ES2672894T3 - Cepa mutante para producir L-ornitina o L-arginina, y procedimiento de producción de la misma - Google Patents

Cepa mutante para producir L-ornitina o L-arginina, y procedimiento de producción de la misma Download PDF

Info

Publication number
ES2672894T3
ES2672894T3 ES10842313.8T ES10842313T ES2672894T3 ES 2672894 T3 ES2672894 T3 ES 2672894T3 ES 10842313 T ES10842313 T ES 10842313T ES 2672894 T3 ES2672894 T3 ES 2672894T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
arginine
ornithine
strain
corynebacterium
acetylornitinase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES10842313.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Jin-Man Cho
Hye-Won Kim
Ji-Hye Lee
Jae-Yong Cho
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
CJ CheilJedang Corp
Original Assignee
CJ CheilJedang Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by CJ CheilJedang Corp filed Critical CJ CheilJedang Corp
Application granted granted Critical
Publication of ES2672894T3 publication Critical patent/ES2672894T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/10—Citrulline; Arginine; Ornithine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01001—Amino-acid N-acetyltransferase (2.3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/01—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in linear amides (3.5.1)
    • C12Y305/01016—Acetylornithine deacetylase (3.5.1.16)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Un uso de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 que muestra ambas actividades de acetilglutamasa y acetilornitinasa para producir L-ornitina y L-arginina.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
DESCRIPCION
Cepa mutante para producir L-ornitina o L-arginina, y procedimiento de producción de la misma Campo técnico
La presente invención se refiere a una variante de Corynebacterium productora de L-ornitina y L-arginina y un procedimiento para la producción de L-ornitina y L-arginina. Más especialmente, la presente invención se refiere a un polinucléotido derivado de Corynebacterium glutamicum que codifica tanto acetilglutamato sintasa como acetilornitinasa que se involucran en la biosíntesis de ornitina o arginina, a un polipéptido codificado por el polinucléotido, a un vector recombinante que transporta el polinucléotido, a un transformante preparado mediante la introducción del vector recombinante en un organismo huésped que produce L-arginina, ya un procedimiento para producir L-ornitina o L-arginina mediante el cultivo del transformante.
Técnica anterior
Los L-aminoácidos se usan como ingredientes en los medicamentos para seres humanos y se aplican especialmente en la industria farmacéutica y la industria alimenticia y se usan, además, como nutrientes para animales. Entre los L-aminoácidos, la L-ornitina, uno de los productos en el ciclo de la arginina, se conoce como un componente medicinal que aumenta la función hepática (Salvatore et. al. 1964). La L-arginina se encuentra en abundancia como una forma libre en semillas de plantas y ajo y se usa como un complemento nutritivo en productos medicinales o alimenticios. Entre los ejemplos de las aplicaciones medicinales de la L-arginina se incluyen las sustancias antihepatotóxicas, potenciadores metabólicos cerebrales, terapéuticos para infertilidad masculina, y formulaciones de aminoácidos generales. Los representantes entre los alimentos en los que se aplica la L-arginina incluyen los aditivos de pasta de pescado, aditivos de bebidas saludables y alternativas de la sal para pacientes con hipertensión.
La fermentación se aplica cuando la bacteria corineforme (en especial, Corynebacterium glutamicum) se usa en la producción masiva de aminoácidos. Debido a la gran importancia de esta en lo referido a la industria, el procedimiento de producción bacterial de aminoácidos se mejora continuamente. Las mejoras metodológicas se han alcanzado con respecto a, por ejemplo, agitación, introducción de oxígeno, y el mantenimiento de la concentración de azúcar durante la fermentación.
Con el fin de aumentar la productividad microbiana de los aminoácidos, la selección de microbios adecuados resulta muy importante. Se pueden seleccionar los L-aminoácidos productores de cepas que son resistentes a sustancias antimetabolito o auxotróficas para metabolitos responsables de la regulación de aminoácidos. Por ejemplo, variantes de Brevibacterium o Corynebacterium spp. que producen glutamato se usan para producir ornitina (EP 0 393 708 A3). Además, variantes de Brevibacterium o Corynebacterium spp. productoras de glutamato se usan para producir, en forma directa, L-arginina a partir de fuentes de carbono y nitrógeno (Publicación de Patente Japonesa NOs. Sho. 57-163487, 60-83593 y 62-265988).
El documento EP 1 108 790 A2 divulga la SEQ ID NO 5168 en la página 124 y las reivindicaciones 16, 17, la cual se identifica en un 100 % con respecto a la SEQ ID No: 1 de la presente invención. Sin embargo, el documento EP 790 solo enseña que la SEQ. ID NO 5186 tiene actividad de puromicina N-acetiltransferasa.
El documento WO 2007/113127 divulga una secuencia que se identifica en un 100 % en una superposición en común con la SEQ ID No: 1 de la presente invención. Sin embargo, el documento WO 127 solo enseña que dicha proteína respectiva tiene actividad de acetiltransferasa.
