-11-06 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey mRNA capping enzymes and uses thereof
AU771367B2 (en) 1998-08-20 2004-03-18 Cook Medical Technologies Llc Coated implantable medical device
US6210892B1 (en) 1998-10-07 2001-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alteration of cellular behavior by antisense modulation of mRNA processing
US6468793B1 (en) * 1998-10-23 2002-10-22 Florida State University Research Foundation CFTR genes and proteins for cystic fibrosis gene therapy
AU1830200A (en) 1998-11-25 2000-06-13 Vanderbilt University Cationic liposomes for gene transfer
US6248725B1 (en) 1999-02-23 2001-06-19 Amgen, Inc. Combinations and methods for promoting in vivo liver cell proliferation and enhancing in vivo liver-directed gene transduction
US6379698B1 (en) 1999-04-06 2002-04-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Fusogenic lipids and vesicles
JP5117648B2 (ja) 1999-04-20 2013-01-16 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア カチオン性ｐｅｇ脂質および使用方法。
US6169923B1 (en) 1999-04-23 2001-01-02 Pacesetter, Inc. Implantable cardioverter-defibrillator with automatic arrhythmia detection criteria adjustment
CN100512879C (zh) 1999-04-23 2009-07-15 阿尔萨公司 用于脂质体中的有可裂解键的缀合物
US7591333B1 (en) * 1999-05-17 2009-09-22 Edscha Ag Front hood assembly
DE60035871T2 (de) 1999-05-19 2008-06-05 Merck Patent Gmbh Expression und export von interferon-alpha proteinen als fc fusionsproteine
US6696424B1 (en) 1999-05-28 2004-02-24 Vical Incorporated Cytofectin dimers and methods of use thereof
US6346382B1 (en) 1999-06-01 2002-02-12 Vanderbilt University Human carbamyl phosphate synthetase I polymorphism and diagnostic methods related thereto
WO2001005375A1 (en) 1999-07-16 2001-01-25 Purdue Research Foundation Vinyl ether lipids with cleavable hydrophilic headgroups
JP2003505077A (ja) 1999-07-23 2003-02-12 ジェネンテック・インコーポレーテッド 平行流ろ過法を用いるｒｎａｓｅ−及び有機溶媒−非含有プラスミドｄｎａの精製方法
US6358278B1 (en) 1999-09-24 2002-03-19 St. Jude Medical, Inc. Heart valve prosthesis with rotatable cuff
US6371983B1 (en) 1999-10-04 2002-04-16 Ernest Lane Bioprosthetic heart valve
US7060291B1 (en) 1999-11-24 2006-06-13 Transave, Inc. Modular targeted liposomal delivery system
CN1433478A (zh) 1999-12-30 2003-07-30 诺瓦提斯公司 用于基因治疗的新的胶体合成载体
JP2003533437A (ja) 2000-02-17 2003-11-11 ジェンザイム・コーポレイション 遺伝子デリバリーのための門戸としての肺の遺伝的修飾
US6370434B1 (en) 2000-02-28 2002-04-09 Cardiac Pacemakers, Inc. Cardiac lead and method for lead implantation
US6565960B2 (en) 2000-06-01 2003-05-20 Shriners Hospital Of Children Polymer composite compositions
EP1297169B1 (en) 2000-06-26 2012-08-08 Ethris Gmbh Method for transfecting cells using a magnetic field
IL138474A0 (en) 2000-09-14 2001-10-31 Epox Ltd Highly branched water-soluble polyamine oligomers, process for their preparation and applications thereof
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
US6998115B2 (en) 2000-10-10 2006-02-14 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
USRE43612E1 (en) 2000-10-10 2012-08-28 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
DE60126801T2 (de) 2000-10-25 2007-12-06 The University Of British Columbia, Vancouver Lipidformulierungen zur zielgerichteten abgabe
GB0028361D0 (en) 2000-11-21 2001-01-03 Glaxo Group Ltd Method of separating extra chromosomal dna from other cellular components
US20020094528A1 (en) 2000-11-29 2002-07-18 Salafsky Joshua S. Method and apparatus using a surface-selective nonlinear optical technique for detection of probe-target interations
