ES2676027T3 - Estabilización de polímeros de soluciones de cromógeno - Google Patents

Abstract

Una composición para inmunohistoquímica cromogénica que comprende en una solución: a) una solución acuosa tamponada, b) un cromógeno de diaminobencidina (DAB), c) un estabilizador, y d) un polímero de polietilenimina soluble en la solución acuosa tamponada, en la que la precipitación del cromógeno DAB de la solución se reduce en condiciones de envejecimiento acelerado con respecto a una composición similar que no comprende el polímero de polietilenimina, en la que el estabilizador es metabisulfito sódico o bisulfito sódico.

Description

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DESCRIPCIÓN

Estabilización de polímeros de soluciones de cromógeno Campo

La presente divulgación se refiere a modos de realización de una composición, un kit y modos de realización de un procedimiento para usar dichas composiciones, útiles para un procedimiento de tinción de tejidos en el que la composición comprende un cromógeno de diaminobencidina (DAB) (y/o derivados de la misma) y un polímero capaz de reducir o eliminar sustancialmente la precipitación del cromógeno.

Antecedentes

Ciertas soluciones de cromógeno DAB comercialmente disponibles (por ejemplo, solución OPTIVIEW® DAB, Ventana Medical Systems Inc., Tucson, AZ) están estabilizadas frente a la oxidación. El metabisulfito sódico, por ejemplo, se ha usado como una solución estabilizante a concentraciones que no inhiben significativamente la tinción de tejidos con DAB. Sin estar limitado a una teoría de operación particular, se cree (basado en el análisis elemental) que este antioxidante forma una sal de hidrogenosulfato de DAB insoluble. Esta sal de hidrogenosulfato de DAB tiene baja solubilidad acuosa y precipita fácilmente de la solución. El proceso propuesto se ilustra a continuación.

imagen1

Se sabe que los cromógenos de tetrametilbencidina (TMB) se asocian con el sulfato de dextrano. El sulfato de dextrano puede mantener los productos oxidados de TMB solubles en los procesos normalmente utilizados para precipitar los productos de cromógeno TMB en solución y también facilitar el depósito de TMB en el Western blot. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 83, pp. 9085-9089: “Use of nonisotopic M13 probes for genetic analysis - Application to HLV class II loci”, el documento US4789630 - «Ionic compounds containing the cationic meriquinone of a benzidine» y el documento US5013646 o el documento WO199100667 - “TMB formulation for soluble and precipitable HRP-ELISA”]. El documento WO2010/077870 divulga formulaciones acuosas estabilizadas de DAB y su uso en inmunohistoquímica, en el que la DAB se estabiliza frente a la precipitación en condiciones de almacenamiento usando polímeros de polioles orgánicos tales como propilenglicol (PG) o un azúcar tal como sulfato de dextrano.

Todavía existe una necesidad en la técnica, sin embargo, de abordar el problema de la precipitación de sulfato de DAB antes de la oxidación de la DAB en procedimientos de tinción de tejidos.

Sumario

La presente divulgación se refiere a una composición, un procedimiento para detectar una diana en una muestra de tejido con dicha composición y un kit para inmunohistoquímica cromogénica. La composición comprende un cromógeno DAB a una concentración suficiente y con estabilidad suficiente para ser utilizado como un cromógeno para la detección de dianas en inmunohistoquímica. Una estabilidad suficiente incluye estabilidad durante el almacenamiento de modo que, después de largos períodos de tiempo (por ejemplo, 6 meses, 12 meses, 18 meses y 24 meses), la solución de cromógeno se puede utilizar para detectar dianas en muestras de tejido sin una disminución significativa de la señal en comparación con la misma solución de cromógeno recién preparada. Una estabilidad suficiente también incluye una inestabilidad suficiente para que, cuando se use en la detección, precipite suficiente cromógeno para detectar las dianas en una muestra de tejido.

La composición para inmunohistoquímica cromogénica incluye una solución acuosa tamponada, un cromógeno DAB, metabisulfito sódico o bisulfito sódico como estabilizador y un polímero de polietilenimina soluble en solución acuosa tamponada. El polímero reduce la precipitación de DAB de la solución en condiciones de envejecimiento acelerado con respecto a una solución similar que no incluye el polímero.

En un modo de realización, el polímero es una polietilenimina lineal o ramificada.

En modos de realización ilustrativos, una composición para inmunohistoquímica cromogénica incluye un

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intensificador seleccionado del grupo que consiste en imidazol, 2-hidroxipiridina y combinaciones de los mismos.

En un modo de realización, el polímero reduce la precipitación de DAB en aproximadamente un 10 % a aproximadamente un 100 % en condiciones de envejecimiento acelerado con respecto a la composición que no incluye el polímero, determinada mediante HPLC en un estudio de envejecimiento acelerado a 45 °C o mediante cribado de polímeros usando KHSO4. En otro modo de realización, el polímero reduce la precipitación de DAB en condiciones de envejecimiento acelerado con respecto a la composición que no incluye el polímero mientras precipita de manera equivalente a la composición que no incluye el polímero en condiciones de detección. De manera ilustrativa, la precipitación equivalente incluye generar una desviación estadísticamente no significativa de la intensidad de tinción observada promedio, según lo determinado por un lector cualificado, en comparación con la composición que no incluye el polímero. Además, de manera ilustrativa, el polímero está configurado para formar un complejo con el cromógeno DAB para mantener la solubilidad del cromógeno DAB en el disolvente. En un modo de realización, el estabilizador y el polímero evitan sustancialmente que el cromógeno DAB se descomponga y/o se oxide en condiciones de almacenamiento.

En modos de realización ilustrativos, una composición para detección por inmunohistoquímica cromogénica incluye un cromógeno DAB, un intensificador, un estabilizador y un polímero; en el que el intensificador es imidazol o 2- hidroxipiridina, el estabilizador es metabisulfito sódico o bisulfito sódico y el polímero es polietilenimina, en el que la solución de detección está configurada para permanecer estable en condiciones de almacenamiento de modo que el polímero compleje el cromógeno DAB o un producto del mismo de manera que se mantenga la cantidad de cromógenos DAB en la solución; en el que la solución de detección está configurada de modo que la DAB precipite en condiciones de detección para producir una señal adecuada para inmunohistoquímica cromogénica.

En otro modo de realización, la composición comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 15 mM de 3,3'- diaminobencidina, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM de imidazol, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mM de 2-hidroxipiridina, de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 mM de metabisulfito sódico y de aproximadamente un 0,05 % a aproximadamente un 0,5 % (m/m) de polietilenimina.

Un procedimiento para detectar una diana en una muestra de tejido con un cromógeno DAB incluye poner en contacto la muestra de tejido con un resto de unión específica en el que el resto de unión específica es específico para la diana, marcar el resto de unión específica con un conjugado enzimático, poner en contacto la muestra de tejido con una solución de cromógeno en la que la solución de cromógeno comprende DAB o un derivado de la misma, el estabilizador y el polímero configurado para reducir la precipitación de DAB en condiciones de almacenamiento pero manteniendo la precipitación en condiciones de detección, poner en contacto la muestra de tejido con un oxidante, en el que una reacción entre el oxidante, la solución de cromógeno y el conjugado enzimático hace que la DAB se deposite proximalmente a la diana, poner en contacto la muestra de tejido con un contratinte y detectar la diana en la muestra de tejido localizando el cromógeno DAB. En un modo de realización, la muestra de tejido es una muestra de tejido incluida en parafina y fijada en formol. En otro modo de realización, las condiciones de almacenamiento incluyen un recipiente de almacenamiento sellado que no está en comunicación fluida con otros reactivos y las condiciones de detección incluyen el oxidante y la composición para inmunohistoquímica cromogénica depositada en la muestra de tejido y en contacto con la enzima. En otro modo de realización, el resto de unión específica es un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico. En otro modo de realización más, marcar el resto de unión específica incluye detectar un hapteno seleccionado entre un oxazol, un pirazol, un tiazol, un compuesto de nitroarilo distinto de dinitrofenilo, un benzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un rotenoide, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo o una benzodiazepina con un conjugado enzimático que incluye un anticuerpo anti-hapteno específico para el hapteno. En diversos modos de realización, el hapteno se selecciona entre HQ, DIG, DNP, TS, NP, DCC y biotina. En un modo de realización, la enzima es una peroxidasa. Por ejemplo, la enzima es peroxidasa de rábano picante. En otros modos de realización más, poner en contacto la muestra de tejido con una solución de cromógeno comprende añadir a la muestra de tejido una primera solución componente que comprende la DAB o un derivado de la misma, una segunda solución componente que comprende el estabilizador y una tercera solución componente que comprende el polímero para formar la solución de cromógeno mientras está en contacto con la muestra de tejido. En modos de realización adicionales, el procedimiento incluye poner en contacto la muestra de tejido con una composición de DAB como se describe en el presente documento.

En modos de realización ilustrativos, un procedimiento para detectar una diana en una muestra de tejido incluida en parafina y fijada en formol incluye poner en contacto la muestra de tejido con un anticuerpo haptenilado, poner en contacto la muestra de tejido con un conjugado enzimático que comprende un anticuerpo anti-hapteno y peroxidasa de rábano picante, poner en contacto la muestra de tejido con una composición de cromógeno en el que la composición de cromógeno comprende un cromógeno DAB o derivado del mismo, un intensificador seleccionado entre imidazol, 2-hidroxipiridina y combinaciones de los mismos, metabisulfito sódico y polietilenimina, poner en contacto la muestra de tejido con hidrógeno peroxidasa, poner en contacto la muestra de tejido con un contratinte de hematoxilina y detectar la diana en la muestra de tejido. En modos de realización ilustrativos adicionales, un kit para detección cromogénica de muestras de tejido incluye un cromógeno DAB, un intensificador, el estabilizador y polietilenimina como el polímero capaz de reducir o prevenir la precipitación de DAB con respecto a una composición que no incluye el polímero, el cromógeno DAB y el polímero envasado en un primer dispensador o botella. En un

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modo de realización, el intensificador se selecciona entre imidazol, 2-hidroxipiridina y combinaciones de los mismos y el estabilizador es metabisulfito sódico. En otro modo de realización, el kit incluye además un conjugado de enzima y anticuerpo envasado en un segundo dispensador o botella. En otro modo de realización, el polímero proporciona una reducción de la precipitación de más de un 10 % a aproximadamente un 50 %, determinada por HPLC en un estudio de envejecimiento acelerado a 45 °C o mediante cribado de polímeros usando KHSO4.

En otro modo de realización, el anticuerpo es un anticuerpo anti-hapteno y la enzima es una peroxidasa de rábano picante. En otro modo de realización, el kit incluye además peróxido de hidrógeno envasado en un tercer dispensador o botella. En un modo de realización, el polímero está presente a una concentración eficaz para reducir la precipitación del cromógeno DAB en el primer dispensador o botella mientras que la concentración también es eficaz para permitir la precipitación al poner en contacto el cromógeno DAB con conjugado de enzima y anticuerpo y el peróxido de hidrógeno. De manera ilustrativa, permitir la precipitación incluye generar una desviación estadísticamente significativa de la intensidad de tinción observada promedio, según lo determinado por un lector cualificado en comparación con una composición de detección cromogénica comparable que no incluye el polímero.

Los anteriores y otros objetos, características y ventajas de la invención serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es una imagen de un portaobjetos de control en el que la muestra de tejido de amígdala se tiñe para Ki67 con una solución de cromógeno DAB.

La figura 2 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y sulfato de dextrano (Mm = 9-20 kDa, 2 % en masa).

La figura 3 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB.

La figura 4 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de sulfonato de poliestireno (PSS) que tiene una Mm = 1,5 kDa (5 % en masa).

La figura 5 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y polímero de PSS que tiene una Mm = 5,1 kDa (5 % en masa).

La figura 6 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de PSS que tiene una Mm = 7,5 kDa (5 % en masa).

La figura 7 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de PSS que tiene una Mm = 16 kDa (5 % en masa).

La figura 8 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de PSS que tiene una Mm = 35 kDa (5 % en masa).

La figura 9 es una imagen de un portaobjetos de control en el que la muestra de tejido de amígdala se tiñe para Ki67 con una solución de cromógeno DAB.

La figura 10 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de aminodextrano que tiene una Mm = 10 kDa.

La figura 11 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de aminodextrano que tiene una Mm = 40 kDa.

La figura 12 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un polímero de aminodextrano que tiene una Mm = 70 kDa.

La figura 13 es una imagen de un rastro de HPLC representativo y un gráfico de índice de espectro.

La figura 14 es una imagen de un portaobjetos de control en el que la muestra de tejido de amígdala se tiñe para Ki67 con una solución de cromógeno DAB.

La figura 15 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un 4 % en masa de PSS (Mm = 1,5 kDa).

La figura 16 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un 4 % en masa de sulfato de dextrano (Mm = 6,5-10 kDa).

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La figura 17 es una imagen de un portaobjetos de control en el que la muestra de tejido de amígdala se tiñe para Ki67 con una solución de cromógeno DAB.

La figura 18 es una imagen de un corte de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de cromógeno DAB y un 5 % en masa de polialilamina (Mm = 15 kDa).

La figura 19 es una imagen de una muestra de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB y un 0,1 % en masa de polietilenimina lineal (Mm = 2,5 kDa).

La figura 20 es una imagen de una muestra de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB y un 0,5 % en masa de polietilenimina lineal (Mm = 2,5 kDa).

La figura 21 es una imagen de una muestra de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB y un 1,0 % en masa de polietilenimina lineal (Mm = 2,5 kDa).

La figura 22 es una imagen de una muestra de tejido de amígdala teñido para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB y un 3,0 % en masa de polietilenimina lineal (Mm = 2,5 kDa).

La figura 23 es una imagen de un portaobjetos de control en el que la muestra de tejido de amígdalas se tiñe para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB.

La figura 24 es una imagen de una muestra de tejido de amígdala teñida para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB y un 7 % en masa de DEAE-dextrano (Mm = 500 kDa).