La entrada Q8NQB1 de UNIPROT se refiere a la secuencia YP_225811 que se identifica en un 100 % en una superposición en común con la SEQ ID No: 1 de la presente invención. En dicha entrada, la funcionalidad se describe como N-acetiltransferasa.
La tecnología de ADN recombinante constituye también una herramienta útil mediante la cual las cepas corineformes productoras de L-aminoácidos pueden modificarse genéticamente para potenciar las funciones que se asocian con la producción de L-aminoácidos. Por ejemplo, argCJBD, un gen para biosíntesis de ornitina, puede introducirse en y sobreexpresarse en una cepa que resulta incapaz de sintetizar arginina y prolina (Hwang et al., 2008). Además, una cepa puede ser recombinada genéticamente para inactivar argR, un gen represor de la expresión del operón de biosíntesis de la arginina (Publicación de Solicitud de Patente U.S. No. 2002/0045223A1).
Un aumento en la productividad de aminoácido puede lograrse mediante el refuerzo de la biosíntesis de genes de interés. Un informe muestra que el rendimiento de la producción de aminoácidos puede mejorarse al aumentar la expresión de genes de biosíntesis. Por ejemplo, la sobreexpresión del gen de biosíntesis de arginina argF conduce a una producción en aumento de arginina (Solicitud de Patente Coreana No. 10-2004-107215).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
De manera adicional, se divulga un procedimiento para producir L-arginina en el que el gen argD2 (Ncgl2355) o (Ncgl0990), un gen putativo de acetilornitina aminotransferasa que se involucra en la biosíntesis de arginina de Corynebacterium glutamicum, se sobreexpresa para producir L-arginina de alto rendimiento (Patentes Coreanas Nos. 0830289 and 0830290).
De manera similar, las cepas microbianas capaces de producir ornitina o arginina de alto rendimiento pueden resultar a partir del refuerzo de genes de biosíntesis, en especial genes de las enzimas de biosíntesis acetilglutamato sintasa y acetilornitinasa.
Sin embargo, la acetilglutamato sintasa no se ha encontrado en ninguna del Corynebacterium spp, según se conoce hasta ahora. En esta invención, la presente invención examinó un gen que codifica una enzima responsable de la función de acetilglutamato sintasa. Se informó que el polipéptido del gen tiene una actividad similar a la de la acetilornitinasa que se codifica mediante argJ. Además, se encontró un aumento de la actividad del gen para aumentar la concentración de ornitina o arginina. En base a estos resultados de investigación, se logró la presente invención.
Divulgación
Problema técnico
Por lo tanto, un objeto de la presente invención se refiere a la provisión de un polinucleótido derivado de Corynebacterium nuevo para codificar un polipéptido que tiene actividad de acetilglutamato sintasa o de acetilornitinasa, o el polipéptido que se codifica de ese modo.
Otro objeto de la presente invención se refiere a la provisión de una cepa en la que el gen se sobreexpresa y que ha aumentado la productividad para la ornitina o arginina.
Otro objeto adicional de la presente invención se refiere a la provisión de un procedimiento para producir ornitina o arginina en altas concentraciones usando la cepa.
Solución técnica
De acuerdo con un aspecto de esta, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido derivado de Corynebacterium glutamicum que muestra actividad de acetilglutamato sintasa y actividad de acetilornitinasa para producir L-ornitina y L-arginina.
En la presente invención, el gen Ncgl1469, cuya secuencia se encuentra disponible de manera pública mediante la base de datos del “National Institute of Health”, se encontró para codificar tanto acetilglutamato sintasa como acetilornitinasa. En Corynebacterium spp., el gen que codifica acetilglutamato no ha sido determinado todavía mientras que se informó que la acetilornitinasa se codificaba a partir del argJ (Sakayan et al., 1996). Ningún documento anterior con respecto a la presente invención divulgó que el gen Ncgl1469 codifica las dos enzimas. Sus secuencias de aminoácidos y nucleótidos se proporcionan como SEQ ID NOS. 1 y 2, respectivamente.
De acuerdo con otro aspecto de esta, la presente invención proporciona el uso de un vector que transporta un gen que codifica tanto la actividad de acetilglutamato sintasa como la actividad de acetilornitinasa para producir L-ornitina y L-arginina. El vector contiene un gen de acetilglutamato sintasa y de acetilornitinasa. Entre los ejemplos de los plásmidos útiles como el vector de la presente invención, se incluyen pZ1 (Menkel et al), pEkEx1 (Eikmarms et al), pHS2-1 (Sonnen et al), pCG4 ( Patente U.S. N°. 4,489,190), pNG2 (Serwold-Davis et al) o pEKO (Eikmanns et al), con preferencia por pEKO. Más preferiblemente, el vector contiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 o la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 2 y se muestra en la Fig. 1.
De acuerdo con un aspecto adicional de esta, la presente invención proporciona el uso de un microorganismo, o una célula transformante o recombinante que se enriquece en la actividad de acetilglutamato sintasa y de acetilornitinasa para producir L-ornitina y L-arginina. En este contexto, la cepa puede ser una que ya resulta capaz de producir L- ornitina o L-arginina antes del refuerzo de acetilglutamato sintasa y acetilornitinasa. El transformante puede prepararse fácilmente por aquellos capacitados en la técnica de acuerdo con cualquier procedimiento de transformación conocido. Según se usa en el presente documento, el término “transformación” se refiere a la modificación genética de una célula que resulta de la toma, incorporación, replicación y expresión de ADN exógeno.
