ES2672883T3 - Microorganismo modificado para la producción de 1,3-propanodiol - Google Patents

Microorganismo modificado para la producción de 1,3-propanodiol Download PDF

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Abstract

Microorganismo modificado para la producción de 1,3-propanodiol (PDO) a partir de un sustrato de carbono en el que el microorganismo comprende: - una ruta para la síntesis de 2,4-dihidroxibutirato (DHB) a partir de malato, y - una ruta metabólica de tres etapas que comprende las etapas siguientes: - una primera 10 etapa de convertir el DHB para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) mediante un enzima que presenta una actividad de 2,4-DHB deshidrogenasa, y - una segunda etapa de descarboxilar el OHB para obtener 3-hidroxipropionaldehído mediante un enzima que presenta una actividad de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa, y - una tercera etapa de reducir el 3-hidroxipropionaldehído obtenido para obtener el PDO con un enzima que presenta una actividad de 3-hidroxipropionaldehído reductasa.

Description

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DESCRIPCION
Microorganismo modificado para la producción de 1,3-propanodiol.
La presente invención se refiere a un microorganismo modificado que puede producir 1,3-propanodiol a partir de un sustrato de carbono mediante la implementación de una ruta sintética que comprende enzimas con actividad de 2,4-dihidroxibutirato deshidrogenasa, de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa y de 3-hidroxipropionaldehído reductasa, respectivamente, y que puede sintetizar 2,4-dihidroxibutirato a partir de un sustrato de carbono.
Antecedentes de la invención
El 1,3-propanodiol (PDO) es un bloque constructivo químico que encuentra su principal aplicación en la producción de poliésteres. El PDO puede utilizarse además como biocida de bajo coste y como aditivo en un gran número de productos químicos (revisión en Saxena, Anand, Saran e Isar, 2009).
El PDO puede producirse mediante síntesis química utilizando acroleína, óxido de etileno o glicerol como materias primas. Sin embargo, los rendimientos de producto comparativamente bajos, las duras condiciones de reacción y la producción de flujos de residuos tóxicos dificultan la producción química económica y ambientalmente respetuosa de PDO.
El PDO también puede ser producido por microorganismos. Algunos organismos naturales, tales como los miembros de los géneros Klebsiella, Citrobacter, Clostridia y Enterobacter, producen PDO durante la fermentación anaeróbica del glicerol, en la que la síntesis de PDO sirva para reoxidar el exceso de moléculas de NAD(P)H producidas durante la conversión del glicerol en el intermediario glucolítico dihidroxiacetona fosfato. La ruta de biosíntesis natural del PDO consiste en una glicerol deshidratasa dependiente de vitamina B12 que convierte el glicerol en 3-hidroxipropionaldehído (3-HPA) y una 1,3-propanodiol oxidorreductasa que convierte la 3-HPA en PDO. Los genes codificantes de glicerol deshidratasa y de PDO oxidorreductasa comúnmente se agrupan en un operón junto con genes que codifican el factor de reactivación de la deshidratasa y los genes codificantes de enzimas para la asimilación del glicerol (Saxena, Anand, Saran e Isar, 2009).
Los últimos enfoques se han dirigido a producir PDO a partir de glucosa mediante la utilización de microorganismos manipulados genéticamente y preferentemente Escherichia coli (Emptage, Haynie, Laffend, Pucci y Whited, 2000) (Laffend, Nagarajan y Nakamura, 1995). E. coli no es naturalmente capaz de producir PDO. Este organismo está dotado de enzimas que potencian tanto la producción de glicerol (GPD1 y GPP2 de Saccharomyces cerevisiae) como la conversión del glicerol en PDO (dhaB1-3, orfZ y orfX de Klebsiella pneumoniae). Se ha encontrado que su alcohol deshidrogenasa natural dependiente de nAdP, YqhD, es capaz de convertir 3-HPA en PDO, convirtiendo la expresión de una PDO oxidorreductasa adicional (por ejemplo, dhaT) en opcional e incluso en cierta medida menos beneficiosa. Además, todos los genes responsables de la asimilación del glicerol se habían eliminado en la cepa de producción. La atenuación del sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato (PEP) y la atenuación de la actividad de la gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa incrementan adicionalmente el rendimiento y productividad de PDO. Esta tecnología está siendo explotada actualmente por DuPont, que ha anunciado productividades de 3,5 g/Lh, títulos de producto finales de 135 g/l y rendimientos de carbono del 51% (en peso) en 2003 (Nakamura y Whited, 2003).
Una desventaja significativa de dicha tecnología es la utilización del enzima glicerol deshidratasa dependiente de vitamina B12 para la biosíntesis del PDO, que requiere la complementación del caldo de fermentación con la cara vitamina B12. Además, las rutas biosintéticas de PDO que utilizan glicerol como intermediario dependen de la utilización de azúcares fermentables o glicerol como materia prima. La utilización de fuentes de carbono alternativas, tales como ácidos orgánicos de cadena corta e intermedia solos o en cofermentaciones con azúcares requiere una actividad gluconeogénica significativa, de manera que la síntesis de PDO se torna ineficiente y se limita el espectro de potenciales materias primas. El desarrollo de rutas que rindan PDO con puntos de entrada diferentes del glicerol puede, por lo tanto, contribuir fuertemente a incrementar el rendimiento de producto de azúcares, reducir los costes de producción al evitar enzimas dependientes de vitamina B12 y/o incrementar la flexibilidad metabólica para adaptar los organismos productores de PDO a un panel más grande de materias primas.
Recientemente se ha dado a conocer una ruta (documento n° WO2012/004247) que describe la producción de PDO partiendo de oxalacetato y que pasa por la aminación del mismo para rendir aspartato, la transformación del aspartato en homoserina, la desaminación de la homoserina que rinde 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) y la conversión del OHB en PDO mediante 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa y 1,3-propanodiol deshidrogenasa. La invención dada a conocer utiliza enzimas disponibles naturalmente para construir la secuencia de reacciones requerida. El rendimiento teórico de PDO con glucosa para dicha ruta es igual al rendimiento de producción de PDO a partir de glucosa mediante glicerol. Sin embargo, debido a que dicha ruta utiliza dos etapas de transaminación, este rendimiento teórico sólo se alcanzará en el caso de que el grupo amino pueda reciclarse por completo en las reacciones de transaminación y en el caso de que la síntesis de novo de glutamato consumidora de NADPH no resulte necesaria. Ello no es muy probable.
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La presente invención representa una alternativa a la tecnología existente al producir PDO a partir del ácido orgánico malato sin necesidad de actividad gluconeogénica, sin la necesidad de reacciones de transaminación, costosas metabólicamente, y sin utilización de enzimas dependientes de vitamina B12. En particular, la invención comprende la producción de PDO a partir de ácido 2,4-dihidroxibutírico (DHB) mediante una ruta sintética no natural y la expresión funcional de dicha ruta en un organismo huésped para producir zimóticamente PDO a partir de, por ejemplo, azúcares tales como la glucosa.
Descripción general de la invención
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, un objeto de la presente invención es un microorganismo modificado para la producción de PDO a partir de un sustrato de carbono en el que el microorganismo comprende una ruta para la síntesis de 2,3-dihidroxibutirato (DHB) a partir de malato y una ruta metabólica en tres etapas que comprende las etapas siguientes: una primera etapa de conversión de 2,4-dihidroxibutirato (DHB) para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) mediante un enzima con actividad de 2,4-DHB deshidrogenasa, una segunda etapa de descarboxilación del OHB para obtener 3-hidroxipropionaldehído mediante un enzima que presenta actividad de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa, y una tercera etapa de reducción del 3- hidroxipropionaldehído obtenido en PDO con un enzima que presenta actividad de 3-hidroxipropionaldehído reductasa. En un aspecto preferente de la invención, el organismo modificado que expresa la ruta de conversión de DHB en PDO expresa adicionalmente una ruta de conversión de malato en DHB que comprende las etapas siguientes: una primera etapa de conversión de malato en 4-fosfo-malato mediante un enzima que presenta actividad de malato cinasa, una segunda etapa de conversión de 4-fosfo-malato en malato-4-semialdehído mediante un enzima que presenta actividad de malato semialdehído deshidrogenasa, y una tercera etapa de conversión de malato-4-semialdehído en DHB mediante un enzima que presenta actividad de malato semialdehído reductasa.
Descripción detallada de la presente invención
La presente invención se refiere a un microorganismo modificado para la producción de PDO a partir de un sustrato de carbono (que preferentemente es un azúcar o una mezcla de azúcares que preferentemente contiene glucosa), en el que dicho microorganismo comprende una ruta metabólica de tres etapas que cataliza la síntesis de PDO a partir de DHB. Debido a que DHB no se encuentra disponible naturalmente dentro de los microorganismos, dicho microorganismo adicionalmente expresa una ruta para la conversión del malato en DHB.
Según la presente invención, cada una de las tres etapas de ruta está catalizada por un enzima definido por su actividad. Dichos enzimas se encuentran codificados por los genes definidos posteriormente. Los homólogos funcionales, variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos genes y proteínas se encuentran comprendidos en la definición. Los enzimas con una o más mutaciones también se encuentran comprendidos en la presente definición con la condición de que los enzimas mutados conserven la actividad enzimática o presenten una actividad incrementada.
La denominación de dichos genes presenta un significado más general según la invención y cubre los genes correspondientes en otros organismos.
En el significado de la invención, la conversión de DHB en OHB está catalizada por un enzima que presenta actividad de DHB deshidrogenasa, dicho enzima puede obtenerse mediante por lo menos una mutación de un enzima, mejorando dicha mutación la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para DHB.
Pueden identificarse enzimas que presentan DHB deshidrogenasa de entre los enzimas que presentan actividad de lactato deshidrogenasa soluble (citosólica) o asociada a membrana. En un aspecto más específico de la invención, la actividad de DHB deshidrogenasa soluble se encuentra codificada por IdhA de Lactococcus lactis (SEC ID n° 119) y la actividad de DHB deshidrogenasa asociada a membrana se encuentra codificada por IldD de E. coli (SEC ID n° 121).
En otro aspecto de la invención, la actividad de DHB deshidrogenasa de Ec-LldD puede mejorarse mediante la mutación de la posición Val108.
En un aspecto adicional de la invención, puede obtenerse el enzima que presenta actividad de DHB deshidrogenasa mediante la mutación de enzimas de malato deshidrogenasa naturales citosólicos o asociados a membrana.
Según otro aspecto, las malato deshidrogenasas citosólicas mutadas se encuentran codificadas por mdh de E. coli (SEC ID n° 123) o mdh de Bacillus subtilis (SEC ID n° 125) y portan mutaciones en por lo menos una de las posiciones siguientes (en referencia a mdh de E. coli, SEC ID n° 124): Ile12, Arg81, Lys82, Met85, Asp86, Val93, Ile117, Gly179, Thr211 o Met227.
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Según otro aspecto, la conversión de OHB en 3-HPA está catalizada por un enzima que presenta actividad de 2- oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa, dicho enzima puede obtenerse mediante por lo menos una mutación de un enzima, mejorando dicha mutación la actividad y/o la afinidad de sustrato del enzima mutado para OHB.
Dicha actividad puede identificarse de entre los enzimas que presentan actividad de 2-cetoácido descarboxilasa. Los genes codificantes de una actividad de 2-cetoácido descarboxilasa son bien conocidos de la técnica, incluyendo genes pdc de diversas especies y más particularmente los genes PDC1, PDC5, PDC6, ARO10 y ThI3 de Saccharomyces cerevisiae, los genes kivD o kdcA de Lactococcus lactis; el gen pdc de Clostridium acetobutylicum; los genes PDC2 y PDC3 de Arabidopsis thaliana; los genes PDC1, PDC2 y ARO10 de Pichia stipitis, y el gen pdc de Zymomonas mobilis. La primera subunidad del complejo de 2-cetoglutarato descarboxilasa, codificado por el gen sucA de Escherichia coli, también presenta actividad de 2-cetoácido descarboxilasa, así como el enzima codificado por el gen dxs de Escherichia coli. Los homólogos funcionales, variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos genes y proteínas se encuentran comprendidos en la definición.
Según otro aspecto de la invención, la actividad de OHD descarboxilasa de los enzimas anteriormente listados puede mejorarse mediante mutaciones.
En un aspecto adicional de la invención, el enzima OHB descarboxilasa mejorado se encuentra codificado por pdc de Z. mobilis (SEC ID n° 127) portador de una mutación en por lo menos una de las posiciones siguientes: Tyr290, Trp392, Gly413 o Ile476 (numeración de Z. mobilis, SEC ID n° 128).
En un aspecto adicional de la invención, el enzima OHB descarboxilasa mejorado se encuentra codificado por kdcA de L. lactis (SEC ID n° 129), portador de una mutación en por lo menos una de las posiciones siguientes: Gln377, Phe381, Phe382, Gly402, Val461, Ile465, Met538 o Phe542 (en referencia a kdcA de L. lactis, SEC ID n° 130).
Según otro aspecto, la conversión de 3-HPA en PDO está catalizada por un enzima que presenta actividad de PDO deshidrogenasa. Dicha actividad puede identificarse de entre los enzimas que presentan actividad de hidroxialdehído reductasa, actividad de alcohol deshidrogenasa, actividad de lactaldehído reductasa o actividad de metilglioxal reductasa, dicho enzima puede obtenerse mediante por lo menos una mutación de un enzima, mejorando dicha mutación la actividad y/o la afinidad de sustrato del enzima mutado para 3-HPA.
Los genes codificantes de una actividad de aldehido reductasa son bien conocidos de la técnica y entre ellos se incluyen los genes yqhD, fucO, dkgA y dkgB de Escherichia colia, el gen dhaT de K. pneumoniae y los genes ADH1 y ADH2 de Saccharomyces cerevisiae. Los homólogos funcionales, variantes funcionales y fragmentos funcionales de dichos genes y proteínas se encuentran comprendidos en la definición.
