ES2674518T3 - Discriminación de variantes de grupos sanguíneos - Google Patents
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Abstract
Un cebador de oligonucleotido de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), que comprende una secuencia de nucleotidos que es de formula: X-Y-Z en la que: X es X1 o X2, en donde: X1 son los n nucleotidos finales en la secuencia de nucleotidos ATATGGAAATTTGATCATGT (SEQ ID NO: 1), en donde n es un numero entre 2 y 20, incluidos; y X2 es una variante de X1 que difiere en no mas de una sustitucion de nucleotidos; Y es Y1 o Y2, en donde Y1 es la secuencia de nucleotidos AS1TAATS2ATAC (SEQ ID NO: 2), en la que S1 y S2 se seleccionan independientemente de G y C; y Y2 es una variante de Y1 que difiere de Y1 en no mas de una sustitucion de nucleotidos, con la condicion de que dicha sustitucion de nucleotidos no sea una sustitucion de la primera A o la C final de Y1; Z son los primeros m nucleotidos en la secuencia de nucleotidos TAAAG, en la que m es un numero entre 0 y 5, incluidos.
Description
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DESCRIPCION
Discriminación de variantes de grupos sanguíneos Campo de la invención
La invención se refiere a métodos para el genotipado y la determinación de antígenos de células sanguíneas, que en particular puede discriminar las variantes de los grupos sanguíneos RHD*r’s o tipo RHD*r’s, que codifican el antígeno C+W y no el antígeno D, de RH*DI-IIa, RHD*DIVa-2 y otras variantes de grupos sanguíneos. La invención también se refiere a productos, en particular sondas, cebadores y kits para su uso en dichos métodos.
Antecedentes de la invención
El éxito de la transfusión sanguínea normalmente depende del grado de compatibilidad entre el donante y el receptor. El grado de compatibilidad, a su vez, es una función de la similitud del contenido de antígenos de los eritrocitos (RBC, por sus siglas en inglés (Red Blood Cell)) entre el donante y el receptor. La expresión de muchos antígenos RBC en un individuo puede predecirse a partir del análisis de su ADN genómico. Por lo tanto, el análisis del ADN del donante y/o del receptor puede usarse para facilitar la coincidencia sanguínea y de esta manera permitir la práctica adecuada de la transfusión sanguínea
Las reacciones hemolíticas son más comunes en individuos con múltiples transfusiones que con transfusiones únicas, no solamente debido a la probabilidad aumentada de un evento tal como que el número de unidades trasfundidas aumenta, sino también debido a la naturaleza acumulativa de la respuesta inmune en el receptor. Un ejemplo de una afección cuyo tratamiento incluye transfusiones sanguíneas repetidas es la enfermedad de células falciformes (ECF). A partir de lo anterior sigue que un alto grado de compatibilidad con el donante es a menudo crítico para el éxito a largo plazo de la transfusión en pacientes con ECF.
Mientras que la ECF es más prevalente entre individuos con linaje africano, la población donante de sangre en los EE.UU. y otros países del oeste es ampliamente caucásica. Como consecuencia de esta disparidad, las diferencias en los antígenos RCB entre ambos grupos raciales a menudo se vuelve responsable de los fallos de transfusión en los pacientes con ECF.
La variante genética RHD*DIIIa-CE(4-7)-D, también conocida como RHD-CE-DS, RHD-CE(4-7)-D, (C)ceS o r'S, (en lo sucesivo RHD*r’S) puede encontrarse hasta el 5-10 % de la población afroamericana, pero es extremadamente rara en caucásicos. Esta variante posee un desafío especial para la transfusión sanguínea porque codifica un perfil antigénico bastante complejo, que incluye la ausencia de antígeno D, formas alteradas de los antígenos C (C+W) y e, expresión del antígeno VS de baja frecuencia, no expresión de antígeno V y ausencia del antígeno hrB de alta frecuencia. Entre ellos, los antígenos D y C son los clínicamente más relevantes.
La complejidad antigénica de RHD*r’S se correlaciona con su complejidad genética, que incluye una sustitución de parte del exón 3 de RHD, los exones 4-7 de RHD y los intrones que intervienen por sus contrapartes RHCE, una sustitución G>T en la posición 186 (exón 2), una sustitución C>T en la posición 410 (exón 3 híbrido), una sustitución C>G en la posición 733 (exón 5) y una sustitución G>T en la posición 1006 (exón 7). Además de los cambios en el gen RHD, RHD*r’S aparece en cis con RHCE*ceS1006T, un gen RHCE que también codifica las sustituciones C>G en la posición 733 (exón 5) y G>T en la posición 1006 (exón 7).
Para añadir a la complejidad antigénica y genética, el conocimiento acerca de la base molecular de RHD*r’S es incompleto. Por ejemplo, los puntos precisos de la combinación RHCEIRHD todavía no se han informado hasta la fecha. Adicionalmente, se han descrito dos tipos de variante RHD*r’S y se han nombrado Tipo 1 y Tipo 2, que difieren no solamente en su composición genética sino también en sus perfiles antigénicos.
Varias publicaciones (Westhoff et al., Transfusion (2010), 50: 1303-1311, Pham et al., Transfusion (2009), 49: 495504 y Tax et al., Transfusion (2002) 42: 634-644) han descubierto la similitud genética entre RHD*r’S y otras variantes de RHD, en particular RHD*DIIIa y RHD*DlVa/RHD*DIVa-2 (en lo sucesivo RHD*DIVa-2). Un número de métodos moleculares para la detección específica de RHD*r'S confían en la detección de polimorfismos localizados en el exón 3 híbrido D-CE del locus del RHD. Se sabe ahora que estos polimorfismos se comparten con las variantes RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2. En consecuencia, hasta la fecha, la identificación de RHD*r'S en una muestra por análisis de ADN requiere la detección de los polimorfismos del exón 3 híbrido y la discriminación de RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2. Esta discriminación es clínicamente relevante ya que las últimas variantes codifican un perfil antigénico diferente, que incluye la expresión de D parcial y la ausencia de C+W
El documento EP1780217 describe la detección de haplotipos positivos de RHD en individuos D negativos. Silvy et al., British Journal of Haematology, (30 de dic 2012) doi: 10.1111/bjh. 12179 [Epub antes de la impresión], describe la identificación de un polimorfismo que se dice está restringido al haplotipo (C)ceS tipo 1. El documento WO2012/17990 describe la discriminación de variantes de tipo sanguíneo en un método que hace uso de los polimorfismos en el intrón 7 del gen RHD y/o el intrón 7 del gen RHCE. El documento EP2471949 describe un
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método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican antígeno D (D-) y codifican el antígeno C alterado (C+W).
Silvy et al., British Journal of Haematology, 2013, Vol. 160, pp. 851-867, describe la identificación de un polimorfismo nuevo, denominado IVS3+3100a>g, que se restringe al haplotipo (C)ceS tipo 1 y que se sugiere que evita el riesgo del punto muerto transfusional en los pacientes con enfermedad de células falciformes (ECF).
El documento EP247949A1 describe un método para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas que no codifican el antígeno D (D-) y codifican el antígeno C alterado (C+W). El documento WO 01/77384 A2 describe la detección de SNP y metilaciones de citosina. El documento WO2012/171990 describe un método para detectar la presencia o ausencia de, o para discriminar entre, variantes de tipo sanguíneo, comprendiendo el método genotipar una muestra obtenida de un sujeto humano en una o más posiciones en el intrón 7 del gen RHD y/o el intrón 7 del gen RHCE.
Los reactivos de anticuerpo usados comúnmente para detectar el antígeno C no discriminan entre C+W y C+. Por lo tanto, el fenotipo se indica normalmente como C+. En casos en los que el reactivo de anticuerpo no discrimina entre C+W y C+ pero la muestra contiene un alelo RHCE*C normal en trans a un alelo RHD*r’S, C+W se oscurece por C+, dando como resultado un fenotipo C+ para la muestra. Por lo tanto, RHCE*C necesita ensayarse y mostrar si es ausente antes de la asignación de un fenotipo C+W a una muestra. En consecuencia, se mantiene una necesidad de métodos adicionales para distinguir los RHD*r’S de RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2. La presente invención aborda estos y otros objetos.
Sumario de la invención
Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que los métodos y, en particular, los cebadores de PCR como se describen en el presente documento son capaces de amplificar una porción del intrón 3 del gen RHD encontrado en las muestras r'S de una manera específica y que esta especificidad se retiene incluso en condiciones de PCR múltiplex. Las desventajas considerables de los cebadores y los métodos de reacción previamente descritos se abarcan por los métodos y los cebadores de la presente invención, como se demuestra por los ejemplos en el presente documento. La presente invención mitiga las lecturas de falsos positivos mostradas por los métodos y documentos previamente descritos y es ventajosamente capaz de discriminar r'S de alelos estrechamente relacionados, incluyendo una variante nuevamente descrita de RHD*DIIIa.
En consecuencia, la presente invención proporciona, en un primer aspecto, un cebador de oligonucleótidos de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que comprende una secuencia de nucleótidos que es de fórmula:
X-Y-Z
en la que:
X es X1 o X2, en la que:
X1 son los n nucleótidos finales en la secuencia de nucleótidos ATATGGAAATTTGATCATGT (SEQ ID NO: 1), en la que n es un número entre 2 y 20, incluidos; y
X2 es una variante de X1 que difiere en no más de una sustitución de nucleótidos;
Y es Y1 o Y2, en la que
Y1 es la secuencia de nucleótidos AS1TAATS2ATAC (SEQ ID NO: 2), en la que S1 y S2 se seleccionan independientemente de G y C; y
Y2 es una variante de Y1 que difiere de Y1 en no más de una sustitución de nucleótidos, con la condición de que dicha sustitución de nucleótidos no sea una sustitución de la primera A o la C final de Y1;
Z son los primeros m nucleótidos en la secuencia de nucleótidos TAAAG, en la que m es un número entre 0 y 5, incluidos.
En algunos casos, el cebador de este y otros aspectos de la invención es tal que X1 es la secuencia de nucleótidos de AAATTTGATCATGT (SEQ ID NO: 3) o ATGT. Lo que es lo mismo, n puede ser, en muchos casos, 14 o 4. En ciertos casos, n puede ser 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20.
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, Y1 se selecciona del grupo que consiste en: ACTAATCATAC (SEQ ID NO: 4); ACTAATGATAC (SEQ ID NO: 5); y AGTAATCATAC (SEQ ID NO: 6). Preferentemente, si S1 es G, S2 es C. Igualmente, si S1 es C, S2 es preferentemente C. De esta manera, la selección de S1 y S2 puede elegirse para mantener el número de no coincidencias con la secuencia molde diana que se pretende para que no sea más de una no coincidencia de nucleótidos. Por ejemplo, en ciertos casos, tanto S1 como S2 pueden ser G. Alternativamente, el número de no coincidencias de nucleótidos puede ser cero. En ciertos casos,
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tanto Si como S2 puede ser C.