Entre los procedimientos normales de transformación figuran la precipitación de CaCh, el procedimiento Hanahan usando DMSO (dimetilsulfóxido) como un agente reductor tomado como base la precipitación de CaCh, electroporación, precipitación de fosfato de calcio, fusión de plasma, transformación mediada por fibra de carburo de silicio, transformación mediada por agrobacteria, transformación mediada por PEG, el procedimiento de sulfato de dextrano, un procedimiento de lipofectamina, una transformación mediada por secado/supresión.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
En la presente invención, por ejemplo, el vector recombinante pEK-Ptrc::1469 se introdujo en un microorganismo huésped mediante electroporación para producir un transformante que se aisló luego usando resistencia por antibiótico.
La expresión “potenciado con respecto a la actividad inherente” significa la superioridad de la actividad intracelular de las enzimas acetilglutamato sintasa y acetilornitinasa que se introducen con respecto a la actividad inherente. El refuerzo de actividad enzimática puede lograrse mediante el aumento de copias del gen de interés. El número de copias del gen puede aumentarse mediante el uso de un vector tal como un plásmido, o mediante la integración de un gen adicional en el cromosoma. El refuerzo de un elemento de regulación que tiene un efecto positivo en la expresión del gen puede ser una manera de aumentar el número de copias de genes. El elemento de regulación puede potenciar la actividad del gen en la etapa de transcripción, y puede usarse especialmente para el refuerzo de una señal de transcripción. De manera alternativa, el refuerzo puede lograrse en la etapa de traducción, por ejemplo, aumentando la estabilidad del ARNm. Se puede usar un gen de interés que tiene alta actividad. La sobreexpresión de un gen de interés puede resultar a partir de una modificación en la composición del medio. La actividad del gen puede aumentarse al potenciar el promotor para ello o al usar un promotor más potente. Un ejemplo de un promotor más potente que resulta útil en la presente invención es un promotor Tac (Amann et al). La actividad inherente de un gen puede reforzarse por mutación. La mutación puede inducirse mediante un procedimiento convencional usando luz UV o químicos mutagénicos o mediante un procedimiento de manipulación genética basado en la supresión, inserción y sustitución de residuos nucleótidos. Las medidas que se menciona anteriormente pueden combinarse para potenciar la actividad de las enzimas.
De las bacterias corineformes, Corynebacterium o Brevibacterium spp., se pueden usar en la presente invención. Entre los ejemplos de las cepas de partida adecuadas para la preparación de las variantes de Corynebacterium glutamicum transformada se incluyen las siguientes cepas de tipo silvestre: Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium thermoaminogenaes FERM BP-1539, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Brevibacterium divaricatum ATCC14020, y variantes de estas que sobreexpresan L- ornitina que carecen de enzimas involucradas en la ruta de biosíntesis de la ornitina, tales como ornitina carbamoyltransferasa, represor de arginina, y glutamato quinasa, y variantes de estas que sobreexpresan L-arginasa que carecen de un represor de arginina involucrado en la biosíntesis de arginina.
De acuerdo con un aspecto adicional de esta, la presente invención proporciona un procedimiento para producir L- ornitina o L-arginina mediante el cultivo de un microorganismo transformado de la presente invención. Para cultivar el microorganismo, deben emplearse medios adecuados y otras condiciones de cultivo bien conocidas en el arte. Aquellos capacitados en la técnica pueden seleccionar fácilmente o modificar de manera adecuada las condiciones de cultivo en base a los microorganismos. Se pueden cultivar de una manera adecuada, por ejemplo, los ejemplos que incluyen, pero sin limitación, cultivo discontinuo, cultivo continuo y cultivo alimentado. Estos procedimientos diversos de cultivo pueden encontrarse en, por ejemplo, "Biochemical Engineering" (James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, pp138-176, 1991). El cultivo puede controlarse en cuanto al pH mediante el agregado de un controlador de pH, tales como hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, amoníaco, ácido fosfórico y ácido sulfúrico. Durante el crecimiento de los microorganismos, se puede usar un agente antiespumante tal como un éster poliglicólico de ácido graso con el fin de impedir la formación de espuma. Para mantener el cultivo en una condición aeróbica, el medio puede airearse mediante la introducción de oxígeno o gas contenedor de oxígeno (por ejemplo, aire). El medio de cultivo puede mantenerse a una temperatura de 20 °C a 45 °C y preferiblemente, a una temperatura de 25 °C a 40 °C. En cuanto al período de cultivo, puede extenderse de manera tal que se alcanza un nivel conveniente de metionina L-arginina y puede encontrarse en el orden de 10 a 160 hrs. En la medida que se conoce en el arte, se puede usar cualquier procedimiento normal para aislar L-ornitina o L-arginina a partir del cultivo. Entre los ejemplos de procedimientos de aislamiento se incluyen centrifugación, filtración, cromatografía de intercambio iónico y cristalización. Por ejemplo, luego de la centrifugación a baja velocidad para retirar biomasa, el sobrenadante resultante se somete a cromatografía de intercambio iónico para purificar los aminoácidos de interés.