Las proteínas/ácidos nucleicos que comparten una homología sustancial con los enzimas/ácidos nucleicos anteriormente indicados también son otro aspecto de la invención, tal como las variantes funcionales o los fragmentos funcionales.
La expresión "homología sustancial" cubre la homología con respecto a la estructura y/o los componentes aminoácidos y/o la actividad biológica.
Más generalmente, dentro del significado de la invención, la homología entre dos secuencias de proteína o de ácidos nucleicos puede determinarse mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia. Se define de manera general como un porcentaje de identidad de secuencias entre una secuencia de referencia y la secuencia de una proteína/ácido nucleico de interés.
Tal como se utiliza en la presente memoria, "porcentaje (%) de identidad de secuencias" con respecto a las secuencias de aminoácidos o de nucleótidos identificadas en la presente memoria se define como el porcentaje de residuos aminoácidos o nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos aminoácidos o nucleótidos en una secuencia de enzima tras la alineación de las secuencias y la introducción de huecos, en caso necesario, para conseguir el máximo porcentaje de identidad de las secuencias, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencias. Los procedimientos para llevar a cabo la alineación de secuencias y determinar la identidad de las secuencias son conocidos por el experto en la materia y pueden llevarse a cabo sin necesidad de experimentación indebida y pueden obtenerse cálculos de los valores de identidad de manera definitiva. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 19 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York), 1995, y el programa ALIGN (Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure 5:supl. 3 (National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C.), 1978). Se encuentran disponibles varios algoritmos para alinear secuencias y determinar la identidad de secuencias y entre ellos se incluyen, por ejemplo, el algoritmo de alineación de homologías de Needleman et al., J. Mol. Biol. 48:443, 1970; el algoritmo de homología local de Smith et al., Adv. Appl. Math. 2:484, 1981; el procedimiento de búsqueda de similitud de Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444, 1988; el algoritmo de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187, 1997) y los algoritmos BLASTP, BLASTN y BLASTX (ver Altschul
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et al., J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990). También se encuentran disponibles algoritmos computerizados que utilizan dichos algoritmos y entre ellos se incluyen, aunque sin limitación, el software ALIGN o Megalign (DNASTAR) o WU-BLAST-2 (Altschul et al., Meth. Enzym. 266:460-480, 1996) o GAP, BESTFIT, BLAST (Altschul et al.), supra, FASTA y TFASTA, disponibles en el paquete del Genetics Computing Group (GCG), versión 8, Madison, Wis., USA, y CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, Calif. El experto en la materia podrá determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo los algoritmos necesarios para alcanzar la máxima alineación a lo largo de la longitud de las secuencias que se comparan. Preferentemente, la identidad de secuencias se determina utilizando los parámetros por defecto determinados por el programa. Específicamente, la identidad de secuencias puede determinarse mediante el algoritmo de búsqueda de homologías de Smith-Waterman (Meth. Mol. Biol. 70:173-187, 1997) según la implementación en el programa MSPRCH (Oxford Molecular) utilizando una búsqueda de huecos afines con los parámetros de búsqueda siguientes: penalización de hueco abierto de 12 y penalización de extensión de hueco de 1. Preferentemente, las comparaciones de aminoácidos apareados pueden llevarse a cabo utilizando el programa GAP del paquete de software de análisis de secuencias GCG del Genetics Computer Group, Inc., Madison, Wis., utilizando la matriz de sustituciones de aminoácidos blosum62, con un peso de hueco de 12 y un peso de la longitud de 2. Con respecto a la alineación óptica de dos secuencias de aminoácidos, el segmento contiguo de la secuencia de aminoácidos variante puede presentar residuos aminoácidos adicionales o residuos aminoácidos eliminados con respecto a la secuencia de aminoácidos de referencia. El segmento contiguo utilizado para la comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia incluirá por lo menos 20 residuos aminoácidos contiguos y puede presentar 30, 40, 50 o más residuos aminoácidos. Las correcciones para una identidad de secuencias incrementada que se asocia con la inclusión de huecos en la secuencia de aminoácidos del derivado pueden llevarse a cabo mediante la asignación de penalizaciones de hueco.
Los enzimas según la presente invención que presentan la misma actividad comparten una identidad de secuencias de aminoácidos de por lo menos aproximadamente 50%, 70% o 85%, preferentemente una identidad de secuencias e aminoácidos de por lo menos aproximadamente 85%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 90%, más preferentemente de por lo menos aproximadamente 95% y todavía más preferentemente de 98%. Preferentemente, cualesquiera sustituciones de aminoácidos son "sustituciones de aminoácidos conservadoras" que utilizan L-aminoácidos, en las que un aminoácido es sustituido por otro aminoácido biológicamente similar. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras son aquellas que conservan la carga general, hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o volumen estérico del aminoácido que se sustituye. Son ejemplos de sustituciones conservadoras las que ocurren entre los grupos siguientes: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Lys/Arg, Asn/Gln, Glu/Asp, Ser/Cys/Thr y Phe/Trp/Tyr. Un derivado puede, por ejemplo, difiere en tan sólo 1 a 10 residuos aminoácidos, tal como 6 a 10, en tan solo 5, en tan solo 4, 3, 2 o incluso 1 residuo aminoácido.
La expresión variante funcional comprende enzimas que pueden presentar modificaciones de secuencia sustanciales en comparación con las secuencias descritas específicamente en la presente solicitud pero todavía conservar la actividad enzimática original.
También se refiere a que la secuencia del enzima puede comprender menos aminoácidos que la secuencia original aunque dicho enzima truncado todavía conserve la actividad enzimática original.
Según un aspecto de la invención, la actividad del enzima que cataliza la primera y/o la segunda y/o la tercera etapa del procedimiento de la presente invención se encuentra incrementada. Este incremento puede medirse mediante un ensayo enzimático tal como se indica en los ejemplos 1 a 5.
La mejora de dichos enzimas puede obtenerse mediante por lo menos una mutación, (i) mejorando dicha mutación o mutaciones la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para 2,4-DHB, OHB y 3-HPA, respectivamente, y/o (ii) reduciendo la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para su sustrato natural.
En la presente invención, la expresión "mejora la actividad y/o afinidad de sustrato" se refiere a que el enzima antes de la mutación:
- era incapaz de utilizar el sustrato y/o
- sintetizaba el producto de la reacción a una velocidad específica máxima por lo menos tres veces inferior y/o
- presentaba una afinidad para 2,4-DHB, OHB o 3-HPA que era por lo menos tres veces inferior y/o
- presentaba una actividad específica máxima sobre el sustrato natural que era por lo menos tres veces
superior y/o
- presentaba una afinidad para el sustrato natural que era por lo menos tres veces superior.
Cualquier ruta metabólica que catalice la síntesis de DHB a partir de un sustrato de carbono se encuentra
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comprendida en la presente invención. La síntesis de DHB a partir de malato constituye un aspecto preferente de la invención.
En un aspecto específico de la invención, se sintetiza DHB mediante una ruta en tres etapas que parte de malato, tal como se describe en la solicitud de patente publicada como n° WO 2012/056318, en la que:
La conversión de malato en 4-fosfomalato se encuentra catalizada por un enzima que presenta actividad de malato cinasa. Dicha actividad de malato cinasa puede identificarse de entre los enzimas que presentan actividad de aspartato cinasa o actividad de homoserina cinasa. Dicha actividad de malato cinasa puede obtenerse mediante mutación de una aminoácido cinasa natural, por ejemplo la aspartato cinasa mutante LysC de E. coli E119G o la aspartato cinasa mutante LysC E119G E250K de E. coli.
La conversión del fosfomalato en malato-4-semialdehído se encuentra catalizada por un enzima que posee actividad de malato semialdehído deshidrogenasa. Dicha actividad de malato semialdehído deshidrogenasa puede identificarse de entre los enzimas que presentan actividad de aspartato semialdehído deshidrogenasa. Dicha actividad de malato semialdehído deshidrogenasa puede obtenerse mediante mutación de una aminoácido deshidrogenasa natural, por ejemplo la aspartato semialdehído deshidrogenasa mutante Asd E241Q de E. coli.
La conversión del malato 4-semialdehído en DHB se encuentra catalizada por la acción de un enzima que posee actividad de malato-4-semialdehído reductasa. Dicha actividad de malato-4-semialdehído reductasa puede identificarse de entre los enzimas que presentan actividad de semialdehído succínico reductasa (SSR), tal como la malato-4-semialdehído reductasa codificada por el gen ssr de Metallosphaera sedula o el mutante M. sedula SSR H39R N43H.
Según la presente invención, una "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma de cadena sencilla o de doble cadena, preferentemente una molécula de ADN. Un "ADN aislado", tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un ADN que no es natural o que ya no se encuentra en el medio natural en el que se encontraba presente originalmente, por ejemplo una secuencia codificante de ADN asociada a otros elementos reguladores en un gen quimérico, un ADN transferido a otra célula huésped o una secuencia de ADN artificial, generada mediante síntesis, que presenta una secuencia de nucleótidos diferente de la de cualquier secuencia de ADN natural. Se da a conocer además en la presente memoria un gen quimérico que comprende, funcionalmente unido a otro, por lo menos un promotor que es funcional en un organismo huésped, un polinucleótido codificante de cualquiera de los enzimas dados a conocer en la presente memoria y un elemento terminador que es funcional en el mismo organismo huésped. Los diversos elementos que puede contener un gen quimérico son, en primer lugar, elementos reguladores de la transcripción, traducción y maduración de las proteínas, tales como un promotor, una secuencia codificante de un péptido de señal o un péptido de tráfico, o un elemento terminador que constituye una señal de poliadenilación y, en segundo lugar, un polinucleótido codificante de una proteína. La expresión "funcionalmente ligado a otro" se refiere a que dichos elementos del gen quimérico se encuentran unidos entre sí de manera que la función de uno de dichos elementos resulta afectada por la de otro. A título de ejemplo, un promotor se encuentra funcionalmente ligado a una secuencia codificante en el caso de que sea capaz de afectar a la expresión de dicha secuencia codificante. La construcción del gen quimérico tal como se da a conocer en la presente memoria y el ensamblaje de los diversos elementos pueden llevarse a cabo utilizando técnicas bien conocidas por el experto en la materia, en particular los indicados en [18]. La elección de los elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende esencialmente del organismo huésped en el que deben funcionar y el experto en la materia será capaz de seleccionar los elementos reguladores que son funcionales en un organismo huésped dado. El término "funcional" pretende referirse a la capacidad de funcionar en un organismo huésped dado.
Los promotores que puede contener el gen quimérico tal como se da a conocer en la presente memoria son constitutivos o inducibles. A título de ejemplo, los promotores utilizados para la expresión en bacterias pueden seleccionarse de entre los promotores mencionados posteriormente. Para la expresión en Escherichia coli pueden mencionarse lac, trp, lpp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-I, tetA, cadA, nar, tac, trc, lpp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, [lambda]PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gen 32, nprM-lac, VHb y los promotores proteína A [19], [20]) o el promotor Ptrp (documento n° WO 99/64607). Para la expresión en bacterias Gram-positivas, tales como Corynebacteria o Streptomyces, puede hacerse mención de los promotores PtipA [21] o PS1 y PS2 (documento n° FR91/09870) o los indicados en la solicitud n° EP0629699A2. Para la expresión en levaduras u hongos, puede hacerse mención de los promotores PLAC4 de K. lactis [22] o el promotor Ppgk de K. lactis (solicitud de patente n° FR 91/05294), el promotor tef1 o cbh1 de Trichoderma reesei (documento n° WO 94/04673), el promotor csl o apf de Penicillium funiculosumhis (documento n° WO 00/68401) y el promotor gla de Aspergillus niger [23]. El gen quimérico puede comprender además otras secuencias reguladoras, que se encuentran situadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como los activadores (intensificadores) de transcripción.
De esta manera, el gen quimérico tal como se da a conocer en la presente memoria comprende, en una forma de realización específica, por lo menos, en la dirección de transcripción, funcionalmente ligado, una secuencia reguladora promotora que es funcional en un organismo huésped, una secuencia de ácidos nucleicos codificante
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de enzimas tal como se da a conocer en la presente memoria y una secuencia reguladora terminadora que es funcional en dicho organismo huésped. Se da a conocer además en la presente memoria un vector de clonación y/o expresión que comprende un gen quimérico tal como se da a conocer en la presente memoria o una secuencia de ácidos nucleicos tal como se da a conocer en la presente memoria. El vector tal como se da a conocer en la presente memoria resulta útil para transformar un organismo huésped y expresar en dicho organismo cualquiera de los enzimas para la biosíntesis del PDO. Dicho vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus. Preferentemente, el vector de transformación tal como se da a conocer en la presente memoria es un plásmido. Generalmente, las cualidades principales de dicho vector deben ser la capacidad de automantenerse y autorreplicarse en las células del organismo huésped, en particular gracias a la presencia de un origen de replicación y la de expresar cualquiera de los enzimas en las mismas. Con el fin de transformar establemente un organismo huésped, el vector también puede integrarse en el genoma. La elección de dicho vector y también las técnicas de inserción del gen quimérico tal como se dan a conocer en la presente memoria en dicho vector han sido ampliamente descritas en [18] y son parte de los conocimientos generales del experto en la materia. Ventajosamente, el vector utilizado en la presente invención adicionalmente contiene, además del gen quimérico tal como se da a conocer en la presente memoria, un gen quimérico codificante de un marcador seleccionable. Dicho marcador seleccionable posibilita la selección de los organismos huésped que han sido efectivamente transformados, es decir, los que incorporan el vector. Según un aspecto particular, el organismo huésped que debe transformarse es una bacteria, una levadura o un hongo. Entre los marcadores seleccionables que pueden utilizarse, puede hacerse mención de marcadores que contienen genes de resistencia a antibióticos, tales como, por ejemplo, el gen higromicín-fosfotransferasa [24], [25]. Otros marcadores pueden ser genes que complementan una auxotrofía, tales como los genes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4 [26], arg4, argB [27] y trpC [28], el gen de la molibdopterina sintasa [29], [30] o el de la acetamidasa [31]. Además, puede hacerse mención de genes codificantes de enzimas fácilmente identificables, tales como el enzima GUS, o genes codificantes de pigmentos o enzimas que regulan la producción de pigmentos en las células transformadas. Dichos genes de marcador seleccionable se describen, en particular, en las solicitudes de patente n° WO 91/02071, n° WO 95/06128, n° WO 96/38567 y n° WO 97/04103. Se dan a conocer además en la presente memoria organismos huésped transformados que contiene por lo menos un gen quimérico tal como se da a conocer en la presente memoria, integrado en su genoma o alojado en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo un plásmido. en un aspecto más específico, el organismo huésped transformado comprende un ácido nucleico tal como se da a conocer en la presente memoria o un gen quimérico que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una malato cinasa y/o una malato semialdehído deshidrogenasa y/o una malato semialdehído reductasa y/o una DHB deshidrogenasa y/o una OHB descarboxilasa y/o una 3-PHA reductasa.
