ES2669984T3 - Antagonistas de IL17C para el tratamiento de trastornos inflamatorios - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, específico para IL17C, para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, en donde dicho trastorno inflamatorio es inflamación pulmonar, artritis reumatoide y/o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), en donde la IL17C consiste en los aminoácidos de la SEQ. ID No.: 181 y en donde dicho anticuerpo bloquea la unión de la IL17C a IL17RE.

Description

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DESCRIPCION

Antagonistas de IL17C para el tratamiento de trastornos inflamatorios Campo de la invención

La presente solicitud se refiere a antagonistas de IL17C para uso en el tratamiento de trastornos inflamatorios, tales como la artritis. Son antagonistas de IL17C ejemplares los anticuerpos específicos de IL17C o sus fragmentos, tales como los anticuerpos anti-IL17C humanos.

Antecedentes

La IL17C es un homodímero con uniones disulfuro segregado de la familia de las proteínas IL17. Se ha demostrado in vitro que la IL17C estimula la liberación de TNF-a e IL-1p de la estirpe celular monocítica THP-1 (Li et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. UU. EE. 97, 773-8). La IL17C puede inducir la expresión del ARNm de citocinas inflamatorias tales como IL-1p, IL-6 e IL-23 en células de exudado peritoneal (PECS, por sus siglas en inglés) y la estirpe celular 3T3 (Yamaguchi et al. (2007) J. Immunol 179, 7l28-36. Las células T CD4+ in vivo transducidas con IL17C exacerbaron la artritis inducida por colágeno (CIA, por sus siglas en inglés) en ratones y los ratones reconstituidos con células de médula ósea transducidas con IL17C experimentaron artritis inducida por colágeno grave. Se indicó que la IL17C se unía a receptor E de la IL-17 (IL17RE/Fc) y parecía que activaba NF-kB (Calhoun (2007) Tesina de licenciatura: Generation of proof of concept molecules: Neutralizing monoclonal antibodies to IL17C; Universidad Estatal de Oregón, Honours College de la Universidad; Gaffen (2009) Nat Rev. Immunol 9, 556-67) y también se indicó que afectaba al miembro de la familia IkappaB nuclear, IkBZ en la activación de células Th17 en ratones deficientes en IL17C (Chang et al. (2011) Immunity 35, 611-621). La expresión de la IL17C en tejido normal parece estar restringido a riñón adulto y fetal. La expresión del ARNm de la IL17c en las patas artríticas de ratones con CIA es muy elevada. Hwang et al., describen la expresión de la IL17C en células mononucleares de fluido sinovial y sangre periférica de pacientes con artritis reumatoide (Hwang & Kim (2005) Mol Cells 19, 180-184).

La patente internacional WO 99/060127 describe la clonación de IL17C (PRO1122). La patente internacional WO 99/060127 asoció vagamente ciertos trastornos con IL17C, incluyendo la artritis (por ejemplo, artrosis, artritis reumatoide, artritis psoriásica), septicemia, colitis ulcerosa, psoriasis, esclerosis múltiple, diabetes tipo I, artritis de células gigantes, lupus eritematoso sistémico y síndrome de Sjogren. También se considera que los compuestos de la patente internacional WO 99/060127 pueden usarse para tratar varias enfermedades, incluyendo las caracterizadas por la sobreexpresión y/o activación de los genes asociados a la enfermedad identificados en la presente memoria. Sin embargo, no se proporciona prueba experimental para esta función especulativa de la IL17C. Lo mismo se aplica para la patente internacional WO 2005/065711.

Además, Yamaguchi et al., (Yamaguchi et al., The Journal of Immunology, 2007, 179: 7128:7136) establecieron la expresión del ARNm de la familia de la IL17 completa e identificaron que no sólo la IL17A sino también la IL17B e IL17C se sobreexpresaban en las células artríticas. Ramirez-Carrozzi et al., (Ramirez-Carrozzi et al., (2011) Nature Immunol. 12(12) 1159-1166) describen que los ratones IL-17C k/o muestran una respuesta más débil al imiquimod y menos inflamación y engrosamiento epidérmico y postula una potencial función de la IL17C en la patogénesis de la psoriasis.

La presente invención demuestra por primera vez en experimentos in vivo que los anticuerpos específicos para IL17C son muy eficaces en el tratamiento de trastornos inflamatorios.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado específico para IL17C para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, en donde dicho trastorno inflamatorio es inflamación pulmonar, artritis reumatoide y/o EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), en donde la IL17C consiste en los aminoácidos de la SEQ. ID No.: 181 y en donde dicho anticuerpo bloquea la unión de la IL17C a la IL17RE.

Preferiblemente, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado específico para IL17 es un anticuerpo monoclonal.

Leyendas de las figuras

La figura 1A muestra el ensayo establecido para un ensayo de la interacción del receptor. Las proteínas de fusión con DEC (dominio extracelular) de los receptores de la IL17 se recubrieron en una placa de 384 pozos Multi-array®. Se aplicó IL17C de ratones biotinilados y se detectó vía estreptavidina.

La figura 1B muestra los resultados del ensayo de interacción de los receptores mostrado en la figura 1A. Se encontró claramente que la IL17C se unía a IL17RE/Fc de ratón, pero no a IL-17RB ratón u otro receptor irrelevante.

La figura 1C muestra los resultados del ensayo de interacción de los receptores mostrado en la figura 1A. Ninguno de los tres anticuerpos de la técnica anterior inhibe la unión de IL17C de ratón a IL17RE/Fc de

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ratón.

La figura 2 muestra los resultados del control de calidad basados en cromatografía de exclusión por tamaños (SEC, por sus siglas en inglés).

La figura 3 muestra los resultados de la determinación de EC50 en ELISA. Se valoraron todos los anticuerpos IgG2a humanos quiméricos-de ratón quiméricos, purificados, en IL17C de ratón partiendo de una concentración 100 nM.

La figura 4 muestra afinidades monovalentes de anticuerpos anti-IL17C. Se determinaron las afinidades por valoración de equilibrio de disolución (SET, por sus siglas en inglés) usando fragmentos Fab.

La figura 5 muestra los valores IC50 determinados en el ensayo de la inhibición de receptor E de la IL-17 descrito en el ejemplo 11.

La figura 6 muestra los resultados de un ensayo de estabilidad de suero de ratón. 11 IgG purificadas presentaron rendimientos de producción aceptables y unión específica a IL17C de ratón después de 24 h de incubación con suero de ratón.

La figura 7 muestra los resultados de la administración de MOR12743 y MOR12762 en la puntuación clínica en el protocolo de tratamiento del modelo de CIA de ratón comparado con vehículo, Enbrel® (etanercept) y un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 8 muestra los resultados de la administración de MOR12743 y MOR12762 en el ABC (área bajo la curva) de la puntuación clínica en el protocolo de tratamiento del modelo de CIA de ratón comparado con vehículo, Enbrel® (etanercept) y un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 9 muestra los resultados de la administración de MOR12762 en la puntuación de Larsen en el protocolo de profilaxis del modelo de CIA de ratón comparado con un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 10 muestra los resultados de la administración de MOR12762 o MOR12743 en la selección de células inflamatorias en BALF en un modelo de ratón de neutrofilia pulmonar aguda comparado con un anticuerpo de control (MOR03207).

La figura 11 muestra los resultados de la caracterización de la expresión de la IL17C usando qRT-PCR. Se detectaron niveles aumentados de expresión de IL17C en muestras de tejido pulmonar procedentes de donadores con enfermedades respiratorias inflamatorias diagnosticadas en comparación con los niveles de expresión de la IL17C en las muestras de control. Se analizaron muestras de 5 donadores individuales para cada grupo.

La figura 12 muestra el efecto de anticuerpos neutralizantes de MOR1243 sobre el grosor epidérmico en modelo de ratón de tipo psoriasis de imiquimod (IMQ).

La figura 13A muestra los resultados del ensayo RT-PCR cuantitativo de expresión de ARNm de IL17C en queratinocitos epidémicos humanos tratados durante 2 h, 6 h, 24 h o 48 h con medio solo, IL-1 (10 ng/mL), TNF (10 ng/mL), IL-17A (250 ng/mL) o combinaciones de estos factores desencadenantes.

La figura 13B muestra los resultados del ensayo RT-PCR cuantitativo de expresión de ARNm de IL17C en queratinocitos epidémicos humanos tratados durante 2 h, 6 h o 24 h con medio solo o varios ligandos TLR: ligando LPS de TLR4 (1 pg/mL), ligando flagelina de TLR5 (1 pg/mL), ligando guardiquimod de TLR7 (4 |jg/mL), ligando CL097 de TLR7/8 (10 pg/mL) y ligando de TLR9 CpG ODN 2116 (10 pM).

Descripción detallada de la invención

El alcance de la invención se define por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención demuestra que la IL17C es una diana válida para el tratamiento de trastornos inflamatorios. Con respecto a esto, la invención proporciona, en un aspecto, métodos para usar un antagonista de IL17C para provocar un beneficio profiláctico o terapéutico en el tratamiento de trastornos inflamatorios.

La presente descripción proporciona métodos terapéuticos que comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de un antagonista de IL17c a un individuo con necesidad de dicho tratamiento. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz", como se usa en la presente memoria, se refiere a la cantidad de un antagonista de IL17C necesaria para obtener la respuesta biológica deseada. Según esto, la cantidad terapéutica eficaz es la cantidad de un antagonista de IL17C necesaria para tratar y/o prevenir un trastorno inflamatorio.

Los términos "trastorno inflamatorio" o "enfermedad inflamatoria" se usan indistintamente y como se usan en la presente memoria se refieren a cualquier anormalidad asociada a inflamación. Ejemplos de trastornos asociados a inflamación incluyen: acné común, artritis, tal como artritis reumatoide, asma, enfermedades autoinmunitarias,

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prostatitis crónica, EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), glomerulonefritis, hipersensibilidades, enfermedades del intestino inflamado, enfermedad pélvica inflamatoria, daño por reperfusión, sarcoidosis, rechazo de trasplante, vasculitis, cistitis intersticial y septicemia. Los trastornos inflamatorios pueden ser crónicos o agudos. Ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen: espondilitis anquilosante, enfermedad de Crohn, diabetes sacarina tipo I, gastritis, síndrome de Guillain-Barré, púrpura trombocitopénica idiopática, lupus eritematoso, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis psoriásica, síndrome de piernas inquietas, artritis reumatoide, sarcoidosis, esclerodermia, lupus eritematoso sistémico y colitis ulcerosa.

La artritis puede manifestarse como la forma principal de una enfermedad. Este es el caso, por ejemplo, de la artrosis, artritis reumatoide, artritis séptica, gota y pseudogota, artritis idiopática juvenil, enfermedad de Still y espondilitis anquilosante. Otras formas de artritis son secundarias a otra enfermedad, por ejemplo, síndrome de Ehlers-Danlos, sarcoidosis, púrpura de Henoch-Schonlein, artritis psoriásica, artritis reactiva, hemocromatosis, hepatitis, granulomatosis de Wegener (y otros síndromes de vasculitis), enfermedad de Lyme, fiebre mediterránea familiar, hiperinmunoglobulinemia D con fiebre recurrente, síndrome periódico asociado a receptor de TNF y enfermedad inflamatoria intestinal (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa).

El término "inflamación pulmonar" incluye cualquier enfermedad pulmonar inflamatoria, bronquitis crónica aguda, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, fibrosis pulmonar, síndrome de Goodpasture y cualquier afección pulmonar en que los glóbulos blancos puedan desempeñar una función que incluye, pero no se limita a, fibrosis pulmonar idiopática y cualquier otra enfermedad pulmonar autoinmunitaria.

El término "IL17C" se refiere a una proteína conocida como interleucina 17C (identificada en el Comité de Nomenclatura de Genes de HUGO (HGNC, por sus siglas en inglés) por las bases de datos ID 5983 y en Genoma del ratón Informática (MGI, por sus siglas en inglés) por ID 2446486). La IL17C en algunas publicaciones más antiguas se refiere como CX2 o IL-21, sin embargo, no debe confundirse con citocina IL-21, que se expresa de manera específica en células T CD4+ activadas, pero no la mayoría de otros tejidos (Parrish-Novak et al (2000). Nature 408 (6808): 57-63). La IL-21 humana se localiza en el cromosoma 4 y se identifica en la base de datos HGNC por ID 6005. La IL17C humana se localiza en el cromosoma 16 y tiene la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q9P0M4):

MTLLPGLLFLTWLHTCLAHHDPSLRGHPHSHGTPHCYSAEELPLGQAPPHLLA RGAKWGQALPVALVSSLEAASHRGRHERPSATTQCPVLRPEEVLEADTHQR SISPWRYRVDTDEDRYPQKLAFAECLCRGCIDARTGRETAALNSVRLLQSLLV LRRRPCSRDGSGLPTPGAFAFHTEFIHVPVGCTCVLPRSV (SEQ ID No.:181)

El término "IL17RA" se refiere a una proteína conocida como receptor A de interleucina 17. La IL17RA humana presenta la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q96F46):

MGAARSPPSAVPGPLLGLLLLLLGVLAPGGASLRLLDHRALVCSQPGLNCTVKNSTC

LDDSWIHPRNLTPSSPKDLQIQLHFAHTQQGDLFPVAHIEWTLQTDASILYLEGAELS

VLQLNTNERLCVRFEFLSKLRHHHRRWRFTFSHFVVDPDQEYEVTVHHLPKPIPDG

DPNHQSKNFLVPDCEHARMKVTTPCMSSGSLWDPNITVETLEAHQLRVSFTLWNES

THYQILLTSFPHMENHSCFEHMHHIPAPRPEEFHQRSNVTLTLRNLKGCCRHQVQIQ

PFFSSCLNDCLRHSATVSCPEMPDTPEPIPDYMPLWVYWFITGISILLVGSVILLIVCM

TWRLAGPGSEKYSDDTKYTDGLPAADLIPPPLKPRKVWIIYSADHPLYVDVVLKFAQ

FLLTACGTEVALDLLEEQAISEAGVMTWVGRQKQEMVESNSKIIVLCSRGTRAKWQ

ALLGRGAPVRLRCDHGKPVGDLFTAAMNMILPDFKRPACFGTYVVCYFSEVSCDGD

VPDLFGAAPRYPLMDRFEEVYFRIQDLEMFQPGRMHRVGELSGDNYLRSPGGRQL

RAALDRFRDWQVRCPDWFECENLYSADDQDAPSLDEEVFEEPLLPPGTGIVKRAPL

VREPGSQACLAIDPLVGEEGGAAVAKLEPHLQPRGQPAPQPLHTLVLAAEEGALVA

AVEPGPLADGAAVRLALAGEGEACPLLGSPGAGRNSVLFLPVDPEDSPLGSSTPMA

SPDLLPEDVREHLEGLMLSLFEQSLSCQAQGGCSRPAMVLTDPHTPYEEEQRQSV

QSDQGYISRSSPQPPEGLTEMEEEEEEEQDPGKPALPLSPEDLESLRSLQRQLLFR

QLQKNSGWDTMGSESEGPSA (SEQ ID No.:182)

El término "IL17RE" se refiere a una proteína conocida como receptor E de interleucina 17. La IL17RE humana presenta la secuencia de aminoácidos de (UniProt Q8NFR9):

MGSSRLAALLLPLLLIVIDLSDSAGIGFRHLPHWNTRCPLASHTDDSFTGSSAYIPCRT

WWALFSTKPWCVRVWHCSRCLCQHLLSGGSGLQRGLFHLLVQKSKKSSTFKFYRR

HKMPAPAQRKLLPRRHLSEKSHHISIPSPDISHKGLRSKRTQPSDPETWESLPRLDS

QRHGGPEFSFDLLPEARAIRVTISSGPEVSVRLCHQWALECEELSSPYDVQKIVSGG

HTVELPYEFLLPCLCIEASYLQEDTVRRKKCPFQSWPEAYGSDFWKSVHFTDYSQH

TQMVMALTLRCPLKLEAALCQRHDWHTLCKDLPNATARESDGWYVLEKVDLHPQL

CFKFSFGNSSHVECPHQTGSLTSWNVSMDTQAQQLILHFSSRMHATFSAAWSLPG

LGQDTLVPPVYTVSQARGSSPVSLDLIIPFLRPGCCVLVWRSDVQFAWKHLLCPDVS

YRHLGLLILALLALLTLLGVVLALTCRRPQSGPGPARPVLLLHAADSEAQRRLVGALA

ELLRAALGGGRDVIVDLWEGRHVARVGPLPWLWAARTRVAREQGTVLLLWSGADL

RPVSGPDPRAAPLLALLHAAPRPLLLLAYFSRLCAKGDIPPPLRALPRYRLLRDLPRL

LRALDARPFAEATSWGRLGARQRRQSRLELCSRLEREAARLADLG (SEQ ID

No.:183)

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Un "antagonista de IL17C" y un "antagonista de IL17C", como se usa en la presente memoria, se refieren a antagonistas de IL17C en el sentido más amplio. Se incluye cualquier molécula que inhiba la actividad o la función de la IL17C o que por cualquier otro modo ejerza un efecto sobre la IL17C. El término antagonista de IL17C incluye, pero no se limita a, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a IL17C, ácidos nucleicos 10 inhibitorios específicos para IL17C o moléculas orgánicas pequeñas específicas para IL17C. También dentro del significado del término antagonista de IL17C están anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente al receptor de IL17C, ácidos nucleicos inhibitorios específicos para el receptor de IL17C o moléculas orgánicas pequeñas específicas para el receptor de IL17C. El término antagonista de IL17C también se refiere a moléculas de andamiaje no anticuerpos, tales como andamiajes de fibronectina, anquirinas, 15 maxicuerpos/avímeros, moléculas procedentes de proteína A, anticalinas, afilinas, miméticos de epítopo de proteína

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(los PEM, por sus siglas en inglés) o similares.

Los ácidos nucleicos inhibitorios incluyen, pero no se limitan a, ADN complementario, oligonucleótidos formadores de triplex, secuencias guía externas, ARNip y microARN. Los ácidos nucleicos inhibitorios útiles incluyen los que reducen la expresión de ARN que codifica IL17C por al menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 95 por ciento comparado con controles. Los ácidos nucleicos inhibitorios y los métodos para producirlos son conocidos en la técnica. El software de diseño de ARNip está disponible.

Las moléculas orgánicas pequeñas (las SMOL, por sus siglas en inglés) específicas para IL17C o el receptor de IL17C pueden identificarse por selección natural de productos o por selección de bibliotecas químicas. Típicamente, el peso molecular de las SMOL está por debajo de 500 Dalton, más típicamente de 160 Dalton a 480 Dalton. Otras propiedades típicas de las SMOL son una o más de las siguientes:

• El coeficiente de partición log P está en el intervalo de -0,4 a +5,6

• La refractividad molar es de 40 a 130

• El número de átomos es de 20 a 70

Para revisiones véase Ghose et al. (1999) J Combin Chem: 1, 55-68 y Lipinski et al (1997) Adv Drug Del Rev: 23, 325.

Un antagonista de IL17C para uso en la presente invención es un anticuerpo específico para IL17C. Dicho anticuerpo puede ser de cualquier tipo, tal como un anticuerpo murino, uno de rata, uno quimérico, uno humanizado o uno humano. Un anticuerpo "humano" o fragmento de anticuerpo humano funcional se define por la presente como uno que no es quimérico (por ejemplo, no "humanizado") y no de especie no humana (en total o en parte). Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional humano puede proceder de un ser humano o puede ser un anticuerpo humano sintético. Un "anticuerpo humano sintético" se define en la presente memoria como un anticuerpo que tiene una secuencia procedente, en total o en parte, in silico de secuencias sintéticas que se basan en el análisis de secuencias conocidas de anticuerpos humanos. Un diseño in silico de una secuencia de anticuerpos humanos o fragmento de la misma puede conseguirse, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos humanos e ideando una secuencia de polipéptidos utilizando los datos obtenidos de ahí. Otro ejemplo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional humanos es uno que está codificado por un ácido nucleico aislado de una biblioteca de secuencias de anticuerpos de origen humano (es decir, estando dicha biblioteca basada en anticuerpos tomados de una fuente natural humana).

Un "anticuerpo humanizado" o fragmento de anticuerpo humanizado funcional se define en la presente memoria como uno que (i) procede de una fuente no humana (por ejemplo, un ratón transgénico que lleve un sistema inmunitario heterólogo), anticuerpo que esté basado en una secuencia de línea germinal humana o (ii) quimérica, en donde el dominio variable procede de un origen no humano y el domino constante procede de un origen humano o (iii) injertado con CDR, en donde las CDR del domino variable son de un origen no humano, mientras uno o más entramados del dominio variable son de origen humano y el dominio constante (si hay) es de origen humano.

El término "anticuerpo quimérico" o fragmento de anticuerpo quimérico funcional se define en la presente memoria como una molécula de anticuerpo que presenta regiones de anticuerpo constantes procedentes de, o que corresponden a, secuencias encontradas en una especie y regiones de anticuerpo variables procedentes de otras especies. Preferiblemente, las regiones constantes de los anticuerpos procedentes, o que corresponden a, secuencias encontradas en seres humanos, por ejemplo, en la línea germinal humana o células somáticas y las regiones variables de los anticuerpos (por ejemplo, las regiones VH, VL, CDR o FR) procedentes de secuencias encontradas en un animal no humano, por ejemplo, un ratón, rata, conejo o hámster.

En un aspecto, puede realizarse unión de antígeno mediante "fragmentos" de un anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro del término "fragmento de anticuerpo" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, cL y CH1; un fragmento F(ab)2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; un fragmento de anticuerpo (dAb) de un solo dominio (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste en un dominio VH y una región determinante de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) aislada.

Un "fragmento de cadena única (scFv)" es una cadena de proteína sencilla en la que las regiones VL y VH se conectan para formar moléculas monovalentes (conocido como Fv de cadena única (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426 y Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Aunque los dos dominios VL y VH se codifican por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un ligador peptídico artificial que permite que se hagan como una cadena de proteína única. Dichos anticuerpos de cadena única incluyen uno o más restos de unión de antígeno. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia y los fragmentos se evalúan por su utilidad de la

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misma manera que los anticuerpos intactos.

El término "aislado" se refiere a un compuesto que puede ser, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que esté sustancialmente exento de otros anticuerpos o fragmentos de anticuerpo con diferentes especificidades antigénicas. Además, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado puede estar sustancialmente exento de otro material celular y/o productos químicos.

El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra un sitio de unión único con una especificidad de unión única y afinidad por epítopos particulares.

Como se usa en la presente memoria, un anticuerpo "se une de manera específica a", "de manera específica se une a", es "específico a/para" o "reconoce de manera específica" un antígeno (aquí, IL17C) si dicho anticuerpo puede distinguir entre dicho antígeno y uno o más antígenos de referencia, puesto que la especificidad de unión no es una propiedad absoluta, sino relativa. El antígeno o los antígenos de referencia pueden ser uno o más antígenos estrechamente relacionados, que se usen como puntos de referencia, por ejemplo, IL17A o IL17B. En su forma más general (y cuando no se mencione referencia definida), "unión específica" se está refiriendo a la capacidad del anticuerpo para distinguir entre el antígeno de interés y un antígeno no relacionado, cuando se determina, por ejemplo, de acuerdo con uno de los siguientes métodos. Dichos métodos comprenden, pero no se limitan a, los métodos Western, pruebas ELISA, RIA, ECL, IRMA y barridos de péptidos. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo ELISA clásico. La calificación puede llevarse a cabo por desarrollo de color clásico (por ejemplo, anticuerpo secundario con peroxidasa de rábano y tetrametilbenzidina con peróxido de hidrógeno). La reacción en algunos pozos se califica por la densidad óptica, por ejemplo, a 450 nm. El fondo típico (=reacción negativa) puede ser 0,1 de D. E.; la reacción positiva típica puede ser 1 de D. E. Esto significa que la diferencia positiva/negativa puede ser mayor que 10 veces. Típicamente, la determinación de la especificidad de unión se realiza usando no un único antígeno de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco antígenos no relacionados, tales como leche en polvo, BSA (albúmina de suero bovino), transferrina o similares. Adicionalmente, "unión específica" puede referirse a la capacidad de un anticuerpo para distinguir entre diferentes partes de su antígeno diana, por ejemplo, diferentes dominios o regiones de IL17C o el receptor de IL17C o entre uno o más restos de aminoácidos clave o tramos de restos de aminoácidos de IL17C o el receptor de IL17C.

