RS57209B1 - Antagonisti il17c za lečenje zapaljenskih poremećaja - Google Patents

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetna prijava odnosi se na antagoniste IL17C za upotrebu u lečenju zapaljenskih poremećaja, kao što je artritis. Primeri IL17C antagonista su IL17C-specifična antitela ili njihovi fragmenti, kao što su humana anti-IL17C antitela.

Osnov pronalaska

[0002] IL17C je sekretorni, disulfidnom vezom uspostavljeni homodimer koji pripada familiji IL17 proteina. In vitro je pokazano da IL17C stimuliše oslobađanje TNF-α i IL-1β iz monocitne ćelijske linije THP-1 (Li et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.

97, 773-8). U ćelijama eksudata peritoneuma (peritoneal exudates cells, PECS) i ćelijama 3T3 ćelijske linije, IL17C može da indukuje ekspresiju iRNK za sintezu zapaljenskih citokina kao što su IL-1β, IL-6 i IL-23 (Yamaguchi et al. (2007) J. Immunol 179, 7128-36. In vivo CD4+ T ćelije transdukovane sa IL17C pogoršavaju artritis indukovan kolagenom (collagen induced arthritis, CIA) kod miševa, a miševi rekonstituisani ćelijama kostne srži transdukovanim sa IL17C oboljevaju od jakog artritisa indukovanog kolagenom. Saopšteno je da se IL17C vezuje za IL-17 receptor E (IL17RE/Fc) i izgleda da aktivira NF-κB (Calhoun (2007) Bachelor’s Thesis: Generation of proof of concept molecules: Neutralizing monoclonal antibodies to IL17C; Oregon State University, University Honours College; Gaffen (2009) Nat Rev. Immunol 9, 556-67), a saopšteno je i da utiče na člana nukleusne IkapaB familije, IkBζ pri aktivaciji Th17 ćelija kod IL17C-deficijentnih miševa (Chang et al. (2011) Immunity 35, 611-621). Izgleda da je ekspresija IL17C u normalnim tkivima ograničena na bubreg fetusa i adulta. Ekspresija iRNK za IL17C u artritičnim šapama CIA miševa izuzetno je povišena. Hwang et al. opisali su ekspresiju IL17C u mononuklearnim ćelijama sinovijalne tečnosti i periferne krvi pacijenata sa reumatoidnim artritisom (Hwang & Kim (2005) Mol Cells 19, 180-184).

[0003] WO 99/060127 opisuje kloniranje IL17C (PRO1122). WO 99/060127 ukazuje na moguću povezanost nekih poremećaja sa IL17C, uključujući artritis (npr., osteoartritis, reumatoidni artritis, psorijazni artritis), sepsu, ulcerativni kolitis, psorijazu, multiplu sklerozu, dijabetes tipa I, gigantocelularni artritis, sistemski eritemski lupus i Sjögren-ov sindrom. Isto tako, ima se u vidu da jedinjenja iz WO 99/060127 mogu da se koriste za lečenje različitih stanja, uključujući ona koja se karakterišu preteranom ekspresijom i/ili aktivacijom gena udruženih sa ovde navedenim bolestima. Međutim, eksperimentalnih dokaza za ovu pretpostavljenu funkciju IL17C nema. Isto važi i za WO 2005/065711.

[0004] Pored toga, Yamaguchi et al. (Yamaguchi et al., The Journal of Immunology, 2007, 179: 7128:7136) profilisali su ekspresiju iRNK čitave familije IL17 i utvrdili da se u artritičnim ćelijama preterano eksprimira ne samo IL17A nego i IL17B i IL17C. Ramirez-Carrozzi et al. (Ramirez-Carrozzi et al, (2011) Nature Immunol 12(12) 1159-1166) objavljuju da IL-17C k/o miševi slabije odgovaraju na imikvimod i pokazuju manje znake zapaljenje i zadebljavanje epiderma i pretpostavljaju moguću ulogu IL17C u patogenezi psorijaze.

[0005] Predmetni pronalazak prvi put pokazuje u eksperimentima in vivo da su antitela specifična za IL17C visoko efikasna u lečenju zapaljenskih poremećaja.

Kratak opis pronalaska

[0006] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C, za upotrebu u lečenju zapaljenskog poremećaja, gde je pomenuti zapaljenski poremećaj zapaljenje pluća, reumatoidni artritis i/ili COPD (chronic obstructive pulmonary disease, hronična opstruktivna bolest pluća), pri čemu se IL17C sastoji od amino-kiselina SEQ. ID No.: 181, i pri čemu pomenuto antitelo blokira vezivanje IL17C za IL17RE.

[0007] Poželjno, pomenuto izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17 je monoklonsko antitelo.

Objašnjenje slika

Slika 1A prikazuje postavku testa interakcije sa receptorima. Multi-array® ploča sa 384 bunarčića obloži se ECD-fuzionim proteinima IL17 receptora. Nanese se biotinisani mišji IL17C i vrši se detekcija pomoću streptavidina.

Slika1B prikazuje rezultate testa interakcije sa receptorima prikazanog na Slici 1A. Jasno je pokazano da se IL17C vezuje za mišji IL17RE/Fc, ali ne i za mišji IL-17RB ili drugi irelevantni receptor.

Slika 1C prikazuje rezultate testa interakcije sa receptorima prikazanog na Slici 1A. Nijedno od tri antitela stanja tehnike ne inhibira vezivanje mišjeg IL17C za mišji IL17RE/Fc.

Slika 2 prikazuje rezultate kontrole kvaliteta bazirane na ekskluzionoj hromatografiji (size exclusion chromatography, SEC).

Slika 3 prikazuje rezultate određivanja EC50pomoću ELISA. Sva prečišćena himerna humano-mišja IgG2a antitela titruju se na mišji IL17C počevši od koncentracije od 100 nM.

Slika 4 prikazuje monovalentne afinitete anti-IL17C antitela. Afiniteti se određuju ravnotežnom titracijom u rastvoru (solution equilibrium titration, SET), korišćenjem Fab fragmenata.

Slika 5 prikazuje IC50vrednosti određene testom inhibicije IL-17 receptora E, opisanim u primeru 11.

Slika 6 prikazuje rezultate testa stabilnosti u mišjem serumu. Jedanaest prečišćenih IgG prikazuje prihvatljive proizvodne prinose i specifično vezivanje za mišji IL17C posle 24h inkubacije sa mišjim serumom.

Slika 7 prikazuje rezultate ispitivanja uticaja primene MOR12743 i MOR12762 na klinički skor u protokolu lečenja, u CIA modelu, kod miša, u poređenju sa prenosnikom, Enbrel® (etanerceptom) i kontrolnim antitelom (MOR03207).

Slika 8 prikazuje rezultate ispitivanja uticaja primene MOR12743 i MOR12762 na AUC kliničkog skora u protokolu lečenja, u CIA modelu, kod miša, u poređenju sa prenosnikom, Enbrel® (etanerceptom) i kontrolnim antitelom (MOR03207).

Slika 9 prikazuje rezultate ispitivanja uticaja primene MOR12762 na Larsen-ov skor u protokolu profilakse CIA modela kod miša, u poređenju sa kontrolnim antitelom (MOR03207).

Slika 10 prikazuje rezultate ispitivanja uticaja primene MOR12762 ili MOR12743 na regrutovanje zapaljenskih ćelija u BALF u mišjem modelu akutne plućne neutrofilije, u poređenju sa kontrolnim antitelom (MOR03207).

Slika 11 prikazuje rezultate profilisanja ekspresije IL17C korišćenjem qRT-PCR. Povećani nivoi ekspresije IL17C detektovani su u uzorcima plućnog tkiva poreklom od davalaca sa dijagnostikovanim zapaljenskim respiratornim oboljenjima, u poređenju sa nivoima ekspresije IL17C u kontrolnim uzorcima. Za svaku grupu analizirani su uzorci dobijeni od 5 pojedinačnih davalaca.

Slika 12 prikazuje efekat MOR1243 neutrališućih antitela na debljinu epiderma u mišjem modelu psorijaze indukovane imikvimodom (Imiquimod, IMQ).

Slika 13A prikazuje rezultate kvantitativne RT-PCR analize ekspresije IL17C iRNK u keratinocitima humanog epiderma tretiranim samo medijumom, IL-1 (10 ng/ml), TNF (10 ng/ml), IL-17A (250 ng/ml) ili kombinacijom ovih okidača, u trajanju od 2h, 6h, 24h ili 48h.

Slika 13B prikazuje rezultate kvantitativne RT-PCR analize ekspresije IL17C iRNK u keratinocitima humanog epiderma tretiranim samo medijumom ili različitim TLR ligandima: TLR4 ligandom LPS (1 μg/ml), TLR5 ligandom flagelinom (1 μg/ml), TLR7 ligandom gardikvimodom (4 μg/ml), TLR7/8 ligandom CL097 (10 μg/ml) i TLR9 ligandom CpG ODN 2116 (10 μM), u trajanju od 2h, 6h ili 24h.

Detaljan opis pronalaska

[0009] Okvir pronalaska definisan je pridruženim patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak pokazuje da je IL17C dobar cilj u lečenju zapaljenskih poremećaja. U tom smislu, pronalazak obezbeđuje, u jednom aspektu, metode upotrebe antagonista IL17C, za postizanje profilaktičke ili terapijske koristi u lečenju zapaljenskih pormeećaja.

[0010] Predmetna objava obezbeđuje metode lečenja, koji uključuju davanje terapijski efikasne količine antagonista IL17C subjektu kojem je takvo lečenje potrebno. "Terapijski efikasna količina" ili "efikasna količina", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na količinu antagonista IL17C potrebnu za izazivanje željenog biološkog odgovora. U skladu sa tim, terapijski efikasna količina je količina antagonista IL17C potrebna za lečenje i/ili prevenciju zapaljenskog poremećaja.

[0011] Izrazi "zapaljenski poremećaj" ili "zapaljensko oboljenje" koriste se naizmenično i ovde se odnose na svaku abnormalnost udruženu sa zapaljenjem. Primeri poremećaja udruženih sa zapaljenjem uključuju acne vulgaris, artritis, kao što je reumatoidni artritis, astmu, autoimunske bolesti, hronični prostatitis, COPD (hroničnu opstruktivnu bolest pluća), glomerulonefritis, preosetljivosti, zapaljenske bolesti creva, zapaljensku bolest karlice, reperfuziono oštećenje, sarkoidozu, odbacivanje transplantata, vaskulitis, intersticijalni cistitis i sepsu. Zapaljenski poremećaji mogu biti hronični ili akutni. Primeri autoimunskih oboljenja uključuju ankilozni spondilitis, Crohn-ovu bolest, dijabetes melitus tipa I, gastritis, Guillain-Barré-ov sindrom, idiopatsku trombocitopenijsku purpuru, eritemski lupus, multiplu sklerozu, psorijazu, psorijazni artritis, sindrom nemirnih nogu, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, sistemski eritemski lupus i ulcerativni kolitis.

[0012] Artritis može da se manifestuje sam, kao primarna forma bolesti. Ovo je na primer slučaj kod osteoartritisa, reumatoidnog artritisa, septičkog artritisa, gihta i pseudogihta, juvenilnog idiopatskog artritisa, Still-ove bolesti i ankiloznog spondilitisa. Druge forme artritisa su sekundarne u odnosu na druge bolesti, npr. Ehlers-Danlos-ov sindrom, sarkoidozu, Henoch-Schönlein-ovu purpuru, psorijazni artritis, reaktivni artritis, hemohromatozu, hepatitis, Wegener-ovu granulomatozu (i druge vaskulitisne sindrome), Lyme-sku bolest, porodičnu mediteransku groznicu, hiperimunoglobulinemiju D sa povratnom groznicom, periodični sindrom udružen sa TNF receptorom i zapaljensku bolest creva (uključujući Crohn-ovu bolest i ulcerativni kolitis).

[0013] Izraz "zapaljenje pluća" obuhvata svaku zapaljensku bolest pluća, akutni i hronični bronhitis, hroničnu opstruktivnu bolest pluća, plućnu fibrozu, Goodpasture-ov sindrom i svako plućno stanje u kojem ulogu mogu imati bele krvne ćelije, uključujući, ali ne ograničavajući se na idiopatsku plućnu fibrozu i svaku drugu autoimunsku bolest pluća.

[0014] Izraz "IL17C" odnosi se na protein poznat kao interleukin 17C (identifikovan u HUGO Gene Nomenclature Committee (HGNC) kao ID 5983 i u bazi podataka Mouse genome Informatics (MGI) kao ID 2446486). U nekim starijim publikacijama, IL17C se označava kao CX2 ili IL-21, međutim, ne bi trebalo mešati ga sa citokinom IL-21 koji se specifično eksprimira u aktiviranim CD4<+>T ćelijama, ali ne i u većini drugih tkiva (Parrish-Novak et al (2000). Nature 408 (6808): 57-63). Humani IL-21 lociran je na hromozomu 4 i identifikovan je u HGNC bazi podataka kao ID 6005. Humani IL17C je lociran na hromozomu 16 i ima aminokiselinsku sekvencu (UniProt Q9P0M4):

[0015] Izraz "IL17RA" odnosi se na protein poznat kao receptor A za interleukin 17. Humani IL17RA ima aminokiselinsku sekvencu (UniProt Q96F46):

[0016] Izraz "IL17RE" odnosi se na protein poznat kao receptor E za interleukin 17. Humani IL17RE ima aminokiselinsku sekvencu (UniProt Q8NFR9):

[0017] "Antagonist IL17C" i "IL17C antagonist", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na antagoniste IL17C u najširem smislu. Obuhvaćen je svaki molekul koji inhibira aktivnost ili funkciju IL17C, ili koji na bilo koji drugi način ispoljava efekat na IL17C. Izraz antagonist IL17C uključuje, ali se ne ograničava na antitela ili fragmente antitela koji se specifično vezuju za IL17C, inhibitorne nukleinske kiseline specifične za IL17C ili male organske molekule specifične za IL17C. Izrazom antagonist IL17C obuhvaćena su i antitela ili fragmenti antitela koji se specifično vezuju za receptor za IL17C, inhibitorne nukleinske kiseline specifične za receptor za IL17C, ili mali organski molekuli specifični za receptor za IL17C. Izraz antagonist IL17C odnosi se i na skafoldmolekule koji nisu antitela, kao što su fibronektinski skafoldi, ankirini, maksitela/avimeri, molekuli izvedeni iz proteina A, antikalini, afilini, mimetici proteinskog epitopa (protein epitope mimetics, PEM) ili slično.