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, m es 0. Por lo tanto, el cebador de la invención puede no tener Z, con el resultado de que el último nucleótido en Y (que es una C que corresponde al nucleótido polimórfico C/A en la posición 3046 del intrón 3 de RHD, como se numera en la Figura 7) es el nucleótido 3' del cebador de la invención. Alternativamente, m puede ser 1, 2, 3, 4 o 5.
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la invención, el cebador no tiene más de 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 o 20 nucleótidos de longitud. En algunos casos, el cebador puede tener al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o al menos 25 nucleótidos de longitud. En ciertos casos el cebador puede tener entre 15 y 25 nucleótidos de longitud. Algunos casos particulares incluyen un cebador de acuerdo con el primer aspecto de la invención que tiene una longitud de exactamente 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos.
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, el cebador puede ser de ADN o de ARN. El cebador es preferentemente de ADN.
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, el cebador puede incluir uno o más, por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5 bases alteradas o no naturales y/o bases de nucleótido derivatizadas o modificadas. En particular, una o más bases (por ejemplo, una base 5' o una 3') puede estar biotinilada o conjugada a un marcador detectable. Alternativa o adicionalmente, una o más bases (por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5 bases de nucleótido) pueden ser bases de ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, la secuencia de nucleótidos del cebador consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
(i) AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 7);
(ii) ATGTACT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 8);
(iii) AAATTTGATCATGTACTAATGATAC (SEQ ID NO: 9); y
(iv) AAATTT GAT CAT GT AGT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 10).
En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, el cebador es adecuado para su uso como un cebador de PCR directo en una amplificación de PCR de una porción del alelo r'S del intrón 3 del gen RHD.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una pluralidad de cebadores de oligonucleótidos que comprenden:
(i) un cebador de oligonucleótido del primer aspecto de la invención; y
(ii)
(a) un cebador inverso que hibrida con una porción del intrón 3 de r'S o su complemento, cuya porción incluye al menos una posición de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP, por sus siglas en inglés) que difiere entre r'S y RHD; o
(b) uno o más cebadores que hibridan con una región del gen RHD y o del gen RHCE.
Preferentemente, dicho cebador inverso (ii) (a) hibrida con el complemento inverso de una porción de la secuencia del intrón 3 de r'S que se muestra en la Figura 7 y que cae en 3' de la posición 3050, como se numera en la Figura 7. En algunos casos de acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención dicho cebador inverso hibrida con una porción del intrón 3 de r'S, o su complemento, cuya porción incluye el polimorfismo G/A de la posición 3189 del intrón 3 del gen RHD, siendo dicha numeración como se muestra en la Figura 7.
En algunos casos de acuerdo con el segundo aspecto de la presente invención, la pluralidad de cebadores comprende:
(i) un cebador de oligonucleótido del primer aspecto de la invención; y
(ii) al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:
(a) un cebador de oligonucleótido de entre 26 y 30 nucleótidos de longitud que comprende la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11) o una variante de la misma que no difiera en más de 3 (por ejemplo, no más de 2 o no más de 1) sustituciones de nucleótidos desde la secuencia de nucleótidos de sEq ID NO: 11, con la condición de que dichas sustituciones no incluyan la sustitución de la T final en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11.
(b) un cebador de oligonucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11);
(c) el cebador directo de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGGGCTTCCTCACCTCAAA
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(SEQ ID NO: 12);
(d) el cebador inverso de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGATGACCACCTTCCCAGG
secuencia de nucleótidos GGCCACCACCATTTGAA
(SEQ ID NO: 13);
(e) el cebador directo de RHCE C que consiste en la (SEQ ID NO: 14);
(f) el cebador inverso de RHCE C que GGTAGCAGGCGTCTGTAAAAA (SEQ ID NO: 15);
(g) el cebador directo del exón 1 de RHCE CATAGACAGGCCAGCACAG (SEQ ID NO: 16);
(h) el cebador inverso del exón 1 de RHCE TGCCCCTGGAGAACCAT (SEQ ID NO: 17);
(i) el cebador directo del exón 5 de RHCE
AAATTAAAATAAGCATTTGACCATC (SEQ ID NO: 18);
(j) el cebador inverso del exón 5 de RHCE
CCTGAGATGGCTGTCACCAC (SEQ ID NO: 19);
(k) el cebador directo del exón 7 de RHCE
ACATGCCATTGCCGTTC (SEQ ID NO: 20); y
(l) el cebador inverso del exón 7 de RHCE
TCTCACCTGCCAATCTGCT (SEQ ID NO: 21).
- consiste en
- la secuencia de nucleótidos
- que
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- que
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- que
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- que
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- que
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- que
- consiste en la secuencia de nucleótidos
En algunos casos la pluralidad de cebadores de oligonucleótidos comprende al menos: un cebador de oligonucleótido del primer aspecto de la invención y
un cebador de oligonucleótido de entre 26 y 30 nucleótidos de longitud que comprende la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11) o una variante de la misma que no difiera en más de 3 (por ejemplo, no más de 2 o no más de 1) sustituciones de nucleótidos desde la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11, con la condición de que dichas sustituciones no incluyan la sustitución de la T final en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11.
En algunos casos la pluralidad de cebadores de oligonucleótidos comprende al menos el primer par:
AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 7); y GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11).
En un tercer aspecto la presente invención proporciona un kit para evaluar un tipo sanguíneo de un sujeto, comprendiendo dicho kit:
una pluralidad de cebadores del segundo aspecto de la invención;
opcionalmente, una o más sondas y/o cebadores que abarcan una o más posiciones polimórficas en el intrón 3, el exón 3, el exón 4, el intrón 7 y/o el exón 7 del locus del gen RHD; y/u
opcionalmente, una o más sondas y/o cebadores que abarcan una o más posiciones polimórficas en el exón 7 del locus del gen RHCE.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un sistema para su uso en la determinación de un tipo sanguíneo de un sujeto, comprendiendo el sistema:
un kit del tercer aspecto de la invención; y
al menos un detector dispuesto para detectar una señal de ADN detectablemente marcado obtenido de dicho sujeto o un amplicón detectablemente marcado producido por amplificación por PCR llevada a cabo en ADN obtenido de dicho sujeto;
al menos un controlador en comunicación con el al menos un detector, estando el controlador programado con instrucciones legibles por ordenador para transformar dicha señal en haplotipos de tipo sanguíneo predichos y, opcionalmente, para transformar dichos haplotipos de tipo sanguíneo predichos en un fenotipo de tipo sanguíneo predicho.
En un quinto aspecto la presente invención proporciona un método para determinar la presencia o ausencia de, o para discriminar entre, los alelos de tipo sanguíneo en una muestra que contiene ADN, cuyo método comprende la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de al menos una porción del intrón 3 del gen RHD, en el que dicha PCR emplea al menos un cebador directo y un cebador inverso cada uno capaz de hibridar a la secuencia r'S expuesta en la SEQ ID NO: 31 (Figura 7), o su complemento, y en el que dicho cebador directo es el cebador del primer aspecto de la invención.
En algunos casos de acuerdo con el método de este y otros aspectos de la invención, los alelos del tipo sanguíneo son alelos que comprenden un exón 3 híbrido RHD/RHCE. En particular, los alelos de tipo sanguíneo pueden seleccionarse del grupo que consiste en: RHD*r'S; tipo RHD*r'S; RHD*r’S Tipo 1; RHD*r’S Tipo 2; RHD*DIIIa; RHD*DIIIa IVS3+3100G; RHD*DIII_FN; RHD*DIVa-2; RHD*DIVa; RHD*DIII-tipo4; RHD*DIII-tipo6; RHD*DIII-tipo7;
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RHD*DMI-tipo8; RHCE*ceS; RHCE*ceS1006T; RHCE*ceS1006C; RHCE*ce733G; RHCE*ce48C,733G,1025T; RHCE*ce48C,697G,733G; RH- CE*ce340T,733G; y RHCE*ce48C,733G,748A.
En algunos casos de acuerdo con el método de este y otros aspectos de la invención la PCR amplifica r'S, pero no amplifica uno o más de: RHD; RHCE*ce; RHD*DIIIa; RHD*DIIIa IVS3+3100G; y RHD*DIVa. En particular, dicha PCR puede en ciertos casos amplificar r'S, pero ninguno de RHD; RHCE*ce; RHD*DIIIa; RHD*DuIa IVS3+3100G; y RHD*DIVa.
En algunos casos de acuerdo con el método de este y otros aspectos de la invención el método es para discriminar r'S de RHD*DIIIa IVS3+3100G. La capacidad para distinguir r'S de la variante nuevamente descubierta, “RHD*DIIIa IVS3+3100G”, que por lo que saben los presentes inventores no se ha informado previamente, es un avance principal. La variante nuevamente descubierta, “RHD*DIIIa IVS3+3100G” comprende el mismo polimorfismo A a G de la posición 3100 del intrón 3 de RHD que se ha informado previamente ser específico para r'S (véase Silvy et al., 2012). Se esperaría que confiar en que la presencia del mismo polimorfismo A a G de la posición 3100 del intrón 3 de RHD identifique únicamente a r'S de como resultado resultados de falso positivo. Se espera que la provisión de un método que discrimine r'S de RHD*DIIIa IVS3+3100G proporcione una contribución clínica significativa.
El método de acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención utiliza un cebador directo del primer aspecto de la invención. Los ejemplos particulares incluyen un cebador que consiste en la secuencia de nucleótidos AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SeQ ID NO: 7). El método utiliza además un cebador inverso adecuado, que puede ser cualquier cebador inverso capaz de producir un producto de PCR cuando se usa en combinación con el cebador directo del primer aspecto de la invención. En ciertos casos, el cebador inverso es capaz de hibridar con una porción del intrón 3 de r'S, o su complemento, cuya porción incluye al menos una posición de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) que difiere entre r'S y RHD. En ciertos casos, dicha posición de SNP comprende el polimorfismo G/A en la posición 3189 del intrón 3 del gen RHD, siendo dicha numeración como se muestra en la Figura 7 (véase además SEQ ID NO: 31). En algunos casos, el cebador inverso es de entre 26 y 30 nucleótidos de longitud que comprende la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11). En ciertos casos, el cebador inverso consiste en la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11). En algunos casos de acuerdo con el método de este y otros aspectos de la invención la PCR es PCR múltiplex. La PCR múltiplex puede comprender además la amplificación de uno o más segmentos génicos de RHD y/o RHCE distintos del intrón 3 de RHD.
