ES2673443B1 - Procedimiento para la conservacion de muestras biologicas que utiliza klotz y producto obtenido con dicho procedimiento - Google Patents
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Description
PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ Y PRODUCTO OBTENIDO CON DICHO PROCEDIMIENTO
DESCRIPCION
Tal y como su nombre indica, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la conservacion de muestras biologicas y el producto que se obtiene y que se utiliza para tal conservacion.
La patente por tanto comprende el procedimiento para la conservacion de muestras biologicas y el producto obtenido con dicho procedimiento y que se utiliza para conservacion de tales muestras.
Lo que se persigue es la obtencion de un bloque semisolido de gran resistencia y transparencia que permite guardar en su interior muestras biologicas y que estas se conserven durante largos periodos de tiempo todo ello sin perjuicio de permitir el acceso a tales muestras, tanto acceso visual, como ffsico (a traves de punciones u otros medios y sistemas quirurgicos) o a traves de ultrasonidos, siendo de gran valor para su uso para el aprendizaje.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION
Existen diferentes tipos de fijacion en que se usan para procesar muestras biologicas. Se agrupan en metodos ffsicos (como la congelacion en Nitrogeno lfquido) o metodos qufmicos.
Dentro de los metodos qufmicos el fijador mas usado es el formol (formaldehido al 40%). Este compuesto es altamente cancerfgeno y su manejo tiene que realizarse con muchas precauciones, por lo que se estan buscando sustitutos para eliminar su uso. Ya existen en el mercado algunos sustitutos de formol como el Histofix® que no son tan peligrosos y ademas su olor no estan fuerte.
Tambien existen soluciones que llevan una pequena proporcion de formol como son la solucion Bouin y Klotz.
La solucion Bouin es util sobre todo para la realizacion de tecnicas inmunohistoqufmicas ya que produce una gran fijacion nuclear aunque tiene el inconveniente que destruye algunos componentes citoplasmaticos.
Por otro lado el Klotz es una solucion compuesta por Cloral hidrato, Sodio sulfato anhidro, Potasio Sulfato, Cloruro Sodio, Bicarbonato de sodio, Acido ascorbico, agua (la mayor parte de la solucion) y una pequena proporcion de formol (5% del total).
Para la fabricacion de 5 litros de Klotz el solicitante utiliza las siguientes cantidades de los siguientes elementos.
El Klotz tiene el beneficio que solo tiene una pequena proporcion de formol y permite que las muestras biologicas (organos, tejidos, etc...) tengan un aspecto macroscopico parecido al que tendrfan recien sacados del cadaver y su textura tambien serfa parecida por lo que es muy util para guardar vfsceras para repasos anatomicos y anatomopatologicos.
Para fijar las muestras con Klotz, hay que sumergirlas en la solucion un mfnimo 5 dfas, y una vez fijadas ya se pueden conservar sumergidas en la solucion, siempre que no se sequen, aunque hay que cambiar la solucion cada cierto tiempo.
Para evitar tener que cambiar la solucion, sea esta la que fuera, y evitar el desecado de las muestras biologicas, una posibilidad era gelificar el fijador de tal modo que tanto la muestra biologica como el fijador quedaran "atrapados" en un bloque semisolido y accesible visualmente, que permitiera la practica de punciones y otro tipo de pruebas asf como util para la utilizacion de ecografos y sistemas de ultrasonidos.
La utilizacion de gelatina, por sus caracterfsticas qufmicas y ffsicas se considero idonea. La gelatina en polvo se usa en la industria alimentaria para realizar comidas y postres, pero tambien se ha utilizado en ecograffa, con agua, para realizar fantomas, que son modelos para la practica de estudio ecografico. Los distintos fantomas utilizados hasta el momento emplean materiales que pretenden simular la apariencia de organos (aceitunas, macarrones) o vfsceras de matadero (pechugas de pollo, hfgados de cordero) que al no estar fijados no pueden mantenerse en el tiempo.
La utilizacion de gelatinas ya viene anticipada en algunos documentos tanto de patentes como de no patente.