[0018] Inhibitorne nukleinske kiseline uključuju, ali se ne ograničavaju na besmislenu DNK, tripleks-formirajuće oligonukleotide, spoljašnje vodeće sekvence, siRNK i mikroRNK. Korisne inhibitorne nukleinske kiseline uključuju one koje smanjuju ekspresiju RNK koja kodira IL17C, za najmanje 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 95 procenata u poređenju sa kontrolama. Inhibitorne nukleinske kiseline i metodi njihove proizvodnje dobro su poznati u struci. Na raspolaganju je softver za dizajniranje siRNK.

[0019] Mali organski molekuli (small organic molecules, SMOL) specifični za IL17C ili receptor za IL17C mogu da se identifikuju skriningom prirodnih proizvoda ili skriningom hemijskih biblioteka. Tipično, molekulska težina SMOL je ispod 500 daltona, tipičnije od 160 do 480 daltona. Druge tipične osobine SMOL su jedna ili više od sledećih:

• Vrednost particionog koeficijenta log P je u rasponu od -0.4 do 5.6

• Molarna refraktivnost je od 40 do 130

• Broj atoma je od 20 do 70

Za pregled vidi Ghose et al. (1999) J Combin Chem: 1, 55-68 i Lipinski et al (1997) Adv Drug Del Rev: 23, 3-25.

[0020] Antagonist IL17C za upotrebu u predmetnom pronalasku je antitelo specifično za IL17C. Takvo antitelo može biti bilo kojeg tipa, na primer mišje, pacovsko, himerno, humanizovano ili humano antitelo. "Humano" antitelo ili funkcionalni fragment humanog antitela definiše se kao antitelo ili fragment antitela koji nije himeran (npr., nije "humanizovan") i ne potiče (u celini ili delom) iz nehumanih vrsta. Humano antitelo ili funkcionalni fragment antitela može biti poreklom iz čoveka ili može biti sintetsko humano antitelo. "Sintetsko humano antitelo" se ovde definiše kao antitelo koje ima sekvencu izvedenu, u celini ili delom, in silico iz sintetskih sekvenci baziranih na analizi poznatih sekvenci humanih antitela. In silico dizajniranje sekvence humanog antitela ili njegovog fragmenta može da se postigne na primer, analiziranjem baze podataka sekvenci humanih antitela ili fragmenata antitela i konstruisanjem polipeptidne sekvence upotrebom tako dobijenih podataka. Drugi primer humanog antitela ili funkcionalnog fragmenta antitela je antitelo ili fragment antitela kodiran nukleinskom kiselinom izolovanom iz biblioteke sekvenci antitela humanog porekla (tj., biblioteke bazirane na antitelima uzetim iz prirodnog humanog izvora).

[0021] "Humanizovano antitelo" ili funkcionalni fragment humanizovanog antitela definiše se u ovom tekstu kao antitelo ili fragment antitela koje je (i) izvedeno iz nehumanog izvora (npr., transgeni miš koji nosi heterologi imunski sistem), koje je antitelo bazirano na sekvenci humane germinativne linije; ili (ii) himerno, pri čemu je varijabilni domen nehumanog porekla, a konstantni domen je humanog porekla ili (iii) CDR-graftovano, pri čemu su CDR varijabilnog domena nehumanog porekla, dok su jedan ili više okvira varijabilnog domena humanog porekla i konstantni domen (ako postoji) je humanog porekla.

[0022] Izraz "himerno antitelo" ili funkcionalni fragment himernog antitela definiše se u ovom tekstu kao molekul antitela koje ima konstantne regione izvedene, ili koji odgovaraju, sekvencama nađenim u jednoj vrsti i varijabilne regione poreklom iz druge vrste. Poželjno, konstantni regioni antitela izvedeni su ili odgovaraju sekvencama koje se nalaze kod ljudi, npr. u humanoj germinativnoj liniji ili somatskim ćelijama, a varijabilni regioni antitela (npr. VH, VL, CDR ili FR regioni) izvedeni su iz sekvenci koje se nalaze u nehumanoj životinji, npr. u mišu, pacovu, zecu ili hrčku.

[0023] U jednom aspektu, vezivanje antigena može da se izvede "fragmentima" intaktnog antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih izrazom "fragment antitela" uključuju Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL i CH1 domena; F(ab)2 fragment, bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta

1

spojena disulfidnim mostom u regionu zgloba; Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne ručice antitela; fragment jednodomenskog antitela (dAb) (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), koji se sastoji od VH domena; i izolovani region koji određuje komplementarnost (complementary determining region, CDR).

[0024] "Jednolančani fragment" (single chain fragment, scFv) je jedan proteinski lanac u kojem se VL i VH regioni sparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); vidi, npr., Bird et al., (1988) Science 242:423-426; i Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Iako su dva domena, VL i VH, kodirana zasebnim genima, oni, korišćenjem rekombinantnih metoda, mogu da se spoje veštačkim peptidnim linkerom, što omogućava da se sintetišu u vidu jednog proteinskog lanca. Takva jednolančana antitela uključuju jednu ili više antigen-vezujućih komponenti. Ovi fragmenti antitela dobijaju se korišćenjem konvencionalnih tehnika poznatih stručnjacima u oblasti, a skrining fragmenata u pogledu njihove korisnosti vrši se na isti način kao i za intaktna antitela.

[0025] Izraz "izolovano" odnosi se na jedinjenje koje može biti, npr., antitelo ili fragment antitela, koji suštinski ne sadrži druga antitela ili fragmente antitela sa različitim antigenskim specifičnostima. Pored toga, izolovano antitelo ili fragment antitela može da suštinski ne sadrži drugi ćelijski materijal i/ili hemikalije.

[0026] Izraz "monoklonsko antitelo", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na pripremanje molekula antitela jednomolekulskog sastava. Smeša monoklonskog antitela pokazuje jedinstveno vezujuće mesto koje ima jedinstvenu vezujuću specifičnost i afinitet za određene epitope.

[0027] Kako se koristi u ovom tekstu, antitelo se "vezuje specifično za", "specifično vezuje za", je "specifično za" ili "specifično prepoznaje" antigen (ovde, IL17C) ukoliko takvo antitelo može da napravi razliku između tog antigena i jednog ili više referentnih antigena, jer vezujuća specifičnost nije apsolutna nego relativna osobina. Referentni antigen ili antigeni mogu biti predstavljeni jednim ili većim brojem blisko srodnih antigena koji se koriste kao referentne tačke, npr. IL17A ili IL17B. U svom najopštijem obliku (i kada se ne pominje definisana referenca), "specifično vezivanje" se odnosi na sposobnost antitela da prepozna razliku između antigena od interesa i nesrodnog antigena, što se određuje, na primer, prema jednom od sledećih metoda. Ti metodi uključuju, ali se ne ograničavaju na Western blot, ELISA-, RIA-, ECL-, IRMA-testove i skenove peptida. Na primer, može da se obavi standardni ELISA test. Ocenjivanje može da se obavi standardnim razvijanjem boje (npr. sekundarno antitelo sa peroksidazom rena i tetrametil benzidin sa vodonik peroksidom). Reakcija u određenim bunarčićima procenjuje se preko optičke gustine, na primer na 450 nm. Tipičan pozadinski signal (=negativna reakcija) može iznositi 0.1 OD; tipična pozitivna reakcija može iznositi 1 OD. To znači da razlika pozitivno/negativno može biti veća od 10 puta. Tipično, određivanje vezujuće specifičnosti obavlja se korišćenjem ne samo jednog referentnog antigena, nego seta od oko tri do pet nesrodnih antigena, kao što su mleko u prahu, BSA, transferin ili slično. Pored toga, "specifično vezivanje" može da se odnosi na sposobnost antitela da prepozna razliku između različitih delova svog ciljnog antigena, npr. različitih domena ili regiona IL17C ili receptora za IL17C, ili između jedne ili više ključnih aminokiselinskih rezidua ili nizova aminokiselinskih rezidua IL17C ili receptora za IL17C.

[0028] "Unakrsno kompetira" označava sposobnost antitela, fragmenta antitela ili druge antigen-vezujuće komponente da interferira sa vezivanjem drugih antitela, fragmenata antitela ili antigen-vezujućih komponenti za specifičan antigen u standardnom testu kompetitivnog vezivanja. Sposobnost ili mera u kojoj antitelo, fragment antitela ili druge antigen-vezujuće komponente mogu da interferiraju sa vezivanjem drugog antitela, fragmenta antitela ili antigen-vezujuće komponente za specifični antigen, a na taj način i da li se može reći da ono unakrsno kompetira u skladu sa pronalaskom, može se odrediti korišćenjem standardni testova kompetitivnog vezivanja. Jedan pogodan test podrazumeva korišćenje Biacore tehnologije (npr. BIAcore 3000 instrumenta (Biacore, Uppsala, Sweden)), kojom se može odrediti mera interakcije, korišćenjm tehnologije rezonance površinskog plazmona. Drugi test za merenje unakrsne kompeticije koristi pristup zasnovan na ELISA. Visokopropusni postupak "epitopskog binovanja" antitela, baziran na njihovoj unakrsnoj kompeticiji opisan je u Međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2003/48731. Unakrsna kompeticija prisutna je ako antitelo ili fragment antitela koji se ispituje, smanjuje vezivanje jednog od antitela opisanih u Tabeli 1 za IL17C za 60% ili više, specifično za 70% ili više i specifičnije za 80% ili više, i ako jedno od antitela opisanih u Tabeli 1 smanjuje vezivanje pomenutog antitela ili fragmenta antitela za IL17C za 60% ili više, specifično za 70% ili više i specifičnije za 80% ili više.

[0029] Izraz "epitop" uključuje svaki region proteina koji može da bude specifično prepoznat imunoglobulinom ili T-ćelijskim receptorom ili da na drugi način interaguje sa molekulom. Uopšteno, epitopi su hemijski aktivne površinske grupacije molekula kao što su amino-kiseline ili ugljenohidratni ili šećerni bočni lanci i obično mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Kao što će stručnjak u oblasti moći da prepozna, epitop može biti praktično bilo šta za šta se antitelo može specifično vezati. Epitop može da sadrži one rezidue za koje se antitelo vezuje i može biti "linearan" ili "konformacioni". Izraz "linearni epitop" odnosi se na epitop u kojem se sve tačke interakcije između proteina i interagujućeg molekula (kao što je antitelo) nalaze linearno duž primarne aminokiselinske sekvence proteina (kontinuirano). Izraz "konformacioni epitop" odnosi se na epitop sačinjen od diskontinuiranih amino-kiselina međusobno približenih tako da formiraju trodimenzonalnu konformaciju. U konformacionom epitopu, tačke interakcije nalaze se na aminokiselinskim reziduama proteina, koje su odvojene jedna od druge.

[0030] "Vezuje se za isti epitop kao" označava sposobnost antitela, fragmenta antitela ili druge antigen-vezujuće komponente da se veže za specifični antigen i da ima isti epitop kao antitelo dato kao primer. Epitopi antitela datog kao primer i drugih antitiela mogu da se odrede korišćenjem tehnika mapiranja epitopa. Tehnike mapiranja epitopa dobro su poznate u oblasti. Na primer, konformacioni epitopi se lako identifikuju određivanjem prostorne konformacije amino-kiselina, npr., razmenom vodonik/deuterijum, kristalografijom x-zraka i dvodimenzionalnom nukelusnom magnetnom rezonancom.

[0031] Isto tako, kako se koristi u ovom tekstu, "imunoglobulin" (Ig) se definiše kao protein koji pripada klasi IgG, IgM, IgE, IgA ili IgD (ili bilo kojoj njihovoj potklasi), i uključuje sva uobičajeno poznata antitela i njihove funkcionalne fragmente. "Funkcionalni fragment" antitela/imunoglobulina se, prema tome, definiše kao fragment antitela/imunoglobulina (npr., varijabilni region IgG), koji zadržava antigen-vezujući region. "Antigen-vezujući region" antitela se tipično nalazi u jednom ili više hipervarijabilnih regiona antitela, tj., regionima CDR-1, -2, i/ili -3; međutim, varijabilni "okvirni" regioni takođe mogu imati važnu ulogu u vezivanju antigena, na primer tako što obezbeđuju skafold za CDR. Poželjno, "antigen-vezujući region" uključuje bar amiokiselinske rezidue 4 do 103 varijabilnog regiona lakog (variable light, VL) lanca i

1

5 do 109 varijabilnog regiona teškog (variable heavy, VH) lanca, poželjnije aminokiselinske rezidue 3 do 107 VL i 4 do 111 VH, i posebno poželjno, to su kompletni VL i VH lanci (aminokiselinske pozicije 1 do 109 VL i 1 do 113 VH; numerisanje po WO 97/08320). Poželjna klasa imunoglobulina za korišćenje u predmetnom pronalasku je IgG klasa. "Funkcionalni fragmenti" pronalaska uključuju domen F(ab’)2 fragmenta, Fab fragment, scFv ili konstrukte koji sadrže pojedinačne imunoglobulinske varijabilne domene ili polipeptide jednodomenskih antitela, npr. pojedinačne teškolančane varijabilne domene ili pojedinačne lakolančane varijabilne domene. F(ab’)2 ili Fab mogu biti inženjerisani tako da se na najmanju meru svedu ili potpuno uklone međumolekulske disulfidne interakcije koje se nalaze između CH1 i CL domena.

[0032] Antitelo za upotrebu prema pronalasku može biti izvedeno iz biblioteke rekombinantnih antitela bazirane na aminokiselinskim sekvencama koje su bile dizajnirane in silico i kodirane nukleinskim kiselinama koje su kreirane veštačkim putem.

