JPH05227995A - 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット - Google Patents
過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キットInfo
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- JPH05227995A JPH05227995A JP6899692A JP6899692A JPH05227995A JP H05227995 A JPH05227995 A JP H05227995A JP 6899692 A JP6899692 A JP 6899692A JP 6899692 A JP6899692 A JP 6899692A JP H05227995 A JPH05227995 A JP H05227995A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 過酸化物とベンジジン系発色剤を含有する過
酸化物分解性物質測定用指示薬の長期保存を可能にす
る。 【構成】 緩衝液を媒体とし、過酸化物、ベンジジン系
発色剤とともにカチオン及び／または両性界面活性剤を
配合しベンジジン系発色剤を溶解させた過酸化物分解性
物質測定用指示薬。
酸化物分解性物質測定用指示薬の長期保存を可能にす
る。 【構成】 緩衝液を媒体とし、過酸化物、ベンジジン系
発色剤とともにカチオン及び／または両性界面活性剤を
配合しベンジジン系発色剤を溶解させた過酸化物分解性
物質測定用指示薬。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法等の分
野に利用され、ペルオキシダーゼなどの過酸化物分解性
物質を測定する目的で使用される、ベンジジン系発色剤
含有指示薬及びこの指示薬を含む試薬キットに関する。
野に利用され、ペルオキシダーゼなどの過酸化物分解性
物質を測定する目的で使用される、ベンジジン系発色剤
含有指示薬及びこの指示薬を含む試薬キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、酵素免疫測定法等の分野において
は、水性媒体中に過酸化水素などの過酸化物およびベン
ジジン系発色剤を溶解させた指示薬が知られている。こ
の指示薬は、過酸化物分解性物質やこの物質で標識され
た物質等を測定対象として使用するものであり、この過
酸化物分解性物質の測定を、この物質と過酸化物との反
応に伴うベンジジン系発色剤の発色により行うものであ
る。
は、水性媒体中に過酸化水素などの過酸化物およびベン
ジジン系発色剤を溶解させた指示薬が知られている。こ
の指示薬は、過酸化物分解性物質やこの物質で標識され
た物質等を測定対象として使用するものであり、この過
酸化物分解性物質の測定を、この物質と過酸化物との反
応に伴うベンジジン系発色剤の発色により行うものであ
る。
【０００３】この指示薬に用いられるベンジジン系発色
剤は、更に以前より用いられているオルトフェニレンジ
アミン等の発色剤と異なり、発癌性のないものが多く高
感度であるという利点があるが、水にはわずかしか溶解
しない。そのため、従来、メタノール、１−メチル―２
−ピロリドン等の有機溶剤ないしこの溶剤を２０％以上
含む水溶液に、ベンジジン系発色剤を高濃度溶解させ、
使用前に緩衝液等で適当な濃度に希釈して、約１０％の
有機溶剤を含む指示薬の形で使用されていた（例えば、
特開昭６３−１９９２７０号公報、特開昭６２−５００
８８２号公報、特公平２―２５１５２号公報）。
剤は、更に以前より用いられているオルトフェニレンジ
アミン等の発色剤と異なり、発癌性のないものが多く高
感度であるという利点があるが、水にはわずかしか溶解
しない。そのため、従来、メタノール、１−メチル―２
−ピロリドン等の有機溶剤ないしこの溶剤を２０％以上
含む水溶液に、ベンジジン系発色剤を高濃度溶解させ、
使用前に緩衝液等で適当な濃度に希釈して、約１０％の
有機溶剤を含む指示薬の形で使用されていた（例えば、
特開昭６３−１９９２７０号公報、特開昭６２−５００
８８２号公報、特公平２―２５１５２号公報）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし従来の有機溶剤
を多く含むベンジジン系指示薬は、この指示薬を調製す
る前の有機溶剤が高濃度の時は比較的安定であるのに対
し、使用濃度に希釈して指示薬とした後は不安定で、発
色剤が析出する、ペルオキシダーゼなどの過酸化物分解
性物質不存在にもかかわらず発色する（ブランク値が上
昇する）、発色度が低下する等の問題があり、使用濃度
で長期保存できないことから、使用直前に調製すること
が必要であった。更に、従来の指示薬は、その中に含ま
れる有機溶剤が、ペルオキシダーゼ等の過酸化物分解性
物質の酸化反応を阻害するため、特に過酸化物分解性物
質の低濃度域において、感度よく正確に測定することが
困難であった。また、多数の検体を測定する場合、フロ
ーセルを用いることがあるが、従来の指示薬は、フロー
セルに付着しやすいため、発色度の高いサンプルを測定
した場合、発色物がフローセル内に残ることにより、次
のサンプルの測定値が実際より高くなる（キャリーオー
バー）という問題点もあった。
を多く含むベンジジン系指示薬は、この指示薬を調製す
る前の有機溶剤が高濃度の時は比較的安定であるのに対
し、使用濃度に希釈して指示薬とした後は不安定で、発
色剤が析出する、ペルオキシダーゼなどの過酸化物分解
性物質不存在にもかかわらず発色する（ブランク値が上
昇する）、発色度が低下する等の問題があり、使用濃度