"Competencia cruzada" significa la capacidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otro resto de unión de antígeno para interferir con la unión de otros anticuerpos, fragmentos de anticuerpo o restos de unión de antígeno a un antígeno específico en un ensayo de unión competitivo clásico. La capacidad o extensión en la que un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otro resto de unión de antígeno puede interferir con la unión de otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo o restos de unión de antígeno a un antígeno específico y, por lo tanto, si se puede decir que haya competencia cruzada según la invención, puede determinarse usando ensayos de unión de competición clásicos. Un ensayo adecuado implica el uso de la tecnología Biacore (por ejemplo, usando el instrumento BIAcore 3000 (Biacore, Uppsala, Suecia)), que puede medir la extensión de las interacciones usando tecnología de resonancia plasmónica de superficie. Otro ensayo para medir la competición cruzada usa una propuesta basada en ELISA. Un procedimiento de alto rendimiento para anticuerpos "que se unen a epítopo" basados en su competición cruzada se describe en la solicitud de patente internacional número WO 2003/48731. Hay competición cruzada si el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se investiga reduce la unión de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 a IL17C por un 60 % o más, específicamente por 70 % o más y más específicamente por un 80 % o más y si uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 reduce la unión de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo a IL17C por un 60 % o más, específicamente por un 70 % o más y más específicamente por un 80 % o más.

El término "epítopo" incluye cualquier región proteinácea que sea reconocida de manera específica por una inmunoglobulina o receptor de células T o interactúe de otro modo con una molécula. En general los epítopos son agrupaciones de moléculas superficiales químicamente activas tales como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidratos o azúcares y en general pueden tener características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Como apreciará un experto en la materia, prácticamente cualquier molécula a la que pueda unirse de manera específica un anticuerpo puede ser un epítopo. Un epítopo puede comprender los restos a los que se una el anticuerpo y puede ser "lineal" o "conformacional". El término "epítopo lineal" se refiere a un epítopo en donde todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula que interactúa (tal como un anticuerpo) se encuentran de manera lineal a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína (continua). El término "epítopo conformacional" se refiere a un epítopo en el que los aminoácidos discontinuos que van juntos en conformaciones tridimensionales. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se encuentran por restos de aminoácidos en la proteína que están separados entre sí.

"Se une al mismo epítopo que" significa la capacidad de un anticuerpo, fragmento de anticuerpo u otro resto de unión de antígeno para unirse a un antígeno específico y teniendo el mismo epítopo que el anticuerpo de ejemplo. Los epítopos del anticuerpo de ejemplo y otros anticuerpos pueden determinarse usando técnicas de cartografía de epítopos. Las técnicas de cartografía de epítopos son conocidas en la técnica. Por ejemplo, los epítopos conformacionales se identifican fácilmente por determinación de la conformación espacial de los aminoácidos tales como, por ejemplo, intercambio de hidrógeno/deuterio, cristalografía de rayos X y resonancia magnética nuclear

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bidimensional.

También, como se usa en la presente memoria, una "inmunoglobuNna" (Ig) se define por la presente como una proteína que pertenece a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquiera de sus subclases) e incluye todos los anticuerpos convencionalmente conocidos y sus fragmentos funcionales. Un "fragmento funcional" de un anticuerpo/inmunoglobulina se define por la presente como un fragmento de un anticuerpo/inmunoglobulina (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión del antígeno. Una "región de unión de antígeno" de un anticuerpo se encuentra típicamente en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, -2 y/o -3; sin embargo, la variable regiones de "entramado" también pueden desempeñar una función importante en la unión del antígeno, tal como proporcionando un andamiaje para las CDR. Preferiblemente, la "región de unión de antígeno" comprende al menos 4 a 103 restos de aminoácidos de cadena variable ligera (VL) y 5 a 109 de la cadena variable pesada (VH), más preferiblemente 3 a 107 restos aminoácido de VL y 4 a 111 de VH y en particular se prefieren las cadenas VL y VH completas (posiciones de los aminoácidos 1 a 109 de VL y 1 a 113 de VH; numeración según la patente internacional WO 97/08320). Una clase preferida de las inmunoglobulinas para uso en la presente invención es la IgG. "Fragmentos funcionales" de la invención incluyen el dominio de un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab, scFv o construcciones que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulinas o polipéptidos de anticuerpos de dominio único, por ejemplo, dominios variables únicos de cadena pesada o dominios variables únicos de cadena ligera. El F(ab')2 o Fab puede lograrse para minimizar o retirar completamente las interacciones disulfuro intermoleculares que se encuentran entre los dominios CH1 y CL.

Un anticuerpo para uso según la invención puede proceder de una biblioteca de anticuerpos recombinantes que se base en secuencias de aminoácidos que hayan sido diseñados in silico y codificados por ácidos nucleicos que se creen sintéticamente. Un diseño in silico de una secuencia de anticuerpos se consigue, por ejemplo, analizando una base de datos de secuencias humanas e ideando una secuencia de polipéptidos que utilice los datos obtenidos de ahí. Se describen métodos para diseñar y obtener secuencias creadas in silico, por ejemplo, en Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001)254:67, Rothe et al., J. Mol. Biol. (2008) 376:1182 y la patente de EE. UU. número 6,300,064 expedida para Knappik et al., que se incorpora por la presente como referencia en su totalidad.

Cualquier anticuerpo específico para IL17C y que bloquee la unión de IL17C a IL17RE puede usarse con la presente invención. Algunos anticuerpos de la técnica anterior ejemplares específicos para IL17c incluyen anticuerpos tales como:

A: anticuerpo de IL17C anti-ratón monoclonal de IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311522,# MAB23061),

B: anticuerpo de IL17C anti-ratón monoclonal de IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311523,# MAB2306) y

C: IL17C anti-ratón de rata (US Biological; clon: 8B28, #I8439-20R3) (tomado del ejemplo 4).

Otros anticuerpos de la técnica anterior incluyen los anticuerpos anti-IL17C disponibles en Abnova (Walnut, CA, EE. UU.; Catálogo #H00027189-B01P, #H00027189-D01 y #H00027189-D01P) y los anticuerpos anti-IL17C disponibles en antibodies-online GmbH (Aachen, Alemania; Catálogo #ABIN525892, #ABIN327411, #ABIN525893, #ABIN221340, #ABIN221341, #ABIN221342 y #ABIN525891). Otros anticuerpos específicos para IL17C que pueden usarse con la presente invención son los aislados y descritos en la presente invención misma, es decir, los enumerados en la tabla 1.

Las composiciones de la descripción pueden usarse para aplicaciones terapéuticas o profilácticas. La descripción, por lo tanto, incluye una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo inventivo (o fragmento de anticuerpo funcional) y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable de ahí. En un aspecto relacionado, la descripción proporciona un método para tratar un trastorno inflamatorio. Dicho método contiene las etapas de administración a un individuo con necesidad de esto de una cantidad eficaz de la composición farmacéutica que contiene un anticuerpo inventivo como se describe o se considera en la presente memoria.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona métodos para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un individuo, comprendiendo dicho método la etapa de administrar un antagonista de IL17C a dicho individuo. "Individuo", como se usa en este contexto se refiere a cualquier mamífero, incluyendo roedores, tales como ratón o rata y primates, tales como el mono Cynomolgus (Macaca fascicularis), mono Rhesus (Macaca mulatta) o seres humanos (Homo sapiens). Preferiblemente, el individuo es un primate, lo más preferiblemente un ser humano.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona métodos para el tratamiento de un trastorno inflamatorio, comprendiendo dicho método la etapa de administrar a un individuo un antagonista de IL17C, en donde dicho antagonista de IL17C puede unirse a IL17C con una afinidad de aproximadamente menos de 100 nM, más preferiblemente menos de aproximadamente 60 nM y aún más preferiblemente menos de aproximadamente 30 nM. Se prefieren además anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unan a IL17C con una afinidad menor que aproximadamente 10 nM y más preferiblemente menor que aproximadamente 3 nM.

En algunos aspectos dicho antagonista de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C y dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo experimenta reacción cruzada con IL17C de otras especies, tales

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como IL17C de ratón, rata, mono Rhesus y/o mono Cynomolgus. En algunos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado específico para IL17C. En otra realización, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado específico para IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal. En una realización más, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal aislado específico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181. En una realización más, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado es un anticuerpo monoclonal aislado específico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181. En una realización más, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado experimenta reacción cruzada con IL17C de otras especies, tales como IL17C de ratón, rata, mono Rhesus y/o mono Cynomolgus.

En algunos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C es un anticuerpo sintético humano. En algunos aspectos la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal, aislado, específico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181 en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunos aspectos, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo monoclonal aislado específico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado o quimérico. En algunos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo sintético humano.

En cierto aspecto, la presente descripción proporciona una composición que comprende un antagonista de IL17C capaz de antagonizar IL17C en un trastorno inflamatorio, comprendiendo además dicha composición uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables. En algunos aspectos, los antagonistas de IL17C, tales como los anticuerpos específicos para IL17C, pueden antagonizar cualquiera de las funciones de IL17C en un trastorno inflamatorio.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para la profilaxis de un trastorno inflamatorio en un individuo, comprendiendo dicho método administrar un antagonista de IL17C a dicho individuo. "Profilaxis" como se usa en este contexto se refiere a métodos cuyo objeto es prevenir el comienzo de una enfermedad o que retardan el comienzo de una enfermedad.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona una composición que comprende un antagonista de IL17C útil en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, comprendiendo además dicha composición uno o más portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado específico para IL17C para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, en donde dicho trastorno inflamatorio es inflamación pulmonar, artritis reumatoide y/o EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica), en donde la IL17C consta de los aminoácidos de la SEQ. ID No.: 181 y en donde dicho anticuerpo bloquea la unión de IL17C a IL17RE.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona el uso de un antagonista de IL17C en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno inflamatorio.

En otros aspectos, la presente descripción proporciona un método para el tratamiento de un trastorno inflamatorio en un individuo, comprendiendo administrar al individuo un antagonista de IL17C.

En aspectos particulares, los antagonistas de IL17C de la presente invención se administran por vía subcutánea. En otros aspectos, los antagonistas de IL17C de la presente invención se administran por vía intravenosa, por vía intraarticular o por vía intraespinal.

Las composiciones de la presente descripción son preferiblemente composiciones farmacéuticas que comprenden un antagonista de IL17C y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptables, para el tratamiento de un trastorno inflamatorio. Dichos portadores, diluyentes y excipientes son conocidos en la técnica y el trabajador cualificado encontrará una formulación y una vía de administración más adecuadas para tratar a un individuo con los antagonistas de IL17C de la presente invención.

En algunos aspectos, la presente descripción proporciona un método para el tratamiento o la profilaxis de un trastorno inflamatorio en un individuo, que comprende la etapa de administrar al individuo una cantidad eficaz de un antagonista de IL17C. En algunos aspectos de la descripción dicho individuo es un ser humano. En aspectos alternativos de la descripción dicho individuo es un roedor, tal como una rata o un ratón.

En algunos aspectos de la descripción, dicho antagonista de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C. En algunos aspectos de la descripción, dicho antagonista es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID No.: 181. En aspectos alternativos de la descripción, dicho antagonista de IL17C es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL17C.

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En algunos aspectos de la invención, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C bloquea la unión de IL17C al receptor de IL17C. En aspectos alternativos de la descripción, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL17c bloquea la unión de IL17C al receptor de IL17C.

Dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C bloquea la unión de IL17C al receptor de IL17, en donde dicho receptor es IL17RE. En aspectos alternativos de la descripción, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL17C bloquea la unión de IL17C a IL17RE.

En algunos aspectos, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C bloquea la unión de IL17C a IL17RE con una concentración de IC50 menor que 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM o 1 pM. En algunos aspectos, la concentración de IC50 puede determinarse por ELISA; SET, FACS o MSD (Meso Escala Descubrimiento, por sus siglas en inglés).

En algunos aspectos de la descripción, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C bloquea la unión de IL17C a uno o más receptores de IL17C. En aspectos alternativos de la descripción, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL17C bloquea la unión de IL17C a receptores de IL17C, en donde los receptores de IL17 incluyen IL17RE e IL17RA. En aspectos alternativos de la descripción, dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para el receptor de IL17C bloquea la unión de IL17C a IL17RE e IL17RA.

En algunos aspectos, la presente invención proporciona un antagonista de IL17C para uso en el tratamiento de una inflamación, como se define en las reivindicaciones. En algunos aspectos, dicho tratamiento comprende la etapa de administrar a un individuo una cantidad eficaz del antagonista de IL17C. En algunos aspectos, dicho individuo es un ser humano. En aspectos alternativos, dicho individuo es un roedor, tal como una rata o un ratón.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que experimenta reacción cruzada con un anticuerpo descrito en la tabla 1. En alguna realización, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que experimenta reacción de competición cruzada con un anticuerpo que comprende 6 CDR de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1. En alguna realización, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que experimenta reacción de competición cruzada con un anticuerpo descrito en la tabla 1 y reduce la unión específica de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 por al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90% en una competición cruzada basada en ELISA. En alguna realización, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que experimenta reacción de competición cruzada con un anticuerpo descrito en la tabla 1 y reduce la unión específica de uno de los anticuerpos descritos en la tabla 1 a IL17C por al menos un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90% en una competición cruzada basada en ELISA.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que interactúa (por ejemplo, por unión, estabilización, distribución espacial) con el mismo epítopo que un anticuerpo descrito en la tabla 1.

En un aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que comprende 6 CDR definidos por Kabat de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1. En otro aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que comprende 6 CDR definidos por Kabat de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1.

En un aspecto, la descripción se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que comprende un VH y un VL de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento en donde el ácido nucleico comprende un VH y un VL de cualquiera de los anticuerpos en la tabla 1.

En otro aspecto, la descripción se refiere a un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal aislado o su fragmento que tiene una identidad de secuencias de al menos un 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, 99 % para los ácidos nucleicos descritos en la tabla 1.

Los expertos en la materia apreciarán que la invención descrita en la presente memoria es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas de manera específica.

Tabla 1:

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

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HCDR1 Seq. ID: 1 GGTFSIYAIS

HCDR2 Seq. ID: 2 WMGGIIPILGIANYAQKFQG

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

HCDR3 Seq. ID: 3 DATHSYYHDY

LCDR1 Seq. ID: 4 TGTSSDVGSYETVS

LCDR2 Seq. ID: 5 VMIYEVSDRPS

LCDR3 Seq. ID: 6 GSFAHWGSW

VL Seq. ID: 7 DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGSYETVSWY QQHPGKAPKVMIYEVSDRPSGVSNRFSGSKSGNTAS LTISGLQAEDEADYYCGSFAHWGSWVFGGGTKLTVL GG

VH Seq. ID: 8 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSIYAISWV RQAPGQGLEWMGGIIPILGIANYAQKFQG RVTITADES TSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDATHSYYHDYWGG GTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 9 GATATCGCGCTGACCCAGCCGGCGAGCGTGAGCG GTAG CCCGG GCCAGAGCATTACCATT AGCTGCACC GGCACCAGCAGCGATGTGGGCT CTT ACGAAACT GT GTCTTGGTACCAGCAGCATCCGGGCAAGGCGCCGA AAG TT ATG AT CT ACG AAG TTTCTG ACCGT CCG AG CG GCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGC AACACCGCGAGCCTGACCATTAGCGGCCTGCAAGC GGAAGACGAAGCGGATTATTACTGCGGTTCTTTCGC TCATTGGGGTTCTTGGGTGTTTGGCGGCGGCACGA AGTT AACCGTT CTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 10 CAGGTGCAATTGGTG CAGAGCGGTG CCGAAGTGAA AAAACCG GG CAG CAGCG TGAAAGTTAGCTGCAAAG CATCCGGAGGGACGTTTTCTATCTACGCTATCTCTT GGGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTG GATGGGCGGTATCATCCCGATCCTGGGCATCGCGA ACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATT

ACCGCCGATGAAAGCACCAGCACCGCCTATATGGA ACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGT ATTATTGCGCGCGTG ACG CTACTCATTCTTACTACC ATG ATT ACT G GGGCCAAG GCACCCTGGTG ACT GTT AGCTCA

12741

HCDR1 Seq. ID: 11 GGTFSSYAIS

HCDR2 Seq. ID: 12 WMGMIMPEVGMADYAQKFQG

HCDR3 Seq. ID: 13 DFIAVGSLEIWHYYYGLDV

LCDR1 Seq. ID: 14 SGDNIGEHYAS

LCDR2 Seq. ID: 15 LVISYDNERPS

LCDR3 Seq. ID: 16 QSWTSQKPDY

VL Seq. ID: 17 DI ELTQ PPS VS VSPGQTASITCSG DNIGEHYASWYQQ KPGQAPVLVISYDNERPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCQSWTSQKPDYVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 18

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISW VRQAPGQGLEWMGMIMPEVGMADYAQKFQGRVTITA DESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDFIAVGSLEIWH YYYGLDVWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 19 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCGGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGAT AACAT CG GT G AACATT ACGCTT CTTGGT ACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CTCTTACGACAACGAACGTCCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTTAGCGG ATCCAACAGCG GCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCGGATTATTACTGCCAGTCTTGGACTTCTCAGAA ACCGGACTACGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAA CCGTTCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 20 CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAA AAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAG CATCCGGAGGGACGTTTAGCAGCTATGCGATTAGC TGGGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGT GGATGGGCATGATCATGCCGGAAGTTGGCATGGCT GACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCAT TACCGCCGATGAAAGCACCAGCACCGCCTATATGG AACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTG TATTATTGCGCGCGTGACTTCATCGCTGTTGGTTCT CTG G AAATCTG GCATTACTACTACG GTCTG GATGTT TGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12742

HCDR1 Seq. ID: 21 GGTFSSYGIS

HCDR2 Seq. ID: 22 WMGRIIPIFGTAYYAQKFQG

HCDR3 Seq. ID: 23 DMRYHDYWPYYYGSDQFDV

LCDR1 Seq. ID: 24 SGSSSNIGSDIVS

LCDR2 Seq. ID: 25 LLIYYNNLRPS

LCDR3 Seq. ID: 26 QSWDWASLAM

VL Seq. ID: 27 DIVLTQPPSVSGAPGQRVTISCSGSSSNIGSDIVSWYQ QLPGTAPKLLIYYNNLRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAI TGLQAEDEADYYCQSWDWASLAMVFGGGTKLTVLG Q

VH Seq. ID: 28 QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGISW VRQAPGQGLEWMGRIIPIFGTAYYAQKFQGRVTITADE STSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMRYHDYWPYYY GSDQFDVWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 29 GATATCGTGCTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGG TGCACCGGGCCAGGGCGTGAGCATTAGCTGTAGCG GCAGCAGCAGCAACATTGGTTCTGACATCGTGTCTT GGTACCAGCAGCTGCCGGGCACGGCGCCGAAACT GCT GATCT ACT ACAACAACCTGCGCCCG AGCGGCG TGCCGGATCGCTTTAGCGGATCCAAAAGCGGCACC AGCGCCAGCCTGGCGATTACCGGCCTGCAAGCAGA AGACGAAGCGGATTATTACTGCCAGTCTTGGGACTG GGCTTCTCTGGCTATGGTGTTTGGCGGCGGCACGA AGTTAACCGTTCTTGGCCAG

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

VH (ADN) Seq. ID: 30 CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCCGAAGTGAA AAAACCGGGCAGCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAG C AT C C G G A G G G AC G TTTT CTTCTT AC G G T A T CT CTT GGGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTG GATGGGCCGTATCATCCCGATCTTCGGCACTGCGT ACTACGCCCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATT ACCGCCGATG AA AG C AC C AG C ACCG CCT AT ATG G A ACTGAGCAGCCTGCGCAGCGAAGATACGGCCGTGT ATTATTGCGCGCGTGACATGCGTTACCATGACTACT GGCCGTACTACTACGGTTCTGACCAGTTCGATGTTT GGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12743

HCDR1 Seq. ID: 31 GYTFTSNFIH

HCDR2 Seq. ID: 32 WMGWISPYNGDTNYAQKFQG

HCDR3 Seq. ID: 33 ESVYYGSDYGYNGMDI

LCDR1 Seq. ID: 34 SGDNLGEEYVS

LCDR2 Seq. ID: 35 LVIYDDTKRPS

LCDR3 Seq. ID: 36 ASWDLWSVE

VL Seq. ID: 37 DI ELTGPPSVSVSPGGTASITCSG DNLG E EYVSWYGQ KPGQAPVLVIYDDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCASWDLWSVEVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 38 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNFIHWV RQAPGQGLEWMGWISPYNGDTNYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARESVYYGSDYGY NGMDIWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 39 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCGGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGATAACCTGGGTGAAGAATACGTTTCTTGGTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CT ACG ACGACACT AAACG TCCGAGCGGCAT CCCGG AACGTTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCG AGGGTGACGATTAGCGGCAGGCAGGCGGAAGACGA AGCGGATTATTACTGCGCTTCTTGGGACCTGTGGTC TGTTG AAGTGTTTGG CGG CGG CACG AAGTTAACCG TTCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 40 CAGGTGCAATTG GTG CAG AGCG GTG CGG AAGTG AA AAAACCGGGTGCCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAG CGTCCGGATATACCTTCACTTCTAACTTCATCCATTG GGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGG ATGGGCTGGATCTCTCCGTACAACGGCGACACGAA

CTACGCG CAG AAATTTCAGG GCCGGGTG ACCATG A CCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAAC TGAGCCGTCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTAT TATTGCGCGCGTGAATCTGTTTACTACGGTTCTGAC TACGGTTACAACGGTATGGATATCTGGGGCCAAGG CACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

12744

HCDR1 Seq. ID: 41 GYTFTSNFIH

HCDR2 Seq. ID: 42 WMGWISPYNGDTNYAQKFQG

HCDR3 Seq. ID: 43 ESVYYGSDYGYNGMDI

LCDR1 Seq. ID: 44 SGDNLGEEYVS

LCDR2 Seq. ID: 45 LVIYDDTKRPS

LCDR3 Seq. ID: 46 ASWAFYSSQ

VL Seq. ID: 47 DI ELTQPPSVSVSPGQTASITCSG DNLG E EYVSWYQQ KPGQAPVLVIYDDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCASWAFYSSQVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 48 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNFIHWV RQAPGQGLEWMGWISPYNGDTNYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARESVYYGSDYGY NGMDIWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 49 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GGGATAACCTGGGTGAAGAATACGTTTCTTGGTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CTACGACGACACTAAACGTCCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTT AGCGG AT CCAACAGCG GCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCGGATTATTACTGCGCTTCTTGGGCTTTCTACTC TTCTCAGGTGTTTGG CGG CGG CACG AAGTTAACCG TTCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 50 CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAA AAAACCG GG TGCC AG CGTG AAAGTTAG CTG CAAAG CGTCCGG AT AT ACCTT CACTTCTAACTT CATCCATT G GGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGG ATGGG CTGG ATCTCT CCGT ACAACGGCGACACG AA CTACGCGCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATGA CCCGTG AT ACCAGCATTAG CACCGCGTAT ATGG AAC TGAGCCGTCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTAT TATTGCGCGCGTGAATCTGTTTACTACGGTTCTGAC TACGGTTACAACGGTATGGATATCTGGGGCCAAGG CACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12745

HCDR1 Seq. ID: 51 GYTFTSNFIH

HCDR2 Seq. ID: 52 WMGWISPYNGDTNYAQKFQG

HCDR3 Seq. ID: 53 ESVYYGSDYGYNGMDI

LCDR1 Seq. ID: 54 SGDNLGEEYVS

LCDR2 Seq. ID: 55 LVIYDDTKRPS

LCDR3 Seq. ID: 56 SAWATWSVA

VL Seq. ID: 57 DI ELTQPPSVSVSPGQTASITCSG DNLG E EYVSWYQQ KPGQAPVLVIYDDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCSAWATWSVAVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 58

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNFIHWV RQAPGQGLEWMGWISPYNGDTNYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARESVYYGSDYGY NGMDIWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 59 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGATAACCTGGGTGAAGAATACGTTTCTTGGTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CTACGACGACACTAAACGTCCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTTAGCGG ATCCAACAGCG GCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCG G ATT ATTACTG CTCTG CTTG GGCTACTTG GTC TGTTGCTGTGTTTGG CGG CGG CACG AAGTTAACCG TTCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 60 CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAA AAAACCG GG TGCC AG CGTG AAAGTTAG CTG CAAAG CGTCCGGATATACCTTCACTTCTAACTTCATCCATTG GGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGG ATGGG CTGG ATCTCT CCGT ACAACGGCGACACG AA CTACGCGCAGAAATTTCAGGGCCGGGTGACCATGA CCCGTG AT ACCAGCATTAG CACCGCGTAT ATGG AAC TGAGCCGTCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTAT TATTGCGCGCGTGAATCTGTTTACTACGGTTCTGAC TACGGTTACAACGGTATGGATATCTGGGGCCAAGG CACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12746

HCDR1 Seq. ID: 61 GYTFTSNFIH

HCDR2 Seq. ID: 62 WMGWISPYNGDTNYAQKFQG

HCDR3 Seq. ID: 63 ESVYYGSDYGYNGMDI

LCDR1 Seq. ID: 64 SGDNLGEEYVS

LCDR2 Seq. ID: 65 LVIYDDTKRPS

LCDR3 Seq. ID: 66 SSWTHFSNI

VL Seq. ID: 67 DI ELTQPPSVSVSPGQTASITCSG DNLG E EYVSWYQQ KPGQAPVLVIYDDTKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCSSWTHFSNIVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 68 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNFIHWV RQAPGQGLEWMGWISPYNGDTNYAQKFQGRVTMTR DTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARESVYYGSDYGY NGMDIWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 69 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGATAACCTGGGTGAAGAATACGTTTCTTGGTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CT ACG ACGACACT AAACG TCCGAGCGGCAT CCCGG AACGTTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCG G ATT ATT ACT G CTCTT CTT GG ACT C ATTT CTCT AACATCGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGT TCTTGGCCAG