In silico dizajniranje sekvence antitela postiže se, na primer, analiziranjem baze podataka humanih sekvenci i osmišljavanjem polipeptidne sekvence upotrebom tako dobijenih podataka. Metodi dizajniranja i dobijanja sekvenci kreiranih in silico, opisani su, na primer, u Knappik et al., J. Mol. Biol. (2000) 296:57; Krebs et al., J. Immunol. Methods. (2001) 254:67, Rothe et al., J. Mol. Biol. (2008) 376:1182; i U.S. patentu br.

6,300,064 za Knappik et al., koji su ovde inkorporisani u celini kao reference.

[0033] Svako antitelo specifično za IL17C i koje blokira vezivanje IL17C za IL17RE može da se koristi sa predmetnim pronalaskom. Neki primeri antitela stanja tehnike specifičnih za IL17C uključuju antitela kao što su

A: pacovsko IgG2Amonoklonsko antimišje IL17C antitelo (R&D Systems; klon 311522,# MAB23061),

B: pacovsko IgG2Amonoklonsko antimišje IL17C antitelo (R&D Systems; klon 311523,# MAB2306), i

C: pacovski antimišji IL17C (US Biological; klon: 8B28, #I8439-20R3) (uzeto iz Primera 4).

[0034] Druga antitela stanja tehnike uključuju anti-IL17C antitela koja se mogu nabaviti od Abnova (Walnut, CA, USA; katal. #H00027189-B01P, #H00027189-D01 i #H00027189-D01P) i anti-IL17C antitela koja se mogu nabaviti od antibodies-online GmbH (Aachen, Germany; katal. #ABIN525892, #ABIN327411, #ABIN525893, #ABIN221340, #ABIN221341, #ABIN221342 i #ABIN525891). Druga antitela specifična za IL17C, koja mogu da se koriste sa predmetnim pronalaskom su ona izolovana i opisana u predmetnom pronalsku tj. ona navedena u Tabeli 1.

[0035] Smeše objave mogu da se koriste u terapijske ili profilaktičke svrhe. Objava, prema tome, uključuje farmaceutske smeše koje sadrže antitelo pronalaska (ili funkcionalni fragment antitela) i farmaceutski prihvatljivi nosač ili ekscipijent za njega. U srodnom aspektu, objava obezbeđuje metod lečenja zapaljenskog poremećaja. Taj metod sadrži korake primene, kod subjekta kojem je to potrebno, efikasne količine farmaceutske smeše koja sadrži antitelo pronalaska, kako je opisano ili se razmatra u ovom tekstu.

[0036] U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje metode lečenja zapaljenskog poremećaja kod subjekta, pomenuti metod uključuje korak primene antagonista IL17C kod pomenutog subjekta. "Subjekt", kako se koristi u ovom kontekstu, odnosi se na bilo kojeg sisara, uključujući glodare, kao što su miš ili pacov, i primate, kao što su cinomolgus majmun (Macaca fascicularis), rezus majmun (Macaca mulatta) ili čovek (Homo sapiens). Poželjno, subjekt je primat, najpoželjnije čovek.

[0037] U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje metode lečenja zapaljenskog poremećaja, pomenuti metod uključuje korak primene, kod subjekta, antagonista IL17C, pri čemu pomenuti antagonist IL17C može da se vezuje za IL17C sa afinitetom od oko manje od 100 nM, poželjnije manje od oko 60 nM, i još poželjnije, manje od oko 30 nM. Poželjna su još i antitela ili fragmenti antitela koji se vezuju za IL17C sa afinitetom manjim od oko 10 nM, i poželjnije manjim od oko 3 nM.

[0038] U određenim aspektima, pomenuti IL17C antagonist je antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C i pomenuto antitelo ili fragment antitela može da unakrsno reaguje sa IL17C iz drugih vrsta, na primer IL17C iz miša, pacova, rezus majmuna i/ili

1

cinomolgus majmuna. U određenim aspektima, pomenuto IL17C antitelo ili fragment antitela je izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C. U drugom primeru izvođenja, pomenuto izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C je monoklonsko antitelo ili fragment antitela. U još jednom primeru izvođenja, pomenuto izolovano antitelo ili fragment antitela je izolovano monoklonsko antitelo specifično za polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.: 181. U još jednom primeru izvođenja, pomenuto izolovano monoklonsko antitelo ili fragment antitela je izolovano monoklonsko antitelo specifično za polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID No.: 181. U još jednom primeru izvođenja, pomenuto izolovano monoklonsko antitelo ili fragment antitela može da unakrsno reaguje sa IL17C iz drugih vrsta, kao što je IL17C iz miša, pacova, rezus majmuna i/ili cinomolgus majmuna.

[0039] U određenim aspektima, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C je humano, humanizovano ili himerno antitelo. U određenim aspektima, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C je humano sintetsko antitelo. U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo ili fragment antitela specifičan za polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.: 181, pri čemu je pomenuto antitelo ili fragment antitela humano, humanizovano ili himerno antitelo. U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano monoklonsko antitelo ili fragment antitela specifičan za polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID No.: 181, pri čemu je pomenuto antitelo ili fragment antitela humano, humanizovano ili himerno antitelo. U određenim aspektima, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za polipeptid koji se sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID No.: 181 je humano sintetsko antitelo ili fragment antitela.

[0040] U određenom aspektu, predmetna objava obezbeđuje smešu koja sadrži antagonist IL17C, koji može da antagonizuje IL17C u zapaljenskom poremećaju, pomenuta smeša uključuje još i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača i/ili razblaživača. U određenim aspektima, antagonisti IL17C, kao što su antitela specifična za IL17C, mogu antagonizovati svaku od uloga IL17C u zapaljenskom poremećaju.

[0041] U sledećem aspektu, predmetna objava obezbeđuje metod profilakse zapaljenskog poremećaja kod subjekta, pomenuti metod uključuje primenu antagonista

1

IL17C kod pomenutog subjekta. "Profilaksa", kako se koristi u ovom kontekstu, odnosi se na metode koji za cilj imaju prevenciju uspostavljanja bolesti ili koji odlažu otpočinjanje bolesti.

[0042] U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje smešu koja sadrži antagonist IL17C koristan za lečenje zapaljenskog poemećaja, pomenuta smeša uključuje još i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih prenosnika i/ili razblaživača.

[0043] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu u lečenju zapaljenskog poremećaja, pomenuti zapaljenski poremećaj je zapaljenje pluća, reumatoidni artritis i/ili COPD (hronična opstruktvna bolest pluća), gde se IL17C sastoji od aminokiselina SEQ. ID No.: 181, i gde pomenuto antitelo blokira vezivanje IL17C za IL17RE.

[0044] U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje upotrebu antagonista IL17C u pripremanju leka za lečenje zapaljenskog poremećaja.

[0045] U drugim aspektima, predmetna objava obezbeđuje metod lečenja zapaljenskog poremećaja kod subjekta, koji uključuje primenu, kod subjekta, antagonista IL17C.

[0046] U posebnim aspektima, antagonisti IL17C predmetnog pronalaska primenjuju se subkutano. U drugim aspektima, antagonisti IL17C predmetnog pronalaska primenjuju se intravenski, intrartikularno ili intraspinalno.

[0047] Smeše predmetne objave su, poželjno, farmaceutske smeše koje sadrže antagonist IL17C i farmaceutski prihvatljivi nosač, razblaživač ili ekscipijent, za lečenje zapaljenskog poremećaja. Takvi nosači, razblaživači i ekscipijenti dobro su poznati u struci i stručnjak u oblasti naći će formulaciju i put primene koji najbolje odgovaraju lečenju subjekta antagonistima IL17C predmetnog pronalaska.

[0048] U određenim aspektima, predmetna objava obezbeđuje metod lečenja i profilakse zapaljenskog poremećaja kod subjekta, koji se sastoji od koraka primene, kod subjekta, efikasne količine antagonista IL17C. U određenim aspektima objave, pomenuti subjekt je čovek. U alternativnim aspektima objave, pomenuti subjekt je glodar, na primer pacov ili miš.

[0049] U određenim aspektima objave, pomenuti antagonist IL17C je antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C. U određenim aspektima objave, pomenuti antagonist je antitelo ili fragment antitela specifičan za polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.: 181. U alternativnim aspektima objave,

1

pomenuti antagonist IL17C je antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL17C.

[0050] U određenim aspektima pronalaska, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C blokira vezivanje IL17C za receptor za IL17C. U alternativnim aspektima objave, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL17C blokira vezivanje IL17C za receptor za IL17C.

[0051] Pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C blokira vezivanje IL17C za receptor za IL17C, pri čemu je pomenuti receptor IL17RE. U alternativnim aspektima objave, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL17C blokira vezivanje IL17C za IL17RE.

[0052] U određenim aspektima, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C blokira vezivanje IL17C za IL17RE sa IC50koncentracijom manjom od 100 nM, 90 nM, 80 nM, 70 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 9 nM, 8 nM, 7 nM, 6 nM, 5 nM, 4 nM, 3 nM, 2 nM, 1 nM, 100 pM, 90 pM, 80 pM, 70 pM, 60 pM, 50 pM, 40 pM, 30 pM, 20 pM, 10 pM, 9 pM, 8 pM, 7 pM, 6 pM, 5 pM, 4 pM, 3 pM, 2 pM ili 1 pM. U određenim aspektima, IC50koncentracija može da se odredi pomoću ELISA; SET, FACS ili MSD (Meso Scale Discovery).

[0053] U određenim aspektima objave, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C blokira vezivanje IL17C za jedan ili više receptora za IL17C. U alternativnim aspektima objave, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL17C blokira vezivanje IL17C za receptore za IL17C, pri čemu receptori IL17 uključuju IL17RE i IL17RA. U alternativnim aspektima objave, pomenuto antitelo ili fragment antitela specifičan za receptor za IL17C blokira vezivanje IL17C za IL17RE i IL17RA.

[0054] U određenim aspektima, predmetni pronalazak obezbeđuje antagonist IL17C za upotrebu u lečenju zapaljenja, kako je definisano u patentnim zahtevima. U određenim aspektima, pomenuto lečenje uključuje korak primene, kod subjekta, efikasne količine antagonista IL17C. U određenim aspektima, pomenuti subjekt je čovek. U alternativnim aspektima subjekt je glodar, na primer pacov ili miš.

[0055] U sledećem aspektu, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji unakrsno kompetira sa antitelom opisanim u Tabeli 1. U određenom primeru izvođenja, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili

1

njegov fragment koji unakrsno kompetira sa antitelom koje sadrži 6 CDR jednog od antitela opisanih u Tabeli 1. U određenom primeru izvođenja, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji unakrsno kompetira sa antitelom opisanim u Tabeli 1 i smanjuje specifično vezivanje jednog od antitela opisanih u Tabeli 1 za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% u ELISA-baziranoj unakrsnoj kompeticiji. U određenom primeru izvođenja, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji unakrsno kompetira sa antitelom opisanim u Tabeli 1 i smanjuje specifično vezivanje jednog od antitela opisanih u Tabeli 1 za IL17C za najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% u ELISA-baziranoj unakrsnoj kompeticiji.

[0056] U sledećem aspektu, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji interaguje sa (npr., vezivanjem, stabilisanjem, prostornom distribucijom) istim epitopom kao antitelo opisano u Tabeli 1.

[0057] U jednom aspektu, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji sadrži 6 CDR definisanih po Kabat-u, bilo kojeg od antitela iz Tabele 1. U sledećem aspektu, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji sadrži 6 CDR definisanih po Kabat-u,, svakog od antitela u Tabeli 1.

[0058] U jednom aspektu, objava se odnosi na izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment koji sadrži VH i VL bilo kojeg od antitela iz Tabele 1.

[0059] U sledećem aspektu, objava se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment, gde nukleinska kiselina sadrži VH iVL bilo kojeg od antitela iz Tabele 1.

[0060] U sledećem aspektu, objava se odnosi na nukleinsku kiselinu koja kodira izolovano monoklonsko antitelo ili njegov fragment sa najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% sekvencione identičnosti sa nukleinskim kiselinama opisanim u Tabeli 1.

[0061] Stručnjaci u oblasti prepoznaće da je pronalazak opisan u ovom tekstu podložan varijacijama i modifikacijama različitim od onih koje su ovde opisane.

Tabela 1.

1

2

2

2

2

2

2

2

1

2

Primer 1: Mišji IL17C

[0062] Mišji IL17C nabavljen je od R&D Systems (#2306-ML/CF; R&D Systems, Inc., Minneapolis, USA). Biotinisani mišji IL17C priprema se korišćenjem ECLTM

4

biotinizacionog modula (GE Healthcare; #1061918). Posle biotinisanja, proizvod se prečišćava korišćenjem ZebaTM Desalt spin-kolona (Pierce; #89889).

[0063] Kontrola kvaliteta biotinisanog IL17C vrši se korišćenjem dinamičkog rasipanja svetlosti (dynamic light scattering, DLS), ekskluzione hromatografije (SEC) i SDS-PAGE. Prema očekivanju, SDS-PAGE pokazuje izmerenu molekulsku težinu od oko 22 kDa pod redukujućim uslovima i oko 40 kDa pod neredukujućim uslovima. Pored toga nisu mogle biti registrovane vrste ni agregati velike molekulske težine. Pretpostavljena veličina antigena potvrđena je u SEC, gde je biotinisani mišji IL17C bio vidljiv kao pik sa molekulskom težinom od oko 43 kDa. U DLS, nisu mogli da se detektuju agregati. Dodatno je potvrđeno da je mišji IL17C kvantitativno biotinisan.

[0064] Za testove selekcionisanja ("panning") i testove vezivanja korišćen je samo materijal koji prošao kontrolu kvaliteta.

Primer 2: Mišji IL17 receptor E

[0065] Vanćelijski domen (extracellular domain, ECD) mišjeg IL-17 receptora E (GeneID: 57890, izoforma 1) kloniran je kao C-terminalni Fc fuzioni protein (označen kao "IL17RE/Fc"). Konstrukt koji sadrži vκ-lider praćen ECD mišjeg IL17C prolazno se eksprimira u HKB11 ćelijama (Cho et al. (2002) J. Biomed Sci. Nov-Dec; 9 (6 Pt 2):631-8). Proizvod se prečisti afinitetnom hromatografijom na proteinu A. Čistoća se analizira pod denaturišućim redukujućim i denaturišućim neredukujućim uslovima u SDS-PAGE i u nativnom stanju, pomoću visokopritisne-SEC i DLS.