で長期保存できないことから、使用直前に調製すること
が必要であった。更に、従来の指示薬は、その中に含ま
れる有機溶剤が、ペルオキシダーゼ等の過酸化物分解性
物質の酸化反応を阻害するため、特に過酸化物分解性物
質の低濃度域において、感度よく正確に測定することが
困難であった。また、多数の検体を測定する場合、フロ
ーセルを用いることがあるが、従来の指示薬は、フロー
セルに付着しやすいため、発色度の高いサンプルを測定
した場合、発色物がフローセル内に残ることにより、次
のサンプルの測定値が実際より高くなる（キャリーオー
バー）という問題点もあった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記問題点
を改善するため鋭意検討した結果、ベンジジン系発色剤
の可溶化剤として、特定の界面活性剤を用いることによ
り、指示薬として長期保存でき、また、低濃度の過酸化
物分解性物質が正確に測定でき、更に、キャリーオーバ
ーが少ない指示薬が得られることを見いだし、本発明に
到達した。すなわち本発明は、下記＜１＞および＜２＞
により構成される。 ＜１＞水性媒体中に過酸化物（Ａ）およびベンジジン系
発色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解性物質
（Ｃ）の測定を、（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う（Ｂ）
の発色により行うことができる指示薬において、更にカ
チオンおよび／または両性界面活性剤から選ばれる可溶
化剤（Ｄ）を含有することを特徴とする過酸化物分解性
物質測定用指示薬。 ＜２＞過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識
された物質を構成品として含む試薬キットにおいて、少
なくとも上記＜１＞項に記載の指示薬もしくはこの指示
薬の各成分をともに構成品とすることを特徴とする試薬
キット。
を改善するため鋭意検討した結果、ベンジジン系発色剤
の可溶化剤として、特定の界面活性剤を用いることによ
り、指示薬として長期保存でき、また、低濃度の過酸化
物分解性物質が正確に測定でき、更に、キャリーオーバ
ーが少ない指示薬が得られることを見いだし、本発明に
到達した。すなわち本発明は、下記＜１＞および＜２＞
により構成される。 ＜１＞水性媒体中に過酸化物（Ａ）およびベンジジン系
発色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解性物質
（Ｃ）の測定を、（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う（Ｂ）
の発色により行うことができる指示薬において、更にカ
チオンおよび／または両性界面活性剤から選ばれる可溶
化剤（Ｄ）を含有することを特徴とする過酸化物分解性
物質測定用指示薬。 ＜２＞過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識
された物質を構成品として含む試薬キットにおいて、少
なくとも上記＜１＞項に記載の指示薬もしくはこの指示
薬の各成分をともに構成品とすることを特徴とする試薬
キット。
【０００６】本発明において、過酸化物（Ａ）として
は、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウ
ム、有機過酸化物（例、クメンペルオキシド、ｔ−ブチ
ルペルオキシド、ジイソプロピルベンゼンペルオキシ
ド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ペルオキシ
ド）等が挙げられる。これらのうち好ましいものは過酸
化水素である。
は、過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウ
ム、有機過酸化物（例、クメンペルオキシド、ｔ−ブチ
ルペルオキシド、ジイソプロピルベンゼンペルオキシ
ド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ペルオキシ
ド）等が挙げられる。これらのうち好ましいものは過酸
化水素である。
【０００７】本発明において、ベンジジン系発色剤
（Ｂ）としては、例えば、ベンジジン、核置換ベンジジ
ン、Ｎ−，Ｎ’−置換ベンジジン、これらの塩酸塩など
の従来公知の各種ベンジジン系発色剤が挙げられる。
（Ｂ）の具体例としては、ベンジジン、ベンジジン・２
ＨＣｌ、o−トリジン、o−トリジン・２ＨＣｌ、o−ジ
アニシジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級アルキ
ル）ベンジジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級ア
ルキル）ベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ2Ｏ、２，７−ジ
アミノフルオレンなどが挙げられる。ここで用いる用語
「低級アルキル」は炭素数１〜６のアルキル基（メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル、並びに種
々のブチル、ペンチル及びヘキシル異性体）を意味す
る。以上（Ｂ）として例示したものは２種以上併用して
もよい。これらのうち好ましいのは３，３’，５，５’
−テトラ（低級アルキル）ベンジジンで、特に好ましい
のは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで
ある。これらのベンジジン系発色剤（Ｂ）の調製は、塩