La expresión "organismo huésped" pretende referirse a cualquier organismo monocelular inferior en el que puede introducirse uno o más genes quiméricos, uno o más ácidos nucleicos o uno o más vectores según la invención con el fin de producir PDO. Preferentemente, el organismo huésped es un microorganismo, en particular una bacteria, preferentemente seleccionada de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae,
Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriaceae y Corynebacteriaceae, más preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens o Lactococcus lactis, o una levadura seleccionada preferentemente de entre Saccharomycetaceae, Pichiaceae y Schizosaccharomycetaceae, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae,
Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Pichia stipitis o Pichia pastoris o un hongo, por ejemplo del género Penicillium o Aspergillus, más particularmente Aspergillus flavus, o del género Chrysosporium o Trichoderma o un baculovirus.
El organismo huésped puede ser un organismo huésped que produce en exceso de manera natural malato o succinato a partir de azúcares tales como la glucosa o un organismo huésped que ha sido manipulado para producir en exceso malato o succinato a partir de azúcares tales como glucosa y en el que todos los potenciales transportadores de membrana que facilitan la exportación de ácidos orgánicos, tales como malato, piruvato, succinato y fumarato han sido eliminados. El organismo huésped puede ser un organismo que ha sido manipulado para producir en exceso DHB y en el que todos los transportadores de membrana que facilitan la exportación de ácidos orgánicos, tales como DHB, malato, piruvato, succinato y fumarato, han sido eliminados. Son ejemplos de permeasas que facilitan la exportación del malato y otros ácidos orgánicos, Mae1 de Schizosaccharomyces pombe (Camarasa et al., 2001; Grobler et al., 1995), DctA de Bacillus subtilis (Groeneveld et al., 2010), Dct 1-4 de E. coli, Jen1 de S. cerevisiae (Akita et al., 2000). Para un experto resultará posible identificar las permeasas candidatas en otros microorganismos basándose en la homología de las secuencias. Estas construcciones servirán para mantener el DHB, malato y otros ácidos orgánicos dentro de la célula para que se encuentren disponibles para la producción de PDO.
Con el fin de obtener los organismos huésped tal como se da a conocer en la presente memoria, el experto en la materia puede utilizarse cualquiera de los muchos procedimientos de transformación conocidos.
Uno de dichos procedimientos consiste en poner en contacto las células de los organismos huésped que deben transformarse con polietilenglicol (PEG) y con los vectores tal como se da a conocer en la presente memoria. La electroporación es otro procedimiento, que consiste en someter las células que deben transformarse y los
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vectores tal como se dan a conocer en la presente memoria, a un campo eléctrico. Otro procedimiento consiste en inyectar directamente los vectores en las células o los tejidos mediante microinyección. Puede utilizarse el procedimiento "biolístico". Consiste en bombardear las células o tejidos con partículas sobre las que se han adsorbido los vectores (patente US n° 4.945.050) dados a conocer en la presente memoria.
En la literatura se describen varios procedimientos para transformar bacterias, para Escherichia coli y otras bacterias Gram-negativas. También puede utilizarse la conjugación. Para las bacterias Gram-positivas, puede utilizarse la electroporación y también la transformación de protoplasto, en particular para las bacterias del género Streptomyces.
En la literatura también se han descrito varios procedimientos para transformar hongos. La transformación de protoplasto con PEG se describe para Aspergillus en la patente n° EP 0 260 762 y se describe una adaptación de dicho procedimiento a la especie Penicillium funiculosum en el documento n° WO 00/36120. La transformación mediante integración mediada por enzima de restricción, o REMI (por sus siglas en inglés), también es conocida, al igual que la transformación de protoplástica utilizando bacterias del género Agrobacterium. Las técnicas para transformar levaduras también se encuentran descritas en la literatura.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento de producción de PDO que comprende las etapas de poner en contacto el microorganismo modificado según la invención con un sustrato de carbono en un medio de cultivo apropiado y recuperar el PDO a partir del medio de cultivo.
En un aspecto más preferido de la invención, el sustrato de carbono es un azúcar o una mezcla de azúcares.
En un aspecto más preferido de la invención, el PDO se purifica adicionalmente.
Los ejemplos, a continuación, ilustran la invención. Dichos ejemplos se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no limitativo del alcance de la invención en modo alguno, que se define en las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1: representación esquemática de la ruta sintética que rinde 1,3-propanodiol. 1 - malato, 2 - malil-4- fosfato, 3 - malato-4-semialdehído, 4 - 2,4-dihidroxibutirato, 5 - 2-oxo-4-hidroxibutirato, 6-3- hidroxipropionaldehído, 7 - 1,3-propanodiol.
Figura 2: actividades específicas de la malato deshidrogenasa de E. coli purificada, Ec-Mdh, mutada en la posición R81. (A) Actividades específicas en DHB, (B) actividades específicas sobre el malato. Se midieron las actividades a una concentración de sustrato de 50 mM de DHB o de 50 mM de malato.
Figura 3: cromatogramas de CG-FID que muestran la presencia de 1,3-propanodiol (PDO) tras la incubación de DHB 20 mM, DCIP 1 mM, NADpH 2 mM y tiamina pirofosfato 50 pM con diferentes combinaciones de enzimas de la ruta de PDO. (A) Estándar de PDO a una concentración de 1 mM; (B) reacción 1: DHB deshidrogenasa (Ec-LldD 160 pg/ml), OHB descarboxilasa (Zm-Pdc 10 pg/ml) y PDO deshidrogenasa (Ec- YqhD 20 pg/ml); (C) control 1: igual que para la reacción 1 aunque sin DHB deshidrogenasa; (D) control 2: igual que para la reacción 1 aunque sin OHB descarboxilasa.
Figura 4: cromatogramas de CG-FID que muestran la presencia de 1,3-propanodiol (PDO) tras la incubación de DHB 20 mM, NAD+ 10 mM, NADPH 2 mM y tiamina pirofosfato 50 pM con diferentes combinaciones de enzimas de la ruta de PDO. (A) Estándar de PDO a una concentración de 1 mM; (B) reacción 1: DHB deshidrogenasa (Ec-Mdh R81A 160 pg/ml), OHB descarboxilasa (LI-KdcA 10 pg/ml) y PDO deshidrogenasa (Ec-YqhD 20 pg/ml); (C) control 1: igual que para la reacción 1 aunque sin PDO deshidrogenasa; (D) control 2: igual que para la reacción 1 aunque sin DHB deshidrogenasa.
Ejemplos
Ejemplo 1: demostración de la actividad de la 2,4-dihidroxibutirato deshidrogenasa
Construcción de plásmidos que contienen genes de tipo salvaje codificantes de enzimas candidatos de DHB deshidrogenasa:
Los genes codificantes de la (L)-lactato deshidrogenasa de Lactococcus lactis, ldhA, (L)-malato deshidrogenasa e Escherichia coli, mdh, (L)-malato deshidrogenasa de Bacillus subtilis, mdh, y para la (L)-lactato deshidrogenasa asociada a membrana de E. coli, lldD, se amplificaron por PCR utilizando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Fermentas) y los cebadores listados en la tabla 1. Se utilizaron ADN genómicos de E. coli MG1655, L. lactis IL1403 y B. subtilis cepa 168 como moldes. Los cebadores introdujeron sitios de restricción (Tabla 1) cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada, respectivamente, facilitando la ligación de los productos de PCR digeridos en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a+ (Novagen)
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utilizando ADN ligasa de T4 (Fermentas). Los productos de ligación se transformaron en células de E. coli DH5a. Los plásmidos pET28-Ec-mdh, pET28-LI-ldh, pET28-Bs-mdh y pET28-Ec-lldD se aislaron y se mostró mediante secuenciación del ADN que contenían la secuencia de longitud completa correcta de los genes mdh de E. coli (SEC ID n° 123), IdhA de L. lactis (SEC ID n° 119), mdh de B. subtilis (SEC ID n° 125) y IldD de E. coli (SEC ID n° 121), respectivamente. Las secuencias de las proteínas correspondientes están representadas por las SEC ID n° 124, SEC ID n° 120, SEC ID n° 126 y SEC ID n° 122, respectivamente.
Tabla 1: secuencias de cebador y sitios de restricción utilizados para la amplificación y clonación de los enzimas
candidatos.
Gen
Secuencias de cebadores directo e inverso 5' -3' Sitios de restricción
Ec-mdh
TATAATCATATGAAAGTCGCAGTCCTC (SEC ID n°131) TATAATGGATCCTTACTTATTAACGAACTC (SEC ID n°132) NdeI BamHI
Ll-ldhA
TATAATCATATGGCTGATAAACAACGTAAAAAA (SEC ID n°133) TATAATGGATCCTTAGTTTTTAACTGCAGAAGCAAA (SEC ID n°134) NdeI BamHI
Bs_mdh
CATATGGGAAATACTCGTAAAAAAGTT (SEC ID n°135) GGATCCTTAGGATAATACTTTCATGAC(SEC ID n°136) Nde1 BamH1
Ec-lldD
CATATGATTATTTCCGCAGCCAGC (SEC ID n°137) AGATCTCTATGCCGCATTCCCTTTC (SEC ID n°138) Nde1 Bgl2
Expresión de enzimas: se transformaron células E. coli BL21 (DE3) Star con los plásmidos apropiados utilizando protocolos genéticos estándares (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989). Los enzimas con una etiqueta hexa-His N-terminal se expresaron en cultivos de 50 ml de LB que habían sido inoculados con un cultivo durante la noche a DO600 de 0,1 y cultivados hasta DO600 de 0,6 antes de inducir la expresión de proteínas mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM al medio de cultivo. Tras 3 h de expresión de proteínas, se recolectaron las células mediante centrifugación a 4.000 g a 4°C durante 10 min y se descartó el sobrenadante. Los pellets celulares se almacenaron a -20°C hasta el análisis posterior. Se llevó a cabo el crecimiento y expresión de proteínas a 37°C. El medio de cultivo contenía canamicina 50 pg/ml.
Purificación de los enzimas: los pellets celulares congelados de los cultivos de expresión se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de fragmentación (Hepes 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5) y se fragmentaron mediante cuatro rondas sucesivas de sonicación (intervalo de sonicación: 20 s, potencia: 30%, sonicador: Bioblock Scientific, VibraCell™ 72437). Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación de los extractos en bruto durante 15 min a 4°C a 4.000 g, conservando el sobrenadante clarificado. Se extrajo el ARN y ADN de los extractos mediante la adición de 15 mg/ml de sulfato de estreptomicina (Sigma), centrifugando las muestras a 13.000 g durante 10 min a 4°C y conservando el sobrenadante. El extracto de proteínas clarificado se incubó durante 1 h a 4°C con 0,75 ml (volumen de lecho) de resina de afinidad Talon™ Cobalt (Clontech). La suspensión se centrifugó a 700xg en una centrífuga de sobremesa y se eliminó el sobrenadante. La resina se lavó con 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado (Hepes 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 15 mM, pH 7,5) antes de eluir las proteínas con 0,5 ml de tampón de elución (Hepes 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM, pH 7,5). La pureza de los enzimas eluidos se verificó mediante análisis de SDS-PAGE. Se estimaron las concentraciones de las proteínas mediante el procedimiento de Bradford (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989). Con el fin de estabilizar la lactato deshidrogenasa de L. lactis, se intercambió sistemáticamente el tampón de elución por tampón fosfato 100 mM ajustado a pH 7. La muestra de proteínas se transfirió a un filtro de ultracentrífuga Amicon™ (valor de corte: 10 kDa) y se centrifugó durante 8 min a 4.000 g a 4°C para eliminar el tampón. La proteína se rediluyó en tampón de fosfato y se repitió el procedimiento 4 veces.
Ensayo enzimático: se sometió a ensayo la actividad de las DHB deshidrogenasas citosólicas (Ec-Mdh, Bs-Mdh y LI-LdhA) mediante el seguimiento de la reducción de NAD+ dependiente de DHB.
Esquema de reacción 1: (L)-2,4-dihidroxibutirato + NAD+ -> 2-oxo-4-hidroxibutirato + NADH
La mezcla de reacción contenía Hepes 60 mM (pH 8), cloruro de potasio 50 mM, MgCh 5 mM, NAD 10 mM (opcionalmente, fructosa-1,6-bisfosfato (F16bP) 5 mM) (todos los productos eran de Sigma) y cantidades apropiadas de enzima purificado o extracto celular. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de (L)-2,4- dihidroxibutirato 50 mM (Rhodia).
Se sometió a ensayo la actividad de la DHB deshidrogenasa asociada a membrana (Ec-LldD) mediante el seguimiento de la reducción dependiente de DHB del 2,6-dicloroindofenol (DCIP).
Esquema de reacción 2: (L)-2,4-dihidroxibutirato + DCIPox -> 2-oxo-4-hidroxibutirato + DCIPred
La mezcla de reacción contenía Hepes 60 mM (pH 7), cloruro de potasio 50 mM, MgCh 5 mM, DCIP 0,06 mM (todos los productos eran de Sigma) y cantidades apropiadas de enzima purificado o extracto celular. Las
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reacciones se iniciaron mediante la adición de (L)-2,4-dihidroxibutirato 20 mM (Rhodia).