Primer 3: Test interakcije IL17C-IL17 receptor E

[0066] Da bi se ispitalo vezivanje mišjeg IL17 za njegov pretpostavljeni receptor, postavlja se test interakcije sa IL17 receptorom E. Postavka testa je prikazana na Slici 1A. Ukratko, IL17 receptori B i E nanesu se na Multi-array® Standard ploču sa 384 bunarčića (Meso Scale Discovery; #L21XA-4) i doda se biotinisani mišji IL17C. Vezivanje mišjeg IL17C za receptor meri se preko vezivanja streptavidina, pomoću MSD Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA).

[0067] Rezultati su prikazani na Slici 1B. Jasno je pokazano da se IL17C vezuje za mišji IL17RE/Fc, ali ne i za mišji IL-17RB ili drugi irelevantni receptor. Isto tako, irelevantni biotinisani ligand se ne vezuje za neki od tri ispitivana receptora. Test interakcije je, prema tome, visoko specifičan i pogodan za analizu interakcija IL17C-IL17 receptor E.

Primer 4: Efekat antitela stanja tehnike na interakciju IL17C-IL17 receptor E

[0068] Testom interakcije iz Primera 3 testirana je sposobnost tri antitela stanja tehnike da inhibiraju vezivanje mišjeg IL17C za mišji IL17RE/Fc. Testirana su sledeća antitela:

A: pacovsko IgG2Amonoklonsko antimišje IL17C antitelo (R&D Systems; klon 311522, # MAB23061)

B: pacovsko IgG2Amonoklonsko antimišje IL17C antitelo (R&D Systems; klon 311523, # MAB2306)

C: pacovsko antimišje IL17C (US Biological; kon: 8B28, #I8439-20R3)

[0069] Antitela su preinkubirana sa biotinisanim mišjim IL17C i preformirani kompleks je zatim dodat oblozi od mišjeg IL17RE/Fc.

[0070] Rezultati su prikazani na Slici 1C. Nijedno od antimišjih IL17C antitela stanja tehnike nije pokazalo nikakav efekat na vezivanje mišjeg IL17C za njegov receptor IL17RE/Fc.

Primer 5: Strategija selekcionisanja ("panning" strategija)

[0071] HuCAL PLATINUM® biblioteka koristi se za selektovanje Fab fragmenata specifičnih za mišji IL17C. Ova fagemidna biblioteka bazirana je na HuCAL® konceptu objavljenom u Knappik et al. (Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol.296:57-86) i koristi CysDisplay® tehnologiju za prikazivanje Fab na površini faga (Lohning et al., WO2001/05950).

[0072] Sprovedene su različite strategije odabiranja, selekcionisanje u rastvoru, uključujući različite strategije maturacije, kao i konvencionalno selekcionisanje na čvrstoj fazi. Za selekcionisanje na čvrstoj fazi, mišji IL17C se direktno nanese na MaxisorpTM Immuno ploče (Nunc; #442404). Za selekcionisanje na čvrstoj fazi izvode se ukupno tri kruga selekcije. Tri kruga selekcije izvode se uz sukcesivno povećavanje stringentnosti ispiranja i smanjenje koncentracije antigena iz kruga u krug. Za selekcionisanje u rastvoru, biotinisani antigen se izlaže biblioteci faga u rastvoru, uz posledično zadržavanje kompleksa fag-antigen na streptavidinskim perlicama. I ovde se izvode tri kruga selekcije, uz sukcesivno povećanje stringentnosti ispiranja i smanjenje koncentracije antigena iz kruga u krug. Fagi se izoluju korišćenjem magnetnih perlica kuplovnih sa streptavidinom (Invitrogen, #112-05D). Da bi se selektovala visokoafinitetna antitela, generišu se HCDR2 i LCDR3 biblioteke posle drugog kruga selekcije (prosečna veličina biblioteke ∼1x10<8>), posle čega slede još dva kruga selekcije, uz dodatno povećavanje stringentnosti i dodatno smanjenje koncentracija antigena.

Primer 6: Inicjalna karakterizacija materijala dobijenog selekcionisanjem pomoću ELISA

[0073] Da bi se olakšala brza ekspresija solubilnih Fab fragmenata u sirovim bakterijskim lizatima, periplazmatski ekstrakti se pripremaju kako je ranije opisano (Rauchenberger et al. (2003) J. Biol. Chem. 278.40: 38194-205). Lizati E. coli, koji sadrže Fab koriste se za ELISA skrining inicijalnih pogodaka.

[0074] Specifičnost vezivača ispituje se ELISA skriningom, na direktno nanetom antigenu ili na biotinisanom antigenu. Za ELISA skrining na direktno nanetom antigenu, Maxisorp™ ploče sa 384 bunarčića (Nunc; #460518) oblože se sa 2.5 μg/ml mišjeg IL17C u PBS. Posle blokiranja ploča 5% obranim mlekom u prahu u PBS, dodaju se Fab- sadržavajući lizati E. coli. Vezivanje Fab detektuje se pomoću F(ab)2specifičnog kozjeg antihumanog IgG konjugovanog sa alkalnom fosfatazom (razblaženje 1:5000), uz koiršćenje Attophos fluorescentnog supstrata (Roche: #11681982001). Fluorescentna emisija na 535 nm registruje se pomoću ekscitacije na 430 nm. Za ELISA skrining na biotinisanom antigenu, Maxisorp™ ploče sa 384 bunarčića oblože se Fd fragmentima specifičnog ovčjeg antihumanog IgG (Binding site, #PC075), razblaženog 1:1000 u PBS. Posle blokiranja 5% obranim mlekom u prahu u PBS, dodaju se Fab-sadržavajući E. coli lizati. Zatim se zadržani HuCAL®-Fab fragmenti ostave da se vežu za 1 μg/ml biotinisanog mišjeg IL17C, što se detektuje inkubiranjem sa streptavidinom konjugovanim sa alkalnom fosfatazom, posle čega sledi dodavanje AttoPhos fluorescentnog supstrata (Roche: #11681982001). Fluorescentna emisija na 535 nm beleži se pomoću ekscitacije na 430 nm. Ovim ELISA testovima bilo je testirano skoro 9000 Fab fragmenata izolovanih u postupku selekcionisanja i oko 2900 ih bilo je pozitivno u svim ELISA testovima.

Primer 7: Karakterizacija vezivača korišćenjem testa interakcije IL17C-IL17 receptor E

[0075] Da bi se testirala neutrališuća aktivnost Fab-sadržavajućih sirovih bakterijskih lizata u visokopropusnom skriningu, koristi se blago modifikovani test opisan u Primeru 3. Maxisorp™ 384 MSD ploče sa 384 bunarčića (Nunc; #460518) oblože se sa 30 μl mišjeg IL17RE/Fc, u koncentraciji od 0.6 μg/ml u PBS, preko noći, na 4 °C. Sledećeg dana, 20 μl Fab-sadržavajućih E. coli lizata preinkubira se 30 min na RT (room temperature, sobna temperatura) sa jednakom zapreminom biotinisanog mišjeg IL17C, u koncentraciji od 2 nM. Posle blokiranja ploča korišćenjem 5% BSA u PBS, u trajanju od 1h, nanetim IL17RE/Fc dodaju se preformirani kompleksi antitelo-ligand, 1h, i vezivanje za receptor detektuje se pomoću Streptavidin-ECL uz korišćenje MSD Sector Imager 6000 (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD, USA).

[0076] Da bi se odredila inhibitorna aktivnost prečišćenog anti-IL17C humano-mišjeg himernog IgG2a u mlL-17 RE testu interakcije, Maxisorp™ MSD ploče sa 384 bunarčića oblože se sa 30 μl mišjeg IL17RE/Fc, u koncentraciji od 75 ng/ml u PBS, na 4 °C, preko noći. Sledećeg dana, po 25 μl serijskih razblaženja antitela (koncentracije od 0.001 do 100 nM) preinkubira se 30 min na RT sa jednakom zapreminom biotinisanog mišjeg IL17C, u koncentraciji od 0.125 nM. Posle blokiranja ploča sa 2.5% BSA u PBST u trajanju od 1h, nanetim IL17RE/Fc dodaju se preformirani kompleksi antitelo-ligand, 1h, i vezivanje receptora se detektuje pomoću streptavidin-ECL uz korišćenje MSD Sector Imager.

[0077] Od svih ELISA-pozitivnih vezivača, test interakcije IL17C-IL17 receptor E, praćen sekvenciranjem pozitivnih klonova, otkrio je samo 141 sekvenciono jedinstven klon koji je pripadao 33 različitim HCDR3 familijama. Ovaj broj je ponovo smanjen konfirmatornim skriningom u ELISA i testu inhibicije mišjeg IL17RE/Fc. Da bi se izvršila selekcija kandidata sa najboljom inhibitornom aktivnošću, BEL lizati se prethodno razblaže do 1:500, da bi se koristili u IL17RE/Fc testu inhibicije. Na kraju, moglo se identifikovati 18 sekvenciono identičnih klonova koji su bili pripadnici 8 različitih HCDR3 familija, i koji su konzistentno i ponavljajuće bili pozitivni u IL17C-IL17 receptor E testu interakcije.

Primer 8: Poliklonska IgG konverzija

[0078] Konverzija Fab fragmenata u IgG format obavljena je poliklonskim kloniranjem Fab fragmenata u željeni IgG format. Humano-mišji himerni IgG format korišćen je da bi se izbegle imunogene reakcije uperene protiv primenjenih antimišjih IL17C antitela u in vivo dokazu konceptne studije sa miševima divljeg tipa. Korišćena su dva različita konstantna regiona - IgG2a i IgG1 izotipa. Potencijalna N-vezujuća glikozilaciona mesta uklonjena su putem usmerene mutageneze uz korišćenje QuickChange II kita za usmerenu mutagenezu (Stratagene; #0200524). Sekvenciona raznovrsnost svih IgG dobijenih u ovom postupku prikazana je u Tabeli 1.

Primer 9: Proizvodnja IgG u eksploratornom obimu

[0079] Svi IgG dobijeni u postupku opisanom u Primeru 8 proizvedeni su u eksploratornom obimu u HKB11 ćelijama (Cho et al. (2002) J. Biomed Sci. Nov-Dec; 9 (6 Pt 2):631-8), u himernom humano/mišjem IgG2a i himernom humano/mišjem IgG1 izotipskom formatu, da bi se procenili proizvodni prinosi i monomerni delovi antitela sa dva različita konstantna regiona. Antitela proizvedena u najvećoj količini bila su antitela himernog humano/mišjeg IgG2a formata. Ovaj format je takođe uspešno prošao kontrolu kvaliteta u SEC (> 90% sadržaj monomera). Himerni humano/mišji IgG2a format je zato odabran za dalje funkcionalno ispitivanje. Prinos prečišćavanja i deo monomera, kako je određeno u SEC, pokazani su na Slici 2.

Primer 10: Određivanje afiniteta

[0080] Sva prečišćena himerna humano-mišja IgG2a antitela titrovana su na mišjem IL17C, za određivanje EC50u ELISA, počevši od koncentracije od 100 nM. EC50vrednosti na mišjem IL17C određivane su u 1 do 3 nezavisna eksperimenta. Rezultati su prikazani na Slici 3.

[0081] EC50vrednosti bile su u rasponu od 200 do 1200 pM, sa najvećim brojem EC50vrednosti oko 300 pM. Vezujuća aktivnost 4 IgG (MOR12755, MOR12756, 12757, 12758) nije mogla da bude potvrđena korišćenjem prečišćenog IgG2a, zato su ovi IgG isključeni iz dalje karakterizacije. Nijedno od antitela nije pokazalo unakrsnu reaktivnost sa humanim IL17C (identičnost sekvenci 77%), sa mišjim IL-17B (identičnost sekvenci 30%) ili sa negativnim kontrolnim antigenom lizozimom.

[0082] Monovalentni afiniteti anti-IL17C antitela određivani su titracijom u rastvoru (SET) korišćenjem Fab fragmenata. Određivanje afiniteta u rastvoru u osnovi je vršeno kako je opisano u literaturi (Friquet et al., (1985) J. Immunol. Meth.77: 305-19). Da bi se poboljšale senzitivnost i pouzdanost SET metoda, izvršen je transfer sa klasične ELISA tehnologije na tehnologiju baziranu na ECL (Haenel et al. (2005) Anal Biochem. 339.1: 182-84). Vezivači su eksprimirani i prečišćeni u Fab_FH formatu. Neki Fab nisu se ni vezivali, niti su pokazivali sigmoidnu krivu vezivanja u SET, prema tome, afiniteti su mogli da se odrede samo za 10 kandidata. Monovalentni afiniteti bili su u opsegu od 48 do 4100 pM, sa većinom KDvrednosti Fab u nižem pM opsegu (≤ 100 pM Greška! Referentni izvor nije nađen.). Rezultati su prikazani na Slici 4.

Primer 11: IL17C-IL17 receptor E test interakcije sa vezivačima u IgG formatu

[0083] Za detaljnije karakterisanje antitela u humano/mišjem IgG2a formatu, za svakog kandidata određivana je IC50vrednost u IL-17 receptor E testu inhibicije, kako je gore opisano, u do 4 nezavisna eksperimenta.

[0084] Rezultati su prikazani na Slici 5. Jedanaest od 12 IgG pokazalo je inhibitornu aktivnost, sa srednjim IC50vrednostima između 9 i 8442 pM. Devet od ovih 11 inhibitornih IgG imalo je IC50vrednosti u niskom pikomolarnom opsegu. Najbolji

4

kandidati pripadali su različitim HCDR3 familijama i bili su različitih VL podtipova (kapa ili lambda).

Primer 12: Stabilnost u mišjem serumu

[0085] Da bi se analiziralo da li su odabrana anti-mišja IL17C antitela pogodna za in vivo primenu kod miševa, stabilnost u mišjem serumu određivana je za podgrupu od 11 prečišćenih IgG koji su pokazali prihvatljive proizvodne prinose i specifično vezivanje za mišji IL17C (vidi ranije u ovom tekstu).