の形のものはそのまま水性媒体中に添加することがで
き、塩の形でないものは少量の有機溶剤に溶解して水性
媒体中に添加するとよい。
（Ｂ）としては、例えば、ベンジジン、核置換ベンジジ
ン、Ｎ−，Ｎ’−置換ベンジジン、これらの塩酸塩など
の従来公知の各種ベンジジン系発色剤が挙げられる。
（Ｂ）の具体例としては、ベンジジン、ベンジジン・２
ＨＣｌ、o−トリジン、o−トリジン・２ＨＣｌ、o−ジ
アニシジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級アルキ
ル）ベンジジン、３，３’，５，５’−テトラ（低級ア
ルキル）ベンジジン・２ＨＣｌ・２Ｈ2Ｏ、２，７−ジ
アミノフルオレンなどが挙げられる。ここで用いる用語
「低級アルキル」は炭素数１〜６のアルキル基（メチ
ル、エチル、ｎ−プロピル及びイソプロピル、並びに種
々のブチル、ペンチル及びヘキシル異性体）を意味す
る。以上（Ｂ）として例示したものは２種以上併用して
もよい。これらのうち好ましいのは３，３’，５，５’
−テトラ（低級アルキル）ベンジジンで、特に好ましい
のは、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンで
ある。これらのベンジジン系発色剤（Ｂ）の調製は、塩
の形のものはそのまま水性媒体中に添加することがで
き、塩の形でないものは少量の有機溶剤に溶解して水性
媒体中に添加するとよい。
【０００８】本発明において、過酸化物分解性物質
（Ｃ）としては、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ、牛
乳、白血球等から抽出したペルオキシダーゼ）またはカ
タラーゼのような活性酵素、この酵素と同様の作用を現
すヘモグロビンまたはチトクロームＣのようなシュドペ
ルオキシダーゼ、無機金属塩等が挙げられる。これらの
うち好ましいのは、ペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビ
から抽出したペルオキシダーゼである。
（Ｃ）としては、ペルオキシダーゼ（西洋ワサビ、牛
乳、白血球等から抽出したペルオキシダーゼ）またはカ
タラーゼのような活性酵素、この酵素と同様の作用を現
すヘモグロビンまたはチトクロームＣのようなシュドペ
ルオキシダーゼ、無機金属塩等が挙げられる。これらの
うち好ましいのは、ペルオキシダーゼ、特に西洋ワサビ
から抽出したペルオキシダーゼである。
【０００９】本発明において、該可溶化剤（Ｄ）のうち
カチオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アン
モニウム型があり、好ましいのは第４級アンモニウム型
である。第４級アンモニウム型としては塩化ベンザルコ
ニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化テトラデシルジメチ
ルベンジルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベン
ジルアンモニウム、塩化メチルラウリルジメチルベンジ
ルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウムな
どが挙げられる。これらのうち特に好ましいのは、塩化
ベンザルコニウムである。該可溶化剤（Ｄ）のうち両性
界面活性剤としては、アミノ酸型、ベタイン型があり、
好ましいのはベタイン型である。ベタイン型としては、
ラウリルジメチルベタイン、ラウリルジヒドロキシエチ
ルベタイン等が挙げられる。可溶化剤として、カチオン
界面活性剤と両性界面活性剤を併用してもよいが好まし
いのはカチオン界面活性剤である。
カチオン界面活性剤としては、アミン塩型、第４級アン
モニウム型があり、好ましいのは第４級アンモニウム型
である。第４級アンモニウム型としては塩化ベンザルコ
ニウム、塩化ベンゼトニウム、塩化テトラデシルジメチ
ルベンジルアンモニウム、塩化ミリスチルジメチルベン
ジルアンモニウム、塩化メチルラウリルジメチルベンジ
ルアンモニウム、塩化ジデシルジメチルアンモニウムな
どが挙げられる。これらのうち特に好ましいのは、塩化
ベンザルコニウムである。該可溶化剤（Ｄ）のうち両性
界面活性剤としては、アミノ酸型、ベタイン型があり、
好ましいのはベタイン型である。ベタイン型としては、
ラウリルジメチルベタイン、ラウリルジヒドロキシエチ
ルベタイン等が挙げられる。可溶化剤として、カチオン
界面活性剤と両性界面活性剤を併用してもよいが好まし
いのはカチオン界面活性剤である。
【００１０】本発明の指示薬を構成する各成分の含有量
について説明する。本発明の指示薬中の過酸化物
（Ａ）、ベンジジン系発色剤（Ｂ）および該可溶化剤
（Ｄ）の各濃度は、測定方法および発色反応を進めるた
めの条件によって最適濃度が設定されなくてはならな
い。また、これら（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）の相互の
濃度のバランスも考慮するとよい。これらの前提はある
が、本発明の指示薬中の各成分の含有量のうち、該過酸
化物（Ａ）は通常０．００５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましく
は０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌである。該発色剤（Ｂ）
は、通常０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０３
〜１．０ｍｇ／ｍｌである。該可溶化剤（Ｄ）は通常
０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１０ｍ
