ES2675993T3 - Procedimiento de diagnóstico, pronóstico o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas - Google Patents

Procedimiento de diagnóstico, pronóstico o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas Download PDF

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Universite Paris Est Creteil Val de Marne
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Abstract

Composición para su utilización en el tratamiento o la prevención de una tauopatía, en particular la enfermedad de Alzheimer, que comprende por lo menos un agente seleccionado de entre el grupo que consiste en: i. un ARNip seleccionado de entre la lista que consiste en: ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 71 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 72, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 73 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 74, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 75 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 76, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 77 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 78, o un oligonucleótido antisentido morfolino seleccionado de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6, y/o ii. protamina o sulfato de protamina.

Description

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heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa, y/o
ii. un nivel y/o una actividad enzimática de por lo menos un producto de traducción de dichos genes, en donde dichos productos se indican en, respectivamente, SEC ID nº 2 y nº 4, y/o
iii. un nivel y/o una actividad enzimática de una variante que presenta una identidad de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2 y nº 4 de dicho gen o de dicho producto de transcripción o traducción, y/o
iv.
el nivel de heparán sulfato, en particular el nivel de heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente el nivel de disacárido de heparán sulfato 3-O-sulfatado,
v.
el nivel de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total.
c) determinar dicha actividad y/o nivel en una muestra de control de un líquido biológico previamente recogido de un mamífero con una enfermedad de tauopatía no puesta en contacto con dicho compuesto,
d) comparar la diferencia entre dicha actividad y/o nivel en la muestra puesta en contacto de un líquido biológico con uno de entre la muestra no puesta en contacto de un líquido biológico, en el que una alteración de dicha actividad y/o nivel de la célula puesta en contacto indica que el compuesto de ensayo es un modulador de dicha enfermedad,
con la condición de que dicho nivel determinado en la etapa b) es uno de entre: heparán sulfato o fosforilación anormal de la proteína Tau y/o la proteína Tau total,
por lo tanto, se determinan tanto los niveles de heparán sulfato como de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total, o
se determina la actividad y/o nivel de por lo menos otro elemento seleccionado de entre dicho producto de transcripción de dichos genes, dicho producto de traducción de dichos genes, o dicha variante de dicho gen o dicho producto de transcripción o traducción.
En una forma de realización preferida, el mamífero del procedimiento para el cribado in vitro según la invención es un ser humano o un ratón, tal como un ratón SAMP8 y/o el modelo de ratón 3xTg-AD de AD o dicho animal es el pez cebra.
Un objetivo de la descripción es proporcionar una composición para su utilización en el tratamiento o la prevención de enfermedades neurodegenerativas.
Otro objetivo de la descripción es proporcionar un procedimiento de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en particular de la enfermedad de Alzheimer, mediante el gen o proteína o producto glicánico de 3-O-sulfotransferasa 2 o 4 en tejido, CSF o sangre.
Otro objetivo de la descripción es proporcionar un kit para la implementación de dicho procedimiento de diagnóstico o pronóstico de una enfermedad neurodegenerativa, en particular de enfermedad de Alzheimer.
Otro objetivo de la descripción es proporcionar un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa, en particular de enfermedad de Alzheimer mediante la reducción por un compuesto del nivel de expresión de los genes de 3-OST-2 y/o 3-OST-4 o la inhibición de dichos genes o la actividad de sus productos.
Todavía otro objetivo de la descripción es proporcionar un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa, en particular de enfermedad de Alzheimer, mediante la reducción por un compuesto del nivel de heparán sulfato, en particular de heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados.
Todavía otro objetivo de la descripción es proporcionar un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa, en particular la enfermedad de Alzheimer, mediante la reducción por un compuesto del nivel de heparán sulfato con sulfatación en la posición 3 de los residuos de glucosamina.
Todavía otro objetivo de la descripción es proporcionar un procedimiento de tratamiento o prevención de una enfermedad neurodegenerativa, en particular la enfermedad de Alzheimer, mediante la reducción por un compuesto del nivel de fosforilación de la proteína Tau.
Todavía otro objetivo de la descripción es proporcionar un procedimiento de cribado in vitro para un modulador
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 cuatro elementos seleccionados de entre los siguientes: a-b-c-d, a-b-c-e, a-b-c-f, a-c-d-e, a-c-d-f, a-d-e-f, b-c-d-e, b-c-d-f, c-d-e-f;  Cinco elementos seleccionados de entre los siguientes: a-b-c-d-e, a-b-c-d-f, a-b-d-e-f, a-c-d-e-f;
5  seis elementos seleccionados de entre los siguientes: a-b-c-d-e-f.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una composición para su utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa tal como se ha definido anteriormente, que comprende por lo menos un agente que afecta directa o indirectamente a una actividad y/o un nivel de:
10 a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa -2 y -4, respectivamente, y/o
15 b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa -2 y -4, respectivamente, y/o
c) por lo menos un producto de traducción de dichos genes, en el que dichos productos se indican, 20 respectivamente, en SEC ID nº 2 y 4, y
d) fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total,
y en el que la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad de Alzheimer.
25 Se ha descubierto en el contexto de la presente invención además que la modulación de la actividad y/o nivel de uno o dos enzimas (3-OST-2 y/o 3-OST-4) y/o de heparán sulfato 3-O-sulfatado y/o de la fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total, puede tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer.