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

VH (ADN) Seq. ID: 70 CAGGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAA AAAACCGGGTGCCAGCGTGAAAGTTAGCTGCAAAG

CGTCCGGATATACCTTCACTTCTAACTTCATCCATTG GGTGCGCCAGGCCCCGGGCCAGGGCCTCGAGTGG ATGGGCTGGATCTCTCCGTACAACGGCGACACGAA CTACGCG CAG AAATTTCAGG GCCGGGTG ACCATG A CCCGTGATACCAGCATTAGCACCGCGTATATGGAAC TGAGCCGTCTGCGTAGCGAAGATACGGCCGTGTAT TATTGCGCGCGTGAATCTGTTTACTACGGTTCTGAC TACGGTTACAACGGTATGGATATCTGGGGCCAAGG CACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12751

HCDR1 Seq. ID: 71 GDSVSSNSAAWN

HCDR2 Seq. ID: 72 WLGVIYYRSKWYINYADSVKS

HCDR3 Seq. ID: 73 EGIVGGWFAY

LCDR1 Seq. ID: 74 SGDKLGSKIAH

LCDR2 Seq. ID: 75 LVIYDDNERPS

LCDR3 Seq. ID: 76 QSWDYLSWSV

VL Seq. ID: 77 DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDKLGSKIAHWYQQK PGQAPVLVIYDDNERPSGIPERFSGSNSGNTATLTISG TQAEDEADYYCQSWDYLSWSWFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 78 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGVIYYRSKWYINYADSVKSRITINP DTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREGIVGGWFAY WGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 79 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCG ATAAACTG GGTTCTAAAATCGCTCATTG GTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CTACGACGACAACGAACGTCCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCGGATTATTACTGCCAGTCTTGGGACTACCTGTC TTGGTCTGTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAAC CGTTCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 80 CAGGTGCAATTGCAGCAGAGCGGTCCGGGCCTGGT GAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGA TTTCCGGAGATAGCGTGAGCAGTAACTCTGCTGCTT GGAACTGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTC GAGTGGCTGGGCGTTATCTACTACCGTAGCAAATG GTACATCAACTATGCCGACAGCGTGAAAAGCCGCAT TACCATTAACCCGGATACTTCGAAAAACCAGTTTAG CCTGCAACTGAACAGCGTGACCCCGGAAGATACGG CCGTGTATTATTGCGCGCGTGAAGGTATCGTTGGTG GTTGGTTCGCTTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTG ACTGTTAGCTCA

12753

HCDR1 Seq. ID: 81 GDSVSSSSAAWN

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

HCDR2 Seq. ID: 82 WLGRIEYRSKWYNDYAVSVKS

HCDR3 Seq. ID: 83 EMYYYSGYGVFDV

LCDR1 Seq. ID: 84 SGDALGGEYVH

LCDR2 Seq. ID: 85 LVIYDDDKRPS

LCDR3 Seq. ID: 86 SSFDTWTSY

VL Seq. ID: 87 DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDALGGEYVHWYQQ KPGQAPVLVIYDDDKRPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCSSFDTWTSYVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 88 QVQLQQSG PG LVKPSQTLSLTCAISGDSVSSSSAAWN WIRQSPSRGLEWLGRIEYRSKWYNDYAVSVKSRITINP DTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREMYYYSGYGVF DVWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 89 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGATGCTCTGGGTGGTGAATACGTTCATTGGTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CTACGACGACGACAAACGTCCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGC G G ATT ATT ACTG CTCTT CTTT CGACACTTGGAC TT CTT ACGT GTTTGGCGG CGG CACG AAGTT AACCGT TCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 90 CAGGT GCAATTGCAGCAGAGCGGT CCGGGCCTGGT GAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGA TTTCCGGAGATAGCGTGAGCTCCTCTTCTGCTGCTT GGAACTGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTC GAGTGGCTGGGCCGTATCGAATACCGTAGCAAATG GTACAACGACTATGCCGTGAGCGTGAAAAGCCGCA TTACCATT AACCCG GAT ACTTCG AAAAACCAGTTT A GCCTG CAACTG AACAGCG TGACCCCGG AAGATACG GCCGTGTATTATTGCGCGCGTGAAATGTACTACTAC TCTGGTTACGGTGTTTTCGATGTTTGGGGCCAAGGC ACCCTGG TGACTGTTAGCTCA

12754

HCDR1 Seq. ID: 91 GFTFSDYAMT

HCDR2 Seq. ID: 92 WVSVISYDGSLTYYADSVKG

HCDR3 Seq. ID: 93 DPGVWWLSYLDY

LCDR1 Seq. ID: 94 RASQDIISYLA

LCDR2 Seq. ID: 95 LLIYGASNLQG

LCDR3 Seq. ID: 96 QQYMIAPPN

VL Seq. ID: 97 DIQMTGSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIISYLAWYQQ KPGKAPKLLIYGASNLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTIS SLQPEDFAVYYCQQYMIAPPNTFGQGTKVEIKRT

VH Seq. ID: 98

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMTW VRQAPGKGLEWVSVISYDGSLTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPGVWWLSYLD YWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 99 GATATCCAG ATG ACCCAG AG CCCGAGCAG CCTG AG CGCCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCA GAGCCAGCCAGGACATTATCTGTTACCTGGCTTGGT ACCAG CAG AAACCGG GC AAAGCG CCG AAACT ATT A ATCTACG GTGCTTCTAACCTG CAAGGCG GCGTGCC GAGCCGCTTT AGCGGCAGCG GAT CCGGCACCGATT TCACCCTG ACCATTAG CTCTCTG CAACCGGAAG ACT TT GCG GTGT ATTATT GCCAGCAGTACATG AT CG CT C CACCGAACACCTTTGGCCAGGGCACGAAAGTTGAA ATTAAACGTACG

VH (ADN) Seq. ID: 100 GAAGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGT GCAGCCGGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCG

GCGTCCGGATTCACCTTTTCTGACTACGCTATGACT TGGGTGCGCCAGGCCCCGGGCAAAGGTCTCGAGT GGGTTTCCGTTATCTCTTACGACGGTTCTCTGACCT ACTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATCA GCCGCG ATAATTCG AAAAAC AC C CTGT AT CTGCAAA TGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTAT TATTGCGCGCGTGACCCGGGTGTTTGGTGGCTGTC TTACCTGGATTACTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGA CTGTTAGCTCA

12755

HCDR1 Seq. ID: 101 GDSVSSNSAAWN

HCDR2 Seq. ID: 102 WLGKTYYRSTWSNDYAESVKS

HCDR3 Seq. ID: 103 EMDSLTRSASSIAFDY

LCDR1 Seq. ID: 104 SGDNLREHYVH

LCDR2 Seq. ID: 105 LVIYDDTERPS

LCDR3 Seq. ID: 106 A TRDWSNV

VL Seq. ID: 107 DI ELTQPPSVSVS PGQTASITCSGDNLR EHYVHWYQQ KPGQAPVLVIYDDTERPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCATRDWSNVVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 108 QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWN WIRQSPSRGLEWLGKTYYRSTWSNDYAESVKSRITIN PDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAR EM DSLTRSAS SIAFDYWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 109

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGATAACCTGCGTGAACATTAGGTTCATTGGTACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CT ACGACGACACT GAACGT CCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTTAGCGGATCCAACAGCGGCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCGGATTATTACTGCGCTACTCGTGACTGGTCTAA CGTTGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTAACCGTTC TTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 110 CAGGTGCAATTGCAGCAGAGCGGTCCGGGCCTGGT GAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGA TTTCCGGAGATAGCGTGAGCAGTAACTCTGCTGCTT GGAACTGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTC GAGTG GCTG GGCAAAACCTACTACCGTAGCACTTG GTCTAACGACTATGCCGAAAGCGTGAAAAGCCGCA TTACCATT AACCCG GAT ACTTCG AAAAACCAGTTT A GCCTG CAACTG AACAGCG TGACCCCGG AAGATACG GCCGTGTATTATTGCGCGCGTGAAATGGACTCTCTG ACTCGTTCTGCTTCTTCTATCGCTTTCGATTACTGGG GCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12756

HCDR1 Seq. ID: 111 GDSVSDNSVAWN

HCDR2 Seq. ID: 112 WLGRIYYRSKWYNDYAVSVKS

HCDR3 Seq. ID: 113 EVLLFPARSYGTGMDV

LCDR1 Seq. ID: 114 SGDNLPSKYVH

LCDR2 Seq. ID: 115 LVIYDDNERPS

LCDR3 Seq. ID: 116 GVADMPRQMK

VL Seq. ID: 117 DIELTQPPSVSVSPGQTASITCSGDNLPSKYVHWYQQ KPGQAPVLVIYDDNERPSGIPERFSGSNSGNTATLTIS GTQAEDEADYYCGVADMPRQMKVFGGGTKLTVLGQ

VH Seq. ID: 118 QVQLQQSG PG LVK PSQTLSLTCAISG DSVSDNS VAW NWIRQSPSRGLEWLGRIYYRSKWYNDYAVSVKSRITI NPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVLLFPARS YGTGM DVWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 119 GATATCGAACTGACCCAGCCGCCGAGCGTGAGCGT GAGCCCGGGCCAGACCGCGAGCATTACCTGTAGCG GCGAT AACCT GCCGTCT AAAT ACGTT CATT GGT ACC AGCAGAAACCGGGCCAGGCGCCGGTGCTGGTGAT CTACGACGACAACGAACGTCCGAGCGGCATCCCGG AACGTTTTAGCGG ATCCAACAGCG GCAACACCGCG ACCCTGACCATTAGCGGCACCCAGGCGGAAGACGA AGCGGATTATTACTG CGG TGTTGCTG ACATG CCGC GTCAGATGAAAGTGTTTGGCGGCGGCACGAAGTTA ACCGTTCTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 120

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

CAGGTGCAATTGCAGCAGAGCGGTCCGGGCCTGGT GAAACCGAGCCAGACCCTGAGCCTGACCTGCGCGA TTTCCGGAGATAGCGTGAGCGACAACTCTGTTGCTT GGAACTGGATTCGTCAGAGCCCGAGCCGTGGCCTC GAGT G GCT G GGCCGT AT CT ACT ACCGTAGCAAAT G GTACAACGACTATGCCGTGAGCGTGAAAAGCCGCA TTACCATT AACCCG GAT ACTTCG AAAAACCAGTTT A GCCTG CAACTG AACAGCG TGACCCCGG AAGATACG GCCGTGTATTATTGCGCGCGTGAAGTTCTGCTGTTC CCGGCTCGTTCTTACGGTACTGGTATGGATGTTTGG GGCCAAGGCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12757

HCDR1 Seq. ID: 121 GFTFSSYAMS

HCDR2 Seq. ID: 122 WVSFISSGGSETFYADSVKG

HCDR3 Seq. ID: 123 VSYIYYYSWVLFDV

LCDR1 Seq. ID: 124 RASQGIGTALN

LCDR2 Seq. ID: 125 LLIYDVSSLQS

LCDR3 Seq. ID: 126 QQGLFLPF

VL Seq. ID: 127 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIGTALNWYQ QKPGKAPKLLIYDVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTI SSLQPEDFATYYCQQGLFLPFTFGQGTKVEIKRT

VH Seq. ID: 128 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSW VRQAPGKGLEWVSFISSGGSETFYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSYIYYYSWVLF DVWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 129 GATATCCAGATGACCCAGAGCCCGAGCAGCCTGAG CGCCAGCGTGGGCGATCGCGTGACCATTACCTGCA GAGCGAGCCAGGGTATTGGTACTGCTCTGAACTGG TACC AG C AG AA ACCG GG C AAAGCG CCG AA ACT ATT AAT CT ACGACGTTT CTT CT CTGCAAAGCGG CGTG CC GAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATT TCACCCT GACCATT AGCT CTCT GCAACCG GAAG ACT TTGCGACCTATTATTGCCAGCAGGGTCTGTTCCTGC CGTTCACCTTTGGCCAGGGCACGAAAGTTGAAATTA AACGTACG

VH (ADN) Seq. ID: 130 GAAGTGCAATTGCTGGAAAGCGGCGGTGGCCTGGT GCAGCCGGGTGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCG

GCGTCCGGATTCACCTTTTCTTCTTACGCTATGTCTT GGGTGCGCCAGGCCCCGGGCAAAGGTCTCGAGTG GGTTTCCTTCATCTCTTCTGGTGGTTCTGAAACCTTC TATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGCTTTACCATCAG CCGCGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAAT GAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATT ATT G CGCGCGT GTTT CTT ACAT CTACT ACT ACTCTT G GGTTCTGTTCGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGG TGACTGTTAGCTCA

12758

HCDR1 Seq. ID: 131 GYSFTDYWIS

HCDR2 Seq. ID: 132 WMGAIDPTDSYTRYSPSFQG

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

HCDR3 Seq. ID: 133 WYTSHPYYEGRYPMDV

LCDR1 Seq. ID: 134 TGTSSDVGHYNYVS

LCDR2 Seq. ID: 135 LMIYGVTKRPS

LCDR3 Seq. ID: 136 ASADEWPTLH

VL Seq. ID: 137 DIALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGHYNYVSWY QQHPGKAPKLMIYGVTKRPSGVSNRFSGSKSGNTASL TISGLQAEDEADYYCASADEWPTLHVFGGGTKLTVLG Q

VH Seq. ID: 138 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTDYWISWV RQMPGKGLEWMGAIDPTDSYTRYSPSFQGQVTISAD KSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARWYTSHPYYEGRY PMDVWGQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 139 GATATCGCGCTGACCCAGCCGGCGAGCGTGAGCG GT AGCCCGGGCCAGAGCATT ACCATT AGCTGCACC GGCACCAGCAGCGATGTGGGCCATTACAACTACGT GTCTTGGTACCAGCAGCATCCGGGCAAGGCGCCGA AACTG ATG ATCTACG GTGTT ACT AAACGT CCG AG CG GCGTGAGCAACCGTTTTAGCGGATCCAAAAGCGGC AACACCGCGAGCCTGACCATTAGCGGCCTGCAAGC GGAAGACGAAGCGGATTATTACTGCGCTTCTGCTGA CGAATGGCCGACTCTGCATGTGTTTGGCGGCGGCA CG AAGTT AACCGTT CTTGGCCAG

VH (ADN) Seq. ID: 140 GAAGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAA AAAACCG GG CG AAAG CCTG AAAATTAGCTGCAAAG GCT CCGG AT AT AGCTT CACT G ACT ACTGGAT CT CTT GGGTGCGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTG GATGGGCGCTATCGACCCGACTGACAGCTACACCC GTTATAGCCCGAGCTTTCAGGGCCAGGTGACCATTA GCGCGGATAAAAGCATCAGCACCGCGTATCTGCAA TGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACCGCGATGTA TTATTGCGCG CGTTG GTACACTTCTC ATCCGTACTA CGAAGGTCGTTACCCGATGGATGTTTGGGGCCAAG GCACCCTGGTGACTGTTAGCTCA

12759

HCDR1 Seq. ID: 141 GYSFNNYWIA

HCDR2 Seq. ID: 142 WMGFIYPSNSATQYSPSFQG

HCDR3 Seq. ID: 143 DNEYSDSYFDV

LCDR1 Seq. ID: 144 RASQIVSSYLA

LCDR2 Seq. ID: 145 LLIYDASSRAT

LCDR3 Seq. ID: 146 QQSVNFPT

VL Seq. ID: 147 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQIVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQSVNFPTTFGQGTKVEIKRT

VH Seq. ID: 148

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFNNYWIAWV RQMPGKGLEWMGFIYPSNSATQYSPSFQGQVTISAD KSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDNEYSDSYFDVW GQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 149 GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAG CCTGAGCCCGGGTGAACGTGCCACCCTGAGCTGCA GAGCGAGCCAGATCGTTTCTTCTTACCTGGCTTGGT ACCAG CAG AAACCGG GCCAG GCCCCGCGTCTATTA ATCTACGACGCTTCTTCTCGTGCGACCGGCATTCCG GCGCGTTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTT CACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGACT TT GCG GTGT ATTATT GCCAGCAGTCT GTTAACTT CC CGACTACCTTTGGCCAGGGCACGAAAGTTGAAATTA AACGTACG

VH (ADN) Seq. ID: 150 GAAGTG CAATTGGTGCAG AGCGGTG CGG AAGTG AA AAAACCG GG CGAAAG CCTG AAAATTAGCTGCAAAG GCTCCGGATATAGCTTCAACAACTACTGGATCGCTT GGGTGCGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTG GATGGGCTTCATCTACCCGTCTAACAGCGCTACCCA GTATAGCCCG AGCTTTCAG G GCCAGGTGACCATT A GCGCGGATAAAAGCATCAGCACCGCGTATCTGCAA TGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACCGCGATGTA TTATTGCGCGCGTGACAACGAATACTCTGACTCTTA CTTCGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTG TTAGCTCA

12760

HCDR1 Seq. ID: 151 GYSFNNYWIA

HCDR2 Seq. ID: 152 WMGFIYPSNSATQYSPSFQG

HCDR3 Seq. ID: 153 DNEYSDSYFDV

LCDR1 Seq. ID: 154 RASQIVSSYLA

LCDR2 Seq. ID: 145 LLIYDASSRAT

LCDR3 Seq. ID: 156 QQSVKSN

VL Seq. ID: 157 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQIVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFATYYCQQSVKSNTFGQGTKVEIKRT

VH Seq. ID: 158 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFNNYWIAWV RQMPGKGLEWMGFIYPSNSATQYSPSFQGQVTISAD KSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDNEYSDSYFDVW GQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 159 GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAG CCTGAGCCCGGGTGAACGTGCCACCCTGAGCTGCA GAGCGAGCCAGATCGTTTCTTCTTACCTGGCTTGGT ACCAG CAG AAACCGG GCCAGGCCCCG CGTCTATTA ATCTACGACGCTTCTTCTCGTGCGACCGGCATTCCG GCGCGTTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTT CACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGACT TTGCGACCTATTATTGCCAGCAGTCTGTTAAATCTAA CACCTTTGGCCAGGGCACGAAAGTTGAAATTAAACG TACG

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

VH (ADN) Seq. ID: 160 GAAGTG CAATTG GTGCAGAGCGGTG CGGAAGTGAA AAAACCG GG CGAAAGCCTG AAAATTAGCTG CAAAG

GCT CCGG AT AT AGCTT CAAC AACTACTGG AT CGCTT GGGTGCGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTG GATGGGCTTCATCTACCCGTCTAACAGCGCTACCCA GTATAGCCCG AGCTTTCAG GGCCAGGTGACCATTA GCGCGGATAAAAGCATCAGCACCGCGTATCTGCAA TGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACCGCGATGTA TTATTGCGCGCGTG ACAACGAAT ACT CT G ACT CTT A CTTCGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTG TTAGCTCA

12761

HCDR1 Seq. ID: 161 GYSFNNYWIA

HCDR2 Seq. ID: 162 WMGFIYPSNSATQYSPSFQG

HCDR3 Seq. ID: 163 DNEYSDSYFDV

LCDR1 Seq. ID: 164 RASQIVSSYLA

LCDR2 Seq. ID: 165 LLIYDASSRAT

LCDR3 Seq. ID: 166 QQSNGWLP

VL Seq. ID: 167 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQIVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFATYYCQQSNGWLPTFGQGTKVEIKRT

VH Seq. ID: 168 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFNNYWIAWV RQMPGKGLEWMGFIYPSNSATQYSPSFQGQVTISAD KSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDNEYSDSYFDWV GQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 169 GATATCGTGCTG ACCCAG AG CCCGGCGACCCTGAG CCTGAGCCCGGGTGAACGTGCCAGCCTGAGGTGCA GAGCGAGCCAGATCGTTTCTTCTTACCTGGCTTGGT ACCAG CAG AAACCGG GCCAG GCCCCG CGTCTATTA ATCTACGACGCTTCTTCTCGTGCGACCGGCATTCCG GCGCGTTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTT GAGGCT GACCATT AGCAGCCTGGAACCGGAAG ACT TTGCG ACCT ATT ATTGCCAG C AGTCT AACGGTTGGC TGCCG ACCTTTG GCCAGG GCACGAAAGTTGAAATTA AACGTACG

VH (ADN) Seq. ID: 170 GAAGTGCAATTGGTGCAGAGCGGTGCGGAAGTGAA AAAACCGGGCGAAAGCCTGAAAATTAGCTGCAAAG GCTCCGGATATAGCTTCAACAACTACTGGATCGCTT GGGTGCGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTG GATGGGTTTCATCTACCCGTCTAACAGCGCTACCCA GTATAGCCCG AGCTTTCAG GG CCAGGTG ACCATTA GCGCGGATAAAAGCATCAGCACCGCGTATCTGCAA TGGAGCAGCCTGAAAGCGAGCGATACCGCGATGTA TT ATT G CGCGCGTGACAACGAAT ACT CTG ACT CTT A CTTCGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTG TTAGCTCA

12762

HCDR1 Seq. ID: 171 GYSFNNYWIA

MOR#

Seq. ID: [aa] / ADN

HCDR2 Seq. ID: 172 WMGFIYPSNSATQYSPSFQG

HCDR3 Seq. ID: 173 DNEYSDSYFDV

LCDR1 Seq. ID: 174 RASQIVSSYLA

LCDR2 Seq. ID: 175 LLIYDASSRAT

LCDR3 Seq. ID: 176 QQSEQVPT

VL Seq. ID: 177 DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQIVSSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASSRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQSEQVPTTFGQGTKVEIKRT

VH Seq. ID: 178 EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFNNYWIAWV RQMPGKGLEWMGFIYPSNSATQYSPSFQGQVTISAD KSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARDNEYSDSYFDVW GQGTLVTVSS

VL (ADN) Seq. ID: 179 GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAG CCTGAGCCCGGGTGAACGTGCCACCCTGAGCTGGA GAGCGAGCCAGATCGTTTCTTCTTACCTGGCTTGGT ACCAG CAG AAACCGG GCCAG GCCCCGCGTCTATTA AT CT ACG ACG CTT CTT CT CGTGCG ACCGGCATTCCG GCGCGTTTTAGCGGCAGCGGATCCGGCACCGATTT CACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCGGAAGACT TTGCGGTGTATTATTGCCAGCAGTCTGAACAGGTTC CGACTACCTTTGGCCAGGGCACGAAAGTTGAAATTA AACGTACG

VH (ADN) Seq. ID: 180 GAAGTG CAATTGGTGCAG AGCGGTG CGG AAGTG AA AAAACCG GG CGAAAG CCTG AAAATTAGCTGCAAAG GCTCCGGATATAGCTTCAACAACTACTGGATCGCTT GGGTGCGCCAGATGCCGGGCAAAGGTCTCGAGTG GATGGGCTTCATCTACCCGTCTAACAGCGCTACCCA GTATAGCCCG AGCTTTCAG G GCCAGGTGACCATT A GCGCGGATAAAAGCATCAGCACCGCGTATCTGCAA TGGAGCAGCCTGAAAGGGAGCGATACCGCGATGTA TT ATTGCGCGCGTG AC AACGAAT ACTCT G ACT CTT A CTTCGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACTG TTAGCTCA

Ejemplo 1: IL17C de ratón

Se adquirió IL17C de ratón en R&D Systems (#2306-ML/CF; R&D Systems, Inc., Minneapolis, EE. UU.). Se preparó IL17C de ratón biotinilada usando el módulo de biotinilación ECLTM (GE Healthcare; #1061918). Después de la 5 biotinilación se purificó el producto usando columnas de centrifugación ZebaTM Desalt (Pierce; #89889).

Se realizó control de calidad de la IL17C biotinilada usando dispersión dinámica de luz (DLS), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y SDS-PAGE (todas por sus siglas en inglés). Como se esperaba, SDS-PAGE reveló un peso molecular aparente de aproximadamente 22 kDa en condiciones reductoras y de aproximadamente 40 kDa en condiciones no reductoras. Además, no se pudieron detectar especies o agregados de peso molecular alto. El 10 tamaño previsto del antígeno se confirmó en SEC, donde se hizo visible IL17C de ratón biotinilada como un pico con un peso molecular de aproximadamente 43 kDa. En DSL, no se pudieron detectar agregados. Adicionalmente se confirmó que la IL17C de ratón era biotinilada de manera cuantitativa.

Sólo el material que pasaba el control de calidad era usado para ensayos de cribado y unión.