ｇ／ｍｌである。
について説明する。本発明の指示薬中の過酸化物
（Ａ）、ベンジジン系発色剤（Ｂ）および該可溶化剤
（Ｄ）の各濃度は、測定方法および発色反応を進めるた
めの条件によって最適濃度が設定されなくてはならな
い。また、これら（Ａ）、（Ｂ）および（Ｄ）の相互の
濃度のバランスも考慮するとよい。これらの前提はある
が、本発明の指示薬中の各成分の含有量のうち、該過酸
化物（Ａ）は通常０．００５〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましく
は０．０５〜０．２ｍｇ／ｍｌである。該発色剤（Ｂ）
は、通常０．０１〜５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．０３
〜１．０ｍｇ／ｍｌである。該可溶化剤（Ｄ）は通常
０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜１０ｍ
ｇ／ｍｌである。
【００１１】本発明の指示薬を用いた過酸化物分解性物
質（Ｃ）の測定は、酸性サイド（ｐＨ２．５〜６．５）
でおこなわれることが好ましく、特にｐＨ３．０〜５．
５で測定すると安定で良好な発色度が得られる。発色反
応の場として用いられる緩衝液は前記のｐＨを満足させ
るものであればどのような種類の緩衝液を用いることも
可能であるが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウ
ム緩衝液、クエン酸二ナトリウム／塩酸緩衝液、クエン
酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、コハク酸
／四ホウ酸ナトリウム緩衝液、クエン酸水素カリウム／
四ホウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム／
クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム／塩酸緩衝液、酢酸／
酢酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。この際、好ま
しい緩衝液濃度は０．１〜１００ｍＭ、特に１〜５０ｍ
Ｍである。また、緩衝液中にメタノール、１−メチル―
２−ピロリドン等の有機溶剤が入っていてもよい。本発
明の指示薬は、上記緩衝液に、過酸化物（Ａ）及び可溶
化剤（Ｄ）を添加し、更に、ベンジジン系発色剤（Ｂ）
を添加しよく攪拌することにより得ることができる。発
色反応を行う際の温度は（Ｃ）の反応に最も適した温度
（ペルオキシダーゼなどの酵素の場合、通常２０〜５０
℃）で実施することが好ましい。
質（Ｃ）の測定は、酸性サイド（ｐＨ２．５〜６．５）
でおこなわれることが好ましく、特にｐＨ３．０〜５．
５で測定すると安定で良好な発色度が得られる。発色反
応の場として用いられる緩衝液は前記のｐＨを満足させ
るものであればどのような種類の緩衝液を用いることも
可能であるが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウ
ム緩衝液、クエン酸二ナトリウム／塩酸緩衝液、クエン
酸二水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、コハク酸
／四ホウ酸ナトリウム緩衝液、クエン酸水素カリウム／
四ホウ酸ナトリウム緩衝液、リン酸水素二ナトリウム／
クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム／塩酸緩衝液、酢酸／
酢酸ナトリウム緩衝液などが挙げられる。この際、好ま
しい緩衝液濃度は０．１〜１００ｍＭ、特に１〜５０ｍ
Ｍである。また、緩衝液中にメタノール、１−メチル―
２−ピロリドン等の有機溶剤が入っていてもよい。本発
明の指示薬は、上記緩衝液に、過酸化物（Ａ）及び可溶
化剤（Ｄ）を添加し、更に、ベンジジン系発色剤（Ｂ）
を添加しよく攪拌することにより得ることができる。発
色反応を行う際の温度は（Ｃ）の反応に最も適した温度
（ペルオキシダーゼなどの酵素の場合、通常２０〜５０
℃）で実施することが好ましい。
【００１２】測定の対象となる過酸化物分解性物質
（Ｃ）は、遊離の状態でも、（Ｃ）により免疫活性物質
等の結合性物質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテ
インＡ、アビジン、ビオチン及び一本鎖核酸）が標識さ
れた状態でもよく、更に他の物質と結合後の複合体の状
態であってもよい。
（Ｃ）は、遊離の状態でも、（Ｃ）により免疫活性物質
等の結合性物質（例えば抗原、抗体、ハプテン、プロテ
インＡ、アビジン、ビオチン及び一本鎖核酸）が標識さ
れた状態でもよく、更に他の物質と結合後の複合体の状
態であってもよい。
【００１３】本発明の試薬キットは、過酸化物分解性物
質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識された物質とともに、少
なくとも本発明の指示薬もしくは本発明の指示薬の各成
分を構成品とするものである。ここで、標識される物質
としては、上記に例示したような免疫活性物質等の結合
性物質を用いることができる。本発明の指示薬は、保存
安定性がよいため、このように、本発明の試薬キットの
構成品とすることができ、そうすれば、従来のように指
示薬の各成分を使用の都度配合しなくてもよい利点があ
る。また、本発明の指示薬の各成分の状態で本発明のキ
ットの構成品とすることもでき、使用時の配合は必要で
あるが、それでも、配合後の保存安定性、前記フローセ
ルで測定した場合のキャリーオーバーの減少などの利点