30 En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una composición para su utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa tal como se ha definido anteriormente, que comprende por lo menos un agente que afecta directa o indirectamente a una actividad y/o un nivel de:
a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas 35 en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa -2 y -4, respectivamente, y/o
b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 40 3-O-sulfotransferasa -2 y -4, respectivamente, y/o
c) por lo menos un producto de traducción de dichos genes, en el que dichos productos se indican, respectivamente, en SEC ID nº 2 y 4, y
45 d) heparán sulfato, en particular heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados, y
e) fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total,
50 y en el que la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una composición para su utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa tal como se ha definido anteriormente, que comprende por lo menos un agente que afecta directa o indirectamente a una actividad y/o un nivel de:
55 a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
60 b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
c) por lo menos un producto de traducción de dichos genes, en el que dichos productos se indican, 65 respectivamente, en SEC ID nº 2 y 4, y
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c) fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total,
y en la que la enfermedad neurodegenerativa es una tauopatía, en particular la enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una composición para su utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa tal como se ha definido anteriormente, que comprende por lo menos un agente que afecta directa o indirectamente a una actividad y/o un nivel de:
a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y la SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
c) por lo menos un producto de traducción de dichos genes, en el que dichos productos se indican, respectivamente, en SEC ID nº 2 y 4, y
d) heparán sulfato, en particular heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados,
y en el que la enfermedad neurodegenerativa es una enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una composición para la utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa tal como se ha definido anteriormente, en la que dicho agente o agentes seleccionados de entre el grupo que consiste en:
a) un polisacárido o un oligosacárido que presenta un peso molecular de entre aproximadamente 2.000 daltons y aproximadamente 20.000 daltons, preferentemente de aproximadamente 20.000 daltons, en particular un mimético de heparán sulfato, tal como una molécula de F6, D6, D4, E5, CR36, HM 100 o HM 2602 o fucoidan o pentosán polisulfato, o en particular un pentasacárido, tal como Arixtra® (fondaparinux), fucoidan o pentosán polisulfato y/o heparinas de bajo peso molecular tales como enoxaparín (Lovenox®) y/o heparinas de peso molecular ultrabajo, y/o
b) un oligonucleótido, en particular un ARNip, tal como un ARNip seleccionado de entre la lista que consiste en: ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 71 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 72, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 73 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 74, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 75 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 76, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 77 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 78, o un oligonucleótido antisentido morfolino seleccionado de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6 y/o
c) una molécula pequeña, inhibidor de heparina y heparán sulfato, tal como protamina o sulfato de protamina.
Dicho agente o agentes pueden ser polisacáridos u oligosacáridos y estos términos se refieren a la aplicación de competidores oligosacáridos o polisacáridos del producto de los genes mediante administración oral, intravenosa, sublingual y/o nasal. En general, la terapia de glicanos se basa en la utilización de análogos de HS tales como derivados de dextrano de diferentes tamaños y sustituciones tales como los indicados en el documento nº WO00/05270, o derivados de fucoidán de diferentes tamaños, en los que se han introducido carboxilatos y/o sulfatos y/o fracciones hidrofóbicas, y pentosán polisulfato y otros glucosaminoglicanos naturales tales como heparán sulfato, condroitín sulfatos (-A, -B, -C, -D, -E), queratán sulfato (Masato Hasegawa et al., J. Biol. Chem. 272(52):33118-33124, 1997). Dichos glicanos deben actuar como: sustitución molecular del producto del gen diana y/o como moduladores de la actividad endógena de proteínas y/o como competidores del producto del gen diana.
Dichos glicanos pueden administrarse solos o preferentemente asociados con otra terapia, tal como terapia génica. Se ha informado de la producción de polisacáridos o derivados oligosacáridos sulfatados biológicamente activos que pueden mimetizar y/o competir y/o sustituir polisacáridos u oligosacáridos endógenos producto de los genes diana (documento nº WO 00/05270). Entre dichos procedimientos de producción se incluyen la introducción de carboxilatos y/o sulfatos y/o fracciones hidrofóbicas en dextrano, celulosa u otros glicanos o polialcoholes de diferentes tamaños (documento nº WO 00/05270).
Los polisacáridos u oligosacáridos también pueden ser heparina de bajo peso molecular, tal como enoxaparina
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 molécula E5 (preparada a partir de T10) con el grado de sustitución siguiente:
0.5CM, 1.0S
5 en la que CM corresponde a los grupos carboximetilo (50% de un posible contenido de 100% a 150%), S corresponde a grupos sulfato (20% de un posible contenido de 20% a 150%); L-Phe(OMe) se encuentra presente a 0% de 0% a 50% de posibles sustituciones.
 molécula D6 (preparada a partir de T0.5, NHX=L-Phe(OMe)) que presenta el grado de sustitución a 10 continuación:
0,60CM, 0,2L-Phe(OMe), 1,2S
en la que CM corresponde a los grupos carboximetilo (60% de un posible contenido de 120% a 150%), S 15 corresponde a grupos sulfato (20% de un posible contenido de 20% a 150%); L-Phe(OMe) se encuentra presente a 20% de 0% a 50% de posibles sustituciones.
en la que CM corresponde a los grupos carboximetilo (61% de un posible contenido de 70% a 150%), S corresponde a grupos sulfato (15% de un posible contenido de 20% a 150%); L-Phe(OMe) se encuentra 20 presente a 20% de 0% a 50% de posibles sustituciones.
 molécula CR 36 (preparada a partir de T10, NHX=L-Phe(OMe)) que presenta el grado de sustitución a continuación:
25 0,59CM, 0,22L-Phe(OMe), 0,83S
en la que CM corresponde a los grupos carboximetilo (59% de un posible contenido de 83% a 150%), S corresponde a grupos sulfato (22% de un posible contenido de 20% a 150%); L-Phe(OMe) se encuentra presente a 20% de 0% a 50% de posibles sustituciones.