A modo de ejemplo cabe citar el artfculo de JRV Pulvertaft, del Westmister School Hospital of Medicine de Londres "Museum Techniques, a review" (1950) que describe en la pag. 16 en la preparacion de especfmenes transparentes, el uso de composiciones que pueden incluir 5% de gelatina y 0,4% de formalina, siendo que en ese caso los especfmenes deben colocarse en el refrigerador para que la gelatina se solidifique. El documento WO0025580A1 hace referencia a un metodo que utiliza una solucion de conservacion de material biologico que se encuentra en forma de gel a temperaturas inferiores a 10 grados y presiones superiores a 79 atm, en donde la solucion comprende gelatina, preferiblemente en cantidades inferiores al 5%, ademas de cloruro sodico y azucares.
El documento GB1253340A describe un medio para la conservacion de tejidos y organos que comprende entre otros compuestos gelatina hidratada, miel y glicerina. Se vuelve lfquido a temperaturas superiores a 40°C.
Ninguno de los documentos citados resuelve como obtener una composicion semisolida y altamente transparente que se mantenga estable a temperatura ambiente (20-40°C) y que sea adecuada para la conservacion de muestras biologicas.
Algunas de las pruebas de gelificacion realizadas -y que abajo se resenan-, tampoco dieron como resultado un bloque semisolido, altamente transparente y estable a temperatura ambiente.
Asf por ejemplo, en la gelificacion con formol, la gelatina precipitaba al entrar en contacto con este por lo que resulta imposible formar un bloque compacto.
Por otro lado, en la gelificacion con Histofix®, el compuesto gelatinoso resultante era tambien muy resistente pero de color mas amarillento y, ademas, a temperaturas de 40° centfgrados se licua por lo que no ofrece la estabilidad deseada.
La invencion que se propone, supera los problemas expuestos al obtenerse un bloque semisolido de gran resistencia y transparencia que permite guardar en su interior las muestras biologicas conservadas durante largos periodos de tiempo y permite el acceso a tales muestras tanto visual, como ffsico (a traves de punciones u otros medios y sistemas quirurgicos) o a traves de ultrasonidos, siendo de gran valor para su uso para el aprendizaje.
DESCRIPCION DE LA INVENCION
Para facilitar la utilizacion de las vfsceras fijadas y para su uso en otras disciplinas como el diagnostico por imagen se plantea la utilizacion de un soporte gelatinoso y con propiedades conservantes.
Para ello se ha desarrollado un procedimiento para obtener un producto que comprende un soporte gelatinoso de gran transparencia y resistencia que contiene una parte de Klotz, en donde ese soporte es adecuado para conservar en su interior muestras biologicas durante largos periodos de tiempo, y en donde ese soporte permite el acceso visual y ffsico a las muestras de su interior asf como el paso de los ultrasonidos de los ecografos sin distorsiones por lo que resulta optimo para el aprendizaje.
El soporte comprende gelatina y Klotz (que a su vez comprende Cloral hidrato, Sodio sulfato anhidro, Potasio Sulfato, Cloruro Sodio, Bicarbonato de sodio, Acido ascorbico, agua (la mayor parte de la solucion) y una pequena proporcion de formol).
Las pruebas se han hecho con gelatina en polvo por lo que las explicaciones y correspondencias se hacen en base a este tipo de gelatina, no obstante no se descarta que pueda realizarse con otros tipos de gelatina, como la gelatina en laminas o la gelatina instantanea, debiendose buscar las equivalencias entre una forma de presentacion del producto y otra. A modo de ejemplo citamos que 10gr de gelatina en polvo equivalen a 6 laminas de gelatina en laminas, segun la informacion que obra en el portal www.gelatine.org de la Gelatine Manufacturers of Europe (GME).
El procedimiento para la conservacion de las muestras biologicas se inicia con la preparacion del compuesto que las contendra, al que llamaremos "producto" y que tambien es objeto de la presente patente.
Previamente es necesario tanto preparar el Klotz, preferiblemente conforme a la formula que se ha expuesto y que al estar ya divulgada no se reivindica, como procesar las muestras biologicas a conservar fijandolas y lavandolas para eliminar los restos de sangre.
El lavado de las muestras biologicas y especialmente la eliminacion de los restos de sangre, puede hacerse con agua pero preferiblemente debe hacerse con alcohol ya que aclara mas el tejido y elimina mejor la sangre.