En algunos casos, el uno o más segmentos génicos de RHD y/o RHCE se seleccionan del grupo que consiste en: RHCE c; RHCE C; exón 1 de RHCE; exón 5 de RHCE; y exón 7 de RHCE. En consecuencia, el método puede emplear cebadores de PCR adicionales a usarse en múltiplex con los cebadores de PCR descritos anteriormente. En ciertos casos, la PCR múltiplex comprende además emplear 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o los 10 de los siguientes cebadores:
(i) el cebador directo de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGGGCTTCCTCACCTCAAA (SEQ ID NO: 12);
(ii) el cebador inverso de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGATGACCACCTTCCCAGG (SEQ ID NO: 13);
(iii) el cebador directo de RHCE C que consiste en la secuencia de nucleótidos GGCCACCACCATTTGAA (SEQ ID NO: 14);
(iv) el cebador inverso de RHCE C que consiste en la secuencia de nucleótidos GGTAGCAGGCGTCTGTAAAAA (SEQ ID NO: 15);
- (v) el cebador directo del exón 1 de CATAGACAGGCCAGCACAG (SEQ ID NO: 16);
- RHCE que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (vi) el cebador inverso del exón 1 de TGCCCCTGGAGAACCAT (SEQ ID NO: 17);
- RHCE que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (vii) el cebador directo del exón 5 de RHCE AAATTAAAATAAGCATTTGACCATC (SEQ ID NO: 18);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (viii) el cebador inverso del exón 5 de CCTGAGATGGCTGTCACCAC (SEQ ID NO: 19);
- RHCE que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (ix) el cebador directo del exón 7 de ACATGCCATTGCCGTTC (SEQ ID NO: 20); y
- RHCE que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (x) el cebador inverso del exón 7 de
- RHCE que consiste en la secuencia de nucleótidos
TCTCACCTGCCAATCTGCT (SEQ ID NO: 21). Preferentemente, los cebadores se emplean en pares, siendo pareados dichos cebadores como sigue: (i) con (ii); (iii) con (iv); (v) con (vi); (vii) con (viii); y (ix) con (x).
En algunos casos de acuerdo con el método de la presente invención, la muestra es una muestra que se ha determinado previamente que comprende un exón 3 híbrido de RHD-RHCE. Alternativamente, puede sospecharse que la muestra comprenda un exón 3 híbrido de RHD-RHCE o ser una muestra desconocida. El método puede por lo tanto comprender además una etapa anterior de determinación si la muestra contiene un exón 3 híbrido de rHD- RHCE.
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En algunos casos de acuerdo con el método de la presente invención, el método comprende además determinar la presencia o ausencia de un alelo RHCE* C en la muestra. En algunos casos, el método comprende además genotipar la muestra en una o más posiciones de polimorfismos en los loci de los genes RHD y/o RHCE. En ciertos casos, el método comprende genotipar la muestra en la posición 410 del exón 3 de RHD. En ciertos casos, el método comprende genotipar la muestra en la posición 602 del exón 4 de RHD. En ciertos casos, el método comprende genotipar la muestra en la posición 1048 del exón 7 de RHD. En ciertos casos, el método comprende genotipar la muestra en la posición 1006 del exón 7 de RHCE. En ciertos casos, el método comprende genotipar la muestra en la posición 3100 del intrón 3 de RHD.
En algunos casos de acuerdo con el método de la presente invención, el método comprende genotipar no más de 50, 40, 30, 25, 20, 15 o no más de 10, posiciones polimórficas de un solo nucleótido en el locus del gen RHD y/o el locus del gen RHCE.
En algunos casos de acuerdo con el método de la presente invención, el método comprende además predecir un fenotipo RHD y/o un fenotipo RHCE para el sujeto basándose en, al menos, el grado de amplificación por PCR de dicha al menos una porción del intrón 3 del gen RHD. Esto puede, por ejemplo, incluir una inspección visual o ayudada por ordenador de la intensidad de una banda en un gel donde la intensidad se relaciona con el grado de amplificación del producto de PCR. El experto en la materia por supuesto será fácilmente capaz de hacer uso de técnicas adecuadas para evaluar el grado de amplificación por PCR, por ejemplo, para la clasificación de muestras que contienen r'S. Dichas técnicas incluyen, sin limitación, PCR a tiempo real (qPCR), detección a base de perlas Luminex y evaluación a base de gel de agarosa. El método puede comprender detectar un resultado positivo para la amplificación por PCR específica de r'S y por lo tanto clasificar una muestra como que contiene un alelo r'S En algunos casos, la predicción del fenotipo se basa además en:
(i) la presencia o ausencia de un exón 3 híbrido de RHD/RHCE;
(ii) la identidad de uno o ambos alelos presentes en la posición 602 del exón 4 de RHD;
(iii) la identidad de uno o ambos alelos presentes en la posición 1048 del exón 7 de RHD;
(iv) la presencia o ausencia de un alelo RHCE*C en el locus del gen RHCE;
(v) la identidad de uno o ambos alelos presentes en la posición 1006 del exón 7 de RHCE; y/o
(vi) la identidad de uno o ambos alelos presentes en la posición 3100 del intrón 7 de RHD.
En algunos casos se descubre que la muestra contiene r'S y por lo tanto se predice que tiene serología C+W.
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, la muestra se obtiene preferentemente o se ha obtenido previamente de un sujeto humano. En algunos casos el sujeto se somete, o es un candidato para, la transfusión de sangre o el trasplante de médula ósea. En algunos casos el sujeto tiene enfermedad de células falciformes (ECF) o talasemia mayor. En algunos casos, el sujeto tiene linaje africano.
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, la muestra puede ser cualquier muestra biológica de la que es posible obtener ácidos nucleicos, particularmente ADN genómico, para su uso en una reacción de PCR. Las muestras adecuadas incluyen cualquier material de origen corporal (líquido, sólido o aspirado) tales como sangre, cabello, células de la mejilla y células de la piel.
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, la muestra puede someterse a uno o más tratamientos para extraer un ácido nucleico antes de o como parte de dicha amplificación por PCR.
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, el método puede comprender una Reacción en Cadena de la Polimerasa Específica de Alelos (ASP).
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, el método puede comprender marcar un ácido nucleico obtenido de la muestra o marcar el amplicón producido por dicha amplificación de PCR.
De acuerdo con este y otros aspectos de la presente invención, el método puede comprender además llevar a cabo análisis serológicos en una muestra de sangre que se ha obtenido del sujeto. Esto puede ser particularmente útil para corroborar o clarificar una predicción de fenotipo hecha. Combinar la predicción basada en el genotipo del tipo sanguíneo con una predicción basada en la serología puede ser útil, por ejemplo, para mejorar la precisión o para resolver resultados ambiguos. Sin embargo, también se contempla específicamente en el presente documento que el método de este y otros aspectos de la presente invención pueden no comprender llevar a cabo análisis serológicos. Retirar la necesidad de llevar a cabo análisis serológicos proporciona ahorros considerables en términos de tiempo, coste y/o recursos.
En un sexto aspecto la presente invención proporciona un método de coincidencia sanguínea, comprendiendo el método:
llevar a cabo el método del quinto aspecto de la invención en una muestra receptora de un sujeto receptor en necesidad de sangre donante y en una muestra donante de un potencial sujeto donante;
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comparar los alelos del tipo sanguíneo presentes en la muestra receptora con aquellos presentes en el sujeto donante y de esta manera determinar la compatibilidad del sujeto receptor para recibir sangre del potencial sujeto donante.
De acuerdo con la presente invención, el sujeto puede someterse, o ser candidato para, una transfusión sanguínea. En algunos casos, el sujeto puede tener ECF, o cualquier otra enfermedad que requiera transfusiones sanguíneas repetidas, tales como talasemia mayor o ciertos tumores malignos de las células sanguíneas.
De acuerdo con la presente invención, el sujeto puede ser de raza no caucásica. En particular, el sujeto puede ser de linaje africano (por ejemplo, “personas negras”). En ciertos casos, el sujeto puede tener un origen ancestral en un país mediterráneo.
De acuerdo con el método de la invención, la muestra puede ser cualquier muestra biológica adecuada de la que es posible amplificar al menos una porción del intrón 3 del locus del gen RHD y/o del que es posible determinar el genotipo del sujeto en una o más posiciones polimórficas en el gen RHD y/o el gen RHCE. En cierto caso, la muestra puede tomar convenientemente la forma de una muestra sanguínea.
En ciertos casos de acuerdo con el método de la invención, el método puede comprender llevar a cabo una Reacción en Cadena de la Polimerasa Específica de Alelos (ASP) y/o una Hibridación Específica de Alelos (ASH).
En ciertos casos de acuerdo con el método de este y otros aspectos de la invención, el método puede comprender marcar un ácido nucleico obtenido de la muestra o marcar un amplicón derivado de un ácido nucleico obtenido de la muestra. El marcador es preferentemente un marcador detectable. En algunos casos, el ADN derivado de la muestra, por ejemplo, el producto de PCR que resulta del uso del ADN de la muestra como molde, puede marcarse usando un marcador fluorescente o un tinte (por ejemplo conjugando dicho marcador fluorescente o tinte al producto de PCR antes o después de la fragmentación del producto de PCR.
En algunos casos, el método de acuerdo con el sexto aspecto de la invención puede llevarse a cabo para una pluralidad de sujetos receptores y una pluralidad de potenciales sujetos donantes.
La invención se describirá ahora con más detalle, a modo de ejemplo y sin limitación, por referencia a los dibujos que acompañan.
Descripción de las figuras
La Figura 1 muestra una imagen de gel que representa los resultados de PCR de una reacción que utiliza cebadores para un control de amplificación (HgH) (banda superior) y r'S (banda inferior) para diversas muestras (incluyendo RhD+, DIIIa, RHD*DIIIa IVS3+3100G, r'S, DIVa y un control negativo);
La Figura 2 muestra los resultados de intensidad Luminex para diversas muestras r'S, RHD*DIIIa IVS3+3100G y otras muestras distintas de r'S siguiendo la PCR múltiplex usando los cebadores específicos de r'S mostrados en la Tabla 1 y uno o más pares de cebadores mostrados en las Tablas 2 y 3;
La Figura 3 muestra una tabla de ciertos rasgos de exones e intrones de RHD y RHCE para r'S, DIIIa, DIVa y la nueva variante "RHD*DIIIa IVS3+3100G";
La Figura 4 muestra una imagen de gel que representa los resultados de PCR de una reacción que utiliza cebadores para un control de amplificación (HgH) (banda superior) y r'S (banda inferior) para diversas muestras (incluyendo RhD+, DIIIa, RhD- y r'S);
La Figura 5 muestra los resultados de intensidad Luminex para diversas muestras r'S, r'S/RHD+ heterozigoto, r'S hemizigoto, DIVa- 2, DIIIa, muestras RHD- y RHD+;
La Figura 6 muestra una imagen de gel que representa los resultados de PCR de un número de reacciones de PCR que compara diferentes combinaciones de cebadores. Se muestran un control de amplificación (HgH) (banda superior) y r'S (banda inferior) para diversas muestras (r'S, RhD+, RhD-, DIIIa y un control negativo);
La Figura 7 muestra una alineación de una porción del intrón 3 de las posiciones numeradas 3001 a 3250 del gen RHD, numeradas de acuerdo con la secuencia RHD (fila superior). Un nucleótido idéntico al anterior se representa por un punto; un nucleótido omitido/eliminado (es decir, un hueco) se representa por un guion. Las secuencias mostradas son (desde arriba hasta abajo): RHD, RHCE*ce, r'S, DIVa, DIIIa y la variante nuevamente descubierta RHD*DIIIa IVS3+3100G (mostrada como n.° 425). Las localizaciones del cebador directo y el cebador inverso de referencia se indican por cajas sombreadas.