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HM100 (fucoidán) 0,50CM, 0,20Ac, IS (Ac=grupo acetato)
en la que CM corresponde a los grupos carboximetilo (50% de un posible contenido de 100% a 150%), S corresponde a grupos sulfato (100% de un posible contenido de 20% a 150%); los grupos acetato se 35 encuentran presentes en 10% de 0% a 50% de posibles sustituciones.
 HM 2602 (preparado a partir de T40, NHX=bencilamina) que presenta el grado de sustitución siguiente:
0,88CM 0,20 bencilamina 0,66S
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en la que CM corresponde a los grupos carboximetilo (88% de un posible contenido de 20% a 150%), S corresponde a grupos sulfato (66% de un posible contenido de 20% a 150%); los grupos bencilamina se encuentran presentes en 20% de 0% a 50% de posibles sustituciones.
45 El término pentasacárido se refiere a un mimético sintético de heparina constituido por cinco unidades glucosídicas y que se encuentra sulfatado, tal como una parte de heparina que puede unirse a antitrombina.
En particular, dicho pentasacárido es Arixtra® (fondaparinux) con la fórmula a continuación:
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Dicho polisacárido, oligosacárido o pentasacárido pueden competir con heparín sulfato o heparín-sulfato 3-Osulfatado y unirse a la proteína Tau con una mejor afinidad que GAG cerebral endógeno, permitiendo reducir la fosforilación anormal de la proteína Tau.
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De esta manera, dicho polisacárido, oligosacárido o pentasacárido puede utilizarse para tratar tauopatías, así como la enfermedad de Alzheimer.
Dicho polisacárido, oligosacárido o pentasacárido puede administrarse en una dosis comprendida entre aproximadamente 1,5 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg por vía intravenosa o por otra vía, tal como la oral, a una dosis de entre aproximadamente 50 mg/kg y aproximadamente 500 mg/kg, en particular 100 a 200 mg/kg o
i.v. a una dosis apropiada para dichas vías.
En una forma de realización ventajosa, dicho polisacárido, oligosacárido o pentasacárido puede administrarse en una dosis diaria comprendida entre aproximadamente 100 mg y aproximadamente 3,5 g por vía intravenosa o por otra vía, tal como la oral, a una dosis de entre aproximadamente 3,5 g y aproximadamente 50 g, en particular de entre 7,5 y 15 g o i.p. a una dosis apropiada para dichas vías.
Dicho agente o agentes también pueden ser oligonucleótidos y dicho término se refiere a un ARNip que puede interferir con las expresiones de los genes indicados en SEC ID nº 1 y nº 3, tal como los definidos anteriormente, por lo menos un ARNip, por lo menos un ARNhp que comprende una secuencia sentido y una antisentido de un ARNip tal como se ha definido anteriormente, un oligonucleótido antisentido morfolino o una combinación de los anteriormente indicados, que puede silenciar el gen 3-OST-2 o -4 y, de esta manera, modificar o bloquear dicha expresión génica.
De esta manera, la transcripción de dicho gen se reduce en por lo menos 50% del valor original o se bloquea por completo, así como la traducción que conduce de esta manera a una reducción del nivel de 3-OST-2 y -4 y, de esta manera, a una reducción de la proteína Tau fosforilada anormalmente.
El ácido ribonucleico de horquilla pequeña (ARNhp) son moléculas de doble cadena que comprende tanto una cadena sentido como una cadena antisentido de un ARNip, en la que las cadenas sentido y antisentido están unidas mediante un conector. Dichas moléculas forman una horquilla y el conector se elimina para permitir la liberación de un ARNip.
En una forma de realización ventajosa, dicho ARNhp se encuentra comprendido en un vector, en el que dicho vector comprende secuencias de ácidos nucleicos que permiten la expresión de dicho ARNhp.
En formas de realización ventajosas, el procedimiento comprende la aplicación de procedimientos conocidos de por sí de terapia génica y/o tecnología de ácidos nucleicos antisentido para administrar dicho agente o agentes. En general, la terapia génica incluye varios enfoques: la sustitución molecular de un gen mutado, la edición de un nuevo gen que resulta en la síntesis de una proteína terapéutica y la modulación de la expresión génica celular endógena mediante procedimientos de expresión recombinante o con fármacos. Las técnicas de transferencia génica se encuentran descritas en detalle (ver, p.ej., Behr, Acc. Chem. Res. 26: 274-278, 1993, y Mulligan, Science 260: 926-931, 1993) y entre ellas se incluyen técnicas de transferencia génica directa utilizando vectores biológicos (tales como virus recombinantes, especialmente retrovirus y lentivirus) o liposomas modelo, o técnicas basadas en la transfección con la coprecipitación de ADN con policationes, la perturbación de la membrana celular por medios químicos (solventes, detergentes, polímeros y enzimas) o físicos (mecánicos, osmóticos, térmicos y descargas eléctricas) o péptidos penetradores de la membrana celular. La transferencia génica postnatal al sistema nervioso central se ha descrito en detalle (ver, p.ej., Wolff, Curr. Opin. Neurobiol. 3:743-748, 1993).