Una vez hecho lo anterior se sigue el procedimiento objeto de esta patente y que comprende:
1.- Una primera fase de calentamiento de aproximadamente 1/3 del Klotz a utilizar. El calentamiento se realiza en agitacion en placa caliente, elevandose la temperatura de forma paulatina y lenta (aproximadamente 30 grados cada minuto) hasta que el Klotz alcanza una temperatura de entre 80° y 99°, preferiblemente de 90° centfgrados. Por encima de 100° centfgrados los reactivos se evaporarfan. El Klotz se mantiene a esa temperatura durante un periodo de tiempo de entre 5 y 10 minutos, preferiblemente 7 minutos.
2. - Una segunda fase, independiente de la primera, en la que se procede a disolver gelatina en los 2/3 restantes del Klotz a utilizar. La cantidad de gelatina que se disuelve es entre un 6% y un 8%, preferiblemente entre un 6,5% y un 7,5% de la cantidad final total de producto que se desea preparar. Si se disminuye la cantidad de gelatina la consistencia no serfa la deseada, y si aumenta practicamente no habrfa cambio, solo se volverfa mas turbio el medio y aumentarfa el coste.
3. - Una tercera fase en la que, antes de los tres minutos siguientes a la disolucion expuesta en la segunda fase, se procede a la mezcla del Klotz caliente de la primera fase con el compuesto de Klotz y gelatina de la segunda fase.
Si esta tercera fase se hace pasado los 3 minutos desde la fase 2, la gelatina puede precipitar y no formarse el soporte gelidificado de forma correcta.
Con estas tres primeras fases se obtiene el producto que se reivindica en la presente patente.
4. - Una cuarta fase en donde se vierte el producto en un molde con los organos que se quieran conservar en su interior, existiendo alternativas del procedimiento en funcion del uso que se le quiera dar a las muestras.
5. - En una quinta fase, el producto, con los organos en su interior, pasa a ser refrigerado. Como resultado de esta gelificacion se obtiene una gelatina practicamente trasparente, mas resistente de la normal ya que las protefnas de la gelatina se han fijado. Ademas esta gelatina permite el paso de los ultrasonidos de los ecografos sin practicamente la aparicion de ningun tipo de artefacto.
Algunas de las ventajas de este producto de conservacion es que:
- Permite conservar organos con muy poca cantidad de formol durante largos periodos de tiempo.
- Permite la conservacion y revision de lesiones menos frecuentes tanto a nivel macroscopico como ecografico.
- Permite la practica de punciones ecoguiadas, tanto a nivel docente como a nivel de clfnicos profesionales.
Como se ha expuesto, en funcion del tipo de uso que se le pretenda dar a las muestras biologicas puede haber alternativas en la ejecucion de la cuarta fase del procedimiento, asf por ejemplo:
Para crear medios idoneos para ecograffa lo mejor es crear en el molde un lecho de producto para evitar que los organos esten en contacto con el fondo del molde. Una vez hecha la base se colocan los organos encima, se fijan con agujas o con suturas y se rellena con producto antes de solidificar.
Para la preparacion de modelos para cistocentesis se pueden realizar modelos especfficos usando vejigas urinarias con sonda uretrales en su interior y una via aplicada a esta sonda, de forma que la vejiga urinaria se puede rellenar tantas veces como sea necesario.
Para ello deben seguirse los siguientes pasos:
- Fijar la vejiga en Klotz
- Meter una sonda urinaria por el cuello de la vejiga, cerrando el cuello alrededor de la sonda con una sutura no reabsorbible.
- Crear en el molde un lecho de producto y fijar la vejiga a esa base con sutura o agujas.
- Llenar la vejiga con fluido (agua u otro lfquido coloreado).
- Rellenar el molde con producto Klotz gelificado lfquido antes de solidificar y meter a refrigerar.
- Retirar las agujas.
DESCRIPCION DE UN MODO DE LLEVAR A CABO LA INVENCION
Tal y como ha quedado expuesto, el procedimiento para la conservacion de muestras biologicas tiene una fase previa de preparacion de uno de los componentes, el Klotz, que se prepara conforme a las siguientes cantidades y pesos.
Para la fabricacion de 5 litros de Klotz el solicitante utiliza las siguientes cantidades de los siguientes elementos.