Todos los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocilios en un volumen final de 250 pl. Se realizó un seguimiento de las reacciones a partir de la absorción característica de NADH a 340 nm (£nadh=6,22 mM-1 cm"1) o la absorción de DCIP a 655 nm (£dcip=5,9 mM-1 cm"1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR).
Resultados: los resultados de las mediciones enzimáticas se resumen en la tabla 2. Se demostró que Ec-Mdh y Bs-Mdh no presentaban actividad de DHB deshidrogenasa medible. Las lactato deshidrogenasas citosólica y asociada a membrana Ll-LdhA y Ec-LldD, respectivamente, presentan actividad de DHB deshidrogenasa.
Tabla 2: resumen de parámetros cinéticos de enzimas candidatos seleccionados sobre su sustrato natural y
DHB.
Actividad específica máx. [pmoles/(mg min)l Afinidad para el sustrato, Km [mMl
Enzima
Sustrato natural3 DHBb Sustrato naturala DHB
Ec-Mdh
52,5 0 0,56 nd
Bs-Mdh
10,5 0 2,6 nd
Ll-LdhA
8,8 1 21,2 ns
Ec-LldD
6,22 0,37 0,13 1,31
(a) Los sustratos naturales para las malato deshidrogenasas y las lactato deshidrogenasas son el (L)- malato y el (L)-lactato, respectivamente.
(b) En el caso de que el enzima no pudiese saturarse, la actividad específica máxima se refiere a la
actividad estimada con una concentración de sustrato de 50 mM. ns - no saturado nd - no determinado
Ejemplo 2: construcción de enzimas malato deshidrogenasa con actividad de DHB deshidrogenasa mejorada
Se llevó a cabo la mutagénesis dirigida a sitio de los genes mdh de E. coli y mdh de B. subtilis utilizando las parejas de oligonucleótidos listadas en la tabla 3 y los plásmidos pET28-Ec-mdh y pET28-Bs-mdh como moldes. Se introdujeron mediante PCR (Phusion 1 U, tampón HF al 20% (v/v), dNTP 0,2 mM, cebadores directos e inversos, 0,04 pM cada uno, 50 ng de plásmido de molde, agua) mutaciones puntuales para modificar la secuencia de aminoácidos utilizando las parejas de oligonucleótidos listadas en la tabla 3. Los genes mutados contenían un nuevo sitio de restricción listado en la tabla 3 (introducido utilizando mutaciones silenciosas) además de la mutación funcional para facilitar la identificación de los clones mutados. Los productos de PCR se digirieron con Dpnl a 37°C durante 1 h para eliminar el ADN molde y se transformaron en células de E. coli DH5- alfa (NEB) competentes. Los plásmidos mutados se identificaron mediante análisis de sitio de restricción y se verificó que portaban las mutaciones deseadas mediante secuenciación del ADN.
Tabla 3: oligonucleótidos utilizados para mutar mdh de malato deshidrogenasa de E. coli y mdh de B. subtilis (nnk se refiere a un codón degenerado en el que k representa timina o citosina).
Proteína
Mutación Secuencias de cebador 5' - 3' Sitio de restr.
Bs-Mdh
R87A TTACAGCCGGTATCGCAGCAAAACCCGGGATGAGCAGAGAT (SEC ID n° 139) ATCTCTGCTCATCCCGGGTTTTGCTGCGATACCGGCTGTAA (SEC ID n° 140) Sma1
Ec-Mdh
R81nnk TTATCTCTGCAGGCGTAGCGNNKAAACCCGGGATGGATCGTTC (SEC ID n° 141) GAACGATCCATCCCGGGTTTMNNCGCTACGCCTGCAGAGATAA (SEC ID n° 142) Sma1
Ec-Mdh
R81AM85E TTATCTCTGCAGGCGTAGCGGCTAAACCGGGTGAGGATCGTTCCGACCTG (SEC ID n° 143) CAGGTCGGAACGATCCTCACCCGGTTTAGCCGCTACGCCTGCAGAGATAA (SEC ID n° 144) sin Sma1
Ec-Mdh
R81A M85Q TTATCTCTGCAGGCGTAGCGGCTAAACCGGGTCAGGATCGTTCCGACCTG (SEC ID n° 145) CAGGTCGGAACGATCCTGACCCGGTTTAGCCGCTACGCCTGCAGAGATAA (SEC ID n° 146). sin Sma1
Ec-Mdh
I12V GTCGCAGTCCTCGGCGCCGCTGGCGGTGTCGGCCAGGCGCTTGCAC (SEC ID n° 147) Nar1
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Proteína
Mutación Secuencias de cebador 5' - 3' Sitio de restr.
GTGCAAGCGCCTGGCCGACACCGCCAGCGGCGCCGAGGACTGCGAC (SEC ID n° 148)
Ec-Mdh
G179D CCG GTT ATT GGC GGC CAC TCT GAT GTT ACC ATT CTG CCG CTG CTG (SEC n° 149) CAGCAGCGGCAGAATGGTAACATCAGAGTGGCCGCCAATAACCGG (SEC ID n° 150) Eae1
Ec-Mdh
R81AD86S GGCGTAGCGGCTAAACCGGGTATGTCTCGTTCCGACCTG (SEC ID n° 151) CAGGTCGGAACGAGACATACCCGGTTTAGCCGCTACGCC (SEC ID n° 152) sin Sma1
Los enzimas mutantes se expresaron, purificaron y sometieron a ensayo para actividad de DHB deshidrogenasa tal como se indica en el ejemplo 1.
Las actividades sobre el DHB y el malato obtenidas al mutar Arg81 en Ec-Mdh se resumen en la figura 2. Los resultados demuestran que la sustitución de Arg81 por alanina, cisteína, glicina, isoleucina, metionina, asparagina, glutamina, serina, treonina o valina confiere una actividad significativa de DHB deshidrogenasa y una reducción concomitante de malato deshidrogenasa. La introducción de la mutación R87C en Bs-Mdh (en referencia a la SEC ID n° 126) incrementó la actividad máxima de dicho mutante sobre DHB de 0 a 0,06 |jmoles/(mg min) y redujo su actividad sobre el malato de 10,9 a 0,13 jmoles/(mg min).
La mutación R81A en Ec-Mdh (en referencia a la SEC ID n° 124) se combinó con cambios adicionales en la secuencia de la proteína. Se listan los resultados en la tabla 4. Puede demostrarse que la introducción de la mutación M85Q, M85E, I12V, G179D y/o D86S además de la mutación R81A resulta en una actividad adicionalmente incrementada sobre DHB.
Tabla 4: resumen de los parámetros cinéticos de mutantes de malato deshidrogenasa de E. coli y B. subtilis
sobre el malato y el DHB.
Actividad específica máx. [jmoles/(mg min)] Km [mM]
Enzima mutante
SEC ID malato3 DHBb malato DHB
Bs-Mdh R87C
SEC ID n° 154 0,13 0,06 6,8 5,4
Ec-Mdh R81A
SEC ID n° 156 0,12 0,3 0,7 33
Ec-MdhR81A M85Q
SEC ID n° 158 0,57 2,98 2,2 29
Ec-MdhR81A M85E
SEQ ID n° 160 0,65 2,38 8,6 48
Ec-MdhR81A I12V
SEC ID n° 162 0,66 2,5 8,5 ns
Ec-MdhR81A M85Q I12V
SEC ID n° 164 0,98 7,1 12,5 19
Ec-Mdh R81A M85E I12V
SEC ID n° 166 0,91 10,3 11,2 20
Ec-MdhR81A G179D
SEC ID n° 168 0,52 2,1 nd ns
Ec-MdhR81A D86S
SEC ID n° 170 0,42 0,79 10,3 28
Ec-MdhR81A D86S G179D
SEC ID n° 172 0,64 2,51 4 25
(a) - se midió la actividad con malato 50 mM (b) - se midió la actividad con DHB 50 mM (ns) - no saturado a concentraciones de hasta 100 mM
Ejemplo 3: construcción de enzimas de (L)-lactato deshidrogenasa con actividad mejorada de DHB deshidrogenasa
Se llevó a cabo mutagénesis dirigida a sitio del gen IldD de E. coli utilizando las parejas de oligonucleótidos listadas en la tabla 5 y el plásmido pET28-Ec-IIdD como molde.
Tabla 5: oligonucleótidos utilizados para mutar IldD de (L)-lactato deshidrogenasa de E. coli.
Proteína
Mutación Secuencias de cebador 5' - 3' Sitio de restricción
Ec-LldD
V108C TTCCGTTTACTCTGTCGACGTGTTCCGTTTGCCCGA (SEC ID n° 173) TCGGGCAAACGGAACCCGTCGACAGAGTAAACGGAA (SEC ID n° 174) HinCII
Se expresaron, purificaron y sometieron a ensayo los enzimas mutantes para actividad de DHB deshidrogenasa y de lactato deshidrogenasa tal como se ha indicado en el ejemplo 1. Los resultados de las mediciones enzimáticas se resumen en la tabla 6. Se demostró que la sustitución de Val108 por cisteína modifica la
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especificidad del enzima en favor de DHB.
Tabla 6: resumen de los parámetros cinéticos de los mutantes de lactato deshidrogenasa de E coli, LLdD, sobre
el lactato y el DHB.
Actividad específica máx. [pmoles/(mg min)l Km [mM] Especificidad3
Enzima mutante
Sec ID lactato DHB lactato DHB
Tipo salvaje
SEC ID n° 122 6,22 0,37 0,13 1,31 0,006
V108C
SEC ID n° 174 0,55 0,24 0,42 0,85 0,21
(a) La especificidad se expresa como (Vmax/Km)DHB/(Vmax/Km)sustrato nat.
Ejemplo 4: demostración de la actividad de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa
El gen Ll-kdcA codificante de alfa-cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa de L. lactis B1157-NIZO se optimizó para los codones para la expresión en E. coli. La secuencia codificante optimizada completa flanqueada por los sitios de restricción Nhel y EcoRI cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada, respectivamente, fue sintetizada por Eurofins MWG y se clonó en los sitios correspondientes de pET28a+ (Novagen) en el mismo marco con una etiqueta hexa-His N-terminal. Se demostró mediante secuenciación de ADN que el plásmido pET28-Ll-kdcA resultante presentaba la secuencia correcta.
Las piruvato descarboxilasas de Saccharomyces cerevisiae, Sc-PDC1, y de Zymomonas mobilis, Zm-PDC, se amplificaron por PCR utilizando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Fermentas) y los cebadores listados en la tabla 7. Se utilizaron ADN genómicos de S. cerevisiae BY4741 y Z. mobilis (Lindner) Kluyver y van Niel (ATCC n° 31821) como moldes. Los cebadores introdujeron sitios de restricción (Tabla 7) cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada, respectivamente, facilitando la ligación de los productos de PCR digeridos en los sitios correspondientes del vector de expresión pET28a+ (Novagen) utilizando ADN ligasa de T4 (Fermentas). Los productos de ligación se transformaron en células competentes de E. coli DH5a (NEB). Los plásmidos pET28-Sc-pdc1 y pET28-Zm-pdc resultantes se aislaron y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenían la secuencia de longitud completa correcta de los genes PDC1 de S. cerevisiae y PDC de Z. mobilis, respectivamente. Las secuencias de proteína correspondientes se representan mediante SEC ID n° 208 y SEC ID n° 128, respectivamente.
Tabla 7: secuencia de cebador y sitios de restricción utilizados para la amplificación y clonación de los enzimas
candidatos.
Gen
Secuencia de los cebadores directo e inverso 5' - 3' Sitios de restricción
Sc-PDC1
CATATGTCTGAAATTACTTTGGGTAA (SEC ID n° 175) Nde1
GGATCCTTATTGCTTAGCGTTGGT (SEC ID n° 176) BamH1
Zm-PDC
CATATGAGTTATACTGTCGGTACC (SEC ID n° 177) Nde1
GGATCCCTAGAGGAGCTTGTTAAC (SEC ID n°178) BamH1
Se utilizaron los plásmidos para transformar células de E. coli BL21 (DE3) Star y se expresaron y purificaron los enzimas portadores de una etiqueta hexa-His N-terminal tal como se ha indicado en el ejemplo 1. Se cuantificó la actividad de descarboxilasa sobre el 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB), el piruvato (Sigma) y el ácido 4-metil-2- oxovalérico (Sigma).
Ensayos enzimáticos: se sometió a ensayo la actividad de OHB descarboxilasa mediante el acoplamiento de la actividad de descarboxilasa con la reducción dependiente de NADPH del 3-hidroxipropanal liberado por aldehido reductasa purificada, YqhD, de E. coli. Se acopló la descarboxilación del piruvato con la reducción dependiente e NADH del acetaldehído catalizada por alcohol deshidrogenasa de levadura. Se midió la actividad de alfa- cetoácido de cadena ramificada descarboxilasa sobre ácido 4-metil-2-oxovalérico mediante el acoplamiento con la reducción dependiente de NADH de 3-metilbutanal catalizada por la alcohol deshidrogenasa hepática de caballo. Las mezclas de reacción contenían Hepes 60 mM (pH 7), cloruro de potasio 50 mM, MgCh 2 mM, NAD(P)H 0,25 mM (todos los productos eran de Sigma), pirofosfato de tiamina 0,5 mM, 10 unidades/ml de YqhD de E. coli purificado o alcohol deshidrogenasa hepática de caballo (Sigma) o alcohol deshidrogenasa de levadura (Sigma) y cantidades apropiadas de enzima purificado o extracto celular. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) 20 mM, ácido 4-metil-2-oxovalérico 10 mM (MOV) o piruvato 5 mM. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 pl. Se realizó un seguimiento de las reacciones a partir de la absorción característica de NAD(P)H a 340 nm (£nad(p)h=6,22 mM-1 cm-1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR).