JP2002167368A (ja) 2000-12-01 2002-06-11 Nitto Denko Corp アルキル置換デンドリマーおよびその製造法
US20050004058A1 (en) 2000-12-07 2005-01-06 Patrick Benoit Sequences upstream of the carp gene, vectors containing them and uses thereof
DE10109897A1 (de) 2001-02-21 2002-11-07 Novosom Ag Fakultativ kationische Liposomen und Verwendung dieser
US20020192721A1 (en) 2001-03-28 2002-12-19 Engeneos, Inc. Modular molecular clasps and uses thereof
US7084303B2 (en) 2001-04-23 2006-08-01 Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. Tertiary amine compounds having an ester structure and processes for preparing same
US6585410B1 (en) 2001-05-03 2003-07-01 The United States Of America As Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration Radiant temperature nulling radiometer
US7514099B2 (en) 2005-02-14 2009-04-07 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
EP2842964A1 (de) 2001-06-05 2015-03-04 Curevac GmbH Virtuelles Verfahren zur Ermittlung einer modifzierten mRNA-Sequenz
JP4371812B2 (ja) 2001-09-28 2009-11-25 マックス−プランク−ゲゼルシャフト・ツア・フェルデルング・デア・ヴィッセンシャフテン・エー・ファオ マイクロｒｎａ分子
WO2003040288A2 (de) 2001-11-09 2003-05-15 Bayer Healthcare Ag Isotopencodierte affinitätsmarker 3
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
DE10207178A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Komponenten für die Herstellung amphoterer Liposomen
DE10214983A1 (de) 2002-04-04 2004-04-08 TransMIT Gesellschaft für Technologietransfer mbH Vernebelbare Liposomen und ihre Verwendung zur pulmonalen Applikation von Wirkstoffen
US20030215395A1 (en) 2002-05-14 2003-11-20 Lei Yu Controllably degradable polymeric biomolecule or drug carrier and method of synthesizing said carrier
US7601367B2 (en) 2002-05-28 2009-10-13 Mirus Bio Llc Compositions and processes using siRNA, amphipathic compounds and polycations
CA2488012A1 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Children's Hospital Medical Center Cftr modifier genes and expressed polypeptides useful in treating cystic fibrosis
DE60334618D1 (de) 2002-06-28 2010-12-02 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
US20040028804A1 (en) 2002-08-07 2004-02-12 Anderson Daniel G. Production of polymeric microarrays
EP1539936A2 (en) 2002-08-22 2005-06-15 Celltran Limited Cell culture surface
JP2006505644A (ja) 2002-11-04 2006-02-16 ジーイー・バイエル・シリコーンズ・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング・ウント・コンパニー・コマンジツトゲゼルシヤフト 線状ポリアミノおよび／またはポリアンモニウムポリシロキサン共重合体ｉ
AU2003281978A1 (en) 2002-11-22 2004-06-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh 2,5-diketopiperazines for the treatment of obesity
US7169892B2 (en) 2003-01-10 2007-01-30 Astellas Pharma Inc. Lipid-peptide-polymer conjugates for long blood circulation and tumor specific drug delivery systems
KR100774067B1 (ko) 2003-01-20 2007-11-06 아사히 가세이 일렉트로닉스 가부시끼가이샤 포인팅 디바이스
KR20050098954A (ko) 2003-03-05 2005-10-12 세네스코 테크놀로지스 인코포레이티드 이아이에프-5에이1의 발현을 억제하기 위한 안티센스올리고뉴클레오타이드 또는 에스아이알엔에이의 이용
US20040224912A1 (en) 2003-05-07 2004-11-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of PAI-1 mRNA-binding protein expression
US7619017B2 (en) 2003-05-19 2009-11-17 Wacker Chemical Corporation Polymer emulsions resistant to biodeterioration
EP1644479A4 (en) 2003-06-16 2008-04-23 Mark W Grinstaff MACROMOLECULES AND FUNCTIONAL SYNTHETIC MOLECULES FOR GENES ADMINISTRATION
KR101164256B1 (ko) 2003-09-15 2012-07-10 프로티바 바이오쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 폴리에틸렌글리콜 개질된 지질 화합물 및 그의 용도
EP1675943A4 (en) 2003-09-15 2007-12-05 Massachusetts Inst Technology SYNTHESIS OF BIOMATERIALS ARRANGED IN AN ARRAY IN THE NANOLITE ASSEMBLY AND SCREENING THEREOF
