ES2672320T3 - Métodos y kits para la medida del factor de von Willebrand - Google Patents

Abstract

Un método para medir el factor de von Willebrand (VWF) sin usar un agonista de la aglutinación plaquetaria, comprendiendo el método las etapas de: proporcionar una superficie que comprende glucoproteína plaquetaria inmovilizada Ibα (GPIbα) o un fragmento funcional de la misma, en donde la GPIbα inmovilizada o fragmento funcional de la misma comprende al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en G233V, D235Y y M239V relativas a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y; poner en contacto una muestra que tiene o se sospecha que tiene VWF con la superficie, en donde la puesta en contacto se hace sin un agonista de la agregación plaquetaria; y detectar un complejo de VWF y GPIbα.

Description

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DESCRIPCION

Métodos y kits para la medida del factor de von Willebrand Declaración relativa a una investigación patrocinada federalmente

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno de los Estados Unidos bajo los números de concesión RO1- HL033721-19 y RO1-HL081588-03, otorgado por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno de los Estados Unidos tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes

La invención se refiere de un modo general a métodos y kits para la medida del factor de von Willebrand (VWF), y más en particular a métodos y kits para medir el VWF que no requieren un agonista de la agregación plaquetaria, tal como la ristocetina.

El VWF es una glicoproteína multimérica sintetizada por megacariocitos y células endoteliales, que es posteriormente segregada en el plasma sanguíneo como un espectro de multímeros. El VWF se une a otras proteínas, especialmente proteínas implicadas en la hemostasia, como el factor VIII (un factor de coagulación esencial que participa en la ruta intrínseca de la coagulación sanguínea) y la glucoproteína plaquetaria Ib (GPIb, un componente de un complejo receptor de la adhesión plaquetaria). El VWF es deficiente o deficitario en la enfermedad de von Willebrand (VWD) y está involucrado en gran número de enfermedades, incluida la púrpura trombocitopénica trombótica, el síndrome de Heyde y posiblemente el síndrome urémico hemolítico. Véase, Sadler J., "Biochemistry and Genetics of von Willebrand factor". Annu. Rev. Biochem. 67: 395-424 (1998). Los niveles del VWF pueden estar afectados por muchos factores, incluido el grupo sanguíneo ABO y la etnia.

La VWD es un trastorno hemorrágico común caracterizado por defectos cualitativos o cuantitativos en las pruebas del VWF. Los síntomas de la VWD incluyen hematomas, menorragia y epistaxis. Actualmente se conocen muchos tipos de VWD hereditaria (por ejemplo, tipo 1, tipo 2A, 2B, 2M, 2N y tipo 3, así como pseudo VWD del tipo de las plaquetas, que resulta de un defecto en la GPIb plaquetaria); sin embargo, también se conocen formas adquiridas de VWD, pero se observan con menos frecuencia. De particular interés en este documento es la pseudo VWD de tipo plaquetario. Al contrario que con las otras formas de VWD, el defecto genético en pseudo VWD de tipo plaquetario es en las plaquetas en vez de VWF y se caracteriza por una afinidad de unión anormalmente alta de las plaquetas de un individuo al VWF, que lleva a una hiper-capacidad de respuesta plaquetaria característica in vitro a una baja concentración de ristocetina.

Los ensayos de cribado adicionales para VWD incluyen aquellos ensayos que miden la actividad del Factor VIII, el antígeno VWF (VWF: Ag), la unión de VWF al colágeno (VWF: CB) y la actividad del cofactor de ristocetina de VWF (VWF: RCo). De particular interés en el presente texto es VWF: RCo, que actualmente es el estándar para la medida de la función de VWF. El ensayo de VWF: RCo utiliza la capacidad de VWF para unir GPIb plaquetaria después de la activación por ristocetina, lo que da como resultado una aglutinación de plaquetas dependiente de VWF que puede medirse cuantitativamente mediante agregación plaquetaria o turbidometría. Véase, Macfarlane D, et al., "A method for assaying the von Willebrand factor (cofactor de ristocetina)", Thromb. Diath. Haemorrh. 34: 306-308 (1975). De hecho, se asignó a una actividad biológica en unidades internacionales un estándar internacional de referencia para VWF: RCo por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y el Comité Científico y de Normalización de la Sociedad Internacional de Trombosis y Hemostasia (ISTH).

Desgraciadamente, VWF: RCo tiene varios fallos. Por una parte, el ensayo de VWF: RCo tiene una alta imprecisión intra e inter ensayos debido a su dependencia de la ristocetina. Véase, por ejemplo, Chng W, et al., "Differential effect of the ABO blood group on von Willebrand factor collagen binding activity and ristocetin cofactor assay”, Blood Coagul. Fibrinolysis 16: 75-78 (2005); Favaloro E, "An update on the von Willebrand factor collagen binding assay: 21 years of age and beyond adolescence but not yet a mature adult”, Semin. Thromb. Hemost. 33: 727-744 (2007); y Riddel A, et al., "Use of the collagen binding assay for von Willebrand factor in the analysis of tipe 2M von Willebrand disease: a comparison with the ristocetin cofactor assay”, Br. J. Haematol. 116: 187-192 (2002). Federici et al. han descrito recientemente un ensayo alternativo con reproducibilidad mejorada que utilizaba GPIb recombinante en un ensayo de inmunosorbente ligado a enzimas de unión con VWF; sin embargo, es dependiente de la ristocetina. Véase, Federici A, et al., “A sensitive ristocetin co-factor activity assay with recombinant glycoprotein Ib for diagnosis of patients with low von Willebrand factor levels”, Haematologica 89: 77-85 (2004).

Además, el VWF: RCo no siempre refleja la verdadera función de VWF in vivo cuando las mutaciones o polimorfismos están en la región de unión con ristocetina del VWF. Por ejemplo, algunos individuos tienen mutaciones de VWF que muestran una interacción reducida con la ristocetina de forma tal que VWF: RCo se reduce notablemente (p. ej., < 0,12 UI/dL), aunque no tienen síntomas hemorrágicos incluso con una cirugía invasiva. Véase, Flood V, et al., “Common VWF haplotypes in normal African-Americans and Caucasians recruited into the ZPMCB-VWD and their impact on VWF laboratory testing”, Blood 10: Abstract 714 (2007); Mackie I, et al., “Ristocetin-induced platelet agglutination in Afro-Caribbean and Caucasian people”, Br. J. Haematol. 50: 171-173 (1982); y Miller C, et al., “Measurement of von Willebrand factor activity: relative effects of ABO blood type and race”,

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J. Thromb. Haemost. 1: 2191-2197 (2003). Estos individuos, que parecen tener un polimorfismo en la región de unión a ristocetina, no tienen anomalías en la unión del VWF con la GPIb plaquetaria.

Además, el VWF: RCo se ve afectado por trastornos VWF/plaquetas de alta afinidad. Por ejemplo, individuos con pseudo VWD de tipo plaquetario tienen mutaciones GPIb que causan la unión espontánea de sus plaquetas al VWF. Véase, Franchini M, et al., “Clinical, laboratory and therapeutic aspects of platelet-type von Willebrand disease,” Int. J. Lab. Hematol. 30: 91-94 (2008); Miller J y Castella A, “Platelet-type von Willebrand's disease: characterization of a new bleeding disorder,” Blood 60: 790-794 (1982); y Miller J, “Platelet-type von Willebrand's Disease”, Thromb. Haemost. 75: 865-869 (1996). Del mismo modo, las personas con VWD tipo 2B tienen mutaciones del VWF que causan la unión espontánea a las plaquetas. Véase, Weiss H, "Type 2B von Willebrand disease and related disorders of patients with increased ristocetin-induced platelet aggregation: what they tell us about the role of von Willebrand factor in hemostasis”, J. Thromb. Haemost. 2: 2055-2056 (2004).

Debido a la amplia variabilidad y reproducibilidad del VWF: RCo, la técnica desea un ensayo de función de VWF que no requiera un agonista de la agregación de las plaquetas, tal como la ristocetina (es decir, sin ristocetina).

Tait et al. (2001) Blood, 98 (6): 1812-1818 se refiere a cambios de fenotipo que tienen como resultado la unión con alta afinidad del factor de von Willebrand con glucoproteína recombinante Ib-IX y análisis de las mutaciones de la enfermedad de von Willebrand de tipo plaquetario.

Resumen breve

La invención se refiere en general a métodos y kits para medir el VWF sin requerir un agonista de la aglutinación plaquetaria utilizando mutaciones de ganancia de función de la GPIb plaquetaria recombinante. Como se usa en este documento, un "agonista de la aglutinación plaquetaria" significa un agente que facilita la adhesión entre VWF y GPIb en pruebas de aglutinación plaquetaria. Los ejemplos de agonistas de la aglutinación plaquetaria incluyen, pero no se limitan a ellos, ristocetina y botrocetina.

En un primer aspecto, la presente invención se resume como un método para medir el factor de von Willebrand (VWF) sin usar un agonista de la aglutinación plaquetaria, comprendiendo el método las etapas de:

proporcionar una superficie que comprende glucoproteína Iba plaquetaria inmovilizada (GPIba) o un fragmento funcional de la misma, en donde la GPIba inmovilizada o fragmento funcional de la misma comprende al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V relativas a SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y;

poner en contacto con la superficie una muestra que tiene o se sospecha que tiene VWF, en donde la puesta en contacto se hace sin un agonista de la agregación plaquetaria; y

detectar un complejo de VWF y GPIba.

En algunas realizaciones del primer aspecto, la superficie puede ser una superficie celular tal que el método es una citometría de flujo (FC) o un ensayo de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Pueden ser células hospedadoras adecuadas un ovocito de Xenopus, una célula CHO-K1, una célula L929, una célula HEK- 293T, una célula COS-7 o una célula S2 diseñada para comprender un polinucleótido que codifica GPIba plaquetaria que tiene al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a la SEQ ID NO: 2 o un fragmento funcional de la misma. La célula hospedadora puede modificarse también por ingeniería genética para que comprenda además un polinucleótido que codifica la glicoproteína plaquetaria Ibp (GPIbp, SEQ ID NO: 4) y/o opcionalmente la glicoproteína plaquetaria IX (GP-IX, SEQ ID NO: 8) o fragmentos funcionales de la misma.