La figura 25 es una imagen de una muestra de tejido de amígdala teñida para Ki67 con una solución de un cromógeno DAB y un 2 % en masa de polietilenimina lineal (Mm = 2,5 kDa).

Descripción detallada

I. Introducción

La presente divulgación se refiere a una composición que comprende un cromógeno DAB y/o derivados del mismo, y un polímero que incluye uno o más grupos funcionales capaces de formar un complejo con el cromógeno, la sal de contraión o el producto sulfato de la oxidación de bisulfito durante la formulación. Se usa una cantidad del polímero para reducir suficientemente o prevenir sustancialmente la precipitación del cromógeno. La composición divulgada se puede usar para aumentar o mejorar el depósito de cromógeno durante un procedimiento de tinción, tal como tinción de tejidos. También se divulga un procedimiento para usar la composición divulgada y kits que comprenden la composición divulgada.

II. Definiciones y abreviaturas

A menos que se indique lo contrario, los términos técnicos se utilizan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes VII, publicado por Oxford University Press, 2000; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995; y George P. Rédei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, and Proteomics, 2.a edición, 2003.

Las formas singulares “un”, “uno”, “una” y “el”, “la” se refieren a uno o más de uno, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “que comprende una célula” incluye células individuales o múltiples y se considera equivalente a la frase “que comprende al menos una célula”. El término o se refiere a un elemento individual de elementos alternativos comentados o a una combinación de dos o más elementos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Una línea ondulada (“jvw”) se utiliza para indicar una desconexión

de enlace, y una línea discontinua (“-----”) se usa para ilustrar que se puede formar un enlace en una posición

particular.

Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento para la práctica o ensayo de la tecnología divulgada, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. Los materiales, procedimientos y ejemplos son sólo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Las siguientes explicaciones de términos y procedimientos se proporcionan para describir mejor la presente divulgación y para guiar a los expertos en la técnica en la práctica de la presente divulgación.

Análogo, derivado o mimético: un análogo es una molécula que difiere en la estructura química con respecto a un compuesto original, por ejemplo, un homólogo (que difiere en un incremento en la estructura química, tal como una diferencia en la longitud de una cadena de alquilo), un fragmento molecular, una estructura que difiere en uno o más

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grupos funcionales, un cambio en la ionización. Los análogos estructurales a menudo se encuentran usando relaciones cuantitativas estructura-actividad (QSAR), con técnicas como las divulgadas en Remington (The Science and Practice of Pharmacology, 19.a edición (1995), capítulo 28). Un derivado es una molécula biológicamente activa derivada de la estructura base. Un mimético es una molécula que imita la actividad de otra molécula, tal como una molécula biológicamente activa. Las moléculas biológicamente activas pueden incluir estructuras químicas que imitan las actividades biológicas de un compuesto.

Arilo: un compuesto aromático basado sustancialmente en hidrocarburo, o un radical del mismo (por ejemplo, C6H5) como un sustituyente unido a otro grupo, particularmente a otros grupos orgánicos, que tiene una estructura de anillo como por ejemplo benceno, naftaleno, fenantreno, antraceno, etc. Este término también abarca compuestos de arilo sustituidos.

Avidina: cualquier tipo de proteína que se une específicamente a biotina para la exclusión sustancial de otras moléculas pequeñas que podrían estar presentes en una muestra biológica. Ejemplos de avidina incluyen avidinas que están presentes de forma natural en la clara de huevo, proteína de semillas oleaginosas (por ejemplo, harina de soja) y granos (por ejemplo, maíz) y estreptavidina, que es una proteína de origen bacteriano.

Ramificado: este término se refiere a un compuesto y/o grupo funcional que comprende una o más unidades que comprenden un átomo de carbono que está unido a al menos otros tres átomos de carbono.

Cromógeno: una sustancia capaz de convertirse en y/o provocar el depósito de un producto coloreado, tal como un pigmento o un colorante. Ciertos cromógenos son donantes de electrones que, cuando se oxidan, se convierten en un producto coloreado. La generación de un producto coloreado y/o la propiedad de volverse insoluble tras la conversión química, tal como por oxidación, hacen que los cromógenos sean útiles para IHQ. Ejemplos particulares de compuestos cromogénicos, sin limitación, incluyen 3,3'-diaminobencidina (DAB), tetrametilbencidina (TMB), 2,2'- azino-di-[3-etilbenzotiazolina sulfonato] (ABTS), yodonitrotetrazolio (INT), tetrazolio azul y tetrazolio violeta. La DAB es un cromógeno que produce un producto final marrón (por ejemplo, a través de una reacción enzimática, tal como HRP) que es altamente insoluble en soluciones acuosas.

Condiciones suficientes para detectar: cualquier entorno que permita la actividad deseada, por ejemplo, que permita que una sonda se una a una diana y se detecte la interacción. Por ejemplo, dichas condiciones incluyen temperaturas apropiadas, soluciones tampón y medios de detección tales como microscopios y equipos de imágenes digitales.

Contacto: colocación que permite la asociación entre dos o más restos, particularmente la asociación física directa, por ejemplo, tanto en forma sólida como en forma líquida (por ejemplo, la colocación de una muestra biológica, tal como una muestra biológica fijada a un portaobjetos, en contacto con una composición tal como una solución que contiene las composiciones divulgadas en el presente documento).

Control: una muestra o procedimiento realizado para evaluar la validez de la prueba. En un ejemplo, un control es un control de calidad, como un control positivo. Por ejemplo, un control positivo es un procedimiento o muestra, tal como un tejido o una célula, que es similar a la muestra de prueba real, pero que se sabe por experiencia previa que da un resultado positivo. Un control positivo confirma que las condiciones básicas de la prueba producen un resultado positivo, incluso si ninguna de las muestras de prueba reales produce dicho resultado. En un ejemplo particular, un control positivo es una muestra que se sabe por pruebas previas que contiene el antígeno sospechoso. En otros ejemplos, un control es un control negativo. Un control negativo es un procedimiento o muestra de prueba que se sabe por experiencia previa que da un resultado negativo. El control negativo demuestra el resultado basal obtenido cuando una prueba no produce un resultado positivo mensurable; a menudo, el valor del control negativo se trata como un valor de «fondo» que se debe restar de los resultados de la muestra de prueba. En un ejemplo particular, un control negativo es un reactivo que no incluye el anticuerpo primario específico. Otros ejemplos incluyen controles de calibrador, que son muestras que contienen una cantidad conocida de un antígeno de control. Dichos controles de calibrador tienen una intensidad de señal esperada y, por lo tanto, se pueden usar para corregir la variabilidad de tinción interserial o intraserial.

Detergente o tensioactivo: una sustancia que reduce la tensión superficial del agua. Específicamente, un detergente o tensioactivo es un agente de superficie activa que se concentra en las interfaces aceite-agua y ejerce una acción emulsionante. Los detergentes se clasifican como aniónicos, catiónicos o no iónicos, dependiendo de su modo de acción química. Los detergentes no iónicos funcionan mediante un mecanismo de puentes de hidrógeno. Además, los tensioactivos o detergentes reducen la tensión interfacial entre dos líquidos. Una molécula de tensioactivo tiene típicamente una “cabeza” polar o iónica y una “cola” de hidrocarburo no polar. Tras la disolución en agua, las moléculas de tensioactivo se agregan y forman micelas, en las que las colas no polares se orientan hacia el interior y las cabezas polares o iónicas se orientan hacia el exterior, hacia el entorno acuoso. Las colas no polares crean un “bolsillo” no polar dentro de la micela. Los compuestos no polares en la solución se secuestran en los bolsillos formados por las moléculas de tensioactivo, lo que permite que los compuestos no polares permanezcan mezclados en la solución acuosa.

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Detectar: determinar si un agente (por ejemplo, una señal o un antígeno particular) está presente o ausente, por ejemplo, en una muestra. En algunos ejemplos, esto puede incluir adicionalmente la cuantificación y/o localización, por ejemplo, localización dentro de una célula o compartimento celular particular. «“Detección”» se refiere a cualquier procedimiento para determinar si algo existe o no existe, por ejemplo, determinar si una molécula diana está presente en una muestra biológica. Por ejemplo, la “detección” puede incluir el uso de un dispositivo mecánico o visual para determinar si una muestra exhibe una característica específica. En determinados ejemplos, la detección se refiere a la observación visual de una sonda unida a una diana o a la observación de que una sonda no se une a una diana. Por ejemplo, microscopía de luz y otros medios microscópicos se usan comúnmente para detectar precipitados cromogénicos para los procedimientos descritos en el presente documento.

Intensific(ar/ador/ación): un intensificador o reactivo intensificador es cualquier compuesto o cualquier combinación de compuestos suficiente para aumentar la actividad catalítica de una enzima, en comparación con la actividad enzimática sin dicho(s) compuesto(s). Los intensificador(es) o reactivo(s) intensificador(es) también se puede(n) definir como un compuesto o combinación de compuestos que aumentan o aceleran la tasa de unión de un conjugado activado a un sitio receptor. La intensificación es un proceso mediante el cual la actividad catalítica de una enzima se incrementa mediante un intensificador, en comparación con un proceso que no incluye dicho intensificador. Intensificar también se puede definir como aumentar o acelerar la tasa de unión de un conjugado activado a un sitio receptor. La intensificación se puede medir visualmente, por ejemplo, mediante puntuación por parte de un anatomopatólogo. En modos de realización particulares, las puntuaciones varían desde más de 0 hasta más de 4, y el número más alto indica una mejor detección visual. Más típicamente, las puntuaciones varían desde más de 0 hasta aproximadamente 4++, tal como 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 3,75, 4, 4+ y 4++. Además, la intensificación se puede medir mediante la determinación de la Vmáx. aparente de una enzima. En modos de realización particulares, el término abarca valores de Vmáx. aparente (medidos como densidad óptica/minuto) que varían desde más de 0 mOD/min hasta aproximadamente 400 mOD/min, tales como aproximadamente 15 mOD/min, 18 mOD/min, aproximadamente 20 mOD/min, aproximadamente 40 mOD/min, aproximadamente 60 mOD/min, aproximadamente 80 mOD/min, aproximadamente 100 mOD/min, aproximadamente 120 mOD/min, aproximadamente 140 mOD/min, aproximadamente 160 mOD/min, aproximadamente 200 mOD/min , aproximadamente 250 mOD/min, aproximadamente 300 mOD/min, aproximadamente 350 mOD/min y aproximadamente 400 mOD/min. Más típicamente, la Vmáx. varía desde más de 0 mOD/min hasta aproximadamente 160 mOD/min, tal como aproximadamente 20 mOD/min, aproximadamente 40 mOD/min, aproximadamente 60 mOD/min, aproximadamente 80 mOD/min, aproximadamente 100 mOD/min, aproximadamente 120 mOD/min, aproximadamente 140 mOD/min y aproximadamente 160 mOD/min. Además, se puede producir intensificación usando cualquier concentración de un intensificador mayor que 0 mM. Típicamente, la intensificación se produce a concentraciones intensificadoras que varían desde más de aproximadamente 0,01 mM hasta aproximadamente 100 mM, tales como aproximadamente 0,01 mM, aproximadamente 0,02 mM, aproximadamente 0,05 mM, aproximadamente 0,10 mM, aproximadamente 0,20 mM, aproximadamente 0,50 mM, aproximadamente 1,0 mM, aproximadamente 2,0 mM, aproximadamente

3.0 mM, aproximadamente 5,0 mM, aproximadamente 10,0 mM, aproximadamente 20,0 mM, aproximadamente

30.0 mM, aproximadamente 40,0 mM, aproximadamente 50,0 mM, aproximadamente 75,0 mM o aproximadamente

100.0 mM, tal como de aproximadamente 0,01 mM a aproximadamente 0,10 mM, de aproximadamente 0,05 mM a aproximadamente 0,50 mM, de aproximadamente 0,4 mM a aproximadamente 1,0 mM, de aproximadamente 0,5 mM a aproximadamente 2,0 mM, de aproximadamente 1,0 mM a aproximadamente 10,0 mM, de aproximadamente 5,0 mM a aproximadamente 50,0 mM y de aproximadamente 20,0 mM a aproximadamente

100.0 mM. Intensific(ar/ador/ación), en general, y especies de los mismos, se divulgan en la publicación de solicitud de patente pendiente de cesión de EE. UU. n.° 2012/0171668.

Fijación: un proceso que conserva los constituyentes celulares y tisulares en un estado lo más cercano posible a la vida y permite realizar procedimientos preparativos sin que se produzcan cambios. La fijación detiene los procesos de autolisis y descomposición bacteriana que comienzan tras la muerte celular y estabiliza los constituyentes celulares y tisulares de modo que sean capaces de soportar las etapas posteriores del procesamiento del tejido, por ejemplo, para IHQ. Los tejidos se pueden fijar mediante perfusión con o inmersión en un fijador, tal como un aldehído (tal como formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído y similares). Otros fijadores incluyen agentes oxidantes (por ejemplo, iones y complejos metálicos, tales como tetróxido de osmio y ácido crómico), agentes desnaturalizantes de proteínas (por ejemplo, ácido acético, metanol y etanol), fijadores de mecanismo desconocido (por ejemplo, cloruro de mercurio, acetona y ácido pícrico), reactivos de combinación (por ejemplo, fijador de Carnoy, metacarn, líquido de Bouin, fijador B5, líquido de Rossman y líquido de Gendre), microondas y varios (por ejemplo, fijación por volumen excluido y fijación por vapor). En el fijador también se pueden incluir aditivos, por ejemplo, tampones, detergentes, ácido tánico, fenol, sales metálicas (por ejemplo, cloruro de cinc, sulfato de cinc y sales de litio) y lantano. El fijador de uso más habitual en la preparación de muestras para IHQ es el formaldehído, en general en forma de una solución de formol (4 % de formaldehído en una solución tampón, conocida como formol tamponada al 10 %).