En particular, la descripción proporciona procedimientos de evaluación o prevención de una enfermedad neurodegenerativa mediante terapia de ácidos nucleicos antisentido, es decir, la regulación negativa de un gen inapropiadamente expresado o defectuoso mediante la introducción de ácidos nucleicos antisentido o derivados de los mismos en determinadas células críticas (ver, p.ej., Gillespie, DN&P 5: 389-395, 1992; Agrawal y Akhtar, Trends Biotechnol 13: 197-199, 1995; Crooke, Biotechnology 10: 882-6, 1992). Aparte de las estrategias de hibridación, la aplicación de ribozimas, es decir, moléculas de ARN que actúan como enzimas, destruyendo el ARN que porta el mensaje de enfermedad, también han sido descritas (ver, p.ej., Barinaga, Science 262: 15121514, 1992). En formas de realización preferidas, los ácidos nucleicos antisentido terapéuticos o derivados de los mismos dirigidos contra transcritos de un gen codificante de HS3ST2 y/o HS3ST4. Resulta preferente que las células del sistema nervioso central, preferentemente el cerebro, de un sujeto tratado de esta manera. La penetración celular puede llevarse a cabo mediante estrategias conocidas, tales como el acoplamiento de ácidos nucleicos antisentido y derivados de los mismos con partículas portadoras, o las técnicas anteriormente indicadas. Las estrategias para administrar oligodesoxinucleótidos terapéuticos dirigidos son conocidas por el experto en la materia (ver, p.ej., Wickstrom, Trends Biotechnol. 10:281-287, 1992). En algunos casos, la administración puede llevarse a cabo mediante la simple aplicación intracraneal (intraventricular). Los enfoques adicionales están dirigidos a la expresión intracelular de ARN antisentido. En la presente estrategia, las células se transforman ex vivo con un gen recombinante que dirige la síntesis de un ARN que es complementario a una región de ácidos nucleicos diana. La utilización terapéutica de ARN antisentido expresado intracelularmente es procedimentalmente similar a la terapia génica. Un procedimiento recientemente desarrollado de regulación de la
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expresión intracelular de los genes mediante la utilización de ARN de doble cadena, también conocido como ARN de interferencia (ARNi), puede ser otro enfoque eficaz para la terapia de ácidos nucleicos (Hannon, Nature
418: 244-251).
El tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, tal como la enfermedad de Alzheimer o una tauopatía diferente de la enfermedad de Alzheimer, puede, de esta manera, llevarse a cabo mediante terapia génica, mediante la administración de dicho oligonucleótido mediante un vector o un exosoma (van den Boorn J.G. et al., Nat. Biotechnol. 29(4):325-6, abril de 2011).
El tratamiento de la enfermedad de Alzheimer también puede llevarse a cabo mediante una doble terapia que comprende como primera terapia, la terapia génica, y como segunda terapia, la protección del medio extracelular inductor de la recuperación celular mediante un mimético de heparina.
Dicho oligonucleótido puede administrarse a una dosis comprendida entre 0,1 y 1 mM, en particular 0,5 mM, por vía intravenosa o intraventricular.
Dicho oligonucleótido también puede administrarse por otra vía, tal como oral, i.p., a una dosis apropiada para dichas vías.
Dicho agente o agentes también pueden ser una molécula pequeña, y mediante dicha expresión debe entenderse una molécula que puede inhibir las actividades de la heparina y del heparán sulfato, los cuales inhiben la capacidad de la heparina de inducir el cambio conformacional de la proteína Tau que conduce a la fosforilación anormal de la proteína Tau.
La protamina o sulfato de protamina son proteínas nucleares pequeñas ricas en arginina y son antagonistas de la heparina con una acción inmediata tras la administración intravenosa.
En la presente forma de realización pueden utilizarse otros inhibidores de la 3-O-sulfatación o inhibidores de sulfotransferasas del heparán sulfato, en particular los indicados en Razi N. et al., (J. Biol. Chem. 270:11267-75, 1995); en Rath V. L.et al. (Drug Discov. Today 9:1003-11, 2004) o en Seko A.et al. (J. Inorg. Biochem. 103:10616, 2009).
También pueden utilizarse inhibidores de heparán sulfato y heparán sulfato sulfotransferasas descritas en el documento nº US2010/0048638.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a una composición para la utilización en el tratamiento o la prevención de una enfermedad neurodegenerativa tal como se ha definido anteriormente, en la que dicho agente o agentes seleccionados de entre el grupo que consiste en:
a) un mimético de heparán sulfato de fórmula (I) definido anteriormente, en particular un mimético de heparán sulfato de fórmula (II), en particular una molécula F6, CR36, HM 100 o HM 2602 o fucoidán o pentosán polisulfato, o un pentasacárido, tal como Arixtra® (fondaparinux), fucoidán o pentosán polisulfato y/o heparinas de bajo peso molecular, tales como enoxaparín (Lovenox®) y/o heparinas de peso molecular ultrabajo, y/o
b) un ARNip, tal como un ARNip seleccionado de entre la lista que consiste en: ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 71 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 72, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 73 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 74, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 75 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 76, ARNip sentido expuesto mediante SEC ID nº 77 y ARNip antisentido expuesto mediante SEC ID nº 78, o un oligonucleótido antisentido morfolino seleccionado de entre el grupo que consiste en SEC ID nº 5 y SEC ID nº 6 y/o
c) una molécula pequeña, inhibidor de las actividades de la heparina y del heparán sulfato, seleccionado de entre el grupo que consiste en protamina o sulfato de protamina.