US20050069590A1 (en) 2003-09-30 2005-03-31 Buehler Gail K. Stable suspensions for medicinal dosages
WO2005035771A2 (en) 2003-10-10 2005-04-21 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid constructs
WO2005037226A2 (en) 2003-10-17 2005-04-28 Georgia Tech Research Corporation Genetically engineered enteroendocrine cells for treating glucose-related metabolic disorders
AU2004287652A1 (en) 2003-11-10 2005-05-19 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Diimonium salt compound and use thereof
US7022214B2 (en) 2004-01-21 2006-04-04 Bio-Rad Laboratories, Inc. Carrier ampholytes of high pH range
US7556684B2 (en) 2004-02-26 2009-07-07 Construction Research & Technology Gmbh Amine containing strength improvement admixture
US20060228404A1 (en) 2004-03-04 2006-10-12 Anderson Daniel G Compositions and methods for treatment of hypertrophic tissues
CA2567116A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Wyeth Enhancing protein expression
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
US7670595B2 (en) 2004-06-28 2010-03-02 Merck Patent Gmbh Fc-interferon-beta fusion proteins
GB0418172D0 (en) 2004-08-13 2004-09-15 Ic Vec Ltd Vector
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102004043342A1 (de) 2004-09-08 2006-03-09 Bayer Materialscience Ag Blockierte Polyurethan-Prepolymere als Klebstoffe
CA2586708A1 (en) 2004-11-05 2006-05-11 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions comprising an oligonucleotide as an active agent
GB0502482D0 (en) 2005-02-07 2005-03-16 Glaxo Group Ltd Novel compounds
EP1869106B1 (en) 2005-03-28 2014-06-25 Dendritic Nanotechnologies, Inc. Janus dendrimers and dendrons
EP1912679A4 (en) 2005-06-15 2009-07-29 Massachusetts Inst Technology AMINOUS LIPIDS AND ITS USES
US9012219B2 (en) 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
RS63964B1 (sr) 2005-08-23 2023-03-31 Univ Pennsylvania Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu
WO2007031091A2 (en) 2005-09-15 2007-03-22 Santaris Pharma A/S Rna antagonist compounds for the modulation of p21 ras expression
CN101346393B (zh) 2005-11-02 2015-07-22 普洛体维生物治疗公司 修饰的siRNA分子及其应用
US7238791B1 (en) 2005-12-16 2007-07-03 Roche Diagnostics Operations, Inc. 6-monoacetylmorphine derivatives useful in immunoassay
WO2007073489A2 (en) 2005-12-22 2007-06-28 Trustees Of Boston University Molecules for gene delivery and gene therapy, and methods of use thereof
CN100569877C (zh) 2005-12-30 2009-12-16 财团法人工业技术研究院 含多uv交联反应基的分枝状结构化合物及其应用
US20070281336A1 (en) 2006-04-14 2007-12-06 Epicentre Technologies Kits and methods for generating 5' capped RNA
US9085778B2 (en) 2006-05-03 2015-07-21 VL27, Inc. Exosome transfer of nucleic acids to cells
BRPI0711950A2 (pt) * 2006-05-19 2011-12-13 Scripps Research Inst tratamento para o dobramento inadequado da proteìna
US20070275923A1 (en) 2006-05-25 2007-11-29 Nastech Pharmaceutical Company Inc. CATIONIC PEPTIDES FOR siRNA INTRACELLULAR DELIVERY
WO2007143659A2 (en) 2006-06-05 2007-12-13 Massachusetts Institute Of Technology Crosslinked, degradable polymers and uses thereof
US20090186805A1 (en) 2006-07-06 2009-07-23 Aaron Thomas Tabor Compositions and Methods for Genetic Modification of Cells Having Cosmetic Function to Enhance Cosmetic Appearance
ES2293834B1 (es) 2006-07-20 2009-02-16 Consejo Superior Investig. Cientificas Compuesto con actividad inhibidora de las interacciones ubc13-uev, composiciones farmaceuticas que lo comprenden y sus aplicaciones terapeuticas.