Hapteno: una molécula, típicamente una molécula pequeña, que se puede combinar específicamente con un anticuerpo, pero, por lo general, es sustancialmente incapaz de ser inmunogénica, excepto en combinación con una molécula vehículo. Haptenos ejemplares incluyen un oxazol, un pirazol, un tiazol, un compuesto de nitroarilo distinto del dinitrofenilo, un benzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un rotenoide, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo o una benzodiazepina. Más particularmente, el hapteno puede ser 2,4-dinitrofenilo

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(DNP), biotina, digoxigenina, 5-nitro-3-pirazolcarbamida (NP), 3-hidroxi-2-quinoxalinacarbamida (HQ), 2-acetamido- 4-metil- 5-tiazolsulfonamida (TS) y 4-(dietilamino)azobenceno-4'-sulfonamida (DABSYL) o ácido 7-(dietilamino)-2- oxo-2H-cromeno-3-carboxílico (DCC).

Inmunohistoquímica (IHQ): un procedimiento de determinar la presencia o distribución de un antígeno en una muestra mediante la detección de la interacción del antígeno con un agente de unión específica o un resto, tal como un anticuerpo. Una muestra que incluye un antígeno (tal como un antígeno diana) se incuba con un anticuerpo en condiciones que permiten la unión anticuerpo-antígeno. La unión anticuerpo-antígeno se puede detectar por medio de un marcador detectable conjugado con el anticuerpo (detección directa) o por medio de un marcador detectable conjugado con un anticuerpo secundario, que se produce contra el anticuerpo primario (por ejemplo, detección indirecta). Los marcadores detectables incluyen, pero no se limitan a, isótopos radiactivos, fluorocromos (tales como derivados de fluoresceína y derivados de rodamina), enzimas y moléculas cromogénicas.

Hibridación in situ (HIS): un tipo de hibridación que utiliza una cadena de ARN o ADN complementaria marcada (esto es, una sonda) para localizar una secuencia de ADN o ARN específica en una parte o corte de tejido (in situ) o, si el tejido es lo suficientemente pequeño (por ejemplo, semillas de plantas, embriones de Drosophila), en todo el tejido (HIS de embriones completos o whole mount). Es distinta de la inmunohistoquímica, que localiza proteínas en cortes de tejido. La HIS de ADN se puede utilizar para determinar la estructura de los cromosomas, tal como en el diagnóstico médico para evaluar la integridad cromosómica. La HIS de ARN (histoquímica de hibridación) se utiliza para medir y localizar ARNm y otros transcritos dentro de los cortes de tejido o whole mount. Para la histoquímica de hibridación, las células y los tejidos de la muestra se tratan, en general, para fijar los transcritos diana en su lugar y aumentar el acceso de la sonda a la molécula diana. Como se indicó anteriormente, la sonda es un ADN complementario marcado o un ARN complementario (ribosonda). La sonda se hibrida con la secuencia diana a temperatura elevada y luego la sonda en exceso se elimina por lavado (opcionalmente se hidroliza usando RNasa en el caso de una sonda de ARN en exceso no hibridada). Los parámetros de la solución, tales como la temperatura, la concentración de sal y/o de detergente, se pueden manipular para eliminar cualquier interacción no idéntica (esto es, solo las secuencias que sean exactas permanecerán unidas). A continuación, la sonda marcada que se ha marcado de manera eficaz, por ejemplo, con bases radiomarcadas, marcadas con fluorescencia o marcadas con antígeno (por ejemplo, digoxigenina), se localiza y se puede cuantificar en el tejido usando autorradiografía, microscopia de fluorescencia o inmunohistoquímica, respectivamente.

Molécula de interés o diana: una molécula cuya la presencia, localización y/o concentración están por determinar. Los ejemplos de moléculas de interés incluyen proteínas y secuencias de ácidos nucleicos marcadas con haptenos.

Multiplexación: Los modos de realización de la presente divulgación permiten detectar múltiples dianas en una muestra de forma sustancialmente simultánea, o secuencial, según se desee, usando múltiples conjugados diferentes. La multiplexación puede incluir la identificación y/o cuantificación de ácidos nucleicos, en general, ADN, ARN, péptidos, proteínas, tanto individualmente como en cualquiera o todas las combinaciones. La multiplexación también puede incluir la detección de dos o más de un gen, un mensajero y una proteína en una célula en su contexto anatómico.

Muestra: El término «muestra» se refiere a cualquier sustancia (o material) líquida, semisólida o sólida en la puede estar presente una diana. En particular, una muestra puede ser una muestra biológica o una muestra obtenida de un material biológico. Entre los ejemplos de muestras biológicas se incluyen muestras de tejido y muestras de citología. En algunos ejemplos, la muestra biológica se obtiene de un sujeto animal, por ejemplo, un sujeto humano. Una muestra biológica es cualquier muestra sólida o líquida obtenida de, excretada por o secretada por cualquier organismo vivo, incluyendo, sin limitaciones, organismos unicelulares (tales como bacterias, levaduras, protozoos y amebas, entre otros) y organismos multicelulares (tales como plantas o animales, incluyendo muestras de un sujeto humano sano o aparentemente sano o de un paciente humano afectado por una afección o enfermedad a diagnosticar o investigar, por ejemplo, cáncer). Por ejemplo, una muestra biológica puede ser un líquido biológico obtenido de, por ejemplo, sangre, plasma, suero, orina, bilis, ascitis, saliva, líquido cefalorraquídeo, humor acuoso o vítreo o cualquier secreción corporal, un trasudado, un exudado (por ejemplo, líquido obtenido de un absceso o cualquier otro sitio de infección o inflamación) o líquido obtenido de una articulación (por ejemplo, una articulación normal o una articulación afectada por una enfermedad). Una muestra biológica también puede ser una muestra obtenida de cualquier órgano o tejido (incluida una muestra de biopsia o autopsia, tal como una biopsia de tumor) o puede incluir una célula (ya sea una célula primaria o una célula cultivada) o un medio acondicionado por cualquier célula, tejido u órgano. En algunos ejemplos, una muestra biológica es un extracto del núcleo. En algunos ejemplos, una muestra biológica es un citoplasma bacteriano. En otros ejemplos, una muestra es una muestra de ensayo. Por ejemplo, una muestra de ensayo es una célula, un corte de tejido o sedimento celular preparado a partir de una muestra biológica obtenida de un sujeto. En un ejemplo, el sujeto es uno que está en riesgo de sufrir una afección o enfermedad concreta o que ya la sufre.

Resto de unión específica: un miembro de un par de unión específica. Los pares de unión específica son pares de moléculas que se caracterizan por que se unen entre sí a la exclusión sustancial de la unión a otras moléculas (por ejemplo, los pares de unión específica pueden tener una constante de unión que es al menos 103 M-1 mayor, 104 M-1 mayor o 105 M-1 mayor que una constante de unión para cualquiera de los dos miembros del par de unión con otras

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moléculas en una muestra biológica). Los ejemplos particulares de restos de unión específica incluyen proteínas de unión específica (por ejemplo, anticuerpos, lectinas, avidinas tales como estreptavidinas y proteína A), secuencias de ácidos nucleicos y ácidos nucleicos de proteínas. Los restos de unión específica también pueden incluir las moléculas (o porciones de las mismas) que están específicamente unidas por dichas proteínas de unión específica.

Estabilizador: un compuesto capaz de prevenir sustancialmente la descomposición, precipitación y/u oxidación de un cromógeno. En un modo de realización, un estabilizador es un antioxidante, tal como metabisulfito sódico.

Tejido: una colección de células interconectadas que realizan una función similar dentro de un organismo.

III. Composición de cromógeno-polímero

Ciertos modos de realización divulgados se refieren a una composición que comprende un cromógeno, particularmente un cromógeno DAB, y/o derivados del mismo, y un polímero capaz de formar un complejo con el cromógeno, la sal de contraión o el producto sulfato de la oxidación con bisulfito. La composición divulgada se puede usar en procedimientos colorimétricos, tales como tinción de tejidos. Un experto en la técnica apreciará que una composición útil para un protocolo particular puede variar con respecto a la de un protocolo diferente, y aún estar dentro del alcance de la composición divulgada en el presente documento. Además, se pueden incluir diversos materiales opcionales, tales como tener diferentes concentraciones de reactivo o relaciones de cantidades de reactivos, en composiciones útiles formuladas de acuerdo con la presente invención, que incluyen, pero no se limitan a, estabilizadores, intensificadores, contratintes y/o tampones.

La composición divulgada se puede usar para aumentar el depósito de cromógeno, particularmente el depósito de DAB, en procedimientos de tinción, tales como tinción de tejidos. La Tabla 1 detalla los resultados obtenidos a partir de modos de realización de trabajo particulares en los que una solución base de cromógeno DAB (DAB, imidazol, 2- hidroxipiridina y metabisulfito sódico) que contiene un polímero de acuerdo con la presente divulgación se expuso a concentraciones variables de hidrogenosulfato de potasio (KHSO4).

Tabla 1: Sistema de cribado de polímeros

5,5 pmol de DAB + 5 % en masa de polímero

0 pmol KHSO4 1,37 pmol KHSO4 2,75 pmol KHSO4 8,0 pmol KHSO4

Sin polímero

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Dextrano de 15-20 kDa

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Sulfato de dextrano de 9-20 kDa

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El metabisulfito sódico se ha usado como un estabilizador antioxidante a concentraciones que no inhiben significativamente la tinción de tejidos con DAB. Sin estar limitado a una teoría de operación particular, este estabilizador forma un subproducto de hidrogenosulfato oxidado que se cree que forma un precipitado de sal de hidrogenosulfato de DAB insoluble (basado en el análisis elemental). Esta sal de hidrogenosulfato de DAB tiene una baja solubilidad acuosa y precipita fácilmente de la solución. El análisis por HPLC se realizó en el cromógeno DAB estabilizado con polímero para determinar la estabilidad al estrés térmico (a 45 °C) y la capacidad de cada polímero para inhibir el precipitado de sulfato de DAB antes y después de la adición de hidrogenosulfato de potasio. Las muestras se analizaron para determinar la concentración residual de DAB (ultracentrifugación analítica, «UCA») con respecto a la 2-hidroxipiridina (UCA) como patrón interno. Se demostró que la concentración de 2-hidroxipiridina no estaba influenciada por el estrés térmico ni por la adición de hidrogenosulfato de potasio. La concentración de DAB (UCA) disminuía si el tetraclorhidrato de DAB formaba un precipitado de hidrogenosulfato de DAB insoluble. Este precipitado se puede eliminar de la muestra usando un filtro de HPLC precolumna y, por lo tanto, no se puede detectar por HPLC. Se demostró que el estrés térmico acelera la oxidación de DAB. Estos subproductos no se acumularon en solución a ninguna concentración sustancial y precipitaron de la solución. Los polímeros que proporcionaron la mayor estabilidad térmica de DAB y la mayor inhibición de la formación de precipitado de sulfato de DAB se convirtieron en los candidatos principales.

Como se indica en la Tabla 1, se evitó la precipitación de sulfato de DAB en composiciones que comprenden la solución de cromógeno y en modos de realización particulares del polímero divulgado. Las figuras 1 y 2 son imágenes que ilustran los resultados obtenidos a partir de modos de realización de trabajo particulares. La figura 1 es una imagen de un corte de tejido teñido con una composición que comprende únicamente la solución de cromógeno DAB y la figura 2 es una imagen de un corte de tejido teñido con una composición que comprende la solución de cromógeno DAB y el polímero divulgado (por ejemplo, 2 % en masa de sulfato de dextrano, Mm = 9-

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A. Cromógenos

La composición divulgada puede comprender uno o más cromógenos. Los modos de realización divulgados en este momento se dirigen particularmente a formar composiciones que comprenden diaminobencidina (DAB) y/o derivados de la misma. Los cromógenos DAB, tales como 3,3'-diaminobencidina, se han usado durante algún tiempo para diversos procedimientos de tinción, tales como inmunotransferencia y tinción inmunohistoquímica. La cantidad de cromógeno DAB usada para los modos de realización divulgados puede variar, pero se usa funcionalmente en cantidades suficientes para proporcionar una muestra de tejido aceptablemente teñida, tal como una cantidad de más de 0,05 mM a aproximadamente 100 mM, más típicamente de más de 0,1 mM a aproximadamente 15 mM, incluso más típicamente de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 11 mM, con modos de realización de trabajo que comprenden típicamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 5,5 mM de cromógeno DAB y/o derivados del mismo.

B. Polímeros

Se pueden usar diversos polímeros en la composición divulgada. Un polímero adecuado contemplado por la presente divulgación es típicamente un polímero soluble en agua que comprende una cadena principal polimérica y al menos uno y típicamente múltiples grupos funcionales que son eficaces para reducir o evitar sustancialmente la precipitación del cromógeno DAB y/o derivados del mismo. Los iniciadores químicos reactivos utilizados en relación con la síntesis de polímeros a menudo dejarán grupos funcionales en las posiciones terminales de las cadenas poliméricas. Si bien estos grupos pueden afectar a la solubilidad y funcionalidad del polímero, especialmente en polímeros de baja masa molecular, la funcionalidad descrita en el presente documento se refiere a los grupos funcionales que abarcan las cadenas principales poliméricas. En modos de realización ilustrativos, los polímeros que se han iniciado con iniciadores reactivos con grupos funcionales que proporcionan operabilidad adicional dentro del alcance de la presente divulgación se incluyen en la composición divulgada.

1. Cadenas principales poliméricas

Ciertos modos de realización de polímeros divulgados incluyen una cadena principal polimérica. La cadena principal polimérica puede ser soluble en agua o sustancialmente insoluble en agua. En modos de realización en los que la cadena principal polimérica en sí misma es sustancialmente insoluble en agua, el polímero completo (por ejemplo, la cadena principal polimérica en combinación con grupos funcionales adecuados) debería ser sustancialmente soluble en agua. Modos de realización divulgados particulares se refieren a cadenas principales poliméricas que tienen cualquiera de las fórmulas 1, 2 y 3, ilustradas a continuación.