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Descripción detallada de la invención
La presente invención encuentra uso en la determinación de los fenotipos de antígenos codificados por RHD y RHCe clínicamente relevantes de una muestra sanguínea. La invención proporciona un método para detectar la presencia o ausencia de, o para discriminar entre, variantes de tipo sanguíneo, cuyo método comprende la amplificación por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de al menos una porción del intrón 3 del gen RHD, en la que dicha PCR emplea al menos un cebador directo y un cebador inverso cada uno capaz de hibridar con la secuencia r'S expuesta en SEQ ID NO: , o su complemento y en la que dicha secuencia de nucleótido cebador directo es de fórmula:
X-Y-Z
en la que:
X es X1 o X2, en la que:
X1 son los n nucleótidos finales en la secuencia de nucleótidos ATATGGAAATTTGATCATGT (SEQ ID NO: 1), en la que n es un número entre 2 y 20, incluidos; y
X2 es una variante de X1 que difiere en no más de una sustitución de nucleótidos;
Y es Y1 o Y2, en la que
Y1 es la secuencia de nucleótidos AS1TAATS2ATAC (SEQ ID NO: 2), en la que S1 y S2 se seleccionan independientemente de G y C; y
Y2 es una variante de Y1 que difiere de Y1 en no más de una sustitución de nucleótidos, con la condición de que dicha sustitución de nucleótidos no sea una sustitución de la primera A o la C final de Y1;
Z son los primeros m nucleótidos en la secuencia de nucleótidos TAAAG, en la que m es un número entre 0 y 5, incluidos.
Ventajosamente, el método de la presente invención puede comprender además determinar la presencia o ausencia de un exón 3 híbrido RHD/RHCE en dicha muestra y/o genotipar una muestra obtenida de un sujeto humano en una o más posiciones en el intrón 7 del gen RHD y/o el intrón 7 del gen RHCE. El tipificado sanguíneo haciendo uso de los polimorfismos del intrón 7 se describe en el documento WO2012/17990. El tipificado sanguíneo haciendo uso de una combinación de polimorfismos en el gen RHD y/o en el gen RHCE se describe en el documento US2012/0172239 y el documento EP2471949.
El antígeno D del grupo sanguíneo Rh se codifica por el gen RHD, que comprende 10 exones. La secuencia génica de RHD completa está disponible en la Secuencia de Referencia de NCBI: NG_007494.1 N.° NG_007494.1, GI:171184448, (SEQ ID NO: 22).
El antígeno C del grupo sanguíneo Rh se codifica por el gen RHCE, que comprende 10 exones. La secuencia génica de RHCE completa está disponible en la Secuencia de Referencia de NCBI: NG_009208.2, GI:301336136, (SEQ ID NO: 23).
El término “muestra” como se usa en el presente documento se destina a abarcar cualquier material (sólido, líquido o aspirado) obtenido directa o indirectamente de un sujeto humano y del que puede determinarse la identidad de uno o más nucleótidos en un locus genómico relevante (por ejemplo el intrón 7 del locus RHD y/o el intrón 7 del locus RHCE). En particular, el término “muestra” incluye cualquier fluido biológico tales como sangre, plasma, orina, saliva, fluido cerebroespinal y fluido intersticial, cualquier materia sólida, tales como tejido, hueso y cabello, cualquier célula o extracto celular, cualquier línea celular derivada, tales como una línea celular de tumor inmortalizado y una línea de células madre, un extracto de cualquiera de los tipos de muestra anteriores, tales como tejido fijado o embebido en parafina. En ciertas realizaciones preferidas, la muestra es un extracto de ADN genómico, opcionalmente amplificado y/o purificado.
Como se usa en el presente documento, el término “genotipado” se destina a abarcar cualquier método para determinar la identidad del nucleótido en una posición particular tal como una posición polimórfica en un locus especificado. De esta manera, el genotipado incluye identificar uno o ambos alelos de un gen particular. El genotipado puede emplear cualquiera de diversas técnicas, incluyendo pero no limitado a, hibridación específica de alelo, PCR específica de alelo, secuenciación de todo o una parte de un gen.
Salvo que se especifique de otra manera, todas las secuencias de ácidos nucleicos, tales como secuencias de cebadores, se exponen en el presente documento en el 5' a 3' directo. De esta manera, la secuencia de cebador AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 7) puede escribirse igualmente como 5'-
AAATTTGATCATGTACTAATCATAC-3' (SEQ ID NO: 7).
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Como se describe en el presente documento con detalle, ciertos alelos de tipos sanguíneos son menos comunes y se denominan normalmente “variantes” (por ejemplo RHD*r’S). Los alelos de variantes de tipos sanguíneos se denominan en algunos casos en el presente documento simplemente “variantes de tipo sanguíneo”.
Ampliamente, la presente invención proporciona métodos y productos para la identificación por técnicas moleculares de variantes genéticas RHD*r’S o tipo RHD*r’S, que no codifican antígeno D (D-), codifican una forma alterada de antígeno D (D parcial), formas alteradas de antígenos C (C+W), expresión del antígeno VS de baja frecuencia, no expresión del antígeno V y/o no antígeno hrB (hrB-) en las células sanguíneas. Los presentes inventores han descubierto que la amplificación de una región del intrón 3 del locus RHD puede ser específica de r'S cuando se emplean los cebadores como se describen en detalle en el presente documento. Esta amplificación específica de r'S permite la discriminación entre variantes RHD*r'S o tipo RHD*r'S y otras variantes del exón 3 híbrido RHD/RHCE, incluyendo pero no limitadas a RHD*DIIIa, RHD*DIIIa IVS3+3100G, RHD*DIII_FN y RHD*DIVa-2. En ciertas realizaciones, el método de la invención proporciona ahorros de eficiencia considerables en comparación con, por ejemplo, secuenciación de ADN completo, o genotipado de un gran número de polimorfismos, o determinación del fenotipo por métodos serológicos. Sin embargo, se contempla específicamente que el método de la invención puede, en algunos casos, implicar la secuenciación de ADN para genotipar la muestra obtenida del sujeto.
Es adecuada una amplia diversidad de técnicas y pueden usarse de acuerdo con la presente invención. Los oligonucleótidos específicos de alelo, por ejemplo, usados en una PCR (ASP de ahora en adelante) competitiva o no competitiva, puede usarse para detectar variantes genéticas.
De acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención, los segmentos funcionales o sus porciones pueden amplificarse, por ejemplo por PCR, usando como un molde ADN genómico. Los segmentos funcionales amplificados o sus porciones pueden marcarse (por ejemplo con un marcador fluorescente) para permitir su detección y opcionalmente fragmentarse para facilitar su apareamiento con sondas de oligonucleótidos.
De acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención, los segmentos funcionales marcados y fragmentados o sus porciones pueden incubarse en condiciones que maximicen la sensibilidad y la especificidad del apareamiento con sondas unidas al soporte sólido. La presencia de segmentos funcionales o sus fragmentos apareados con sondas se determinará indirectamente a partir de la medición del marcador, habitualmente un fluorocromo, unido al soporte sólido. Esta medición se denomina en el presente documento intensidad de señal. A modo de ejemplo, la fluorescencia emitida por el fluorocromo puede recogerse por medio de un dispositivo de detección de fluorescencia, tal como un escáner confocal.
Ejemplos
Discriminar entre variantes genéticas que comparten un exón 3 híbrido RHD/RHCE pero que codifican formas diferentes de Ag D (Ag D parcial frente a No Ag D) y de Ag RhC (Ag C normal frente a Ag C alterado/debilitado, a veces abreviado como C+W).
El siguiente ejemplo se refiere a un método para discriminar entre las variantes del exón 3 híbrido RHD/RHCE RHD*r's, RHD*DIIIa y RHD*DIVa-2 y una variante nuevamente descubierta designada en el presente documento "RHD*DNIa IVS3+3100G".
El ADN genómico se extrajo de células nucleadas en una muestra de sangre por lisis celular. El ADN extraído se purificó en una columna de afinidad. Tanto la lisis celular como la purificación de ADN se realizan con el kit QIAamp Blood (Qiagen, Alemania) siguiendo los protocolos y las recomendaciones del fabricante. La pureza del ADN se determinó por espectrofotometría en un instrumento Nanodrop (Nanodrop, DE). Solamente las soluciones de ADN con una DO260/DO280 1,8±0,2 procedieron al posterior análisis.
Amplificación por PCR específica de r'S
El ADN purificado se usó como un molde para la amplificación por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) multiplexada de los segmentos génicos de interés en un termociclador GeneAmp 9700 (Perkin-Elmer, CA). Las secuencias de cebadores fueron como sigue (5'-3'):
- Tabla 1
- r'S
- Directo AAATTT GAT CAT GTACT AAT CAT AC SEQ ID NO: 7
- Inverso
- GGAAAAGGTTT GAGAGGAATT AT ATT SEQ ID NO: 11
Las condiciones de ciclado consisten en una etapa de desnaturalización/activación de la polimerasa a 95 °C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 60 °C durante 30 s, extensión a 72 °C durante 80 s y una etapa de extensión final a 72 °C durante 7 min.
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El ADN amplificado se separó por electroforesis en un gel de agarosa al 2 %, se tiñó con tinte SYBR Safe (Invitrogen, OR) y se fotografió en iluminación UV. La amplificación frente a la no amplificación de un segmento se determinó visualmente por un técnico de laboratorio entrenado.
Las siguientes muestras de identidad conocida se sometieron a PCR específica de alelos usando el par de cebadores específicos de r'S: Rhd+ (una muestra), DIIIa (17 muestras), la variante nuevamente descubierta “RHD*DIIIa IVS3+3100G” (una muestra), r'S (una muestra), DIVa (3 muestras) y un control negativo de agua (una muestra).
Como un control positivo para la amplificación de PCR, también se emplearon los cebadores para la amplificación de HgH. Los productos de reacción de PCR se hicieron correr en un gel de agarosa (véase la Figura 1).