Resultados: los resultados de los ensayos con descarboxilasa se resumen en la tabla 8. Se demostró que los enzimas KdcA de L. lactis y las piruvato descarboxilasas Sc-Pdc1 y Zm-Pdc presentaban una actividad significativa de OHB descarboxilasa.
5 Tabla 8: resumen de los parámetros cinéticos de enzimas candidatos seleccionados sobre su sustrato natural y
OHB.
Actividad específica máx. [jmoles/(mg min)l Afinidad para el sustrato, Km [mMl
Enzima
Sustrato natural3 OHB Sustrato naturala OHB
Ll-KdcA SEC ID n° 130
4 0,08 0,15 4
Zm-Pdc SEC ID n° 128
65 0,052 2,5 1,5
Sc-Pdc1 SEC ID n° 208
1,3 0,055 nd nd
(a) Los sustratos naturales para KdcA y las piruvato descarboxilasas eran el ácido 4-metil-2- oxovalérico y el piruvato, respectivamente
(b) En el caso de que el enzima no pudiese saturarse, la actividad específica máxima se refiere
a la actividad estimada con una concentración de sustrato de 20 mM. ns - no saturado nd - no determinado
Ejemplo 5: construcción de enzimas con actividad mejorada de OHB descarboxilasa
10
Se llevó a cabo mutagénesis dirigida a sitio de los genes kdcA de L. lactis y Pdc de Z. mobilis utilizando las parejas de oligonucleótidos listadas en la tabla 9 y los plásmidos pET28-LI-kdcA y pET28-Zm-Pdc, respectivamente, como molde.
15 Tabla 9: oligonucleótidos utilizados para mutar la 2-oxoácido de cadena ramificada descarboxilasa, kdcA, de L.
lactis y la piruvato descarboxilasa, PDC, de Z. mobilis
Proteína
Mutación Secuencias de cebador 5' - 3' Sitio de restr.
Zm-Pdc.
W392Q GTTATTGCTGAAACCGGTGACTCTCAGTTCAATGCGCAGCGCATGAAGC (SEC ID n° 179) GCTTCATGCGCTGCGCATTGAACTGAGAGTCACCGGTTTCAGCAATAAC (SEC ID n° 180) FSP1
Zm-Pdc
W392L ACGGTTATTGCTGAAACCGGTGACTCTTTATTCAATGCGCAGCGCATGAAG CTC (SEC ID n° 181) G AG CTT C ATG C G CTG CG C ATT G A AT AAAG AGTCACCG GTTT CAGCAATAAC CGT (SEC ID n°182) FSP1
Zm-Pdc
G413N TATGAAATGCAGTGGAACCACATTGGTTGGTCGGTACCTGCCGCCTTC (SEC ID n° 183) GAAGGCGGCAGGTACCGACCAACCAATGTGGTTCCACTGCATTTCATA (SEC ID n° 184) KPNI
LI-Kdc
G402S GGACAACCGCTGTGGTCCAGTATTGGGTATACGTTTCCAGCG (SEC ID n° 185) CGCTGGAAACGTATACCCAATACTGGACCACAGCGGTTGTCC (SEC ID n° 186) ACC1
LI-Kdc
V461I TTTGCTTTATCATTAATAATGACGGCTACACAATCGAGCGCGAAATTCA ((SEC ID n° 187) TGAATTTCGCGCTCGATTGTGTAGCCGTCATTATTAATGATAAAGCAAA (SEC ID n° 188) ASE1
Se expresaron, purificaron y sometieron a ensayo enzimas mutantes para actividad de OHB descarboxilasa, 20 piruvato descarboxilasa y MOV descarboxilasa tal como se indica en el ejemplo 4. Los resultados de las mediciones enzimáticas se resumen en la tabla 10. Se demostró que las mutaciones W392Q, W392L y G413N en Zm-Pdc y las mutaciones G402S y V461I en LI-KdcA incrementaron la actividad y/o la especificidad para OHB.
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Tabla 10: resumen de parámetros cinéticos de mutantes de descarboxilasa sobre OHB, piruvato y MOV
Actividad específica máx. [jmoles/(mg min)l Km [mM]
Enzima mutante
Sec ID Sustrato natural3 OHBb Sustrato natural OHB
Zm-Pdc W392Q
SEC ID n° 190) 1,39 0,19 9,2 2,9
Zm-Pdc W392L
SEC ID n° 192) 0,09 0,04 ns 3,7
Zm-Pdc G413N
SEC ID n° 194) 0,1 0,04 ns 1,4
Ll-KdcA G402S
SEC ID n° 196) 3,1 0,09 1,5 1,5
Ll-KdcA V461I
SEC ID n° 198) 2,76 0,24 0,15 2,8
(a) - se midió la actividad con una concentración de MOV de 10 mM en el caso de los mutantes de KdcA y con piruvato 50 mM en el caso de los mutantes de Pdc (b) - se midió la actividad a una concentración de OHB de 20 mM (ns) - no saturado a concentraciones de hasta 50 mM
Ejemplo 6: demostración de la actividad de 1,3-propanodiol deshidrogenasa
Se amplificó por PCR la región codificante de yqhD de la alcohol deshidrogenasa de Escherichia coli utilizando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y los cebadores directo e inverso 5'- TATCGTGCTAGCATGAACAACTTTAATCTGCACA-3' (SEC ID n° 199) y 5'- TATAATGAATTCTTAGCGGGCGGCTTCGTATATACGGCGGCTGACA-3' (SEC ID n° 200) que introdujeron los sitios de restricción Nhel y EcoRI cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada, respectivamente. Se utilizó ADN genómico de E. coli MG1655 como el molde. El producto de PCR se digirió con Nhel y EcoRI, se ligó en los sitios correspondientes de pET28a+ (Novagen) en el mismo marco con una etiqueta hexa-His N-terminal utilizando ADN ligasa de T4 (Biolabs). El producto de ligación se transformó en células de E. coli DH5a. Se aisló plásmido pET28-Ec-yqhD resultante y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenía la secuencia de longitud completa correcta del gen yqhD de E. coli. Se utilizó el plásmido para transformar células de E. coli BL21 (DE3) Star y el enzima se expresó y purificó con una etiqueta hexa-His N- terminal tal como se ha indicado en el ejemplo 1.
Ensayo enzimático: la actividad de PDO deshidrogenasa se sometió a ensayo mediante el seguimiento de la reducción de NADP dependiente de PDO.
Esquema de reacción: 1,3-propanodiol + NADP+ -> 3-hidroxipropional + NADPH
La mezcla de reacción contenía Hepes 60 mM (pH 8), cloruro de potasio 50 mM, ZnSO4 2 mM, NADP 10 mM (todos los productos eran de Sigma) y cantidades apropiadas del enzima purificado o extracto celular. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 1,3-propanodiol 100 mM (PDO, Sigma). Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 |jl. Se realizó un seguimiento de las reacciones a partir de la absorción característica del NADPH a 340 nm (£nadh = 6,22 mM-1 cm'1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR). El enzima mostraba una actividad de PDO deshidrogenasa de 0,15 jmoles/(min mg).
Ejemplo 6: demostración de la producción in vitro de 1,3-propanodiol mediante la ruta sintética
Se expresaron y purificaron los enzimas DHB deshidrogenasa (Ec-Mdh R81A o EcLldD), OHB descarboxilasa (Zm-Pdc o Sc-Pdc) y la PDO deshidrogenasa (Ec-YqhD) tal como se ha indicado en el ejemplo 1. Se demostró la síntesis in vitro de PDO mediante la adición de dHb 20 mM a una mezcla de reacción que contenía Hepes 50 mM (pH 7), pirofosfato de tiamina 50 jM, NADPH 2 mM, MgCh 2 mM, NAD 10 mM o DCIP 1 mM, 160 jg/ml de DHB deshidrogenasa, 10 jg/ml de OHB descarboxilasa y 20 jg/ml de PDO deshidrogenasa. Las reacciones de control contenían todos los componentes pero no contenían DHB deshidrogenasa (Control 1) o no contenían OHB descarboxilasa (Control 2).
Tras 10 h de incubación a 37°C, se analizaron las mezclas de reacción mediante cromatografía de gases (GCMS-QP2010 Ultra Shimadzu), dotado de un detector FID (FID-2010 Plus Shimadzu); automuestreador AoC20s (Shimadzu), inyector sin divisor de flujo ('splitless') AOC20i (Shimadzu) (240°C); columna: Zebron ZB- WAX, 30 m x 0,25 mm, df 0,25 jm y cámara de mezcla: 'tapered focus' de 5 x 95 x 3,4 mm (SGE). El gas portador era hidrógeno a un caudal total de 4,9 ml/min. La ionización de llama se llevó a cabo utilizando una mezcla de aire-hidrógeno (los caudales eran de 400 ml/min y 40 ml/min, respectivamente). La temperatura del detector era de 250°C. El volumen de muestra inyectado era de 1 jl. Se proporciona el programa de temperaturas en la tabla 11.
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Tabla 11: programa de temperaturas utilizado para los análisis de CG-FID de las mezclas de reacción.
Temperatura de la columna [°C1
Mantenimiento [minl Gradiente [°C/min1 Tiempo de operación [minl
50
0 0 0
95
0 20 2,15
160
5 40 3,52
230
2 50 12,27
Los cromatogramas que muestran la presencia de PDO en las reacciones que contenían todos los enzimas de la ruta y la ausencia de PDO en muestras que contenían únicamente dos de los tres enzimas de la ruta se muestran en las figuras 3 y 4.
Ejemplo 7: construcción de cepas productoras de propanodiol optimizadas
Construcción del plásmido pACT3-op-PDO para la expresión de DHB deshidrogenasa (Ec-Mdh R81A), OHB descarboxilasa (Zm-Pdc) y PDO deshidrogenasa (Ec-YqhD).
Se construyó el vector pACT3-yqhD mediante la amplificación de la secuencia codificante de yqhD utilizando los cebadores directo e inverso 5'-TATAATGAGCTCTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAACAACTTTAAT CTGCACACCCCAACC-3' (SEC ID n° 201) y 5'-TATAATGGATCCTTAGCGGGCGGCTTCGTA-3' (SEC ID n° 202) que añadieron un sitio de restricción SacI y uno BamHI cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada. Se utilizó el plásmido pET28-yqhD como el molde. El fragmento de PCR se purificó y se ligó en los sitios SacI y BamHI del vector Pact3 (Dykxhoorn et al., A set of compatible tac promoter expression vectors, Gene 177:133-136, 1996). A continuación, se digirió el vector pACT3-yqhD en los sitios Xbal e HindIII, situado en el extremo de la secuencia codificante Ec-yqhD. Se amplificaron por PCR los genes Ec-mdh R81A y Zm-pdc utilizando las parejas de cebadores 5'-
GCCCGCTAAGGATCCTCTAGGGAGGTCTAGAATGAAAGTCGCAGTCCTCG GC-3' (SEC ID n° 203); 5'- CGAGCCTCCTTACTTATTAACGAACTCTTCGCC-3' (SEC ID n° 204), and 5'- CATAGGGAGGCTCGAGATGTATACCGTTGGGGATTATCTG-3' (SEC ID n° 205); 5'-
CGCCAAAACAGAAGCTTGACGTCCTAGAGGAGCTTGTTAACAGGCTT-3', (SEC ID n° 206), respectivamente. Los fragmentos amplificados por PCR (2 pl cada uno) y el plásmido pACT-yqhD digerido (3 pl) se mezclaron y se incubaron con 2 pl de enzima InFusion (Clontech) durante 20 min a 50°C. A continuación, se transformaron 2 pl de la mezcla de reacción en células competentes Stellar™. La presencia del operón completo en el plásmido pACT3-op-PDO resultante se confirmó mediante secuenciación del ADN plasmídico aislado que se recuperó a partir de los clones transformados.
Construcción de cepas con distribución de flujo de carbono optimizado para la producción de propanodiol
Se interrumpieron varios genes en E. coli cepa MG1655 con el fin de optimizar la distribución del flujo de carbono y el suministro de cofactores para la producción de PDO. Se llevaron a cabo eliminaciones de genes utilizando el procedimiento de la recombinasa Red de lambda según Datsenko et al. (Datsenko y Wanner, 2000), que puede refinarse para permitir eliminaciones génicas múltiples más eficientes utilizando el protocolo de Mizoguchi (Mizoguchi, Tanaka-Masuda y Mori, 2007). Una alternativa a la introducción de múltiples eliminaciones génicas en los cromosomas en E. coli se basa en la transferencia de mutaciones de una cepa a otra mediante transducción del fago P1 (Thomason, Costantino, Shaw y Court, 2007).
Se prepararon casetes de eliminación mediante PCR utilizando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y el gen de resistencia a canamicina (kan) flanqueado por FRT del plásmido pKD4 como molde (Datsenko y Wanner, 2000). Los cebadores de sentido contenían secuencias correspondientes al extremo 5' de cada gen diana (subrayado) seguido de 20 pb correspondientes al casete FRT-kan-FRT de pKD4. Los cebadores antisentido contenían secuencias correspondientes a la región del extremo 3' de cada gen diana (subrayado) seguido de 20 pb correspondientes al casete. Los cebadores se indica en la tabla 11. Los productos de pCr se digirieron con Dpnl y se purificaron antes de la transformación.
La cepa de E. coli MG1655 se convirtió en electrocompetente mediante el cultivo de las células hasta una DO600 de 0,6 en medio líquido LB a 37°C, concentrando las células 100 veces y lavándolas dos veces con glicerol al 10% helado. Las células se transformaron con el plásmido pKD46 (Datsenko y Wanner, 2000) mediante electroporación (2,5 kV, 200 O, 25 pF en cubetas de 2 mm de paso). Se seleccionaron los transformantes a 30°C en medio sólido LB con ampicilina (100 pg/ml).