[0086] Maxisorp ploče sa 96 bunarčića (Nunc; #442404) oblože se avidinom u koncentraciji od 1 μg/ml, u PBS, preko noći, na 4 °C. Sledećeg dana, ant i-IL17 himerno IgG2a inkubira se u mišjem serumu, 24h na 37 °C, u finalnoj koncentraciji od 100 μg/ml. Posle koraka inkubacije, antitela se razblaže 1:100 LowCross puferom (Candor Bioscience; #100500). Kao referenca, isti set antitela se sveže razblaži u LowCross puferu 1% mišji serum i inkubira 30 min na RT. Avidinom obložene ploče se inkubiraju sa blokirajućim puferom (Superblock blokirajući pufer, Pierce, #37515) i zatim se blokiranim bunarčićima doda 100 μl 0.1 μg/ml biotin-IL17C u LowCross puferu. Posle koraka ispiranja, dodaju se serijska razblaženja serum-inkubiranih i sveže razblaženih IgG. Vezivanje IgG detektuje se anti-mišjim-IgG2a POD-konjugovanim detekcionim antitelom (razblaženje 1:5000 u LowCross puferu) uz korićenje TMB One Component HRP kao supstrata. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 1M HCI i apsorbanca se meri na 450 nm.

[0087] Sa izuzetkom jednog IgG kandidata (MOR12760) koji je pokazao samo umerenu stabilnost u serumu, sva druga antitela pokazala su veoma dobru stabilnost u mišjem serumu (koeficijent varijacije ≤ 20%), posle 24h inkubacije na 37 °C. Rezultati su prikazani na Slici 6.

Primer 13: Selekcija vezivača za in vivo dokaz konceptne studije

[0088] Na osnovu povoljnih osobina u odnosu na produktivnost, stabilnost, vezivanje i funkcionalnu aktivnost u IL-17RE receptor testu inhibicije i u NFkB reporter gen testu baziranom na ćelijama, MOR12743 i MOR12762 odabrani su kao kandidati za in vivo dokaz studije koncepta.

Primer 14: In vivo CIA model

14.1 Materijali

[0089] Kompletni Freund-ov adjuvans (CFA) i nekompletni Freund-ov adjuvans (IFA) nabavljeni su od Difco (MI, US). Goveđi kolagen tipa II (CII), lipopolisaharid (LPS) i enbrel nabavljeni su od MD Biosciences (Germany); Sigma (P4252, L’Isle d’Abeau, France), Whyett (25 mg injektabilni špric, France), respektivno. Svi drugi korišćeni reagensi bili su kvaliteta za reagense, a svi rastvarači bili su analitičkog kvaliteta.

14.2 Životinje

[0090] DBA1/J miševi (mužjaci, 6-7 nedelja stari, pribl.20 grama) dobijeni su iz Centre d’Elevage Regional Janvier (Laval, France). Miševi su držani na 12-časovnom dnevnonoćnom ciklusu (0700-1900). Temperatura je održavana na 22 °C, a voda i hrana su bile dostupne ad libitum.

14.3 Artritis indukovan kolagenom (CIA)

[0091] Jedan dan pre eksperimenta, rastvor CII (2 mg/ml) pripremljen je sa 0.05 M sirćetnom kiselinom i odložen na 4 ºC. Neposredno pre imunizacije, jednake zapremine adjuvansa (IFA) i CII pomešane su homogenizerom u prethodno ohlađenoj staklenoj boci, u ledenom vodenom kupatilu. Ako se ne formira emulzija, može biti potrebno dodati još adjuvansa i produžiti homogenizaciju. Emulzija u količini od 0.1 ml injektira se intradermalno u bazu repa svakog miša, na dan 1, druga pojačavajuća intradermalna injekcija (rastvor CII, 2 mg/ml, u CFA, 0.1 ml emulzije) daje se na dan 21. Ovaj metod imunizacije je modifikacija objavljenih metoda (Brand et al, 2007, Collagen-induced arthritis. Nature Protocols; vol 2 (5): 1269- 1275; Lin et al., 2007, Anti-rheumatic activities of histone deacetylase (HDAC) inhibitors in vivo in collagen-induced arthritis in rodents. Br J Pharmacol. Apr; 150 (7):829-31).

14.4 Dizajn studije

14.4.1 Terapijski protokol

[0092] Terapijski efekti antitela ispituju se na modelu CIA, kod miševa. Miševi se nasumično rasporede u jednake grupe i u svakoj grupi je 10 miševa. Svi miševi se imunizuju na dan 1, a pojačavajuću injekciju dobiju na dan 21. Terapijsko doziranje traje od dana 31 do dana 46. Negativna kontrolna grupa tretira se prenosnikom (PBS), a pozitivna kontrolna grupa enbrelom (10 mg/kg, 3x nedeljno., i.p.). Antitelo od interesa testira se u dozi od 10 mg/kg, i.p.3 puta nedeljno.

[0093] Prema tome, koristi se pet različitih grupa tretmana, pri čemu se svaka grupa sastoji od deset miševa.

Grupa 1: Prenosnik (PBS)

Grupa 2: Enbrel 10 mg/kg/3x nedeljno, i.p.

Grupa 3: MOR0320710 mg/kg/3 x nedeljno, i.p.

Grupa 4: MOR1274310 mg/kg/3 x nedeljno, i.p.

Grupa 5: MOR1276210 mg/kg/3 x nedeljno, i.p.

[0094] Anti-IL17C antitela se primenjuju i.p. tri puta nedeljno u dozi od 10 mg/kg. Uzorci krvi (pribl.250 μl) za farmakokinetičku analizu uzimaju se na dane 31 i 46.

14.4.2 Protokol za prevenciju

[0095] Preventivni efekti antitela testirani su u modelu CIA kod miševa. Miševi se nasumično rasporede u dve jednake grupe i u svakoj grupi je 20 miševa. Svi miševi se imunizuju na dan 1, a pojačavajuću injekciju dobijaju na dan 21. Profilaktičko doziranje traje od dana 21 do dana 46. Negativna kontrolna grupa se tretira negativnim antitelom

4

(MOR03207, 10 mg/kg, 3x nedeljno, i.p.) Antitelo od interesa (MOR12762) testira se u dozi od 10 mg/kg, 3x nedeljno, i.p.

[0096] Prema tome, koriste se dve različite grupe tretmana, pri čemu se svaka grupa sastoji od dvadeset miševa.

Grupa 1: MOR0320710 mg/kg/3 x nedeljno, i.p.

Grupa 2: MOR1276210 mg/kg/3 x nedeljno, i.p.

[0097] Anti-IL17C antitela primenjuju se i.p.tri puta nedeljno u dozi od 10 mg/kg. Uzorci krvi (pribl.250 μl) za farmakokinetičku analizu uzimaju se na dane 21, 36 i 46.

14.5 Klinička procena artritisa

[0098] Artritis se procenjuje prema metodima Khachigian 2006 (Collagen antibodyinduced arthritis. (2006) Nature Protocols 1, 2512-6), Lin et al 2007 (gore); Nishida et al. 2004 (Histone deacetylase inhibitor suppression of autoantibody-mediated arthritis in mice via regulation of p16INK4a and p21(WAF1/Cip1) expression. Arthritis Rheum.

10: 3365-76); i Brand et al. 2007 (gore). Otok na svakoj od četiri šape ocenjuje se artritisnim skorom na sledeći način: 0 - bez simptoma; 1 - blago ali jasno crvenilo i otok jednog tipa zgloba, npr. članak zadnje noge ili članak prednje noge, ili vidljivo crvenilo i otok ograničeni na pojedinačne prste, bez obzira na broj zahvaćenih prstiju; 2 -umereno crvenilo i otok dva ili više tipova zglobova; 3 - jako crvenilo i oticanje cele šape uključujući prste; 4 - maksimalno zapaljen ekstremitet uz učešće više zglobova (maksimalni kumulativni skor kliničkog artritisa je 16 po životinji) (Nishida etal., 2004 (gore)).

[0099] Po potrebi, da bi se omogućila meta-analiza većeg broja terapijskih studija, vrednosti kliničkog skora mogu da se normalizuju na sledeći način:

AUC kliničkog skora (AUC skor):

[0100] Područje ispod krive (area under the curve, AUC) od dana 31(21) do dana 46 izračunava se za svaku pojedinačnu životinju. AUC za svaku životinju deli se prosečnim AUC dobijenim za prenosnik u studiji iz koje su dobijeni podaci za tu životinju i množi sa 100 (tj. AUC se izražava kao procenat prosečnog AUC za prenosnik, po studiji).

Porast kliničkog skora od dana 21 do dana 46 (Završni skor):

[0101] Razlika kliničkog skora za svaku životinju deli se prosečnom razlikom kliničkog skora dobijenom za prenosnik u studiji iz koje su dobijeni podaci za tu životinju i množi sa 100 (tj. razlika se izražava kao procenat prosečne razlike kliničkog skora za prenosnik, po studiji).

14.6 Radiologija (Larsen-ov skor)

[0102] Naprave se rendgenski snimci zadnjih šapa svake životinje. Svakoj slici se pripiše nasumično, naslepo, identifikacioni broj, i tri nezavisna procenitelja ocenjuju jačinu erozije kosti pomoću Larsen-ovog sistema radiološke procene na sledeći način: 0 - normalno, sa intaktnim ivicama kosti i normalnim zglobnim prostorom; 1 - blaga abnormalnost, jedna ili dve spoljne metatarzalne kosti pokazuju blagu koštanu eroziju; 2 - jasna rana abnormalnost, tri do pet spoljašnjih metatarzalnih kostiju pokazuje koštanu eroziju; 3 - srednja destruktivna abnormalnost, sve spoljašnje metatarzalne kosti kao i jedna ili dve unutrašnje metatarzalne kosti pokazuju jasnu koštanu eroziju; 4 - jaka destruktivna abnormalnost, sve metatarzalne kosti pokazuju jasnu koštanu eroziju i najmanje jedan od unutrašnjih metatarzalnih zglobova potpuno erodira ostavljajući samo mali deo zglobne ivice kosti delimično očuvan; 5 - višestruke abnormalnosti bez koštanih ivica. Ovaj sistem procenjivanja je modifikacija sistema po Salvemini et al., 2001 (Amelioration of joint disease in a rat model of collagen-induced arthritis by M40403, a superoxide dismutase mimetic. Arthritis Rheum. 44:2909-21); Bush et al., 2002 (Reduction of joint inflammation and bone erosion in rat adjuvant arthritis by treatment with interleukin-17 receptor IgG1 Fc fusion protein. Arthritis Rheum. 46: 802-5); Sims et al., 2004, (Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum., 50: 2338-46) i Jou et al.,

4

2005 (Thrombospondin 1 as an effective gene therapeutic strategy in collagen-induced arthritis. Arthritis Rheum. 52:339-44).

14.7 Rezultati

[0103] U modelu lečenja, lečenje se procenjuje korišćenjem kliničkog skora i Larsenovog skora. Rezultati su prikazani na Slici 7 i Slici 8. Važno je istaći da oba testirana anti-IL17C antitela (MOR12743 i MOR12762) pokazuju značajnu inhibiciju zapaljenja. Negativno kontrolno antitelo, MOR03207, nije inhibiralo zapaljenje, dok pozitivna kontrola, enbrel, inhibira razvoj bolesti.

[0104] U modelu prevencije, tretman se procenjuje korišćenjem kliničkog skora i Larsenovog skora. Rezultati su prikazani na Slici 9. Važno je istaći da testirano anti-IL17C antitelo (MOR12762) pokazuje značajnu inhibiciju zapaljenja i degradacije kosti. Antitelo dato kao negativna kontrola, MOR03207, nije inhibiralo ni zapaljenje ni eroziju kosti.

14.8 PK u stanju ravnoteže

[0105] Pre doziranja, dani 31 i 46 (protokol lečenja), ili dani 21, 36 i 46 (protokol prevencije), uzorci krvi se sakupljaju preko retroorbitalnog sinusa, uz litijum heparin kao antikoagulant. Uzorci cele krvi se centrifugiraju i dobijeni uzorci plazme se skladište na -20 °C do analize.

Primer 15 - Model duvanskog dima

[0106] Dnevno izlaganje miševa (C57BL/6J, Charles River) duvanskom dimu (tobacco smoke, TS) tokom 11 uzastopnih dana, za rezultat je imalo zapaljenje pluća, na šta je ukazao porast ukupnog broja ćelija prisutnih u bronhoalveolarnom lavažu (bronchoalveolar lavage, BAL), 24h posle poslednjeg izlaganja, u poređenju sa slično tretiranom grupom koja je izlagana vazduhu. Odgovor se sastojao od značajnog porasta broja makrofaga, epitelnih ćelija, neutrofila i limfocita prisutnih u BAL.

4

[0107] MOR12743 se primenjuje intraperitonealnim putem (i.p.), 1h pre izlaganja TS na dane izlaganja 1, 4, 7 i 10. Ovo je dovelo do značajne inhibicije ukupnog broja ćelija u BAL i, specifično, broja epitelnih ćelija i neutrofila.

[0108] MOR03207 se primenjuje intraperitonealnim putem (i.p.), 1h pre izlaganja TS, na dane izlaganja 1, 4, 7 i 10. Ovo nije dovelo do značajne inhibicije ukupnog broja ćelija ili broja nekog specifično identifikovanog tipa ćelija u BAL.

[0109] Roflumilast (ChemPharmaServe Ltd. Ref.0010206) je primenjivann u dozi od 5 mg/kg oralno (p.o.), 1h pre svakog izlaganja TS. Ovim je značajno inhibiran ukupan broj ćelija u BAL i, specifično, broj epitelnih ćelija, neutrofila i limfocita.

[0110] U trenutku žrtvovanja na dan 12, sve grupe izložene TS pokazale su gubitak telesne težine, ali to nije bilo značajno u poređenju sa grupom koja je bila izlagana vazduhu.