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Con referencia a la fórmula 1, R1 se puede seleccionar entre un resto alifático, arilo, heteroarilo y un resto que contiene un heteroátomo. En un modo de realización, R1 puede comprender además cualquiera de los grupos funcionales poliméricos adecuados divulgados en el presente documento. El resto que contiene un heteroátomo se puede seleccionar entre éster, ácido y amida. R2 se puede seleccionar entre hidrógeno, resto alifático, heteroalifático, arilo o heteroarilo. Con referencia a las fórmulas 3 y 2, cada Y se puede seleccionar independientemente entre oxígeno, azufre y NRa en el que Ra se selecciona entre hidrógeno, resto alifático, arilo, heteroarilo y heteroalifático. R3 se puede seleccionar de cualquiera de los grupos funcionales poliméricos adecuados divulgados en el presente documento, y n varía desde 1 hasta aproximadamente 100.

En un modo de realización, el polímero puede tener una fórmula 4 o 5, ilustradas a continuación.

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Con referencia a las fórmulas 4 y 5, R2 se puede seleccionar entre hidrógeno, resto alifático, heteroalifático, arilo o heteroarilo y R3 puede ser un grupo funcional polimérico seleccionado entre un sulfonato, una amina, un grupo

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carboxilo, un carboxilato o combinaciones en los mismos. R4 se puede seleccionar entre hidrógeno, resto alifático y (CH2)qNRaRbRc en el que Ra, Rb y Rc se seleccionan independientemente entre hidrógeno, resto alifático, arilo y combinaciones de los mismos, y q varía desde 1 hasta aproximadamente 10; y n varía desde 1 hasta aproximadamente 100.

Además, cualquiera de las cadenas principales poliméricas divulgadas se puede combinar con otra cadena principal polimérica para producir una cadena principal polimérica híbrida.

Modos de realización divulgados particulares se refieren a cadenas principales poliméricas seleccionadas entre dextranos, poliestireno, derivados de polivinilo, derivados de polimetacrilato, derivados de poliacrilamida, derivados de polisacáridos, derivados polipeptídicos, derivados de ácidos nucleicos y derivados de cadenas principales de ácidos nucleicos, copolímeros de poliestireno y ácido maleico, copolímeros de poli(acrilamida/metacrilato) y similares. Los ejemplos de restos solubles en agua adecuados incluyen polímeros de dextrano. Los dextranos son fácilmente solubles en agua, sal y composiciones que contienen electrolitos, y el pH tiene un efecto insignificante sobre la solubilidad. Se pueden preparar soluciones concentradas de dextranos, tales como soluciones que comprenden más del 50 % (m/v). Un experto en la técnica reconocerá que los dextranos tienen diversas masas moleculares.

Otras cadenas principales poliméricas se pueden basar en cadenas principales menos solubles, o sustancialmente no solubles, siempre que el material polimérico usado para formar las composiciones divulgadas sea en sí mismo sustancialmente soluble en agua. Ejemplos de esta clase de cadenas principales incluyen cadenas principales de arilo, tales como por ejemplo materiales poliméricos de tipo estireno.

2. Grupos funcionales poliméricos adecuados

Los grupos funcionales adecuados incluyen cualquier grupo funcional que facilite el mantenimiento de un cromógeno DAB y/o derivados del mismo, en solución durante y después de la formulación del producto. A modo de ejemplo, los grupos funcionales adecuados incluyen carboxilato, sulfonato (R-SO2O-), sulfato (SO42-), amina, incluyendo aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias, aminas sustituidas, y combinaciones de dichos grupos funcionales. Un grupo funcional amina se puede seleccionar entre aminas alifáticas, particularmente aminas funcionalizadas con uno o más átomos de hidrógeno o uno o más grupos alquilo inferiores, tales como grupos metilo, etilo, propilo y butilo; arilaminas, tales como aminas funcionalizadas con uno o más grupos arilo, particularmente fenilo; heteroarilaminas; y combinaciones de los mismos. En un modo de realización, el polímero puede ser una polialquilenamina.

3. Polímeros ejemplares

Los siguientes polímeros están destinados únicamente a ser ejemplos de clases y especies de polímeros adecuados para formar la composición divulgada y no están destinados a ser limitantes. Los polímeros de sulfonato y sulfato reducen sustancialmente o previenen la precipitación de sulfato de DAB aparentemente formando un complejo de polímero soluble en agua con DAB y/o derivados de la misma. El efecto de los polímeros de sulfato y sulfonato sobre la tinción de tejidos con cromógeno DAB también se puede controlar variando el tamaño del polímero, tal como masa molecular media en masa (Mm) y/o masa molecular media en número (Mn) y/o la concentración de polímero en % en masa. La tinción de tejidos con cromógeno DAB se redujo y la tinción de fondo con hematoxilina aumentó con polímeros de Mm más grandes. Por ejemplo, las figuras 3-8 ilustran colectivamente los efectos de modos de realización de trabajo ejemplares sobre el depósito de DAB con Mm crecientes de polímero de sulfonato de poliestireno (PSS). La figura 3 es una imagen de control de un corte de tejido teñido producido usando una composición que comprende únicamente una solución de cromógeno DAB (por ejemplo, una solución OPTIVIEW® DAB, Ventana Medical Systems, Inc. Tucson AZ, en lo sucesivo denominada “Ventana”). Las figuras 4-8 son imágenes de cortes de tejido teñidos producidos usando una composición que comprende una solución de cromógeno DAB y un polímero de PSS que tienen masas moleculares de aproximadamente 1,5 kDa (figura 4), 5,1 kDa (figura 5), 7,5 kDa (figura 6), 16 kDa (figura 7) y 35 kDa (figura 8). Todos los polímeros utilizados en estos modos de realización a modo de ejemplo se usaron a una concentración de polímero de un 5 % en masa. Como se ilustra en las figuras 4-8, los derivados de mayor masa molecular de los polímeros de PSS conducen a una menor tinción con DAB y a una mayor tinción de fondo con hematoxilina. En modos de realización ejemplares, el sulfato de dextrano y sulfato de poliestireno de baja masa molecular provocan la precipitación de sulfato de DAB con un impacto mínimo sobre la tinción de tejidos con DAB.

Los polímeros de amina también son útiles para reducir, o prevenir sustancialmente, la precipitación de sulfato de DAB. En un modo de realización, los polímeros de amina se pueden usar para inhibir completamente la precipitación de DAB y/o derivados de la misma. Los polímeros de aminas primarias, secundarias, terciarias y cuaternarias se contemplan en la presente divulgación. Los polímeros de amina no tienen el mismo impacto sobre la tinción de tejidos con DAB que los polímeros de sulfato y sulfonato. Sin estar ligado a una teoría particular de operación, actualmente se cree que la concentración del polímero puede aumentar la viscosidad y, por lo tanto, puede afectar la tinción de tejidos con DAB. Los polímeros de amina pueden reducir sustancialmente o prevenir la precipitación de sulfato de DAB formando un complejo polimérico soluble en agua entre el polímero catiónico y los aniones sulfato,

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reduciendo así la concentración de sulfato libre disponible para complejarse con DAB y formar el complejo de sulfato de DAB insoluble. La tinción tisular también se puede ver afectada por la solubilidad del polímero de amina, que puede ser un problema a pH neutro en el tampón de reacción para modos de realización particulares de polímeros de amina, tales como polialilamina de Mm = 15 kDa. Los polímeros de aminas adecuados a modo de ejemplo incluyen, aunque sin limitación, polímeros de polietilenimina (lineal o ramificada), DEAE-dextrano y poli(2- metilacriloxietiltrimetilamonio bromuro).

En un modo de realización, la composición comprende un cromógeno, o cromógenos, y un polímero de aminodextrano. Las figuras 9-12 ilustran colectivamente los resultados de ciertos modos de realización de trabajo usando la composición divulgada. La figura 9 es una imagen que ilustra los resultados obtenidos con un control en el que solo se aplicó la solución de cromógeno DAB a una muestra de tejido. Las figuras 10-12 son imágenes de cortes de tejido teñidos en los que se añadió una composición que comprende la solución de cromógeno DAB y un 4 % en masa de aminodextrano que tiene masas moleculares variables al corte de tejido. La figura 10 ilustra los resultados

obtenidos con un polímero de aminodextrano de Mm = 10 kDa, la figura 11 se refiere a un polímero de

aminodextrano de Mm = 40 kDa y la figura 12 ilustra los resultados obtenidos utilizando un polímero de

aminodextrano de Mm = 70 kDa. La concentración de polímero (% en masa) de los polímeros basados en

aminodextrano típicamente tiene menos impacto sobre la tinción de tejidos; sin embargo, la optimización de la concentración de polímero se puede llevar a cabo para promover la solubilidad del polímero y la prevención del precipitado de sulfato de DAB.

En otros modos de realización divulgados, las soluciones de cromógeno DAB que contienen concentraciones de polímero variables, tales como un 0,05 a un 3 % en masa, de polietilenimina lineal (PEI, base libre de 2,5 kDa o sal de HCl de 4 kDa correspondiente) se pueden usar para tratar la precipitación de sulfato de DAB. Este modo de realización divulgado se puede usar con soluciones de cromógeno DAB que comprenden hasta aproximadamente 4 mM de un estabilizador antioxidante, tal como metabisulfito sódico y típicamente no tendrán un impacto negativo sobre la tinción de tejidos con DAB. Se encontró que otras clases de polímeros de amina, tales como DEAE- dextrano y aminodextrano, reducen significativamente la precipitación de sulfato de DAB con hasta aproximadamente 1 mM de un estabilizador antioxidante, tal como metabisulfito sódico, sin afectar negativamente a la tinción des tejido con DAB; sin embargo, estos modos de realización divulgados particulares típicamente proporcionan una protección mínima frente a la precipitación de sulfato de DAB a aproximadamente 4 mM de metabisulfito sódico. Otros modos de realización divulgados de polímeros de amina incluyen PEI ramificada y polialilamina, que se pueden usar para evitar la precipitación a niveles de estabilizador de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 4 mM. Sin embargo, en un modo de realización, estos polímeros de amina pueden no producir la tinción con DAB deseada de la muestra de tejido.

En base a lo anterior, una lista ejemplar de especies particulares de materiales poliméricos adecuados para la presente invención incluye sulfato de dextrano, sulfonato de poliestireno, copolímero de sulfonato de poliestireno y ácido maleico, polietilenimina lineal, DEAE-dextrano, aminodextrano, poli(2-vinil-1-metilpiridinio bromuro), poli(2- metilacriloxietiltrimetilamonio bromuro), poli(acrilamida/2-metilacriloxietiltrimetilamonio bromuro) y combinaciones de los mismos.

C. Relación DAB/polímero, masas moleculares y concentraciones

En un modo de realización, los polímeros de baja masa molecular tienden a tener menos impacto sobre la tinción con DAB. La capacidad de influir en la contratinción (por ejemplo, contratinción con hematoxilina) también se puede controlar manipulando el % en masa del polímero y la masa molecular. Modos de realización divulgados particulares se refieren a una composición que comprende una solución de cromógeno DAB que comprende cromógeno DAB y/o derivados del mismo, a una concentración que varía de más de 0,1 mM a aproximadamente 100 mM, más típicamente de más de 0,5 mM a aproximadamente 15 mM, incluso más típicamente de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 11 mM, con modos de realización de trabajo que comprenden típicamente de aproximadamente 5 a aproximadamente 11 mM de DAB y/o sus derivados. Los modos de realización divulgados de la composición también comprenden uno o más de los polímeros divulgados o equivalentes de los mismos en los que el polímero tiene una masa molecular que varía de más de 1 kDa a aproximadamente 500 kDa, más típicamente de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 250 kDa, incluso más típicamente de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 100 kDa. El polímero tiene una concentración de polímero que varía de más de un 0,01 a aproximadamente un 10 por ciento en masa, más típicamente de aproximadamente un 0,1 a aproximadamente un 7 por ciento en masa.

En modos de realización divulgados en los que el polímero es un polímero de sulfato de dextrano, la masa molecular del polímero variará típicamente de aproximadamente 5 kDa a aproximadamente 30 kDa a una concentración de polímero de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. Incluso más típicamente, el polímero de sulfato de dextrano tiene una masa molecular que varía de aproximadamente 6,5 kDa a aproximadamente 20 kDa a una concentración de polímero de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. Si el polímero es un polímero de sulfonato de poliestireno, entonces los modos de realización típicos tendrán una masa molecular que varía de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 40 kDa a una concentración de polímero de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. Incluso más típicamente, el

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polímero de sulfonato de poliestireno tendrá una masa molecular que varía de aproximadamente 1 kDa a aproximadamente 35 kDa a una concentración de polímero de aproximadamente un 2 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. Ejemplos de modos de realización de trabajo utilizaron un polímero de sulfonato de poliestireno que tiene una masa molecular de aproximadamente 1,5 kDa y una concentración de polímero de un 2 por ciento en masa. Si la composición comprende un copolímero de sulfonato de poliestireno y ácido maleico, entonces el polímero típicamente tendrá una masa molecular de más de 0 kDa a aproximadamente 20 kDa y una concentración de polímero de más de un 2 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. Si la composición comprende un polímero de polivinilsulfonato, entonces el polímero típicamente tendrá una masa molecular de aproximadamente 4 a aproximadamente 6 kDa y una concentración de polímero de más de un 2 a aproximadamente un 5 por ciento en masa.