Efectos ventajosos
La presente invención, según se describe anteriormente, proporciona el uso de un polinucleótido derivado de Corynebacterium glutamicum que codifica tanto acetilglutamato sintasa como acetilornitinasa para biosíntesis de ornitina o arginina, el uso respectivo de un polipéptido codificado por el polinucleótido, el uso respectivo de un vector recombinante que transporta el polinucleótido, y el uso respectivo de un transformante que se prepara mediante la introducción del vector recombinante en un microorganismo huésped que produce L-arginina, y un procedimiento para producir L-ornitina o L-arginina mediante el cultivo del transformante. Al mostrar mayor actividad de acetilglutamato sintasa y de acetilornitinasa con respecto a la actividad inherente, el transformante es capaz de producir L-ornitina o L-arginina y resulta tener, de este modo, una aplicación útil en la industria biomédica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Descripción de los dibujos
La Figura 1 es un mapa genético que muestra la estructura del vector pEK-Ptrc::Ncgl1469 de acuerdo con la presente invención.
Modo de invención
Se puede lograr una mejor comprensión de la presente invención a partir de los siguientes ejemplos que se establecen para ilustrar, pero que no se deben interpretar como limitantes de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1: Clonado de Ncgl1469
Se realizó PCR usando los oligonucleótidos de SEQ ID NOS. 3 y 4 como cebadores, con pTrc99A (Amann et al. 1988) que sirvió como modelo, para amplificar un promotor trc útil para la preparación de un vector de sobreexpresión. Por separado, un terminador rrnB se amplificó mediante PCR usando los oligonucleótidos de SEQ ID NOS. 5 y 6, con pTrc99A que sirvió como modelo. El PCR se realizó en presencia de ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra™ (stratagene), con 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, renaturalización a 55 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 1 minuto. La secuencia de nucleótidos de NCgl1469 se obtuvo a partir de la base de datos del NIH GenBank. Sobre la base de la secuencia, se designaron un par de cebadores (SEQ ID NOS. 7 y 8). Usando los cebadores sintéticos, se realizó el PCR en el ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC13032, con 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, renaturalización a 55 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 1,5 minutos.
El vector pEKO (vector transportador de E.coli-C.glutamicum, Eikmanns et al.1991) se trató con Xbal. Por separado, el promotor ptrc y el 1469 ORF, ambos amplificados anteriormente, fueron digeridos con XbaI, NdeI / NedI, Xba1, respectivamente y luego ligados al vector digerido para producir un vector recombinante. Este fue doblemente digerido con HincII y EcoRI mientras que la fracción del terminador rrnB amplificada se trató con SmaI/EcoRI, seguido de ligación para producir un vector recombinante en el que una fracción promotor - 1469 ORF - terminador fue insertada.
Ejemplo 2: Sobreexpresión de Ncgl1469
Para examinar la actividad del gen Ncgl1469 clonado en el Ejemplo 1, se necesita, en primer lugar, una mutación de Corynebacterium glutamicum ATCC13032 en la que se interrumpe argJ. En este contexto, el vector de integración pK18mobsacB (Schafer et al. 1994) se empleó para producir una cepa de argJ interrumpido. Usando dos pares de cebadores (SeQ ID NOS. 7 y 8; 9 y 10), se realizó PCR en el ADN genómico de AtCc13032, con 25 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 segundos, renaturalización a 55 °C durante 30 segundos, y extensión a 68 °C durante 1,5 minutos. Los dos productos PCR que se obtuvieron de ese modo se trataron con XbaI/ApaI, y ApaI/XbaI, respectivamente, mientras que el vector pK18mobsacB fue digerido con XbaI. Estos tres digeridos resultantes se ligaron entre sí para producir un vector recombinante.
Mediante electroporación, el vector recombinante se transformó en la cepa ATCC13032 que luego se desarrolló en agar que contenía kanamicina a una concentración de 25 mg/l para discriminar cepas en las que se insertó el gen en el cromosoma a través de recombinación homóloga. La cepa insertada en el cromosoma primario se cultivó en una medio nutritivo con agitación (30 °C, 4 hrs.), seguido del despliegue de la cepa en placas de agar que contenían sucrosa en una concentración diluida diez veces desde 10"4 a 10. La mayoría de las bacterias murieron mientras que una pequeña porción apareció en forma de colonias. La cepa que formó colonias se seleccionó como una cepa conveniente en la que la secuencia del vector insertado en el cromosoma se retiró mediante entrecruzamiento secundario. La cepa se seleccionó finalmente luego de examinarse con respecto a la sensibilidad a la kanamicina y su estructura génica se identificó mediante PCR usando los cebadores de SEQ ID NOS. 7 y 10.