En algunas realizaciones del primer aspecto, la superficie puede ser una superficie de fase sólida tal que el método es un ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). La superficie de la fase sólida puede ser de agarosa, vidrio, látex o material plástico.

En algunas realizaciones del primer aspecto, el complejo se puede detectar con un anticuerpo anti-VWF marcado o un fragmento funcional del mismo, tal como un anticuerpo marcado fluorescentemente o un fragmento funcional del mismo marcado fluorescentemente. Alternativamente, el complejo se puede detectar mediante resonancia de plasmón de superficie o dispersión de luz cuasi-elástica.

En algunas realizaciones del primer aspecto, la muestra puede ser una muestra biológica de un individuo que tiene o se sospecha que tiene VWD, tal como plasma.

En algunas realizaciones del primer aspecto, las al menos dos mutaciones pueden ser D235Y/G233V, D235Y/M239V o G233V/M239V. En otras realizaciones del primer aspecto, las al menos dos mutaciones pueden ser una mutación triple, tal como D235Y/G233V/M239V.

En un segundo aspecto, la presente invención se resume como un kit para medir el factor de von Willebrand (VWF) activo, comprendiendo el kit:

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glucoproteína plaquetaria recombinante (GPIba) o un fragmento funcional de la misma, en donde la GPIba o el fragmento funcional de la misma comprende al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y; y

un reactivo para detectar un complejo de VWF y GPIba.

En algunas realizaciones del segundo aspecto, el reactivo puede ser un anticuerpo anti-VWF marcado o un fragmento funcional del mismo marcado, tal como un anticuerpo marcado fluorescentemente o un fragmento funcional marcado fluorescentemente del mismo.

En algunas realizaciones del segundo aspecto, el kit incluye además un control negativo o un control positivo, o ambos. Si se incluye el control negativo, este puede ser plasma empobrecido en VWF. Si se incluye el control positivo, puede ser plasma agrupado de individuos que no tienen VWD o puede ser un patrón disponible comercialmente, como los disponibles en la OMS y la ISTH. En otras realizaciones del segundo aspecto, el kit incluye además un control anormal. Si se incluye, el control anormal puede ser plasma agrupado de individuos con formas variantes de VWD, como el tipo 2A, 2B o 2M VWD, así como el plasma agrupado de individuos con verdadera pérdida de la función VWF in vivo o individuos de plasma agrupado que no son ensayados apropiadamente usando VWF: RCo (es decir, plasma de individuos que tienen cualquier mutación de ganancia de función en VWF).

En algunas realizaciones del segundo aspecto, las al menos dos mutaciones se pueden seleccionar entre D235Y/G233V, D235Y/M239V o G233V/M239V. En otras realizaciones del segundo aspecto, las al menos dos mutaciones pueden ser una mutación triple, tal como D235Y/G233V/M239V.

En algunas realizaciones del segundo aspecto, la GPIba plaquetaria recombinante que tiene al menos dos mutaciones seleccionadas entre G233V, D235Y y M239V con relación a la SEC ID N°: 2 o un fragmento funcional de la misma puede inmovilizarse en una superficie. En ciertas realizaciones, la superficie puede ser una superficie de la célula hospedadora de una célula hospedadora que no expresa nativamente GPIba plaquetaria, como se describió anteriormente. En otras ciertas realizaciones, la superficie puede ser una superficie de fase sólida, como se describió anteriormente.

Estas y otras características, objetos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor a partir de la descripción que sigue. En la descripción, se hace referencia a los dibujos adjuntos, que forman parte del presente documento y en los que se muestra a modo de ilustración, no de forma limitante, las realizaciones de la invención. Se entiende que la descripción de las realizaciones preferidas no limita la invención para cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas.

Breve descripción de los dibujos

La presente invención se entenderá mejor y las características, aspectos y ventajas distintas de las expuestas anteriormente se harán evidentes cuando se considere la siguiente descripción detallada de la misma. Tal descripción detallada hace referencia a los siguientes dibujos, en los que:

La FIG. 1 es una ilustración esquemática del receptor de adhesión de plaquetas, que muestra los componentes del receptor, que incluyen GPIba, GPIbp, GP-V y GP-IX;

Las FIGS. 2A a C muestran el efecto de las mutaciones de GPIba (simple, doble o triple, FIG. 2A, el eje y es la fluorescencia media y el eje x es la concentración logarítmica de ristocetina en mg/mL), ristocetina (FIG. 2B, el eje y es fluorescencia media y el eje x es la concentración logarítmica de ristocetina en mg/ml) y botrocetina (figura 2C, el eje y es fluorescencia media y el eje x es la concentración logarítmica de botrocetina en mg/ml) durante FACS. “Mock" o “control” es células HEK-293T transfectadas con un vector de expresión vacío.

La FIG. 3 muestra un ensayo FACS con GPIba que tiene dos mutaciones de pseudo VWD de tipo plaquetas usando muestras de individuos testigo y con VWD de tipo 3, que tiene un VWF entre bajo e indetectable (el eje y es fluorescencia media y el eje x es diluciones de plasma pobre en plaquetas (PPP)).

La FIG. 4 muestra un ensayo FACS con muestras adicionales de individuos que tienen VWD tipo 2B, que tiene mutaciones de VWF de ganancia de función (el eje y es fluorescencia media y el eje x es diluciones de plasma pobre en plaquetas (PPP)).

La FIG. 5 muestra un ensayo FACS con muestras adicionales de individuos que tienen VWD tipo 2M, que tiene una baja unión a GPIb, y VWD tipo 2M aparente, que tiene bajo VWF: RCo / VWF: Ag, niveles normales de VWF (el eje y es fluorescencia media y el eje x es diluciones de plasma pobre en plaquetas (PPP)).

La FIG. 6 muestra el efecto de la carga sobre la superficie de fase sólida durante un ELISA con GPIba inmovilizada que tiene dos mutaciones de pseudo VWD de tipo plaquetario (el eje y es fluorescencia media y el eje x es la concentración de ISTH (un patrón) en U/dL).

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Aunque la presente invención es susceptible de diversas modificaciones y formas alternativas, los ejemplos de realizaciones de la misma se muestran a modo de ejemplo en los dibujos y se describen con detalle en este documento. Sin embargo, debe entenderse que la descripción de las realizaciones preferidas no pretende limitar la invención a las formas particulares descritas, sino que, por el contrario, la intención es cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que caen dentro del espíritu y alcance de la invención según se define en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de las formas de realización preferidas

La presente invención procede de la observación del inventor de que algunos individuos con EVW tienen mutaciones de VWF que reducen el VWF: RCo (es decir, < 10 UI/dL), aunque su función VWF in vivo es normal (es decir, VWF aún se une al componente receptor de adhesión de plaquetas GPIb). Véase, Friedman K, et al., "Factitious diagnosis of type 2M von Willebrand disease (VWD) with a mutation in von Willebrand factor (VWF) that affects the ristocetin cofactor assay but does not significantly affect VWF function in vitro”: Blood 98: 536a (2001).

En cambio, otros individuos con VWD (es decir, VWD tipo 2B y de tipo plaquetario) tienen mutaciones de VWF o GPIba que reducen la concentración de ristocetina requerida para la agregación de las plaquetas en un ensayo para la función de VWF. Esta paradoja resulta de las mutaciones de ganancia de función que hacen que los multímeros de VWF y los receptores de GPIb en las plaquetas se unan más estrechamente entre ellos. El inventor planteó la hipótesis de que las mutaciones de GPIba de ganancia de función recombinante podrían ser útiles en ensayos para la función de VWF, evitando así la ristocetina (es decir, sin ristocetina). Como se usa en el presente documento, "sin ristocetina" o "sin agonista" significa que en un ensayo de VWF no se requiere ristocetina ni otros agonistas de aglutinación de plaquetas (es decir, botrocetina).

Por consiguiente, la presente invención se refiere de forma amplia a nuevos métodos y kits para VWF que utilizan mutaciones GPIba de ganancia de función, especialmente mutaciones GPIba identificadas en individuos que tienen pseudo VWD de tipo plaqueta, para medir VWF (denominado aquí "VWF: IbCo"). Los métodos y kits son útiles en una diversidad de aplicaciones. Por ejemplo, los métodos y kits descritos en este documento se pueden usar para diagnosticar VWD en un individuo sospechoso de tener VWD, clasificar VWD en un individuo diagnosticado con VWD y monitorizar el tratamiento en un individuo que tiene VWD.

A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente texto tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque en la práctica o prueba de la presente invención puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en este documento, se describen en este documento los métodos y materiales preferidos.

Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" significa dentro del 5% de un margen de concentración, margen de pureza, intervalo de temperatura o marco de tiempo establecido.

Como se usa en el presente texto, una "secuencia codificadora" significa una secuencia que codifica un polipéptido particular, tal como GPIba, y es una secuencia de ácidos nucleicos que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en ese polipéptido in vitro o in vivo cuando se pone bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan mediante un codón de iniciación en un extremo 5' (amino) y un codón de parada de la traducción en un extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir, pero no se limita a ellas, secuencias de ácido nucleico virales, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota, e incluso secuencias de ADN sintéticas. Una secuencia de terminación de la transcripción se ubicará usualmente en 3' con relación a la secuencia codificadora.

Como se usa en el presente documento, una "secuencia de expresión" significa una secuencia de control unida operativamente a una secuencia codificadora.

Como se usa en el presente texto, "secuencias de control" significa secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma ("IRES"), potenciadores y similares, que proporcionan colectivamente la replicación, la transcripción y la traducción de una secuencia codificadora en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan estar siempre presentes, siempre y cuando la secuencia de codificación seleccionada sea capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en una célula hospedadora apropiada.