Se transformaron los casetes de disrupción en cepas de E. coli electrocompetentes que alojaban el plásmido pKD46 expresante de la recombinasa Red de Lambda. Las células se cultivaron a 30°C en medio SOB líquido que contenía ampicilina (100 pg/ml). El sistema de recombinasa Red de lambda se indujo mediante la adición de arabinosa 10 mM al alcanzar la DO600 de los cultivos un valor de 0,1. Las células se cultivaron adicionalmente hasta una DO600 de 0,6 antes de recolectarlas mediante centrifugación, lavarlas dos veces con glicerol al 10%
helado y transformarlas con el casete de disrupción mediante electroporación. Tras una expresión fenotípica durante la noche a 30°C en medio LB líquido, las células se sembraron en placas con medio LB sólido que contenía canamicina 25 |jg/ml. Se seleccionaron los transformantes tras el cultivo a 30°C.
5 Se verificó la sustitución génica mediante PCR de las colonias utilizando polimerasa Taq Crimson (NEB). Se llevó a cabo una primera reacción con los cebadores específicos de locus flanqueantes (ver la tabla 12) con el fin de verificar la pérdida simultánea del fragmento parental y la ganancia del nuevo fragmento específico de mutante. Se llevaron a cabo dos reacciones adicionales mediante la utilización de un cebador específico de locus junto con uno de los cebadores correspondientes klrev o k2for (ver la tabla 6) que se alinean dentro del casete 10 de FRT-resistencia a canamicina (locus sentido cebador/klrev y k2for/locus inverso cebador).
Seguidamente se extrajo el gen de resistencia (FRT-kan-FRT) del cromosoma utilizando el plásmido pCP20 que alojaba la recombinasa FLP (Cherepanov y Wackernagel, 1995), dejando una región cicatriz que contenía un sitio de FRT. pCP20 es un plásmido de ampicilina y CmR que muestra una replicación termosensible e inducción 15 térmica de la síntesis de la recombinasa FLP. Se transformaron los mutantes resistentes a canamicina con pCP20 y se seleccionaron los transformantes resistentes a ampicilina a 30°C. A continuación, se cultivaron los transformantes sobre medio LB sólido a 37°C y se sometieron a ensayo para la pérdida de todas las resistencias a antibióticos. La extracción del casete de FRT-canamicina se analizó mediante PCR de colonias utilizando la polimerasa Taq Crimson y cebadores específicos de locus flanqueantes (Tabla 13). Se obtuvieron múltiples 20 eliminaciones mediante la repetición de las etapas anteriormente descritas.
Tabla 12: cebadores utilizados para las disrupciones génicas. Las secuencias homólogas a los genes diana se
encuentran subrayadas.
Gen
Cebador Secuencia
IdhA
A IdhA for gaaggttgcgcctacactaagcatagttgttgatgagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 1)
A IdhA rev ttaaaccagttcgttcgggcaggtttcgcctttttcatgggaattagccatggtcc SEC ID n° 2)
adhE
A adhE for atggctgttactaatgtcgctgaacttaacgcactcgtagagcgtgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 3)
A adhE rev ttaagcggattttttcgcttttttctcagctttagccggagcagccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 4)
ackA
A ackA for atgtcgagtaagttagtactggttctgaactgcggtagttcttcagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 5)
A ackA rev tcaggcagtcaggcggctcgcgtcttgcgcgataaccagttcttccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 6)
focA-
A focA- ttactccgtatttgcataaaaaccatgcgagttacgggcctataagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 7)
pflB
pfIB_ for A focA- atagattgagtgaaggtacgagtaataacgtcctgctgctgttctcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 8)
pta
pfIB_rev A pta for gtgtcccgtattattatgctgatccctaccggaaccagcgtcggtgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 9)
A pta rev
ttactgctgctgtgcagactgaatcgcagtcagcgcgatggtgtacatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 10)
poxB
A poxB for atgaaacaaacggttgcagcttatatcgccaaaacactcgaatcggtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 11)
A poxB rev
ttaccttagccagtttgttttcgccagttcgatcacttcatcacccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 12)
sad
A sad for atgaccattactccggcaactcatgcaatttcgataaatcctgccgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 13)
A sad rev tcagatccggtctttccacaccgtctggatattacagaattcgtgcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 14)
gabD
A gabD for atgaaacttaacgacagtaacttattccgccagcaggcgttgattgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 15)
A gabD rev
ttaaagaccgatgcacatatatttgatttctaagtaatcttcgatcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 16)
gadA
A gadA for atggaccagaagctgttaacggatttccgctcagaactactcgatgtgtaggctggagctggagctgcttc (SEC ID
A gadA rev
n° 17) tcaggtgtgtttaaagctgttctgctgggcaataccctgcagtttcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 18)
gadB
A gadB for atggataagaagcaagtaacggatttaaggtcggaactactcgatgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 19)
A gadB rev
tcaggtatgtttaaagctgttctgttgggcaataccctgcagtttcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 20)
gadC
A gadC for atggctacatcagtacagacaggtaaagctaagcagctcacattagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 21)
A gadC rev
ttagtgtttcttgtcattcatcacaatatagtgtggtgaacgtgccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 22)
sfcA
A sfcA for atggaaccaaaaacaaaaaaacagcgttcgctttatatcccttacgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 23)
A sfcA rev ttagatggaggtacggcggtagtcgcggtattcggcttgccagaacatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 24)
maeB
A maeB for atggatgaccagttaaaacaaagtgcacttgatttccatgaatttgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 25)
A maeB rev ttacagcggttgggtttgcgcttctaccacggccagcgccaccatcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 26)
pykA
A pykA for atgtccagaaggcttcgcagaacaaaaatcgttaccacgttaggcgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 27)
A pykA rev
ttactctaccgttaaaatacgcgtggtattagtagaacccacggtcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 28)
pykF
A pykF for atgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccgaaaaccgaagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 29)
A pykF rev
ttacaggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 30)
mgsA
A mgsA for atggaactgacgactcgcactttacctgcgcggaaacatattgcggtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 31)
A mgsA rev
ttacttcagacggtccgcgagataacgctgataatcggggatcagcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 32)
iclR
A iclR for atggtcgcacccattcccgcgaaacgcggcagaaaacccgccgttgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 33)
A iclR rev tcagcgcattccaccgtacgccagcgtcacttccttcgccgctttcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 34)
icd
A icd for atggaaagtaaagtagttgttccggcacaaggcaagaagatcaccgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 35)
Gen
Cebador Secuencia
A icd rev ttacatgttttcgatgatcgcgtcaccaaactctgaacatttcagcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 36)
sucA
A sucA for atgcagaacagcgctttgaaagcctggttggactcttcttacctcgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 37)
A sucA rev ttattcgacgttcagcgcgtcattaaccagatcttgttgctgtttcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 38)
sucB
A sucB for atgagtagcgtagatattctggtccctgacctgcctgaatccgtagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 39)
A sucB rev ctacacgtccagcagcagacgcgtcggatcttccagcaactctttcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 40)
frdA
A frdA for gtgcaaacctttcaagccgatcttgccattgtaggcgccggtggcgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 41)
A frdA rev tcagccattcgccttctccttcttattggctgcttccgccttatccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 42)
frdB
A frdB for atggctgagatgaaaaacctgaaaattgaggtggtgcgctataacgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 43)
A frdB rev ttagcgtggtttcagggtcgcgataagaaagtctttcgaactttccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 44)
frdC
A frdC for atgacgactaaacgtaaaccgtatgtacggccaatgacgtccaccgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 45)
A frdC rev ttaccagtacagggcaacaaacaggattacgatggtggcaaccaccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 46)
frdD
A frdD for atgattaatccaaatccaaagcgttctgacgaaccggtattctgggtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 47)
A frdD rev ttagattgtaacgacaccaatcagcgtgacaactgtcaggatagccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 48)
ptsI
A ptsI for atgatttcaggcattttagcatccccgggtatcgctttcggtaaagtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 49)
A ptsI rev
ttagcagattgttttttcttcaatgaacttgttaaccagcgtcatcatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 50)
ptsG
A ptsG for atgtttaagaatgcatttgctaacctgcaaaaggtcggtaaatcggtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n° 51)
A ptsG rev
ttagtggttacggatgtactcatccatctcggttttcaggttatccatatgaatatcctccttag (SEC ID n° 52)
lacl
A lacl for gtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtcgtgtaggctggagctgcttc(SEC ID n° 53)
A lacl rev tcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcatcatatgaatatcctccttag(SEC ID n° 54)
pgi
A pgi for atgaaaaacatcaatccaacgcagaccgctgcctggcaggcactagtgtaggctggagctgcttc(SEC ID n° 55)
A pgi rev
ttaaccgcgccacgctttatagcggttaatcagaccattggtcgacatatgaatatcctccttag(SEC ID n° 56)
eda
A_ eda_ for A eda for atgaaaaactggaaaacaagtgcagaatcaatcctgaccaccggcgtgtaggctggagctgcttc (SEC ID n°
57) ctcgatcgggcattttgacttttacagcttagcgccttctacagcratatgaatatcctccttag(SEC ID n° 58)
Tabla 13: parejas de cebadores utilizadas para la verificación de las disrupciones génicas.
Gen eliminado
Secuencia (5' - 3')
Cebador directo Cebador inverso
K2for / k1 rev
cggtgccctgaatgaactgc (SEC ID n° 59) cagtcatagccgaatagcct (SEC ID n° 60)
IdhA
atacgtgtcccgagcggtag (SEC ID n° 61) tacacatcccgccatcagca (SEC ID n° 62)
adhE
gaagtaaacgggaaaatcaa (SEC ID n° 63) agaagtggcataagaaaacg (SEC ID n° 64)
ackA
ccattggctgaaaattacgc (SEC ID n° 65) gttccattgcacggatcacg (SEC ID n° 66)
focA_pflB
atgccgtagaagccgccagt (SEC ID n° 67) tgttggtgcgcagctcgaag (SEC ID n° 68)
pta
gcaaatctggtttcatcaac (SEC ID n° 69) tcccttgcacaaaacaaagt (SEC ID n° 70)
poxB
ggatttggttctcgcataat (SeC ID n° 71) agcattaacggtagggtcgt (SEC ID n° 72)
sad
gctgattctcgcgaataaac (SEC ID n° 73) aaaaacgttcttgcgcgtct (SeC ID n° 74)
gabD
tctgtttgtcaccaccccgc (SeC ID n° 75) aagccagcacctggaagcag (SEC ID n° 76)
gadA
aagagctgccgcaggaggat (SEC ID n° 77) gccgccctcttaagtcaaat (SEC ID n° 78)
gadB
ggattttagcaatattcgct (SEC ID n° 79) cctaatagcaggaagaagac (SEC ID n° 80)
gadC
gctgaactgttgctggaaga (SEC ID n° 81) ggcgtgcttttacaactaca (sEc ID n° 82)
sfcA
tagtaaataacccaaccggc (SEC ID n° 83) tcagtgagcgcagtgtttta (SEC ID n° 84)
maeB
attaatggtgagagtttgga (SEC ID n° 85) tgcttttttttattattcgc (SEC ID n° 86)
pykA
tttatatgcccatggtttct (SEC ID n° 87) atctgttagaggcggatgat (SEC ID n° 88)
pykF
ctggaacgttaaatctttga (SEC ID n° 89) ccagtttagtagctttcatt (SEC ID n° 90)
iclR
gatttgttcaacattaactcatcgg (SEC ID n° 91) tgcgattaacagacaccctt (SEC ID n° 92)
mgsA
tctcaggtgctcacagaaca (SEC ID n° 93) tatggaagaggcgctactgc (SEC ID n° 94)
icd
cgacctgctgcataaacacc (SEC ID n° 95) tgaacgctaaggtgattgca (SEC ID n° 96)
sucA
acgtagacaagagctcgcaa (SEC ID n° 97) catcacgtacgactgcgtcg (SEC ID n° 98)
sucB
tgcaactttgtgctgagcaa (SEC ID n° 99) tatcgcttccgggcattgtc (SEC ID n° 100)
frdA
aaatcgatctcgtcaaatttcagac (SEC ID n° 101) aggaaccacaaatcgccata (SEC ID n° 102)
frdB
gacgtgaagattactacgct (SEC ID n° 103) agttcaatgctgaaccacac (SEC ID n° 104)
frdC
tagccgcgaccacggtaagaaggag (SEC ID n° 105) atcgtgatcattaacctgat (SEC ID n° 107) cagcgcatcacccggaaaca (SEC ID n° 106)
frdD
ttaccctgataaattaccgc (SEC ID n° 108)
lacl
gaatctggtgtatatggcga(SEC ID n° 109) tcttcgctattacgccagct(SEC ID n° 110)
pgi
ttgtcaacgatggggtcatg(SEC ID n° 111) aaaaatgccgacataacgtc(SEC ID n° 112)
ptsG
ccatccgttgaatgagtttt (SEC ID n° 113) tggtgttaactggcaaaatc (SeC ID n° 114)
ptsl
gtgacttccaacggcaaaag (SEC ID n° 115) ccgttggtttgatagcaata (SEC ID n° 116)
edo
Gacagacaggcgaactgacg (SEC ID n° 117) Gcgcagatttgcagattcgt (SEC ID n° 118)
5 El plásmido que expresaba los enzimas que constituyen la ruta que conduce de DHB a pDO (pACT3-op-PDO) se transformaron en la cepa E. coli MG1655 de tipo salvaje. Se seleccionaron los transformantes sobre medio LB
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
sólido que contenía cloranfenicol (25 |jg/ml) y canamicina (50 |jg/ml). En la tabla 14 se listan ejemplos no exclusivos de las cepas construidas.
Tabla 14: ejemplos de cepas construidas para la producción de DHB.