Ejemplo 3: Medición de Ncgl1469 para actividad de acetilglutamato sintasa y acetilornitinasa
La cepa finalmente seleccionada en el Ejemplo 2 se cultivó en un caldo. Luego de cosecharse mediante centrifugación, la masa de células se lavó dos veces con 100 mM de regulador Tris/Hcl (pH 7,5) y se sometió a lisis con perlas de vidrio para remover las membranas.
De acuerdo con un procedimiento conocido (Errey and Blanchard, 2005), la actividad del acetilglutamato se determinó mediante la medición del nivel de absorbancia del 5-tio-2-nitrobanzonato a 412 nm. Además, la actividad de la acetilornitinasa se determinó de acuerdo con un procedimiento conocido (Vogel and Mcleelan, 1970).
Las cepas obtenidas mediante la introducción del vector pEKO y del vector pEK-Ptrc::1469 en la cepa ATCC13032, argJA fueron inducidas para sobreexpresar el gen de interés, y los resultados se resumen en la Tabla 1, dada a continuación
5
10
15
20
25
30
Tabla 1
Cepa
Plásmido Actividad específica (unidades/mg de proteína)*
Acetilglutamato sintasaa Acetilornitinasas eb
C. glutamicum argJ
pEKO 0,03 ND
pEK-Ptrc::1469 0,17 0,07
* Cuando la cepa que se creó para carecer de argJ, un gen que se conoce porque codifica acetilornitinasa, se indujo para sobreexpresar Ncgl1469, las actividades de tanto la acetilglutamato como de la acetilornitinasa aumentaron, lo que condujo a la conclusión de que el Ncgl1469 codifica ambas enzimas.
Ejemplo 4: Producción de ornitina de cepa SJ8074-pEK-Ptrc::1469
Para examinar la productividad de ornitina de la cepa en la que el gen Ncgl1469 fue sobreexpresado, se empleó la cepa productora de ornitina (argF-argR-proBA, Hwang et al. 2008) como una cepa madre.
Las cepas fueron cultivadas en un medio que contenía 0,8 g/l de KH2PO4, 10 g/l de (NH^SO4, 1 g/l de MgSO4-7H2O, 1,2 g/l de Na2HPO4, 2 mg/l MnSO4H2O, 10 mg/l ZnSO4-7H2O, 10 g de extracto de levadura, 20g/l de CaCO3, 60 g/l de glucosa y 10 Mm de IPTG en matraces con deflectores de 250 mL, con agitación. Los niveles de ornitina en el medio se resumieron en la Tabla 2, dada a continuación.
Tabla 2
Cepa
Plásmido Concentración de L-ornitina (Mg/l)a
Glutamato (0 mM) Glutamato (50 mM)
C. glutamicum SJ8074
pEKO 137,57 145,27
pEK-Ptrc::1469 178,81 207,84
a. Cuando Ncgl1469 fue sobreexpresado en la cepa productora de ornitina, SJ8074, el nivel de producción de ornitina aumentó en aproximadamente el 20 % o más.
El transformante preparado mediante la introducción del vector recombinante pEK-Ptrc::Ncgl1469 en C. glutamicum SJ8074 se denominó Corynebacterium glutamicum CA06-0020 y se depositó el 23 de dic., 2009 en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (en adelante denominado “KCCM”) con el número de acceso KCCM 11057P.
Ejemplo 5: Producción de arginina de la cepa ATCC21831, argRA - pEK-Ptrc::1469
Para examinar la productividad de organina de la cepa de sobreexpresión de TL2, la cepa productora de arginina ATCC21831 se modificó para carecer del represor de arginina argR, y la cepa modificada se usó como una cepa madre.
Las cepas fueron cultivadas en un medio que contenía 0,8 g/l de KH2PO4, 10 g/l de (NH4)2SO4, 1 g/l de MgSO4-7H2O, 1,2 g/l de Na2HPO4, 2 mg/l MnSO4H2O, 10 mg/l ZnSO4-7H2O, 10 g de extracto de levadura, 20g/l de CaCO3, 60 g/l de glucosa en matraces con deflectores de 250 mL, con agitación. Los niveles de arginina en el medio se resumieron en la Tabla 3, dada a continuación.
Tabla 3
Cepa
Plásmido Concentración de L-arginina (Mg/l)a
IPTG (0 mM) IPTG (50 mM)
ATCC21831 argRA
pEKO 1,42 1,39
pEK-Ptrc::1469 1,39 1,56
a. Cuando Ncgl1469 fue sobreexpresado en la cepa productora de arginina ATCC21831 argRA, el nivel de producción de arginina aumentó en aproximadamente el 10 %.
5
10
15
20
25
30
35
40
El transformante preparado mediante la introducción del vector recombinante pEK-Ptrc::Ncgl1469 en ATCC21831 argRA se denominó Corynebacterium glutamicum CA06-0021 y se depositó el 23 de dic., 2009 en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (en adelante denominado “KCCM”) con el número de acceso KCCM 11058P.