En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico o seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o determinar si un sujeto presenta un riesgo incrementado de desarrollar dicha enfermedad neurodegenerativa, que comprende determinar el nivel y/o actividad de:
a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las
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dicha molécula de proteína y un anticuerpo antiproteína mediante la utilización de marcajes enzimáticos, cromodinámicos, radioactivos, magnéticos o luminiscentes que se unen al anticuerpo antiproteína o a un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo antiproteína. Además, pueden utilizarse otros ligandos de alta afinidad. Entre los inmunoensayos que pueden utilizarse se incluyen, p.ej., ELISA, transferencias western y otras técnicas conocidas por el experto ordinario en la materia (ver Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999 y Edwards R, Immunodiagnostics: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford; Inglaterra, 1999). La totalidad de dichas técnicas de detección puede utilizarse en el formato de micromatrices, matrices de proteínas, micromatrices de anticuerpos, micromatrices de tejidos, biochip electrónico o tecnologías basadas en chip de proteínas (ver Schena M., Microarray Biochip Technology, Eaton Publishing, MA, 2000).
En una forma de realización ventajosa, se compara el nivel o la actividad, o ambas, dicho nivel y dicha actividad, de (i) un producto de transcripción de un gen codificante de HS3ST2 y/o HS3ST4 y/o de (ii) un producto de traducción de un gen codificante de HS3ST2 y/o HS3ST4 y/o de (iii) un fragmento o derivado o variante de dicho producto de transcripción o traducción, y/o de (iv) un producto glicánico, o un fragmento de dicho producto glicánico, procedente del producto de traducción del gen codificante de HS3ST2 y/o SH3ST4 en una serie de muestras obtenida de dicho sujeto durante un periodo de tiempo, con el fin de monitorizar la progresión de dicha enfermedad. En formas de realización preferidas adicionales, dichos sujetos reciben un tratamiento antes de una
o más de dichas recolecciones de muestras. En todavía otra forma de realización preferida, dicho nivel y/o actividad se determina antes y después de dicho tratamiento de dicho sujeto.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro tal como se ha definido anteriormente, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una tauopatía, incluyendo la enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una tauopatía tal como se ha definido anteriormente, y en la que el nivel de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 10% respecto a un valor de referencia respectivo.
El valor de referencia se proporciona mediante un valor obtenido de pacientes que no sufren de una tauopatía u otra enfermedad neurodegenerativa o una enfermedad que afecta al nivel de fosforilación anormal de la proteína Tau.
El valor de referencia puede adoptar una diversidad de formas. Puede ser un único valor de corte, tal como, por ejemplo, una mediana o una media o el percentil 75, 90, 95 o 99 de una población. Puede establecerse basándose en grupos comparativos, tales como en los que el riesgo en un grupo definido es el doble del riesgo en otro grupo definido. Puede ser un intervalo, por ejemplo en que la población sometida a ensayo se divide igualmente (o desigualmente) en grupos, tales como un grupo de bajo riesgo, un grupo de riesgo intermedio y un grupo de alto riesgo, o en cuartiles, en donde el cuartil más bajo son individuos con el riesgo más bajo y el cuartil más alto son individuos con el riesgo más alto.
El valor predeterminado puede variar entre poblaciones particulares seleccionadas según sus hábitos, etnicidad, genética, etc.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 20% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 30% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 40% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 50% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 60% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 70% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 80% respecto a dicho valor de referencia.
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En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 90% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, la fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 100% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o la actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau en comparación con dicho valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% y el nivel y/o la actividad de proteína Tau total en comparación con dicho valor de referencia respectivo se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico o seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o determinar si un sujeto presenta un riesgo incrementado de desarrollar dicha enfermedad neurodegenerativa, que comprende determinar el nivel y/o actividad de:
a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3 y codificante de heparán sulfato glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y/o
c) por lo menos un producto de traducción de dichos genes, en el que dichos productos se indican, respectivamente, en SEC ID nº 2 y nº 4, y/o
d) un fragmento o derivado o variante de dicho gen o de dicho producto de transcripción o traducción, y/o
e) heparán sulfato, en particular heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacárido de heparán sulfato 3-O-sulfatados, y/o
f) fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total,
en una muestra de líquido biológico obtenida anteriormente de dicho sujeto y que compara dicho nivel y/o dicha actividad con un valor de referencia respectivo que representa una enfermedad o estado de salud conocido, un nivel y/o actividad incrementado de por lo menos uno de entre dicho gen y/o dicho producto de transcripción y/o dicho producto de traducción y/o dicho heparán sulfato, en particular en el que dicho heparán sulfato 3-Osulfatado y/o dicha fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de proteína Tau total en la muestra del sujeto es indicativa de enfermedad neurodegenerativa o de un riesgo de desarrollar dicha enfermedad neurodegenerativa, ventajosamente una tauopatía, en particular la enfermedad de Alzheimer, con la condición de que dicha enfermedad neurodegenerativa no sea una enfermedad priónica, y con la condición de que dicha actividad y/o nivel determinado es uno de entre:
heparán sulfato o
de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o proteína Tau total,
por lo tanto, se determinan los niveles de heparán sulfato y/o los niveles de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total, o ambos, o
también se determina la actividad y/o nivel de por lo menos otro elemento seleccionado de entre dicho gen, dicho producto de transcripción de dichos genes, dicho producto de traducción de dichos genes, o dicho fragmento o derivado o variante de dicho gen o dicho producto de transcripción o traducción.