CA2658768C (en) 2006-07-21 2016-05-17 Massachusetts Institute Of Technology End-modified poly(beta-amino esters) and uses thereof
EP2695608B1 (en) 2006-10-03 2016-11-23 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
US20110035819A1 (en) 2006-10-12 2011-02-10 Copernicus Therapeutics Inc. Codon optimized cftr
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
EP2104739B1 (en) 2006-12-21 2013-06-19 Novozymes Inc. Modified messenger rna stabilizing sequences for expressing genes in bacterial cells
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
US8859229B2 (en) 2007-02-02 2014-10-14 Yale University Transient transfection with RNA
WO2008113364A2 (en) 2007-03-20 2008-09-25 Recepticon Aps Amino derivatives to prevent nephrotoxicity and cancer
EP2141985B1 (en) * 2007-03-28 2018-10-17 University of Iowa Research Foundation Transgenic pig models of cystic fibrosis
JP5186126B2 (ja) 2007-03-29 2013-04-17 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 新規トリアジン誘導体ならびにその製法およびそのガス分離膜としての用途
ES2528414T3 (es) 2007-04-18 2015-02-10 Cornerstone Pharmaceuticals, Inc. Formulaciones farmacéuticas que contienen derivados de ácido lipoico
US8678686B2 (en) 2007-05-01 2014-03-25 Pgr-Solutions Multi-chain lipophilic polyamines
US20090163705A1 (en) 2007-05-21 2009-06-25 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cationic lipids
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
WO2009036280A1 (en) 2007-09-12 2009-03-19 Copernicus Therapeutics, Inc. Long-term in vivo transgene expression
WO2009046220A2 (en) 2007-10-02 2009-04-09 Mdrna, Inc. Lipopeptides for delivery of nucleic acids
WO2009046739A1 (en) 2007-10-09 2009-04-16 Curevac Gmbh Composition for treating prostate cancer (pca)
EP2221371B1 (en) 2007-11-22 2013-11-13 Japan Science and Technology Agency Translation regulation system in cell or artificial cell model by using low-molecular-weight rna
CA2910760C (en) 2007-12-04 2019-07-09 Muthiah Manoharan Targeting lipids
WO2009120247A2 (en) 2007-12-27 2009-10-01 The Ohio State University Research Foundation Lipid nanoparticle compositions and methods of making and using the same
EP2238251B1 (en) 2007-12-27 2015-02-11 Protiva Biotherapeutics Inc. Silencing of polo-like kinase expression using interfering rna
CA2711236A1 (en) 2008-01-02 2009-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Screening method for selected amino lipid-containing compositions
WO2009126933A2 (en) 2008-04-11 2009-10-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
US20090263407A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Abbott Laboratories Cationic Lipids and Uses Thereof
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
CA2726052A1 (en) 2008-06-04 2009-12-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Modulation of gene expression through endogenous small rna targeting of gene promoters
JP5024216B2 (ja) 2008-07-23 2012-09-12 トヨタ自動車株式会社 内燃機関の点火時期制御装置及び点火時期制御方法
US20100035249A1 (en) 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
DK2331954T3 (da) 2008-08-27 2020-04-06 Life Technologies Corp Apparat og fremgangsmåde til processering af biologiske prøver
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
JP5777519B2 (ja) 2008-10-09 2015-09-09 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法
CA2739046A1 (en) 2008-10-16 2010-04-22 Marina Biotech, Inc. Process and compositions for liposomal and effective delivery of nucleic acids
US9080211B2 (en) 2008-10-24 2015-07-14 Epicentre Technologies Corporation Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
US20120009222A1 (en) 2008-10-27 2012-01-12 Massachusetts Institute Of Technology Modulation of the immune response
WO2010053572A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
DK2355851T3 (en) 2008-11-10 2018-06-25 Arbutus Biopharma Corp Newly known lipids and compositions for release of therapeutic agents
US20110305769A1 (en) 2008-11-17 2011-12-15 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Branched cationic lipids for nucleic acids delivery system
US9023820B2 (en) 2009-01-26 2015-05-05 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein C-III expression
US20100222489A1 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Jiang Dayue D Copolymer composition, membrane article, and methods thereof