Ejemplo 2: Receptor E de IL17 de ratón

15 El dominio extracelular (DEC) de receptor E de IL-17 de ratón (GeneID: 57890, isoforma 1) se clonó como una

24

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

proteína de fusión Fc terminal C (referido como "IL17RE/Fc"). Una construcción que contenía un líder-vK seguida por el DEC de IL17C de ratón se expresó de manera transitoria en células HKB11 (Cho et al. (2002) J. Biomed Sci. Nov.-Dic.; 9 (6 Pt 2):631-8). Los productos se purificaron vía cromatografía de afinidad de proteína A. Se analizó la pureza en condiciones de desnaturalización, reducción y desnaturalización, no reductoras en SDS-PAGE y en estado natural por SEC de alta presión y DLS.

Ejemplo 3: Ensayo de interacción de IL17C - receptor E de IL17

Para analizar la unión de IL17 de ratón a su receptor putativo, se estableció un ensayo de interacción de receptor E de IL17. El ensayo establecido se representa en la figura 1A. En resumen, los receptores B y E de la IL17 se recubrieron en una placa estándar de 384 pozos Multi-array® (Meso Escala Descubrimiento; #L21XA-4) y se añadió IL17C de ratón biotinilada. Se midió la unión de la IL17C de ratón a su receptor mediante la unión de estreptavidina en un MSD Sector Imager6000 (Meso Escala Descubrimiento, Gaithersburg, MD, EE. UU.).

Los resultados se muestran en la figura 1B. Se encontró claramente que la IL17C se unía a IL17RE/Fc de ratón, pero no a IL-17RB de ratón u otro receptor irrelevante. Tampoco un ligando biotinilado irrelevante mostró unión a ninguno de los tres receptores ensayados. El ensayo de interacción es por lo tanto altamente específico y adecuado para el análisis de interacciones de IL17C - receptor E de IL17.

Ejemplo 4: Efecto de anticuerpos de la técnica anterior sobre la interacción de IL17C - receptor E de IL17

Se ensayaron tres anticuerpos de la técnica anterior en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de IL17C de ratón a IL17RE/Fc de ratón en el ensayo de interacción del ejemplo 3. Se ensayaron los siguientes anticuerpos:

A: anticuerpo de IL17C anti-ratón monoclonal de IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311522,# MAB23061)

B: anticuerpo de IL17C anti-ratón monoclonal de IgG2A de rata (R&D Systems; clon 311523,# MAB206)

C: IL17C anti-ratón de rata (US Biological; clon: 8B28, #I8439-20R3)

Se preincubaron anticuerpos con IL17C de ratón biotinilada y después se añadió el complejo preformado a la IL17RE/Fc de ratón recubierta.

Los resultados se muestran en la figura 1C. Ninguno de los anticuerpos de IL17C anti-ratón de la técnica anterior mostró ningún efecto sobre la unión de la IL17C de ratón a su receptor IL17RE/Fc.

Ejemplo 5: Estrategia de cribado

Se usó la biblioteca HuCAL PLATINUM® para seleccionar fragmentos Fab específicos contra IL17C de ratón. Esta

biblioteca de fagémidos se basa en el concepto HuCAL® descrito en Knappik et al. (Knappik et al. (2000) J. Mol.

Biol. 296:57-86) y emplea la tecnología CysDisplay® para visualizar el Fab en la superficie del fago (Lohning et al., patente internacional WO2001/05950).

Se llevaron a cabo diferentes estrategias de cribado, cribado en disolución, incluyendo varias estrategias de maduración, así como cribado en fase sólida convencional. Para cribado en fase sólida, se recubrió directamente IL17C de ratón en placas MaxisorpTM Immuno (Nunc; #442404). Se llevó a cabo un total de tres series de cribado para cribado en fase sólida. Se llevaron a cabo tres series de selección con un aumento sucesivo de exigencia de lavado y reducción de concentración de antígeno de una serie a otra. Para cribado en disolución se expuso antígeno biotinilado a la biblioteca de fagos en disolución con posterior captura de complejos fago-antígeno en perlas de estreptavidina. De nuevo, se llevaron a cabo tres series de selección con un aumento sucesivo de exigencia de lavado y reducción de concentración de antígeno de una serie a otra. Se aislaron los fagos usando perlas magnéticas acopladas a estreptavidina (Invitrogen, #112-05D). Para seleccionar anticuerpos de alta afinidad, se generaron bibliotecas de HCDR2 y LCDR3 después de la segunda serie de selección (tamaño de la biblioteca promedio ~1x108) seguido por dos series más de selección con exigencia más aumentada y concentraciones de antígeno más disminuidas.

Ejemplo 6: Caracterización inicial de rendimiento de cribado por ELISA

Para facilitar la rápida expresión de fragmentos Fab solubles en lisados bacterianos brutos se prepararon extractos periplasmáticos como se describió previamente (Rauchenberger et al. (2003) J. Biol. Chem. 278.40: 38194-205). Se usaron lisados de E. coli que contenían Fab para examen por ELISA de los resultados iniciales.

Se investigó la especificidad de los aglutinantes por examen por ELISA sobre el antígeno recubierto directamente o sobre el antígeno biotinilado. Para examen por ELISA en el antígeno recubierto directamente, se recurrieron placas de 384 pozos Maxisorp™ (Nunc; #460518) con 2,5 pg/mL de IL17C de ratón en PBS. Después de bloqueo de las placas con leche en polvo desnatada al 5 % en PBS, se añadieron lisados de E. coli que contenían Fab. La unión de los Fabs se detectó mediante IgG antihumana de cabra específica de F(ab)2 conjugada a fosfatasa alcalina (diluida 1:5000) usando sustrato de fluorescencia Attophos (Roche: #11681982001). Se registró la emisión de fluorescencia a 535 nm con excitación a 430 nm. Para examen por ELISA en el antígeno biotinilado se recubrieron placas

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Maxisorp™ de 384 pozos con IgG antihumana de oveja específica de fragmento Fd (sitio de unión, #PC075) diluido 1:1000 en PBS. Después de bloqueo con leche en polvo desnatada al 5 % en PBS, se añadieron lisados de E. coli que contenían Fab. Con posterioridad, se permitió que los fragmentos HuCAL®-Fab capturados se unieran a 1 pg/ml de IL17C de ratón biotinilada, que se detectó por incubación con estreptavidina conjugada a fosfatasa alcalina seguido por adición de sustrato de fluorescencia AttoPhos (Roche: #11681982001). Se registró la emisión de fluorescencia a 535 nm con excitación a 430 nm. Casi 9000 fragmentos Fab aislados del procedimiento de cribado fueron analizados en estos ensayos ELISA y aproximadamente 2900 fueron positivos en todos los ensayos ELISA.

Ejemplo 7: Caracterización de los aglutinantes por el ensayo de interacción de IL17C - receptor E de IL17

Para ensayar los lisados bacterianos brutos que contenían Fab en cuanto a la actividad neutralizante en modo examen de alto rendimiento se usó un ensayo ligeramente modificado como se indica en líneas generales en el ejemplo 3. Se recubrieron placas MSD de 384 pozos Maxisorp™ (Nunc; #460518) con 30 pL de IL17RE/Fc de ratón a 0,6 pg/mL en PBS, durante la noche, a 4 °C. Al día siguiente, se preincubaron 20 pL de lisados de E. coli que contenían Fab durante 30 minutos a TA con un volumen igual de IL17C de ratón biotinilada a 2 nM. Después del bloqueo de las placas durante 1 h con BSA al 5 % en PBS, se añadieron complejos anticuerpo-ligando preformados durante 1 h a IL17RE/Fc recubierto y se detectó unión de receptor por estreptavidina-ECL usando MSD Sector Imager 6000 (Meso Escala Descubrimiento, Gaithersburg, MD, EE. UU.).

Para determinar la actividad inhibitoria de IgG2a quimérica humana-de ratón de anti-IL17C, purificada, en un ensayo de interacción de mIL-17 RE, se recubrieron placas MSD de 384 pozos Maxisorp™ con 30 pL de IL17RE/Fc de ratón a 75 ng/mL en PBS a 4°C, durante la noche. Al día siguiente, se preincubaron 25 pL de una dilución de anticuerpo en serie (concentraciones de 0,001 a 100 nM) durante 30 min a TA con un volumen igual de IL17C de ratón biotinilada a 0,125 nM. Después del bloqueo de las placas durante 1 h con BSA al 2,5 % en PBST, se añadieron complejos anticuerpo-ligando preformados durante 1 h a IL17RE/Fc recubierto y se detectó unión de receptor mediante estreptavidina-ECL usando MSD Sector Imager.

De todos los aglutinantes positivos de ELISA, el ensayo de interacción de IL17C - receptor E de IL17, seguido por secuenciación de los clones positivos, revelaron simplemente 141 clones de única secuencia pertenecientes a 33 familias de HCDR3 diferentes. Este número de redujo de nuevo por examen confirmatorio en ELISA y ensayo de inhibición de IL17RE/Fc de ratón. Para seleccionar los candidatos con mejor actividad inhibitoria, se prediluyeron lisados BEL hasta 1:500 para uso en ensayo de inhibición de IL17RE/Fc. Finalmente, pudieron identificarse 18 clones de única secuencia pertenecientes a 8 diferentes familias de HCDR3 que fueron positivos de manera consistente y repetida en el ensayo de interacción de IL17C - receptor E de IL17.

Ejemplo 8: Conversión de IgG policlonal

Se llevó a cabo conversión de los fragmentos Fab en un formato de IgG por clonación policlonal de los fragmentos Fab en el formato de IgG deseado. Se usó un formato de IgG quimérica humana-de ratón para evitar las reacciones de inmunogenicidad dirigidas contra anticuerpos de IL17C antirratón administrados en una prueba in vivo de estudio conceptual con ratones sin manipular. Se usaron dos regiones constantes diferentes - el isotipo IgG2a y el IgG1. Se retiraron sitios potenciales de glicosilación ligados a N por mutagénesis de sitio dirigido usando el estuche de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange II (Stratagene; #0200524). La diversidad de secuencias de todas las IgG recuperadas de este procedimiento se representa en la tabla 1.

Ejemplo 9: Producción a escala exploratoria de IgG

Todas las IgG recuperadas del procedimiento descrito en el ejemplo 8 fueron producidas en escala exploratoria en células HKB11 (cho et al. (2002) J. Biomed Sci. Nov-Dec; 9(6 Pt 2):631-8) tanto en formato isotipo IgG2a humano/de ratón quimérico como IgG1 humano/de ratón quimérico, para valorar rendimientos de producción y la porción monomérica de los anticuerpos con dos regiones constantes diferentes. Las cantidades más altas podían producirse con anticuerpos del formato IgG2a humano/de ratón quimérico. Este formato también pasó con éxito el control de calidad en SEC (> 90 % de contenido en monómero). El formato IgG2a humano/de ratón quimérico se eligió, por lo tanto, para más ensayo funcional. El rendimiento de purificación y la porción de monómero cuando se determina en SEC se muestra en la figura 2.

Ejemplo 10: Determinación de la afinidad

Se valoraron todos los anticuerpos IgG2a humanos-de ratón quiméricos, purificados, sobre IL17C de ratón para determinación de EC50 en ELISA partiendo de una concentración 100 nM. Se determinaron los valores de EC50 en IL17C de ratón en 1 a 3 experimentos independientes. Los resultados se presentan en la figura 3.

Los valores de EC50 oscilaron entre 200 pM y 1200 pM, con la mayoría de los valores de EC50 alrededor de 300 pM. La actividad de unión de las 4 IgG (MOR12755, MOR12756, 12757, 12758) no pudo confirmarse con IgG2a purificada, por lo tanto, estas IgG se excluyeron de caracterización adicional. Ninguno de los anticuerpos mostró reactividad cruzada para IL17C humana (identidad de secuencias del 77 %), para IL-17B de ratón (identidad de secuencias del 30 %) o para la lisozima de antígeno de control negativo.

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Se determinaron las afinidades monovalentes de anticuerpos anti-IL17C por valoración de equilibrio en disolución (SET) usando fragmentos Fab. La determinación de la afinidad en disolución se llevó a cabo básicamente como se describe en la bibliografía (Friquet et al., (1985) J. Immunol. Meth. 77: 305-19). Para mejorar la sensibilidad y la precisión del método SET, se transfirió de ELISA clásica a tecnología basada en ECL (Haenel et al. (2005) Anal Biochem. 339.1: 182-84). Los aglutinantes se expresaron y se purificaron en formato Fab_FH. Algunos Fab no se unieron o no mostraron curva de unión sigmoidal en SET, por lo tanto, las afinidades solo se pudieron determinar para 10 candidatos. Las afinidades monovalentes oscilaban entre 48 pM y 4100 pM con la mayoría de los valores de Kd de los Fab en el intervalo de pM bajo (< 100 pM ¡Error! Fuente de referencia no encontrada). Los resultados se presentan en la figura 4.

Ejemplo 11: Ensayo de interacción de IL17C - receptor E de IL17 con aglutinantes en formato IgG

Para caracterizar los anticuerpos en formato IgG2a humano/de ratón con más detalle, se determinaron para cada candidato los valores de IC50 en el ensayo de inhibición de receptor E de IL-17, como se describió en la presente memoria anteriormente en hasta 4 experimentos independientes.

Los resultados se muestran en la figura 5. 11 de cada una de las 12 IgG mostraron actividad inhibitoria oscilando los valores medios de IC50 entre 9 pM y 8442 pM. 9 de cada una de estas 11 IgG inhibitorias incluso presentaron valores de IC50 en el rango picomolar bajo. Los mejores candidatos pertenecían a diferentes familias de HCDR3 y eran de diferentes subtipos VL (kappa o lambda).

Ejemplo 12: Estabilidad en suero de ratón

Para analizar si eran adecuados los anticuerpos IL17C antirratón seleccionados, para administración in vivo en ratones, se determinó la estabilidad en suero de ratón para un subconjunto de 11 IgG purificadas que presentaron rendimientos de producción aceptables y unión específica a IL17C de ratón (véase anteriormente).

Se recubrieron placas de 96 pozos Maxisorp (Nunc; #442404) con avidina en una concentración de 1 pg/ml en PBS durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, se incubaron IgG2a quiméricas anti-IL17 en suero de ratón durante 24 h a 37°C en una concentración final de 100 pg/mL. Después de la etapa de incubación, se diluyeron los anticuerpos 1:100 en tampón LowCross (Candor Bioscience; #100500). Como referencia se diluyó recientemente el mismo conjunto de anticuerpos en tampón LowCross + suero de ratón al 1 % y se incubó durante 30 min a TA. Se incubaron placas recubiertas de avidina con tampón de bloqueo (tampón de bloqueo Superblock de Pierce, #37515) y con posterioridad se añadieron 100 pL de 0,1 pg/mL de biotina-IL17C en tampón LowCross a los pozos bloqueados. Después de una etapa de lavado se añadió una dilución seriada de las IgG incubadas en suero y recién diluidas. Se detectó la unión de las IgG mediante anticuerpo de detección conjugado con POD IgG2a antirratón (diluido 1:5000 en tampón LowCross) usando TMB de un componente para HRP como sustrato. Se detuvo la reacción añadiendo HCl 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm.

Con la excepción de un candidato de IgG (MOR12760) que presentó sólo estabilidad en suero moderada, todos los demás anticuerpos presentaron una estabilidad muy buena en suero de ratón (coeficiente de variación < 20 %) después de incubación durante 24 h a 37°C. Los resultados se representan en la figura 6.

Ejemplo 13: Selección de los aglutinantes para la prueba in vivo del estudio conceptual

Basándose en sus propiedades favorables con respecto a la productividad, estabilidad, unión y actividad funcional en el ensayo de inhibición de receptor IL-17RE y en un ensayo de gen indicador de NFkB celular, se seleccionaron MOR12743 y MOR12762 como candidatos para la prueba in vivo de estudio conceptual.

Ejemplo 14: Modelo CIA in vivo

14.1 Materiales

El adyuvante completo de Freund (CFA, por sus siglas en inglés) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA, por sus siglas en inglés) se adquirieron en Difco (MI, EE. UU.). Se obtuvieron colágeno bovino tipo II (CII), lipopolisacárido (LPS) y Enbrel en MD Biosciences (Alemania); Sigma (P4252, L'Isle d'Abeau, Francia), Whyett (jeringa inyectable de 25 mg, Francia), respectivamente. Todos los demás reactivos usados fueron de calidad reactivo y todos los disolventes fueron de calidad analítica.

14.2 Animales

Se obtuvieron ratones DBA1/J (macho, 6-7 semanas, de aprox. 20 gramos) en el Centre d'Elevage Regional Janvier (Laval, Francia). Se mantuvieron los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (0700 - 1900). Se mantuvo la temperatura a 22°C y se proporcionó alimento y agua ad líbitum.

14.3 Artritis inducida por colágeno (CIA)

Un día antes del experimento, se preparó disolución de CII (2 mg/mL) con ácido acético 0,05 M y se almacenó a 4 °C. Justo antes de la inmunización, se mezclaron volúmenes iguales de adyuvante (IFA) y CII mediante un

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homogeneizador en un frasco de vidrio preenfriado en un baño de agua de hielo. Puede requerirse adyuvante extra y homogenización prolongada si no se forma una emulsión. Se inyectaron por vía intradérmica 0,1 mL de la emulsión en la base de la cola de cada ratón el día 1, se efectuó una segunda inyección intradérmica reforzante (disolución de CII a 2 mg/mL en emulsión de 0,1 mL de CFA) el día 21. Este método de inmunización se modificó a partir de los métodos publicados (Brand et al, 2007, Collagen-induced arthritis. Nature Protocols; vol. 2 (5): 12691275; Lin et al., 2007, Anti-rheumatic activities of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in vivo in collagen-induced arthritis in rodents. Br J Pharmacol. Abr.; 150 (7):829-31).

14.4 - Diseño del estudio

14.4.1 Protocolo terapéutico

Los efectos terapéuticos de los anticuerpos se ensayaron en el modelo CIA de ratón. Se dividieron los ratones en grupos iguales de manera aleatoria y cada grupo contuvo 10 ratones. Todos los ratones fueron inmunizados el día 1 y se reforzaron el día 21. La dosificación terapéutica duró desde el día 31 al día 46. El grupo de control negativo fue tratado con vehículo (PBS) y el grupo de control positivo con Enbrel (10 mg/kg, x3 semana, i. p.). Se ensayó un anticuerpo de interés con 10 mg/kg, i. p. 3 veces por semana.

Por lo tanto, se usaron cinco grupos de tratamiento diferentes, en donde cada grupo consistió en diez ratones.

Grupo 1: Vehículo (PBS)

Grupo 2: Enbrel 10 mg/kg/x3 semana, i. p.

Grupo 3: MOR03207 10 mg/kg/x3 semana, i. p.

Grupo 4: MOR12743 10 mg/kg/x3 semana, i. p.

Grupo 5: MOR12762 10 mg/kg/x3 semana, i. p.

Se administraron anticuerpos anti-IL17C i. p. tres veces a la semana a 10 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre (aprox. 250 jL) los días 31 y 46 para análisis farmacocinético.

14.4.2 Protocolo preventivo

Los efectos preventivos de los anticuerpos se ensayaron en el modelo CIA de ratón. Se dividieron los ratones en dos grupos iguales de manera aleatoria que contenían 20 ratones. Todos los ratones fueron inmunizados el día 1 y se reforzaron el día 21. La dosis profiláctica duró desde el día 21 al día 46. Se trató el grupo de control negativo con anticuerpo negativo (MOR03207, 10 mg/kg, x3 semana., i. p.). Se ensayó un anticuerpo de interés (MOR12762) a 10 mg/kg, x 3 semana, i. p.

Por lo tanto, se usaron dos grupos de tratamiento diferentes, en donde cada grupo consistió en veinte ratones.

Grupo 1: MOR03207 10 mg/kg/x3 semana, i. p.

Grupo 2: MOR12762 10 mg/kg/x3 semana, i. p.

Se administraron anticuerpos anti-IL17C i. p. tres veces a la semana a 10 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre (aprox. 250 jL) los días 21, 36 y 46 para análisis farmacocinético.

14.5 Valoración clínica de artritis

Se calificó la artritis según el método de Khachigian 2006 (Collagen antibody-induced arthritis. (2006) Nature Protocols 1, 2512-6), Lin et al. 2007 (supra); Nishida et al. 2004 (Histone deacetylase inhibitor suppression of autoantibody-mediated arthritis in mice via regulation of p16INK4a and p21(WAF1/Cip1) expression. Arthritis Rheum. 10: 3365-76) y Brand et al. 2007 (supra). La hinchazón de cada una de las cuatro patas se calificó con la puntuación artrítica como sigue: 0 - sin síntomas; 1 - leve, pero enrojecimiento definido e hinchazón de un tipo de articulación tal como el tobillo o la muñeca o enrojecimiento aparente e hinchazón limitada a dedos individuales, sin considerar el número de dedos afectados; 2 - moderado enrojecimiento e hinchazón de dos o más tipos de articulaciones; 3 - intenso enrojecimiento e hinchazón de toda la pata incluyendo los dedos; 4 - extremidad inflamada al máximo con implicación de múltiples articulaciones (puntuación clínica de la artritis acumulativa máxima 16 por animal) (Nishida et al., 2004 (supra)).

Si se requiere, para permitir el metaanálisis de múltiples estudios terapéuticos pueden normalizarse los valores de la puntuación clínica como sigue:

ABC de puntuación clínica (puntuación del ABC):

El área bajo la curva (ABC) del día 31 (21) al día 46 se calculó para cada animal individual. El ABC de cada animal se dividió por el ABC promedio obtenido para el vehículo en el estudio del que se obtuvieron los datos sobre ese

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animal y se multiplicó por 100 (es decir, el ABC se expresó como un porcentaje del ABC promedio del vehículo por estudio).

La puntuación clínica aumentó del día 21 al día 46 (puntuación de extremo):

La diferencia de puntuación clínica para cada animal se dividió por la diferencia de puntuación clínica promedio obtenida para el vehículo en el estudio del que se obtuvieron los datos sobre ese animal y se multiplicó por 100 (es decir, la diferencia se expresó como un porcentaje de la diferencia de puntuación clínica promedio para el vehículo por estudio).

14.6 Radiología (puntuación de Larsen)

Se tomaron fotos por rayos X de las patas posteriores de cada animal individual. Se asignó un número de identidad ciego, aleatorio, a cada una de las fotos y se ordenó la gravedad de la erosión ósea mediante tres marcadores independientes con el sistema de puntuación de Larsen radiológico como sigue: 0 - normal con contornos óseos intactos y espacio articular normal; 1 - ligera anormalidad mostrando uno o dos cualesquiera de los huesos metatarsales exteriores una ligera erosión ósea; 2 - anormalidad temprana definida mostrando de tres a cinco cualesquiera de los huesos metatarsales exteriores erosión ósea; 3 - anormalidad destructiva media mostrando todos los huesos metatarsales exteriores así como uno o dos cualesquiera de los huesos metatarsales interiores erosiones óseas definidas; 4 - anormalidad destructiva grave mostrando todos los huesos metatarsales erosión ósea definida y al menos una de las articulaciones metatarsales internas completamente erosionada dejando algunos contornos de articulaciones óseos parcialmente protegidos; 5 - anormalidad de mutilación sin contornos óseos. Este sistema de puntuación es una modificación de Salvemini et al., 2001 (Amelioration of joint disease in a rat model of collagen-induced arthritis by M40403, a superoxide dismutase mimetic. Arthritis Rheum. 44:2909-21); Bush et al., 2002 (Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum. 46: 802-5); Sims et al., 2004, (Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum., 50: 2338-46) y Jou et al., 2005 (Thrombospondin 1 as an effective gene therapeutic strategy in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 52:339- 44).

14.7 Resultados

En el modelo de tratamiento, se valoró el tratamiento mediante la puntuación clínica y la puntuación de Larsen. Los resultados se representan en la figura 7 y la figura 8. Sorprendentemente, ambos anticuerpos anti-IL17C ensayados (MOR12743 y MOR12762) demostraron una inhibición significativa de la inflamación. El anticuerpo de control negativo, MOR03207, no inhibió la inflamación, mientras que el control positivo, Enbrel, inhibió el progreso de la enfermedad.

En el modelo preventivo, se valoró el tratamiento mediante la puntuación clínica y la puntuación de Larsen. Los resultados se muestran en la figura 9. Sorprendentemente, el anticuerpo anti-IL17C ensayado (MOR12762) demostró una inhibición significativa de la inflamación y degradación ósea. El anticuerpo de control negativo, MOR03207, no inhibió ni la inflamación ni la erosión ósea.

14.8 Estado estable FC

En la predosis, los días 31 y 46 (protocolo de tratamiento) o los días 21, 36 y 46 (protocolo preventivo), se recogieron muestras de sangre en el seno retroorbital con heparina de litio como anticoagulante. Se centrifugaron las muestras de sangre completa y se almacenaron las muestras de plasma resultantes -20 °C pendientes de ensayo.