Igualmente, las muestras biologicas, previamente a someterse al proceso de conservacion, deben procesarse lo cual comprende:
1. Fijarlas mediante la utilizacion de un tipo de fijacion, preferiblemente el Klotz si bien pueden usarse otros medios.
2. Lavarlas para eliminar los restos de sangre, operacion que normalmente se lleva a cabo con alcohol de 96° y deben ser eliminados los restos de sangre (se puede retirar con agua pero el alcohol aclara mas el tejido y elimina la sangre mejor).
El proceso propiamente dicho de conservacion de muestras biologicas que se reivindica se inicia con la preparacion del producto, y asf, para 150ml de producto se sigue el siguiente procedimiento:
1. - Una primera fase de calentamiento de 50ml de Klotz:
El calentamiento se realiza en agitacion en placa caliente, elevandose la temperatura a razon de 30° grados por minuto hasta que el Klotz alcanza una temperatura de 90° centfgrados, temperatura a la que se debe mantener durante 7 minutos.
2. - Una segunda fase, independiente de la anterior, en la que se procede a disolver 10gr de gelatina en polvo estandar en 100ml de Klotz.
3. - Menos de tres minutos despues de la fase anterior tiene lugar una tercera fase en la que se procede a la mezcla del Klotz a 90° centfgrados de la primera fase con el compuesto de Klotz y gelatina de la segunda fase.
Con estas tres primeras fases se obtiene el producto que tambien se reivindica en la presente patente.
Ese producto se caracteriza por que comprende Klotz (cloral hidrato, sodio sulfato anhidro, potasio sulfato, cloruro sodio, bicarbonato de sodio, acido ascorbico, agua, formol) y gelatina siendo el contenido de gelatina entre un 6% y un 8%, preferiblemente entre un 6,5% y un 7,5% del peso total del producto, y porque ademas se mantiene estable a temperatura entre 20° y 40°.
4. - Para la conservacion de las muestras biologicas, el procedimiento comprende una cuarta fase en la que el producto se vierte en un molde y los organos a conservar se depositan en dicho molde quedando recubiertos con el producto.
En funcion del uso que se pretenda de las muestras biologicas, los organos se depositaran de distintos modos que son alternativas del procedimiento de conservacion.
4.a. Para conservar los organos de manera que queden idoneos para ecograffa, el procedimiento comprende, dentro de la fase 4 las siguientes subfases:
Creacion en el molde de un lecho de producto para evitar que los organos esten en contacto con el fondo del recipiente.
Una vez hecha la base se colocan los organos sobre la misma y se fijan con agujas o con suturas.
Se procede a rellenar el molde con el producto hasta al menos cubrir la muestra para, posteriormente, retirar las agujas.
4.b. Para la conservacion de organos que sirvan de modelo para cistocentesis, de forma que la vejiga pueda pueda rellenarse tantas veces como sea neceario, el procedimiento comprende, dentro de su fase 4 las siguientes subfases:
- Meter una sonda urinaria por el cuello de la vejiga, cerrando el cuello alrededor de la sonda con una sutura no reabsorbible.
- Crear un lecho de producto en la base del molde y fijar la vejiga al lecho con sutura o agujas.
- Llenar la vejiga con fluido (agua u otro lfquido coloreado).
- Rellenar el molde con producto hasta al menos cubrir la muestra.
- Posteriormente se retiraran las agujas.
5.- Por ultimo, una quinta fase del procedimiento de conservacion de muestras biologicas, comprende el refrigerado (entre 7 y 14 grados) del producto con los organos en su interior.
Como resultado de esta gelificacion se obtiene una gelatina practicamente trasparente, mas resistente de la normal ya que las protefnas de la gelatina se han fijado. Ademas esta gelatina permite el paso de los ultrasonidos de los ecografos sin practicamente la aparicion de ningun tipo de artefacto.
Los organos que se meten dentro moldes pueden ser practicamente todos (probado con rinones, intestinos, hfgado vejiga urinaria, encefalos, pulmones y corazones). Estos organos deben ser fijados previamente, preferiblemente en Klotz como se describio anteriormente y ademas se deben lavar preferiblemente con alcohol 96° para eliminar restos de sangre.