NZ594995A (en) 2009-03-12 2013-06-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc LIPID FORMULATED COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF HUMAN KINESIN FAMILY MEMBER 11 (Eg5) AND VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR (VEGF) GENES
CN102334237B (zh) 2009-04-02 2015-05-13 西蒙公司 电信接线板
DK2419144T3 (da) 2009-04-17 2019-10-21 Univ Oxford Innovation Ltd Sammensætning til levering af genetisk materiale
US9220682B2 (en) 2009-04-22 2015-12-29 Emory University Nanocarrier therapy for treating invasive tumors
CA2760776C (en) 2009-05-05 2019-07-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid compositions for the delivery of therapeutic agents
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
KR20120050429A (ko) 2009-06-15 2012-05-18 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｐｃｓｋ9 유전자를 표적으로 하는 지질 제형된 ｄｓｒｎａ
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
WO2011000106A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Improved cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011000108A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein b
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
CN102574818B (zh) 2009-07-30 2015-02-25 萨尔瓦特实验室股份有限公司 Apaf-1抑制剂化合物
BR112012002291A2 (pt) * 2009-07-31 2016-11-29 Ethris Gmbh "polirribonucleotídeo com uma sequência que codifica uma proteína ou fragmento de proteína, implante, e, processo para a seleção de sequências de nucleotídeos"
DE102009043342A1 (de) 2009-09-29 2011-03-31 Bayer Technology Services Gmbh Stoffe für selbstorganisierte Träger zur kontrollierten Freisetzung eines Wirkstoffs
ME03091B (me) 2009-12-01 2019-01-20 Translate Bio Inc Isporuka irnk za povećanje ekspresije proteina i enzima u humanim genetskim oboljenjima
SI3112467T1 (en) 2009-12-07 2018-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EP2338520A1 (de) 2009-12-21 2011-06-29 Ludwig Maximilians Universität Konjugat mit Zielfindungsligand und dessen Verwendung
WO2011076807A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
CA2800401C (en) 2010-06-03 2020-09-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
CN101863544B (zh) 2010-06-29 2011-09-28 湖南科技大学 一种氰尿酸基重金属螯合絮凝剂及其制备方法
US9006417B2 (en) 2010-06-30 2015-04-14 Protiva Biotherapeutics, Inc. Non-liposomal systems for nucleic acid delivery
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
US9193827B2 (en) 2010-08-26 2015-11-24 Massachusetts Institute Of Technology Poly(beta-amino alcohols), their preparation, and uses thereof
DK4108671T3 (da) 2010-10-01 2025-01-06 Modernatx Inc Modificerede nukleosider, nukleotider og nukleinsyrer samt anvendelser deraf
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
US9238716B2 (en) 2011-03-28 2016-01-19 Massachusetts Institute Of Technology Conjugated lipomers and uses thereof
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
WO2012133737A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 公益財団法人地球環境産業技術研究機構 架橋性アミン化合物、該化合物を用いた高分子膜及びその製造方法
EP2705152B1 (en) 2011-05-04 2017-10-25 The Broad Institute, Inc. Multiplexed genetic reporter assays and compositions
CA2835428A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
EP2532649B1 (en) 2011-06-07 2015-04-08 Incella GmbH Amino lipids, their synthesis and uses thereof
PT2717893T (pt) 2011-06-08 2019-08-20 Translate Bio Inc Composições de nanopartículas lipídicas e métodos para transferência de arnm
EP3998064A1 (en) 2011-06-08 2022-05-18 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
US9862926B2 (en) 2011-06-27 2018-01-09 Cellscript, Llc. Inhibition of innate immune response
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2755986A4 (en) 2011-09-12 2015-05-20 Moderna Therapeutics Inc MANIPULATED NUCLEIC ACIDS AND METHOD OF APPLICATION THEREFOR
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP6113737B2 (ja) 2011-10-03 2017-04-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法
US8999950B2 (en) 2011-10-05 2015-04-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing aldehyde dehydrogenase
MX363734B (es) 2011-10-27 2019-03-29 Massachusetts Inst Technology Derivados de aminoacidos funcionalizados en la terminal n capaces de formar microesferas encapsuladoras de farmaco.