Ejemplo 15 - Modelo de humo de tabaco

Las exposiciones diarias de los ratones (C57BL/6J, Charles River) a humo de tabaco (HT) durante 11 días consecutivos dio como resultado inflamación pulmonar, como se indica por un aumento en el número total de células recuperadas en el lavado bronquioalveolar (LBA), cuando se compara con un grupo expuesto al aire tratado de manera similar, 24 h después de la exposición final. La respuesta consistió en aumentos significativos en los números de macrófagos, células epiteliales, neutrófilos y linfocitos recuperados en el LBA.

Se administró MOR12743 por vía intraperitoneal (i. p.), 1 h previamente a la exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10 de exposición. Esto dio como resultado una inhibición significativa en el número total de células recuperadas en el LBA y específicamente en los números de células epiteliales y neutrófilos.

Se administró MOR03207 por vía intraperitoneal (i. p.), 1 h previamente a la exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10 de exposición. Esto no dio como resultado ninguna inhibición significativa en los números totales de células o los números de tipos de células identificados de manera específica cualesquiera recuperados en el LBA.

Se administró roflumilast (ChemPharmaServe Ltd. Ref. 0010206), 5 mg/kg, por vía oral (p. o.), 1 h previamente a cada exposición a HT. Esto inhibió de manera significativa el número total de células recuperadas en el LBA y

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específicamente los números de células epiteliales, neutrófilos y linfocitos.

Todos los grupos expuestos a HT mostraron alguna pérdida de peso corporal, pero esto no fue significativo cuando se comparó con el grupo expuesto al aire en el sacrificio el día 12.

15.1 Materiales

Vehículo para administración i. p.: D-PBS pH 7,4 (Producto PAA Ref. H15-002, Lote H00208-2353)

Vehículo para administración p. o.: PEG 200/agua para inyección (60 %/40 % v/v)

Se obtuvo solución salina tamponada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés), para el lavado broncoalveolar (LBA), en Gibco. Se obtuvo eutatal (pentobarbitona sódica) en Merial Animal Health Ltd. Se generó el humo de tabaco usando cigarrillos 'Marlboro 100' adquiridos de un proveedor comercial.

Formulaciones:

Se congelaron MOR12743 y MOR03207, a 1 mg/mL. Se dejó que las dos sustancias de ensayo descongelaran a 4 °C durante la noche previamente a la administración.

Se formuló roflumilast poniendo una cantidad prepesada en un mortero y triturándola con cuidado mientras se añadía vehículo (PEG200/agua, 60 %/40 % v/v), gota a gota, para formar una suspensión. Las suspensiones se mezclaron en vórtice previamente a la administración.

15.2 Métodos

Estudios previos han establecido que los números totales de células recuperadas en el LBA eran significativamente elevados 24 h después de la última de las 11 exposiciones a HT diarias. En este estudio, se usó para análisis un instante del tiempo de 24 h después de la exposición al aire o a HT final.

Se administró vehículo (PBS), MOR12743 y MOR03207 i. p., 1 h previamente a la exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Se administró roflumilast p. o., 1 h previamente a cada exposición a hT.

15.2.1 Exposición de los animales a HT a diario durante 11 días consecutivos.

En este protocolo de exposición, se expusieron los ratones en grupos de 5 en cámaras de policarbonato claras (27 cm x 16 cm x 12 cm). Se dejó que el HT de los cigarrillos 'Marlboro 100' entrara en las cámaras de exposición a un caudal de 100 mL/min. Para minimizar cualquier problema potencial producido por la exposición repetida a un nivel alto de HT, el periodo de exposición a HT se aumentó inicialmente de 25 minutos al comienzo del estudio (día 1) a un máximo de 45 minutos el día 3. El plan de exposición usado en este estudio fue como sigue:

Día 1:

25 min de exposición (~5 cigarrillos)

Día 2:

35 min de exposición (~7 cigarrillos)

Días 3-11:

45 min de exposición (~9 cigarrillos)

Se ventilaron las jaulas de exposición después de 10 min y cada 5 min después.

Se expuso un grupo más de ratones al aire en una base diaria para extensiones de tiempo equivalentes como controles simulados (sin exposición a HT).

15.2.2 Lavado broncoalveolar y ensayo cytospin

El lavado broncoalveolar se realizó como sigue:

Se canuló la tráquea usando una cánula de acero inoxidable de conector Luer de 10 mm de largo. Se usó solución salina tamponada con fosfato (PBS) como el fluido de lavado. Se instiló con cuidado un volumen de 0,4 ml y se retiró 3 veces usando una jeringa de 1 ml y después se puso en un tubo Eppendorf y se mantuvo en hielo previamente a determinaciones posteriores.

Se llevaron a cabo recuentos de células totales como sigue:

Se separó el fluido de lavado de las células por centrifugación (6 min a 356 rad/s (3400 rpm), RCF (fuerza centrífuga relativa, por sus siglas en inglés) = 3070 x g - 'Eppendorf Mini Spin') y se decantó el sobrenadante y se congeló para posibles análisis posteriores. Se resuspendió el botón celular en un volumen conocido de PBS y se calcularon los

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números de células totales por recuento de una alícuota teñida (tinción de Turk) bajo el microscopio usando un hemocitómetro.

Se llevaron a cabo recuentos de células diferenciales como sigue:

Se diluyó el botón celular residual a aproximadamente 105 células por mL. Se puso un volumen de 500 jl en el embudo de un portaobjetos de cytospin y se centrifugó durante 8 min a 84 rad/s (800 rpm), RCF = 72,26 x g (Shandon Cytospin 3). Se secó al aire el portaobjetos y se coloreó usando tinción Wrights/Giemsa según las instrucciones registradas. Cuando se secó y se deslizó la cubierta, se llevaron a cabo recuentos de células diferenciales usando microscopía óptica. Se contaron aproximadamente 400 células para cada portaobjetos. Se identificaron las células usando técnicas morfométricas clásicas.

15.3 Regímenes de tratamiento

En este estudio, se sometieron 4 grupos de ratones a exposición diaria a HT, durante 11 días, y se sacrificaron el día 12, 24 h después de la exposición a HT final. Se administró a tres grupos vehículo (D-PBS), MOR12743 o MOR03207 i. p., 1 h previamente a la exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Se administró a un grupo roflumilast p. o., 1 h previamente a cada exposición a HT. Se expuso un grupo más al aire durante 11 días consecutivos y se sacrificaron el día 12, 24 h después de la exposición al aire final. Se administró vehículo (D-PBS) a este grupo, i. p., 1 h previamente a la exposición los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Para todos los grupos n = 10.

15.4 Procedimientos de muestreo

Todos los ratones fueron sacrificados el día 12, por sobredosis de anestésico de barbiturato intraperitoneal, 24 h después de exposición final al aire o a HT. Se tomó una muestra de sangre sobre heparina de la vena subclavia y se separó el plasma por centrifugación y se almacenó a -40 °C. Se llevó a cabo un LBA usando 0,4 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se usaron células recuperadas del LBA para los recuentos de células totales y de células diferenciales. Los sobrenadantes del LBA y el botón celular restante se almacenaron a -40 °C y -80 °C, respectivamente, para posibles futuros análisis. Después del LBA, se dejó la cánula ajustada. Se retiraron el corazón y los pulmones después de abrir cuidadosamente el tórax y reduciendo cada lado del esternón y las costillas. Se cerró el lóbulo izquierdo, se retiró, se congeló de manera instantánea y se almacenó a -80 °C. Se infló el lóbulo derecho con formalina tamponada con fosfato al 10 % (PBF, por sus siglas en inglés) a una presión de 18 cm de PBF durante 20 minutos. Después se ligó la tráquea por debajo de la cánula y se retiró la cánula. Se sumergieron corazón, pulmón y tráquea en PBF.

15.5 Medición de datos y análisis estadístico

Los resultados se presentan como puntos de datos individuales para cada animal y se calculó el valor medio para cada grupo.

Los datos se sometieron inicialmente, por lo tanto, a un análisis de una vía de ensayo de la varianza (ANOVA), seguido por una corrección de Bonferroni para múltiples comparaciones para ensayar diferencias estadísticamente significativas entre grupos de tratamiento. Se consideró que un valor de "p" <0,05 era estadísticamente significativo. Se calcularon las inhibiciones en porcentaje usando la fórmula a continuación:

7,

% Inhibición = (1-

Resuitado grupo de tratamiento-Result. grupo simulación Resultado grupo vehículo HT -Resutt. grupo simulación

)x100

15.6 Resultados

15.6.1 Inflamación pulmonar, como se indica por el aumento en el número de células recuperadas en el LBA, inducida por exposiciones diarias a HT.

Se expuso un grupo a HT diariamente durante 11 días y se le administró vehículo (D-PBS), i. p., 1 h previamente a la exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10 del estudio. Cuando se comparó con un grupo expuesto al aire tratado de manera similar, los ratones presentaron inflamación pulmonar presentada como un incremento significativo (p < 0,001) en el número total de células recuperadas en el LBA en el sacrificio el día 12 (24 h después de la exposición a HT final). Esta inflamación consistió en incrementos significativos en los números de macrófagos, células epiteliales, neutrófilos y linfocitos (p < 0,001 para todos), cuando se compara con los animales expuestos al aire (simulación) (Tabla 2).

Tabla 2: Resumen de los efectos de la exposición a HT durante 11 días consecutivos en respuestas inflamatorias pulmonares en ratones.

Marcadores inflamatorios (LBA)

Exposición a HT Días 1-11

Veces de aumento* p

Células totales

9,5 <0,001

Macrófagos

7,3 <0,001

Células epiteliales

6,6 <0,001

Neutrófilos

551,8 <0,001

Eosinófilos

80,1 n. s.

Linfocitos

96,7 <0,001

* Cuando se compara con el grupo de control expuesto al aire en el mismo instante de tiempo. Se sometieron los datos a ANOVA. Se consideró que un valor de "p" <0,05 era estadísticamente significativo. n. s. = no estadísticamente significativo.

15.6.2 Efecto de administración i. p. de MOR12743 en inflamación pulmonar, como se indica por el aumento en el número de células recuperadas en el LBA, inducido por exposiciones diarias a HT.

MOR12743, 5 mg/kg, administrado i. p., 1 h previamente a exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10, inhibió de manera 5 significativa los números de células totales recuperadas en el LBA (26 %, p < 0,001) y específicamente células epiteliales (52 %, p < 0,001) y neutrófilos (48 %, p < 0,001). El grado y la significancia de la inhibición se resumen en la tabla 3.

15.6.3 Efecto de administración i. p. de MOR03207 en inflamación pulmonar, como se indica por el aumento en el número de células recuperadas en el LBA, inducido por exposiciones diarias a HT.

10 MOR12743, 5 mg/kg, administrado i. p., 1 h previamente a exposición a HT los días 1, 4, 7 y 10, no inhibió de

manera significativa los números de células totales recuperadas en el LBA o los números de cualquier tipo celular identificado de manera específica, elevados, después de exposición a HT. Los datos se resumen en la tabla 3.

15.6.4 Efecto de administración oral de roflumilast en inflamación pulmonar, como se indica por el aumento en el número de células recuperadas en el LBA, inducido por exposiciones diarias a HT.

15 Roflumilast, 5 mg/kg, administrado p. o., 1 h previamente a cada exposición a HT, inhibió de manera significativa los números de células totales recuperadas en el LBA (32 %, p < 0,001) y específicamente células epiteliales (50 %, p < 0,001), neutrófilos (56 %, p < 0,001) y linfocitos (54 %, p < 0,01). El grado y la significancia de la inhibición se resumen en la tabla 3.

Tabla 3: Resumen de los efectos de MOR12743, MOR03207 y roflumilast sobre las respuestas inflamatorias 20 inducidas por HT en ratones.

Compuesto

MOR12743 MOR03207 Roflumilast

Tratamiento

5 mg/kg i. p. los días 1, 4, 7 y 10. 5 mg/kg i. p. los días 1, 4, 7 y 10. 5 mg/kg p. o. una vez al día

Inhibición

% valor p % valor p % valor p

Células totales

26 <0,001 0 n. s. 32 <0,001

Macrófagos

6 n. s. -3 n. s. 13 <0,001

Células epiteliales

52 <0,001 8 n. s. 50 <0,001

5

10

15

20

25

Compuesto

MOR12743 MOR03207 Roflumilast

Tratamiento

5 mg/kg i. p. los días 1, 4, 7 y 10. 5 mg/kg i. p. los días 1, 4, 7 y 10. 5 mg/kg p. o. una vez al día

Neutrófilos

48 <0,001 -1 n. s. 56 <0,001

Linfocitos

24 n. s. 20 n. s. 54 <0,01

Eosinófilos

Aumento no estadísticamente significativo después de exposición a HT.

Todos los datos se sometieron a un ensayo ANOVA para comparaciones para ensayar diferencias significativas entre grupos de tratamiento. Se consideró que un valor de "p" < 0,05 era estadísticamente significativo. n. s.= no estadísticamente significativo.

15.6.5 Efecto del tratamiento en los pesos corporales de ratones durante las once exposiciones diarias a HT.

Para vigilar la salud de los ratones durante la duración del protocolo de exposición, se pesaron los ratones al comienzo del estudio, el día 6 y el día 12 previamente al sacrificio. Durante los 12 días del estudio, los ratones con exposición simulada presentaron poco cambio o ninguno en el peso corporal. Todos los grupos expuestos a HT mostraron alguna pérdida de peso corporal durante este periodo, pero estas pérdidas no fueron estadísticamente significativas.

15.7 Conclusión

MOR12743, 5 mg/kg, administrado i. p., los días 1, 4, 7 y 10, inhibió de manera significativa el número total de células recuperadas en el LBAy específicamente células epiteliales y neutrófilos. MOR03207, 5 mg/kg, administrado de la misma manera, no presentó efecto en el número de células totales recuperadas en el LBA o en los números de cualquier tipo celular identificado de manera específica.

El compuesto de referencia, roflumilast, 5 mg/kg, administrado p. o., 1 h previamente a cada exposición a HT, inhibió de manera significativa el número total de células recuperadas en el LBA y específicamente células epiteliales, neutrófilos y linfocitos. La respuesta fue similar a la observada en estudios previos.

Todos los grupos expuestos a HT mostraron alguna pérdida de peso corporal durante el periodo de estudio de 12 días, pero no hubo diferencias significativas entre ninguno de los grupos de tratamiento.

Ejemplo 16 - Instilación intranasal de LPS: un modelo en ratones de neutrofilia aguda de pulmón.

Se realizaron dos estudios independientes con un mAb negativo y dos mAb positivos en la instilación intranasal de modelo en ratones de lipopolisacárido (LPS) de neutrofilia aguda de pulmón, un modelo que imita algunos aspectos relevantes de la EPOC (enfermedad pulmonar obstructiva crónica). Los efectos se midieron por recuento de células inflamatorias de lavado bronquioalveolar (LBA).

16.1 Grupos de estudio

Se trataron varios grupos de ratones con diferentes anticuerpos y dexametasona y se comparó con los ratones sometidos a LPS solo. El resumen de los grupos se proporciona en la tabla 4.

Tabla 4

Número de animales en el grupo Dosis Vía Frecuencia Vehículo

Solución salina

5 - - - -

LPS

10 10 pg/ratón Intranasal - Solución salina

LPS+DEX

10 30 mg/kg Per os Dos veces al día MC 0,5 %

5

10

15

20

25

30

35

Número de animales en el grupo Dosis Vía Frecuencia Vehículo

LPS+MOR0 3207

10 5 mg/kg Por vía intraperitoneal UNA VEZ D-PBS

LPS+MOR1 2743

10 5 mg/kg Por vía intraperitoneal UNA VEZ D-PBS

LPS+MOR1 2762

10 5 mg/kg Por vía intraperitoneal UNA VEZ D-PBS

16.2 Materiales

• Lipopolisacárido (LPS): de Escherichia coli 055:B5, ref.: L4524-25MG, purificado por cromatografía de afinidad lote: 018K4077 - Sigma. Se preparó LPS por volumen administrado por instilación intranasal: 50 jL/ratón (10 jg/50 jL)

• Solución salina: cloruro de sodio 0,9 %, lote 9F0191 (sin endotoxina, Lavoisier)

• Ketamina: Imalgene MERIAL 1000, 10 mL

• Xilazina: Rompun BAYER PHARMA 2 %, 25 mL

• Isoflurano: Aerrane, lote 10E28A35

• Metilcelulosa (MC): VWR, ref. AX021233 lote M1395

• Preparación de dexametasona (DEX): 30 mg/kg, 10 mL/kg, 0,2 mL/ratón, p. o.

• Se congelaron los anticuerpos, a 1 mg/mL. Se dejó que las sustancias de ensayo descongelaran a 4 °C durante la noche previamente a la administración. Todos los anticuerpos estuvieron listos para uso en la descongelación (o se diluyeron improvisadamente).

16.3 Animales

Se usaron en el estudio ratones hembra BALB/c de Harlan (Francia). El peso de los ratones fue alrededor de 20 g.

16.4 Procedimientos experimentales Administración intranasal

Los ratones fueron anestesiados por inhalación de isoflurano. Durante la respiración, se instiló por vía intranasal LPS. Después de 24 h, se anestesiaron los ratones por vía intraperitoneal (IP) y se llevó a cabo procedimiento de lavado bronquioalveolar. Los ratones fueron anestesiados por inyección de solución anestésica de 0,1 mL por 10 g del peso del ratón. La solución anestésica estaba constituida por 18 ml de NaCl al 0,9 %, 0,5 mL de xilazina (5 mg/kg) y 1,5 mL de ketamina (75 mg/kg).

Lavado bronquioalveolar (LBA)

Se expuso la tráquea por incisión de la línea media y se canuló (con un catéter de ratones). Se llevó a cabo un LBA dos veces usando 1 mL de tampón PBS estéril. Se retiró fluido de lavado y se centrifugó a 157 rad/s (1500 rpm) durante 10 min a 4 °C. Se resuspendió el botón celular en 200 jL de tampón de PBS. Se contaron las células usando un contador de células (Vet abc, Francia). Se mantuvo el sobrenadante de fluido de lavado a -20 °C para dosificación de mediadores de la inflamación.

16.5 - Diseño del estudio

Dexametasona: Se realizó tratamiento con dexametasona 24, 16 y 1 hora previamente a instilación de LPS y 6 horas después de administración de LPS

Anticuerpos: 24 horas antes de instilación de LPS, se trataron los ratones con uno de los mAb (MOR03207, MOR12762 o MOR12743).

Para todos los grupos, se llevó a cabo LBA 24 horas después de administración de LPS y se midió el contenido de

34

5

10

15

20

25

30

35

40

células.

Resultados

Los resultados se analizaron usando la prueba t de Student. Se compararon los contenidos en células de LBA de ratones tratados con anticuerpo o dexametasona con el contenido en células en ratones sometidos solo a LPS. Se consideraron los promedios +/- sem (error estándar de la media, por sus siglas en inglés) de los contenidos en células de los ratones en cada grupo. Los resultados se presentan en la figura 10.

Conclusión

El tratamiento único con anticuerpo MOR03207 (control negativo) a 5 mg/kg no inhibió de manera significativa (tendencia n. s.) la selección de células inflamatorias en el BALF. Al mismo tiempo, un solo tratamiento con anticuerpo MOR12762 o MOR12743 a 5 mg/kg inhibió de manera significativa la selección de células inflamatorias en el BALF. Esto indica que la IL17C regula la neutrofilia grave y es una diana terapéutica para enfermedades pulmonares tales como EPOC.

Por lo tanto, se demuestra por primera vez que los antagonistas de la IL17C, por ejemplo, los anticuerpos de IL17C, son eficaces en el tratamiento de trastornos y enfermedades inflamatorias.

Ejemplo 17 - Perfil de expresión de la IL17C en tejido respiratorio humano

En este estudio, se midió la expresión de la IL17C por PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR, en inglés) en diferentes tipos de tejido respiratorio humano (bronquio terciario, bronquio cuaternario y arteria pulmonar) de muestras tanto de control como de enfermedad. Las muestras de control procedían de donadores no fumadores y fumadores mientras que las muestras de enfermedad procedían de pacientes de EPOC, pacientes con bronquitis aguda/crónica y pacientes con enfisema pulmonar.

17.1. Purificación de ARN y CC (control de calidad)

Se aisló ARN total de los tejidos congelados usando metodologías clásicas de acuerdo con los protocolos de los proveedores o con adaptaciones propias.

Criterios de CC cumplidos (datos no mostrados):

Presencia de ARN ribosómico 18S

Número de copias mínimo de transcritos de ARNm de los genes de control, determinado usando qRT-PCR, como sigue:

• p-actina (longitud del amplicón 295 pb) > 3.800 copias de transcrito/100 ng de ARN total

• gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH, longitud del amplicón 71 pb) > 10.000 copias de transcrito/100 ng ARN total

• No contaminación del ADN

17.2 Tratamiento de muestras de ARN con ADNasa

Se trató ARN total con ADNasa I exenta de ARNasa para eliminar el ADN genómico residual (ADNg). Para ensayar la eliminación exitosa de ADN de muestras de ARN, se realizó qPCR sin previa transcripción inversa. La ausencia de una señal de multiplicación confirmó que las muestras de ARN estaban exentas de ADN.

17.3 Conjuntos de sonda y cebador

Los conjuntos de sondas y cebadores usados para qRT-PCR se muestran a continuación:

Tamaño del amplicón de la IL17C: 72 pb

Cebador directo:

5' - ATGAGGACCGCTATCCACAGA - 3' (SEQ ID No.:184)

Cebador inverso:

5' - CCCGTCCGTGCATCGA - 3' (SEQ ID No.:185)

Sonda:

5' - TGGCCTTCGCCGAGTGCCTG - 3' (SEQ ID No.:186)

Se etiquetó la sonda en el extremo 5' con 6-carboxifluoresceína (FAM) y en el extremo 3' con 6-carboxi-tetrametil-

5

10

15

20

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45

50

rodamina (TAMRA).

17.4 Síntesis de ADNc

Se incubó ARN de ADNasa con los cebadores inversos para beta 1, beta 2, beta 3 y GAPDH en tampón de transcripción inversa, calentándose las muestras a 72 °C (para retirar la estructura secundaria) y enfriando después a 55 °C (para hibridar los cebadores). Se añadieron transcriptasa inversa MuLV y nucleótidos y se incubaron las mezclas de reacción durante 30 minutos a 37 °C para permitir que tuviera lugar la síntesis de ADNc. Después se calentaron las muestras a 90 °C durante 5 minutos para desnaturalizar la transcriptasa inversa.

17.5 qRT-PCR

Se usó metodología de multiplexación - usando qRT-PCR para la medición simultánea de los niveles de ARNm de los genes de interés y GAPDH. La medición simultánea de GAPDH en cada tubo de ensayo proporcionó una comprobación de CC para una exitosa transcripción inversa y qRT-PCR. Se llevaron a cabo las reacciones con ADNc procedente de 50 ng de ARN total. Se añadieron cebadores directos e inversos y sondas para cada diana y GAPDH a la mezcla de reacción junto con nucleótidos, tampón y polimerasa Taq AmpliTaq GoldTM. Las condiciones de la PCR fueron: 94 °C durante 12 minutos (etapa de activación enzimática), seguido por 40 ciclos de 94 °C durante 15 segundos (etapa de desnaturalización) y 60 °C durante 30 segundos (para hibridar I y extender). Después del ensayo de sensibilidad, se aumentó la temperatura de la PCR inicial para beta 3 a 97 °C.

Resultados

Los datos presentados aquí muestran que la IL17C, un miembro de la familia de la interleucina 17 de citocinas proinflamatorias, se expresa de manera constitutiva en el pulmón humano. Además, se observaron niveles aumentados de expresión de IL17C en muestras de tejido pulmonar procedentes de donadores con enfermedades respiratorias inflamatorias diagnosticadas como EPOC, bronquitis o enfisema pulmonar, en comparación con las muestras de control (Figura 11).

Ejemplo 18 - Modelo de psoriasis en ratones inducida por imiquimod (IMQ)

La función proinflamatoria de la IL17C en la piel se examinó en un modelo de psoriasis en ratones con inflamación cutánea no infecciosa donde el imiquimod agonista de TLR7-TLR8 tópico induce lesiones cutáneas psoriásicas caracterizadas por proliferación epidérmica e infiltración de leucocitos, que son dependientes de citocinas TH17 patógenas (Van der Fits et al., J of Immunol. 1 de mayo de 2009; 182(9):5836-45). La función de la IL17C en este modelo particular se documentó recientemente (Ramirez-Carrozzi et al., Nat Immunol. 2011 12(12):1159-66) y se proporcionó una prueba genética convincente de la función de la IL17C en el modelo de la enfermedad con IL17C'/_ ratones. Se usó el mismo modelo de psoriasis para estudiar más la respuesta de la IL17C a IMQ en la piel e identificar las células que producen la IL17C.

18.1 Reactivos

Se usaron vaselina (Vaseline officinale, Cooper) e imiquimod crema (Aldara, crema al 5 %, MEDA). Los anticuerpos usados fueron IL17A/F antirratón (R&D System, clon 50104, ref. MAB421) e IL23p40 antirratón (eBioscience, clon C17.8, ref. 16-7123-85).