Como se muestra en la Figura 1, la banda superior que indica la presencia del producto de PCR control positivo HgH es visible para todas las muestras con la excepción del control negativo de agua. La banda específica de r'S (banda inferior) es visible solamente en la muestra de r'S (panel inferior; carril 4). Estos resultados demuestran claramente que la PCR específica de r'S es capaz de discriminar entre r'S y otras variantes del exón 3 híbrido RHD/RHCE tales como DIIIa, DIVa y la variante nuevamente descubierta “RHD*DIIIa IVS3+3100G”.
Genotipado por PCR múltiplex y basado en sondas
Los siguientes cebadores (5'-3') se usaron en múltiplex con los cebadores de r'S descritos anteriormente:
- Tabla 2
- RHCE c
- Directo T GGGCTTCCT CACCT CAAA SEQ ID NO: 12
- Inverso
- T GAT GACCACCTTCCCAGG SEQ ID NO: 13
- RHCE C
- Directo GGCCACCACCATTT GAA SEQ ID NO: 14
- Inverso
- GGT AGCAGGCGT CT GT AAAAA SEQ ID NO: 15
- Tabla 3
- Exón 1 de RHCE
- Directo CAT AGACAG G C CAG CACAG SEQ ID NO: 16
- Inverso
- TGCCCCTGGAGAACCAT SEQ ID NO: 17
- Exón 5 de RHCE
- Directo AAATT AAAAT AAGCATTTGACCATC SEQ ID NO: 18
- Inverso
- CCT GAGATGGCT GT CACCAC SEQ ID NO: 19
- Exón 7 de RHCE
- Directo ACATGCCATTGCCGTTC SEQ ID NO: 20
- Inverso
- T CT CACCT GCCAAT CTGCT SEQ ID NO: 21
La siguiente secuencia de sonda se usó para determinar la presencia o ausencia del amplicón del intrón 3: CAAAAGCTGATATGTCATGTTTAGTTA (SEQ ID NO: 24)
Una sonda única puede usarse para determinar la presencia o ausencia del amplicón del intrón 3 porque la PCR es
específica de alelo (debido al diseño del cebador directo). En otras palabras, no es necesario que la propia sonda de
detección interrogue una secuencia que es específica a r'S
Como un ejemplo no limitante, el procedimiento para la detección basada en Luminex® xMAP® empleado en el
presente documento, fue como sigue:
PREPARACIÓN DE MUESTRA DE ADN
• Se extrajo ADN genómico humano de sangre entera con EDTA como anticoagulante. La extracción de ADN genómico se llevó a cabo en el área pre-PCR.
• La entrada de ADN genómico fue 100 ng. La pureza del ADN genómico (relación DO260/DO280) estaba en el intervalo de 1,63-1,95.
• Las muestras de ADN genómico se almacenaron de -15 a -25 °C durante hasta un mes. Se evitaron los ciclos múltiples de congelación/descongelación.
Se aplicó el siguiente procedimiento:
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PROCEDIMIENTO
• El protocolo ID-CORE XT™ consiste en 4 etapas:
• Cada lote de muestras se procesó con un control negativo (agua de tipo biología molecular que se sabe que está libre de cualquier contaminación de ADN).
I AMPLIFICACIÓN
• Trabajar en el área pre-PCR y usar puntas de barrera de aerosol. Usar una punta nueva para cada muestra de ADN.
• Brevemente someter a vórtex y tubos de espín antes de su uso.
• No es necesario realizar la reacción de PCR en hielo.
1. Encender el termociclador.
2. Sacar los siguientes reactivos del refrigerador y del congelador: ID-CORE XT™ PCR Master Mix y ADN polimerasa HotStartTaq®, respectivamente.
Nota: la ADN polimerasa HotStartTaq® debe retirarse del congelador inmediatamente antes de su uso y devolverse al congelador inmediatamente después de su uso. Alternativamente usar hielo o un enfriador de microtubos. El almacén de enzima debe mezclarse cuidadosamente dando golpecitos al tubo.
3. Ajustar la mezcla de reacción ID-CORE XT™ PCR Master Mix como se muestra en la siguiente tabla (todos los volúmenes en jl):
- Número de muestras
- 1 8 24 48
- ID-CORE XT™ PCR Master Mix
- 22,5 180 540 1080
- ADN polimerasa HotStartTaq®
- 0,5 4 12 24
NOTA: los volúmenes citados ya incluyen un exceso para contar con el error de pipeteado.
4. Someter a vórtex y espín la mezcla de reacción ID-CORE XT™ PCR Master Mix.
5. Inmediatamente dispensar 20 jl por muestra en los pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos.
6. Añadir 5 jl de muestra de ADN, AdN control positivo y control negativo a los pocillos apropiados en este orden.
7. Sellar la placa con la película adhesiva.
• Trabajar en el área post-PCR.
8. Centrifugar la placa de PCR para recoger el líquido en el fondo de los pocillos.
9. Verificar que todos los pocillos están sellados apropiadamente y que la pestaña del termociclador ha alcanzado la temperatura pre-ajustada.
10. Colocar la placa en el termociclador. Colocar la almohadilla de compresión sobre la placa.
11. Cerrar la pestaña del termociclador e iniciar el programa de amplificación ID XT PCR.
- Temperatura Time Ciclos
- Activación de la polimerasa
- CO en o O 15 min 1
- Desnaturalización
- CO en o O 30 s 40
- Hibridación
- o o O CO 30 s 40
- Extensión
- o o CM 80 s 40
- Extensión final
- o o CM 7 min 1
- Mantener
- o o 1
- Volumen de reacción de amplificación: 25 jl
II. HIBRIDACIÓN
• Trabajar en el área post-PCR. Usar una nueva punta para cada muestra.
• Siempre que sea necesario durante las etapas de dispensación, secar la superficie de la placa Costar usando una toallita de poca pelusa.
• Manejo y almacenamiento de las perlas ID-CORE XT™ Beads Master Mix:
a. Las perlas se asientan y se agregan con el tiempo. Antes de pipetear, llevarlas a una suspensión homogénea
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sometiendo a vórtex vigorosamente durante 30 segundos.
b. Durante la dispensación de ID-CORE XT™ Beads Master Mix, mantener las perlas en suspensión sometiendo a vórtex frecuentemente (cada 8 muestras).
c. No centrifugar la placa una vez que ID-CORE XT™ Beads Master Mix se ha dispensado para evitar la mala agregación.
d. Las perlas contienen un tinte fluorescente interno. Para evitar el fotoblanqueamiento, protegerlas de la luz durante el almacenamiento y su uso.
• Preparación del sistema Luminex®:
a. Encender el sistema Luminex® 100/200™ entre 30 minutos y4 horas antes de evaluar las muestras.
b. Ajustar la temperatura del calentador del instrumento XYP a 52 °C y verificar que el bloque de calentamiento está en el portaplacas.
c. Realizar el mantenimiento de inicio diario de Luminex® 100/200™.
1. Encender el termociclador.
2. Sacar ID-CORE XT™ Beads Master Mix del refrigerador y dejarlo equilibrarse a temperatura ambiente.
3. Someter a vórtex ID-CORE XT™ Beads Master Mix durante 30 segundos.
4. Dispensar 46 pl de ID-CORE XT™ Beads Master Mix en una placa Costar. Evitar la formación de burbujas durante la dispensación.
5. Centrifugar la placa de PCR para recoger el líquido en el fondo de los pocillos.
6. Añadir 4 pl de producto de PCR en cada pocillo de la placa Costar.
7. Mezclar cuidadosamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Evitar la formación de burbujas durante la dispensación y el pipeteado.
8. Sellar la placa con una película de sellado BioRad.
9. Verificar que todos los pocillos se sellan apropiadamente y que la pestaña del termociclador ha alcanzado la temperatura pre-ajustada.
10. Colocar la placa y los manteles de compresión de silicona correspondientes en el bloque del termociclador.
11. Cerrar la pestaña del termociclador e iniciar el programa de hibridación ID XT HYB.
- Temperatura Tiempo
- Desnaturalización
- CO en o O 2 min
- Hibridación
- o o CM LO 30 min
- Mantener
- o o CM lO
12. Durante la etapa de preparación preparar la mezcla de marcaje (véase la sección Marcaje) y realizar la etapa “Crear un nuevo lote” en el software Luminex® (véase la sección Adquisición de datos).
Nota: los productos de PCR deben marcarse inmediatamente después de la hibridación. El proceso no puede detenerse después de la etapa de hibridación.
III. MARCAJE
• Trabajar en el área post-PCR.
1. Llevar los siguientes reactivos a temperatura ambiente: SAPE y tampón de dilución SAPE.
2. Preparar la mezcla de marcaje como se muestra en la siguiente tabla (todos los volúmenes en pl): 3 4 5 6
- Número de muestras
- 1 8 24 48
- Tampón de dilución SAPE
- 87 696 2088 4176
- SAPE
- 4,6 36,8 110 221
NOTA: los volúmenes citados ya incluyen un exceso para tener en cuenta el error de pipeteado.
3. Someter a vórtex la mezcla de marcaje y mantenerla protegida de la luz a temperatura ambiente.
4. En la etapa de mantener a 52 °C, abrir la pestaña del termociclador y retirar las almohadillas de compresión y la película de sellado con cuidado, manteniendo la placa en el termociclador para la etapa de marcaje.
5. Dispensar 80 pl de la mezcla de marcaje en cada pocillo de la placa de hibridación y mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo una vez.
6. Analizar las muestras usando el sistema Luminex® inmediatamente después del marcaje.
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IV. OBTENCION DE DATOS Y ANALISIS Preparación del sistema Luminex®
• Referirse al Manual del usuario de Luminex® (Manual de usuario Luminex® 100™ IS 2.3., Manual de usuario Luminex® 200™ o Manual de Software xPONENT® 3.1) para la preparación y el funcionamiento del instrumento, incluyendo el inicio diario, la calibración, el mantenimiento y los procedimientos de apagado.
1. Seleccionar Crear un nuevo lote a partir de un protocolo existente en la página de inicio (para el software Luminex® 100™ IS 2.3.) o la opción pestaña Lotes (para el Software xPONENT® 3.1) y seleccionar el protocolo correspondiente.
2. Meter las ID de muestras.
3. Seguir paso a paso las instrucciones que aparecen en la pantalla para crear lotes. Para las instrucciones adicionales al crear lotes y multilotes, referirse al manual de usuario Luminex® correspondiente.
4. Seleccionar el icono Eyectar para eyectar el portaplacas. Colocar la placa de hibridación en el bloque de calentamiento del instrumento Luminex® XYP presente en el portaplacas.
5. Seleccionar el icono Retraer. Las muestras ya están listas para analizarse.
6. Iniciar el procedimiento de análisis haciendo clic en el icono Inicio (para el software Luminex® IS 2.3.) o el icono Ejecutar (para el software Luminex® xPONENT® 3.1).