15.1 Materijali

[0111]

Prenosnik za i.p. primenu: D-PBS pH7.4 (PAA ref. proizv. H15-002, partija. H00208-2353)

Prenosnik za p.o. primenu: PEG 200/voda za injekciju (60%/40% v/v)

[0112] Fosfatom puferisani slani rastvor (phosphate buffered saline, PBS), za bronhoalveolarni lavaž (BAL), dobijen je od Gibco. Eutatal (natrijum pentobarbiton) je dobijen od Merial Animal Health Ltd. Duvanski dim je proizveden korišćenjem ’Marlboro 100’ cigareta koje su kupljene od komercijalnog dobavljača.

Formulacije:

[0113] MOR12743 i MOR03207 se zamrzavaju u koncentraciji od 1 mg/ml. Pre primene, obe testne supstance se ostave da se odmrznu na 4 ºC preko noći,.

4

[0114] Roflumilast se formuliše stavljanjem prethodno izmerene količine u avan i blagim mrvljenjem uz dodavanje prenosnika (PEG200/voda, 60%/40% v/v) u kapima da se formira suspenzija. Suspenzije se pre primene vorteksuju.

15.2 Metodi

[0115] U prethodnim studijama utvrđeno je da je ukupan broj ćelija u BAL značajno povećan 24h posle poslednjeg od 11 dnevnih izlaganja TS. U ovoj studiji, za analizu je korišćena vremenska tačka od 24h od poslednjeg izlaganja vazduhu ili TS.

[0116] Prenosnik (PBS), MOR12743 i MOR03207 davani su i.p., 1h pre izlaganja TS na dane 1, 4, 7 i 10 studije. Roflumilast je davan p.o.1h pre svakog izlaganja TS.

15.2.1 Izlaganje životinja TS jednom dnevno tokom 11 uzastopnih dana

[0117] U ovom protokolu izlaganja, miševi su izlagani u grupama od 5, u providnim polikarbonatnim komorama (27 cm x 16 cm x 12 cm). TS ’Marlboro 100’ cigareta pušten je da uđe u komoru za izlaganje pri stopi protoka od 100 ml/min. Da bi se na minimum sveli mogući problemi izazvani ponavljanim izlaganjem visokim nivoima TS, period izlaganja TS povećavan je od 25 minuta na početku studije (dan 1) do najviše 45 minuta na dan 3. Raspored izlaganja u ovoj studiji bio je sledeći:

Dan 1: 25 min izlaganja (∼ 5 cigareta)

Dan 2: 35 min izlaganja (∼ 7 cigareta)

Dani 3-11: 45 min izlaganja (∼ 9 cigareta)

Kutije za izlaganje provetravane su posle 10 min i svakih 5 min posle toga.

[0118] Još jedna grupa miševa bila je izlagana vazduhu na dnevnoj bazi, tokom ekvivalentnog perioda vremena, kao lažno tretirane kontrole (bez izlaganja TS).

15.2.2 Bronhoalveolarna lavaža i citospin analiza

Bronhoalveolarna lavaža obavljena je na sledeći način:

4

[0119] Izvršena je kanilacija traheje korišćenjem 10 mm duge kanile od nerđajućeg čelika sa Luer spojnim elementom. Fosfatom puferisani slani rastvor (PBS) korišćen je kao lavažna tečnost. Zapremina od 0.4 ml se blago ubrizga i povuče 3 puta korišćenjem šprica od 1 ml i zatim stavi u ependorf i drži na ledu do determinacije koja će uslediti.

Utvrđivanje ukupnog broja ćelija obavlja se na sledeći način:

[0120] Lavažna tečnost se odvoji od ćelija centrifugiranjem (6 min na 3400 rpm, RCF = 3070 x g - ’Eppendorf Mini Spin’) i supernatant se dekantuje i zamrzne za moguću dodatnu analizu. Ćelijski pelet se resuspenduje u poznatoj zapremini PBS i ukupan broj ćelija se izračunava brojanjem obojenog (Turks bojenje) alikvota pod mikroskopom uz korišćenje hemocitometra.

Diferencijalno brojanje ćelija obavlja se na sledeći način:

[0121] Rezidualni ćelijski pelet se razblaži do približno 10<5>ćelija po ml. Zapremina od 500 μl se stavi u levak citospin pločice i centrifugira 8 min na 800 rpm, RCF = 72.26 x g (Shandon Cytospin 3). Pločica se suši na vazduhu i boji korišćenjem Wrights/Giemsa boje prema instrukcijama proizvođača. Kada se osuši i pokrije pokrovnim staklom, obavlja se diferencijalno brojanje ćelija korišćenjem svetlosnog mikroskopa. Sa svake pločice broji se približno 400 ćelija. Ćelije se identifikuju korišćenjem standardnih morfometrijskih tehnika.

15.3 Režimi tretmana

[0122] U ovoj studiji, 4 grupe miševa su izlagane jednom dnevno TS tokom 11 dana i žrtvovanje je izvršeno 12. dana, 24h posle poslednjeg izlaganja TS. Tri grupe životinja primale su prenosnik (D-PBS), MOR12743 ili MOR03207, i.p., 1h pre izlaganja TS, na dane 1, 4, 7 i 10 studije. Jedna grupa primala je roflumilast, p.o., 1h pre svakog izlaganja TS. Sledeća grupa bila je izlagana vazduhu tokom 11 uzastopnih dana i žrtvovana 12. dana, 24h posle poslednjeg izlaganja vazduhu. Ova grupa primala je

4

prenosnik (D-PBS), i.p., 1h pre izlaganja na dane 1, 4, 7 i 10 studije. Za sve grupe n = 10.

15.4 Postupci uzorkovanja

[0123] Svi miševi su ubijeni 12. dana, intraperitonealnom visokom dozom barbiturata, 24h posle poslednjeg izlaganja vazduhu ili TS. Uzorci krvi uzeti su iz potključne vene, naneti na heparin i plazma je izdvojena centrifugiranjem i uskladištena na -40 ºC. BAL je obavljena korišćenjem 0.4 ml slanog rastvora puferisanog fosfatom (PBS). Ćelije dobijene u BAL korišćene su za utvrđivanje ukupnog broja ćelija i diferencijalnog broja ćelija. BAL supernatanti i preostali ćelijski pelet uskladišteni su na -40 ºC odnosno -80 ºC za moguće dodatne analize. Posle BAL, kanila se ostavlja na mestu. Srce i pluća se uklanjaju posle pažljivog otvaranja grudnog koša i uklanjanja rebara i grudne kosti. Levi režanj se oslobodi, ukloni i brzo zamrzne i skladišti na -80 °C. U desni režanj se ubrizga 10% fosfatom puferisani formalin (phosphate buffered formalin, PBF) do pritiska od 18 cm PBF tokom 20 minuta. Traheja se zatim podveže ispod kanile i kanila se ukloni. Srce, pluća i traheja se zatim urone u PBF.

15.5 Podaci dobijeni merenjem i statistička analiza

[0124] Rezultati su prikazani kao pojedinačni podaci za svaku životinju i za svaku grupu je izračunavana srednja vrednost.

[0125] Podaci se, prema tome, inicijalno podvrgavaju testu univarijantne analize varijanse (analysis of variance test, ANOVA), posle čega sledi Bonferroni korekcija za višestruka poređenja da bi se testirale statistički značajne razlike između grupa tretmana. "p" vrednost od <0.05 smatra se za statistički značajnu. Procenat inhibicije izračunava se korišćenjem dole prikazane formule:

15.6 Rezultati

15.6.1 Zapaljenje pluća indukovano dnevnim izlaganjem TS, koje se manifestuje porastom broja ćelija u BAL

[0126] Jedna grupa bila je izlagana TS dnevno tokom 11 dana i primala je prenosnik (D-PBS), i.p., 1h pre izlaganja TS na dane 1, 4, 7 i 10 studije. U poređenju sa slično tretiranom grupom izlaganom vazduhu, miševi su ispoljili zapaljenje pluća koje se manifestovalo značajnim porastom (p<0.001) ukupnog broja ćelija dobijenih u BAL 12. dana, na dan žrtvovanja (24h posle poslednjeg izlaganja TS). Ovo zapaljenje odlikovalo se značajnim porastom broja makrofaga, epitelnih ćelija, neutrofila i limfocita (p<0.001 za sve), u poređenju sa životinjama izloženim vazduhu (lažno tretirane) (Tabela 2).

Tabela 2: Zbirni prikaz efekata izlaganja TS tokom 11 uzastopnih dana, na odgovor miševa upalom pluća.

15.6.2 Efekat i.p. primene MOR12743 na zapaljenje pluća indukovano dnevnim izlaganjem TS, koje se manifestuje porastom broja ćelija u BAL

[0127] MOR12743, 5 mg/kg, primenjeno i.p., 1h pre izlaganja TS na dane 1, 4, 7 i 10, značajno utiče na smanjenje ukupnog broja ćelija u BAL (26%, p<0.001) i specifično

1

epitelnih ćelija (52%, p<0.001) i neutrofila (48% , p<0.001). Stepen i značaj ovog smanjenje zbirno su prikazani u Tabeli 3.

15.6.3 Efekat i.p. primene MOR03207 na zapaljenje pluća indukovano dnevnim izlaganjem TS, koje se manifestuje porastom broja ćelija u BAL

[0128] MOR12743, 5 mg/kg, primenjeno i.p., 1h pre izlaganja TS na dane 1, 4, 7 i 10, ne utiče značajno na inhibiciju ukupnog broja ćelija dobijenih u BAL, ni broja bilo kojih specifičnih tipova ćelija čiji se broj povećava posle izlaganja TS. Podaci su zbirno prikazani u Tabeli 3.

15.6.4 Efekat oralne primene roflumilasta na zapaljenje pluća indukovano dnevnim izlaganjem TS, koje se manifestuje porastom broja ćelija dobijenih u BAL

[0129] Roflumilast, 5 mg/kg, primenjivan p.o., 1h pre svakog izlaganja TS, značajno inhibira ukupan broj ćelija u BAL (32% p<0.001) i specifično epitelnih ćelija (50% p<0.001), neutrofila (56% p<0.001) i limfocita (54% p<0.01). Stepen i značaj ove inhibicije zbirno su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3: Zbirni prikaz efekata MOR12743, MOR03207 i roflumilasta na zapaljenski odgovor miševa izazvan TS.

2

15.6.5 Efekat tretmana na telesnu težinu miševa tokom jedanaest dana izlaganja TS

[0130] Da bi se pratilo zdravlje miševa tokom protokola izlaganja, miševi su mereni na početku studije, zatim na dan 6 i na dan 12, pre žrtvovanja. Tokom 12 dana studije, lažno izlagani miševi pokazali su male promene telesne težine ili promena nije bilo. Sve grupe izlagane TS pokazale su gubitak telesne težine tokom ovog perioda, ali ovi gubici nisu bili statistički značajni.

15.7 Zaključak

[0131] MOR12743 (5 mg/kg), primenjivan i.p., na dane 1, 4, 7 i 10, značajno je inhibirao ukupan broj ćelija dobijenih u BAL i, specifično, broj epitelnih ćelija i neutrofila. MOR03207 (5 mg/kg), primenjen na isti način, nije uticao na ukupan broj ćelija u BAL, ili na broj nekog specifičnog tipa ćelija.

[0132] Referentno jedinjenje, roflumilast (5 mg/kg), primenjeno p.o., 1h pre svakog izlaganja TS, značajno inhibira ukupan broj ćelija dobijenih u BAL i, specifično, broj epitelnih ćelija, neutrofila i limfocita. Odgovor je sličan odgovorima viđenim u ranijim studijama.

[0133] Sve grupe izlagane TS pokazale su određeni gubitak težine tokom 12 dana trajanja studije, ali nije bilo statistički značajnih razlika između grupa tretmana.

Primer 16 - Intranazalno unošenje LPS: mišji model akutne plućne neutrofilije

[0134] Obavljene su dve nezavisne studije sa jednim negativnim mAb i dva pozitivna mAb, u mišjem modelu akutne plućne neutrofilije izazvane ubrizgavanjem lipopolisaharida (LPS), to je model koji imitira neke relevantne aspekte COPD (hronične opstruktivne bolesti pluća). Efekti se mere brojanjem zapaljenskih ćelija u bronhoalveolarnom lavažu.

16.1 Grupe u studiji

[0135] Nekoliko grupa miševa tretirano je različitim antitelima i deksametazonom i upoređivano sa miševima koji su izlagani samo LPS. Zbirni prikaz grupa dat je u Tabeli 4.

Tabela 4

16.2 Materijali

[0136]

• Lipopolisaharid (LPS): iz Escherichia coli 055:B5, ref: L4524-25MG, prečišćen afinitetnom hromatografijom partija: 018K4077 - Sigma. LPS je pripremljen po zapremini datoj intranazalnim ubrizgavanjem: 50 μl/mišu (10 μg/50 μl)

4

• Slani rastvor: natrijum hlorid 0.9%, partija 9F0191 (bez endotoksina, Lavoisier)

• Ketamin: Imalgene MERIAL 1000, 10 ml

• Ksilazin: Rompun BAYER PHARMA 2%, 25 ml

• Izofluran: Aerrane, serija 10E28A35

• Metilceluloza (MC): VWR, ref AX021233 serija M1395

• Priprema deksametazona (DEX): 30 mg/kg, 10 ml/kg, 0.2 ml/mišu, oralnim putem

• Antitela su bila zamrznuta u koncentraciji od 1 mg/ml. Pre primene, testne supstance su ostavljene da se otope na 4 ºC, preko noći.

Sva antitela su bila spremna za upotrebu posle otapanja (ili su razblažena neposredno pre upotrebe).

16.3 Životinje

[0137] U studiji su korišćene BALB/c ženke miševa iz Harlan (France). Težina miševa iznosila je oko 20 g.

16.4 Eksperimentalni postupci

Intranazalna primena

[0138] Miševi se anesteziraju inhalacijom izoflurana. Tokom disanja, LPS se ubrizga intranazalno. Posle 24h, miševi se anesteziraju intraperitonealno (IP) i izvede se postupak bronhoalveolarne lavaže. Miševi se anesteziraju injekcijom anestetičkog rastvora 0.1 ml na 10 g težine miša. Rastvor anestetika sastojao se od 18 ml 0.9% NaCl, 0.5 ml ksilazina (5 mg/kg) i 1.5 ml ketamina (75 mg/kg).