18.2 Animales

Se obtuvieron ratones Balb/c N (hembra, 18-20 g, aprox., de 10 semanas) en CERJ o Halan (Francia). Se mantuvieron los ratones en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h (0700 - 1900). Se mantuvo la temperatura a 22°C y se proporcionó alimento y agua ad líbitum.

18.3 Procedimientos experimentales

Para inducir una respuesta psoriásica, una dosis típica diaria de 62,5 mg de imiquimod crema sobre el dorso rasurado y la oreja derecha durante 5 días consecutivos (D0-D4), que se traduce en una dosis diaria de 3,13 mg del compuesto activo. El grupo de control se constituyó con ratones a los que se administró la misma cantidad de vaselina en crema. Se observó cada día la gravedad de la inflamación cutánea (eritema, descamación y engrosamiento). Se registró a diario el peso corporal. En la necropsia y en los días indicados, se midieron las orejas y los grosores de la piel del dorso usando un micrómetro (Mitutoyo). Se recogieron muestras de la piel del dorso y las orejas para histología y expresión génica. Se midió el peso del bazo y el timo.

18.4 - Diseño del estudio

Se dividieron los ratones en grupos iguales (n=10) de manera aleatoria. Al grupo de IMQ se administró una dosis tópica diaria de 62,5 mg de imiquimod crema sobre el dorso rasurado y la oreja durante 5 días consecutivos (D0- D4), que se traduce en una dosis diaria de 3,13 mg del compuesto activo. Se constituyó el grupo de control con ratones de control a los que se administró la misma cantidad de vaselina. Se formularon anticuerpos en PBS, se ensayaron a 10 mg/kg (200 ug/ratón) y se les administró i. p., 3 días antes y en el comienzo del experimento (D0),

5

10

15

20

25

30

35

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45

50

por lo tanto, se usaron 6 grupos de tratamiento diferentes:

• Control (vaselina)

• IMQ (Aldara crema al 5 %)

• IMQ + MOR03207_h/m 10 mg/kg i. p. (Ab de control negativo)

• IMQ + MOR12743_h/m 10 mg/kg i. p.

• IL17A/F antirratón 10 mg/kg i. p.

• IL23p40 antirratón 10 mg/kg i. p.

18.5 Resultados

Se detectó expresión de la proteína IL17C usando anticuerpos MOR12743 biotinilados e IHC. Se expresó IL17C en los mastocitos de la dermis tanto en grupos de control como en grupos tratados con IMQ (datos no mostrados). Como respuesta a IMQ, la expresión de IL17C aumentó en queratinocitos de la epidermis de D2 a D4 - con la mayor expresión observada en D3- así como en algunas células inflamatorias más pequeñas de la dermis y el estrato. MOR03207 (control de isotipo) no presentó coloración independientemente de las condiciones.

Esta observación estaba en consonancia con la expresión génica de IL17C. Los niveles basales no fueron detectables para IL17A e IL17F y bajos para IL17C e IL23p19. IL17A, IL17F aumentaron lo máximo por IMQ en la piel del dorso después de 96 h mientras que IL23p19 e IL17c aumentaron más temprano con un máximo a las 48 h. IL17RA e IL17RE se expresaron bien con cambios de expresión muy moderados en respuesta a IMQ.

Se valoraron los efectos de la neutralización de anticuerpos relevantes para la ruta o específicos para IL17C en la psoriasis inducida por IMQ por una medición histológica de espesor epidérmico. Los anticuerpos de IL-17A e IL- 23p40 presentaron efectos preventivos parciales en consonancia con el conocimiento común en el campo. El efecto de los anticuerpos neutralizantes de MOR1243 fue significativo demostrándose así que la neutralización de IL17C puede prevenir de manera significativa el espesor epidérmico inducido por IMQ en la piel de oreja de ratón (figura 12).

Ejemplo 19 - Expresión de la IL17C y función en queratinocitos epidérmicos humanos primarios

Para explorar más la función de IL17C en la psoriasis, nos centramos en la expresión de IL17C y la función en queratinocitos epidémicos humanos primarios.

19.1 Cultivos de queratinocitos epidérmicos humanos normales adultos (NHEK-Ad)

Se obtuvieron queratinocitos epidémicos humanos normales primarios criopreservados de adulto de Lonza y se cultivaron en medio de cultivo gold para queratinocitos (KGM-Gold™) que se preparó enriqueciendo el medio basal gold para queratinocitos (KBM-Gold™) con varios SingleQuots™ de suplementos de factor de crecimiento incluyendo extracto de pituitaria bovina, hidrocortisona, hEGF, epinefrina, transferrina, insulina y GA-1000 (medios y suplementos todos de Lonza). Las células que se extendieron durante 2 pases más se sembraron en placas de 96 pozos (25 000 c/pozo) en KGM-Gold™. Después de cultivo durante la noche, se retiró el medio y se cambió a KGM- Gold™ sin hidrocortisona previamente a la adición de varios activadores de citocinas. Se extrajo ARN total en varios instantes de tiempo y se determinó la expresión de IL-17RE, IL17C y p-defensina-2 (DEF4B) por RT-PCR cuantitativa. El sobrenadante celular recogido se mantuvo a -20 °C hasta que se analizó en cuanto a los niveles de p-defensina-2 (hBD2) segregada usando ELISA. La IL17C humana recombinante era de Novus Biologicals. La IL-1p y el TNFa recombinantes humanos fueron de PeproTech. La IL-17A y la IL-22 recombinantes humanas fueron de R&D Systems. Los siguientes agonistas de receptor tipo Toll (TLR, por sus siglas en inglés) fueron adquiridos en InvivoGen: flagelina (FLA) purificada de S. typhimurium (agonista de TLR5), guardiquimod (agonista de TLR7), CL097 (agonista de TLR7/8) y oligonucleótido CpG ODN 2611 (agonista de TLR9). El lipopolisacárido agonista de TLR4 (LPS, de serotipo 026:B6 E. Coli) se obtuvo de Sigma.

19.2 RT-PCR cuantitativa

Se extrajo ARN total de células usando el miniestuche RNeasy (Qiagen) y se sometió a transcripción inversa usando reactivos de transcripción inversa Taqman® (Applied Biosystems). Se prepararon reacciones PCR de veinticinco pl usando mezclas patrón de PCR universales Taqman®/No AmpErase® UnG y se prediseñaron conjuntos de cebador de expresión génica/sonda de acuerdo con las necesidades de la prueba (todos Applied Biosystems). Se llevó a cabo qPCR en el ABI Prism® 7000 (Applied Biosystems). Se normalizó la expresión génica para el gen constitutivo GAPDH y se expresó como valores ACt, con ACt = Ctgen-Ct(GAPDH) o se expresó como nivel de ARNm relativo de expresión específica de genes cuando se obtiene usando el método 2-ACt.

19.3 ELISA hBD2

5

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50

55

Se desarrolló el siguiente protocolo y se válido para medir los niveles de hBD2 usando captura y detección de anticuerpos obtenidos de PeproTech (cat. núm. 900-K172). Se recubrieron placas blancas de 384 pozos de Lumitrac 600 (Greiner) con 40 pL de solución de anticuerpos de captura anti-hBD2 (0,5 pg/mL en PBS). Después de incubación durante la noche a 4 °C, se lavaron las placas una vez con PBST (PBS + Tween-20 al 0,05 % (Sigma)) y una vez con PBS y se bloquearon por una incubación de 4 h a temperatura ambiente con 100 uL/pozo de tampón de bloqueo (PBS + BSA al 1 % + sacarosa al 1% + NaN3 al 0,05 %). Se retiró tampón de bloqueo invirtiendo la placa y golpeándola sobre un papel absorbente. Se lavó la placa con 100 pL de PBST y 100 pL de PBS y se añadieron 35 uL de patrón o muestra de hBD2. Después de incubación durante la noche a 4 °C, se lavaron las placas dos veces con PBST y una vez con PBS. Con posterioridad, se añadieron 35 uL de solución de anticuerpo de detección anti- hBD2 biotinilado (0,1 pg/mL en PBS conteniendo BSA al 1%). Después de una incubación de 2 h a temperatura ambiente, se lavaron las placas como se describió anteriormente y se incubaron con 35 pL de conjugado de estreptavidina-HRP (Invitrogen, cat. núm. SNN2004) diluido 1/2000 en PBS + BSA al 1%. Después de 45 minutos, se lavaron las placas como se describió anteriormente y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente con 50 pL/pozo de sustrato BM Chem para ELISA (Roche). La lectura se llevó a cabo en el luminómetro Luminoscan Ascent (Labsystems) con un tiempo de integración de 100 ms.

19.4 Resultados

Si bien la IL-17RA se expresa de manera generalizada, la expresión de IL-17RE es más restringida y su expresión es particularmente alta en células de origen epitelial. Se analizó la expresión de ARNm de IL-17RE en queratinocitos epidémicos humanos primarios y se observó una alta expresión de IL-17RE en estas células con ACT (IL-17RE, GAPDH) ~ 4-6. La expresión de la IL-17RE no fue modulada por ninguno de los activadores inflamatorios ensayados (datos no mostrados).

Se extendieron además estos hallazgos iniciales y también se analizó la regulación de la expresión de la IL17C en queratinocitos por IL-17A, una citocina producida por células Th17 y que se sabe que desempeñan una función importante en la psoriasis. Los datos obtenidos confirman la inducción del ARNm de la IL17C por IL-1 y por flagelina, un agonista de TLR5 (figuras 13A y 13B). El ligando de otros TLR (TLR4, TLR7, TLR8 o TLr9) no indujo significativamente ARNm de IL17C. El análisis cinético mostró que la inducción de ARNm de IL17C por IL-1 o flagelina fue rápido y pasajero. Curiosamente, si bien la IL-17A no indujo significativamente ARNm de IL17C por sí misma, reforzó de manera sinérgica y mantuvo la expresión de IL17C con el tiempo cuando se combinó con el TNF o la IL-1 de citocinas proinflamatorias (figura 13A).

Como los queratinocitos expresan altos niveles de IL-17RE, se examinó además la función de la IL17C en estas células. Aunque los queratinocitos primarios humanos no respondieron a la IL17C sola, la IL17C estimuló la expresión de p-defensina-2 en sinergia con otros genes proinflamatorios ensayados, es decir, IL-1p, TNFa e IL-22. Se observó la estimulación sinérgica de expresión de ARNm de p-defensina-2 tanto a nivel de ARNm como de proteína.

19.5 Resumen

En general, los datos indican que la IL17C producida por citocinas proinflamatorias en queratinocitos podía desempeñar una función en un bucle de realimentación positiva que multiplica y mantiene la expresión génica inflamatoria en queratinocitos contribuyendo a inflamación de la piel por psoriasis.

Ejemplo 20: Ensayo de competición cruzada basado en ELISA

La competición cruzada de un anticuerpo anti-IL17C u otro agente de unión de IL17C puede detectarse usando un ensayo ELISA de acuerdo con el siguiente procedimiento estándar. Asimismo, puede detectarse la competición cruzada de un anticuerpo anti-IL17C u otro agente de unión de IL17C.

El principio general del ensayo ELISA implica el recubrimiento de un anticuerpo anti-IL17C en los pozos de una placa ELISA. Después se añade una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-IL17C de competición cruzada potencialmente, en solución (es decir, no ligado a la placa ELISA). Con posterioridad, se añade después una cantidad limitada de IL17C-Fc a los pozos.

El anticuerpo que se recubre en los pozos y el anticuerpo en solución competirán por la unión del número limitado de moléculas de IL17C. Se lava después la placa para retirar las moléculas de IL17C que no se han ligado al anticuerpo recubierto y retirar también el segundo anticuerpo en fase disolución, así como cualquier complejo formado entre el segundo anticuerpo en fase disolución e IL17C. La cantidad de IL17C ligada se mide después usando un reactivo de detección de IL17c apropiado. Por lo tanto, puede fusionarse IL17C con una etiqueta, por ejemplo, Fc, Flag, etc., que puede detectarse mediante un anticuerpo específico de la etiqueta apropiado.

Un anticuerpo en disolución que interviene en competición cruzada con el anticuerpo recubierto podrá producir una disminución en el número de moléculas IL17C que puede unir el anticuerpo recubierto respecto al número de moléculas de IL17C que puede unir el anticuerpo recubierto en ausencia del segundo anticuerpo en fase disolución.

Este ensayo se describe con más detalle más a continuación para dos anticuerpos denominados Ab-X y Ab-Y. En el

caso en que se elija que Ab-X sea el anticuerpo inmovilizado, se recubre en los pozos de la placa ELISA, después de lo cual se bloquean las placas con una solución bloqueante adecuada para minimizar la unión no especifica de reactivos que se añaden con posterioridad. Se añade después una cantidad en exceso de Ab-Y a la placa ELISA de manera que los moles de sitios de unión de Ab-Y IL17C por pozo sean al menos 10 veces mayores que los moles de 5 sitios de unión de Ab-X IL17C que se usan, por pozo, durante el recubrimiento de la placa ELISA. Se añade después IL17C de manera que los moles de IL17C añadidos por pozo fueran al menos 25 veces menores que los moles de sitios de unión de Ab-X IL17C que se usan para recubrir cada pozo. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava la placa ELISA y se añade un reactivo de detección de IL17C para medir la cantidad de moléculas de IL17C ligadas de manera específica por el anticuerpo anti-IL17C recubierto (en este caso Ab-X). La señal de 10 fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en los pozos con el anticuerpo recubierto (en este caso Ab- X), segundo anticuerpo en fase solución (en este caso Ab-Y), solo tampón (es decir, no IL17C) y reactivos de detección de IL17C. La señal de control positiva para el ensayo se define como la señal obtenida en los pozos con el anticuerpo recubierto (en este caso Ab-X), segundo anticuerpo en fase solución, solo tampón (es decir, no segundo anticuerpo en fase solución), reactivos de detección de IL17c. Se requiere que el ensayo ELISA se realice de tal 15 manera que presente la señal de control positiva al menos 6 veces la señal de fondo.

Para evitar artefactos (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-X y Ab-Y para IL17C) dando como resultado la elección de qué anticuerpo usar como anticuerpo de recubrimiento y cual usar como el segundo anticuerpo (competidor), se requiere que el ensayo de bloqueo cruzado se realice en dos formatos: 1) el formato 1 es donde Ab-X es el anticuerpo que se recubre en la placa ELISA y Ab-Y es el anticuerpo competidor que está en 20 solución y el 2) formato 2 es donde Ab-Y es el anticuerpo que se recubre en la placa ELISA y Ab-X es el anticuerpo competidor que está en solución.

5

10

15

20

25

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> MorphoSys AG Galapagos NV

<120> Antagonistas de IL17C para el tratamiento de trastornos inflamatorios

<130> MS169/EP Prov

<160> 186

<170> BiSSAP 1.2

<210> 1

< 211> 10

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR1 <400> 1

Gly Gly Thr Phe Ser lie Tyr Ala lie Ser 15 10

<210> 2

< 211> 20

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR2 <400> 2

Trp Met Gly Gly lie lie Pro lie Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala Gln 15 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 3

< 211> 10

< 212> PRT

< 213> construcción sintética

5

10

15

20

25

< 223> HCDR3 <400>3

Asp Ala Thr His Ser Tyr Tyr His Asp Tyr 15 10

<210>4

< 211> 14

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 4

Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Ser Tyr Glu Thr Val Ser 15 10

<210> 5

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2 <400> 5

Val Met lie Tyr Glu Val Ser Asp Arg Pro Ser 15 10

<210>6

< 211>9

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3

<400>6

Gly Ser Phe Ala His Trp Gly Ser Trp 1 5

<210>7

5 <211> 112

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL

10 <400> 7

15

Asp 1

lie Ala Leu Thr 5

Ser

lie Thr lie 20

Ser

Glu

Thr Val 35 Ser Trp

Met

lie 50 Tyr Glu Val

Ser 65

Gly Ser Lys Ser

Gln

Ala Glu Asp Glu 85

Gly

Ser Trp Val 100 Phe

Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly 10

Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp 25

Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys 40

Ser Asp Arg Pro Ser Gly Val 55 60

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr 70 75

Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser 90

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 105

Ser

Pro Gly 15 Gln

Val

Gly 30 Ser Tyr

Ala 45

Pro Lys Val

Ser

Asn Arg Phe

lie

Ser Gly Leu 80

Phe

Ala His 95 Trp

Val

Leu 110 Gly Gln

<210>8

< 211> 119

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser lie Tyr 20 25 30

5

10

15

20

Ala

lie Ser 35

Gly

Gly 50 lie

Gln 65

Gly Arg

Met

Glu Leu

Ala

Arg Asp

Thr

Leu Val 115

Trp

Val Arg

lie

Pro

lie

Val

Thr lie

Ser

Ser

70 Leu

Ala

85 Thr His

100 Thr

Val Ser

Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 40 45

Leu Gly lie Ala Asn Tyr Ala 55 60

Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser 75

Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 90

Ser Tyr Tyr His Asp Tyr Trp 105

Ser

Glu

Trp Met

Gln

Lys Phe

Thr

Ala Tyr 80

Tyr

Tyr 95 Cys

Gly 110

Gln Gly

<210>9

< 211> 336

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..336

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400>9

gatatcgcgc

agctgcaccg

catccgggca

agcaaccgtt

caagcggaag

tttggcggcg

tgacccagcc ggcgagcgtg gcaccagcag cgatgtgggc aggcgccgaa agttatgatc ttagcggatc caaaagcggc acgaagcgga ttattactge gcacgaagtt aaccgttctt

agcggtagcc cgggccagag tcttacgaaa ctgtgtcttg tacgaagttt ctgaccgtcc aacaccgcga gcctgaccat ggttctttcg ctcattgggg ggccag

cattaccatt

60

gtaccagcag

120

gagcggcgtg

180

tagcggcctg

240

ttcttgggtg

300

336

<210> 10

< 211> 357

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..357

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado"

/nota="VH (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 10

5

10

15

caggtgcaat

tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag

catccggagg gacgttttct atctacgcta tctcttgggt gcgccaggcc 120

ccgggccagg

gcctcgagtg gatgggcggt atcatcccga tcctgggcat cgcgaactac 180

gcccagaaat

ttcagggccg ggtgaccatt accgccgatg aaagcaccag caccgcctat 240

atggaactga

gcagcctgcg cagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgacgct 300

actcattctt

actaccatga ttactggggc caaggcaccc tggtgactgt tagctca 357

<210> 11 < 211> 10

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR1 <400> 11

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala lie Ser

15 10

<210> 12

< 211> 20

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR2 <400> 12

Trp Met Gly Met lie Met Pro Glu Val Gly Met Ala Asp Tyr Ala Gln 15 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 13 < 211> 19

5

10

15

20

25

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 13

Asp Phe lie Ala Val Gly Ser Leu Glu lie Trp His Tyr Tyr Tyr Gly 15 10 15

Leu Asp Val

<210> 14

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 14

Ser Gly Asp Asn lie Gly Glu His Tyr Ala Ser 15 10

<210> 15

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2 <400> 15

Leu Val lie Ser Tyr Asp Asn Glu Arg Pro Ser 15 10

<210> 16

< 211> 10

5

10

15

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 16

Gln Ser Trp Thr Ser Gln Lys Pro Asp Tyr 15 10

<210> 17

<211> 110

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 17

Asp 1

lie Glu Leu Thr 5 Gln Pro

Thr

Ala Ser lie 20 Thr Cys Ser

Ser

Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro

Tyr

Asp 50 Asn Glu Arg Pro Ser 55

Asn 65

Ser Gly Asn Thr Ala 70 Thr

Asp

Glu Ala Asp Tyr 85 Tyr Cys

Tyr

Val Phe Gly 100 Gly Gly Thr

Pro Ser Val Ser Val 10

Gly Asp Asn lie Gly 25

Gly Gln Ala Pro Val 40

Gly lie Pro Glu Arg 60

Leu Thr lie Ser Gly 75

Gln Ser Trp Thr Ser 90

Lys Leu Thr Val Leu 105

Ser

Pro Gly 15 Gln

Glu

His 30 Tyr Ala

Leu 45

Val lie Ser

Phe

Ser Gly Ser

Thr

Gln Ala Glu 80

Gln Gly

Lys Gln 110 Pro 95 Asp

<210> 18 <211> 128 < 212> PRT

< 213> construcción sintética

<220>

< 223> VH <400> 18

5

10

15

20

Gln

1

Ser

Ala

Gly

Gln

65

Met

Ala

Tyr

Val

Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

5 10 15

Val

Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

lie

Ser Trp val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Met

lie Met Pro Glu Val Gly Met Ala Asp Tyr Ala Gln Lys Phe

50

55 60

Gly

Arg Val Thr lie Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

70 75 80

Glu

Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg

Asp Phe lie Ala Val Gly Ser Leu Glu lie Trp His Tyr Tyr

100 105 110

Gly

Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 19

< 211> 330

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..330

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial"

<400> 19

gatatcgaac

acctgtagcg

caggcgccgg

tttagcggat

gacgaagcgg

ggcggcacga

tgacccagcc

gccgagcgtg agcgtgagcc cgggccagac cgcgagcatt 60

gcgataacat

eggtgaacat tacgcttctt ggtaccagca gaaaccgggc 120

tgctggtgat

ctcttacgac aacgaacgtc cgagcggcat cccggaacgt 180

ccaacagcgg

caacaccgcg accatgacca ttagcggcac ccaggcggaa 240

attattactg

ccagtcttgg acttctcaga aaccggacta cgtgtttggc 300

agttaaccgt

tcttggccag 330

<210> 20

< 211> 384

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

5

10

15

< 222> 1..384

<223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VH (ADN)”

/organismo="Secuencia artificial"

<400> 20

caggtgcaat

agctgcaaag

ccgggccagg

gcccagaaat

atggaactga

atcgctgttg

ggcaccctgg

tggtgcagag

cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtt 60

catccggagg

gacgtttagc agctatgcga ttagctgggt gcgccaggcc 120

gcctcgagtg

gatgggcatg atcatgccgg aagttggcat ggctgactac 180

ttcagggccg

ggtgaccatt accgccgatg aaagcaccag caccgcctat 240

gcagcctgcg

cagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgacttc 300

gttctctgga

aatctggcat tactactacg gtctggatgt ttggggccaa 360

tgactgttag

ctca 384

<210> 21 < 211> 10 <212> PRT

< 213> construcción sintética

<220>

< 223> HCDR1 <400> 21

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Gly lie Ser 15 10

<210> 22

< 211> 20

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR2 <400> 22

5

10

15

20

25

Trp Met Gly Arg lie lie Pro lie Phe Gly Thr Ala Tyr Tyr Ala Gln 15 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 23

< 211> 19

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 23

Asp Met Arg Tyr His Asp Tyr Trp Pro Tyr Tyr Tyr Gly Ser Asp Gln 15 10 15

Phe Asp Val

<210> 24

< 211> 13

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 24

Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser Asp lie Val Ser 15 10

<210> 25

< 211> 11 <212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2 <400> 25

Leu Leu lie Tyr Tyr Asn Asn Leu Arg Pro Ser 15 10

<210> 26

< 211> 10

5 < 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 26

10

Gln Ser Trp Asp Trp Ala Ser Leu Ala Met 15 10

<210> 27

<211> 112

< 212> PRT

15 < 213> construcción sintética

<220>

< 223> VL <400> 27

Asp 1

He Val Leu Thr 5

Arg

Val Thr He 20 Ser

lie

Val Ser 35 Trp Tyr

lie

Tyr 50 Tyr Asn Asn

Gly 65

Ser Lys Ser Gly

Ala

Glu Asp Glu Ala 85

Leu

Ala Met Val 100 Phe

Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly 10 15

Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn lie Gly Ser 25 30

Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu 40 45

Leu Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 55 60

Thr Ser Ala Ser Leu Ala lie Thr Gly Leu 70 75

Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Trp Ala 90 95

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110

Gln

Asp

Leu

Ser

Gln

80

Ser

Gln

<210> 28 <211> 128 < 212> PRT

< 223> VH <400> 28

5

10

15

20

Gln 1

Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly Ala Glu 10 Val Lys Lys Pro Gly 15 Ser

Ser

Val Lys Val 20 Ser Cys Lys Ala Ser 25 Gly Gly Thr Phe Ser 30 Ser Tyr

Gly

He Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Gln Gly Leu 45 Glu Trp Met

Gly

Arg 50 lie lie Pro lie Phe 55 Gly Thr Ala Tyr Tyr 60 Ala Gln Lys Phe

Gln 65

Gly Arg Val Thr lie 70 Thr Ala Asp Glu Ser 75 Thr Ser Thr Ala Tyr 80

Met

Glu Leu Ser Ser 85 Leu Arg Ser Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

Ala

Arg Asp Met 100 Arg Tyr His Asp Tyr 105 Trp Pro Tyr Tyr Tyr 110 Gly Ser

Asp

Gln Phe 115 Asp Val Trp Gly Gln 120 Gly Thr Leu Val Thr 125 Val Ser Ser

<210> 29

< 211> 336

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..336

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial"