7. Después de que se complete un lote, los datos se exportan como un archivo de Valores separados por comas (csv). Este archivo se guarda en una carpeta con el nombre del lote metido dentro del software Luminex®.
8. Realizar un mantenimiento de apagado diario de Luminex® 100/200™.
9. El sistema puede apagarse en este punto si no va a usarse durante el resto del día.
El software propietario (Progenika Biopharma S.A) se usa para transformar los valores de intensidad de fluorescencia para las variantes alélicas particulares detectadas, de forma única o en combinación, en genotipos de grupos sanguíneos, y de genotipos en fenotipos de grupo sanguíneo predichos.
La Figura 2 muestra la salida y la representación gráfica (el eje vertical es “intensidad normalizada”) de un ensayo Luminex para muestras r'S, la variante nuevamente descubierta “RHD*DIIIa IVS3+3100G” y otras muestras distintas de r'S que siguen la PCR múltiplex usando los cebadores específicos de r'S mostrados en la Tabla 1 y uno o más pares de cebadores mostrados en las Tablas 2 y 3. Los datos mostrados en la Figura 2 confirman que las muestras r'S se amplifican exitosamente por PCR en múltiplex y que la intensidad de señal normalizada Luminex es marcadamente más alta para las muestras de r'S que para las muestras distintas de r'S, incluyendo la variante nuevamente descubierta “RHD*DIIIa IVS3+3100G”. De hecho, la separación de la señal normalizada (mayor que 6 veces más alta para las muestras de r'S) proporciona una discriminación clara no ambigua entre las muestras r'S y las muestras distintas de r'S estrechamente relacionadas, a pesar de las condiciones de PCR relativamente menos estrictas utilizadas para la PCR múltiplex. Estos resultados por lo tanto subrayan la adaptabilidad sorprendente de los cebadores de la presente invención, en particular el cebador directo como se expone en la Tabla 1, para su uso en PCR específica de alelos en múltiplex para la identificación de muestras de r'S.
Como se muestra en la Figura 3, la capacidad de los cebadores específicos de r'S de la presente invención para trabajar en múltiplex con los cebadores para la amplificación de otros segmentos de los loci del gen RHD y/o del gen RHCE permite el uso eficiente de la muestra, por ejemplo, para interrogar otros polimorfismos relevantes a la clasificación de variantes de tipo sanguíneo. En particular, los segmentos que incluyen todo o una parte de uno o más exones y/o intrones de RHD y/o RHCE pueden amplificarse y los productos de amplificación interrogados por sondas específicas de alelo para detectar la presencia o ausencia de, y/o la identidad de: un RHCE c; un RHCE C; el exón 1 de RHCE; el exón 5 de RHCE; el exón 7 de RHCE; y el alelo del exón 3 híbrido RHD/RHCE; un polimorfismo G/C en la posición 602 del exón 4 de RHD; un polimorfismo C/G en la posición 1048 del exón 7 de RHD; la presencia o ausencia de un alelo RHCE*C; un polimorfismo G/T en la posición 1006 del exón 7 de RHCE; y/o un polimorfismo G/A en la posición 3100 del intrón 3 de RHD.
Comparación con un cebador previamente descrito
Silvy et al., British Journal of Haematology, (30 dic 2012) doi: 10.1111/bjh. 12179 [Epub antes de la impresión] describe la amplificación de PCR de una porción del intrón 3 del gen RHD. Se dice que la amplificación es selectiva para r'S (denominada en el presente documento haplotipo (C)ceS tipo 1). El par de cebadores empleado por Silvy et al. incluyó (Véase la Figura 1 y el apéndice S1 de información de apoyo de Silvy et al.):
un cebador directo (“RHD-for”) que es específico para la secuencia que contiene RHD que tiene la secuencia (5' a 3'):
GCAAATATGGAAATTTGATCATGTA (SEQ ID NO: 25);
un cebador inverso (“RHCE-rev”) que es específico para la secuencia que contiene RHCE que tiene la secuencia
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(5' a 3'):
CTTAATCACAAGATTATTTTCAGAATCTAAC (SEQ ID NO: 26); y
un cebador inverso control (“RHDce-REV”) que híbrida tanto con la secuencia que contiene RHD como la que contiene RHCE que tiene la secuencia (5' a 3'):
GGGCCTTGGACAAGTTGTTA (SEQ ID NO: 27).
El método enseñado por Silvy et al. confía en la amplificación de un amplicón de 240 pb por el par de cebadores RHD-for y RHCE-rev siendo específicos para r'S, en comparación con, por ejemplo, RHD*DIVa2 y RHD*DIIIa (véase Silyv et al., Fig. 1(B)). Aunque Silvy et al. informaron la amplificación de 52 muestras del haplotipo (C)ceS tipo 1 y la amplificación negativa de todas las demás muestras en un conjunto de 118 muestras, independientemente de los alelos RHD y RHCE presentes, este método padece un montón de inconvenientes importantes. En particular, la especificidad se logra por medio de la intersección de los dos cebadores específicos, RHD-for y RHCE-rev, en lugar de que ambos cebadores en sí mismos sean específicos por r'S Esto significa que, por ejemplo, el cebador RHD-for también hibrida con otro molde que contenga la secuencia RHD, incluyendo RHD*DIIIa y RHD*DIVa2.
Como se describe a continuación, los presentes inventores han descubierto que el método y los cebadores de Silvy et al. dan como resultado una discriminación pobre de r'S, por ejemplo, de RHD*DIIIa y RHD*DIVa2 bajo las condiciones de PCR poco rigurosas normalmente empleadas en la pCr múltiplex.
Además, Silvy et al. enseñan que IVS3+3100a>g SNP es específico del h haplotipo (C)ceS tipo 1 (es decir r'S). Sin embargo, los presentes inventores han descubierto ahora que este no es el caso. En particular, se ha identificado en el presente documento una variante provisionalmente denominada “RHD*DIIIa IVS3+3100G”, que no es r'S, sino realmente una variante de RHD*DIIIa que tiene el mismo polimorfismo A a G en la posición 3100 del intrón 3. Por lo tanto, la confianza en la presencia del polimorfismo A a G en la posición 3100 del intrón 3 para identificar r'S puede y dará lugar a resultados falsos positivos cuando una muestra “rHd*DIIIa IVS3+3100G” se asignaría incorrectamente como una muestra r'S. Esto es clínicamente relevante porque “RHD*DIIIa IVS3+3100G” es serológicamente C, en lugar de C+W. De esta manera, la confianza en el polimorfismo A a G en la posición 3100 del intrón 3 para identificar r'S es indeseable.
Como se muestra en la alineación de la Figura 7, el cebador directo de Silvy et al. (RHD-for) hibridaría con todos de los siguientes: muestra RHD, r'S, DIVa, DIIIa y el nuevamente descrito “RHD*DIIIa IVS3+3100G”. Aunque puede esperarse que la intersección de las secuencias que coinciden con los cebadores RHD-for y RHCE-rev de Silvy et al. se confine a r'S, la amplificación solamente será específica en condiciones de rigurosidad. Bajo condiciones menos rigurosas, el cebador directo de Silvy et al. da como resultado en un número de amplificaciones no específicas. Por el contrario, el cebador directo de la presente invención es específico solamente para r'S.
En el procedimiento de diseño de los cebadores directos de la presente invención, los inventores buscaron mitigar los inconvenientes asociados al cebador directo desvelado en Silvy et al.
La Figura 4 muestra los resultados de usar el cebador RHD-for de Silvy et al. que tiene la secuencia GCAAATATGGAAATTTGATCATGTA (SEQ ID NO: 25) junto con el cebador inverso específico de RHCE que tiene la secuencia GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (sEq ID NO: 11) en condiciones de PCR adecuadas para PCR múltiplex. La banda superior muestra el control de amplificación (HgH), mientras que la banda inferior es, teóricamente, un amplicón que es específico para r'S. El carril 1 muestra que la muestra “BGG-10-656” que es una muestra r'S de hecho se amplifica por la combinación anterior de cebadores. Sin embargo, el carril 2, que es la muestra “BGG-10-628”, siendo una muestra conocida de DIIIa, y el carril 3, que es “L22”, una muestra RhD+ conocida, exhibieron ambas amplificación positiva del amplicón supuestamente específico de r'S. Estos resultados demuestran que el cebador directo RHD-for de Silvy et al. da como resultado resultados falsos positivos en las condiciones ensayadas. Estos resultados pueden contrastarse con los resultados obtenidos cuando se usa un cebador directo de la presente invención, en cuyo caso no se encontraron dichos resultados falsos positivos.
Los resultados mostrados en la Figura 5 igualmente demuestran que el cebador directo de Silvy et al. da como resultado la amplificación no específica y por lo tanto resultados falsos positivos. En particular, las muestras que se conocen DIVa, DIIIa y RhD+ dieron todas una señal de intensidad de fluorescencia media Luminex por encima de la línea umbral para clasificarse como r'S (como lo hicieron las muestras que se sabía que eran r'S). Las muestras que se sabía que eran RhD- no exhibieron resultados positivos en este experimento. Estos datos pueden contrastarse con los resultados específicos de r'S mostrados en la Figura 2, en la que se empleó un cebador directo de la presente invención.
Variantes de cebador de la invención
Los presentes inventores buscaron proporcionar cebadores que contuvieran modificaciones de secuencia comparadas con el cebador directo de “referencia” que tiene la secuencia AAATTTGATCATGTACTAATCATAC
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(SEQ ID NO: 7). A modo de ejemplo, se realizaron los siguientes cambios a la secuencia de cebador directo de “referencia”, reteniendo la especificidad de r'S.
En una primera modificación, el cebador de referencia se acortó eliminando 10 nucleótidos en el extremo 5', para disminuir la temperatura de hibridación para la PCR. Esta modificación da como resultado el cebador directo de la invención que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
ATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 8).
En una segunda modificación, el cebador de referencia se alteró introduciendo una sustitución de nucleótidos (reemplazando una C por una G) para aumentar la especificidad. Esta modificación dio como resultado el cebador directo de la invención que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos (estando subrayada la posición de sustitución):
AAATTTGATCATGTACTAATGATAC (SEQ ID NO: 9).
En una tercera modificación, el cebador de referencia se alteró introduciendo una sustitución de nucleótidos que difiere de la sustitución descrita anteriormente en relación a la segunda modificación. Esta modificación fue también un reemplazamiento de una C por una G para aumentar la especificidad, pero fue en una posición diferente. Esta modificación dio como resultado el cebador directo de la invención que tiene la siguiente secuencia de nucleótidos (estando subrayada la posición de sustitución):
AAATTT GAT CAT GT AGT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 10).