Bronhoalveolarna lavaža (BAL)

[0139] Središnjom incizijom dođe se do traheje i postavi se kanila (sa mišjim kateterom). BAL se obavi dva puta korišćenjem 1 ml sterilnog PBS. Lavažna tečnost se preuzme i centrifugira na 1500 rpm, 10 min na 4 °C. Ćelijski pelet se resuspenduje u 200 μl PBS. Ćelije se broje korišćenjem brojača ćelija (Vet abc, France). Supernatant lavažne tečnosti drži se na -20 °C za doziranje medijatora inflamacije.

16.5 Dizajn studije

[0140]

Deksametazon: Tretman deksametazonom izvodi se 24, 16 i 1 sat pre unošenja LPS i 6 sati posle primene LPS.

Antitela: 24 sata pre unošenja LPS miševi se tretiraju jednim od mAb (MOR03207, MOR12762 ili MOR12743).

[0141] Za sve grupe, BAL se obavlja 24 sata posle primene LPS i vrši se brojanje ćelija.

Rezultati

[0142] Rezultati se analiziraju Student-ovim t-testom. Broj ćelija iz BAL miševa tretiranih nekim od antitela ili deksametazonom upoređuje se sa brojem ćelija kod miševa tretiranih samo LPS. Razmatraju se prosečne vrednosti /- sem broja ćelija, dobijene za miševe iz svake grupe. Rezultati su prikazani na Sl.10.

Zaključak

[0143] Jedan tretman MOR03207 antitelom (negativna kontrola) u dozi od 5 mg/kg ne inhibira u značajnoj meri (ns trend) regrutovanje zapaljenskih ćelija u BALF. U isto vreme, jedan tretman MOR12762 ili MOR12743 u dozi od 5 mg/kg, značajno inhibira regrutovanje zapaljenskih ćelija u BALF. Ovo ukazuje na to da IL17C reguliše akutnu neutrofiliju i predstavlja terapijski cilj kod plućnih oboljenja kao što je COPD.

[0144] Prema tome, prvi put je pokazano da su IL17C antagonisti, npr. IL17C antitela, efikasni u lečenju zapaljenskih poremećaja i oboljenja.

Primer 17 - profilisanje ekspresije IL17C u respiratornom tkivu čoveka

[0145] U ovoj studiji, ekspresija IL17C merena je kvantitativnim PCR u realnom vremenu (quantitative real time PCR, qRT-PCR), u različitim tipovima respiratornih tkiva čoveka (tercijarna bronhija, kvaternarna bronhija i plućna arterija), u kontrolnim uzorcima i uzorcima obolelih. Kontrolni uzorci dobijeni su od nepušača i od pušača, dok su uzorci obolelih dobijeni od pacijenata sa COPD, akutnim/hroničnim bronhitisom i emfizemom pluća.

17.1. Prečišćavanje RNK i QC (kontrola kvaliteta)

[0146] Ukupna RNK izolovana je iz zamrznutih tkiva korišćenjem standardnih metodologija, prema protokolima proizvođača ili uz originalne adaptacije.

Zadovoljeni kriterijumi QC (podaci nisu prikazani) bili su:

Prisustvo 18S ribozomske RNK

Minimalni broj kopija iRNK transkripata kontrolnih gena, određen korišćenjem qRT-PCR, bio je sledeći:

• β-aktin (dužina amplikona 295 bp) > 3800 kopija transkripta/100 ng ukupne RNK

• gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH, dužina amplikona 71 bp) > 10000

kopija transkripta/100 ng ukupne RNK

• bez kontaminirajuće DNK

17.2 Tretman uzoraka RNK DNazom

[0147] Ukupna RNK tretira se DNazom I koja ne sadrži RNazu, da bi se uklonila rezidualna genomska DNK (gDNK). Da bi se ispitala uspešnost uklanjanja DNK iz uzoraka RNK, obavlja se qPCR bez prethodne reverzne transkripcije. Odsustvo amplifikacionog signala potvrdilo je da uzorci RNK ne sadrže DNK.

17.3 Setovi prajmerskih proba

[0148] Setovi prajmerskih proba korišćeni za qRT-PCR prikazani su dole:

IL17C veličina amplikona: 72 bp

Uzvodni prajmer: 5’ - ATGAGGACCGCTATCCACAGA - 3’ (SEQ ID No.:184)

Reverzni prajmer: 5’ - CCCGTCCGTGCATCGA - 3’ (SEQ ID No.:185)

Proba: 5’ - TGGCCTTCGCCGAGTGCCTG - 3’ (SEQ ID No.:186)

[0149] Proba se obeležava na 5’-kraju 6-karboksifluoresceinom (FAM) i na 3’-kraju 6-karboksi-tetrametil-rodaminom (TAMRA).

17.4 Sinteza cDNK

[0150] RNK obrađena korišćenjem DNaze inkubira se sa reverznim prajmerima za beta 1, beta 2, beta 3 i GAPDH u puferu za reverznu transkripciju, uz zagrevanje uzoraka na 72 °C (da bi se uklonila sekundarna struktura) i zatim se hladi na 55 °C (da se "zalepe" prajmeri). Dodaju se MuLV reverzna transkriptaza i nukelotidi i reakcione mešavine se inkubiraju 30 minuta na 37 °C, da se dopusti odvijanje sinteze cDNK. Uzorci se zatim zagreju na 90 °C, 5 minuta, da se denaturiše reverzna transkriptaza.

17.5 qRT-PCR

[0151] Koristi se multipleks metodologija uz upotrebu qRT-PCR za istovremeno merenje nivoa iRNK gena od interesa i GAPDH. Istovremeno merenje GAPDH u svakoj testnoj epruveti obezbeđuje kontrolu kvaliteta uspešnosti reverzne transkripcije i qRT-PCR. Reakcije se obavljaju sa cDNK izvedenom iz 50 ng ukupne RNK. Uzvodni i reverzni prajmeri i probe za svaki cilj i GAPDH dodaju se reakcionoj mešavini zajedno sa nukleotidima, puferom i AmpliTaq GoldTM Taq polimerazom. PCR uslovi su: 94 °C, 12 minuta (korak enzimske aktivacije), zatim 40 ciklusa 94 °C, 15 sekundi (korak denaturacije) i 60 °C, 30 sekundi (za lepljenje i produženje). Posle testiranja osetljivosti, inicijalna PCR temperatura za beta 3 povećana je na 97°C.

Rezultati

[0152] Ovde prikazani podaci pokazuju da se IL17C, član interleukin 17-familije proinflamatornih citokina, konstitutivno eksprimira u plućima čoveka. Pored toga, povećani nivoi ekspresije IL17C bili su zapaženi u uzorcima plućnog tkiva poreklom od davalaca sa dijagnostikovanim zapaljenskim respiratornim oboljenjima, kao što su COPD, bronhitis ili emfizem pluća, u poređenju sa kontrolnim uzorcima (Slika 11).

Primer 18 - Mišji model psorijaze indukovane imikvimodom (IMQ)

[0153] Proinflamatorna funkcija IL17C u koži ispitivana je u neinfektivnom kožnom zapaljenskom modelu psorijaze kod miša, u kojem površinski TLR7-TLR8 agonist imikvimod indukuje psorijazne lezije na koži, koje se karakterišu proliferacijom epiderma i infiltracijom leukocita, zavisnim od patogenih TH17 citokina (Van der Fits et al., J of Immunol. 2009 May 1;182(9):5836-45.). Uloga IL17C u ovom posebnom modelu nedavno je dokumentovana (Ramirez-Carrozzi et al, Nat Immunol. 2011 12(12):1159-66) i ubedljiv genetički dokaz uloge IL17C u modelu bolesti obezbeđen je kod IL17C-/-miševa. Isti model psorijaze korišćen je za dodatno izučavanje odgovora IL17C na IMQ u koži i identifikovanje ćelija koje proizvode IL17C.

18.1 Reagensi

[0154] Korišćeni su vazelin (Vaseline officinale, Cooper) i imikvimod krem (Aldara, 5% krem, MEDA). Korišćena antitela bila su anti-mišji IL17A/F (R&D System, klon 50104, ref. MAB421) i anti-mišji IL23p40 (eBioscience, klon C17.8, ref.16-7123-85).

18.2 Životinje

[0155] Balb/c N miševi (ženke, 18-20 g, pribl.10 nedelja stare) dobijene su od CERJ ili Halan (France). Miševi su držani na 12-časovnom dnevno-noćnom ciklusu (0700 -1900). Temperatura je održavana na 22 °C, a hrana i voda su bile dostupne ad libitum.

18.3 Eksperimentalni postupci

[0156] Da bi se indukovao odgovor sličan psorijazi, na dnevnoj bazi je nanošena doza od 62.5 mg imikvimod krema na površinu obrijane kože dela leđa i desnog uva, tokom 5 uzastopnih dana (D0-D4), što je, prevedeno u dnevnu dozu, iznosilo 3.13 mg aktivnog jedinjenja. Kontrolna grupa sastojala se od miševa koji su primali istu količinu vazelin krema. Jačina zapaljenja kože (eritem, perutanje i zadebljavanje) posmatrani su svakodnevno. Telesna težina je registrovana na dnevnoj bazi. Posle žrtvovanja, kao i navedenih dana, debljina kože na ušima i na leđima merena je korišćenjem mikrometra (Mitutoyo). Uzorci kože sa leđa i uva uzeti su za histološku analizu i analizu ekspresije gena. Merene su težine slezine i timusa.

18.4 Dizajn studije

[0157] Miševi su nasumično raspoređeni u jednake grupe (n=10). IMQ grupa primala je dnevno površinsku dozu od 62.5 mg imikvimod krema na obrijani deo leđa i uva, tokom 5 uzastopnih dana (D0-D4), što je, prevedeno u dnevnu dozu, iznosilo 3.13 mg aktivnog jedinjenja. Kontrolna grupa sastojala se od kontrolnih miševa koji su primali istu količinu vazelin krema. Antitela su formulisana u PBS, testirana u dozi od 10 mg/kg (200 μg/mišu) i primenjivana i.p., 3 dana pre i na početku eksperimenta (D0), dakle, korišćeno je 6 različitih grupa tretmana:

• Kontrola (vazelin)

• IMQ (Aldara 5% krem)

• IMQ MOR03207_h/m 10 mg/kg i.p. (negativna kontrolna Ab)

• IMQ MOR12743_h/m 10 mg/kg i.p.

• antimišji IL17A/F 10 mg/kg i.p

• antimišji IL23p4010 mg/kg i.p

18.5 Rezultati

[0158] Ekspresija IL17C proteina detektovana je korišćenjem biotinisanih MOR12743 antitela i IHH. IL17C se eksprimira u mastocitima derma kontrolne grupe i grupa tretiranih IMQ (podaci nisu prikazani). U odgovoru na IMQ, ekspresija IL17C se povećava u keratinocitima epiderma od D2 do D4 - uz višu ekspresiju zapaženu na D3 -kao i u nekim manjim zapaljenskim ćelijama derma i stratuma. MOR03207 (izotipska kontrola) ne pokazuje bojenje, bez obzira na uslove.

[0159] Ovo zapažanje je u skladu sa ekspresijom gena za IL17C. Bazalni nivoi su nedetektabilni za IL17A i IL17F i niski za IL17C i IL23p19. IL17A, IL17F bili su maksimalno povišeni pod delovanjem IMQ na koži leđa, posle 96h dok su IL23p19 i IL17C bili povišeni ranije, sa maksimumom na 48h. IL17RA i IL17RE bili su dobro eksprimirani, sa veoma umerenim promenama ekspresije u odgovoru na IMQ.

[0160] Efekti neutrališućih antitela relevantnih za put ili specifičnih za IL17C, procenjivani su na modelu psorijaze indukovane korišćenjem IMQ, histološkim merenjem debljine epiderma. IL-17A i IL-23p40 antitela pokazala su delimične preventivne efekte u skladu sa onim što je opšte poznato u struci. Efekat MOR1243 neutrališućih antitela bio je značajan, čime je pokazano da neutralizacija IL17C može značajno da prevenira zadebljavanje epiderma indukovano IMQ, na koži uva miša (Slika 12).

Primer 19 - Ekspresija i funkcija IL17C u primarnim humanim epidermalnim keratinocitima

1

[0161] Da bi se dodatno ispitala funkcija IL17C u psorijazi, usmerili smo pažnju na ekspresiju i funkciju IL17C u primarnim keratinocitima humanog epiderma.

19.1 Kulture adultnih normalnih humanih epidermalnih keratinocita (NHEK-Ad)

[0162] Krioprezervirani primarni normalni humani epidermalni keratinociti adulta dobijeni su od kompanije Lonza i kultivisani su u medijumu za rast keratinocita (Keratinocyte Growth Medium-gold, KGM-Gold™) koji je napravljen dopunjavanjem Keratinocyte BasalMedium-gold (KBM-Gold™) različitim SingleQuots™ suplementima faktora rasta, uključujući ekstrakt goveđe hipofize, hidrokortizon, hEGF, epinefrin, transferin, insulin i GA-1000 (svi medijumi i suplementi nabavljeni od kompanije Lonza). Ćelije se ekspanduju u još 2 pasaže i zaseju na ploče sa 96 bunarčića (25 000 ćel/bunarčiću) u KGM-Gold™. Posle kultivisanja preko noći, medijum se ukloni i zameni sa KGM-Gold™ bez hidrokortizona, pre nego što se dodaju različiti citokinski "okidači". Ukupna RNK se ekstrahuje u različitim vremenskim tačkama i ekspresija IL-17RE, IL17C i β-defenzina-2 (DEF4B) određuje se kvantitativnom RT-PCR. Sakupljeni ćelijski supernatant drži se na -20 °C do analize nivoa sekretovanog βdefenzina-2 (hBD2) korišćenjem ELISA. Rekombinantni humani IL17C bio je nabavljen od Novus Biologicals. Rekombinantni humani IL-1β i TNFα bili su nabavljeni od PeproTech. Rekombinantni humani IL-17A i IL-22 nabavljeni su od R&D Systems. Sledeći agonisti Toll-sličnih receptora (TLR) nabavljeni su od InvivoGen: flagelin (FLA) prečišćen iz S. typhimurium (TLR5 agonist), gardikvimod (TLR7 agonist), CL097 (TLR7/8 agonist) i CpG oligonukleotid ODN 2611 (TLR9 agonist). TLR4 agonist lipopolisaharid (LPS, iz E. Coli serotip 026:B6) dobijen je od Sigma.