WO2013090186A1 (en) 2011-12-14 2013-06-20 modeRNA Therapeutics Modified nucleic acids, and acute care uses thereof
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
CA2859691A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Moderna Therapeutics, Inc. Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
WO2013101690A1 (en) 2011-12-29 2013-07-04 modeRNA Therapeutics Modified mrnas encoding cell-penetrating polypeptides
EP3421601B1 (en) 2011-12-30 2019-12-04 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
NZ700075A (en) 2012-02-24 2016-05-27 Protiva Biotherapeutics Inc Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
CN104487055A (zh) 2012-03-29 2015-04-01 夏尔人类遗传性治疗公司 脂质衍生的中性纳米颗粒
HK1206645A1 (en) 2012-03-29 2016-01-15 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Ionizable cationic lipids
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
HK1206612A1 (en) 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US20140275229A1 (en) 2012-04-02 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides encoding udp glucuronosyltransferase 1 family, polypeptide a1
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US20150050354A1 (en) 2012-04-02 2015-02-19 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the treatment of otic diseases and conditions
US20150126589A1 (en) 2012-06-08 2015-05-07 Ethris Gmbh Pulmonary Delivery of Messenger RNA
BR112014030677A2 (pt) 2012-06-08 2022-07-19 Shire Human Genetic Therapies distribuição pulmonar de mrna para células-alvo não-pulmonares
US20150267192A1 (en) 2012-06-08 2015-09-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Nuclease resistant polynucleotides and uses thereof
CA2884870C (en) 2012-08-13 2022-03-29 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipidoids and uses thereof
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
WO2014089486A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lipidic nanoparticles for mrna delivering
EP2931319B1 (en) 2012-12-13 2019-08-21 ModernaTX, Inc. Modified nucleic acid molecules and uses thereof
US20150315541A1 (en) 2012-12-13 2015-11-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for altering cell phenotype
JP2016504050A (ja) 2013-01-17 2016-02-12 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 細胞表現型の改変のためのシグナルセンサーポリヌクレオチド
EP2968397A4 (en) 2013-03-12 2016-12-28 Moderna Therapeutics Inc DIAGNOSIS AND TREATMENT OF FIBROSIS
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
HUE055044T2 (hu) 2013-03-14 2021-10-28 Translate Bio Inc MRNS-kódolt ellenanyagok bejuttatására szolgáló eljárások és készítmények
CA2904151C (en) 2013-03-14 2023-09-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cftr mrna compositions and related methods and uses
JP2016515216A (ja) 2013-03-14 2016-05-26 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド メッセンジャーｒｎａのキャップ効率の定量的評価
KR20150128687A (ko) 2013-03-14 2015-11-18 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 메신저 rna의 정제 방법
WO2014152659A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Quantitative assessment for cap efficiency of messenger rna
US20160184458A1 (en) 2013-03-14 2016-06-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
KR20150127582A (ko) 2013-03-14 2015-11-17 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 4''-티오 개질된 뉴클레오티드를 갖는 리보핵산 및 관련 방법
WO2014152030A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Removal of dna fragments in mrna production process
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
US11377470B2 (en) 2013-03-15 2022-07-05 Modernatx, Inc. Ribonucleic acid purification
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