La Figura 6 muestra los resultados de PCR obtenidos usando: el cebador directo de referencia de la invención AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 7); el cebador directo “inespecífico” de Silvy et al. GCAAATATGGAAATTTGATCATGTA (SEQ ID NO: 25); la variante de cebador de la invención que tiene la modificación 1 ATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 8); la variante de cebador de la invención que tiene la modificación 2 AAATTTGATCATGTACTAATGATAC (SEQ ID NO: 9); la variante de cebador de la invención que tiene la modificación 3 AAATTTGATCATGTAGTAATCATAC (SEQ ID NO: 10); y una versión modificada del cebador directo “inespecífico” de Silvy et al. que tiene la secuencia GGCAAATATGGAAATTTGATCATGTA (SEQ ID NO: 28). En todos los casos el cebador inverso usado fue GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11).
La Figura 6 muestra los resultados de la amplificación de PCR de los cebadores anteriormente descritos. La banda superior es un control y la banda inferior se destina a ser un producto de amplificación específico de r'S, hasta el grado en que los cebadores usados de hecho amplifican de una forma específica de r'S bajo las condiciones empleadas. Como se muestra en la Figura 6, el cebador directo de referencia (panel superior) exhibe amplificación específica de r'S (positiva para tres muestras de r'S conocidas (carriles 1, 2 y 6) y negativa para no r'S (RhD+ en el carril 3, RhD- en el carril 4 y DIIIa en el carril 5)). El control negativo del carril 7 no muestra amplificación.
El cebador directo inespecífico en la caja 1 (segundo panel inferior; lado a mano derecha) exhibe una banda r'S positiva con presencia no solamente de muestras r'S, sino también RhD+ y DIIIa (véanse los carriles 3 y 5), confirmando de esta manera los resultados falsos positivos.
Los resultados de la modificación 1 de cebador se muestran en la caja 2 (aparece en el segundo panel, a mano derecha y en el tercer panel, a mano izquierda). La banda r'S, aunque de alguna manera menos clara que la banda control superior, es claramente visible en todas las muestras r'S (carriles 1, 2 y 6), mientras que los otros carriles (RhD+, RhD-, DIIIa y el control negativo) están sin ninguna banda r'S. Estos resultados confirman que la modificación al cebador directo de referencia (acortándolo eliminando los 10 nucleótidos 5') no obstante retiene la especificidad de r'S.
Los resultados de la modificación 2 de cebador se muestran en la caja 3 (tercer panel, centro). La banda r'S es claramente visible en todas las muestras r'S (carriles 1, 2 y 6), mientras que los otros carriles (RhD+, RhD-, DIIIa y el control negativo) están sin ninguna banda r'S. Estos resultados confirman que la modificación al cebador directo de referencia (sustitución C por G para generar una no coincidencia de base única) no obstante retiene o incluso la especificidad de r'S.
Los resultados de la modificación 3 de cebador se muestran en la caja 4 (aparecen en el tercer panel, a mano derecha y cuarto panel, a mano izquierda). La banda r'S es claramente visible en todas las muestras r'S (carriles 1, 2 y 6), mientras que los otros carriles (RhD+, RhD-, DIIIa y el control negativo) están sin ninguna banda r'S. Estos resultados confirman que la modificación al cebador directo de referencia (sustitución C por G para generar una no coincidencia de base única) no obstante retiene o incluso la especificidad de r'S.
El cebador directo inespecífico en la caja 5 (cuarto panel a mano derecha) exhibe presencia de banda r'S positiva de no solamente las muestras de r'S, sino también de RhD+ y DIIIa (véanse los carriles 3 y 5), confirmando de esta
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manera los resultados de falso positivo. Hay incluso una ligera banda r'S visible en la muestra RhD- (carril 4).
Tomados juntos, los presentes resultados demuestran que el cebador directo de referencia de la presente invención exhibe rendimiento superior en comparación con aquel de Silvy et al. El cebador RHD-for y que el cebador directo de la presente invención es tolerante a un número de modificaciones de secuencia, incluyendo una truncación 5' de 10 nucleótidos (es decir, reduciendo el valor de n en la fórmula X-Y-Z como se define en el presente documento) y sustituciones de nucleótidos que dan como resultado no coincidencias con la secuencia diana (es decir, selección de S1, S2 y/o cambios reflejados en las posibilidades de sustitución de X2 y/o Y2 de la fórmula X-Y-Z como se define en el presente documento. La presente invención por lo tanto proporciona, entre otros, un género de diseños de cebadores de PCR directos relacionados que abordan la necesidad de la amplificación específica de r'S y mitigan los inconvenientes asociados al cebador previamente descrito.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Progenika Biopharma S.A.
<120> Discriminación de variantes de tipo sanguíneo
<130> CSC/FP6960132
<140> <141>
<150> 13/791.284 <151 >
<160> 32
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 1
atatggaaat ttgatcatgt 20
<210>2 <211> 11 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>2
astaatsata c 11
<210>3 <211 > 14 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>3
aaatttgatc atgt 14
<210>4 <211> 11 <212> ADN
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<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>4
actaatcata c 11
<210>5 <211> 11 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>5
actaatgata c 11
<210> 6 <211> 11 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>6
agtaatcata o 11
<210>7 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>7
aaatttgatc atgtactaat catac 25
<210>8 <211 > 15 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>8
atgtactaat catac 15
<210>9 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400>9
aaatttgatc atgtactaat gatac 25
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<211> 25 <212>ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 10
aaatttgatc atgtagtaat catac 25
<210> 11 <211> 26 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 11
ggaaaaggtt tgagaggaat tatatt 26
<210> 12 <211 > 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 12
tgggcttcct cacctcaaa 19
<210> 13 <211 > 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 13
tgatgaccac cttcccagg 19
<210> 14 <211 > 17 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 14
ggccaccacc atttgaa 17
<210> 15 <211> 21 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 15
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ggtagcaggc gtctgtaaaa a 21
<210> 16 <211> 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 16
catagacagg ccagcacag 19
<210> 17 <211 > 17 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 17
tgcccctgga gaaccat 17
<210> 18 <211> 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 18
aaattaaaat aagcatttga ccatc 25
<210> 19 <211> 20 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador <400> 19
cctgagatgg ctgtcaccac 20
<210> 20 <211 > 17 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador
<400> 20
acatgccatt gccgttc 17
<210> 21 <211 > 19 <212> ADN
<213> Secuencia artificial <220>
<223> Secuencia sintética: cebador
10
<400> 21
totcacotgo caatotgot 19
<210> 22 <211> 64956 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 22
- gacaccccag
- ccacgccaag ccgggaagtc cccgcctcct ggagctgaac ccgcccctct 60
- cccagaggtg
- gagctgcggg gggcgggaac aggcacggag aaaataaaca agactaaaaa 120
- gtcctgagta
- gcgotgtgtg gccgcaaacc tgaacccacc ttttgcacca cgcgggaccc 180
- ggcacgcttc
- ctgccaccca cccctgagag ggctgcgcgg ccgaccccag tactagaaaa 240
- cactcgtcac
- ctcaatcaag acgggtacga aggccaacgg acgccttcct ttagaacgct 300
- cagcacacag
- agcaacttct cacgcctact otoaaatggc gtactccaaa ctagcactcc 360
- cgacgtccag
- ctgtgaaccc agagcggcgg aaagcccctg aacccagcgc ccgggoatgo 420
- gcagacgcgt
- tgttgtggtg ggcgtggctc cctccggacc cggcgccccg ccctccgccc 480
- cgtgtccgca
- tgcgcgaotg agccgcgggg gtggtactgc tgcatccggg tgtctgaaga 540
- tccgatgaaa
- taacatatgc aaaatgattg ggtccgtgat tggcattcca gaaatggtag 600
- ctgttattca
- gccaacaaat atttattgag cacctactat ggacttccct ggtgctgagg 660
- atacaacagc
- aaccacagca gtcaaaagtc cctgtcttca tgttgctcag attctcatag 720
- gggaaagcaa
- ataatgaaca aatacacggc cgggcgcagt ggctcacgcc tgtaatccca 780
- gtactttgcg
- aggccaaggt gggcaagtca cctgaggtca ggagttcgag accagactag 840
- ccaacgtggt
- gaaaccctgt cactactaaa aatacaaaaa ttagcgcggt gtggtggctc 900
- atgcctgtag
- tcccagctac ttgggaggct gaggaaggag aatcgcttga acctaaaagg 960
- cagaagttgc
- aatgagccaa gatcgtgcca ctgcattcca gcctgggtga cagagtactc 1020
- cgtctaaaaa
- aaaaacctaa atacacaagt aaaaatatag acctcgtcag atgctagtaa 1080
- gtgctgtgaa
- ggaaactaaa aggggaacac aaggaaccct tgtcaagggg agaagaaagg 1140
- ggagttgatg
- ctgtcctttt aaatagggca gtcagaggcc gggcacagtg gttcacacct 1200
Claims (20)
- 51015202530354045505560651. Un cebador de oligonucleótido de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que comprende una secuencia de nucleótidos que es de fórmula:X-Y-Zen la que:X es X1 o X2, en donde:X1 son los n nucleótidos finales en la secuencia de nucleótidos ATATGGAAATTTGATCATGT (SEQ ID NO: 1),en donde n es un número entre 2 y 20, incluidos; yX2 es una variante de X1 que difiere en no más de una sustitución de nucleótidos;Y es Y1 o Y2, en dondeY1 es la secuencia de nucleótidos AS1TAATS2ATAC (SEQ ID NO: 2), en la que S1 y S2 se seleccionan independientemente de G y C; yY2 es una variante de Y1 que difiere de Y1 en no más de una sustitución de nucleótidos, con la condición de que dicha sustitución de nucleótidos no sea una sustitución de la primera A o la C final de Y1;Z son los primeros m nucleótidos en la secuencia de nucleótidos TAAAG,en la que m es un número entre 0 y 5, incluidos.
- 2. Un cebador de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos de dicho cebador consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:(i) AAATTTGATCATGTAGTAATCATAC (SEQ ID NO: 10)(ii) AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 7);(iii) ATGTACT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 8); y(iv) AAATTT GAT CAT GTACT AAT GAT AC (SEQ ID NO: 9).
- 3. Un cebador de acuerdo con la reivindicación 1, en el que X1 es la secuencia de nucleótidos de AAATTT GAT CAT GT (SEQ ID NO: 3) o ATGT.
- 4. Un cebador de acuerdo con la reivindicación 1, en el que Y1 se selecciona del grupo que consiste en: ACTAATCATAC (SEQ ID NO: 4), ACT AAT GAT AC (SEQ ID NO: 5) y AGT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 6).
- 5. Un cebador de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho cebador es adecuado para su uso como un cebador de PCR directo en una amplificación por PCR de una porción del alelo r'S del intrón 3 del gen RHD.