Cepa
Genotipo relevante
MG1655
Tipo salvaje
ECE90
pACT3 (plásmido vacío)
ECE91
pACT3-op-PDO
Ejemplo 8: producción zimótica de propanodiol
Cepas y medio: se llevaron a cabo experimentos con las cepas listadas en la tabla 14. Un litro de medio de cultivo contenía 20 g de glucosa, 18 g de Na2HPO4-12H2O, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCl, 2 g de NH4Cl, 0,5 g de MgSO4'7H2O, 0,015 g de CaCl2-2H2O, 1 ml de solución madre de FeCh 0,06 moles/l preparada en HCl concentrado diluido 100 veces, 2 ml de solución madre de HCl de tiamina 10 mM, 20 g de MOPS y 1 ml de solución de elementos traza (que contenía por litro: 0,04 g de Na2EDTA2H2O, 0,18 g de CoCl2-6H2O, ZnSO4-7H2O, 0,04 g de Na2MoO4'2H2O, 0,01 g de H3BO3, 0,12 g de MnSO4^O, 0,12 g de CuCh^O). Se ajustó el pH del medio a 7 y el medio se esterilizó mediante filtración. Se añadió cloranfenicol (Sigma) a una concentración de 25 jg/ml.
Condiciones de cultivo: todos los cultivos se llevaron a cabo a 37°C en un agitador rotatorio Infors operando a 170 rpm. Se cultivaron las células sobre medio mineral que contenía glucosa. Se sometió a ensayo la producción de PDO bajo dos condiciones:
(A) crecimiento sobre medio mineral que contiene glucosa en presencia de DHB 20 mM, o
(B) incubación de una suspensión celular en tampón de fosfato con DHB 20 mM.
Datos experimentales para la condición (A): se inocularon cultivos de durante la noche ('overnight') (3 ml de medio en probeta) a partir de stocks en glicerol y se utilizaron para ajustar una DO600 inicial de 0,05 en cultivos de crecimiento de 100 ml cultivados en matraces de agitación de 500 ml. Se añadió IPTG a una concentración de 1 mmol/l tras alcanzar la DO600 en los cultivos de crecimiento el valor de 1. Simultáneamente se añadió DHB a los cultivos a una concentración de 20 mM. Se analizó el sobrenadante de los cultivos tras 20 h de incubación.
Datos experimentales para la condición (B): se inocularon cultivos de durante la noche (3 ml de medio en probeta) a partir stocks en glicerol y se utilizaron para ajustar una DO600 inicial de 0,05 en cultivos de crecimiento de 100 ml cultivados en matraces de agitación de 500 ml. Se añadió IPTG a una concentración de 1 mmol/l tras alcanzar la DO600 en los cultivos de crecimiento un valor de 1. Se recolectaron las células mediante centrifugación tras la incubación con IPTG durante 4 h. Se lavaron las células dos veces con agua destilada y se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de fosfato 50 mM a pH 7 para ajustar la densidad celular a 5,5 g (peso celular seco)/l. Se añadió DHB a una concentración de 20 mM. Se cuantificó el contenido de PDO tras 20 h de incubación.
Estimación de la concentración de PDO mediante análisis de CL-EM: se llevó a cabo una cromatografía líquida de intercambio aniónico en un sistema ICS-3000 de Dionex (Sunnyvale, USA) dotado de un sistema generador de eluyente (KOH) automático (RFIC, Dionex) y un automuestreador (AS50, Dionex) que mantenía las muestras a 4°C. Se separaron los analitos en una columna lonPac AS11 HC (250 x 2 mm, Dionex) protegida por una precolumna AG11 HC (50 x 2 mm, Dionex). Se mantuvo la temperatura de la columna a 25°C; se fijó el caudal a 0,25 ml/min y se eluyeron los analitos aplicando el gradiente de KOH indicado anteriormente (Groussac E., Ortiz M. y Francois J.: Improved protocols for quantitative determination of metabolites from biological samples using high performance ionic-exchange chromatography with conductimetric and pulsed amperometric detection, Enzyme Microb. Technol. 26:715-723, 2000). El volumen de muestra inyectada fue de 15 jl. Para la reducción del fondo, se utilizó un supresor de aniones ASRS Ultra II (2 mm, modo de agua externa, 75 mA). Los analitos se cuantificaron utilizando un detector sensible a la masa (MSQ Plus, Thermo) operando en modo ESI (divisor de flujo: 1/3, presión de nitrógeno: 90 psi, voltaje capilar: 3,5 kV, temperatura de la sonda: 450°C).
Resultados:
Condición A: la concentración de PDO en el sobrenadante de las cepas ECE90 y ECE91 tras 20 h de incubación era de 0 mg/l y 0,92 mg/l, respectivamente.
Condición B: la concentración de PDO en el sobrenadante de las cepas ECE90 y ECE91 tras 20 h de incubación era de 0,11 mg/l y 7,56 mg/l, respectivamente.
Por lo tanto, se demostró la producción zimótica de PDO mediante la ruta sintética.
5
10
15
20
25
30
35
Referencias
Cherepanov, P. P. & Wackernagel, W.(1995).Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excisión of the antibiotic-resistance determinant. Gene158, 9-14.
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Laffend, L. A., Nagarajan, V. & Nakamura, C. E.(1995). Bioconversion of a fermentable carbon source to 1,3- propandiol by a single microorganism.
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Saxena, R. K., Anand, P., Saran, S. & Isar, J.(2009). Microbial production of 1,3-propanediol: Recent developments and emerging opportunities. Biotechnol. Adv27, 895-913.
Schuster, S., Dandekar, T. & Fell, D. A.(1999). Detection of elementary flux modes in biochemical networks: a promising tool for pathway analysis and metabolic engineering. Trends Biotechnol17, 53-60.
Thomason, L. C., Costantino, N., Shaw, D. V. & Court, D. L.(2007). Multicopy plasmid modification with phage lambda Red recombineering. Plasmid58, 148-158.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
LISTADO DE SECUENCIAS
<110>INSA
<120> Microorganismo para la producción de 1,3-propanodiol
<130> BR079240
<150> 61/670389 <151> 2012-07-11
<160> 208
<170> PatentIn versión 3.5
<210> 1 <211> 56 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 1
gaaggttgcg cctacactaa gcatagttgt tgatgagtgt aggctggagc tgcttc 56
<210> 2 <211> 56 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 2
ttaaaccagt tcgttcgggc aggtttcgcc tttttcatgg gaattagcca tggtcc 56
<210> 3 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400>3
atggctgtta ctaatgtcgc tgaacttaac gcactcgtag agcgtgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 4 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400>4
ttaagcggat tttttcgctt ttttctaaga tttagccgga gcagccatat gaatatcctc
cttag
<210> 5 <211> 65 <212> ADN
60
65
60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400>5
atgtcgagta agttagtact ggttctgaac tgcggtagtt cttcagtgta ggctggagct
gcttc
<210>6 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400>6
tcaggcagtc aggcggctcg cgtcttgcgc gataaccagt tcttccatat gaatatcctc
cttag
<210>7 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400>7
ttactccgta tttgcataaa aaccatgcga gttacgggcc tataagtgta ggctggagct gcttc
60
65
60
65
60
65
<210>8 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400>8
atagattgag tgaaggtacg agtaataacg tcctgctgct gttctcatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210>9 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400>9
gtgtcccgta ttattatgct gatccctacc ggaaccagcg tcggtgtgta ggctggagct gcttc
60
<210> 10 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
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50
55
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 10
ttactgctgc tgtgcagact gaatcgcagt cagcgcgatg gtgtacatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 11 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 11
atgaaacaaa cggttgcagc ttatatcgcc aaaacactcg aatcggtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 12 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 12
ttaccttagc cagtttgttt tcgccagttc gatcacttca tcacccatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 13 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 13
atgaccatta ctccggcaac tcatgcaatt tcgataaatc ctgccgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 14 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 14
tcagatccgg tctttccaca ccgtctggat attacagaat tcgtgcatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 15 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 15
atgaaactta acgacagtaa cttattccgc cagcaggcgt tgattgtgta ggctggagct gcttc
60
65
<210> 16 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 16
ttaaagaccg atgcacatat atttgatttc taagtaatct tcgatcatat gaatatcctc cttag
60
65
<210> 17 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 17
atggaccaga agctgttaac ggatttccgc tcagaactac tcgatgtgta ggctggagct gcttc
60
65
<210> 18 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 18
tcaggtgtgt ttaaagctgt tctgctgggc aataccctgc agtttcatat gaatatcctc cttag
60
65
<210> 19 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 19
atggataaga agcaagtaac ggatttaagg tcggaactac tcgatgtgta ggctggagct gcttc
60
<210> 20 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<223> Cebador de amplificación <400> 20
tcaggtatgt ttaaagctgt tctgttgggc aataccctgc agtttcatat gaatatcctc
cttag
<210> 21 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 21
atggctacat cagtacagac aggtaaagct aagcagctca cattagtgta ggctggagct gcttc
65
60
65
<210> 22 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 22
ttagtgtttc ttgtcattca tcacaatata gtgtggtgaa cgtgccatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 23 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 23
atggaaccaa aaacaaaaaa acagcgttcg ctttatatcc cttacgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 24 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 24
ttagatggag gtacggcggt agtcgcggta ttcggcttgc cagaacatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 25 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 25
atggatgacc agttaaaaca aagtgcactt gatttccatg aatttgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 26 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 26
ttacagcggt tgggtttgcg cttctaccac ggccagcgcc accatcatat gaatatcctc
cttag
<210> 27 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
65
60
65
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 27
atgtccagaa ggcttcgcag aacaaaaatc gttaccacgt taggcgtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 28 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 28
ttactctacc gttaaaatac gcgtggtatt agtagaaccc acggtcatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 29 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 29
atgaaaaaga ccaaaattgt ttgcaccatc ggaccgaaaa ccgaagtgta ggctggagct 60
gcttc 65
<210> 30 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
<400> 30
ttacaggacg tgaacagatg cggtgttagt agtgccgctc ggtaccatat gaatatcctc
cttag
<210> 31 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 31
atggaactga cgactcgcac tttacctgcg cggaaacata ttgcggtgta ggctggagct
gcttc
<210> 32 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 32
ttacttcaga cggtccgcga gataacgctg ataatcgggg atcagcatat gaatatcctc
cttag
<210> 33 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 33
atggtcgcac ccattcccgc gaaacgcggc agaaaacccg ccgttgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 34 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 34
tcagcgcatt ccaccgtacg ccagcgtcac ttccttcgcc gctttcatat gaatatcctc
cttag
<210> 35 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 35
65
60
65
60
65
60
65
60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
gcttc
<210> 36 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 36
ttacatgttt tcgatgatcg cgtcaccaaa ctctgaacat ttcagcatat gaatatcctc
cttag
<210> 37 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 37
atgcagaaca gcgctttgaa agcctggttg gactcttctt acctcgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 38 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 38
ttattcgacg ttcagcgcgt cattaaccag atcttgttgc tgtttcatat gaatatcctc
cttag
<210> 39 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 39
atgagtagcg tagatattct ggtccctgac ctgcctgaat ccgtagtgta ggctggagct gcttc
<210> 40 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 40
ctacacgtcc agcagcagac gcgtcggatc ttccagcaac tctttcatat gaatatcctc
65
60
65
60
65
60
65
60
65
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
cttag
<210> 41 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 41
gtgcaaacct ttcaagccga tcttgccatt gtaggcgccg gtggcgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 42 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 42
tcagccattc gccttctcct tcttattggc tgcttccgcc ttatccatat gaatatcctc
cttag
<210> 43 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 43
atggctgaga tgaaaaacct gaaaattgag gtggtgcgct ataacgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 44 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 44
ttagcgtggt ttcagggtcg cgataagaaa gtctttcgaa ctttccatat gaatatcctc
cttag
<210> 45 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 45
65
60
65
60
65
60
65
60
65
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
gcttc
<210> 46 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 46
ttaccagtac agggcaacaa acaggattac gatggtggca accaccatat gaatatcctc
cttag
<210> 47 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 47
atgattaatc caaatccaaa gcgttctgac gaaccggtat tctgggtgta ggctggagct
gcttc
<210> 48 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 48
ttagattgta acgacaccaa tcagcgtgac aactgtcagg atagccatat gaatatcctc
cttag
<210> 49 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 49
atgatttcag gcattttagc atccccgggt atcgctttcg gtaaagtgta ggctggagct
gcttc
<210> 50 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 50
65
60
65
60
65
60
65
60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
ttagcagatt gttttttctt caatgaactt gttaaccagc gtcatcatat gaatatcctc
cttag
<210> 51 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 51
atgtttaaga atgcatttgc taacctgcaa aaggtcggta aatcggtgta ggctggagct
gcttc
<210> 52 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 52
ttagtggtta cggatgtact catccatctc ggttttcagg ttatccatat gaatatcctc
cttag
<210> 53 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
60
65
60
65
60
65
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 53
gtgaaaccag taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtcgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 54 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 54
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcatcatat gaatatcctc
cttag
<210> 55 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 55
60
65
60
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
gcttc
<210> 56 <211> 65 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 56
ttaaccgcgc cacgctttat agcggttaat cagaccattg gtcgacatat gaatatcctc
cttag
<210> 57 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 57
atgaaaaact ggaaaacaag tgcagaatca atcctgacca ccggcgtgta ggctggagct
gcttc
<210> 58 <211> 65 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
65
60
65
60
65
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 58
ctcgatcggg cattttgact tttacagctt agcgccttct acagccatat gaatatcctc 60
cttag 65
<210> 59 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 59
cggtgccctg aatgaactgc 20
<210> 60 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Cebador de amplificación <400> 60
cagtcatagc cgaatagcct 20 <210> 61
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 61
atacgtgtcc cgagcggtag 20
<210> 62 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 62
tacacatccc gccatcagca 20
<210> 63 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 63
gaagtaaacg ggaaaatcaa 20
<210> 64 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 64
agaagtggca taagaaaacg 20
<210> 65 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 65
ccattggctg aaaattacgc 20
<210> 66 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 66
gttccattgc acggatcacg 20
<210> 67
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 67
atgccgtaga agccgccagt 20
<210> 68 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 68
tgttggtgcg cagctcgaag 20
<210> 69 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 69
gcaaatctgg tttcatcaac 20
<210> 70 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 70
tcccttgcac aaaacaaagt 20
<210> 71 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 71
ggatttggtt ctcgcataat 20
<210> 72 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 72
agcattaacg gtagggtcgt 20 <210> 73