US20160017313A1 (en) 2013-03-15 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Analysis of mrna heterogeneity and stability
ES3032013T3 (en) 2013-03-15 2025-07-14 Translate Bio Inc Synergistic enhancement of the delivery of nucleic acids via blended formulations
EP3578663A1 (en) 2013-03-15 2019-12-11 ModernaTX, Inc. Manufacturing methods for production of rna transcripts
US20160032273A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Moderna Therapeutics, Inc. Characterization of mrna molecules
WO2014179562A1 (en) 2013-05-01 2014-11-06 Massachusetts Institute Of Technology 1,3,5-triazinane-2,4,6-trione derivatives and uses thereof
WO2014210356A1 (en) 2013-06-26 2014-12-31 Massachusetts Institute Of Technology Multi-tailed lipids and uses thereof
DK3019619T3 (da) 2013-07-11 2021-10-11 Modernatx Inc Sammensætninger, der omfatter syntetiske polynukleotider, som koder for crispr-beslægtede proteiner, og syntetiske sgrna'er, og anvendelsesfremgangsmåder
WO2015011633A1 (en) 2013-07-23 2015-01-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for delivering messenger rna
AU2014315287A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
EP3041938A1 (en) 2013-09-03 2016-07-13 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
WO2015051173A2 (en) 2013-10-02 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc Polynucleotide molecules and uses thereof
EP3052511A4 (en) 2013-10-02 2017-05-31 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide molecules and uses thereof
AU2014337156A1 (en) 2013-10-18 2016-05-12 Modernatx, Inc. Compositions and methods for tolerizing cellular systems
EA201992208A1 (ru) 2013-10-22 2020-07-31 Транслейт Био, Инк. ЛЕЧЕНИЕ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
CN105658800A (zh) 2013-10-22 2016-06-08 夏尔人类遗传性治疗公司 Mrna的cns递送及其用途
BR112016009014B1 (pt) 2013-10-22 2024-02-06 Translate Bio, Inc USO DE COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO mRNA PARA DEFICIÊNCIA DE ARGININOSSUCINATO SINTETASE
EP3076994A4 (en) 2013-12-06 2017-06-07 Modernatx, Inc. Targeted adaptive vaccines
EP3053585A1 (en) 2013-12-13 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Alternative nucleic acid molecules and uses thereof
WO2015101414A2 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules
US20170002060A1 (en) 2014-01-08 2017-01-05 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides for the in vivo production of antibodies
US10307472B2 (en) 2014-03-12 2019-06-04 Curevac Ag Combination of vaccination and OX40 agonists
RU2021109685A (ru) 2014-04-23 2021-04-13 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот
CR20170174A (es) 2014-10-02 2017-11-07 Protiva Biotherapeutics Inc Composiciones y métodos para el silenciamiento de la expresión cénica del virus de la hepatitis b
WO2016071857A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus expression
EP4324473A3 (en) 2014-11-10 2024-05-29 ModernaTX, Inc. Multiparametric nucleic acid optimization
EP3041948B1 (en) 2014-11-10 2019-01-09 Modernatx, Inc. Alternative nucleic acid molecules containing reduced uracil content and uses thereof
US20180000953A1 (en) 2015-01-21 2018-01-04 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
EP3247398A4 (en) 2015-01-23 2018-09-26 Moderna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle compositions
US20180245077A1 (en) 2015-03-20 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for treating hypertriglyceridemia
WO2016164762A1 (en) 2015-04-08 2016-10-13 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor egf-a and intracellular domain mutants and methods of using the same
WO2016183366A2 (en) 2015-05-12 2016-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing expression of hepatitis d virus rna