- 6. Una pluralidad de cebadores de oligonucleótidos que comprenden:(i) un cebador de oligonucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y(ii) al menos un cebador seleccionado del grupo que consiste en:(a) un cebador inverso que hibrida con una porción del intrón 3 de r'S, o su complemento, porción que incluye la posición 3189 de polimorfismo G/A del intrón 3 del gen RHD, siendo dicha numeración como se muestra en la Figura 7;(b) un cebador de oligonucleótido de entre 26 y 30 nucleótidos de longitud que comprende la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11) o una variante de la misma que no difiera en más de 3 sustituciones de nucleótidos de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11, con la condición de que dichas sustituciones no incluyan la sustitución de la T final en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 11.(c) un cebador de oligonucleótido que consiste en la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11);(d) el cebador directo de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGGGCTTCCTCACCTCAAA (SEQ ID NO: 12);(e) el cebador inverso de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGATGACCACCTTCCCAGG (SEQ ID NO: 13);(f) el cebador directo de RHCE C que consiste en la secuencia de nucleótidos GGCCACCACCATTTGAA (SEQ ID NO: 14);5101520253035404550556065
- (g) el cebador inverso de RHCE C que GGTAGCAGGCGTCTGTAAAAA (SEQ ID NO: 15);
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- (h) el cebador directo del exón 1 de RHCE CATAGACAGGCCAGCACAG (SEQ ID NO: 16);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (i) el cebador inverso del exón 1 de RHCE TGCCCCTGGAGAACCAT (SEQ ID NO: 17);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (j) el cebador directo del exón 5 de RHCE AAATTAAAATAAGCATTTGACCATC (SEQ ID NO: 18);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (k) el cebador inverso del exón 5 de RHCE CCTGAGATGGCTGTCACCAC (SEQ ID NO: 19);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (l) el cebador directo del exón 7 de RHCE ACATGCCATTGCCGTTC (SEQ ID NO: 20); y
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (m) el cebador inverso del exón 7 de RHCE TCTCACCTGCCAATCTGCT (SEQ ID NO: 21).
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- 7. Una pluralidad de cebadores de oligonucleótido de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dichos cebadores comprenden el par de cebadores:AAATTTGATCATGTACTAATCATAC (SEQ ID NO: 7); y GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11).
- 8. Un kit para evaluar un tipo sanguíneo de un sujeto, comprendiendo dicho kit:una pluralidad de cebadores como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7;opcionalmente, una o más sondas y/o cebadores que abarcan una o más posiciones polimórficas en el intrón 3,el exón 3, el exón 4, el intrón 7 y/o el exón 7 del locus del gen RHD; yopcionalmente, una o más sondas y/o cebadores que abarcan una o más posiciones polimórficas en el exón 7 del locus del gen RHCE.
- 9. Un sistema para su uso en la determinación de un tipo sanguíneo de un sujeto, comprendiendo el sistema:un kit como se define en la reivindicación 8; yal menos un detector dispuesto para detectar una señal de ADN detectablemente marcado obtenido de dicho sujeto o un amplicón detectablemente marcado producido por amplificación por PCR llevada a cabo en ADN obtenido de dicho sujeto;al menos un controlador en comunicación con el al menos un detector, estando el controlador programado con instrucciones legibles por ordenador para transformar dicha señal en haplotipos de tipo sanguíneo predichos y, opcionalmente, para transformar dichos haplotipos de tipo sanguíneo predichos en un fenotipo de tipo sanguíneo predicho.
- 10. Un método para determinar la presencia o ausencia de, o para discriminar entre, los alelos de tipo sanguíneo en una muestra que contiene ADN, método que comprende la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de al menos una porción del intrón 3 del gen RHD, en donde dicha PCR emplea al menos un cebador directo y un cebador inverso cada uno capaz de hibridar con la secuencia r'S expuesta en la SEQ ID NO: 31, o su complemento, y en donde dicho cebador directo es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
- 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dichos alelos del tipo sanguíneo se seleccionan delgrupo que consiste en: RHD*r'S; de tipo RHD*r'S; RHD*r’S Tipo 1; RHD*r’S Tipo 2; RHD*DIIIa; RHD*DIIIa IVS3+3100G; RHD*DIII_FN; RHD*DIVa-2; RHD*DIVa; RHD*DIII-tipo4; RHD*DIII-tipo6; RHD*DIII-tipo7; RHD*DIII- tipo8; RHCE*ceS; RHCE*ceS1006T; RHCE*ceS1006C; RHCE*ce733G; RHCE*ce48C,733G,1025T;RHCE*ce48C,697G,733G; RHCE*ce340T,733G; y RHCE*ce48C,733G,748A.
- 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que:(a) dicha PCR amplifica r'S, pero no amplifica uno o más de: RHD; RHCE*ce; RHD*DIIIa; RHD*DIIIa IVS3+3100G; y RHD*DIVa.(b) dicha PCR amplifica r'S, pero no amplifica ninguno de RHD; RHCE*ce; RHD*DIIIa; RHD*DIIIa IVS3+3100G; y RHD*DIVa; o(c) el método es para discriminar r'S de RHD*DIIIa IVS3+3100G.
- 13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que:(a) dicho cebador directo consiste en la secuencia de nucleótidosAAATTT GAT CAT GT AGT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 10) o AAATTT GAT CAT GTACT AAT CAT AC (SEQ ID NO: 7).51015202530354045(b) dicho cebador inverso híbrida con una porción del intrón 3 de r'S, o su complemento, cuya porción incluye al menos una posición de polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) que difiere entre r'S y RHD, opcionalmente en el que dicha posición de SNP comprende el polimorfismo G/A en la posición 3189 del intrón 3 del gen RHD, siendo dicha numeración como se muestra en la Figura 7;(c) dicho cebador inverso es de entre 26 y 30 nucleótidos de longitud y comprende la secuencia de nucleótidos GGAAAAGGTTTGAGAGGAATTATATT (SEQ ID NO: 11); o(d) dicha PCR es PCR múltiplex, que comprende además la amplificación de uno o más segmentos génicos de RHD y/o RHCE.
- 14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13(d), en el que(a) dichos uno o más segmentos génicos distintos de RHD y/o RHCE se seleccionan del grupo que consiste en: rHcE c, RHCE C, exón 1 de RHCE, exón 5 de RHCE y exón 7 de RHCE; o(b) dicha PCR múltiplex comprende además emplear 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o los 10 de los siguientes cebadores:(i) el cebador directo de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGGGCTTCCTCACCTCAAA (SEQ ID NO: 12);(ii) el cebador inverso de RHCE c que consiste en la secuencia de nucleótidos TGATGACCACCTTCCCAGG (SEQ ID NO: 13);(iii) el cebador directo de RHCE C que consiste en la secuencia de nucleótidos GGCCACCACCATTTGAA (SEQ ID NO: 14);
- (iv) el cebador inverso de RHCE C que GGTAGCAGGCGTCTGTAAAAA (SEQ ID NO: 15);
- consiste en la secuencia de nucleótidos
- (v) el cebador directo del exón 1 de RHCE CATAGACAGGCCAGCACAG (SEQ ID NO: 16);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (vi) el cebador inverso del exón 1 de RHCE TGCCCCTGGAGAACCAT (SEQ ID NO: 17);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (vii) el cebador directo del exón 5 de RHCE AAATTAAAATAAGCATTTGACCATC (SEQ ID NO: 18);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (viii) el cebador inverso del exón 5 de RHCE CCTGAGATGGCTGTCACCAC (SEQ ID NO: 19);
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (ix) el cebador directo del exón 7 de RHCE ACATGCCATTGCCGTTC (SEQ ID NO: 20); y
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- (x) el cebador inverso del exón 7 de RHCE TCTCACCTGCCAATCTGCT (SEQ ID NO: 21).
- que consiste en la secuencia de nucleótidos
- 15. Un método de coincidencia sanguínea, comprendiendo el método:llevar a cabo el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en una muestra del receptor de un sujeto receptor que necesita sangre donante y en una muestra donante de un potencial sujeto donante;comparar los alelos de tipo sanguíneo presentes en la muestra del receptor con aquellos presentes en el sujeto donante y de esta manera determinar la compatibilidad del sujeto receptor para recibir sangre del potencial sujeto donante.AmplificaciónControl (HgH)
imagen1 I/Banda específica de r’sINTRON 03- Muestra
- csv MFL1 MFI 2 □ ist 10 Dist 2 Propor ción Cluster Ventana relaoQC EEGMFI EE12MFI Comentario PS
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- CQ_207_2_ 15D113 JD4663 CSV 1158 1213 0-04 0.036 0.977 AP 1 0 D Genotipo indeter minado
muestras r's (BCGEM693 y BGG-10-643)5H4-imagen2 fig. e3-2:rBGG-10-425 (Nueva variante RHD*Dllla IVS3+3100G)1 -imagen3 Otras muestras no r's (NA22641. BC106 y BCGENG12-2)ttHD- Presencia o ausencia de un alelo det exón 3 hi&ndO RHD/RHCE exón 4 (posición 602)
- r's
- Presencia G
- Dllla
- Presencia G
- Di Va
- Presencia C
- Nueva variante
- Presencia G
RHCEExón 7(posición 1045)P resencia/a use nc ¡a de un alelo RHCE'CExón 7(posición 1006)CGAusenciaAusenciaTG orTCAusenciaGAusenciaGG- 1 PHD
- Sero logia
- intrón 3 en la posición 3100
- G
- c*"
- A
- c-
- A
- c-
- G
- C-
Figura 5100Control de amplificación(HgH)imagen4 BJ0JJBQ-¡¡tarace ■ -*3- -vimagen5 Solamente las muestras r's deberían ser positivas (por encima de la línea verde}.É iot i-'fi_addÉNéí3.i í's r hr TpjcT j - *cain«j* i Todos los demás (DIVa, Dllla, RhD+ y RhD-) deberian ser negativos (por debajo ¡_73s-;í-!aí3i f^pnc- de la línea roja).=jct.¡>_mg-ií-¡j«í ,-SiRhC,’J :T-: ■ *_s5fi.]-r-: 3=5.1 ri|MkHgn ijSTJPJM-KMHUieT_l..i_*CÍ,10*Jí 6rv*"í|CT_JiCT_]y*__4CfiÉNB i2-¿. ¡ bilí» &lll* f.HC-|CT_J.i-_Jl¿á,l¿7S-í *HC-I&TJ.¡'h«—'W£ÍÉ*l.i *HC*shd-Figura 5imagen6 - 2. Modifi cación 1Cebador directo de referencia1. Modificación de cebador directo inespecíficc
- 2. Modificación de cebador 1
- 3. Modificación de cebador 2
- 4. Modificación de cebador 3
- 5. Modificación de cebador directo inespecíficoFigura 6
imagen7
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