De esta manera, en la presente forma de realización, a continuación se listan varios casos que pueden producirse, es decir, dicha determinación de la actividad y/o del nivel consiste en:
 únicamente un elemento seleccionado de entre: a), b), c) o d); ello implica que la actividad y/o nivel de sólo e) o sólo f), por lo tanto, resulta excluido,
 dos elementos seleccionados de entre las parejas siguientes: a-b, a-c, a-d, a-e, a-f, b-c, b-d, b-e, b-f, c-d, c-e, c-f, d-e, d-f, o e-f;
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En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 300% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 400% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro tal como se ha definido anteriormente, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer y en el que dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 100 % según determinación mediante PCR en tiempo real.
En dicha forma de realización, únicamente participa el gen de 3-OST-4 en la enfermedad; el nivel del gen de 3-OST-2 se mantiene sustancialmente sin cambios.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 200% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 300% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 400% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer tal como se ha definido anteriormente y en el que dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En la presente forma de realización, tanto el gen de 3-OST-2 como el gen de 3-OST-4 participan en la enfermedad.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y dicho nivel del producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 200% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y dicho nivel del producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 300% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y dicho nivel del producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 400% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 200% según determinación mediante PCR en tiempo real y dicho nivel del producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 200% según determinación mediante PCR en tiempo real y dicho nivel del producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 200% según determinación mediante PCR en tiempo real.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 200% según determinación mediante PCR en tiempo
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En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 90 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
El valor basal en el CSF humano de 3-OST-2 es de 60 pg/ml.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a dicho nivel basal se encuentra incrementado en por lo menos 60 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica en el CSF.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a dicho nivel basal se encuentra incrementado en por lo menos 70 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica en el CSF.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a dicho nivel basal se encuentra incrementado en por lo menos 80 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica en el CSF.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a dicho nivel basal se encuentra incrementado en por lo menos 90 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica en el CSF.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 respecto a dicho nivel basal se encuentra incrementado en por lo menos 100 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica en el CSF.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer tal como se ha definido anteriormente y en el que dicho nivel de producto de transcripción del gen y expuesto en la SEC ID nº 4 se encuentra incrementado en por lo menos 50% según determinación mediante procedimientos de transferencia Western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 60 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 70 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 80 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 90 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
El valor basal en el CSF humano de 3-OST-4 es de 60 pg/ml.
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En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 90 % y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 90 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 90 % y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 50 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 60 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 70 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 80 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 90 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 2 en comparación con un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100% y dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 respecto a un valor de referencia se encuentra incrementado en por lo menos 100 % según determinación mediante procedimientos de transferencia western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica.
En una forma de realización ventajosa, dicho valor de referencia de 3-OST-2 es el valor basal de 3-OST-2 en el CSF humano y es de 60 pg/ml y dicho valor de referencia de 3-OST-4 es el valor basal de 3-OST-2 en el CSF humano y es de 60 pg/ml.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, en el que
dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y/o
dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y/o
dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante SEC ID nº 2 se encuentra incrementado en por lo menos 50% y/o dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 se encuentra incrementado en por lo menos 50% según determinación mediante procedimientos de transferencia Western,
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ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica tal como se ha definido anteriormente, que comprende determinar además el nivel y/o actividad de heparán sulfato, un incremento de por lo menos 50% de dicho nivel y/o actividad en comparación con un valor de referencia indicativo de enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 60% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 70% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 80% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 90% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 100% respecto a dicho valor de referencia.
El nivel basal de heparán sulfato en un hipocampo humano de control es de aproximadamente 0,5 µg/mg de tejido húmedo según determinación mediante el ensayo de azul de dimetilmetileno (DMMB) (Huynh et al., Neurobiol Aging. 33(5):1005.e11-22, 2012).
Considerando que dicho valor de referencia es dicho nivel basal, de esta manera dicho nivel en la enfermedad de Alzheimer se encuentra incrementado en por lo menos 50% en el hipocampo y en el córtex.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 60% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo y en el córtex.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 70% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo y en el córtex.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 80% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo y en el córtex.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 90% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo y en el córtex.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementado en 100% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo y en el córtex.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, en el que
dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y/o
dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y/o
dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante SEC ID nº 2 se encuentra incrementado en por lo menos 50% y/o dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 se encuentra incrementado en por lo menos 50% según determinación mediante procedimientos de transferencia Western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica tal como se ha definido anteriormente, que comprende determinar además el nivel y/o actividad de heparán sulfato, que puede unirse a la proteína Tau, un incremento de por lo menos 50% de dicho nivel y/o actividad en comparación con un valor de referencia indicativo de enfermedad de Alzheimer.
Varios glucosaminoglicanos sulfatados y miméticos pueden unirse a Tau; entre ellos se incluyen heparán sulfatos, condroitín sulfato, queratán sulfato y otros polisacáridos sulfatados de síntesis química como dextrán sulfato y pentosán sulfato.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra adicionalmente incrementada en 60% respecto a dicho valor de referencia.
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En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra adicionalmente incrementado en 90% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
5 En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra adicionalmente incrementado en 100% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra adicionalmente incrementado en 110% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
10 En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra adicionalmente incrementado en 120% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra 15 adicionalmente incrementado en 130% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra adicionalmente incrementado en 140% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
20 En una forma de realización ventajosa, el nivel y/o actividad de heparán sulfato 3-O-sulfatado se encuentra adicionalmente incrementado en 150% respecto al nivel y/o actividad basal en el hipocampo.