Como se usa en el presente documento, un "promotor" significa una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ácido nucleico (es decir, ADN, en donde la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa y de iniciar la transcripción de una secuencia codificadora aguas abajo (dirección 3'). Los promotores de la transcripción pueden incluir "promotores inducibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos ligada operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), "promotores reprimibles" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos ligada operativamente al promotor es reprimida por un analito, un cofactor, una proteína reguladora, etc.) y "promotores constitutivos" (donde la expresión de una secuencia de polinucleótidos ligada operativamente al promotor no está regulada y por lo tanto es continua).

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Como se usa en el presente texto, una secuencia de "ácido nucleico" significa una secuencia de ADN o ARN. El término abarca secuencias que incluyen, pero sin limitarse a ellas, cualquiera de los análogos de base conocidos de ADN y ARN tales como 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5- fluorouracilo, 5- bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5- carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracilo-5- oxiacético, ácido uracilo-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2- tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil 5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

Como se usa en el presente documento, "unido operativamente" significa que los elementos de una secuencia de expresión están configurados para realizar su función habitual. Por tanto, las secuencias de control (es decir, promotores) unidas operativamente a una secuencia codificadora son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificadora. Las secuencias de control no necesitan ser contiguas a la secuencia de codificación, siempre y cuando funcionen para dirigir su expresión. Por ejemplo, las secuencias interpuestas no traducidas, pero transcritas, pueden estar presentes entre un promotor y una secuencia codificadora, y la secuencia promotora todavía se puede considerar "unida operativamente" a la secuencia codificadora.

Como se usa en este documento, "interacción operable" significa que las subunidades de un polipéptido (por ejemplo, los componentes del receptor de adhesión de las plaquetas, tales como GPIbp y/o GP-IX) y cualquier otra proteína accesoria, que se expresa heterólogamente en una célula hospedadora, se ensambla en un receptor de adhesión plaquetaria funcional (es decir, capaz de unión con VWF o fragmentos funcionales de la misma capaces de unirse a VWF).

Como se usa en el presente documento, un "vector" significa un replicón, tal como un plásmido, fago o cósmido, al que puede unirse otro segmento de ácido nucleico para provocar la replicación del segmento unido. Un vector es capaz de transferir secuencias génicas a células diana (por ejemplo, vectores plasmídicos bacterianos, portadores en partículas y liposomas).

Típicamente, los términos o expresiones "constructo vectorial", "vector de expresión", "vector de expresión génica", "vector de suministro de genes", "vector de transferencia génica" y "casete de expresión" se refieren todos ellos a un ensamblaje que es capaz de dirigir la expresión de una secuencia codificadora o gen de interés. Así pues, los términos incluyen vehículos de clonación y expresión.

Como se usa en el presente documento, un "polinucleótido aislado" o "polipéptido aislado" significa un polinucleótido o polipéptido aislado de su entorno natural o preparado usando métodos de síntesis tales como los conocidos por los expertos en la técnica. En ninguno de los casos se requiere una purificación completa. Los polinucleótidos y polipéptidos descritos en este documento se pueden aislar y purificar a partir del material normalmente asociado de formas convencionales, de forma tal que, en la preparación purificada, el polinucleótido o polipéptido es la especie predominante en la preparación. Como mínimo, el grado de purificación es tal que el material extraño en la preparación no interfiere con el uso del polinucleótido o polipéptido de la manera descrita aquí. El polinucleótido o polipéptido es de al menos aproximadamente 85% de pureza; alternativamente, al menos aproximadamente 95% de pureza; y alternativamente, al menos aproximadamente 99% de pureza.

Además, un polinucleótido aislado tiene una estructura que no es idéntica a la de cualquier molécula de ácido nucleico de origen natural o a la de cualquier fragmento de un ácido nucleico genómico de origen natural que abarca más de un gen. Un polinucleótido aislado también incluye, sin que sea limitación, (a) un ácido nucleico que tiene una secuencia de una molécula de ácido nucleico genómica o extracromosómica de origen natural, pero que no está flanqueada por las secuencias codificadoras que flanquean la secuencia en su posición natural; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en un genoma de una célula hospedadora procariota o eucariota de modo que el polinucleótido resultante no es idéntico a cualquier vector de origen natural o ADN genómico; (c) una molécula distinta tal como un ADNc, un fragmento genómico, un fragmento producido por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de nucleótidos recombinante que es parte de un gen híbrido (es decir, un gen que codifica una proteína de fusión). Se excluyen específicamente de esta definición los ácidos nucleicos presentes en mezclas de clones, por ejemplo, ya que estos se producen en una biblioteca de ADN tal como una biblioteca de ADN genómico o ADNc. Un polinucleótido aislado puede ser ADN o ARN modificado o no modificado, bien sea total o parcialmente monocatenario o bicatenario o incluso tricatenario. Además, un polinucleótido aislado puede modificarse química o enzimáticamente y puede incluir las llamadas bases no estándar tales como inosina.

Como se usa en el presente texto, "homólogo" significa los polinucleótidos o polipéptidos que comparten al menos aproximadamente 90% o al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia, por ejemplo con SEC ID N°: 1 a 6, respectivamente, que dan como resultado polipéptidos funcionales que se unen a VWF. Por ejemplo, un polipéptido que es al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% idéntico a las mutaciones de GPIba discutido en el presente texto, es de esperar que sea un constituyente del receptor de adhesión de las

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plaquetas. Un experto en la técnica entiende que las modificaciones al polinucleótido o bien al polipéptido incluyen sustituciones, inserciones (p. ej., añadiendo no más de aproximadamente diez nucleótidos o aminoácidos) y deleciones (p. ej., eliminación de no más de aproximadamente diez nucleótidos o aminoácidos). Estas modificaciones se pueden introducir en el polinucleótido o polipéptido descrito a continuación sin abolir la estructura y, finalmente, la función. Los polinucleótidos y/o polipéptidos que contienen tales modificaciones pueden usarse en los métodos de la presente invención. Dichos polipéptidos pueden identificarse usando los métodos de selección descritos a continuación.

Un ácido nucleico aislado que contiene un polinucleótido (o su complemento) que puede hibridarse con cualquiera de las secuencias de ácido nucleico ininterrumpidas descritas anteriormente, bajo unas condiciones de hibridación rigurosas o moderadamente rigurosas, también está dentro del alcance de la presente invención. Las condiciones de hibridación rigurosas se definen como hibridación a 68°C en 5 x SSC/5 x solución de Denhardt /1,0% SDS, y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS ± 100 pg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a temperatura ambiente, y las condiciones de hibridación moderadamente rigurosas se definen como el lavado en el mismo tampón a 42°C. En la técnica se dispone fácilmente de unas directrices adicionales relativas a tales condiciones, p. ej., en Sambrook J, et al. (eds.), "Molecular cloning: a laboratory manual”, (3a ed. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 2001); y Ausubel F, et al. (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons, N. Y.)

Es bien conocido en la técnica que los aminoácidos dentro del mismo grupo conservador pueden sustituirse típicamente entre sí sin afectar sustancialmente a la función de una proteína. Para el propósito de la presente invención, dichos grupos conservadores se exponen en la Tabla 1 y se basan en propiedades compartidas.

Tabla 1. Sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Resto original

Sustitución conservadora

Ala (A)

Val, Leu, Ile

Arg (R)

Lys, Gln, Asn

Asn(N)

Gln, His, Lys, Arg

Asp(D)

Glu

Cys (C)

Ser

Gln (Q)

Asn

Glu (E)

Asp

His (H)

Asn, Gln, Lys, Arg

Ile (I)

Leu, Val, Met, Ala, Phe

Leu (L)

Ile, Val, Met, Ala, Phe

Lys (K)

Arg, Gln, Asn

Met (M)

Leu, Phe, Ile

Phe (F)

Leu, Val, Ile, Ala

Pro (P)

Gly

Ser (S)

Thr

Thr (T)

Ser

Trp (W)

Tyr, Phe

Tyr (Y)

Trp, Phe, Thr, Ser

Val (V)

Ile, Leu, Met, Phe, Ala

Como se usa en el presente documento, un "anticuerpo" significa un anticuerpo monoclonal y policlonal y puede pertenecer a cualquier clase de anticuerpo (es decir, IgG, IgM, IgA, etc.). Un profesional con una experiencia normal en la técnica está familiarizado con los métodos para preparar anticuerpos monoclonales (Mab). Por ejemplo, un experto en la técnica puede fabricar anticuerpos monoclonales aislando linfocitos y fusionándolos con células de mieloma, produciendo así hibridomas. Véase, p. ej., Milstein C, "Handbook of experimental immunology" (Blackwell Scientific Pub., 1986); y Goding J, "Monoclonal antibodies: principles and practice" (Academic Press). Los

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hibridomas clonados se exploran después para producir, por ejemplo, "anti-GPIba" (es decir, anticuerpos que se unen preferentemente a GPIba o fragmentos de los mismos) o anticuerpos "anti-VWF" (es decir, anticuerpos que se unen preferentemente a VWF o fragmentos de los mismos). Así pues, los anticuerpos monoclonales no están limitados por la forma en que se producen los anticuerpos, tanto si dicha producción es in situ como si no. Alternativamente, los anticuerpos pueden producirse mediante tecnología de ADN recombinante que incluye, pero no se limita a ellas, la expresión en bacterias, levaduras, líneas de células de insectos o líneas de células de mamíferos.

Del mismo modo, un experto en la técnica está familiarizado con los métodos para preparar anticuerpos policlonales. Por ejemplo, un experto en la técnica puede preparar anticuerpos policlonales inmunizando un animal hospedador adecuado, p. ej. un conejo, con un inmunógeno y usando suero apropiadamente diluido o aislando inmunoglobulinas del suero. Por tanto, el animal puede inocularse con el inmunógeno, retirándose posteriormente la sangre del animal y se purifica una fracción de IgG. Otros animales hospedadores adecuados incluyen un pollo, cabra, oveja, cobaya, rata o ratón. Si se desea, el inmunógeno se puede administrar como un conjugado en el que el inmunógeno se acopla, por ejemplo, a través de una cadena lateral de uno de sus restos de aminoácido, a un vehículo adecuado. La molécula transportadora es típicamente un vehículo fisiológicamente aceptable. El anticuerpo obtenido puede purificarse hasta una pureza que llegue hasta aproximadamente un 70%, hasta aproximadamente 80%, hasta aproximadamente 90%, hasta aproximadamente 95%, hasta aproximadamente 99% o hasta aproximadamente 100%.