Si la composición comprende un polímero de aminodextrano, entonces el polímero típicamente tendrá una masa molecular que varía de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 70 kDa a una concentración de polímero de más de un 0,1 a aproximadamente un 10 por ciento en masa, más típicamente de aproximadamente un 0,25 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. Si la composición comprende un polímero de DEAE-dextrano, entonces el polímero típicamente tendrá una masa molecular que varía de más de 1 kDa a aproximadamente 500 kDa y una concentración de polímero que varía de más de un 0,1 a aproximadamente un 7 por ciento en masa. En otros modos de realización descritas, la composición puede comprender un polímero de polialilamina que tiene una masa molecular de más de 1 kDa a aproximadamente 15 kDa y una concentración de polímero que varía de más de un 0,01 a aproximadamente un 5 por ciento en masa. En modos de realización ejemplares, la composición comprende un polímero de polietilenimina que tiene una masa molecular de aproximadamente 2,5 kDa y una concentración de polímero de aproximadamente un 0,15 por ciento en masa. El polímero de polietilenimina se puede seleccionar entre un polímero de base libre o una sal, en el que la sal típicamente es una sal de HCl de 4 kDa del mismo polímero de base libre de polietilenimina de 2,5 kDa correspondiente.

D. Formulaciones de base de DAB

Un modo de realización de una solución base de DAB comprende cromógeno DAB, uno o más intensificadores y un estabilizador. En un modo de realización, la solución base de DAB comprende un cromógeno DAB y/o derivados del mismo que tiene una concentración que varía de más de 0,1 mM a aproximadamente 15 mM, más típicamente de más de 0,1 mM a aproximadamente 11 mM, un intensificador de imidazol que tiene una concentración que varía de más de 0,01 mM a aproximadamente 15 mM, un intensificador de 2-hidroxipiridina que tiene una concentración que varía de más de 0,01 mM a aproximadamente 15 mM y un estabilizador de metabisulfito sódico que tiene una concentración que varía de más de 0,01 mM a aproximadamente 2 mM. Las soluciones base ejemplares comprenden DAB 5,5 mM, imidazol 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM y metabisulfito sódico 1 mM, con un pH de 2,5 ± 0,1. En un modo de realización, estas composiciones se analizaron usando concentraciones de KHSO4 que varían de 0 a aproximadamente 10 mM; más típicamente 0, 1,37, 2,75 y 8,0 mM, induciendo la precipitación de sulfato de DAB a 4 °C durante la noche. En otro modo de realización, el intensificador se omite de la formulación base de DAB y se incluye en la formulación de oxidante, como se divulga en el presente documento, a concentraciones equivalentes a las especificadas en el presente documento.

Se conocen ciertas composiciones de cromógeno DAB, y están disponibles comercialmente, que no incluyen un estabilizador polimérico como se usa con modos de realización divulgados en la presente solicitud. Por ejemplo, Ventana Medical Systems, Inc. proporciona una formulación de cromógeno DAB que comprende DAB"4HCl 5,5 mM, imidazol 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM, metabisulfito sódico 1 mM, 5 % en masa de PEG8000, Brij 35 al 0,05 % m/v, trihidrato de estannato sódico 750 pM, con un pH de 2,3 ± 0,1.

Un experto en la técnica reconocerá que el metabisulfito sódico se desproporciona en agua para formar 2 moles de bisulfito sódico por mol de metabisulfito sódico. Cada mol de bisulfito sódico puede formar un mol de hidrogenosulfato sódico que puede formar un complejo de sal insoluble con DAB. En un modo de realización se determinó mediante análisis que el sulfato de DAB probablemente sea una sal de monosulfato de DAB.

Ciertos modos de realización divulgados de una nueva composición de cromógeno DAB desarrollada por Ventana Medical Systems, Inc. comprenden DAB"4HCl 5,5 mM, imidazol 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM, metabisulfito sódico 1 mM, un 0,15 % en masa de PEI lineal de 2,5 kDa (base libre o polímeros de sal de HCl de 4 kDa) y Brij 35 al 0,05 % m/v, con un pH de 2,3 ± 0,1. Otros modos de realización de composiciones de cromógeno DAB comprenden un 0,15 % en masa de PEI lineal de 2,5 kDa (base libre o sal de HCl de 4 kDa), un 5-7 % en masa de DEAE-dextrano de 500 kDa, un 2 % en masa de sulfato de dextrano de 6,5-10 kDa y un 2 % en masa de polímeros de PSS de ~1,5 kDa.

IV. Procedimiento de uso de la composición

La presente divulgación también se refiere a modos de realización de un procedimiento para usar composiciones de cromógeno DAB divulgadas en el presente documento. En un modo de realización, el procedimiento puede comprender proporcionar una muestra de tejido que comprende un epítopo; exponer la muestra de tejido a un resto de unión específica marcado y a una enzima marcada; exponer la muestra de tejido a una composición que

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comprende cromógeno DAB o derivado del mismo en una cantidad eficaz para un procedimiento de tinción de tejidos, una cantidad eficaz de estabilizador y polímero en una cantidad eficaz para reducir o prevenir sustancialmente la precipitación de DAB con respecto a una composición que no incluye el polímero; exponer la muestra de tejido a un oxidante y un contratinte; y detectar el epítopo.

En un modo de realización, la muestra de tejido puede ser cualquier muestra de tejido capaz de analizarse usando detección colorimétrica. Modos de realización divulgados particulares se refieren al uso de una muestra de tejido incluida en parafina y fijada en formol. El resto de unión específica marcado se puede marcar con un primer miembro de un par de unión específica, tal como un hapteno (por ejemplo, un oxazol, un pirazol, un tiazol, un compuesto de nitroarilo distinto de dinitrofenilo, un benzofurazano, un triterpeno, una urea, una tiourea, un rotenoide, una cumarina, un ciclolignano, un heterobiarilo, un azoarilo o una benzodiazepina). En un modo de realización, el hapteno se selecciona entre HQ, DIG, DNP, TS, NP, DCC y biotina. Ejemplos de haptenos y conjugados que comprenden haptenos se divulgan en la Patente de EE. UU. n.° 7.695.929.

El resto de unión específica se puede seleccionar entre un anticuerpo o un ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN). En un modo de realización, la enzima marcada es una enzima que está conjugada con un segundo miembro de un par de unión específica, tal como un anticuerpo o avidina. (por ejemplo, estreptavidina). La enzima puede ser una peroxidasa, como la peroxidasa de rábano picante.

La muestra de tejido se puede exponer a la composición divulgada usando una variedad de técnicas diferentes. En un modo de realización, la muestra de tejido se expone a la composición añadiendo soluciones separadas del cromógeno DAB y del polímero a la muestra de tejido simultáneamente, añadiendo secuencialmente soluciones separadas del cromógeno DAB y del polímero a la muestra de tejido, o añadiendo un solución que comprende el cromógeno DAB y el polímero a la muestra de tejido. La composición puede comprender cualquiera de los componentes divulgados descritos en el presente documento. Después de la adición de la composición divulgada, se puede añadir un oxidante, tal como peróxido de hidrógeno, a la muestra de tejido. Además, se puede añadir un contratinte, tal como hematoxilina, a la muestra de tejido. A continuación, se puede detectar un epítopo en la muestra de tejido usando detección colorimétrica. El procedimiento divulgado se puede realizar manualmente o puede estar total o parcialmente automatizado.

V. Kits

La presente divulgación también contempla modos de realización de un kit que comprende la composición divulgada. En un modo de realización, el kit divulgado puede comprender cromógeno DAB o derivado del mismo; un intensificador seleccionado entre imidazol, 2-hidroxipiridina y combinaciones de los mismos; un estabilizador antioxidante, tal como metabisulfito sódico; y un polímero capaz de reducir o prevenir la precipitación de sulfato de DAB con respecto a una composición que no incluye el polímero. Los reactivos se pueden envasar por separado o dos o más reactivos pueden estar en la misma solución.

VI. Muestras y dianas

La composición divulgada se puede usar para detectar una o más dianas en una muestra. Las muestras incluyen componentes biológicos y, en general, se sospecha que incluyen una o más moléculas diana de interés. Las moléculas diana pueden estar en la superficie de las células y las células pueden estar en una suspensión o en un corte de tejido. Las moléculas diana también pueden ser intracelulares y se detectan después de la lisis celular o la penetración de la célula por una sonda. Un experto en la técnica apreciará que el procedimiento de detección de moléculas diana en una muestra variará dependiendo del tipo de muestra y de la sonda utilizada. En la técnica se conocen procedimientos de preparación y recogida de muestras.

Las muestras para uso en los modos de realización del procedimiento y con la composición divulgada en el presente documento, tales como un tejido u otra muestra biológica, se pueden preparar usando cualquier procedimiento conocido en la técnica por un experto en la materia. Las muestras se pueden obtener de un sujeto para un cribado de rutina o de un sujeto que se sospecha que tiene un trastorno, tal como una anomalía genética, una infección o una neoplasia. Los modos de realización descritos del procedimiento divulgado también se pueden aplicar a muestras que no tienen anomalías genéticas, enfermedades, trastornos, etc., que se conocen como muestras «normales». Dichas muestras normales son útiles, entre otras cosas, como controles para la comparación con otras muestras. Las muestras se pueden analizar para muchas finalidades diferentes. Por ejemplo, las muestras se pueden usar en un estudio científico o para el diagnóstico de una posible enfermedad, o como indicadores pronósticos para evaluar el éxito del tratamiento, la supervivencia, etc.

Las muestras pueden incluir múltiples dianas que se pueden unir específicamente mediante una sonda o molécula indicadora. Las dianas pueden ser secuencias de ácido nucleico o proteínas. A lo largo de la presente divulgación, cuando se hace referencia a una proteína diana, se entiende que las secuencias de ácido nucleico asociadas a dicha proteína también se pueden utilizar como una diana. En algunos ejemplos, la diana es una proteína o molécula de ácido nucleico de un patógeno, tal como un virus, bacteria o parásito intracelular, tal como de un genoma vírico. Por ejemplo, una proteína diana se puede producir a partir de una secuencia de ácido nucleico diana asociada a (por

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ejemplo, correlacionada con, causalmente implicada en, etc.) una enfermedad.

Una secuencia de ácido nucleico diana puede variar sustancialmente de tamaño. Sin limitación, la secuencia de ácido nucleico puede tener un número variable de residuos de ácido nucleico. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico diana puede tener aproximadamente 10 residuos de ácido nucleico o aproximadamente 20, 30, 50, 100, 150, 500, 1000 residuos. Del mismo modo, un polipéptido diana pueden variar sustancialmente de tamaño. Sin limitación, el polipéptido diana incluirá un epítopo que se une a un anticuerpo específico de péptido, o fragmento del mismo. En algunas modos de realización, dicho polipéptido puede incluir dos epítopos que se unen a un anticuerpo específico de péptido, o fragmento del mismo.

En ejemplos no limitantes específicos, una proteína diana es producida por una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico genómico diana) relacionada con una neoplasia (por ejemplo, un cáncer). En las células neoplásicas se han identificado numerosas anomalías cromosómicas (incluidas translocaciones y otros reordenamientos, amplificación o deleción), especialmente en las células cancerosas, tales como leucemias de linfocitos B y de linfocitos T, linfomas, cáncer de mama, cáncer de colon, cánceres neurológicos y similares. Por lo tanto, en algunos ejemplos, una parte de la molécula diana es producida por una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómico diana) amplificada o delecionada en una subpoblación de células de una muestra.

Se sabe que los oncogenes son responsables de varias neoplasias malignas humanas. Por ejemplo, los reordenamientos cromosómicos que afectan al gen SYT situado en la región del punto de ruptura del cromosoma 18q11.2 son frecuentes entre los tumores de tejidos blandos de sarcoma sinovial. La translocación t(18q11.2) se puede identificar, por ejemplo, utilizando sondas con diferentes marcadores: la primera sonda incluye moléculas de ácido nucleico FPC generadas a partir de una secuencia de ácido nucleico diana que se extiende distalmente desde el gen SYT y la segunda sonda incluye ácido nucleico FPC generado a partir de una secuencia de ácido nucleico diana que se extiende en dirección 3' o proximal al gen SYT. Cuando las sondas que corresponden a estas secuencias de ácido nucleico diana (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico genómico diana) se usan en un procedimiento de hibridación in situ, las células normales, que carecen de una t(18q11.2) en la región del gen SYT, exhiben dos señales de fusión (generadas por los dos marcadores en proximidad estrecha), lo que refleja las dos copias intactas de SYT. Las células anormales con t(18q11.2) exhiben una única señal de fusión.

En otros ejemplos, se selecciona una proteína diana producida por una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómico diana) que es un gen supresor de tumor que está delecionado (se ha perdido) en las células malignas. Por ejemplo, la región p16 (que incluye D9S1749, D9S1747, p16(INK4A), p14(ARF), D9S1748, p15(INK4B) y D9S1752) localizada en el cromosoma 9p21 está delecionada en ciertos tipos de cáncer de vejiga. Las deleciones cromosómicas que implican a la región distal del brazo corto del cromosoma 1 (que abarca, por ejemplo, SHGC57243, TP73, EGFL3, ABl2, ANGPTL1 y SFIGC-1322) y la región pericentromérica (por ejemplo, 19p13-19q13) del cromosoma 19 (que abarca, por ejemplo, MAN2B1, zNF443, ZNF44, CRX, GLTSCR2 y GLTSCR1) son rasgos moleculares característicos de ciertos tipos de tumores sólidos del sistema nervioso central.