A pesar de que las realizaciones preferidas de la presente invención se han divulgado con fines ilustrativos, aquellos capacitados en la técnica apreciarán que son posibles diversas modificaciones, adiciones y sustituciones, sin abandonar el alcance y el espíritu de la invención según se divulga en las reivindicaciones adjuntas.
Aplicación industrial
Según se describe hasta ahora, la presente invención proporciona a el uso de un polinucleótido derivado de Corynebacterium glutamicum que codifica tanto acetilglutamato sintasa como acetilornitinasa para biosíntesis de ornitina y arginina, el uso respectivo de un polipéptido codificado por el polinucleótido, el uso respectivo de un vector recombinante que transporta el polinucleótido, el uso respectivo de un transformante que se prepara mediante la introducción del vector recombinante en un microorganismo huésped que produce L-arginina, y un procedimiento para producir L-ornitina o L-arginina mediante el cultivo del transformante. Al mostrar mayor actividad de acetilglutamato sintasa y de acetilornitinasa con respecto a la actividad inherente, el transformante es capaz de producir L-ornitina o L-arginina y resulta tener, de este modo, una aplicación útil en la industria biomédica.
<110> CJ JEILJEDANG CO., LTD.
<120> Variedad de Corynebacterium glutamicum que produce L-ornitina o L-arginina y procedimiento para producción de esta
<160> 10
<170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 203 <212> PRT
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 1
Met
Ser Pro Thr Val Leu Pro Ala Thr Gln Ala Asp Phe Pro Lys lie
1
5 10 15
val
Asp Val Leu val Glu Ala Phe Ala Asn Asp Pro Ala Phe Leu Arg
20 25 30
Trp
lie Pro Gln Pro Asp Pro Gly Ser Ala Lys Leu Arg Ala Leu Phe
55 40 45
Glu
Leu Gln ríe Glu Lyú Glrt Tyr Ala Val Ala Gly Asrt He Aap val
50 55 60
Ala
Arg Asp Ser Glu Gly Glu lie val Gly val Ala Leu Trp Asp Arg
65
70 75 80
PEO
Asp Gly Asn HÍS Ser Ala LyS Asp Gln Ala Ala Met Leu Pro Arg
85 90 95
Leu
Val Ser He Phe Gly lie LyS Ala Al» Gln Val Ala Trp Thr Aap
LOO IOS 110
Leu
ser Ser Ala Arg Phe H19 Pro Lys Phe Pro HÍS Trp Tyr Leu Tyr
115 120 125
5
10
15
20
25
30
Thr
V*1 130 Ala Thr Ser Ser- Ser 135 Ala Arg Gly Thr Gly 140 Val Gly Ser Ala
Leu 145
Leu Asn HiS Gly lie 150 Ala Arg Ala Gly ASp 155 Glu Ala lie Tyr Leu 160
Glu
Ala Thr Ser Thr 165 Arg Ala Ala Gln Leu 170 Tyr Asn Arg Leu Gly 175 Phe
val
Pro Leu Gly 180 Tyr He Pro Ser Asp 185 Asp Aep Gly rhr Pro 150 Glu Leu
Ala
Met Trp 155 Lys Pro Pro Ala Met 200 Pro Thr Val
<210>2 <211> 612 <212>ADN
<213> Corynebacterium glutamicum <400>2
atgagtccca
ccgttttgcc tgctacacaa gctgacttcc ctaagatcgt cgatgttctg 60
gttgaagcat
tcgecaaega tccagcattt ttacgatgga teecgeagce ggaccceggt 120
tcagoaaaqc
ttcgagcact tttcgaactg cagatfcgaga agoagtatga agtggcggga 130
aatattgatg
t cgcgcgtga ttctgaggga gaaatCgtcg gcgtcgcgtt atgggatcgg 240
ccaqatggta
atcacagtgc caaagatcaa gcagcgatgc -t cccccggct cgtctccatt 300
ttcgggatca
aggctgcgca ggtggcgtgg acggat-ttga gt-t-cggctcg tttccaccoc 360
aaattccccc
at11 ggt acct ctacaccgtg gcaacatcta gttCtgcccg tggaacgggt -■.20
gt t gigcagtg
cgcttCttaa tcacggaatc gctcgcgogg gtgatgaagc tatctatttg 480
gaggcgacgt
cgactcgtgc ggctoaacta tataaccgtc tgggatttgt gcccttgggt 540
tatatceoct
cagatgatga tggcact cet gaactggcga tg-tggaaace gceagcgatg 600
ccaactgttt
aa 612
<210>3 <211> 29 <212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 3
ctagtctaga tcatcaccga aacgcgcga 29
<210>4 <211> 34 <212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
<400> 4
ggaattccat atgtctgttt cctgtgtgaa attg 34
<210>5 <211> 31 <212>ADN
<213> Corynebacteríum glutamicum <400> 5
cccccggggc tgttttggcg gatgagagaa g 31
<210> 6 <211> 32 <212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 6
cggaattcaa aaggccatcc gtcaggatgg cc 32
<210>7
<211> 28 <212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 7
ctagtctaga tccagttcag gaagcacc 28
<210> 8 <211> 27 <212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 8
nnngggcccg tgtttgctgg ttagggc 27
<210>9 <211> 27 <212> ADN
<213> Corynebacteríum glutamicum <400> 9
nnngggccca tgaactcaac gatgcgg 27
<210> 10 <211> 29 <212> ADN
<213> Corynebacterium glutamicum <400> 10
ctagtctaga cgagcaagtc gatgtagac 29

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Un uso de un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 que muestra ambas actividades de acetilglutamasa y acetilornitinasa para producir L-ornitina y L-arginina.