El anticuerpo también abarca fragmentos funcionales, como Fab y F(ab')2, de anticuerpos anti-GPIba o anti-VWF. El tratamiento de anticuerpos con enzimas proteolíticas, tales como papaína y pepsina, genera estos fragmentos de anticuerpo, especialmente fragmentos anti-GPIba.

Los anticuerpos se conjugan típicamente con un marcador detectable para una fácil visualización. Los ejemplos de marcadores adecuados para los métodos y kits descritos en el presente texto incluyen, pero no se limitan a ellos, marcadores radiactivos, biotina (que puede detectarse mediante avidina o estreptavidina conjugada con peroxidasa), lantánidos, fosfatasa alcalina y marcadores fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína, rodamina, especialmente la familia Alexa Fluor® de colorantes fluorescentes disponibles de Invitrogen/Molecular Probes). El marcado del anticuerpo se puede llevar a cabo p. ej. marcando grupos amina libres (covalente o no covalentemente). Algunos marcadores pueden detectarse utilizando un contador marcado adecuado para la detección de la etiqueta en cuestión.

Los anticuerpos anti-GPIba comercialmente disponibles y los anticuerpos anti-VWF son adecuados para usar con los métodos y kits descritos en este documento, y se pueden obtener de Blood Research Institute (Milwaukee, WI) y Dako (Carpinteria, CA), respectivamente.

Como se muestra en la FIG. 1, el receptor de adhesión de las plaquetas se compone de una combinación de cuatro proteínas, que incluye GPIb, que es un heterodímero de una cadena alfa (GPIba; número de ingreso de GenBank NM_000173.4; SEC ID N°: 1-2) y una cadena beta (GPIb\beta, número de ingreso de GenBank NM _ 000407.4, SEC ID N°: 3-4) ligada mediante enlaces disulfuro. Otros componentes del receptor incluyen GP-V (número de ingreso de GenBank NM_004488.2, SEC ID N°: 5-6) y GP-IX (número de ingreso de GenBank NM_000174.2, SEC ID N°: 7-8). El receptor de adhesión de las plaquetas se une a VWF (número de ingreso de GenBank NM_000552.3, SEC ID N°: 9-10) para regular la hemostasia y la trombosis.

De particular interés en el presente texto es la GPIba humana modificada de modo que no se requiere un agonista de la agregación de plaquetas en los ensayos de la función de VWF. Por ejemplo, la GPIba puede modificarse para que incluya las mutaciones de ganancia de función que causan pseudo VWD de tipo plaquetas, que incluye, pero no se limita a ella, G233V (véase, Miller J, et al., "Mutation in the gene coding the alpha chain of platelet glycoprotein Ib in platelet-type von Willebrand disease”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4761-4765 (1991), D235V (véase, Dong J, et al., "Novel gain-of-function mutations of platelet glycoprotein IBa by valine mutagenesis in the Cys209-Cys248 disulfide loop, which interacts with the A1 domain of VWF. Functional analysis under static and dynamic conditions”, J. Biol. Chem. 275: 27663-27670, M239V (véase, Russell S & Roth G, "Pseudo von Willebrand disease: a mutation in the platelet glycoprotein Ib alpha gene associated with a hyperactive Surface receptor”, Blood 81: 1787-1791 (1993), G233S (Matsubara Y, et al., "Identification of a novel point mutation in platelet glycoprotein Ib, Gly to Ser at residue 233, in a Japanese family with platelet-type von Willebrand disease”, J. Thromb. Haemost. 1: 2198-2205 (2003)); y K237V (véase, Dong et al., supra). Ventajosamente, la mutación o las mutaciones pueden estar en el puente disulfuro Cys209-Cys248 de GPIba que compromete la hemostasia aumentando la afinidad de GPIb por VWF. Por ejemplo, y como se muestra más adelante, el inventor encontró que D235Y es otra mutación de ganancia de función adecuada para su uso con los métodos y kits descritos en el presente texto.

Como se usa en este documento, un "fragmento funcional" significa un fragmento de un componente de un receptor de adhesión de plaquetas, tal como un fragmento de GPIba, que tiene al menos dos de la mutación antes mencionada, pero que retiene su capacidad para interaccionar con VWF u otros sustratos. Por ejemplo, el término amino de GPIba conserva su capacidad de interactuar con VWF. Como se muestra más adelante, los fragmentos de GPIba tan pequeños como 290 aminoácidos y que tienen dos mutaciones retuvieron la capacidad de interaccionar con el VWF, aunque se contemplan fragmentos más pequeños. Respecto a VWF, un fragmento funcional puede

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comprender al menos el dominio A1, que es el dominio de unión de GPIb. Con respecto a los anticuerpos, los fragmentos funcionales son aquellas porciones de un anticuerpo que se unen a un epítopo particular, tal como los dominios indicados anteriormente.

Como se usa en el presente texto, una "muestra" significa una muestra biológica, tal como líquido amniótico, humor acuoso, fluido cerebroespinal, fluido intersticial, linfa, plasma, líquido pleural, saliva, suero, esputo, líquido sinovial, sudor, lágrimas, orina, leche materna o tejido que tiene o se sospecha que tiene VWF. Con respecto a la medida de VWF, el plasma es una muestra adecuada.

Como se usa en el presente texto, una "superficie" significa, por ejemplo, la superficie de una célula o la superficie de una fase sólida, tal como un material polimérico insoluble, que puede ser un polímero orgánico como la poliamida o un polímero de vinilo (por ejemplo, poli(met)acrilato, poliestireno y polialcohol vinílico o derivados del mismo), un polímero natural, tal como celulosa, dextrano, agarosa, quitina y poliaminoácidos, o un polímero inorgánico, tal como vidrio o plástico. La superficie de fase sólida puede estar en forma de una esfera, microvehículo, partícula, membrana, tira, papel, película, perla o placa, en particular una placa de microtítulo.

Un aspecto de la presente invención incluye un ensayo de diagnóstico para medir el VWF. La metodología de base del ensayo puede ser FC, FACS o ELISA, cada uno de los cuales es bien conocido por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Alice Giva, "Flow cytometry: first principles” (2a ed. Wiley-Liss, Nueva York, 2001); Howard Shapiro, "Practical flow cytometry", (4a ed., Wiley-Liss, Nueva York, 2003); Larry Sklar, "Flow cytometry for biotechnology” (Oxford University Press, Nueva York, 2005); J. Paul Robinson, et al., "Handbook of flow cytometry" (Wiley-Liss, Nueva York, 1993); "Flow cytometry in clinical diagnosis” (3a ed., Carey, McCoy y Keren, eds., ASCP Press 2001); Lequin R, "Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)”, Clin. Chem. 51: 2415-2418 (2005); Wide L & Porath J, "Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies”, Biochem. Biophys. Acta. 30: 257-260 (1966); Engvall E & Perlman P, "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G”, Immunochemistry 8: 871-874 (1971); y Van Weemen B & Schuurs A, "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates”, FEBS Letters 15: 232-236 (1971),

Como se señaló anteriormente, la superficie para los métodos y kits descritos en la presente memoria puede ser la superficie de una célula hospedadora que exprese al menos GPIba de plaquetas para uso en FACS. Por ejemplo, se puede expresar de manera heteróloga (bien sea de forma transitoria o estable) GPIba mutante u otros componentes del receptor de adhesión de las plaquetas (es decir, GPIbp y/o GP-IX) en las células hospedadoras. Los expertos en la técnica conocen los métodos para expresar polinucleótidos y sus polipéptidos receptores de glucoproteínas plaquetarias codificados en células hospedadoras heterólogas. Véase, por ejemplo, Tait A, et al., "Phenotype changes resulting in high-affinity binding of von Willebrand factor to recombinant glycoprotein Ib-IX: analysis of the platelet-type von Willebrand disease mutations”, Blood 98: 1812-1818 (2001), y Dong et al., supra.

Las células adecuadas para su uso en la presente invención no muestran de forma nativa GPIba o los otros componentes del complejo receptor de adhesión de plaquetas. Uno de estos tipos de células son las células HEK- 293T (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, número de catálogo CRL-11268). Véase también Graham F, y col., "Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5”, J. Gen. Virol. 36: 59-74 (1977). Las células HEK-293 son fáciles de reproducir y mantener, son susceptibles de transfección usando una amplia variedad de métodos, tienen una alta eficacia de transfección y producción de proteínas, tienen traducción fidedigna y procesamiento de proteínas, y tienen un tamaño de célula pequeño con procesos mínimos apropiados para experimentos electrofisiológicos.

Otro tipo de célula adecuado son las células COS-7 (ATCC; n.° de catálogo CRL-1651). Véase también, Gluzman Y, "SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants”, Cell 23: 175-182 (1981). Al igual que las células HEK-293, las células COS-7 son fáciles de reproducir y mantener, y son susceptibles de transfección usando una amplia variedad de métodos.

Otro tipo de célula adecuada son los ovocitos de Xenopus. Los ovocitos de Xenopus se usan comúnmente para la expresión de genes heterólogos debido a su gran tamaño (~1,0 mm), que hacen fácil su manejo y su manipulación. Los ovocitos de Xenopus se prestan fácilmente a inyección y por tanto expresan proteínas funcionales cuando se inyectan con ARNc para una proteína deseada.

Otro tipo más de célula adecuado son las células de Drosophila melanogaster S2. Las células S2 son ideales para proteínas difíciles de expresar, y se dispone comercialmente de un sistema de expresión S2 en Invitrogen (Carlsbad, CA). El sistema de expresión S2 se puede diseñar para que preferiblemente carezca de la secuencia de secreción de Bip de manera que las proteínas codificadas se expresen en la superficie celular. La expresión de los componentes del receptor de adhesión plaquetaria en las células S2 fue mostrada previamente por Celikel et al. Véase, Celikel R, et al., "Modulation of alpha-thrombin function by distinct interactions with platelet glycoprotein Iba", Science 301: 218-221 (2003).