Los ejemplos mencionados anteriormente se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden ser limitantes. Los expertos en la técnica conocen otras numerosas anomalías citogenéticas que se correlacionan con la transformación y/o crecimiento neoplásico. Las proteínas diana producidas por una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencias de ácido nucleico genómico diana) que se han correlacionado con la transformación neoplásica y que son útiles en los procedimientos divulgados también incluyen el gen del EGFR (7p12 por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000007, nucleótidos 55054219-55242525), el gen de C-MYC (8q24.21; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000008, nucleótidos 128817498-128822856), D5S271 (5p15.2), gen de la lipoproteína lipasa (LPL) (8p22; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ nC_000008, nucleótidos 1984105819869049), RBI (13q14; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000013, nucleótidos 47775912-47954023), p53 (17p13.1; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000017, complemento, nucleótidos 75124647531642), N-mYc (2p24; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleótidos 151835231-151854620), cHoP (12q13; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000012, complemento, nucleótidos 56196638-56200567), Fus (16p11.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000016, nucleótidos 31098954-31110601), FKHR (13p14; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000013, complemento, nucleótidos 40027817-40138734), así como, por ejemplo: ALK (2p23; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleótidos 29269144-29997936), cadena pesada de Ig, CCND1 (11q13; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000011, nucleótidos 69165054-69178423), BCL2 (18q21.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000018, complemento, nucleótidos 58941559-59137593), BCL6 (3q27; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000003, complemento, nucleótidos 188921859-188946169), MALF1, AP1 (1p32-p31; por ejemplo, n.° de acceso en GENbAnK™ NC_000001, complemento, nucleótidos 59019051-59022373), TOP2A (17q21-q22; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000017, complemento, nucleótidos 35798321-35827695), TmPrsS (21q22.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000021, complemento, nucleótidos 41758351-41801948), ERG (21q22.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000021, complemento, nucleótidos 38675671-38955488); ETV1 (7p21.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000007, complemento, nucleótidos 13897379-13995289), EWS (22q12.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000022, nucleótidos 27994271-28026505); FLI1 (11q24.1-q24.3; por ejemplo, n.° de

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acceso en GENBANK™ NC_000011, nucleótidos 128069199-128187521), PAX3 (2q35-q37; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, complemento, nucleótidos 222772851-222871944), PAX7 (1p36.2-p36.12; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000001, nucleótidos 18830087-18935219), PTEN (10q23.3; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000010, nucleótidos 89613175-89716382), AKT2 (19q13.1-q13.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000019, complemento, nucleótidos 45431556-45483036), MyCl1 (1p34.2; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000001, complemento, nucleótidos 40133685-40140274), rEl (2p13-p12; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000002, nucleótidos 60962256-61003682) y CSF1R (5q33-q35; por ejemplo, n.° de acceso en GENBANK™ NC_000005, complemento, nucleótidos 149413051149473128).

En otros ejemplos, una proteína diana se selecciona entre un virus u otro microorganismo asociado a una enfermedad o afección. La detección de la secuencia de ácido nucleico diana derivado de virus o de microorganismo (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómico diana) en una muestra de célula o tejido es indicativa de la presencia del organismo. Por ejemplo, el péptido, polipéptido o proteína diana se pueden seleccionar entre el genoma de un virus oncógeno o patógeno, una bacteria o un parásito intracelular (tal como Plasmodium falciparum y otras especies de Plasmodium, Leishmania (sp.), Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, así como especies de Toxoplasma, Eimeria, Theileria y Babesia). En algunos ejemplos, la proteína diana se produce a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) a partir de un genoma vírico. Entre los ejemplos de virus y las correspondientes secuencias genómicas (n.° de acceso en GENBANK™ y RefSeq entre paréntesis) se incluyen adenovirus humano A (NC_001460), adenovirus humano B (NC_004001), adenovirus humano C (NC_001405), adenovirus humano D (NC_002067), adenovirus humano E (NC_003266), adenovirus humano F (NC_001454), astrovirus humano (NC_001943), poliomavirus humano BK (V01109; GI:60851), bocavirus humano (NC_007455), coronavirus humano 229E (NC_002645), coronavirus humano HKU1 (NC_006577), coronavirus humano NL63 (NC_005831), coronavirus humano OC43 (NC_005147), enterovirus humano A (NC_001612), enterovirus humano B (NC_001472), enterovirus humano C (NC_001428), enterovirus humano D (NC_001430), eritrovirus humano V9 (NC_004295), virus espumoso humano (NC_001736), herpesvirus humano 1 (virus del herpes simple de tipo 1) (NC_001806), herpesvirus humano 2 (virus del herpes simple de tipo 2) (NC_001798), herpesvirus humano 3 (virus de varicela zóster) (NC_001348), herpesvirus humano 4 de tipo 1 (virus de Epstein-Barr de tipo 1) (NC_007605), herpesvirus humano 4 de tipo 2 (virus de Epstein-Barr de tipo 2) (NC_009334), herpesvirus humano 5 cepa AD169 (NC_001347), herpesvirus humano 5 cepa Merlin (NC_006273), herpesvirus humano 6A (NC_001664), herpesvirus humano 6B (NC_000898), herpesvirus humano 7 (NC_001716), herpesvirus humano 8 de tipo M (NC_003409), herpesvirus humano 8 de tipo P (NC_009333), virus de inmunodeficiencia humana 1 (NC_001802), virus de inmunodeficiencia humana 2 (NC_001722), metapneumovirus humano (NC_004148), virus del papiloma humano 1 (NC_001356), virus del papiloma humano 18 (Nc_001357), virus del papiloma humano 2 (NC_001352), virus del papiloma humano 54 (NC_001676), virus del papiloma humano 61 (NC_001694), virus del papiloma humano cand90 (NC_004104), virus del papiloma humano RTRX7 (NC_004761), virus del papiloma humano de tipo 10 (NC_001576), virus del papiloma humano de tipo 101 (NC_008189), virus del papiloma humano de tipo 103 (NC_008188), virus del papiloma humano de tipo 107 (NC_009239), virus del papiloma humano de tipo 16 (NC_001526), virus del papiloma humano de tipo 24

(NC_001683), virus del papiloma humano de tipo 26 (NC_001583), virus del papiloma humano de tipo 32

(NC_001586), virus del papiloma humano de tipo 34 (NC_001587), virus del papiloma humano de tipo 4

(NC_001457), virus del papiloma humano de tipo 41 (NC_001354), virus del papiloma humano de tipo 48

(NC_001690), virus del papiloma humano de tipo 49 (NC_001591), virus del papiloma humano de tipo 5

(NC_001531), virus del papiloma humano de tipo 50 (NC_001691), virus del papiloma humano de tipo 53

(NC_001593), virus del papiloma humano de tipo 60 (NC_001693), virus del papiloma humano de tipo 63

(NC_001458), virus del papiloma humano de tipo 6b (NC_001355), virus del papiloma humano de tipo 7

(NC_001595), virus del papiloma humano de tipo 71 (NC_002644), virus del papiloma humano de tipo 9

(NC_001596), virus del papiloma humano de tipo 92 (NC_004500), virus del papiloma humano de tipo 96

(NC_005134), virus de parainfluenza humano 1 (NC_003461), virus de parainfluenza humano 2 (NC_003443), virus de parainfluenza humano 3 (NC_001796), parechovirus humano (NC_001897), parvovirus humano 4 (NC_007018), parvovirus humano B19 (NC_000883), virus sincitial respiratorio humano (NC_001781), rinovirus humano A (NC_001617), rinovirus humano B (NC_001490), retrovirus espumoso humano (NC_001795), virus linfótropo T humano 1 (NC_001436), virus linfótropo T humano 2 (NC_001488).

En ciertos ejemplos, la proteína diana se produce a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómica diana) a partir de un virus oncógeno, tal como el virus de Epstein-Barr (VEB) o un virus del papiloma humano (VPH, por ejemplo, VPH16, VPH18). En otros ejemplos, la proteína diana producida a partir de una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, secuencia de ácido nucleico genómico diana) es de un virus patógeno, tal como un virus sincitial respiratorio, un virus de hepatitis (por ejemplo, virus de la hepatitis C), un coronavirus (por ejemplo, el virus del SRAS), un adenovirus, un poliomavirus, un citomegalovirus (CMV) o un virus del herpes simple (VHS).

VII. Modos de realización de trabajo

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ejemplificar ciertos detalles de modos de realización de trabajo. Un experto en la técnica apreciará que la presente invención no está limitada a aquellas características específicas

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ejemplificadas por estos ejemplos.

A. Procedimientos generales

1. Cribado de polímeros

Los polímeros fueron seleccionados por su impacto sobre la formación de precipitación de sulfato de DAB mediante la combinación de una solución base de DAB mejorada que contiene una cantidad fija de polímero con relaciones molares seleccionadas de hidrogenosulfato de potasio (KHSO4) respecto a DAB. La solución base de DAB mejorada utilizada comprendía DAB"4HCl 5,5 mM, imidazol 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM, metabisulfito sódico 1 mM y Brij 35 al 0,05 % m/v a pH = 2,3 ± 0,1. Las concentraciones de hidrogenosulfato de potasio examinadas fueron 2,75 y 8,0 mM. Las soluciones se mezclaron vigorosamente a temperatura ambiente durante 15 segundos y luego se almacenaron a 2-8 °C para inducir la precipitación de sulfato de DAB. Las soluciones se monitorizaron en busca de cambios físicos (es decir, color o precipitación). Las soluciones candidatas se analizaron por HPLC antes y después de la adición de sulfato para confirmar los cambios en la concentración de DAB con respecto a la 2-hidroxipiridina como patrón interno.

2. Procedimiento de tinción inmunohistoquímica

Toda la inmunohistoquímica se realizó en una plataforma de tinción automatizada Ventana Benchmark XT usando componentes de los kits de detección VENTANA OPTIVIEW® DAB (Ventana Medical Systems, Inc. n.° de cat. 760700) o iView DAB (Ventana Medical Systems, Inc. n.° de cat. 760-091) siguiendo los protocolos de inserción de productos sugeridos. La detección de antígeno se realizó usando anticuerpo CONFIRM® anti-Ki67 (30-9) (Ventana n.° 790-4286) o anticuerpo anti-CD10 (SP67) (Ventana n.° 790-4056) añadiendo una gota de cada anticuerpo e incubando a 37 °C durante 16 minutos. La detección IHQ de DAB se logró mediante la adición de una gota de la solución de cromógeno DAB candidata, seguida de una gota de la solución de H2O2 adecuada y la coincubación durante 8 minutos. Los portaobjetos se contratiñeron con hematoxilina II (Ventana n.° 790-2208) durante 4 minutos, seguido de Bluing (Ventana n.° 760-2037) durante cuatro minutos. Los portaobjetos se enjuagaron con una mezcla de agua y detergente, se deshidrataron a través de gradientes de alcohol y baños de xileno y se cubrieron con cubreobjetos.

3. Procedimiento analítico de HPLC

El análisis por HPLC se realizó usando el siguiente procedimiento y la figura 13 ilustra espectros de HPLC representativos obtenidos usando este procedimiento ejemplar.

Columna: columna Waters Xbridge RP-C18 4,6 x 150 mm (5 pm) (columna de protección de seguridad Phenomenex C18)

Eluyentes: A: agua desionizada, C: acetonitrilo, D: acetato de amonio ac. 100 mM (pH = 5,0)

Caudal: 1 ml/min Perfil de gradiente:

Tiempo (min)

% A % C % D

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4 80 16

12

4 80 16

13

83 1 16

16

83 1

16

Volumen de invección: 3 pl de solución de cromógeno DAB sin dilución Longitud de onda de detección: 260 nm

Tiempo de retención: DAB (4,94 min), 2-hidroxipiridina (3,65 min)

Ejemplos Ejemplo 1

Los polímeros candidatos fueron seleccionados por su impacto sobre la formación de precipitación de sulfato de

10

15

20

25

Base de DAB mejorada (DAB 5,5 mM)

KHSO4 2,75 mM KHSO4 8,0 mM

DAB/2HP

%A DAB/2HP %A

Estándar sin adición de KHSO4

4,49 4,49

Estándar sin polímero añadido

2,22 (b) -50,6 0,40 (b) -91,1

PEG8000, 5 % en masa

2,40 (b) -46,5 n/d n/d

Sulfato de dextrano de 9-20 kDa, 5 % en masa

4,07 -9,4 3,66 -18,5

Sulfato de dextrano de 6,5-10 kDa, 5 % en masa

4,33 -3,6 4,20 -6,5

Sulfonato de poliestireno de 1,53 kDa, 5 % en masa

4,07 -9,4 3,85 -14,3

Sulfonato de poliestireno de 5,18 kDa, 5 % en masa

4,14 -7,8 4,00 -10,9

Copolímero de sulfonato de poliestireno y ácido maleico de 20 kDa, 5 % en masa

4,10 -8,7 4,00 -10,9

Polietilenimina lineal de 2,5 kDa (sal de HCl de 4 kDa), 2 % en masa

4,50 0,0 4,49 0,0

Polietilenimina lineal de 2,5 kDa (base libre), 2 % en masa

4,51 0,0 4,56 0,0

Polietilenimina ramificada de 1,8 kDa (base libre), 2 % en masa

3,82 (a) -14,9 3,82 (a) -14,9

DEAE-dextrano de 500 kDa, 7 % en masa

3,89 (a,b) -13,4 1,08 (b) -75,9

Aminodextrano de 10 kDa, 5 % en masa

3,81 (a,b) -15,1 0,68 (b) -84,9

Poli(2-vinil-1 -metilpiridinio bromuro), 2 % en masa

4,25 (a) -5,3 1,89 (a,b) -57,9

Poli(2-metilacriloxietiltrimetilamonio bromuro), 2 % en masa

4,01 -10,7 1,00 (a,b) -77,7

Poli(acrilamida/2-metilacriloxetiltrimetilamonio bromuro) (80:20), 2 % en masa

1,87 (b) -58,3 0,30 (b) -93,3

DAB mediante la combinación de una solución base de DAB mejorada que contiene una cantidad fija de polímero con relaciones molares seleccionadas de hidrogenosulfato de potasio (KHSO4) respecto a DAB. La solución base de DAB mejorada utilizada comprendía DAB"4HCl 5,5 mM, imidazol 10 mM, 2-hidroxipiridina 10 mM, metabisulfito sódico 1 mM y Brij 35 al 0,05 % m/v a pH = 2,3 ± 0,1. Las concentraciones potenciales de cribado de hidrogenosulfato de potasio fueron 0, 1,37, 2,75 y 8,0 mM. Las soluciones se mezclaron vigorosamente a temperatura ambiente durante 15 segundos y luego se almacenaron a 2 °C-8 °C para inducir la precipitación de sulfato de DAB. Las soluciones se monitorizaron en busca de cambios físicos (es decir, color o precipitación). Las soluciones candidatas se analizaron por HPLC antes y después de la adición de sulfato para confirmar los cambios en la concentración de DAB con respecto a la 2-hidroxipiridina como patrón interno. Los resultados se muestran resumidos en la tabla 2 a continuación.