<400> 29

gatatcgtgc

agctgtagcg

ccgggcacgg

gatcgcttta

gcagaagacg

tttggcggcg

tgacccagcc

gccgagcgtg agcggtgcac cgggccagcg cgtgaccatt 60

gcagcagcag

caacattggt tctgacatcg tgtcttggta ccagcagctg 120

cgccgaaact

gctgatctac tacaacaacc tgcgcccgag cggcgtgccg 180

gcggatccaa

aagcggcacc agcgccagcc tggcgattac cggcctgcaa 240

aagcggatta

ttactgccag tcttgggact gggcttctct ggctatggtg 300

gcacgaagtt

aaccgttctt ggccag 336

<210> 30

< 211> 384

< 212> ADN

< 213> construcción sintética

5

10

15

20

25

< 221> fuente

< 222> 1..384

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado"

/nota="VH (ADN)”

/organismo="Secuencia artificial"

<400> 30

caggtgcaat tggtgcagag cggtgccgaa gtgaaaaaac cgggcagcag cgtgaaagtt 60

agctgcaaag catccggagg gacgttttct tcttacggta tctcttgggt gcgccaggcc 120

cagggccagg gcctcgagtg gatgggccgt atcatcccga tcttcggcac tgcgtactac 180

gcccagaaat ttcagggccg ggtgaccatt accgccgatg aaagcaccag caccgcctat 240

atggaactga gcagcctgcg cagcgaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtgacatg 300

cgttaccatg actactggcc gtactactac ggttctgacc agttcgatgt ttggggccaa 360

ggcaccctgg tgactgttag ctca 384

<210> 31

< 211> 10

<212> PRT

< 213> construcción sintética

<220>

< 223> HCDR1 <400> 31

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn Phe lie His

1 5 10

<210> 32 < 211> 20

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR2

5

10

15

20

25

<400> 32

Trp Met Gly Trp lie Ser Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln 15 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 33 < 211> 16 <212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 33

Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr Asn Gly Met Asp lie 15 10 15

<210> 34

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<220>

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Asp 1

lie Glu Leu Thr 5

Thr

Ala Ser lie 20

Thr

Ser

Trp Tyr 35 Gln Gln

Asp

Asp 50 Thr Lys Arg

Asn 65

Ser Gly Asn Thr

Asp

Glu Ala Asp Tyr 85

Val

Phe Gly Gly 100 Gly

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly 10 15

Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Glu Tyr 25 30

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Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly 55 60

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Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 105

Gln

Val

Tyr

Ser

Glu

80

Glu

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< 223> VH <400> 38

5

10

15

20

Gln

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1

5 10 15

Ser

Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Asn

20 25 30

Phe

He His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly

Trp lie Ser Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln

Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser Thr Ala Tyr

65

70 75 80

Met

Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

Arg Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr Asn Gly Met

100 105 110

Asp

lie Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

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ggcacgaagt

tgacccagcc

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375

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10

15

20

25

<400> 42

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 43

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 44

Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Glu Tyr Val Ser 15 10

<210> 45

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2 <400> 45

Leu Val lie Tyr Asp Asp Thr Lys Arg Pro Ser 15 10

<210> 46

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5 < 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 46

10

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<211> 109

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<220>

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Pro

Gly 15 Gln

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Tyr Val

Val

lie Tyr

Ser

Gly

Ser

Gln

Ala Glu 80

Ser

Ser 95 Gln

<210> 48 <211> 125 < 212> PRT

< 223> VH <400> 48

5

10

15

20

Gln 1

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Ser

Val Lys Val 20 Ser Cys Lys

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lie His 35 Trp Val Arg Gln

Gly

Trp 50 He Ser Pro Tyr Asn 55

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Gly Arg Val Thr Met 70 Thr

Met

Glu Leu Ser Arg 85 Leu Arg

Ala

Arg Glu Ser 100 Val Tyr Tyr

Asp

lie Trp 115 Gly Gln Gly Thr

Gly Ala Glu Val Lys Lys 10

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Ala Pro Gly Gln Gly Leu 40 45

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Arg Asp Thr Ser lie Ser

75

Ser Glu Asp Thr Ala Val 90

Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr 105

Leu Val Thr Val Ser Ser 120 125

Pro

Gly 15 Ala

Thr 30

Ser Asn

Glu

Trp Met

Gln

Lys Phe

Thr

Ala Tyr 80

Tyr

Tyr 95 Cys

Asn 110

Gly Met

<210> 49

< 211> 327

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15

< 212> ADN

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gtgactgtta

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taccttcact tctaacttca tccattgggt gcgccaggcc 120

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< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

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20

25

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Lys Phe Gln Gly 20

<210> 53 < 211> 16 <212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 53

Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr Asn Gly Met Asp lie 15 10 15

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 54

Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Glu Tyr Val Ser 15 10

<210> 55

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2 <400> 55

5

10

15

20

25

Leu Val lie Tyr Asp Asp Thr Lys Arg Pro Ser 15 10

<210> 56

< 211>9

<212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 56

Ser Ala Trp Ala Thr Trp Ser Val Ala 1 5

<210> 57

<211> 109

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 57

Asp 1

lie Glu Leu Thr 5

Thr

Ala Ser lie 20

Thr

Ser

Trp Tyr 35 Gln Gln

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro 10

Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Glu Glu 25 30

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Ser

Glu

80

Ala

<210> 58

< 211> 125

< 212> PRT

<223> VH <400> 58

5

10

15

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 15 10

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 20 25

Phe lie His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 35 40 45

Gly Trp lie Ser Pro Tyr Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser lie Ser 65 70 75

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Ala Arg Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr 100 105

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Pro

Gly 15 Ala

Thr 30

Ser Asn

Glu

Trp Met

Gln

Lys Phe

Thr

Ala Tyr 80

Tyr

Tyr 95 Cys

Asn 110

Gly Met

<210> 59

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10

15

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..375

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< 213> construcción sintética <220>

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atggaactga

gtttactacg

gtgactgtta

tggtgcagag

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gctca

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taccttcact

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tagcgaagat

cggttacaac

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tctaacttca

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ggtatggata

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caccgcgtat

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10

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< 211> 16

<212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 63

Glu Ser Val Tyr Tyr Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr Asn Gly Met Asp lie 15 10 15

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 64

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< 211> 11

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< 213> construcción sintética <220>

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<212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

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< 212> PRT

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< 223> VL

20 <400> 67

Asp 1

lie Glu Leu Thr 5

Thr

Ala Ser lie 20

Thr

Ser

Trp Tyr 35 Gln Gln

Asp

Asp 50 Thr Lys Arg

Asn 65

Ser Gly Asn Thr

Asp

Glu Ala Asp Tyr 85

Val

Phe Gly Gly 100 Gly

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser 10

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Pro

Gly 15 Gln

Glu 30

Tyr Val

Val

lie Tyr

Ser

Gly

Ser

Gln

Ala Glu 80

Ser

Asn 95 lie

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10

15

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 68

Gln 1

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Ser

Val Lys Val 20 Ser Cys Lys

Phe

lie His 35 Trp Val Arg Gln

Gly

Trp 50 He Ser Pro Tyr Asn 55

Gln 65

Gly Arg Val Thr Met 70 Thr

Met

Glu Leu Ser Arg 85 Leu Arg

Ala

Arg Glu Ser 100 Val Tyr Tyr

Asp

lie Trp 115 Gly Gln Gly Thr

Gly Ala Glu Val Lys Lys 10

Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 25

Ala Pro Gly Gln Gly Leu 40 45

Gly Asp Thr Asn Tyr Ala 60

Arg Asp Thr Ser lie Ser

75

Ser Glu Asp Thr Ala Val 90

Gly Ser Asp Tyr Gly Tyr 105

Leu Val Thr Val Ser Ser 120 125

Pro

Gly 15 Ala

Thr 30

Ser Asn

Glu

Trp Met

Gln

Lys Phe

Thr

Ala Tyr 80

Tyr

Tyr 95 Cys

Asn 110

Gly Met

<210> 69

< 211> 327

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..327

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10

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR1 <400> 71

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<210> 72

< 211> 21

caggtgcaat

agctgcaaag

cagggccagg

gcgcagaaat

atggaactga

gtttactacg

gtgactgtta

tggtgcagag

cgtccggata

gcctcgagtg

ttcagggccg

gccgtctgcg

gttctgacta

gctca

cggtgcggaa

taccttcact

gatgggctgg

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tagcgaagat

cggttacaac

gtgaaaaaac

tctaacttca

atctctccgt

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ggtatggata

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cgtgaaagtt

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cacgaactac

caccgcgtat

gcgtgaatct

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15

20

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 73

Glu Gly lie Val Gly Gly Trp Phe Ala Tyr 15 10

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 74

Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser Lys lie Ala His 15 10

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< 211> 11

< 212> PRT

10

15

20

<220>

< 223> LCDR2 <400> 75

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<212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 76

Gln Ser Trp Asp Tyr Leu Ser Trp Ser Val 15 10

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< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 77

Asp 1

lie Glu Leu Thr 5

Thr

Ala Ser lie 20

Thr

His

Trp Tyr 35 Gln Gln

Asp

Asp 50 Asn Glu Arg

Asn 65

Ser Gly Asn Thr

Asp

Glu Ala Asp Tyr 85

Val

Val

Phe Gly 100 Gly

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser 10

Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Ser

25

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 40 45

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Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr 70 75

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Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105

Pro

Gly 15 Gln

Lys 30

lie Ala

Val

lie Tyr

Ser

Gly

Ser

Gln

Ala Glu 80

Ser Gln 110

Trp 95 Ser

< 211> 330

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 78

Gly Ala Thr Ala Thr Cys Gly Ala Ala Cys Thr Gly Ala Cys Cys Cys 15 10 15

Ala

Gly Cys Cys 20 Gly Cys Cys Gly

Cys

Gly Thr 35 Gly Ala Gly Cys Cys 40

Ala

Cys 50 Cys Gly Cys Gly Ala 55 Gly

Gly 65

Thr Ala Gly Cys Gly 70 Gly Cys

Gly

Gly

Gly

Thr Thr 85 Cys Thr Ala

Cys

Ala Thr Thr 100 Gly Gly Thr Ala

Ala

Ala

Cys 115 Cys Gly Gly Gly Cys 120

Gly

Gly 130 Thr Gly Cys Thr Gly 135

Gly

Gly 145

Ala Cys Gly Ala Cys 150 Ala Ala

Cys

Gly Ala Gly Cys 165 Gly Gly

Cys

Ala

Cys Gly Thr 180 Thr Thr Thr

Ala

Ala

Ala

Cys 195 Ala Gly Cys Gly Gly 200

Cys

Gly 210 Ala Cys Cys Cys Thr 215 Gly

Cys 225

Gly Gly Cys Ala Cys 230 Cys Cys

Gly

Ala Cys Gly Ala 245 Ala Gly Cys

Ala

Cys Thr Gly 260 Cys Cys Ala Gly

Cys

Thr Ala 275 Cys Cys Thr Gly Thr 280

Gly

Thr 290 Thr Gly Thr Gly Thr 295 Thr

Gly 305

Cys Ala Cys Gly Ala 310 Ala Gly

Thr

Cys Thr Thr Gly 325 Gly Cys Cys

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< 211> 330

< 212> ADN

< 213> construcción sintética

Ala 25

Gly Cys Gly Thr Gly 30 Ala Gly

Cys

Gly Gly Gly Cys 45 Cys Ala Gly

Cys

Ala Thr Thr 60 Ala Cys Cys Thr

Gly

Ala Thr 75 Ala Ala Ala Cys Thr 80

Ala

Ala 90 Ala Thr Cys Gly Cys 95 Thr

Cys 105

Cys Ala Gly Cys Ala 110 Gly Ala

Cys

Ala Gly Gly Cys 125 Gly

Cys

Cys

Thr

Gly Ala Thr 140 Cys Thr Ala Cys

Cys

Gly Ala 155 Ala Cys Gly Thr Cys 160

Ala

Thr 170 Cys Cys Cys Gly Gly 175

Ala

Gly 185

Cys Gly Gly Ala Thr 190 Cys Cys

Cys

Ala Ala Cys Ala 205 Cys Cys Gly

Ala

Cys Cys Ala 220 Thr Thr Ala Gly

Ala

Gly Gly 235 Cys Gly Gly Ala Ala 240

Gly

Gly 250 Ala Thr Thr Ala Thr 255 Thr

Thr 265

Cys Thr Thr Gly Gly 270 Gly Ala

Cys

Thr Thr Gly Gly 285 Thr Cys Thr

Thr

Gly Gly Cys 300 Gly Gly Cys Gly

Thr Ala

Thr Gly 330 Ala 315 Ala Cys Cys Gly Thr 320

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5

10

15

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Gly Asp Ser Val Ser Ser Ser Ser Ala Ala Trp Asn 15 10

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Trp Leu Gly Arg lie Glu Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 15 10 15

Val Ser Val Lys Ser 20 20

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< 212> PRT

< 213> construcción sintética

5

10

15

20

25

< 223> HCDR3 <400> 83

Glu Met Tyr Tyr Tyr Ser Gly Tyr Gly Val Phe Asp Val 15 10

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< 211> 11

<212> PRT

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< 223> LCDR1 <400> 84

Ser Gly Asp Ala Leu Gly Gly Glu Tyr Val His 15 10

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2 <400> 85

Leu Val He Tyr Asp Asp Asp Lys Arg Pro Ser 15 10

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< 211>9

< 212> PRT

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< 223> LCDR3

10

15

20

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 87

Asp lie Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly

15 10 15

Thr Ala Ser lie Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Gly Glu Tyr

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val lie

35 40 45

Asp Asp Asp Lys Arg Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr Gln Ala

65 70 75

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Phe Asp Thr Trp Thr Ser

Gln

Val

Tyr

Ser

Glu

80

Tyr

85 90

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln

100 105

95

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< 223> VH <400> 88

5

10

15

Gln 1

Val Gln Leu Gln 5 Gln Ser Gly

Thr

Leu Ser Leu 20 Thr Cys Ala lie

Ser

Ala Ala 35 Trp Asn Trp lie Arg 40

Trp

Leu 50 Gly Arg lie Glu Tyr 55 Arg

val 65

Ser Val Lys Ser Arg 70 lie Thr

Gln

Phe Ser Leu Gln 85 Leu Asn Ser

Tyr

Tyr

Cys Ala 100 Arg Glu Met

Tyr

Asp

Val Trp 115 Gly Gln Gly Thr Leu 120

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< 211> 327

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

Pro

Gly 10 Leu Val Lys Pro Ser 15 Gln

Ser 25

Gly Asp Ser Val Ser 30 Ser Ser

Gln

Ser Pro Ser Arg 45 Gly Leu Glu

Ser

Lys Trp Tyr 60 Asn Asp Tyr Ala

lie

Asn Pro 75 Asp Thr Ser Lys Asn 80

Val

Thr 90 Pro Glu Asp Thr Ala 95

Val

Tyr 105 Val

Tyr Thr Ser Val Gly Ser Tyr Ser 125 Gly 110 Val Phe

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< 222> 1..327

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acctgtagcg

caggcgccgg

tttagcggat

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ggcacgaagt

tgacccagcc

gccgagcgtg agcgtgagcc cgggccagac cgcgagcatt 60

gcgatgctct

gggtggtgaa tacgttcatt ggtaccagca gaaaccgggc 120

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ccaacagcgg

caacaccgcg accatgacca ttagcggcac ccaggcggaa 240

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ctcttctttc gacacttgga cttcttacgt gtttggcggc 300

taaccgttct

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aacgactatg

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cgtgaaatgt

gtgactgtta

tgcagcagag

cggtccgggc ctggtgaaac cgagccagac cctgagcctg 60

tttccggaga

tagcgtgagc tcctcttctg ctgcttggaa ctggattcgt 120

gccgtggcct

cgagtggctg ggccgtatcg aataccgtag caaatggtac 180

ccgtgagcgt

gaaaagccgc attaccatta acccggatac ttcgaaaaac 240

tgcaactgaa

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gctca

375

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Trp Val Ser Val lie Ser Tyr Asp Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp 15 10 15

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20

25

< 212> PRT

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< 223> HCDR3 <400> 93

Asp Pro Gly Val Trp Trp Leu Ser Tyr Leu Asp Tyr 15 10

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Arg Ala Ser Gln Asp lie lie Ser Tyr Leu Ala 15 10

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10

15

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Gln Gln Tyr Met lie Ala Pro Pro Asn

1 5

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< 213> construcción sintética <220>

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Asp 1

lie Gln Met Thr 5 Gln Ser Pro

Asp

Arg Val Thr 20 He Thr Cys Arg

Leu

Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Lys Pro 40

Tyr

Gly 50 Ala Ser Asn Leu Gln 55 Gly

Ser 65

Gly Ser Gly Thr Asp 70 Phe Thr

Glu

Asp Phe Ala Val 85 Tyr Tyr Cys

Asn

Thr Phe Gly 100 Gln Gly Thr Lys

Ser

Ser

Leu Ser Ala Ser Val Gly

10 15

Ala

Ser Gln Asp lie lie Ser Tyr

25

30

Gly

Lys Ala Pro Lys Leu Leu He

45

Gly Val

Pro Ser Arg Phe Ser Gly

60

Leu

Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro

75 80

Gln

Gln

Tyr Met lie Ala Pro Pro

90 95

Val

Glu lie Lys Arg Thr

105

110

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5

10

15

Glu 1

Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly

Ser

Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala

Ala

Met Thr 35 Trp Val Arg Gln Ala 40

Ser

Val 50 lie Ser Tyr Asp Gly 55

Ser

Lys 65

Gly Arg Phe Thr lie 70 Ser Arg

Leu

Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala

Ala

Arg Asp Pro 100 Gly Val Trp Trp

Gln

Gly Thr 115 Leu Val Thr Val Ser 120

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< 212> ADN

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< 221> fuente

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Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 25 30

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 60

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 75 80

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 90 95

Leu Ser Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly 105 110

Ser

gatatccaga

attacctgca

ggcaaagcgc

cgctttagcg

gaagactttg

cagggcacga

tgacccagag

cccgagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga tcgcgtgacc 60

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aagttgaaat

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5

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60

120

180

240

300

360

363

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<220>

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Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn 15 10

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10

15

20

25

Trp Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Ser Thr Trp Ser Asn Asp Tyr Ala 15 10 15

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Glu Met Asp Ser Leu Thr Arg Ser Ala Ser Ser lie Ala Phe Asp Tyr 15 10 15

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10

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< 212> PRT

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<220>

< 223> VL <400> 107

Asp 1

lie Glu Leu Thr 5

Thr

Ala Ser lie 20

Thr

HiS

Trp Tyr 35 Gln Gln

Asp

Asp 50 Thr Glu Arg

Asn 65

Ser Gly Asn Thr

Asp

Glu Ala Asp Tyr 85

Phe

Gly Gly Gly 100 Thr

Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser 10

Cys Ser Gly Asp Asn Leu Arg Glu 25

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu 40 45

Pro Ser Gly lie Pro Glu Arg Phe 55 60

Ala Thr Leu Thr lie Ser Gly Thr 70 75

Tyr Cys Ala Thr Arg Asp Trp Ser 90

Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 105

Pro

Gly 15 Gln

His 30

Tyr Val

Val

lie Tyr

Ser

Gly

Ser

Gln

Ala Glu 80

Asn

Val 95 Val

<210> 108 <211> 128 < 212> PRT

< 213> construcción sintética

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5

10

15

20

Gln 1

Val Gln Leu Gln 5 Gln Ser Gly Pro

Thr

Leu Ser Leu 20 Thr Cys Ala lie Ser 25

Ser

Ala Ala 35 Trp Asn Trp lie Arg 40 Gln

Trp

Leu Gly Lys Thr Tyr Tyr Arg Ser

Gly 10

Leu Val Lys Pro Ser 15 Gln

Gly

Asp Ser Val Ser 30 Ser Asn

Ser

Pro Ser Arg 45 Gly Leu Glu

Thr

Trp Ser Asn Asp Tyr Ala

50 55 60

Glu 65

Ser Val Lys Ser Arg 70 lie Thr lie Asn Pro 75 Asp Thr Ser Lys

Gln

Phe Ser Leu Gln 85 Leu Asn Ser Val Thr 90 Pro Glu Asp Thr Ala 95

Tyr

Tyr

Cys Ala 100 Arg Glu Met Asp Ser 105 Leu Thr Arg Ser Ala 110 Ser

He

Ala Phe 115 Asp Tyr Trp Gly Gln 120 Gly Thr Leu Val Thr 125 Val Ser

Asn

80

Val

Ser

Ser

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< 211> 324

< 212> ADN

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< 221> fuente

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gatatcgaac

acctgtagcg

caggcgccgg

tttagcggat

gacgaagcgg

acgaagttaa

tgacccagcc gccgagcgtg agcgtgagcc gcgataacct gcgtgaacat tacgttcatt tgctggtgat ctacgacgac actgaacgtc ccaacagcgg Gaacaccgcg accatgacca attattactg cgctactcgt gactggtcta ccgttcttgg ccag

cgggccagac

cgcgagcatt 60

ggtaccagca

gaaaccgggc 120

cgagcggcat

cccggaacgt 180

ttagcggcac

ccaggcggaa 240

acgttgtgtt

tggcggcggc 300

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Gly Asp Ser Val Ser Asp Asn Ser Val Ala Trp Asn 15 10

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< 213> construcción sintética <220>

5

10

15

20

25

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Trp Leu Gly Arg lie Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala 15 10 15

Val Ser Val Lys Ser 20

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 113

Glu Val Leu Leu Phe Pro Ala Arg Ser Tyr Gly Thr Gly Met Asp Val 15 10 15

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 114

Ser Gly Asp Asn Leu Pro Ser Lys Tyr Val His 15 10

<210> 115

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2

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Leu Val lie Tyr Asp Asp Asn Glu Arg Pro Ser 15 10

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5 <211> 10

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3

10 <400> 116

15

20

Gly Val Ala Asp Met Pro Arg Gln Met Lys 15 10

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< 211> 110

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 117

Asp 1

lie Glu Leu Thr 5 Gln Pro Pro

Thr

Ala Ser lie 20 Thr Cys Ser Gly

His

Trp Tyr 35 Gln Gln Lys Pro Gly 40

Asp

Asp 50 Asn Glu Arg Pro Ser 55 Gly

Asn 65

Ser Gly Asn Thr Ala 70 Thr Leu

Asp

Glu Ala Asp Tyr 85 Tyr Cys Gly

Lys

Val Phe Gly 100 Gly Gly Thr

Lys

Ser Val Ser Val Ser 10

Asp Asn Leu Pro Ser 25

Gln Ala Pro Val Leu 45

lie Pro Glu Arg Phe 60

Thr lie Ser Gly Thr 75

Val Ala Asp Met Pro 90

Leu Thr Val Leu Gly 105

Pro Gly Gln 15

Lys Tyr Val

30

Val lie Tyr

Ser Gly Ser

Gln Ala Glu 80

Arg Gln Met

95

Gln

110

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10

15

20

<220>

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gatatcgaac

acctgtagcg

caggcgccgg

tttagcggat

gacgaagcgg

ggcggcacga

tgacccagcc gccgagcgtg agcgtgagcc gcgataacct gccgtctaaa tacgttcatt tgctggtgat ctacgacgac aacgaacgtc ccaacagcgg caacaccgcg accatgacca attattactg cggtgttgct gacatgccgc agttaaccgt tcttggccag

cgggccagac

cgcgagcatt 60

ggtaccagca

gaaaccgggc 120

cgagcggcat

cccggaacgt 180

ttagcggcac

ccaggcggaa 240

gtcagatgaa

agtgtttggc 300

330

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< 212> PRT

< 213> construcción sintética

10

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5

10

15

20

25

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<212> PRT

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Val Ser Tyr lie Tyr Tyr Tyr Ser Trp Val Leu Phe Asp Val 15 10

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< 211> 11

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< 213> construcción sintética <220>

10

15

20

<400> 125

Leu Leu lie Tyr Asp Val Ser Ser Leu Gln Ser 15 10

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< 223> LCDR3 <400> 126

Gln Gln Gly Leu Phe Leu Pro Phe 1 5

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 127

Asp 1

lie Gln Met Thr 5

Asp

Arg Val Thr 20 lie

Leu

Asn Trp 35 Tyr Gln

Tyr

Asp 50 Val Ser Ser

Ser 65

Gly Ser Gly Thr

Glu

Asp Phe Ala Thr 85

Thr

Phe Gly Gln 100 Gly

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 10

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Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 40 45

Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser 70 75

Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Phe 90

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr 105

Ser

val 15 Gly

Gly 30

Thr Ala

Leu

Leu

lie

Phe

Ser Gly

Leu

Gln Pro 80

Leu

Pro 95 Phe

10

15

20

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 128

Glu 1

Val Gln Leu Leu 5 Glu Ser Gly

Ser

Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala

Ala

Met Ser 35 Trp Val Arg Gln Ala 40

Ser

Phe 50 lie Ser Ser Gly Gly 55

Ser

Lys 65

Gly Arg Phe Thr He 70 Ser Arg

Leu

Gln Met Asn Ser 85 Leu Arg Ala

Ala

Arg Val Ser 100 Tyr lie Tyr Tyr

Trp

Gly Gln 115 Gly Thr Leu Val Thr 120

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< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

Gly

Gly 10 Leu Val Gln Pro Gly 15

Gly

Ser 25

Gly Phe Thr Phe Ser 30 Ser Tyr

Pro

Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val

Glu

Thr Phe Tyr 60 Ala Asp Ser Val

Asp

Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80

Glu

Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys

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Ser Ser Trp Ser Val Leu Phe 110 Asp Val

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attacctgca

ggcaaagcgc

cgctttagcg

gaagactttg

ggcacgaaag

tgacccagag cccgagcagc ctgagcgcca gagccagcca gggtattggt actgctctga cgaaactatt aatctacgac gtttcttctc gcagcggatc cggcaccgat ttcaccctga cgacctatta ttgccagcag ggtctgttcc ttgaaattaa acgtacg

gcgtgggcga

tcgcgtgacc 60

actggtacca

gcagaaaccg 120

tgcaaagcgg

cgtgccgagc 180

ccattagctc

tctgcaaccg 240

tgccgttcac

ctttggccag 300

327

10

15

20

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

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Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr Trp lie Ser 15 10

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< 213> construcción sintética <220>

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369

5

10

15

20

25

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< 213> construcción sintética <220>

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< 211> 14

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 134

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

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< 211> 10

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 136

10

Ala Ser Ala Asp Glu Trp Pro Thr Leu His 15 10

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< 212> PRT

15 < 213> construcción sintética

<220>

< 223> VL <400> 137

20

Asp 1

lie Ala Leu Thr 5

Ser

He Thr He 20

Ser

Asn

Tyr Val 35 Ser Trp

Met

lie 50 Tyr Gly val

Ser 65

Gly Ser Lys Ser

Gln

Ala Glu Asp Glu 85

Pro Gln

Thr Leu His 100 Val

Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser 10

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25

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Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr lie 70 75

Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Ala 90

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 105

Pro

Gly 15 Gln

Gly 30

His Tyr

Pro

Lys Leu

Asn

Arg Phe

Ser

Gly Leu 80

Asp

Glu 95 Trp

Val 110

Leu Gly

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< 213> construcción sintética

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5

10

15

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Gly Ala lie Asp Pro Thr Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser 50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser 65 70 75

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met 85 90

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Pro

Gly 15 Glu

Thr 30

Asp Tyr

Glu

Trp Met

Pro

Ser Phe

Thr

Ala Tyr 80

Tyr

Tyr 95 Cys

Tyr 110

Pro Met

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gatatcgcgc

agctgcaccg

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agcaaccgtt

caagcggaag

gtgtttggcg

tgacccagcc

ggcgagcgtg agcggtagcc cgggccagag cattaccatt 60

gcaccagcag

cgatgtgggc cattacaact acgtgtcttg gtaccagcag 120

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actgatgatc tacggtgtta ctaaacgtcc gagcggcgtg 180

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caaaagcggc aacaccgcga gcctgaccat tagcggcctg 240

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ttattactgc gcttctgctg acgaatggcc gactctgcat 300

gcggcacgaa

gttaaccgtt cttggccag 339

10

15

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< 213> construcción sintética <220>

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cggtgcggaa gtgaaaaaac tagcttcact gactactgga gatgggcgct atcgacccga ggtgaccatt agcgcggata agcgagcgat accgcgatgt aggtcgttac ccgatggatg

cgggcgaaag cctgaaaatt tctcttgggt gcgccagatg ctgaoagcta cacccgttat aaagcatcag caccgcgtat attattgcgc gcgttggtac tttggggcca aggcaccctg

Gly Tyr Ser Phe Asn Asn Tyr Trp lie Ala

20 1 5 10

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5

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20

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Gln Gln Ser Val Asn Phe Pro Thr 1 5

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< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 147

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Tyr

lie

Gly

Pro

80

Thr

10

15

20

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 148

Glu 1

Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly

Ser

Leu Lys He 20 Ser Cys Lys Gly

Trp

lie Ala 35 Trp Val Arg Gln Met 40

Gly

Phe 50 He Tyr Pro Ser Asn 55 Ser

Gln 65

Gly Gln Val Thr He 70 Ser Ala

Leu

Gln Trp Ser Ser 85 Leu Lys Ala

Ala

Arg Asp Asn 100 Glu Tyr Ser Asp

Gly

Thr Leu 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 149

< 211> 327

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..327

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 149

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 10 15

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ctgagctgca

gagcgagcca gatcgtttct tcttacctgg cttggtacca gcagaaaccg 120

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cgcgtctatt aatctacgac gcttcttctc gtgcgaecgg cattccggcg 180

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cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagactttg

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ggcacgaaag ttgaaattaa

acgtacg 327

5

10

15

20

25

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< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..360

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gaagtgcaat tggtgcagag cggtgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag agctgcaaag gctccggata tagcttcaac aactactgga tcgcttgggt ccgggcaaag gtctcgagtg gatgggcttc atctacccgt ctaacagcgc agcccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcatcag ctgcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat accgcgatgt attattgcgc gaatactctg actcttactt cgatgtttgg ggccaaggca ccctggtgac

cctgaaaatt

60

gcgccagatg

120

tacccagtat

180

caccgcgtat

240

gcgtgaeaac

300

tgttagctca

360

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< 213> construcción sintética <220>

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Gly Tyr Ser Phe Asn Asn Tyr Trp lie Ala 15 10

<210> 152

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< 213> construcción sintética <220>

5

10

15

20

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Ser Phe Gln Gly 20

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< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 153

Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Ser Tyr Phe Asp Val 15 10

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< 213> construcción sintética <220>

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< 213> construcción sintética <220>

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< 213> construcción sintética <220>

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15

20

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< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 157

Asp 1

lie Val Leu Thr 5

Glu

Arg Ala Thr 20 Leu

Leu

Ala Trp 35 Tyr Gln

Tyr

Asp 50 Ala Ser Ser

Ser 65

Gly Ser Gly Thr

Glu

Asp Phe Ala Thr 85

Phe

Gly Gln Gly 100 Thr

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 10

Ser Cys Arg Ala Ser Gln lie Val 25

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Ser

Pro 15 Gly

Ser 30

Ser Tyr

Leu

Leu

lie

Phe

Ser Gly

Leu

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Ser

Asn 95 Thr

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10

15

<220>

< 223> VH <400> 158

Glu 1

Val Gln Leu Val 5 Gln Ser Gly

Ser

Leu Lys lie 20 Ser Cys Lys Gly

Trp

lie Ala 35 Trp Val Arg Gln Met 40

Gly

Phe 50 lie Tyr Pro Ser Asn 55 Ser

Gln 65

Gly Gln Val Thr lie 70 Ser Ala

Leu

Gln Trp Ser Ser 85 Leu Lys Ala

Ala

Arg Asp Asn 100 Glu Tyr Ser Asp

Gly

Thr Leu 115 Val Thr Val Ser Ser 120

<210> 159

< 211> 324

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..324

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 159

Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 10 15

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Ala Thr Gln Tyr Ser Pro Ser Phe 60

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20

gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggtga acgtgcca.cc 60

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<210> 160

5

10

15

20

25

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..360

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VH (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 160

gaagtgcaat agctgcaaag ccgggcaaag agcccgagct ctgcaatgga gaatactctg

tggtgcagag

cggtgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60

gctccggata

tagcttcaac aactactgga tcgcttgggt gcgccagatg 120

gtctcgagtg

gatgggcttc atctacccgt ctaacagcgc tacccagtat 180

ttcagggcca

ggtgaccatt agcgcggata aaagcatcag caccgcgtat 240

gcagcctgaa

agcgagcgat accgcgatgt attattgcgc gcgtgacaac 300

actcttactt

cgatgtttgg ggccaaggca ccctggtgac tgttagctca 360

<210> 161 < 211> 10 < 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

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10

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20

25

30

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< 211> 11

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< 213> construcción sintética <220>

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Arg Ala Ser Gln lie Val Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

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< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

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10

15

20

<400> 165

Leu Leu lie Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr

15 10

<210> 166 < 211>8 <212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 166

Gln Gln Ser Asn Gly Trp Leu Pro 1 5

<210> 167

<211> 109

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 167

Asp 1

lie Val Leu Thr 5

Glu

Arg Ala Thr 20 Leu

Leu

Ala Trp 35 Tyr Gln

Tyr

Asp 50 Ala Ser Ser

Ser 65

Gly Ser Gly Thr

Glu

Asp Phe Ala Thr 85

Thr

Phe Gly Gln 100 Gly

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 10

Ser Cys Arg Ala Ser Gln lie Val 25

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 40 45

Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser 70 75

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Gly 90

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr 105

Ser

Pro 15 Gly

Ser 30

Ser Tyr

Leu

Leu

He

Phe

Ser Gly

Leu

Glu Pro 80

Trp

Leu 95 Pro

10

15

20

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 168

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Asn Asn Tyr 20 25 30

Trp lie Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Phe lie Tyr Pro Ser Asn Ser Ala Thr Gln Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60

Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 169

< 211> 327

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..327

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 169

gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggtga acgtgccacc 60

ctgagctgca gagcgagcca gatcgtttct tcttacctgg cttggtacca gcagaaaccg 120

ggccaggccc cgcgtctatt aatctacgac gcttcttctc gtgcgaccgg cattccggcg 180

cgttttagcg gcagcggatc cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagactttg cgacctatta ttgccagcag tctaacggtt ggctgccgac ctttggccag 300

ggcacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327

<210> 170

5

10

15

20

25

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..360

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VH (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 170

gaagtgcaat tggtgcagag cggtgcggaa agctgcaaag gctccggata tagcttcaac ccgggcaaag gtctcgagtg gatgggtttc agcccgagct ttcagggcca ggtgaccatt ctgcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat gaatactctg actcttactt cgatgtttgg

gtgaaaaaac

cgggcgaaag cctgaaaatt 60

aactactgga

tcgcttgggt gcgccagatg 120

atctacccgt

ctaacagcgc tacccagtat 180

agcgcggata

aaagcatcag caccgcgtat 240

accgcgatgt

attattgcgc gcgtgacaac 300

ggccaaggca

ccctggtgac tgttagctca 360

<210> 171 < 211> 10 <212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR1 <400> 171

Gly Tyr Ser Phe Asn Asn Tyr Trp lie Ala

15 10

<210> 172 < 211> 20

< 212> PRT

< 213> construcción sintética

5

10

15

20

25

< 223> HCDR2 <400> 172

Trp Met Gly Phe lie Tyr Pro Ser Asn Ser Ala Thr Gln Tyr Ser Pro 15 10 15

Ser Phe Gln Gly 20

<210> 173

< 211> 11

<212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> HCDR3 <400> 173

Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Ser Tyr Phe Asp Val 15 10

<210> 174

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR1 <400> 174

Arg Ala Ser Gln lie Val Ser Ser Tyr Leu Ala 15 10

<210> 175

< 211> 11

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR2

10

15

20

<400> 175

Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 15 10

<210> 176

< 211>8

<212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> LCDR3 <400> 176

Gln Gln Ser Glu Gln Val Pro Thr 1 5

<210> 177

<211> 109

< 212> PRT

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VL <400> 177

Asp 1

lie Val Leu Thr 5

Glu

Arg Ala Thr 20 Leu

Leu

Ala Trp 35 Tyr Gln

Tyr

Asp 50 Ala Ser Ser

Ser 65

Gly Ser Gly Thr

Glu

Asp Phe Ala val 85

Thr

Phe Gly Gln 100 Gly

Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu 10

Ser Cys Arg Ala Ser Gln lie Val 25

Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg 40 45

Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg 55 60

Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser 70 75

Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Glu Gln 90

Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr 105

Ser

Pro 15 Gly

Ser 30

Ser Tyr

Leu

Leu

lie

Phe

Ser Gly

Leu

Glu Pro 80

Val

Pro 95 Thr

<210> 178 <211> 120

10

15

< 213> construcción sintética <220>

< 223> VH <400> 178

Glu

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly

Glu

1

5 10 15

Ser

Leu Lys He Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Asn Asn Tyr

20 25 30

Trp

lie Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly

Phe He Tyr Pro Ser Asn Ser Ala Thr Gln Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

Gln

Gly Gln Val Thr He Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr

65

70 75 80

Leu

Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala

Arg Asp Asn Glu Tyr Ser Asp Ser Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 179

< 211> 327

< 212> ADN

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..327

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado" /nota="VL (ADN)” /organismo="Secuencia artificial" <400> 179

gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggtga acgtgccacc 60

ctgagctgca gagcgagcca gatcgtttct tcttacctgg cttggtacca gcagaaaccg 120

ggccaggccc cgcgtctatt aatctacgac gcttcttctc gtgcgaccgg cattccggcg 180

cgttttagcg gcagcggatc cggcaccgat ttcaccctga ccattagcag cctggaaccg 240

gaagactttg cggtgtatta ttgccagcag tctgaacagg ttccgactac ctttggccag 300

ggcacgaaag ttgaaattaa acgtacg 327

<210> 180

< 211> 360

10

15

< 213> construcción sintética <220>

< 221> fuente

< 222> 1..360

< 223> /mol_tipo="ADN no asignado"

/nota="VH (ADN)”

/organismo="Secuencia artificial"

<400> 180

gaagtgcaat tggtgcagag cggtgcggaa gtgaaaaaac cgggcgaaag cctgaaaatt 60

agctgcaaag gctccggata tagcttcaac aactactgga tcgcttgggt gcgccagatg 120

ccgggcaaag gtctcgagtg gatgggcttc atctacccgt ctaacagcgc tacccagtat 180

agcccgagct ttcagggcca ggtgaccatt agcgcggata aaagcatcag caccgcgtat 240

ctgcaatgga gcagcctgaa agcgagcgat accgcgatgt attattgcgc gcgtgacaac 300

gaatactctg actcttactt cgatgtttgg ggccaaggca ccctggtgac tgttagctca 360

<210> 181

<211> 197

< 212> PRT

< 213> Homo sapiens <220>

<223> IL17C <400> 181

20

Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys 15 10 15

5

Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser 20 25 30

Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gln 35 40 45

Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gln Ala Leu 50 55 60

Ala Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg 65 70 75

Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gln Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu 85 90

Leu Glu Ala Asp Thr His Gln Arg Ser lie Ser Pro Trp Arg 100 105 110

Val Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gln Lys Leu Ala Phe 115 120 125

Cys Leu Cys Arg Gly Cys lie Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu 130 135 140

Ala Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gln Ser Leu Leu Val Leu 145 150 155

Arg Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly 165 170

Ala Phe His Thr Glu Phe lie His Val Pro Val Gly Cys Thr 180 185 190

Leu Pro Arg Ser Val 195

<210> 182

< 211> 866

< 212> PRT

< 213> Homo sapiens <220>

< 223> IL17RA <400> 182

His Gly Ala Pro Pro Val

His Glu

80

Glu Val 95

Tyr Arg

Ala Glu

Thr Ala

Arg Arg 160 Ala Phe 175

Cys Val

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, específico para IL17C, para uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, en donde dicho trastorno inflamatorio es inflamación pulmonar, artritis reumatoide y/o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), en donde la IL17C consiste en los aminoácidos de la SEQ. ID No.: 181 y en donde dicho anticuerpo bloquea la unión de la IL17C a IL17RE.
2. 2. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, específico para IL17C, para uso según la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo experimenta competición cruzada con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende 6 CDR definidos por Kabat que se selecciona de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende:

   una HCDR1 de la Seq. ID: 1, una HCDR2 de la Seq. ID: 2, una HCDR3 de la Seq. ID: 3, una LCDR1 de la Seq. ID: 4, una LCDR2 de la Seq. ID: 5 y una LCDR3 de la Seq. ID: 6 (MOR12740) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 31, una HCDR2 de la Seq. ID: 32, una HCDR3 de la Seq. ID: 33, una LCDR1 de la Seq. ID: 34, una LCDR2 de la Seq. ID: 35 y una LCDR3 de la Seq. ID: 36 (MOR12743) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 41, una HCDR2 de la Seq. ID: 42, una HCDR3 de la Seq. ID: 43, una LCDR1 de la Seq. ID: 44, una LCDR2 de la Seq. ID: 45 y una LCDR3 de la Seq. ID: 46 (MOR12744) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 51, una HCDR2 de la Seq. ID: 52, una HCDR3 de la Seq. ID: 53, una LCDR1 de la Seq. ID: 54, una LCDR2 de la Seq. ID: 55 y una LCDR3 de la Seq. ID: 56 (MOR12745) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 61, una HCDR2 de la Seq. ID: 62, una HCDR3 de la Seq. ID: 63, una LCDR1 de la Seq.

   ID: 64, una LCDR2 de la Seq. ID: 65 y una LCDR3 de la Seq. ID: 66 (MOR12746) o una HCDR1 de la Seq. ID: 71,

   una HCDR2 de la Seq. ID: 72, una hCdR3 de la Seq. ID: 73, una LcDr1 de la Seq. ID: 74, una LCDR2 de la Seq.

   ID: 75 y una LCDR3 de la Seq. ID: 76 (MOR12751) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 91, una HCDR2 de la Seq. ID: 92, una HCDR3 de la Seq. ID: 93, una LCDR1 de la Seq.

   ID: 94, una LCDR2 de la Seq. ID: 95 y una LCDR3 de la Seq. ID: 96 (MOR12754) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 141, una HCDR2 de la Seq. ID: 142, una HCDR3 de la Seq. ID: 143, una LCDR1 de la Seq. ID: 144, una LCDR2 de la Seq. ID: 145 y una LCDR3 de la Seq. ID: 146 (MOR12759) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 151, una HCDR2 de la Seq. ID: 152, una HCDR3 de la Seq. ID: 153, una LCDR1 de la Seq. ID: 154, una LCDR2 de la Seq. ID: 155 y una LCDR3 de la Seq. ID: 156 (MOR12760) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 161, una HCDR2 de la Seq. ID: 162, una HCDR3 de la Seq. ID: 163, una LCDR1 de la Seq. ID: 164, una LCDR2 de la Seq. ID: 165 y una LCDR3 de la Seq. ID: 166 (MOR12761) o

   una HCDR1 de la Seq. ID: 171, una HCDR2 de la Seq. ID: 172, una HCDR3 de la Seq. ID: 173, una LCDR1 de la Seq. ID: 174, una LCDR2 de la Seq. ID: 175 y una LCDR3 de la Seq. ID: 176 (MOR12762).
3. 3. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, específico para IL17C, para el uso según la reivindicación 1 o 2, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
4. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, específico para IL17C, para el uso según la reivindicación 3, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano, humanizado o quimérico.
5. 5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo específico para IL17C para el uso según la reivindicación 3, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada humana y una región constante de cadena ligera humana.
6. 6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, específico para IL17C, para el uso según la reivindicación 3, en donde dicho anticuerpo es del isotipo IgG.
7. 7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo, específico para IL17C, para el uso según la reivindicación 3, en donde dicho fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un Fab, F(ab2)', F(ab)2', scFV.

   Estreptavidina de etiqueta para ECL

   mlL-17C biotinilada

   Fusión de Fe con DEC de receptor de miL-17

   imagen1

   Unidades ECL

   imagen2

   imagen3

   IIIHI lgG2a anti-mlL-17C de rata (311522)

   i, lgG2a anti-ml L-17C de rata (311523)

   ▼ lgG2a anti-ml L-17C de rata (8B28)

   <l||i> lgG1 antirratón de rata irrelevante — IL-17RE/Fc murina soluble

   h/rn lgG2a

   familia HCDR3

   MOR VL SEC porción monómero i%:i * ’ . rendimiento cultivo purificado [mg/l] Comentarios

   1

   ¡ 2740 lannbda 93 13 baja concentración

   2

   12741 lannbda 95 23

   3

   12742 lannbda 8 10 fallo en SEC

   4

   12743 lannbda 98 23

   4

   12744 lannbda 98 16

   4

   12745 lannbda 94 28

   4

   II2746 lannbda 99 18

   5

   12751 lannbda 96 19

   6

   12753 lannbda 92 3 baja concentración

   7

   12754 kappa 93 28

   8

   12755 lannbda 96 26

   9

   12756 laimbda 92 25

   10

   12757 kappa 98 22

   11

   12758 lairnbda 93 29

   12

   12759 kappa 97 18

   12

   12760 kappa 91 17

   12

   112761 kappa 97 24

   12

   12762 kappa 97 28

   126

   03

   00 00 0*3 05 0*5 ro — 5 sr

   ro Si ro

   ro -0 Si ro -o Si o ro -o Si =3 ro S ro -o Si ro o* OI ro $ ro -o £ ro -o w ro "O ro -o -ÍD w i jj

   f g

   f g

   í Tj & íT 1 Di 1 Di 5T 3 g dí sr 3 g Di 53“ 3 g Di 53“ 3 g Di DT 3 g Di < —

   0,4

   o -i LO 05 !+ O o ro i+ o o & i-i- -p l-O'Q + 01^0 0,39 ± 0,0 O fe !+ o 'ro o '-p* p ro oo i+ o O 0*3 O V -o ¡+ o 1,14 ±0,11 _ 3 =-• F # í lí w ~ ~ ro v / <£•

   No unión

   F s c 3 o> rs

   No unión

   mslL-17B m rñ >

   No unión

   oo c N 3 03

   CQ

   C

   ü)

   oo

   Afinidad (Fab)

   familia HCDR3

   MOR VL KD [pM]

   1

   112740 larri bda 170

   2

   112741 larri bda *

   3

   12742 larri bda *(no disponible como lgG2a)

   4

   12743 larri bda 48

   4

   1 ¡2744 larri bda 53

   4

   112745 lambda 75

   4

   12746 larri bda 56

   5

   112751 lambda *

   6

   12753 lambda 62..(no disponible como lgG2a]

   7

   12754 kappa 4100

   8

   12755 lambda sin señal

   9

   12756 lambda sin señal

   10

   12757 kappa sin señal

   11

   12758 lambda sin señal

   12

   12759 kappa 220

   12

   12760 kappa **

   12

   12761 kappa 85

   12

   12762 kappa 96

   sin unión sigmoidal

   **= Fab precipita

   Figura 5

   mlL17C - mlL-17RE ensayo inhibición ICS0 [pM]

   1 familia HCDR3

   MOR VIL

   í

   12740 lambda 3493±142

   2

   12741 lambda inhibición incompleta

   4

   12743 lambda 1 6:!: 5,4

   4

   12744 lambda 12 ±3,7

   4

   12745 lambda 13 ±7,3

   4

   12746 lambda 23 ± 13

   5

   12751 lambda 160 ±93,6

   8

   12754 kappa 8442±1494

   13

   12759 kappa 28 ± 2/7

   13

   12760 kappa 122 ± 43,9

   13

   12761 kappa 24 6

   13

   12752 kappa 9 + 1,8 ]

   Ensayo estabilidad suero ratón 24 h/37 °C Coeficiente de variación

   familia HCDR3

   MOR VL

   1

   12740 larnbda n. d.

   2

   12741 lambda 13,01%

   3

   12743 larnbda 2,88%

   3

   12744 lambda 11 ,.78%

   3

   12745 lambda 15,94%

   3

   12746 lambda 7,36%

   4

   12751 lambda 3,75%

   5

   12754 Ikappa 17,00%

   6

   12759 Ikappa 8,80%

   6

   12760 kappa 35,31%

   6

   12761 Ikappa 1,23%

   6

   12762 kappa 2,43%

   co

   o

   1 Q

   9

   8

   5 7

   
   os t.-

   
   o 5

   c

   
   o 5

   tz

   o

   
   O 4

   03

   zs

   
   § 3

   CL

   imagen4

   —Vehículo

   MOR12743 (lOmg/kg)

   imagen5

   ! ! 1 días

   37 40 43 46

   -s-Enbre! (10 mg/kg) —MC'R03207 (10 mg/kg)

   -«-MOR12762 (10 mg/kg)

   ueu

   Puntuación clínica ABC

   imagen6

   Figura 8

   Puntuación Larsen (Ul)

   ||pvi»k- |i.....I» |V )

   imagen7

   LO LO

   O u~\

   133

   10

   y¿>

   O

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   «5

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   13

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   lili

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   -■■■: 'W.

   :1 *'**.'•

   m Solución salina

   ü LPS 10ug/atones+ DEX 30 mg/kg dos veces p. o.

   S LPS lUpg/íatones^ MOR12743 5 mg/kg una vez i. p.

   1 LPS lOpg/ratones

   H LPS lOLig/atones1- MOR03207 5 mg/kg una vez i. p. i¡ LPS lUng/ratones^ MOR12762 5 mg/kg una vez i. p.

   IL17C Núm, de copias

   Parénquima pulmonar bronquio terciario bronquio cuaternario

   imagen8

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