Cualquiera de los polinucleótidos contemplados para el receptor de adhesión de plaquetas puede clonarse en un vector de expresión (o una diversidad de vectores de expresión) construidos para soportar la expresión a partir de los polinucleótidos. Los vectores de expresión adecuados comprenden un promotor transcripcional activo en una

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célula huésped receptora aguas arriba, por ejemplo, de un polinucleótido GPIba modificado por ingeniería genética para que tenga las mutaciones mencionadas anteriormente o polinucleótidos adicionales, y puede comprender opcionalmente una secuencia de adición de poliA aguas abajo del polinucleótido.

El vector o vectores pueden ser introducidos (o co-introducidos), por ejemplo, mediante transfección o lipofección, en células hospedadoras receptoras competentes para recibir y expresar GPIba mutante y opcionalmente otros componentes del receptor de adhesión de plaquetas. Se puede emplear un kit de lipofección disponible comercialmente, tal como un kit disponible de Mirus Corporation (Madison, WI). Preferiblemente, las células hospedadoras receptoras no contienen GPIba de forma nativa, por lo que la presencia de la misma es completamente atribuible a la expresión del vector de expresión introducido. Las células huésped receptoras adecuadas se describen anteriormente y pueden expresar los polipéptidos en su superficie o segregarlos.

Alternativamente, la superficie para los métodos y kits descritos en el presente texto puede ser una superficie de fase sólida que tiene GPIba plaquetario inmovilizado sobre la misma, por ejemplo mediante unión covalente o anticuerpos. Las superficies de fase sólida adecuadas incluyen las superficies de fase sólida descritas anteriormente. Un experto en la materia está familiarizado con métodos para unir anticuerpos anti-GPIba o fragmentos funcionales de los mismos a superficies de fase sólida. Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo se puede inmovilizar en la superficie directamente mediante acoplamiento covalente o a través de un vehículo tal como una molécula de enlace o un anticuerpo inmovilizado en la superficie de la fase sólida. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal, tal como anti-GPIba o un fragmento funcional del mismo. Alternativamente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo anti-epítopo que reconoce una etiqueta de epítopo (por ejemplo, biotina, digoxigenina, GST, hexahistidina, hemaglutinina, FLAG™, c-Myc, VSV-G, V5 y HSV) complejado con GPIba. Las etiquetas de epítopo disponibles comercialmente y sus respectivos anticuerpos son adecuadas para su uso con los métodos y kits descritos en este documento, y se pueden obtener de Sigma Aldrich (St. Louis, Mo) y Abcam, Inc. (Cambridge, MA).

Los métodos y kits descritos en el presente texto son pues sensibles a la medida de los multímeros de VWF más grandes y funcionales, se correlacionan con VWF: Ag en individuos con función de VWF reducida y permanecen no afectados por mutaciones que afectan a la unión a VWF de la ristocetina pero no tienen un fenotipo hemorrágico.

La invención se entenderá mejor al considerar los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Células que expresan heterogéneamente la unión espontánea de GPIba mutante en ausencia de ristocetina.

Métodos: Se construyó un sistema de expresión del receptor de adhesión de plaquetas heterólogo mediante la transfección transitoria de células HEK-293T (ATCC) con un constructo GPIba de longitud completa que codifica una mutación simple (es decir, G233V, D235Y o M239V), una mutación doble (es decir, G233V/M239V, G233V/D235Y o D235Y/M239V) o una mutación triple (es decir, G233V/D235Y/M239V) relativa a la SEC ID N°: 2 o GPIba de tipo silvestre (SEQ ID NO: 2). Algunas células HEK-293T también se transfectaron transitoriamente con constructos GPIbp y GP-IX que codifican las SEQ ID NOS: 4 y 8, respectivamente. Un grupo simulado (mock) de células HEK- 293T fue tratado de manera similar, pero se transfectaron con un vector de expresión que carecía de los constructos anteriores, sirviendo así como controles o testigos.

Los constructos se clonaron en un vector pCI-neo (Promega, Madison, WI) y se expresaron en células HEK-293T como se describe más adelante. En algunos casos, se realizaron construcciones separadas para cada mutación GPIba; sin embargo, en otros casos se hizo una única construcción que tenía múltiples mutaciones de GPIba.

Brevemente, las células HEK-293T se sembraron en primer lugar hasta que llegaron a una confluencia del 50-80% (es decir, 3,5-4 x 106/100 mm de placa). Normalmente, las células se sembraron el día anterior a la transfección.

Para la transfección se calentaron a 37°C Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) y OptiMEM (Invitrogen). Se añadieron 800 pl de OptiMEM a 17 x 100 tubos de poliestireno (2 tubos/placa a transfectar). Se añadió lo siguiente a un conjunto de tubos: 4,5 pg de ADN (1,5 pg de cada constructo) y 20 pl de reactivo PLUS (Invitrogen). A otro conjunto de tubos se añadió lo siguiente: 30 pl de Lipofectamina (Invitrogen). Cada conjunto se dejó incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla de ADN se añadió después a la mezcla de Lipofectamina y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Durante la incubación, las células se lavaron dos veces con 5 ml de HBSS. Se añadieron 3,4 ml de OptiMEM a la mezcla de ADN/Lipofectamina, y después se añadieron a las células HEK-293T (volumen total = 5 ml). Las células se incubaron luego a 37°C con 5% de CO2 durante 3-3,5 horas.

Después de la transfección, se eliminó el medio de transfección y se añadieron a las células 8 ml de medio completo nuevo. Las células se incubaron a 37 °C con 5% de CO2 durante aproximadamente 60 horas. Después las células fueron cosechadas para su uso en un ensayo FACS estándar usando ristocetina.

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Para FACS, se añadieron a la placa aproximadamente 50 |jl de una dilución 1:10 de plasma pobre en plaquetas (PPP; fuente de VWF) en el tampón para ensayo y se diluyó en serie 1: 2 hasta la dilución final de 1: 80. Se usó como patrón ISTH Lot n° 3 (GTI; Milwaukee, WI) y se diluyó 1: 10 en tampón para ensayo y se diluyó en serie 1: 2 hasta una dilución final de 1: 320. La placa se incubó después durante una hora a temperatura ambiente. Después de una hora de incubación, la placa se centrifugó de nuevo a 1200 rpm durante 5 minutos y se desechó el sobrenadante.

En algunos experimentos, el PPP se diluyó en PBS que contenía BSA al 1% y 1 mg/ml de ristocetina A (American Biochemical & Pharmaceuticals, Ltd., Marlton, NJ) o bien 1 mg/ml de Botrocetin (Sigma Aldrich).

Se diluyeron anticuerpos marcados fluorescentemente (anti-GPIba, Blood Research Institute) hasta una concentración final de 5 jg/ml en tampón para ensayo. El anti-VWF policlonal marcado fluorescentemente también se diluyó hasta una concentración final de 5 jg/ml en tampón para ensayo y se añadió a células transfectadas incubadas en PPP. Se añadieron IgG de conejo normal (NRIgG; Pierce) y AP-1 a una concentración de 5 jg/ml a células transfectadas como controles negativo y positivo, respectivamente. La placa se incubó en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Se añadió tampón para ensayo a cada pocillo para llevar el volumen final hasta 150 jl, y se llevó a cabo FACS usando un sistema LSRII BD (Becton Dickinson). Los resultados se muestran en unidades VWF: IbCo.

Resultados: como se muestra en la FIG. 2A, las células HEK-293T transfectadas simuladas (mock) no mostraron ninguna unión en presencia de ristocetina, mientras que las células que expresaban GPIba de tipo silvestre mostraron una disminución dependiente de la concentración en la unión a ristocetina después de 1,2 mg/ml. Las células HEK-293T que expresan solo una de las mutaciones de GPIba mostraron una sensibilidad aumentada incluso a bajas concentraciones de ristocetina, lo que sugiere que la unión es independiente de la ristocetina. Las células que expresan dos mutaciones de GPIba mostraron una sensibilidad extrema a la ristocetina o, alternativamente, un aumento de la unión espontánea que era independiente de la ristocetina. Las células HEK-293T que expresan la mutación triple de GPIba (es decir, G233V/D235Y/M239V), sin embargo, no mostraron un aumento de la sensibilidad/unión espontánea con relación a los dobles mutantes. Como se muestra en la FIG. 2B, cada uno de los mutantes dobles (es decir, G233V/M239V, G233V/D235Y o D235Y/M239V) mostró una unión espontánea comparable relativa entre sí que no se vio significativamente afectada por la ristocetina (es decir, sin ristocetina). Como se esperaba, el control de tipo silvestre mostró aumentos dependientes de la concentración en VWF:IbCo a ristocetina. Como se muestra en la FIG. 2C, VWF:IbCo no se ve afectado por el tipo de agonista de la agregación de plaquetas, ya que ninguno de los dobles mutantes estaba significativamente afectado por la botrocetina (es decir, sin botrocetina). Como se esperaba, el control de tipo silvestre mostró aumentos dependientes de la concentración en VWF: IbCo a botrocetina.

Ejemplo 2: Función de VWF en muestras de pacientes usando GPIba mutante en FACS.

Métodos: Células HEK293T se transfectaron transitoriamente con un constructo GPIba de tipo silvestre o GPIba que codifica uno de los mutantes dobles, como se describió anteriormente. Las células fueron transfectadas adicionalmente con los constructos GPIbp y GP-IX. Un grupo de células HEK-293T fueron transfectadas simuladamente, como se describió anteriormente.

Después de cuarenta y ocho horas, las células transfectadas se recogieron de la placa con EDTA 3 mM, se resuspendieron en tampón para ensayos (es decir, 1x PBS que contenía BSA al 2%) y se contaron. No se usó tripsina, ya que potencialmente puede escindir GPIba de la superficie celular. Después del recuento, 1,75 x 105 células se cultivaron en placas de 96 pocillos (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N. J.) como forma de estandarizar GPIba en la superficie de la placa, y después la placa se centrifugó a 2000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. El sobrenadante fue desechado.