En una forma de realización ventajosa, dicho heparán sulfato 3-O-sulfatado se selecciona de entre formas de unidad de GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S trisulfatado y de GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S6S tetrasulfatado que
25 corresponden a ΔUA2S-GlcNS3S y ΔUA2S-GlcNS3S6S obtenidos tras la digestión de heparán sulfatos por las heparinasas I, II y III y el líquido biológico es CSF. También pueden utilizarse procedimientos químicos, tales como el tratamiento con ácido nitroso (Huynh et al., Neurobiol Aging. 33(5):1005.E11-22, 2012) para producir disacáridos HS.
30 Una estructura representativa de heparán sulfato 3-O-sulfatado es la siguiente:
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La fosforilación anormal de proteína Tau se produce tras los cambios conformacionales inducidos por HS 3-O
35 sulfatado y la formación de HS GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S6S (unidad tetraS) y GlcA2S/IdoA2S-GlcNS3S (unidad triS) en cerebros de pacientes de AD precede al suceso de fosforilación y, de esta manera, se encuentran estas especies en CSF de pacientes de AD.
Deben encontrarse ausentes o presentes a niveles inferiores que en la AD en otras tauopatías en las que la
40 fosforilación anormal es el resultado de mutaciones en el gen de la proteína Tau. De esta manera, la detección de los disacáridos TetraS y TriS puede utilizarse para el diagnóstico y/o pronóstico diferencial de tauopatías y AD, incluyendo aquellas con fosforilación de Tau dependiente de mutación.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que 45 dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, en el que
dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante SEC ID nº 1 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y/o
50 dicho nivel de producto de transcripción del gen expuesto mediante SEC ID nº 3 se encuentra incrementado en por lo menos 100% según determinación mediante PCR en tiempo real y/o
dicho nivel de producto de traducción del gen expuesto mediante SEC ID nº 2 se encuentra incrementado en por lo menos 50% y/o dicho nivel del producto de traducción del gen expuesto mediante la SEC ID nº 4 se encuentra
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incrementado en por lo menos 50% según determinación mediante procedimientos de transferencia Western, ELISA, espectrometría de masas o inmunohistoquímica, y/o el nivel y/o actividad de heparán sulfato se encuentra incrementado en por lo menos 50% respecto a un valor de referencia, tal como se ha definido anteriormente, que comprende determinar además el nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total, un incremento de por lo menos 10% respecto al valor de referencia respectivo, que es indicativo de enfermedad de Alzheimer.
En la enfermedad de Alzheimer, el nivel de fosforilación anormal de proteína Tau se encuentra incrementado, así como el nivel de proteína Tau total.
Por lo tanto, determinar el nivel de fosforilación anormal de proteína Tau o de proteína Tau total o ambos permite el diagnóstico o pronóstico o seguimiento de la enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 20% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 30% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 40% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 50% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 60% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 70% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 80% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 90% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 20% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 30% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 40% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 50% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 60% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 70% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 80% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 90% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 100% respecto a dicho valor de referencia.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de proteína A se
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encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% respecto a dicho valor de referencia, y dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% respecto a dicho valor de referencia.
La presente descripción muestra resultados en los que el enzima 3-OST-2 se encuentra presente en CSF de los pacientes de AD y que los niveles de la proteína se correlacionan con los niveles de Tau hiperfosforilado en las mismas muestras de CSF. Lo anterior demuestra que el enzima puede, al igual que la proteína Tau, encontrarse en el espacio extracelular y, de esta manera, pasar al CSF y confirma que la medida de sus niveles o la medida de su actividad puede utilizarse como marcador diagnóstico y/o pronóstico de AD.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, tal como se ha definido anteriormente, en la que dicho líquido biológico es CSF y dicha actividad y/o nivel de:
a) por lo menos un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3 y codificante de heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa 2 y 4, respectivamente, y
b) por lo menos un producto de transcripción de un gen seleccionado de entre el grupo que consiste en las secuencias nucleótidas indicadas en SEC ID nº 1 y SEC ID nº 3 y codificantes de una heparín glucosamina 3-O-sulfotransferasa, y
c) dicho producto de traducción de dichos genes, en el que dichos productos se indican, respectivamente, en SEC ID nº 2 y nº 4, y
d) heparán sulfato, en particular heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados, y
d) dicha actividad y/o nivel de fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total,
se encuentra incrementado en dicho sujeto respecto a dicho valor de referencia respectivo.
Debe indicarse que el incremento del nivel y/o actividad de dicho gen y dicho producto de transcripción de dicho gen y dicho producto de traducción de dicho gen y HS podrían encontrarse incrementados antes del incremento de la fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total.
En la enfermedad de Alzheimer, no sólo se encuentra implicada la fosforilación anormal de la proteína Tau sino también los genes de 3-OST-2 y/o de 3-OST-4, por lo menos uno de los productos de transcripción de dichos genes, por lo menos uno de los productos de traducción de dichos genes, heparán sulfato y en particular heparán sulfato que puede unirse a proteína Tau, especialmente heparán sulfato 3-O-sulfatado.
Lo anterior permite realizar un diagnóstico y/o pronóstico diferencial entre tauopatías.
La detección de la fosforilación anormal de la proteína Tau y por lo menos otro nivel y/o actividad incrementado de los otros constituyentes indicados anteriormente permite, de esta manera, el diagnóstico y/o pronóstico de la enfermedad de Alzheimer.