Claims (13)
1. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ en donde las muestras se encuentran previamente fijadas y lavadas caracterizado por que comprende:
Una primera fase de calentado de 1/3 del Klotz a utilizar y en donde ese Klotz es calentado, durante un tiempo de entre 2 y 4 minutos, , hasta alcanzar una temperatura de entre 80° y 99°, manteniendose a esa temperatura durante un periodo de tiempo de entre 5 y nueve minutos.
Una segunda fase, independiente de la primera, en la que se procede a disolver gelatina en los 2/3 restantes del Klotz a utilizar. La cantidad de gelatina que se disuelve es entre un 6% y un 8%, de la cantidad final total de producto que se desea preparar.
Una tercera fase en la que, antes de los tres minutos siguientes a la disolucion expuesta en la segunda fase, se procede a la mezcla del Klotz caliente de la primera fase con el compuesto de Klotz y gelatina de la segunda fase.
2. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 1 caracterizado por que comprende ademas:
Una cuarta fase en al que se introducen en un molde el producto obtenido con el procedimiento expuesto en la reivindicacion 1 y las muestras biologicas a conservar. Una quinta fase en la que el resultado de la cuarta fase para a ser refrigerado a una temperatura de entre 7° y 14°.
3. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 2 caracterizado por que la introduccion del producto y las muestras a conservar en el molde se lleva a cabo conforme a las siguientes subfases:
Creacion en el molde de un lecho de producto.
Colocacion de las muestras a conservar sobre el lecho sujetandolas al mismo. Rellenado del molde con el producto al menos hasta cubrir las muestras a conservar.
Retirada de los medios de fijacion de las muestras al lecho.
4. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 2 caracterizado por que las muestras comprenden al menos una vejiga y por que la introduccion del producto y las muestras a conservar en el molde se lleva a cabo conforme a las siguientes subfases:
- Introduccion de una sonda por el cuello de la vejiga, cerrando el cuello alrededor de la sonda con una sutura no reabsorbible.
- Creacion en el molde de un lecho de producto.
- Sujecion de la vejiga al lecho.
- Llenado de la vejiga con fluido.
- Rellenado del molde con el producto al menos hasta cubrir las muestras a conservar.
- Retirada de los medios de sujecion de las muestras al lecho.
5. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 1 caracterizado por que el klotz se calienta en agitacion y gradualmente.
6. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 1 caracterizado por que la etapa de calentado del klotz hasta alcanzar su temperatura adecuada es de 3 minutos.
7. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 1 caracterizado por que la temperatura adecuada que debe alcanzar el klotz es de 90°.
8. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 1 caracterizado por que el tiempo que debe pemanecer el klotz a la temperatura adecuada es de 7 minutos.
9. - PROCEDIMIENTO PARA LA CONSERVACION DE MUESTRAS BIOLOGICAS QUE UTILIZA KLOTZ conforme reivindicacion 1 caracterizado por que la cantidad de gelatina que se disuelve es entre un 6,5% y un 7,5% de la cantidad final total de producto que se desea preparar.
10. - PRODUCTO OBTENIDO mediante el procedimiento descrito en la reivindicacion 1 caracterizado por que comprende Klotz (cloral hidrato, sodio sulfato anhidro, potasio sulfato, cloruro sodio, bicarbonato de sodio, acido ascorbico, agua, formol) y gelatina siendo la cantidad de gelatina entre un 6% y un 8%.
11. - PRODUCTO OBTENIDO conforme reivindicacion anterior caracterizado por que 5 litros de klotz comprenden
- Cloral hidrato 49,94g
- Sodio sulfato anhidro 79,93g
- Potasio Sulfato 1,26g
- Cloruro Sodio 1,47g
- Bicarbonato de sodio 3g
- Acido ascorbico 2,64g
- Agua 4900gr
Formol 24,97 ml
12. - PRODUCTO OBTENIDO conforme reivindicacion 10 caracterizado por que la cantidad de gelatina es entre un 6,5% y un 7,5% del peso total del producto obtenido.
13.- PRODUCTO OBTENIDO mediante el procedimiento descrito en la reivindicacion 1 caracterizado por que es semisolido a temperatura entre 20° y 40°.
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