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 73
gctgattctc gcgaataaac 20
<210> 74 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 74
aaaaacgttc ttgcgcgtct 20
<210> 75 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 75
tctgtttgtc accaccccgc 20
<210> 76 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 76
aagccagcac ctggaagcag 20
<210> 77 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 77
aagagctgcc gcaggaggat 20
<210> 78 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 78
gccgccctct taagtcaaat 20 <210> 79
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 79
ggattttagc aatattcgct 20
<210> 80 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 80
cctaatagca ggaagaagac 20
<210> 81 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 81
gctgaactgt tgctggaaga 20
<210> 82 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 82
ggcgtgcttt tacaactaca 20
<210> 83 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 83
tagtaaataa cccaaccggc 20
<210> 84 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 84
tcagtgagcg cagtgtttta 20 <210> 85
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 85
attaatggtg agagtttgga 20
<210> 86 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 86
tgcttttttt tattattcgc 20
<210> 87 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 87
tttatatgcc catggtttct 20
<210> 88 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 88
atctgttaga ggcggatgat 20
<210> 89 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 89
ctggaacgtt aaatctttga 20
<210> 90 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 90
ccagtttagt agctttcatt 20 <210> 91
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 91
gatttgttca acattaactc atcgg 25
<210> 92 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 92
tgcgattaac agacaccctt 20
<210> 93 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 93
tctcaggtgc tcacagaaca 20
<210> 94 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 94
tatggaagag gcgctactgc 20
<210> 95 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 95
cgacctgctg cataaacacc 20
<210> 96 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 96
tgaacgctaa ggtgattgca 20 <210> 97
5
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15
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30
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<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 97
acgtagacaa gagctcgcaa 20
<210> 98 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 98
catcacgtac gactgcgtcg 20
<210> 99 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 99
tgcaactttg tgctgagca 19
<210> 100 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 100
tatcgcttcc gggcattgtc 20
<210> 101 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 101
aaatcgatct cgtcaaattt cagac 25
<210> 102 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 102
aggaaccaca aatcgccata 20 <210> 103
5
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20
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<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 103
gacgtgaaga ttactacgct 20
<210> 104 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 104
agttcaatgc tgaaccacac 20
<210> 105 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 105
tagccgcgac cacggtaaga aggag 25
<210> 106 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 106
cagcgcatca cccggaaaca 20
<210> 107 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 107
atcgtgatca ttaacctgat 20
<210> 108 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 108
ttaccctgat aaattaccgc 20
<210> 109
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15
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<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 109
gaatctggtg tatatggcga 20
<210> 110 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 110
tcttcgctat tacgccagct 20
<210> 111 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 111
ttgtcaacga tggggtcatg 20
<210> 112 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 112
aaaaatgccg acataacgtc 20
<210> 113 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 113
ccatccgttg aatgagtttt 20
<210> 114 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 114
tggtgttaac tggcaaaatc 20 <210> 115
5
10
15
20
25
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35
40
45
<211> 20 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 115
gtgacttcca acggcaaaag 20
<210> 116 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 116
ccgttggttt gatagcaata 20
<210> 117 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 117
gacagacagg cgaactgacg 20
<210> 118 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Cebador de amplificación <400> 118
gcgcagattt gcagattcgt 20
<210> 119 <211> 978 <212> ADN
<213> Lactococcus lactis <400> 119
5
10
tacgcttttg
aaagaaaaaa
aaaaagattt
tctggtgctc
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gcttcaggtt
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gatactgcac
cacgcataca
gttgctggtg
atcgttgaat
gcaacattct
gaacatgcag
imagen1
<210> 120 <211> 325 <212> PRT
<213> Lactococcus lactis
<400> 120
acggtgctgt aggttcatca taggaattgt tgaccttttt ccttggcatt tacttcacct ctgacctcgt agtcttgact ttgttgaaaa aaatcttcgt tcaaaggaat cttccttgtt aattctcagg tttccctaaa gtttccgtca agcattggca tcatgggtga acacggtgac ttaaattgga acaatggttc tgtttgaatc tgtacgtgat atggtgtcgc tgtagctctt tacttccagt atcagtattc aaccagctgt agttggtgct ctgaaatgca aaaaatggaa ttgctaaaga agaatttgct
120
180
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780
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900
960
978

Claims (21)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
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    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    1. Microorganismo modificado para la producción de 1,3-propanodiol (PDO) a partir de un sustrato de carbono en el que el microorganismo comprende:
    - una ruta para la síntesis de 2,4-dihidroxibutirato (DHB) a partir de malato, y
    - una ruta metabólica de tres etapas que comprende las etapas siguientes:
    - una primera etapa de convertir el DHB para obtener 2-oxo-4-hidroxibutirato (OHB) mediante un enzima que presenta una actividad de 2,4-DHB deshidrogenasa, y
    - una segunda etapa de descarboxilar el OHB para obtener 3-hidroxipropionaldehído mediante un enzima que presenta una actividad de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa, y
    - una tercera etapa de reducir el 3-hidroxipropionaldehído obtenido para obtener el PDO con un enzima que presenta una actividad de 3-hidroxipropionaldehído reductasa.
  2. 2. Microorganismo modificado según la reivindicación 1, en el que el microorganismo ha sido modificado además mediante la introducción de genes que codifican:
    - una malato cinasa que cataliza la transformación del malato en 4-fosfo-malato,
    - una malato semialdehído deshidrogenasa que cataliza la transformación del 4-fosfo-malato en malato-4- semialdehído,
    - una malato semialdehído reductasa que cataliza la transformación del malato-4-semialdehído en 2,4-DHB.
  3. 3. Microorganismo según la reivindicación 1 o 2, en el que los enzimas son codificados por un gen endógeno o heterólogo.
  4. 4. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enzima que presenta una actividad de 2,4-DHB deshidrogenasa se selecciona de entre enzimas que presentan una actividad de lactato deshidrogenasa o de malato deshidrogenasa.
  5. 5. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enzima que presenta una actividad de 2,4-DHB deshidrogenasa se obtiene mediante por lo menos una mutación de dicho enzima, mejorando dicha mutación la actividad y/o la afinidad de sustrato del enzima mutado para DHB.
  6. 6. Organismo modificado según la reivindicación 4 o 5, en el que el enzima es un producto génico codificado por genes seleccionados de entre IdhA de Lactococcus lactis, IldD de Escherichia coli, IldD de E. coli que porta una mutación en la posición V108 (en referencia a la SEC ID n° 122), mdh de E. coli o de Bacillus subtilis, o mdh de E. coli que porta mutaciones en por lo menos una de las posiciones siguientes (en referencia a la SEC ID n° 124): Ile12, Arg81, Lys82, Met85, Asp86, Val93, Ile117, Gly179, Thr211 o Met227 (en referencia a la SEC ID n° 126).
  7. 7. Organismo modificado según la reivindicación 6, en el que el enzima es
    - codificado por un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que comprende SEC ID n° 119, SEC ID n°

    121, SEC ID n° 153, SEC ID n° 155, SEC ID n° 157, SEC ID n° 159, SEC ID n° 161, SEC ID n° 163, SEC ID
    n° 165, SEC ID n° 167, SEC ID n° 169, SEC ID n° 171 o SEC ID n° 173 o cualquier secuencia que comparte
    una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias,

    - un polipéptido seleccionado de entre el grupo que comprende SEC ID n° 120, SEC ID n° 122, SEC ID n°

    154, SEC ID n° 156, SEC ID n° 158, SEC ID n° 160, SEC ID n° 162, SEC ID n° 164, SEC ID n° 166, SEC ID
    n° 168, SEC ID n° 170, SEC ID n° 172 o SEC ID n° 174 o cualquier secuencia que comparte una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias.
  8. 8. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enzima que presenta una actividad de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa es un enzima que presenta una actividad de 2-cetoácido descarboxilasa.
  9. 9. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enzima que presenta una actividad de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa se obtiene mediante por lo menos una mutación de dicho enzima, mejorando dicha mutación la actividad y/o la afinidad de sustrato del enzima mutado para OHB.
    5
    10
    15
    20
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    35
    40
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    50
    55
    60
    65
  10. 10. Organismo modificado según la reivindicación 8 o 9, en el que el enzima es un producto génico codificado por genes seleccionados de entre los genes PDC1, PDC5, PDC6, ARO10, THI3 de Saccharomyces cerevisiae, los genes kivD, kdcA de Lactococcus lactis, el gen pdc de Clostridium acetobutylicum, los genes PDC2 y PDC3 de Arabidopsis thaliana, los genes PDC1, PDC2 y ARO10 de Pichia stipitis, el gen pdc de Zymomonas mobilis, el gen sucA de Escherichia coli, el gen dxs de Escherichia coli, el gen pdc de Z. mobilis que porta una mutación en por lo menos una de las posiciones siguientes: Tyr290, Trp392, Gly413 o Ile476 (en referencia a la SEC ID n° 128), el gen kdcA de L. lactis que porta una mutación en por lo menos una de las posiciones siguientes: Gln377, Phe381, Phe382, Gly402, Val461, Ile465 o Phe542 (en referencia a la SEC ID n° 130).
  11. 11. Organismo modificado según la reivindicación 10, en el que el enzima es
    - codificado por un polinucleótido seleccionado de entre el grupo que comprende SEC ID n° 129, SEC ID n° 127, SEC ID n° 207, SEC ID n° 189, SEC ID n° 191, SEC ID n° 193, SEC ID n° 195 o SEC ID n° 197 o cualquier secuencia que comparte una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias,
    - un polipéptido seleccionado de entre el grupo que comprende SEC ID n° 130, SEC ID n° 128, SEC ID n° 208, SEC ID n° 190, SEC ID n° 192, SEC ID n° 194, SEC ID n° 196 o SEC ID n° 198 o cualquier secuencia que comparte una homología de por lo menos 50% con dichas secuencias.
  12. 12. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el enzima que presenta una actividad de 3-hidroxipropionaldehído reductasa se selecciona de entre enzimas que presentan una actividad de hidroxialdehído reductasa, una actividad de alcohol deshidrogenasa, una actividad de lactaldehído reductasa o una actividad de metilglioxal reductasa.
  13. 13. Organismo modificado según la reivindicación 12, en el que el enzima es un producto génico codificado por genes seleccionados de entre los genes yqhD, fucO, dkgA, dkgB de Escherichia coli, el gen dhaT de K. pneumoniae, o los genes ADH1 y ADH2 de Saccharomyces cerevisiae o un enzima que presenta una actividad de 3-hidroxipropionaldehído reductasa obtenido mediante por lo menos una mutación de dicho enzima, mejorando dicha mutación la actividad y/o la afinidad de sustrato del enzima mutado para 3-HPA.
  14. 14. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la producción del PDO es aumentada.
  15. 15. Organismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que las actividades de 2,4- dihidroxibutirato deshidrogenasa, de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa y/o de 3-hidroxipropionaldehído reductasa y/o las actividades de enzimas que permiten la síntesis de DHB son aumentadas.
  16. 16. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es una bacteria, seleccionada preferentemente de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae, y Corynebacteriaceae, más preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens, o Lactococcus lactis, una levadura seleccionada preferentemente de entre Saccharomycetaceae, Pichiaceae, y Schizosaccharomycetaceae, más preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Pichia stipitis, o Pichia pastoris o un hongo seleccionado preferentemente de entre los géneros Penicillium, Aspergillus y más particularmente Aspergillus flavus, Chrysosporium o Trichoderma.
  17. 17. Microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la expresión de por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, isocitrato liasa, piruvato carboxilasa y permeasa simportadora de hexosa es aumentada, y/o por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre lactato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, acetato cinasa, fosfato acetiltransferasa, piruvato oxidasa, isocitrato liasa, fumarasa, 2- oxoglutarato deshidrogenasa, piruvato cinasa, enzima málico, fosfoglucosa isomerasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxicinasa, piruvato-formato liasa, semialdehído succínico desidrogenasa, fosfotransferasa que transporta azúcares, cetohidroxiglutarato aldolasa, homoserina-O-succinil transferasa, homoserina cinasa, diaminopimelato descarboxilasa y/o metilglioxal sintasa es reducida.
  18. 18. Microorganismo según la reivindicación 16 o 17 que es Escherichia coli que sobreexpresa por lo menos uno de los genes seleccionados de entre ppc, pck, aceA, galP, asd, thrA, metL, lysC, todos de E. coli; pycA de L. lactis, y/o que presenta por lo menos uno de los genes eliminados seleccionados de entre ldhA, adhE, ackA, pta, poxB, focA, pflB, sad, gabABC, sfcA, maeB, ppc, pykA, pykF, mgsA, sucAB, ptsI, ptsG, pgi, fumABC, aldA, lldD, iclR, metA, thrB, lysA, eda.
  19. 19. Procedimiento de producción de PDO que comprende las etapas de
    - poner en contacto el microorganismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 con un
    sustrato de carbono en un medio de cultivo apropiado,
    - recuperar el PDO a partir del medio de cultivo.
    5 20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que el PDO es purificado además.
  20. 21. Utilización según cualquiera de los enzimas que presentan una actividad de 2,4-dihidroxibutirato deshidrogenasa, de 2-oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa y de 3-hidroxipropionaldehído reductasa para transformar el DHB en PDO.
    10
  21. 22. Utilización según cualquiera de los enzimas que presentan una actividad de malato cinasa, de malato semialdehído deshidrogenasa, de malato semialdehído reductasa, de 2,4-dihidroxibutirato deshidrogenasa, de 2- oxo-4-hidroxibutirato descarboxilasa y de 3-hidroxipropionaldehído reductasa para transformar el malato en PDO.
    imagen1
    ADP
    cinasa
    OH •
    NADPH
    Malato
    HADP,
    semialdehido
    deshidrogenasa
    Malato
    NADPH
    semialdehido
    NADP
    reductasa
    MAD
    dihdiroxibutirato
    NADH
    deshidrogenasa
    2 -oxo-4-
    hidroxibutirato
    descarboxilasa
    NADPH
    1,3-propanodiol
    NADP
    deshidrogenasa
    Figura 1
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    Figura 3
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