がある。
質（Ｃ）もしくは（Ｃ）で標識された物質とともに、少
なくとも本発明の指示薬もしくは本発明の指示薬の各成
分を構成品とするものである。ここで、標識される物質
としては、上記に例示したような免疫活性物質等の結合
性物質を用いることができる。本発明の指示薬は、保存
安定性がよいため、このように、本発明の試薬キットの
構成品とすることができ、そうすれば、従来のように指
示薬の各成分を使用の都度配合しなくてもよい利点があ
る。また、本発明の指示薬の各成分の状態で本発明のキ
ットの構成品とすることもでき、使用時の配合は必要で
あるが、それでも、配合後の保存安定性、前記フローセ
ルで測定した場合のキャリーオーバーの減少などの利点
がある。
【００１４】以下、酵素免疫測定に利用される例とし
て、「酵素標識抗体」及び「本発明の指示薬」を構成品
として含むキットの例を挙げる。試験管、ガラスビー
ズ、プラスチィックビーズ、マイクロパーティクル、ナ
イロン膜、濾紙等の固相担体に抗体を結合させる。これ
に試料を加え測定対象物質である抗原と反応させる。未
反応物を除去後「酵素標識抗体」を加え、固定化された
抗原と反応させる。未反応の「酵素標識抗体」を固液分
離して除去し、固相と結合した酵素と「本発明の指示
薬」とを反応させ吸光度を測定する。この吸光度は、試
料中の測定対象物質の量に比例するので、既知濃度の標
準物質を測定して作成した検量線から試料中の測定対象
物質量を求めることができる。
て、「酵素標識抗体」及び「本発明の指示薬」を構成品
として含むキットの例を挙げる。試験管、ガラスビー
ズ、プラスチィックビーズ、マイクロパーティクル、ナ
イロン膜、濾紙等の固相担体に抗体を結合させる。これ
に試料を加え測定対象物質である抗原と反応させる。未
反応物を除去後「酵素標識抗体」を加え、固定化された
抗原と反応させる。未反応の「酵素標識抗体」を固液分
離して除去し、固相と結合した酵素と「本発明の指示
薬」とを反応させ吸光度を測定する。この吸光度は、試
料中の測定対象物質の量に比例するので、既知濃度の標
準物質を測定して作成した検量線から試料中の測定対象
物質量を求めることができる。
【００１５】本発明の試薬キットは、例えば酵素免疫反
応を利用し、ＡＦＰ、ＣＥＡ、フェリチンなどの腫瘍マ
ーカー、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、インスリンなどのホル
モン、コーチゾール、Ｔ３、Ｔ４などのハプテンホルモ
ン、ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、肝炎抗原な
どの感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥなどの抗体の測定に
利用することができるが、必ずしもこれらの項目に限定
されるものではない。
応を利用し、ＡＦＰ、ＣＥＡ、フェリチンなどの腫瘍マ
ーカー、ＴＳＨ、ＬＨ、ＦＳＨ、インスリンなどのホル
モン、コーチゾール、Ｔ３、Ｔ４などのハプテンホルモ
ン、ジゴキシン、テオフィリンなどの薬物、肝炎抗原な
どの感染性物質、肝炎抗体、ＩｇＥなどの抗体の測定に
利用することができるが、必ずしもこれらの項目に限定
されるものではない。
【００１６】また、酵素免疫測定以外の検査試薬とし
て、「本発明の指示薬」を構成品として含むヘモグロビ
ン定量試薬キットの例を挙げる。「本発明の指示薬」、
過酸化ストロンチウムを混合する。その後、ヘモグロビ
ンを含む試料を添加して一定時間反応する。吸光度をブ
ランクを対照として測定する。既知濃度のヘモグロビン
を測定して作成した検量線から、試料中のヘモグロビン
濃度を求める。
て、「本発明の指示薬」を構成品として含むヘモグロビ
ン定量試薬キットの例を挙げる。「本発明の指示薬」、
過酸化ストロンチウムを混合する。その後、ヘモグロビ
ンを含む試料を添加して一定時間反応する。吸光度をブ
ランクを対照として測定する。既知濃度のヘモグロビン
を測定して作成した検量線から、試料中のヘモグロビン
濃度を求める。
【００１７】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。 調製例１〜４、比較調製例１ ２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、可溶化剤である塩化ベンザルコニウム［三洋
化成工業（株）製］が２ｍｇ／ｍｌになる様に添加し、
更に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・
２ＨＣｌ（SIGMA CHEMICAL COMPANY製、以下ＴＭＢと略
す）３ｍｇ添加しよく攪拌することにより、本発明の指
示薬［１］を得た。可溶化剤として塩化テトラデシルジ
メチルベンジルアンモニウムを用いた以外は、上記と同
様の方法で本発明の指示薬［２］を得た。可溶化剤とし
て塩化ベンゼトニウムを用いた以外は、上記と同様の方
法で本発明の指示薬［３］を得た。可溶化剤として塩化
ジデシルジメチルアンモニウムを用いた以外は、上記と
同様の方法で本発明の指示薬［４］を得た。一方、１０
％の１―メチル―２―ピロリドンを含む２０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍｌに、０．０５ｍｇ／ｍ
ｌになる様に過酸化水素を添加し、更に、ＴＭＢを３ｍ
ｇ添加しよく攪拌することにより、比較の指示薬［５］
を得た。
が本発明はこれに限定されるものではない。 調製例１〜４、比較調製例１ ２０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍｌに、過