  2. 2. Un uso de un polinucleótido de SEQ ID NO. 2 que codifica el polinucleótido de la reivindicación 1 que muestra ambas actividades de acetilglutamasa y de acetilornitinasa para transformar una cepa de Corynebacterium sp. Para producir niveles potenciados de L-ornitina o L-arginina.
  3. 3. Un uso de una vector recombinante que contiene el polinucleótido de la reivindicación 2 para generar una cepa transgénica de Corynebacterium sp. para potenciar las actividades de acetilglutamato sintasa y de acetilornitinasa con respecto a la actividad inherente para producir L-ornitina o L-arginina.
  4. 4. Un uso de una cepa de Corynebacterium sp. que se transforma con y comprende un vector recombinante que comprende el polinucleótido de SEQ ID N°2 para aumentar la expresión del polinucleótido de la reivindicación 2 para potenciar las actividades de acetilglutamato sintasa y acetilornitinasa con respecto a la actividad inherente para producir L-ornitina o L-arginina.
  5. 5. El uso de la cepa de Corynebacterium sp de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la cepa de Corynebacterium sp. es Corynebacterium glutamicum.
  6. 6. Un procedimiento de producción de L-ornitina o L-arginina, que comprende el cultivo de la cepa transgénica Corynebacterium sp. de acuerdo con la reivindicación 4 o 5 en un medio; y el recupero de L-ornitina o L-arginina a partir de la cepa y del medio.
ES10842313.8T 2010-01-06 2010-12-29 Cepa mutante para producir L-ornitina o L-arginina, y procedimiento de producción de la misma Active ES2672894T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR20100000726 2010-01-06
KR1020100000726A KR101174267B1 (ko) 2010-01-06 2010-01-06 Ｌ-오르니틴 또는 ｌ-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
PCT/KR2010/009521 WO2011083933A2 (ko) 2010-01-06 2010-12-29 Ｌ-오르니틴 또는 ｌ-아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2672894T3 true ES2672894T3 (es) 2018-06-18

Family

ID=44305914

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES10842313.8T Active ES2672894T3 (es) 2010-01-06 2010-12-29 Cepa mutante para producir L-ornitina o L-arginina, y procedimiento de producción de la misma

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8883460B2 (es)
EP (1) EP2522720B1 (es)
JP (1) JP5732469B2 (es)
KR (1) KR101174267B1 (es)
CN (1) CN102712910B (es)
BR (1) BR112012016535B1 (es)
ES (1) ES2672894T3 (es)
WO (1) WO2011083933A2 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112014017091A2 (pt) 2012-01-11 2020-10-27 Cj Cheiljedang Corporation microorganismos recombinantes com uma melhor produtividade de putrescina e método de produção de putrescina que utiliza os mesmos
KR101481782B1 (ko) * 2012-12-28 2015-01-13 대상 주식회사 Gogat의 불활성화에 의한 아미노산 고생산능 변이 균주
KR101735935B1 (ko) * 2015-07-20 2017-05-16 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
KR102734703B1 (ko) * 2021-10-15 2024-11-26 씨제이제일제당 주식회사 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법
CN114990039B (zh) * 2022-06-01 2023-07-04 南京工业大学 一种利用半乳糖原料合成l-鸟氨酸的重组谷氨酸棒杆菌及其应用

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57163487A (en) 1981-04-02 1982-10-07 Ajinomoto Co Inc Production of l-arginine through fermentation process
JPS6083593A (ja) 1983-10-12 1985-05-11 Ajinomoto Co Inc 発酵法によるｌ−アルギニンの製造法
JPH0630596B2 (ja) 1986-05-14 1994-04-27 協和醗酵工業株式会社 発酵法によるｌ−アルギニンの製造法
JP2817185B2 (ja) 1989-04-20 1998-10-27 味の素株式会社 発酵法によるｌ―オルニチンの製造法
DE4440118C1 (de) * 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
US7160705B2 (en) 2000-04-28 2007-01-09 Ajinomoto Co., Inc. Arginine repressor deficient strain of coryneform bacterium and method for producing L-arginine
EP1201758B1 (en) * 2000-10-27 2008-04-09 Ajinomoto Co., Inc. Microorganisms and method for L-arginine production by fermentation
KR20040107215A (ko) 2003-06-13 2004-12-20 주식회사 하이닉스반도체 표면 리세스를 갖는 스토리지 노드 전극를 구비한 반도체메모리 소자 및 그 제조방법
US8497098B2 (en) * 2004-07-15 2013-07-30 Dsm Ip Assets B.V. Biochemical synthesis of 1,4-butanediamine