19.2 Kvantitativna RT-PCR

[0163] Ukupna RNK ekstrahovana je iz ćelija korišćenjem RNeasy mini kita (Qiagen) i reverzno transkribovana korišćenjem Taqman® reagenasa za reverznu transkripciju (Applied Biosystems). Dvadeset pet μl PCR reakcije pripreme se korišćenjem Taqman® universal PCR master mix/No AmpErase® UNG i predizajniranih setova Assay-on-

2

Demand Gene Expression prajmera/proba (svi: Applied Biosystems). qPCR se obavlja na ABI Prism® 7000 (Applied Biosystems). Ekspresija gena se normalizuje prema "housekeeping" genu GAPDH i izražava kao ΔCt vrednost, sa ΔCt = Ctgen-Ct(GAPDH) ili se izražava kao relativan nivo iRNK specifične genske ekspresije, kako je dobijeno korišćenjem 2-ΔCt metoda.

19.3 hBD2 ELISA

[0164] Sledeći protokol razvijen je i usvojen za merenje hBD2 nivoa korišćenjem "zarobljavajućih" i detekcionih antitela dobijenih od PeproTech (kat. br. 900-K172). Bele ploče Lumitrac 600 sa 384 bunarčića (Greiner) oblože se sa 40 μl rastvora antihBD2 zarobljavajućih antitela (0.5 μg/ml u PBS). Posle inkubiranja preko noći na 4 °C, ploče se jednom isperu pomoću PBST (PBS 0.05% Tween-20 (Sigma)) i jednom uz korišćenje PBS i blokiraju inkubacijom 4h na sobnoj temperaturi sa 100 μl/bunarčiću blokirajućeg pufera (PBS 1% BSA 1% saharoza 0.05% NaN3). Blokirajući pufer se ukloni okretanjem ploče i prislanjanjem na upijajući papir. Ploča se ispere sa 100 μl PBST i 100 μl PBS i doda se 35 μl hBD2 standarda ili uzorka. Posle inkubiranja preko noći na 4 °C, ploče se dva puta isperu korišćenjem PBST i jednom korišćenjem PBS. Posle toga, doda se 35 μl rastvora biotinisanog anti-hBD2 detekcionog antitela (0.1 μg/ml u PBS koji sadrži 1% BSA). Posle 2 sata inkubacije na sobnoj temperaturi, ploče se isperu kako je gore opisano i inkubiraju sa 35 μl streptavidin-HRP konjugata (Invitrogen, kat. br. SNN2004) razblažnog 1/2000 u PBS 1% BSA. Posle 45 min, ploče se isperu kako je gore opisano i inkubiraju 5 min na sobnoj temperaturi sa 50 μl/bunarčiću BM Chem ELISA supstrata (Roche). Očitavanje se obavlja na Luminoscan Ascent luminometru (Labsystems) sa integracionim vremenom od 100 msec.

19.4 Rezultati

[0165] Dok se IL-17RA široko eksprimira, ekspresija IL-17RE je ograničenija i njegova ekspresija je posebno visoka na ćelijama epitelnog porekla. Analizirali smo ekspresiju IL-17RE iRNK u primarnim humanim epidermalnim keratinocitima i zapazili smo visoku ekspresiju IL-17RE u ovim ćelijama, uz ΔCT (IL-17RE, GAPDH) ∼ 4-6.

Ekspresija IL-17RE nije modulisana nijednim od ispitivanih okidača zapaljenja (podaci nisu prikazani).

[0166] Proširili smo ove inicijalne nalaze i analizirali regulaciju ekspresije IL17C u keratinocitima korišćenjem IL-17A, citokina koji proizvode Th17 ćelije za koji se zna da ima važnu ulogu u psorijazi. Dobijeni podaci potvrdili su indukciju IL17C iRNK putem IL-1 i flagelina, TLR5 agonista (Slike 13A i 13B). Ligandi drugih TLR (TLR4, TLR7, TLR8 ili TLR9) nisu značajno indukovali IL17C iRNK. Kinetička analiza je pokazala da je indukcija IL17C iRNK putem IL-1 ili flagelina bila brza i prolazna. Interesantno, iako IL-17A sam nije značajno indukovao IL17C iRNK, sinergistički je podstakao i podržavao ekspresiju IL17C tokom vremena kada se kombinovao sa proinflamatornim citokinima TNF ili IL-1 (Slika 13A).

[0167] Kako keratinociti eksprimiraju visoke nivoe IL-17RE, funkcija IL17C u ovim ćelijama je dodatno ispitivana. Iako humani primarni keratinociti nisu odgovarali na sam IL17C, IL17C je stimulisao ekspresiju β-defenzina-2 u sinergiji sa drugim ispitivanim proinflamatornim genima tj. IL-1β, TNFα i IL-22. Sinergistička stimulacija ekspresije β-defenzin-2 iRNK zapažena je i na nivou iRNK i na nivou proteina.

19.5 Rezime

[0168] U celini, podaci pokazuju da IL17C proizveden pod uticajem proinflamatornih citokina u keratinocitima, može imati ulogu u pozitivnoj kontrolnoj sprezi koja umnožava i održava ekspresiju inflamatornih gena u keratinocitima doprinoseći zapaljenju kože u psorijazi.

Primer 20: Test unakrsne kompeticije baziran na ELISA

[0169] Unakrsna kompeticija anti-IL17C antitela ili drugog IL17C vezujućeg sredstva može da se detektuje korišćenjem ELISA testa prema sledećem standardnom postupku. Slično tome, može se detektovati unakrsna kompeticija anti-IL17C antitela ili drugog IL17C vezujućeg sredstva.

[0170] Opšti princip ELISA testa uključuje nanošenje anti-IL17C antitela na zidove bunarčića ploče za ELISA. Drugo, potencijalo unakrsno kompetitivno, anti-IL17C

4

antitelo se zatim u višku dodaje u rastvor (tj. nevezano za ELISA ploču). Zatim se u bunarčiće dodaje ograničena količina IL17C-Fc.

[0171] Antitelo koje oblaže bunarčiće i antitelo u rastvoru kompetiraće za vezivanje sa ograničenim brojem IL17C molekula. Ploča se zatim ispere da se uklone IL17C molekuli koji se nisu vezali za imobilisano antitelo i da se ukloni drugo antitelo u fazi rastvora, kao i svi kompleksi formirani između drugog antitela u fazi rastvora i IL17C. Količina vezanog IL17C se zatim meri korišćenjem odgovarajućeg reagensa za detekciju IL17C. Prema tome, IL17C može biti fuzionisan sa markerom, npr. Fc, Flag, itd. koji može da se detektuje odgovarajućim antitelom specifičnim za marker.

[0172] Antitelo u rastvoru koje je unakrsno kompetitivno sa antitelom nanetim na zidove bunarčića biće u stanju da dovede do smanjenja broja IL17C molekula koje imobilisano antitelo može da veže u odnosu na onaj broj IL17C molekula koje imobilisano antitelo može da veže u odsustvu drugog antitela u fazi rastvora.

[0173] Ovaj test je detaljinije opisan dole, za dva antitela označena kao Ab-X i Ab-Y. U ovom slučaju u kojem je Ab-X odabrano da bude imobilisano antitelo, ono se nanosi na zidove bunarčića ELISA ploče, posle čega se ploče blokiraju odgovarajućim blokirajućim rastvorom da se na minimum svede nespecifično vezivanje reagenasa koji se zatim dodaju. Zatim se na ELISA ploču dodaje Ab-Y u višku tako da molovi Ab-Y IL17C vezujućih mesta po bunarčiću budu najmanje 10 puta brojniji nego molovi Ab-X IL17C vezujućih mesta koja se koriste, po bunarčiću, tokom oblaganja ELISA ploče. IL17C se zatim dodaje tako da molovi IL17C dodati po bunarčiću budu najmanje 25 puta manje brojni nego molovi Ab-X IL17C vezujućih mesta koja se koriste za oblaganje svakog bunarčića. Posle odogovarajućeg perioda inkubacije, ELISA ploča se ispere i IL17C detekcioni reagens se doda da se meri količina IL17C molekula specifično vezanih imobilisanim anti-IL17C antitelom (u ovom slučaju Ab-X). Pozadinski signal za test definiše se kao signal koji se dobija u bunarčićima sa imobilisanim antitelom (u ovom slučaju Ab-X), drugim antitelom u fazi rastvora (u ovom slučaju Ab-Y), samo puferom (tj. bez IL17C) i IL17C detekcionim reagensima. Pozitivni kontrolni signal za test definiše se kao signal koji se dobija u bunarčićima sa imobilisanim antitelom (u ovom slučaju Ab-X), drugim antitelom u fazi rastvora - samo puferom (tj. bez drugog antitela u fazi rastvora), IL17C detekcionim reagensima. ELISA test treba da se izvede tako da pozitivni kontrolni signal iznosi najmanje 6 puta koliko pozadinski signal.

[0174] Da bi se izbegli artefakti (npr. značajno različiti afiniteti imeđu Ab-X i Ab-Y za IL17C) nastali zbog izbora antitela koje će se koristiti kao imobilisano antitelo, a koje će se koristiti kao drugo (kompetitorsko) antitelo, test unakrsnog blokiranja treba da se izvede u dva formata: 1) format 1 kada je Ab-X antitelo koje se nanosi na ELISA ploču i Ab-Y je kompetitorsko antitelo koje je u rastvoru i 2) format 2 gde je Ab-Y antitelo koje se nanosi na ELISA ploču i Ab-X je kompetitorsko antitelo koje je u rastvoru.

LISTING SEKVENCI

1

2

4

1

2

4

1

2

4

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

11

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

Claims (7)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C, naznačen time, što se upotrebljava za lečenje zapaljenskog poremećaja, gde je pomenuti zapaljenski poremećaj zapaljenje pluća, reumatoidni artritis i/ili hronična opstruktivna bolest pluća (COPD), pri čemu se IL17C sastoji od amino-kiselina SEQ. ID No.: 181, i gde pomenuto antitelo blokira vezivanje IL17C za IL17RE.

2. Izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što pomenuto antitelo ili fragment antitela unakrsno kompetira sa antitelom ili fragmentom antitela koji sadrži 6 CDR definisanih po Kabat-u, koji se bira između antitela ili fragmenta antitela koji sadrži

HCDR1 Seq. ID: 1, HCDR2 Seq. ID: 2, HCDR3 Seq. ID: 3, LCDR1 Seq. ID: 4, LCDR2 Seq. ID: 5 i LCDR3 Seq. ID: 6 (MOR12740), ili

HCDR1 Seq. ID: 31, HCDR2 Seq. ID: 32, HCDR3 Seq. ID: 33, LCDR1 Seq. ID: 34, LCDR2 Seq. ID: 35 i LCDR3 Seq. ID: 36 (MOR12743), ili

HCDR1 Seq. ID: 41, HCDR2 Seq. ID: 42, HCDR3 Seq. ID: 43, LCDR1 Seq. ID: 44, LCDR2 Seq. ID: 45 i LCDR3 Seq. ID: 46 (MOR12744), ili

HCDR1 Seq. ID: 51, HCDR2 Seq. ID: 52, HCDR3 Seq. ID: 53, LCDR1 Seq. ID: 54, LCDR2 Seq. ID: 55 i LCDR3 Seq. ID: 56 (MOR12745), ili

HCDR1 Seq. ID: 61, HCDR2 Seq. ID: 62, HCDR3 Seq. ID: 63, LCDR1 Seq. ID: 64, LCDR2 Seq. ID: 65 i LCDR3 Seq. ID: 66 (MOR12746), ili

HCDR1 Seq. ID: 71, HCDR2 Seq. ID: 72, HCDR3 Seq. ID: 73, LCDR1 Seq. ID: 74, LCDR2 Seq. ID: 75 i LCDR3 Seq. ID: 76 (MOR12751), ili

HCDR1 Seq. ID: 91, HCDR2 Seq. ID: 92, HCDR3 Seq. ID: 93, LCDR1 Seq. ID: 94, LCDR2 Seq. ID: 95 i LCDR3 Seq. ID: 96 (MOR12754), ili

HCDR1 Seq. ID: 141, HCDR2 Seq. ID: 142, HCDR3 Seq. ID: 143, LCDR1 Seq. ID: 144, LCDR2 Seq. ID: 145 i LCDR3 Seq. ID: 146 (MOR12759), ili HCDR1 Seq. ID: 151, HCDR2 Seq. ID: 152, HCDR3 Seq. ID: 153, LCDR1 Seq. ID: 154, LCDR2 Seq. ID: 155 i LCDR3 Seq. ID: 156 (MOR12760), ili

HCDR1 Seq. ID: 161, HCDR2 Seq. ID: 162, HCDR3 Seq. ID: 163, LCDR1 Seq. ID: 164, LCDR2 Seq. ID: 165 i LCDR3 Seq. ID: 166 (MOR12761), ili HCDR1 Seq. ID: 171, HCDR2 Seq. ID: 172, HCDR3 Seq. ID: 173, LCDR1 Seq. ID: 174, LCDR2 Seq. ID: 175 i LCDR3 Seq. ID: 176 (MOR12762).

3. Izolovano antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu iz patentnog zahteva 1 ili 2, naznačen time, što je pomenuto antitelo ili njegov fragment monoklonsko antitelo.

4. Antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu iz patentnog zahteva 3, naznačen time, što je pomenuto antitelo ili fragment antitela humano, humanizovano ili himerno antitelo ili fragment antitela.

5. Antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu iz patentnog zahteva 3, naznačen time, što pomenuto antitelo ili fragment antitela sadrži humani teškolančani konstantni region i humani lakolančani konstantni region.

6. Antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu iz patentnog zahteva 3, naznačen time, što je pomenuto antitelo IgG izotipa.

7. Antitelo ili fragment antitela specifičan za IL17C za upotrebu iz patentnog zahteva 3, naznačen time, što se fragment antitela bira iz grupe koja se sastoji od Fab, F(ab2)’, F(ab)2’, scFV.

1