Las células HEK-293T que expresan las mutaciones GPIba se usaron en ensayos de citometría de flujo para probar la unión con VWF, que se midió con un anticuerpo policlonal anti-VWF marcado fluorescentemente de Dako. Se desarrolló una curva normal usando diluciones en serie de plasma de referencia previamente estandarizadas frente a los patrones de VWF ISTH y WHO basados en el patrón internacional VWF: Ag que también está estandarizado para VWF: RCo.

En un conjunto de experimentos, se usaron muestras de pacientes normales para determinar si las células HEK- 293T requirieron todos los componentes del receptor de adhesión de plaquetas o simplemente GPIba. Se usaron muestras de pacientes normales. En otro conjunto de experimentos, se usaron muestras de pacientes de individuos normales y de individuos con VWD en el ensayo FACS como se describió anteriormente en el Ejemplo 2.

Las muestras incluían 41 normales, 16 VWD de plasma tipo 2M, 5 VWD tipo 2 y 5 VWD tipo 2. Se incluyeron individuos con VWD tipo 2M aparente, pero sin síntomas clínicos, y afroamericanos con una relación reducida de VWF: RCo/VWF: Ag (RCo/Ag). De las 16 muestras de VWD de tipo 2M, 7 habían reducido notablemente el VWF: IbCo (coherente con el ensayo VWF: RCo), y 9 tenían VWF: IbCo normal. Los afroamericanos con SNPs asociados con una proporción RCo/Ag reducida tenían ensayos VWF: IbCo que se correlacionaron con su VWF: Ag en contraste con las relaciones anormales RCo/Ag identificadas mediante ensayos estándar. Los individuos de tipo 2A

exhibieron ensayos reducidos de VWF: IbCo y el tamaño del multímero pareció correlacionarse con la actividad de VWF: IbCo. Así pues, la medida de la función VWF usando el ensayo VWF: IbCo se correlaciona más directamente con la función de VWF y evita algunos de los inconvenientes y la variabilidad funcional de los ensayos VWF: RCo.

Resultados: Como se muestra en la Tabla 2, no se requieren GPIbp y GP-IX para la expresión superficial de GPIba 5 mutante, ya que los resultados de FACS de células HEK-293T que expresan componentes múltiples del receptor de adhesión a la placa no fueron significativamente diferentes de las células que expresan solo GPIba.

Tabla 2: Efecto de GPIba que tiene una mutación doble con o sin los otros componentes del receptor de adhesión de las plaquetas en un FACS.

Muestra

VWF:RCo conocido (UI/dL) GPIba (G233V/M239V), GPIbp y IX GPIba % Dif. entre transfecciones % Dif. entre GPIba, GPIbp y IX y conocido % Dif. entre GPIba, y conocido

ISTH 2

71 70,4 70,3 0,1 0,4 0,5

ISTH 3

86 86,9 91,4 2,5 0,5 3,0

CCNRP

82 to 103 89,0 74,6 8,8 4,1 4,7

Cntrl 3

65 64,4 52,1 10,5 0,5 11,0

Cntrl 4

24,6 26,7 22,7 8,0 4,0 4,1

JS

0 0 0 0 0 0

XX-01

200 136,4 119,5 6,6 18,9 25,2

ISTH = muestra de referencia

Como se muestra a continuación en la Tabla 3, el ensayo FACS tuvo como resultado medidas de VWF comparables 10 a las de un método utilizado en laboratorios clínicos. Las muestras fueron individuos normales e individuos que tienen VWD. La Tabla 4 es similar a la Tabla 3, excepto que las muestras eran de individuos normales y de individuos con VWD de tipo 2. La Tabla 5 es también similar a la Tabla 3, excepto que las muestras eran de individuos que tenían VWD Tipo 2M.

Tabla 3: Resumen de VWF:IbCo por FACS en muestras de plasma de afroamericanos y caucásicos con y sin 15 polimorfismos de nucleótido simple (SNPs) de VWF.

Muestra

VWF:Ag 1 VWF:RCo Rel, 1 VWF:Ag 2 VWF:IbCo Rel, 2 Rel, 2/Rel, 1

IN-09

215 104 0,484 167 131 0,781 0,608

XX-22

193 140 0,725 152 240 1,579 1,244

XX-24

278 225 0,809 233 240 1,029 0,863

XX-27

195 130 0,667 186 147 0,788 0,753

XX-29

85 74 0,871 79 104 1,313 1,222

AT-09

103 69 0,670 88 78 0,886 0,756

AT-13

71 72 1,014 72 89 1,226 1,251

AT-14

257 248 0,965 231 233 1,009 0,906

AT-17

225 95 0,422 188 144 0,768 0,641

AT-18

225 195 0,867 186 155 0,834 0,689

XX-21

85 92 1,082 90 72 0,801 0,844

AT-06

154 176 1,143 150 -- -- --

IN-15

122 85 0,697 83 140 1,685 1,146

PB-06

86 88 1,023 78 137 1,755 1,594

PB-14

234 211 0,902 238 197 0,831 0,843

PB-17

109 93 0,853 104 68 0,649 0,620

Muestra

VWF:Ag 1 VWF:RCo Rel, 1 VWF:Ag 2 VWF:IbCo Rel, 2 Rel, 2/Rel, 1

AT-16

82 94 1,146 73 94 1,284 1,143

AT-19

164 151 0,921 147 126 0,859 0,771

AT-42

86 69 0,802 70 64 0,902 0,739

NO-53

243 252 1,037 239 159 0,666 0,655

DT-08

68 71 1,044 58 62 1,064 0,910

DT-01

88 107 1,216 91 82 0,906 0,937

DT-06

82 79 0,963 83 82 0,981 0,995

XX-04

96 109 1,135 86 128 1,481 1,334

XX-06

129 149 1,155 111 128 1,148 0,993

XX-13

124 169 1,363 114 186 1,638 1,503

IN-13

103 92 0,893 100 88 0,887 0,859

IN-22

96 110 1,146 104 65 0,627 0,678

PB-09

88 78 0,886 100 77 0,767 0,870

XX-03

106 136 1,283 103 160 1,551 1,511

XX-12

137 183 1,336 128 189 1,437 1,380

XX-14

115 163 1,417 109 -- -- --

XX-15

123 137 1,114 159 122 0,768 0,992

IN-01

209 220 1,053 149 -- -- --

IN-03

71 68 0,958 68 54 0,801 0,762

IN-07

95 85 0,895 77 76 0,995 0,802

PB-01

84 77 0,917 82 71 0,862 0,805

PB-04

155 162 1,045 146 105 0,722 0,678

PB-20

107 114 1,065 91 95 1,046 0,855

NO-23

-- -- -- 143 <1,1 -- --

1 = método DT (un método de laboratorio clínico) 2 = método BRI (método del Blood Research Institute) Área recuadrada = < 0,81

Tabla 4: VWF:lbCo por FACS en plasma procedente de afroamericanos y caucásicos con/sin VWD Tipo 2 y repeticiones.

Muestra

Raza VWD Fenotipo VWF Mutación VWF:Ag VWF:RCo RCo/Ag FACS1 FACS1/Ag FACS2 FACS2/Ag

DB

AA "2M" 3 AA snps 86 47 0,547 78 0,910 78 0,905

MK0055

AA "2M" P1467S 257 36 0,140 214 0,833 184 0,718

LJ

C "2M" 3 AA snps 66 40 0,606 180 2,734 48 0,735

IN0061

2M R1374C 22 11 0,500 4 0,204 10 0,432

RH

2B R1308S 43 37 0,860 67 1,558 67 1,557

LB

2B V1316M 91 62 0,681 159 1,751 106 1,162

SB

2B V1316M 27 12 0,444 36 1,347 25 0,914

AJ

2B H1268D 21 17 0,810 31 1,484 41 1,959

PB0068

2B R1306W 23 13 0,565 - - 25 1,065

YG

2A L1503P 26 13 0,500 - - 19 0,714

AV

2A G1579R 46 16 0,348 - - 1 0,028

AT0021

2A M7401? 31 12 0,387 - - 18 0,574

AT0032

2A I1628T 120 32 0,267 - - 103 0,586

IA0001

2A R1597W 33 <10 - - - 8 0,247

ATO017

AA NL 3 AA snps 225 95 0,422 144 0,641 156 0,695

XX0027

AA NL 3 AA snps 195 130 0,677 147 0,753 116 0,595

XX0004

C NL - 96 109 1,135 128 1,334 114 1,183

XX0013

C NL - 124 169 1,363 186 1,503 105 0,843

PB0014

AA NL - 234 211 0,902 197 0,843 213 0,909

AT0042

AA NL - 86 69 0,802 64 0,739 91 1,056

AA = afroamericano

C = caucásico

NL = normal

"2M" = tipo 2M aparente

Tabla 5: Función VWF en el plasma de afroamericanos y caucásicos con/sin VWD Tipo 2 M.

Muestra

Raza VWD Fenotipo VWF Mutación VWF:Ag 1 VWF:R Co 1 RCo/Ag 1 FACS2 FACS2/Ag

TB

C "2M" -- 127 87 0,69 87 0,69

DB

AA "2M" 3 AA snps 86 47 0,55 78 0,91

AC

C 2M G13242S 95 13 0,14 <1,1 --

BF

-- 2M I1416T (new) 89 31 0,35 36 0,41

MG

H 2M I1425F 45 16 0,36 >1,1 --

LG

C 2M E1359K 67 37 0,55 27 0,41

GI

-- 2M D1283H (new) 16 4 0,25 <1,1 --

KJ

C 2M -- 12 3 0,25 <1,1 --

LJ

AA "2M" 3 AA snps 66 40 0,61 180 2,73

BM

C 2M I1426T 156 43 0,28 93 0,60

AR

-- 2M R1374L 48 10 0,21 <1,1 --

DR

AA "2M" R1342C; I1343V; 13013103 del; y R2185Q 38 12 0,32 37 0,97

MK0038

C 2M R1392-Q1402 del 47 11 0,23 <1,1 --

IN0061

C 2M R1374C 22 11 0,50 4 0,20

MK0055

AA "2M" P1467S 257 36 0,14 214 0,83

MK0058

AA "2M" P1467S 265 68 0,14 194 0,73

AA = afroamericano C = caucásico H = hispánico

Resultados: como se muestra en la FIG. 4, los individuos con VWF normal mostraron un aumento típico en la fluorescencia media con diluciones de su plasma más bajas. Como era de esperar, los individuos con vWd Tipo 3 mostraron cambios en la fluorescencia media porque su plasma tiene un VWF bajo o nulo.