KR100620092B1 (ko) 2004-12-16 2006-09-08 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 세포로부터 유래된 신규한 프로모터서열, 그를 포함하는 발현 카세트 및 벡터, 상기 벡터를포함하는 숙주 세포 및 그를 이용하여 유전자를 발현하는방법
DE102005020538A1 (de) * 2005-05-03 2006-11-23 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
BRPI0709628A2 (pt) * 2006-03-30 2011-07-19 Basf Se processo para produção de cadaverina, e de uma poliamida, e, microrganismo recombinante
KR100830290B1 (ko) 2007-01-18 2008-05-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
KR100830289B1 (ko) 2007-01-18 2008-05-16 씨제이제일제당 (주) Ｌ－아르기닌 생산 변이주 및 이의 제조방법
WO2009131040A1 (ja) * 2008-04-25 2009-10-29 財団法人地球環境産業技術研究機構 イソプロパノール生産能を有するコリネ型細菌の形質転換体
KR101189622B1 (ko) 2008-06-25 2012-10-10 주식회사 엘지화학 안트라센계 에폭시 수지를 포함하는 이방 도전성 접착재료및 이를 이용하는 회로접속 구조체
CN101586130A (zh) * 2009-06-23 2009-11-25 广东肇庆星湖生物科技股份有限公司 一种l-精氨酸的制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011083933A2 (ko) 2011-07-14
EP2522720A4 (en) 2013-06-12
BR112012016535B1 (pt) 2021-10-26
US8883460B2 (en) 2014-11-11
US20130023016A1 (en) 2013-01-24
JP2013512687A (ja) 2013-04-18
KR101174267B1 (ko) 2012-08-14
CN102712910A (zh) 2012-10-03
BR112012016535A2 (pt) 2017-03-21
KR20110080475A (ko) 2011-07-13
EP2522720A2 (en) 2012-11-14
JP5732469B2 (ja) 2015-06-10
CN102712910B (zh) 2015-05-27
WO2011083933A3 (ko) 2011-11-10
EP2522720B1 (en) 2018-03-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7680454B2 (ja) グアニジノ酢酸の発酵生産方法
KR101186128B1 (ko) Ｌ-아미노산 생산 세균 및 ｌ-아미노산의 생산 방법
ES2369022T3 (es) Un microorganismo del género corynebacterium quie tiene una productividad aumentada de l-lisina y un método de producir l-lisina usando el mismo.
JP3106501B2 (ja) Ｌ−リジンの製造法
ES2654809T3 (es) Microorganismos de Corynebacterium que pueden utilizar xilosa y procedimiento de producción de L-lisina utilizando los mismos
TWI716841B (zh) 新穎啟動子及使用該啟動子製造l-胺基酸的方法
ES2796799T3 (es) Microorganismo capaz de producir l-aminoácido y método para producir L-aminoácido mediante el uso del mismo
RU2733426C1 (ru) Модифицированная гомосериндегидрогеназа и способ получения гомосерина или l-аминокислоты, имеющей происхождение от гомосерина, с использованием такой гомосериндегидрогеназы
ES2743422T3 (es) Promotor mejorado y un procedimiento de producción de L-lisina mediante el uso del mismo
BR112019021322A2 (pt) variante de glucoamilase, métodos para aumentar a atividade de hidrólise de amido em bruto de uma glucoamilase e para produzir uma variante de glucoamilase, composição, uso de uma variante de glucoamilase, processos para produzir um produto de fermentação e para produzir um produto de xarope, polinucleotídeo codificando a variante de glucoamilase, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, e, célula hospedeira
BR112019018036A2 (pt) variante de aspartoquinase inovadora e método para produzir l-aminoácido com o uso da mesma
BRPI0519410B1 (pt) método para produzir ácido l-glutâmico
ES2761590T3 (es) Microorganismo de Corynebacterium sp. que tiene una productividad mejorada de L-arginina y procedimiento de producción de L-arginina mediante el uso del mismo
ES2673582T3 (es) Método de generación de L-lisina por medio de bacterias fermentadoras que poseen un gen de aconitasa y/o un elemento regulador modificado
ES2364881T3 (es) Variedad de corynebacterium glutamicum que produce l-arginina y método para fabricar la misma.
EP2522720B1 (en) Mutant strain for producing l-ornithine or l-arginine, and method for producing same
CN101010423A (zh) 生产l－谷氨酸的微生物和生产l－谷氨酸的方法
ES2208178T3 (es) Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos y secuencias de nucleotidos que codifican el gen accda.
JP7475409B2 (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
KR101526047B1 (ko) 아미노트랜스퍼라제 활성 강화를 통하여 ｌ-오르니틴 생산능이 향상된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-오르니틴의 제조방법
JP7475408B2 (ja) Ｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリン生産能が向上したコリネバクテリウム属微生物およびこれを用いたｌ－アルギニンまたはｌ－シトルリンの生産方法
RU2838210C2 (ru) Вариант corynebacterium glutamicum, имеющий улучшенную способность к продукции l-лизина, и способ продуцирования l-лизина с его применением