Los polímeros ilustrativos (sulfato de dextrano y sulfonato de poliestireno) inhibieron sustancialmente la precipitación de DAB, y otros polímeros ilustrativos (DEAE-dextrano y aminodextrano de 10 kDa) también redujeron significativamente la precipitación de DAB. Por ejemplo, las figuras 14-16 ilustran colectivamente los resultados obtenidos usando polímeros de sulfonato y sulfato ejemplares en comparación con un muestreador en el que no se usa polímero (figura 14). La figura 15 es una imagen de un corte de tejido teñido usando la composición divulgada que comprende la solución DAB y un 4 % en masa de sulfonato de poliestireno (1,5 kDa) y la figura 16 es una imagen de un corte de tejido teñido usando la composición divulgada que comprende la solución DAB y un 4 % en masa de sulfato de dextrano (6,5-10 kDa). Las figuras 17 y 18 son imágenes que ilustran los resultados obtenidos usando un control (figura 17) y un 5 % en masa de polialilamina de 15 kDa (figura 18). Otros resultados de HPLC de modos de realización ejemplares de la composición divulgada se resumen en la tabla 2.

Tabla 2: Datos analíticos de HPLC para soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero candidato tratadas con hidrogenosulfato de potasio

a: Nuevos picos de HPLC presentes aún no identificados, b: Se observó precipitado de sulfato de DAB

5

10

15

20

25

30

35

40

El análisis por HPLC mostró que las soluciones de DAB con y sin PEG8000 perdieron una cantidad similar de DAB de la solución después de la adición de la adición de KHSO4 2,75 mM. Se ha informado que los polioles y alcoholes reducen la precipitación de sulfato de DAB. Un aditivo de alcohol no volátil, tal como 1,2-propanodiol, no inhibió la precipitación de sulfato de DAB. Los polímeros de dextrano redujeron pero no inhibieron completamente la precipitación de sulfato de DAB. Se evaluaron otras clases de polímeros tales como alcohol polivinílico (APV), poliacrilamida (PAA), polivinilpirrolidinona (PVP), poli(propilenglicol) (PPG) y no inhibieron la precipitación de sulfato de DAB.

Ejemplo 2

Este ejemplo particular se refiere al uso de polímeros de amina en la composición divulgada. Los polímeros de amina tuvieron un amplio intervalo de influencia sobre la formación de precipitado de sulfato de DAB. Se cree que los polímeros de amina forman sales con el contraanión de sulfato que reduce la frecuencia de formación del sulfato de DAB y/o ayudan a reducir el tamaño de partícula del sulfato de DAB. La precipitación de sulfato de DAB no se observó en las soluciones de cromógeno DAB que contenían polímeros de polietilenimina (PEI) lineal, PEI ramificada o polialilamina (PAA) tras la adición de KHSO4 2,75 u 8,0 mM. Las influencias de la concentración de polímero de PEI lineal (% en masa) se examinaron en este proceso. Se utilizó una PEI lineal de 2,5 kDa como una sal de HCl de 4 kDa y se varió de 0,1 a 5,0 el % en masa en la solución de cromógeno (ver la tabla 3). La PEI lineal inhibió la precipitación de sulfato de DAB en todo el intervalo de concentraciones de polímero a KHSO4 2,75 mM. El precipitado de sulfato de DAB sólo se observó con KHSO4 8,0 mM al 0,1 % en masa de PEI. Los polímeros de PEI lineales y ramificados se examinaron de 0,8 a 25 kDa de tamaño. La masa molecular del polímero no modificó el efecto del polímero sobre la inhibición de la precipitación de sulfato de DAB.

Tabla 3: Datos analíticos de HPLC para soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de amina tratadas con hidrogenosulfato de potasio

Base de DAB mejorada (DAB 5,5 mM)

KHSO4 2,75 mM KHSO4 8,0 mM

DAB/2HP

%A DAB/2HP %A

Estándar sin adición de KHSO4

5,03 5,03

5 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,03 0,4 5,06 1,0

4 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,04 0,6 5,08 1,4

3 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,02 0,2 5,10 1,8

2 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,01 0,0 5,05 0,8

1 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,02 0,2 5,03 0,4

0,5 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,03 0,4 5,05 0,8*

0,1 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,04 0,6* 2,38 -52,5**

* Se observó una neblina muy pequeña en el fondo del vial, pero no se detectó de forma apreciable la formación de precipitado de sulfato de DAB. ** Se observó precipitado de sulfato de DAB con almacenamiento prolongado a 4 °C.

Los polímeros de aminodextrano, DEAE-dextrano y de aminas cuaternarias ayudaron a reducir, pero no inhibieron por completo, la precipitación de sulfato de DAB. La concentración de polímero de amina en % en masa fue importante para estos polímeros. Fueron necesarias concentraciones más altas de DEAE-dextrano para controlar la cantidad de precipitación de sulfato de DAB (ver la tabla 4). El límite de solubilidad en agua para el DEAE-dextrano en condiciones de formulación no permitió que se examinaran concentraciones superiores al 7 % en masa de polímero.

Tabla 4: Datos analíticos de HPLC para soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de DEAE- dextrano de 500 kDa tratadas con hidrogenosulfato de potasio

5

10

15

20

25

30

35

40

DEAE-dextrano de 500 kDa (DAB 5,5 mM)

KHSO4 2,75 mM

DAB/2HP

%A

Base sin polímero ni KHSO4

4,49 n/d

Base sin polímero

2,40 -47

5 % en masa de PEG8000

2,40 -47

3 % en masa de DEAE-dextrano

2,75 -39

4 % en masa de DEAE-dextrano

2,94 -35

5 % en masa de DEAE-dextrano

3,48 -22

6 % en masa de DEAE-dextrano

3,43 -24

7 % en masa de DEAE-dextrano

3,96 -12

La influencia de la concentración del polímero sobre la tinción IHQ con DAB se examinó utilizando un procedimiento de detección iView (tejido de amígdala, Ki67). Se usó una PEI lineal de 2,5 kDa como una sal de HCl de 4 kDa y se varió de 0,1 a 5,0 el % en masa en la solución de cromógeno DAB. Las imágenes representativas se muestran a 20X (ver las figuras 19-22). las soluciones de cromógeno DAB más viscosas redujeron la intensidad de tinción IHQ con DAB y la cobertura del tejido. Las soluciones de cromógenos de mayor viscosidad son bien conocidas por reducir las velocidades de reacción enzimática en ensayos basados en placas. La solubilidad del polímero de amina puede ser un problema a pH neutro en el tampón de reacción Ventana (es decir, polialilamina de 15 kDa), que afectó en gran medida a la intensidad y la cobertura tanto de la tinción IHQ con DAB como de la tinción con hematoxilina.

La influencia de la masa molecular del polímero de aminodextrano sobre la tinción IHQ con DAB se examinó usando un procedimiento de detección iView (tejido de amígdala, Ki67). Se prepararon soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de aminodextrano usando un 4 % en masa de polímeros de diferentes masas moleculares. Las imágenes representativas se muestran a 10X (ver las figuras 9-12). La intensidad de tinción IHQ con DAB no se vio significativamente afectada por el aumento de la masa molecular del polímero. El polímero de aminodextrano era soluble en agua y no tenía efecto sobre la viscosidad de la solución al 4 % en masa.

Se pueden usar soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de amina sin afectar a la tinción IHQ de tejidos con DAB. El % en masa de polímero se puede controlar para ayudar a inhibir la precipitación de sulfato de DAB y controlar la viscosidad de la solución para reducir los efectos perjudiciales de la tinción de tejidos. Ejemplos de modos de realización de trabajo en esta clase incluyen una PEI lineal de 2,5 kDa (base libre de 2,5 kDa o sal de HCl de 4 kDa) y en menor medida DEAE-dextrano de 500 kDa. Las imágenes representativas se muestran en las figuras 23-25. Estas figuras ilustran los resultados de un corte de tejido teñido con soluciones de cromógeno DAB estabilizadas que no comprenden polímero (figura 23); 7 % en masa de DEAE-dextrano de 500 kDa (figura 24); y 2 % en masa de PEI lineal de 2,5 kDa (figura 25). El DEAE-dextrano puede tener una influencia menor sobre la intensidad de tinción con hematoxilina, pero es mucho más sutil que la observada con sulfato de dextrano.

Se tiñeron soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero (solución OPTIVIEW® DAB) en tejido de amígdala para los marcadores de antígenos Ki67 y CD10. Se examinaron dos bloques de tejidos diferentes para cada marcador de antígeno. Se tiñeron cinco muestras de cortes seriados para cada condición. Cada muestra fue evaluada por un anatomopatólogo calificado para determinar la intensidad de tinción IHQ con DAB, l tinción IHQ de fondo y la calidad de la contratinción con hematoxilina. Cada muestra se comparó con el reactivo DAB comercialmente disponible sin polímero (solución OPTIVIEW® DAB). Se puede encontrar un resumen de los resultados de la tinción IHQ de la tabla 5. No se observaron diferencias para la tinción IHQ de fondo entre muestras de cromógeno. Se observaron diferencias sutiles en el contratinte de hematoxilina entre muestras de cromógeno, pero se juzgó que el matiz y las intensidades del contratinte eran aceptables. La base libre de polietilenimina lineal de 2,5 kDa y la correspondiente sal de HCl de PEI lineal de 4 kDa se tiñeron de manera equivalente o mejor que con el reactivo cromógeno comercialmente disponible en todas las muestras excepto en el conjunto de muestras para Ki67. La sal de HCl de PEI lineal de 4 kDa se tiñó ligeramente mejor que la base libre de PEI lineal de 2,5 kDa para CD10.

Tabla 5: Detección IHQ de los antígenos Ki67 y CD10 en la amígdala utilizando soluciones de cromógeno

DAB estabilizadas con polímero

OptiView DAB IHC Intensidad de tinción OptiView DAB IHC Intensidad de tinción

DAB + Polímero estabilizador

(Ki67, amígdala) (CD10, amígdala)

Bloque de tejido 352-10-23

Bloque de tejido 397-10-12 Bloque de tejido 357-10-10 Bloque de tejido 386-10-7

Puntuación promedio Desv. estánd. Puntuación promedio Desv. estánd. Puntuación promedio Desv. estánd. Puntuación promedio Desv. estánd.

A. DAB comercialmente disponible

2,4 0,5 3,0 0,0 1,8 0,4 1,6 0,5

B. A sin PEG ni estannato

2,4 0,5 3,0 0,0 1,4 0,9 1,8 0,4

B. con 0,15 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

2,2 0,4 3,0 0,0 2,0 0,0 2,0 0,0

B. con 0,15 % en masa de PEI lineal (base libre de 2,5 kDa)

2,2 0,4 3,0 0,0 1,8 0,4 1,8 0,4

B. con 2,0 % en masa de sulfato de dextrano (6,5-10 kDa)

1,8 0,4 2,0 0,0 1,4 0,5 1,4 0,5

B. con 2,0 % en masa de sulfonato de poliestireno (1 kDa)

2,8 0,4 2,6 0,5 1,2 0,4 1,0 0,0

B. con 7,0 % en masa de DEAE- dextrano (500 kDa)

1,1 0,5 2,0 0,7 1,4 0,5 1,0 0,5

Las soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de amina se sometieron a estrés térmico a 45 °C 5 para examinar la estabilidad del cromógeno en presencia de los nuevos polímeros. Las soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de sal de HCl de PEI lineal de 4 kDa (equivalente a base libre de 2,5 kDa) demostraron la mayor estabilidad del cromógeno (ver las tablas 6 y 7) para los polímeros sometidos a ensayo. Las soluciones de cromógeno DAB con <1 % en masa de polímero de sal de HCl de PEI lineal de 4 kDa demostraron una estabilidad mayor que la solución de cromógeno base. Las soluciones de cromógeno DAB con polímero de base 10 libre de PEI lineal de 2,5 kDa demostraron una estabilidad similar a la solución de cromógeno base. Los polímeros de PEI ramificada, DEAE-dextrano y los polímeros de amina a 4 °C formaron subproductos con DAB que disminuyeron la estabilidad del cromógeno. Estos subproductos no fueron aislados ni confirmados por análisis estructural.