5 Como se muestra en la FIG. 5, los individuos con VWD tipo 2B mostraron un aumento mucho más temprano en la fluorescencia media en comparación con los normales, comenzando a diluciones muy altas de su plasma (es decir, > 1/100). La VWD Tipo 2B se caracteriza por tener mutaciones de ganancia de función. Nuevamente, los individuos con VWD Tipo 3 no mostraron reacción en el ensayo.

Como se muestra en la FIG. 6, los individuos con VWD Tipo 2M no mostraron aumento en la fluorescencia media en 10 comparación con los normales. La VWD Tipo 2M se caracteriza por VWF defectuoso que no interactúa con GPIba. Los individuos con tipo 2M aparente ("2M") mostraron un aumento mucho más temprano en la fluorescencia media en comparación con los normales, comenzando en diluciones muy altas de su plasma (es decir, > 1/100). El tipo 2M aparente se caracteriza por un bajo VWF:RCo/VWF:Ag, pero niveles normales de VWF. Tampoco en este caso los individuos con VWD Tipo 3 mostraron reacción en el ensayo.

15 Ejemplo 3: Función de GPIba mutante en ELISA.

Se transfectaron de forma estable células S2 (Invitrogen) con un constructo GPIba mutante, un constructo GPIba de tipo silvestre y un constructo GP-IX. En algunos experimentos las células S2 se transfectaron con constructos GPIba que tenían una mutación C65A y una mutación ATM290. La mutación C65A eliminó una cisteína que podría permitir la dimerización de GPIba; y la mutación ATM290 eliminó la región transmembrana de modo que la proteína 20 expresada se excretó.

Brevemente, los constructos fueron clonados en un vector de secreción pMT/Bip/V5-His:GPIba C65A, D235Y, M239V ATM290 o pMT/Bip/V5-His: GPIba C65A ATM290 (Invitrogen). El día 1, las células S2 se contaron y se sembraron en un plato de 35 mm o en un pocillo de una placa de 6 pocillos a razón de 3 x 106 células en 3 ml de

5

10

15

20

25

30

35

40

medio completo (Ex-Cell 420 + 10% FBS + 7 mM L-Glutamina) . Las células se dejaron crecer 6-8 horas a 28°C. A un conjunto de tubos se añadió lo siguiente: Solución A, que contenía 36 jl de CaCl2 2 M, 19 |jg de ADN de plásmido (purificado con Qiagen Maxi Kit; Qiagen; Valencia, CA), 1 |jg de pCoBlast (vector de selección) y ddH20 hasta 300 jl. A otro conjunto de tubos se añadió lo siguiente: Solución B, que contenía 300 jl de 2 x solución salina tamponada con HEPES. La solución A se añadió lentamente gota a gota a la solución B mientras se agitaba suavemente en vórtice. Las soluciones combinadas fueron después incubadas a temperatura ambiente durante 3040 minutos hasta que se formó un precipitado fino.

La solución mixta se añadió gota a gota a las células incubadas en placa mientras se removía la placa suavemente. Las células se incubaron a continuación durante la noche a 28°C (aproximadamente 16-24 horas).

Al día siguiente, la solución de transfección se eliminó y se reemplazó con 3 ml de medio completo fresco y se incubó a 28°C sin CO2. El día 5, las células se resuspendieron y se transfirieron a un tubo cónico de 15 cc, se centrifugaron a 2400 rpm durante 2 minutos. El medio se decantó y las células se resuspendieron en 3 ml de medio estable (medio completo + 25 jg/ml de Blastidin-S) y se incubaron en un nuevo plato o pocillo.

La selección comenzó en la semana 2. Como se hizo el día 5, el medio de selección se reemplazó cada 3-4 días con 3 ml de medio de selección fresco. La selección y la expansión continuaron durante la semana 3. Durante este tiempo, las células se resuspendieron, se transfirieron a tubos cónicos de 15 cc y se centrifugaron a 2400 rpm durante 2 minutos. Los medios se decantaron y las células se resuspendieron en 5 ml de medio selector y se cultivaron en placa en un matraz T25 nuevo. Al cabo de 4 días, las células se expandieron de 1 T25 a 2 matraces T25.

Las existencias de expansión y congelación comenzaron en la semana 4. Las células se expandieron desde los matraces T25 hasta los matraces T75 (3 x 106 células/ml de medio). Los matraces T75 recibieron 15 ml de medio, lo que era aproximadamente 45 x 106 células. Las células restantes (aproximadamente 2 x 107 células/vial) se congelaron y se almacenaron en nitrógeno líquido.

La inducción de las células en los matraces T75 comenzó en la semana 5. Las células se resuspendieron, se transfirieron a un tubo cónico de 15 cc para el recuento, y se centrifugaron. Se resuspendieron 45 x 106 células en 15 ml de medio de inducción (medio estable + CuSO4 500 jM) y se transfirieron a matraces T75. Las células se incubaron después 4 días a 28°C, y el sobrenadante que tenía GPIba segregada fue recolectado.

Como se muestra en la Tabla 6 y en la FIG. 3, varias superficies de fase sólida fueron primero probadas para los ensayos ELISA. La Tabla 6 muestra que la densidad superficial de GPIba estaba afectada por la carga superficial de la superficie de fase sólida, mientras que la FIG. 3 muestra que diferentes superficies de fase sólida revestidas con GPIba que tienen una doble mutación afectan a la unión de VWF. La carga superficial de fase sólida parece afectar a la unión de GPIba/VWF, sugiriendo que cualquier superficie de fase sólida debe analizarse primero en relación con su capacidad de (1) proporcionar una densidad uniforme de GPIba y (2) de permitir que VWF se una a GPIba. Después de considerar tanto la Tabla 6 como la FIG. 3, las placas Immulon® 4 HBX funcionaron mejor y se usaron en adelante.

Tabla 6: Efecto de varias superficies de fase sólida sobre la concentración de Doble Mutación GPIba (G233V/M239V) (las mismas muestras en placas diferentes).

Superficie de fase sólida Característica de la superficie Concentraciones de GPIba calculadas

Immulon 1

Hidrófobo 635,1

Immulon 2

Hidrófobo 370,8

Immulon 4

Máximo 383,7

Polysorp

Hidrófobo 321,7

Corning medio

Hidrófobo 576,8

Corning alto

Iónico y/o hidrófobo 414,7

Multisorb

Moléculas polares no unión

Maxisorb

Hidrófobo/hidrófilo 408,5

Una placa Immulon® 4 HBX Plate (Thermo Scientific; Waltham, MA) fue recubierta con anticuerpo monoclonal anti- GPIba 142.16 (Blood Research Institute) a una concentración de 5 jg/ml, que después se incubó durante la noche a 4°C. La placa se bloqueó con PBS que contenía 1% de BSA durante 1 hora a temperatura ambiente. Las proteínas expresadas en S2 purificadas con níquel - GPIba C65A, D235Y, M239V y ATM290 - se diluyeron en PBS que contenía 1% de BSA y se incubaron en la placa recubierta con anticuerpo anti-GPIba durante 1 hora a 37°C. Véase,

Celikel et al., supra.

El PPP de controles o individuos que tienen VWD se diluyó 1:50 en PBS que contenía 1% de BSA y se diluyó en serie 1: 2 hasta una dilución final de 1:100. El PPP diluido se añadió a la placa y se incubó durante 1 hora a 37°C. El lote N° 3 de ISTH se utilizó de nuevo como patrón, empezando las diluciones de curva a 1:25 en tampón de sustrato, que luego se diluyó en serie 1: 2 a una dilución final de 1:1600. Se añadieron 2 pg/ml de AVW-1 biotinilada y AVW- 5 15 (Blood Research Institute) a la placa y se incubaron durante 30 minutos a 37°C. Finalmente, se añadió a la placa

fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Ltd., West Grove, PA.), diluido 1:5000 en tampón para sustrato, y se incubó durante 30 minutos a 37°C. Se diluyó 1: 100 p-nitrofenil fosfato (PNPP; Invitrogen), un sustrato de fosfato alcalino, en tampón para sustrato y se añadió a la placa. La placa se leyó a 405/650 nm en un lector de placas. La placa se lavó tres veces entre cada etapa con PBS que contenía Tween-20 10 al 0,05%.

Resultados: como se muestra en las Tablas 7 y 8, los individuos con VWF normal mostraron resultados de ELISA similares al margen tanto si se añadió ristocetina al ensayo como si no se hizo. Además, el ensayo ELISA dio como resultado medidas de VWF comparables a un método utilizado en laboratorios clínicos.

Tabla 7: Resumen de VWF:lbCo mediante ELISA en muestras de plasma de afroamericanos y caucásicos con y sin polimorfismos de nucleótidos simples VWEF (SNPs).

Sujeto

VWF:Ag IbCo ELISA Ristocetina ELISA lbCoA/WF:Ag RisA/WF:Ag VWF:Ag clínico VWF.RCo VWF:RCoA/WF:Ag

ISTH 3 A

121,25 109,4 127,3 0,90 1,05 106 86 0,81

Ctrl 5 (70%)

75,62 68,97 69,68 0,91 0,92 74,2 60,2 0,81

Ctrl 6 (35%)

32,28 31,12 28,76 0,96 0,89 37,1 30,1 0,81

CCNRP 7122 A

94,56 84,6 73,34 0,89 0,78 114 71 0,62

ISTH 3 B

96,71 99,71 104,05 1,03 1,08 106 86 0,81

MK0038

33,44 1,41 14,16 0,04 0,42 47 11 0,23

XX0017

139,5 157,35 169,5 1,13 1,22 206 200 0,97

JS

0 0,5 0,99 0,00 0,00 <1 <10 0,00

Ctrl 8 (30%)

23,84 26,96 23,58 1,13 0,99 31,8 25,8 0,81

ISTH 3 C

85,14 94,42 90,48 1,11 1,06 106 86 0,81

CCNRP 7122 B

59,61 60,64 55,44 1,02 0,93 114 71 0,62

AT0068

70,4 59,18 31,47 0,84 0,45 99 57 0,58

Tabla 8: Resumen de VWF:IbCo mediante ELISA en muestras de plasma de afroamericanos y caucásicos con y sin

polimorfismos de nucleótidos simples VWEF (SNPs).