WO2016197133A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Protiva Biotherapeutics, Inc. Delivering crispr therapeutics with lipid nanoparticles
US20180245074A1 (en) 2015-06-04 2018-08-30 Protiva Biotherapeutics, Inc. Treating hepatitis b virus infection using crispr
EP3307305A4 (en) 2015-06-10 2019-05-22 Modernatx, Inc. TARGETED ADAPTIVE VACCINES
EP3329003A2 (en) 2015-07-29 2018-06-06 Arbutus Biopharma Corporation Compositions and methods for silencing hepatitis b virus gene expression
PL3350333T3 (pl) 2015-09-17 2022-03-07 Modernatx, Inc. Polinukleotydy zawierające region stabilizujący ogon
WO2017049286A1 (en) 2015-09-17 2017-03-23 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides containing a morpholino linker
US20190054112A1 (en) 2015-09-18 2019-02-21 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotide formulations for use in the treatment of renal diseases
EP3784284B1 (en) 2018-04-25 2023-08-02 Ethris GmbH Lipid-based formulations for the delivery of rna

Also Published As

Publication number Publication date
AU2021215095A1 (en) 2021-08-26
US20160106772A1 (en) 2016-04-21
EA037922B1 (ru) 2021-06-07
KR20210122917A (ko) 2021-10-12
JP2022022419A (ja) 2022-02-03
AU2014236305A1 (en) 2015-09-24
US20200046752A1 (en) 2020-02-13
JP2018100307A (ja) 2018-06-28
JP2020169218A (ja) 2020-10-15
CL2015002675A1 (es) 2016-06-10
IL262984B (en) 2021-05-31
CA2904151C (en) 2023-09-12
HK1220137A1 (en) 2017-04-28
IL290953B1 (en) 2023-09-01
JP2016517437A (ja) 2016-06-16
PE20151773A1 (es) 2015-12-20
US9713626B2 (en) 2017-07-25
IL240982A0 (en) 2015-11-30
AU2019202582B2 (en) 2021-05-27
KR20160010398A (ko) 2016-01-27
KR20210049986A (ko) 2021-05-06
EP3446712A1 (en) 2019-02-27
MX393573B (es) 2025-03-21
HUE042640T2 (hu) 2019-07-29
US20180015116A1 (en) 2018-01-18
EA202190410A1 (ru) 2022-03-31
SG11201507391VA (en) 2015-10-29
JP6316930B2 (ja) 2018-04-25
EA201591477A1 (ru) 2016-03-31
AU2019202582A1 (en) 2019-07-25
KR102311614B1 (ko) 2021-10-08
CY1120790T1 (el) 2019-12-11
IL240982B (en) 2018-11-29
LT2968586T (lt) 2018-11-26
BR112015022868B1 (pt) 2023-05-16
JP7236525B2 (ja) 2023-03-09
AU2021215095B2 (en) 2024-09-19
KR102248744B1 (ko) 2021-05-06
EP3446712A8 (en) 2019-04-10
MX2015012333A (es) 2016-05-31
SMT201800546T1 (it) 2019-01-11
SG10201710253QA (en) 2018-01-30
PL2968586T3 (pl) 2019-01-31
EP2968586B1 (en) 2018-07-25
IL262984A (en) 2018-12-31
AU2014236305B2 (en) 2019-01-17
ES2689523T3 (es) 2018-11-14
NZ711657A (en) 2021-01-29
MX365409B (es) 2019-05-31
IL282453B (en) 2022-03-01
IL305374A (en) 2023-10-01
PT2968586T (pt) 2018-11-13
JP6738366B2 (ja) 2020-08-12
IL290953B2 (en) 2024-01-01
BR112015022868A2 (pt) 2017-11-07
US11510937B2 (en) 2022-11-29
CN115154620A (zh) 2022-10-11
US10420791B2 (en) 2019-09-24
HRP20181580T1 (hr) 2019-02-22
NZ751462A (en) 2021-07-30
WO2014153052A2 (en) 2014-09-25
CA2904151A1 (en) 2014-09-25
UA117008C2 (uk) 2018-06-11
CN105142676A (zh) 2015-12-09
US9181321B2 (en) 2015-11-10
JP2023054353A (ja) 2023-04-13
WO2014153052A3 (en) 2015-09-24
EP2968586A2 (en) 2016-01-20
US20230302039A1 (en) 2023-09-28
SI2968586T1 (sl) 2018-12-31
US20150038556A1 (en) 2015-02-05
CN105142676B (zh) 2022-06-28
IL282453A (en) 2021-06-30
DK2968586T3 (en) 2018-10-08
HK1218068A1 (zh) 2017-02-03
IL290953A (en) 2022-04-01
WO2014153052A9 (en) 2015-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230302039A1 (en) Cftr mrna compositions and related methods and uses
HK40005353A (en) Cftr mrna compositions and related methods and uses
EA047691B1 (ru) КОМПОЗИЦИИ mPHK CFTR И СВЯЗАННЫЕ С НИМИ СПОСОБЫ И ВАРИАНТЫ ПРИМЕНЕНИЯ
HK1220137B (en) Cftr mrna compositions and related methods and uses
NZ711657B2 (en) Cftr mrna compositions and related methods and uses