酸化水素が０．０５ｍｇ／ｍｌになる様に添加する。こ
の溶液に、可溶化剤である塩化ベンザルコニウム［三洋
化成工業（株）製］が２ｍｇ／ｍｌになる様に添加し、
更に、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン・
２ＨＣｌ（SIGMA CHEMICAL COMPANY製、以下ＴＭＢと略
す）３ｍｇ添加しよく攪拌することにより、本発明の指
示薬［１］を得た。可溶化剤として塩化テトラデシルジ
メチルベンジルアンモニウムを用いた以外は、上記と同
様の方法で本発明の指示薬［２］を得た。可溶化剤とし
て塩化ベンゼトニウムを用いた以外は、上記と同様の方
法で本発明の指示薬［３］を得た。可溶化剤として塩化
ジデシルジメチルアンモニウムを用いた以外は、上記と
同様の方法で本発明の指示薬［４］を得た。一方、１０
％の１―メチル―２―ピロリドンを含む２０ｍＭクエン
酸緩衝液（ｐＨ５．０）２０ｍｌに、０．０５ｍｇ／ｍ
ｌになる様に過酸化水素を添加し、更に、ＴＭＢを３ｍ
ｇ添加しよく攪拌することにより、比較の指示薬［５］
を得た。
【００１８】実施例１、比較例１ 指示薬の調製後の安定性（溶解性）を比較するため、指
示薬［１］〜［５］を調製直後より１年、４℃で保存
し、ＴＭＢの析出の有無を調べた結果を下記表１に示
す。
示薬［１］〜［５］を調製直後より１年、４℃で保存
し、ＴＭＢの析出の有無を調べた結果を下記表１に示
す。
【００１９】
【表１】
【００２０】実施例２、比較例２ この実施例と比較例は、指示薬のブランクの上昇、活性
の低下を比較したものである。 （１）ＰＯＤ溶液の調製 １％牛血清アルブミン、０．８５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．
２、０．０２Ｍリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ［６］と略
す）１ｍｌに、ペルオキシダーゼ［東洋紡（株）製、以
下ＰＯＤと略す］０．５ｍｇを溶解し、更に、ＰＢＳ
［６］で５００倍希釈して、ＰＯＤ溶液［７］を得た。 （２）ブランク試験 指示薬［１］、［２］、［５］の６５０ｎｍの吸光度を
分光光度計［島津製作所（株）製、ＵＶ−１６０Ａ］を
用いて、水を対照にして測定した。更に、指示薬
［１］、［２］、［５］を４℃、４０℃に１ヶ月保存し
たものについても、同様にブランクを測定した。結果を
下記表２に示す。 （３）発色度試験 指示薬［１］、［２］、［５］各３００μｌに、ＰＯＤ
溶液［７］を５０μｌ添加し、３７℃、１５分反応させ
た。その後、分光光度計を用いて、６５０ｎｍの発色度
を測定した。更に、４℃、４０℃に１ヶ月保存した指示
薬［１］、［２］、［５］についても、同様にＰＯＤ溶
液［７］を反応させ、吸光度を測定した。結果を下記表
２に示す。
の低下を比較したものである。 （１）ＰＯＤ溶液の調製 １％牛血清アルブミン、０．８５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．
２、０．０２Ｍリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳ［６］と略
す）１ｍｌに、ペルオキシダーゼ［東洋紡（株）製、以
下ＰＯＤと略す］０．５ｍｇを溶解し、更に、ＰＢＳ
［６］で５００倍希釈して、ＰＯＤ溶液［７］を得た。 （２）ブランク試験 指示薬［１］、［２］、［５］の６５０ｎｍの吸光度を
分光光度計［島津製作所（株）製、ＵＶ−１６０Ａ］を
用いて、水を対照にして測定した。更に、指示薬
［１］、［２］、［５］を４℃、４０℃に１ヶ月保存し
たものについても、同様にブランクを測定した。結果を
下記表２に示す。 （３）発色度試験 指示薬［１］、［２］、［５］各３００μｌに、ＰＯＤ
溶液［７］を５０μｌ添加し、３７℃、１５分反応させ
た。その後、分光光度計を用いて、６５０ｎｍの発色度
を測定した。更に、４℃、４０℃に１ヶ月保存した指示
薬［１］、［２］、［５］についても、同様にＰＯＤ溶
液［７］を反応させ、吸光度を測定した。結果を下記表
２に示す。
【００２１】
【表２】
【００２２】実施例３、比較例３ この実施例と比較例は、各濃度のペルオキシダーゼにつ
いて、発色度の比較を行ったものである。 （１）ＰＯＤ溶液の希釈系列の準備 ＰＯＤ溶液［７］を、ＰＢＳ［６］を用いて２、４、８
倍に希釈し、ＰＯＤ濃度が０．５、０．２５、０．１２
５μg/mlのものを調製した。これらとＰＯＤ溶液［７］
の無希釈品（ＰＯＤ濃度１．０μg/ml）を合わせ、計４
種類の濃度のものを準備した。 （２）希釈直線性試験 指示薬［１］、［５］各３００μｌに、（１）で準備し
た各濃度のＰＯＤ溶液５０μｌを添加し、３７℃、１５
分反応させ、実施例２の発色度試験に準じて各ＰＯＤ溶
液の吸光度を測定した。その結果を下記表３及び図１に
示す。図１は、横軸にＰＯＤ濃度、縦軸に発色度（６５
０ｎｍの吸光度）をとり、ＰＯＤ濃度と発色度の関係を
示したグラフである。指示薬［５］に比べ指示薬［１］
は低値においても直線性があり正確な測定が可能である
ことを示している。
いて、発色度の比較を行ったものである。 （１）ＰＯＤ溶液の希釈系列の準備 ＰＯＤ溶液［７］を、ＰＢＳ［６］を用いて２、４、８
倍に希釈し、ＰＯＤ濃度が０．５、０．２５、０．１２
５μg/mlのものを調製した。これらとＰＯＤ溶液［７］
の無希釈品（ＰＯＤ濃度１．０μg/ml）を合わせ、計４
種類の濃度のものを準備した。 （２）希釈直線性試験 指示薬［１］、［５］各３００μｌに、（１）で準備し
た各濃度のＰＯＤ溶液５０μｌを添加し、３７℃、１５
分反応させ、実施例２の発色度試験に準じて各ＰＯＤ溶
液の吸光度を測定した。その結果を下記表３及び図１に