Son ejemplos de la descripción que demuestran que los enzimas responsables de la sulfatación específica de HS (3-OST-2 y 4) se encuentran incrementados en cerebros de AD y CSF y que HS derivado de dichas actividades enzimáticas participa en la fosforilación anormal de Tau in vitro e in vivo. Los ejemplos también muestran que los grupos 3-O-sulfatados en la heparina pueden inducir la fosforilación anormal de Tau in vitro.
Los ejemplos muestran particularmente que la fosforilación de la proteína Tau por GSK-3β es dependiente de la presencia de grupos 3-O-sulfato en los polisacáridos u oligosacáridos utilizados en el medio de reacción de quinasa. Además, la presente descripción muestra que no es el enzima GSK-3β que se une a cualquiera de los heparinoides utilizados, sino la proteína Tau misma, sugiriendo la existencia de cambios conformacionales que permiten la exposición de los sitios fosforilados a la actividad de la quinasa. De esta manera, HS 3-O-sulfatado interactúa con la proteína Tau, regulando su fosforilación en presencia de la quinasa.
Debe indicarse que dicha actividad y/o nivel también puede ser un fragmento o derivado o variante de dicho gen
o de dicho producto de transcripción o traducción.
El valor basal en el CSF humano para pTau es aproximadamente igual o inferior a 60 pg/ml y para Tau total es aproximadamente igual o inferior a 450 pg/ml.
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En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 20% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 30% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 40% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 50% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 60% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 70% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 80% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 90% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 100% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 10% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 20% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de la proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 30% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 40% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 50% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 60% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 70% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 80% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 90% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 100% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de proteína A se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% respecto a dicho valor basal, y dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% respecto a dicho valor basal.
En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es una tauopatía, en particular la enfermedad de Alzheimer, tal como se ha definido anteriormente, en la que dicho líquido biológico es CSF y dicha actividad y/o nivel de:
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a) heparán sulfato, en particular heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados, y
5 b) fosforilación anormal de la proteína Tau y/o de la proteína Tau total,
se encuentran incrementados en dicho sujeto en comparación con dicho valor de referencia respectivo, en particular en por lo menos 10% y dicho heparán sulfato puede unirse a dicha proteína Tau fosforilada y/o Tau total en una proporción de por lo menos 10%.
10 Los inventores todavía adicionalmente han encontrado que en tauopatías, en particular la enfermedad de Alzheimer, la actividad y/o nivel de heparán sulfato, en particular de heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados y uno de entre fosforilación anormal de la proteína Tau y/o proteína Tau total no sólo se encuentran incrementados en el CSF sino también el HS presentes en el
15 CSF presenta una capacidad alta de unirse a Tau total, siendo de esta manera representativo de dichas tauopatías, en particular de enfermedad de Alzheimer.
En una forma de realización ventajosa,
20 dicho nivel y/o actividad de fosforilación anormal de proteína Tau se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% en comparación con dicho valor basal y dicho nivel y/o actividad de proteína Tau total se encuentra incrementado en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% respecto a dicho valor basal, y dicha actividad y/o nivel de heparán sulfato, en particular de heparán sulfato 3-O-sulfatado, especialmente disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados, se encuentran
25 incrementados en por lo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100% respecto a dicho valor basal, y dicha proporción de HS que puede unirse a proteína Tau fosforilada y/o Tau total se encuentra comprendida entre 10% y 100%, en particular es de por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 100%.
30 En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, tal como se ha definido anteriormente, en el que dicho líquido biológico es plasma y en el que el heparán sulfatado es un disacárido de heparán sulfato 3O-sulfatado de la glucosamina obtenida tras la digestión con las heparinasa I, II y III (I-III) del heparán sulfato.
35 Dichos disacáridos de heparán sulfato 3-O-sulfatados obtenidos mediante digestión con las heparinasas I, II y III corresponden, por ejemplo, a los compuestos siguientes, sin limitación a los mismos:
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Otra ventaja de la descripción es proporcionar un procedimiento in vitro de diagnóstico o pronóstico o seguimiento de una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto, o determinar si un sujeto se encuentra en 5 riesgo incrementado de desarrollar dicha enfermedad neurodegenerativa, que puede implementarse muy fácilmente en una muestra de plasma que resulta más fácil de recolectar que una muestra de CSF.
En una forma de realización ventajosa, por lo menos uno de los disacáridos seleccionados de la lista anteriormente definida se encuentra presente en el plasma del paciente que presenta enfermedad de Alzheimer; 10 en particular, por lo menos uno de los dos disacáridos seleccionados posteriormente se encuentra presente en dicho plasma.
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15 En una forma de realización ventajosa, la presente descripción se refiere a un procedimiento in vitro en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer, tal como se ha definido anteriormente, en el que dicho líquido biológico es plasma, dicho derivado de producto de traducción es un producto de degradación del heparán sulfato (glucosamina) 3-O-sulfotransferasa 2 y/o 4, y dicho heparán sulfato es un disacárido de heparán sulfato 3-O-sulfatado obtenido tras la digestión con heparinasa I-III del heparán sulfato,
20 encontrándose incrementados ambos niveles, tanto de dicho derivado de producto de traducción como dicho nivel y/o actividad de disacárido de heparán sulfato 3-O-sulfatado respecto a un valor de referencia o valor basal y siendo indicativos de enfermedad de Alzheimer.
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