15 Tabla 6: Datos analíticos de HPLC para soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero sometidas a estrés térmico a 45 °C

1 d - 45 °C 4 d- 45 °C 10d - 45°C 24 d - 45 °C

Base DAB + Polímero

DAB 2HP % A DAB 2HP % A DAB 2HP % A DAB 2HP % A

Sin polímero estándar

4,89 -2,4 4,82 -3,8 4,73 -5,6 3,81 -24

5 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

4,91 -2,0 4,95 -1,2 4,64 -7,4 3,90 -22

4 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

4,90 -2,2 4,95 -1,2 4,68 -6,6 3,97 -21

3 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

4,86 -3,0 4,97 -0,8 4,72 -5,8 3,70 -26

1 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,00 -0,2 4,97 -0,8 4,69 -6,4 4,31 -14

1 d - 45 °C 4 d- 45 °C 10d - 45°C 24 d - 45 °C

Base DAB + Polímero

DAB 2HP % A DAB 2HP % A DAB 2HP % A DAB 2HP % A

0,5 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,01 0,0 5,02 0,2 4,77 -4,8 4,35 -13

0,1 % en masa de PEI lineal (sal de HCl de 4 kDa)

5,00 -0,2 5,02 0,2 4,77 -4,8 4,77 -4,8

5 % en masa de PEI ramificada (sal de HCl de 25 kDa)

2,29 -54** 2,32 -54** 0,82 -84** n/d n/d

4 % en masa de PEI ramificada (sal de HCl de 25 kDa)

2,66 -47** 2,65 -47** 1,53 -69** n/d n/d

3 % en masa de PEI ramificada (sal de HCl de 25 kDa)

2,99 -40** 3,01 -40** 2,05 -59** n/d n/d

2 % en masa de PEI ramificada (sal de HCl de 25 kDa)

3,26 -35** 3,30 -34** 2,70 -46** n/d n/d

7 % en masa de DEAE-dextrano (500 kDa)

4,61 -8,0** 4,51 -10** 4,01 -20** 2,45 -51**

** Nuevos picos de subproductos de HPLC estaban presentes en la solución de cromógeno.

Tabla 7: Datos analíticos de HPLC para soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero sometidas a estrés térmico a 45 °C

Base DAB + 2 % en masa de polímero

1 d - 45 °C 3 d- 45 °C 9 d - 45 °C 23 d - 45 °C

DAB 2HP

% A DAB 2HP % A DAB 2HP % A DAB 2HP % A

Sin polímero de control

4,91 -2,0 4,82 -3,8 4,66 -7,0 3,66 -26,9

Poli(2-vinil-1 -metilpiridinio bromuro)

4,08 -19** 3,70 -26** 2,42 -52** n.d. -100**

Poli(acrilamida/2- metilacriloxetiltrimetilamonio bromuro) (80:20)

4,71 -6,0** 4,50 -10** 4,33 -14** 3,92 -22**

Poli(2-metilacriloxetiltrimetilamonio bromuro)

4,53 -9,6** 4,34 -13** 4,14 -17** 2,15 -57**

PEI ramificada de baja Mm (sal de HCl de 2,0 kDa)

3,21 -36** 3,20 -36** 2,98 -41** 1,26 -75**

PEI ramificada (sal de HCl de 1,3 kDa)

3,37 -33** 3,37 -33** 3,29 -34** 2,27 -55**

PEI ramificada (sal de HCl de 1,8 kDa)

3,42 -32** 3,01 -40** 1,21 -76** n.d. -100**

PEI lineal (polímero de amina libre de 2,5 kDa)

4,97 -0,8 4,89 -2,4 4,71 -6,0 3,60 -28,1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

** Nuevos picos de subproductos de HPLC estaban presentes en la solución de cromógeno.

La precipitación de sulfato de DAB no se observó en las soluciones de cromógeno DAB que contenían polímeros de polietilenimina (PEI) lineal, PEI ramificada o polialilamina (PAA) tras la adición de KHSO4 2,75 u 8,0 mM. Los polímeros de PEI ramificada parecen reaccionar con DAB formando los subproductos observados en el análisis por HPLC. Los polímeros de aminodextrano, DEAE-dextrano y de aminas cuaternarias redujeron, pero no inhibieron por completo, la precipitación de sulfato de DAB. Se observaron nuevos subproductos de DAB-polímero durante el análisis por HPLC con polímeros de aminodextrano y de amina cuaternaria. Los subproductos de DAB-polímero propuestos no fueron aislados ni confirmados por análisis estructural. Materiales pequeños de amina de tipo monomérico, concretamente aminoácidos o etanolaminas (mono-, di- y tri-), no inhibieron la precipitación de sulfato de DAB.

Ejemplo 3

Este ejemplo se refiere a modos de realización particulares de la composición divulgada y polímeros de sulfato y/o sulfonato. Se cree que los polímeros de sulfato y sulfonato forman un complejo de sal DAB-polímero en el que la cadena principal del polímero hidrófilo ayuda a mantener la solubilidad en agua. Las soluciones de cromógeno DAB OptiView se prepararon con concentraciones variables de polímero de sulfato de dextrano (9-29 kDa) (0,25 a 5 % en masa). Se observó un precipitado con las soluciones de cromógeno DAB OptiView que contenían menos de un 1 % en masa de polímero de sulfato de dextrano (9-29 kDa). Se produjo una proporción entre DAB y polímero más alta con soluciones con menor % en masa de polímero de sulfato de dextrano, lo que aumentó la hidrofobia del complejo DAB-polímero y provocó que perdiera solubilidad en agua. No se observó precipitado de sulfato de DAB con las soluciones de cromógeno DAB OptiView con más de un 2 % en masa de sulfato de dextrano (9-29 kDa) después de la adición de cualquiera de KHSO4 2,75 u 8,0 mM. Se observó un efecto similar con polímeros de sulfonato de poliestireno (PSS) de diferentes masas moleculares. Los polímeros PSS más pequeños, tales como PSS de 1,5 o

3.1 kDa, eran más propensos a una baja solubilidad del complejo DAB-polímero a concentraciones con menor % en masa de polímero que sus polímeros PSS de mayor masa molecular. Los polímeros de sulfato de dextrano con una masa molecular de 6 kDa también eran propensos a una menor solubilidad del complejo DAB-polímero.

La influencia de la masa molecular del polímero de PSS sobre la tinción IHQ con DAB se examinó usando un procedimiento de detección iView (tejido de amígdala, Ki67). Se prepararon soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de PSS usando PSS de diferentes masas moleculares al 2 % en masa. Las imágenes representativas se muestran a 10X en las figuras 3-8. La figura 3 ilustra los resultados de un corte de tejido teñido con una solución de cromógeno DAB OptiView. Las figuras 4 a 8 ilustran los resultados de un corte de tejido teñido con una solución de cromógeno DAB estabilizada con un 4 % en masa de sulfonato de poliestireno (1,5 kDa,

5.1 kDa, 7,5 kDa, 16 kDa y 35 kDa, respectivamente). La intensidad y la cobertura de la tinción IHQ con DAB disminuyeron al aumentar la masa molecular de PSS. La molaridad aparente neta del complejo DAB-polímero PSS disminuye al aumentar la masa molecular del polímero. Se ha demostrado que una concentración más baja de DAB causa los efectos observados. La intensidad y el fondo de la contratinción con hematoxilina aumentaron al aumentar la masa molecular del polímero. La intensidad y el fondo de la contratinción con hematoxilina se controlan mediante el pH del tejido durante la aplicación del contratinte. El complejo DAB-polímero PSS depositado sobre el tejido se desprotonará en tampón de reacción Ventana y requiere un ajuste de pH adicional durante la contratinción. Los copolímeros de sulfonato de poliestireno y ácido maleico (PSSMA) con una masa molecular por debajo de 15 kDa no proporcionaron una tinción IHQ con DAB apropiada.

Los polímeros de sulfato y sulfonato tienen un cierto impacto sutil sobre la tinción de tejidos con DAB; sin embargo, este impacto se puede controlar en gran medida con el tamaño y la concentración de polímero. La tinción de tejidos con DAB se redujo y la tinción de fondo con hematoxilina aumentó con polímeros más grandes. El % en masa de polímero tuvo menos impacto sobre la tinción de tejidos con polímeros más pequeños; sin embargo, se requirió una optimización para la solubilidad del complejo polimérico y la prevención del precipitado de sulfato de DAB. Los principales polímeros candidatos de esta clase fueron sulfato de dextrano de baja masa molecular (6-9,5 kDa) y sulfonato de poliestireno (masa molecular = 1,53 kDa, Mn = 1,37 kDa). Se muestran imágenes representativas en las figuras 14-16. Estas figuras ilustran los resultados de un corte de tejido teñido con soluciones de cromógeno DAB estabilizadas que no comprenden polímero (figura 14); que comprenden un 4 % en masa de sulfonato de poliestireno de 1,53 kDa (figura 15); y que comprenden un 4 % en masa de sulfato de dextrano de 6,5-10 kDa (figura 16).

Las soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero de sulfato y sulfonato se sometieron a estrés térmico a 45 °C para examinar la estabilidad del cromógeno en presencia de los nuevos polímeros. Como se estableció anteriormente, los polímeros de PSS de mayor masa molecular se usan en la purificación de agua para secuestrar metales polivalentes. Se sabe que los contaminantes metálicos polivalentes catalizan la oxidación de DAB. Los polímeros de sulfato y sulfonato pueden contener contaminantes metálicos polivalentes potenciales y dar como resultado velocidades de oxidación de DAB más rápidas. Los polímeros de sulfato de dextrano, PSS y PSSMA han demostrado la capacidad de causar una menor estabilidad del cromógeno DAB (véase la tabla 8). Los polímeros de sulfato de dextrano y PSSMA eran propensos a formar subproductos de DAB que se observaron durante el análisis

por HPLC. Estos subproductos no fueron aislados ni confirmados por análisis estructural. Los polímeros de sulfonato de poliestireno (PSS) contenían cantidades variables de contaminantes, que afectan las velocidades de oxidación de DAB. Las soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con PSS fueron tan estables como la solución base en ciertos casos.

5

Tabla 8: Datos analíticos de HPLC para soluciones de cromógeno DAB estabilizadas con polímero sometidas a estrés térmico a 45 °C

Base DAB + 5 % en masa de polímero

1 d - 0°C 5 d- 45 °C 25 d - 45 °C

DAB 2HP

% A DAB 2HP % A DAB 2HP % A

Sin polímero estándar

4,60 n/d 4,57 -0,7 3,10 -33

Sulfato de dextrano de 9-20 kDa

4,15 -9,8 2,13 -53** n/at -100**

Sulfato de dextrano de 6,5-10 kDa

4,58 -0,4 3,92 -15** 0,45 -90**

PSS de 1,53 kDa

4,07 -12 3,70 -20 1,27 -72

PSS de 5,18 kDa

4,28 -7,0 4,10 -11 3,01 -35

Copolímero PSS-ácido maleico de 15 kDa

4,04 -12,2 2,31 -49** n/d n/d

Copolímero PSS-ácido maleico de baja Mm

4,15 -9,8 2,61 -43** n/d n/d

10 ** Nuevos picos de subproductos de HPLC estaban presentes en la solución de cromógeno. t No queda DAB.

En resumen, los polímeros de sulfonato de poliestireno (PSS) de mayor masa molecular se usan en la purificación de agua para secuestrar metales polivalentes. Los contaminantes metálicos polivalentes aumentan las velocidades de oxidación de DAB. Los polímeros de sulfato de dextrano, sulfonato de poliestireno y copolímeros de sulfonato 15 poliestireno y ácido maleico (PSSMA) fueron los principales polímeros candidatos de este grupo para reducir la precipitación de sulfato de DAB. El ácido polivinilsulfónico (PVS de 4-6 kDa, sal de Na) y el sulfato de polietilenglicol (600 Da) no formaron un complejo DAB-polímero soluble en agua. Materiales pequeños de sulfato de tipo monomérico, concretamente hidrogenosulfato de 2-aminoetilo, no formaron complejos de DAB solubles en agua.

Claims (13)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una composición para inmunohistoquímica cromogénica que comprende en una solución:

   a) una solución acuosa tamponada,

   b) un cromógeno de diaminobencidina (DAB),

   c) un estabilizador, y

   d) un polímero de polietilenimina soluble en la solución acuosa tamponada,

   en la que la precipitación del cromógeno DAB de la solución se reduce en condiciones de envejecimiento acelerado con respecto a una composición similar que no comprende el polímero de polietilenimina,

   en la que el estabilizador es metabisulfito sódico o bisulfito sódico.
2. 2. La composición de la reivindicación 1, en la que el polímero de polietilenimina es una polietilenimina lineal o ramificada.
3. 3. La composición de la reivindicación 2, en la que la polietilenimina lineal o ramificada es una sal de HCl de 4 kDa de polietilenimina.
4. 4. La composición de la reivindicación 1, en la que el polímero de polietilenimina tiene una masa molecular media en número de entre 1 kDa y 500 kDa y/o en la que el polímero de polietilenimina es de un 0,05 por ciento a un 10 por ciento en masa de la solución.
5. 5. La composición de la reivindicación 1, en la que el cromógeno DAB tiene una concentración de entre 0,1 mM y 100 mM.
6. 6. La composición de la reivindicación 1, que comprende además un intensificador seleccionado del grupo que consiste en imidazol, 2-hidroxipiridina y combinaciones de los mismos.
7. 7. La composición de la reivindicación 1, en la que el estabilizador es metabisulfito sódico.
8. 8. La composición de la reivindicación 1, en la que el cromógeno DAB es 3,3'-diaminobencidina y el estabilizador es metabisulfito sódico.
9. 9. La composición de la reivindicación 8, en la que la composición comprende de 1 a 15 mM de 3,3'- diaminobencidina, de 0,1 a 6 mM de metabisulfito sódico y de un 0,05 % a un 0,5 % (m/m) de polietilenimina.
10. 10. Un procedimiento para detectar una diana en una muestra de tejido con un cromógeno DAB, que comprende:

    • poner en contacto la muestra de tejido con un resto de unión específica en el que el resto de unión específica

    es específico para la diana,

    • marcar el resto de unión específica con un conjugado enzimático,

    • poner en contacto la muestra de tejido con una composición para inmunohistoquímica cromogénica de

    acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9,

    • poner en contacto la muestra de tejido con un oxidante, en el que una reacción entre el oxidante, la composición para inmunohistoquímica cromogénica y el conjugado de enzima hace que el cromógeno DAB se deposite proximalmente a la diana,

    • poner en contacto la muestra de tejido con un contratinte, y

    • detectar la diana en la muestra de tejido localizando el cromógeno DAB.
11. 11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la muestra de tejido es una muestra de tejido incluida en

    parafina y fijada en formol.
12. 12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las condiciones de almacenamiento incluyen un recipiente

    de almacenamiento sellado que no está en comunicación fluida con otros reactivos y las condiciones de

    detección incluyen el oxidante y la composición para inmunohistoquímica cromogénica depositada en la muestra de tejido y en contacto con la enzima.
13. 13. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el resto de unión específica es un anticuerpo o una sonda de ácido nucleico.

    5 14. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que poner en contacto la muestra de tejido con la composición

    para inmunohistoquímica cromogénica comprende añadir a la muestra de tejido una primera solución componente que comprende el cromógeno DAB, una segunda solución componente que comprende el estabilizante y una tercera solución componente que comprende el polímero de polietilenimina para formar la composición para inmunohistoquímica cromogénica mientras está en contacto con la muestra de tejido.

    10