示す。図１は、横軸にＰＯＤ濃度、縦軸に発色度（６５
０ｎｍの吸光度）をとり、ＰＯＤ濃度と発色度の関係を
示したグラフである。指示薬［５］に比べ指示薬［１］
は低値においても直線性があり正確な測定が可能である
ことを示している。
【００２３】
【表３】
【００２４】実施例４、比較例４ この実施例と比較例は、フローセルを用いて吸光度を測
定した時の、キャリーオーバーの程度を比較したもので
ある。 （１）高吸光度の発色物の調製 指示薬［１］〜［５］各３００μｌに、ＰＯＤ溶液
［７］５０μｌを添加して、３７℃、１５分反応させ、
発色物［１ａ］〜［５ａ］を得た。 （２）キャリーオーバーの試験 発色物［１ａ］〜［５ａ］及び未反応指示薬［１］〜
［５］をそれぞれ実施例２の分光光度計のフローセルを
用い、以下の順序で測定した。 指示薬［１］ 測定順Ｎｏ． １ ２ ３ ４ 測定対象 ［１ａ］［１］［１］［１］ 指示薬［２］ 測定順Ｎｏ． １ ２ ３ ４ 測定対象 ［２ａ］［２］［２］［２］ 同様にして、発色物［３ａ］〜［５ａ］及び指示薬
［３］〜［５］の測定を行った。キャリーオーバーの程
度はＮｏ．１とＮｏ．２の吸光度比［（Ｎｏ．２／Ｎ
ｏ．１）×１００（％）］により比較評価した。結果を
下記表４に示す。
定した時の、キャリーオーバーの程度を比較したもので
ある。 （１）高吸光度の発色物の調製 指示薬［１］〜［５］各３００μｌに、ＰＯＤ溶液
［７］５０μｌを添加して、３７℃、１５分反応させ、
発色物［１ａ］〜［５ａ］を得た。 （２）キャリーオーバーの試験 発色物［１ａ］〜［５ａ］及び未反応指示薬［１］〜
［５］をそれぞれ実施例２の分光光度計のフローセルを
用い、以下の順序で測定した。 指示薬［１］ 測定順Ｎｏ． １ ２ ３ ４ 測定対象 ［１ａ］［１］［１］［１］ 指示薬［２］ 測定順Ｎｏ． １ ２ ３ ４ 測定対象 ［２ａ］［２］［２］［２］ 同様にして、発色物［３ａ］〜［５ａ］及び指示薬
［３］〜［５］の測定を行った。キャリーオーバーの程
度はＮｏ．１とＮｏ．２の吸光度比［（Ｎｏ．２／Ｎ
ｏ．１）×１００（％）］により比較評価した。結果を
下記表４に示す。
【００２５】
【表４】
【００２６】
（１）本発明の指示薬は、保存安定性が良好なので、試
薬キットの構成品とすることができる。従来の指示薬
は、調製後不安定で、発色剤が析出する、ペルオキシダ
ーゼなどの過酸化物分解性物質不存在にもかかわらず発
色する（ブランク値が上昇する）、発色度が低下するた
め、使用直前に調製しなければならない等の問題があっ
たのを解決するものである。 （２）本発明の指示薬は、過酸化物分解性物質の低濃度
域においても、感度良く正確に測定できるという利点が
ある。即ち、従来の指示薬で見られた様な、ペルオキシ
ダーゼ等の過酸化物分解性物質の酸化反応を阻害するこ
とがない。 （３）本発明の指示薬は、界面活性剤を可溶化剤として
用いるため、セルに指示薬が付着し難い。即ち、フロー
セルを用いて測定する場合、従来の指示薬で見られたキ
ャリーオーバーがほとんど認められない。 （４）本発明の指示薬は、界面活性剤の殺菌作用により
防腐される。
薬キットの構成品とすることができる。従来の指示薬
は、調製後不安定で、発色剤が析出する、ペルオキシダ
ーゼなどの過酸化物分解性物質不存在にもかかわらず発
色する（ブランク値が上昇する）、発色度が低下するた
め、使用直前に調製しなければならない等の問題があっ
たのを解決するものである。 （２）本発明の指示薬は、過酸化物分解性物質の低濃度
域においても、感度良く正確に測定できるという利点が
ある。即ち、従来の指示薬で見られた様な、ペルオキシ
ダーゼ等の過酸化物分解性物質の酸化反応を阻害するこ
とがない。 （３）本発明の指示薬は、界面活性剤を可溶化剤として
用いるため、セルに指示薬が付着し難い。即ち、フロー
セルを用いて測定する場合、従来の指示薬で見られたキ
ャリーオーバーがほとんど認められない。 （４）本発明の指示薬は、界面活性剤の殺菌作用により
防腐される。
【図１】図１は、実施例３，比較例３における指示薬
［１］及び［５］の、ＰＯＤ濃度と発色度の関係を示し
たものである。
［１］及び［５］の、ＰＯＤ濃度と発色度の関係を示し
たものである。
Claims (7)
- 【請求項１】 水性媒体中に過酸化物（Ａ）およびベン
ジジン系発色剤（Ｂ）を溶解させてなり、過酸化物分解
性物質（Ｃ）の測定を、（Ａ）と（Ｃ）との反応に伴う
（Ｂ）の発色により行うことができる指示薬において、
更にカチオンおよび／または両性界面活性剤から選ばれ
る可溶化剤（Ｄ）を含有することを特徴とする過酸化物
分解性物質測定用指示薬。 - 【請求項２】 （Ｄ）が第４級アンモニウム塩型カチオ
ン界面活性剤である請求項１記載の指示薬。 - 【請求項３】 （Ｄ）の含有量が０．０１〜５０mg/ml
である請求項１または２記載の指示薬。 - 【請求項４】 （Ｂ）が３，３’，５，５’−テトラメ
チルベンジジンである請求項１〜３のいずれか記載の指
示薬。 - 【請求項５】 （Ｂ）の含有量が０．０１〜５mg/mlで
ある請求項１〜４のいずれか記載の指示薬。 - 【請求項６】 （Ｃ）がペルオキシダーゼである請求項
１〜５のいずれか記載の指示薬。 - 【請求項７】 過酸化物分解性物質（Ｃ）もしくは
（Ｃ）で標識された物質を構成品として含む試薬キット
において、少なくとも請求項１〜６のいずれか記載の指
示薬もしくはこの指示薬の各成分をともに構成品とする