Sujeto

VWF:Ag clínico BRI VWF:Ag VWF:RCo clínico IbCo ELISA Ristocetina ELISA VWF:RCo/V WF:Ag clínico IbCo ELISA/BRI VWF:Ag

AA w/1380 + 1435+1472

HN

334 228 165 165 -- 0,494 0,725

XX

278 228 225 235 222 0,809 1,029

AT

257 309 248 234 220 0,965 0,759

AT

225 159 198 149 152 0,880 0,932

AT

225 172 95 67 106 0,422 0,393

IN

215 179 104 77 73 0,484 0,429

XX

193 200 140 123 154 0,725 0,616

NO

179 178 180 171 -- 1,006 0,960

AT

103 83 69 58 64 0,670 0,701

XX

85 67 74 73 57 0,871 1,095

AT

71 65 72 70 53 1,014 1,077

HN

67 77 54 54 -- 0,806 0,704

AA w/1472 solo

NO

259 209 224 151 213 0,865 0,723

XX

195 129 130 118 132 0,667 0,910

XX

185 143 154 143 183 0,832 1,001

XX

167 172 170 123 198 1,018 0,714

NO

166 151 175 155 -- 1,054 1,025

IN

153 123 146 120 55 0,954 0,970

NO

144 141 85 92 -- 0,590 0,652

DT

141 -- 121 -- -- 0,858 --

HN

139 -- 98 -- -- 0,705 --

XX

137 112 123 90 151 0,898 0,801

HN

136 136 113 106 -- 0,831 0,784

XX

122 89 85 75 -- 0,697 0,839

XX

116 103 89 82 81 0,767 0,793

XX

110 104 91 100 62 0,827 0,967

IN

108 107 101 86 94 0,935 0,800

AT

99 91 57 50 25 0,576 0,550

DT

98 89 85 79 85 0,867 0,885

AT

84 96 79 82 63 0,940 0,856

AA w/ no SNPs

NO

243 237 252 217 -- 1,037 0,917

PB

234 192 211 110 83 0,902 0,576

Sujeto

VWF:Ag clínico BRI VWF:Ag VWF:RCo clínico IbCo ELISA Ristocetina ELISA VWF:RCo/V WF:Ag clínico IbCo ELISA/BRI VWF:Ag

DT

224 185 167 190 -- 0,746 1,025

AT

199 178 193 177 -- 0,970 0,993

NO

195 179 220 207 233 1,128 1,160

AT

164 132 151 98 96 0,921 0,743

AT

154 139 176 159 135 1,143 1,143

IN

122 76 85 68 74 0,697 0,897

PB

109 91 93 76 63 0,853 0,832

PB

86 63 88 64 52 1,023 1,025

AT

86 107 97 68 63 1,128 0,633

AT

86 57 69 60 56 0,802 1,055

XX

85 79 92 65 44 1,082 0,817

AT

82 93 94 70 49 1,146 0,750

C w/ 1380 + 1435 + 1472

PB

180 144 149 122 115 0,828 0,842

IN

94 91 84 68 79 0,894 0,747

C w/ 1472 solo

XX

206 254 200 266 251 0,971 1,050

IN

192 137 144 133 126 0,750 0,973

DT

174 148 137 165 127 0,787 1,119

IN

171 106 122 94 127 0,713 0,888

PB

129 102 85 76 66 0,659 0,751

IN

111 88 99 76 78 0,892 0,861

XX

97 67 89 82 80 0,918 1,224

HN

94 103 82 82 -- 0,872 0,791

IN

91 65 88 58 51 0,967 0,902

C w/ no SNPs

PB

289 313 256 309 292 0,886 0,988

IN

237 171 255 154 275 1,076 0,901

IN

187 165 138 124 144 0,738 0,753

XX

129 121 149 90 112 1,155 0,745

XX

124 128 169 137 127 1,363 1,073

IN

103 82 92 67 78 0,893 0,815

IN

100 71 91 68 72 0,910 0,957

XX

96 93 109 132 103 1,135 1,425

IN

96 86 110 94 87 1,146 1,086

XX

94 77 101 74 83 1,074 0,972

XX

94 100 86 88 93 0,915 0,875

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   1. Un método para medir el factor de von Willebrand (VWF) sin usar un agonista de la aglutinación plaquetaria, comprendiendo el método las etapas de:

   proporcionar una superficie que comprende glucoproteína plaquetaria inmovilizada Iba (GPIba) o un fragmento funcional de la misma, en donde la GPIba inmovilizada o fragmento funcional de la misma comprende al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo que consiste en G233V, D235Y y M239V relativas a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y;

   poner en contacto una muestra que tiene o se sospecha que tiene VWF con la superficie, en donde la puesta en contacto se hace sin un agonista de la agregación plaquetaria; y

   detectar un complejo de VWF y GPIba.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde:

   (a) la superficie es una superficie de fase sólida y el método es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) o

   (b) la superficie es una superficie celular y el método es una citometría de flujo (FC) o un ensayo de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS); o
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde la superficie es la superficie de una célula hospedadora que no expresa nativamente GPIba y el método de detección es la clasificación de células activada por fluorescencia (FACS).
4. 4. El método según la reivindicación 3, en donde la superficie es la superficie de una célula hospedadora seleccionada entre el grupo que consiste en un ovocito de Xenopus, una célula CHO-K1, una célula L929, una célula HEK-293T, una célula COS-7 y una célula S2, en donde la célula hospedadora se construye mediante ingeniería genética para que comprenda un polinucleótido que codifica GPIba o un fragmento funcional de la misma que tiene las al menos dos mutaciones elegidas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235y.
5. 5. El método según la reivindicación 1, en donde la superficie es una superficie de fase sólida y el método de detección es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde la superficie es la superficie de una célula hospedadora, y en donde la célula hospedadora no expresa nativamente GPIba, preferiblemente en donde:

   (a) la célula hospedadora para la superficie de célula hospedadora se selecciona entre el grupo consistente en un ovocito de Xenopus, una célula CHO-K1, una célula L929, una célula HEK-293T, una célula cOS-7 y una célula S2, y en donde la célula hospedadora se construye mediante ingeniería genética para que comprenda un polinucleótido que codifica GPIba o un fragmento funcional de la misma que tiene las al menos dos mutaciones elegidas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y; o

   (b) la superficie de la célula hospedadora comprende también glucoproteína Ibp (GPIbp) y opcionalmente glucoproteína IX (GP-IX), en donde GPIbp comprende la SEQ ID NO: 4 y gP-IX comprende SeQ ID NO: 8.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en donde la superficie es una superficie de fase sólida seleccionada entre el grupo consistente en agarosa, vidrio, látex y material plástico, preferiblemente en donde la superficie de fase sólida comprende un anticuerpo anti-GPIba que se une a la GPIba o a un fragmento funcional de la misma.
8. 8. El método según la reivindicación 1, en donde:

   (a) la muestra es plasma; o

   (b) se usa un anticuerpo anti-VWF marcado, para detectar el complejo de VWF y GPIba.
9. 9. El método según la reivindicación 1, en donde las al menos dos mutaciones se eligen entre el grupo consistente en D235Y/G233V y D235Y/M239V con relación a la SEQ ID NO: 2.
10. 10. El método según la reivindicación 1, en donde las al menos dos mutaciones son D235Y/G233V/M239V con relación a la SEQ ID NO: 2.
11. 11. Un kit para la medida del factor de von Willebrand activo (VWF), comprendiendo el kit:

    5

    10

    15

    20

    25

    glucoproteína plaquetaria Iba (GPIba) recombinante o un fragmento funcional de la misma, en donde la GPIba o el fragmento funcional de la misma comprende al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y; y

    un reactivo para detectar un complejo de VWF y GPIba.
12. 12. El kit según la reivindicación 11, en donde:

    (a) el reactivo es un anticuerpo anti-VWF marcado;

    (b) el control es una muestra de plasma de un individuo que no tiene la enfermedad de von Willebrand (VWD);

    (c) la GPIba o fragmento funcional de la misma que tiene las al menos dos mutaciones seleccionadas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y, está inmovilizada sobre una superficie; o

    (d) las al menos dos mutaciones se eligen entre el grupo consistente en D235Y/G233V, D235Y/M239V y

    D235Y/G233V/M239V con relación a la SEQ ID NO: 2.
13. 13. El kit según la reivindicación 12 (c), en donde la superficie es una superficie de célula hospedadora, y en donde la célula hospedadora no expresa nativamente GPIba.
14. 14. El kit según la reivindicación 13, en donde:

    (a) la célula hospedadora para la superficie de célula hospedadora se selecciona entre el grupo consistente en un ovocito de Xenopus, una célula CHO-K1, una célula L929, una célula HEK-293T, una célula cOS-7 y una célula S2, y en donde la célula hospedadora se construye mediante ingeniería genética para que comprenda un polinucleótido que codifica GPIba o un fragmento funcional de la misma que tiene las al menos dos mutaciones elegidas entre el grupo consistente en G233V, D235Y y M239V con relación a la SEQ ID NO: 2, en donde una de las mutaciones es D235Y; o

    (b) la superficie de la célula hospedadora comprende también glucoproteína Ibp (GPIbp) y opcionalmente glucoproteína IX (GP-IX), en donde GPIbp comprende la SEQ ID NO: 4 y gP-IX comprende SeQ ID NO: 8.
15. 15. El kit según la reivindicación 12 (c), en donde la superficie es una superficie de fase sólida seleccionada entre el grupo consistente en agarosa, vidrio, látex y material plástico, preferiblemente en donde la superficie de fase sólida comprende un anticuerpo anti-GPIba que se une a la GPIba o a un fragmento funcional de la misma.