ことを特徴とする試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6899692A JPH05227995A (ja) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6899692A JPH05227995A (ja) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05227995A true JPH05227995A (ja) | 1993-09-07 |
Family
ID=13389788
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6899692A Pending JPH05227995A (ja) | 1992-02-17 | 1992-02-17 | 過酸化物分解性物質測定用指示薬および試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05227995A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5804404A (en) * | 1996-01-22 | 1998-09-08 | Dako Corporation | Stable substrate-chromogen solutions for enenzyme activity detection |
| WO2013110549A1 (en) * | 2012-01-23 | 2013-08-01 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymer stabilization of chromogen solutions |
| JP2018158317A (ja) * | 2017-03-23 | 2018-10-11 | 学校法人甲南学園 | 難水溶性物質の可溶化剤 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63501595A (ja) * | 1985-10-30 | 1988-06-16 | セルテク リミティド | 結合アッセイ装置 |
| JPS63501983A (ja) * | 1985-12-12 | 1988-08-04 | デニソン マニユフアクチユアリング カンパニ− | 試験物質の測定 |
| JPH01101898A (ja) * | 1987-10-13 | 1989-04-19 | Taunzu:Kk | ペルオキシダーゼ活性測定用試薬 |
| JPH0310696A (ja) * | 1989-06-09 | 1991-01-18 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 体液成分の測定方法 |
-
1992
- 1992-02-17 JP JP6899692A patent/JPH05227995A/ja active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63501595A (ja) * | 1985-10-30 | 1988-06-16 | セルテク リミティド | 結合アッセイ装置 |
| JPS63501983A (ja) * | 1985-12-12 | 1988-08-04 | デニソン マニユフアクチユアリング カンパニ− | 試験物質の測定 |
| JPH01101898A (ja) * | 1987-10-13 | 1989-04-19 | Taunzu:Kk | ペルオキシダーゼ活性測定用試薬 |
| JPH0310696A (ja) * | 1989-06-09 | 1991-01-18 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 体液成分の測定方法 |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5804404A (en) * | 1996-01-22 | 1998-09-08 | Dako Corporation | Stable substrate-chromogen solutions for enenzyme activity detection |
| WO2013110549A1 (en) * | 2012-01-23 | 2013-08-01 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymer stabilization of chromogen solutions |
| US9618429B2 (en) | 2012-01-23 | 2017-04-11 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymer stabilization of chromogen solutions |
| EP2807269B1 (en) * | 2012-01-23 | 2018-05-02 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymer stabilization of chromogen solutions |
| US12123813B2 (en) | 2012-01-23 | 2024-10-22 | Ventana Medical Systems, Inc. | Polymer stabilization of chromogen solutions |
| JP2018158317A (ja) * | 2017-03-23 | 2018-10-11 | 学校法人甲南学園 | 難水溶性物質の可溶化剤 |
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