ES2677595T3 - Compuestos heterocíclicos aromáticos como compuestos antiinflamatorios - Google Patents

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Abstract

Un compuesto de fórmula (I):**Fórmula** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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25
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35
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DESCRIPCION
Compuestos heterodclicos aromaticos como compuestos antiinflamatorios Campo de la invencion
La invencion se refiere a un compuesto el cual es un inhibidor de la familia de enzimas protema quinasas activadas por mitogeno p38 (denominados en esta invencion inhibidores de p38 MAP quinasa), por ejemplo sus subtipos de alfa y gamma quinasas, y la familia Src de tirosina quinasas, y a su utilizacion en terapia, incluyendo en combinaciones farmaceuticas, especialmente en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, en particular enfermedades inflamatorias del pulmon, tales como asma o EPOC, asf como tambien aquellas enfermedades del tracto gastrointestinal, tales como colitis ulcerativa, enfermedad intestinal irritable (EII) y enfermedad de Crohn y del ojo, tal como uveitis.
Antecedentes de la invencion
Cuatro isoformas de p38 MAPK (alfa, beta, gamma y delta respectivamente), han sido identificadas exhibiendo cada una diferentes patrones de expresion tisular en el hombre. Las isoformas de p38 MAPK alfa y beta son encontradas ubicuamente en el cuerpo, estando presentes en muchos tipos celulares diferentes. La isoforma alfa es bien caracterizada en terminos de su rol en la inflamacion. Si bien los estudios que utilizan un enfoque genetico qrnmico en ratones indican que la isoforma beta de p38 MAPK no juega un rol en la inflamacion (O'Keefe, S.J. et al., J. Biol. Chem., 2007, 282(48), 34663-71), puede estar involucrada en mecanismos de dolor a traves de la regulacion de la expresion de COX2 (Fitzsimmons, B.L. et al., Neuroreport, 2010, 21(4), 313-7). Estas isoformas son inhibidas por una cantidad de compuestos de peso molecular pequeno previamente descritos. Las primeras clases de inhibidores eran sumamente toxicos debido a la amplia distribucion en los tejidos de estas isoformas lo cual dio como resultado multiples efectos fuera del objetivo de los compuestos. Por anadidura, el desarrollo de una cantidad sustancial de inhibidores ha sido discontinuado debido a perfiles inaceptables de seguridad en estudios clmicos (Pettus, L.H. y Wurz, R.P., Curr. Top. Med. Chem., 2008, 8(16), 1452-67). Como estos efectos adversos vanan con el quimiotipo, y los compuestos tienen patrones distintos de selectividad de quinasa, las toxicidades observadas pueden estar relacionadas con la estructura mas que basadas en el mecanismo de p38. Mas recientemente, se han desarrollado compuestos con mayor potencia y especificidad para p38a/p MAPK; sin embargo, los niveles de eficacia logrados en el tratamiento de enfermedades inflamatorias cronicas, incluyendo la artritis reumatoidea (SCIO-469, Genovese et al., J. Rheumatol., 2011, 38, 846-54; Pamapimod, Cohen et al., Arthritis Rheum., 2009, 60, 335-344; BMS-582949, Schieven et al., Arthritis Rheum., 2010, 62, Suppl. 10:1513) y EPOC (Losmapimod, Watz et al., Lancet Resp. Med., 2014, 2, 63-72) han sido decepcionantes. Adicionalmente, cabe destacar que se descubrio que un inhibidor de p38 MAPK proporciona beneficio para pacientes con EII despues de tratamiento durante una semana el cual no fue sostenido durante un curso de tratamiento de cuatro semanas (BIRB-796, Schreiber, S. et al., Clin. Gastro. Hepatology, 2006, 4, 325-334).
Una conclusion importante a la cual se llega a partir de estos estudios es que el uso de un inhibidor de quinasa espedfico del objetivo puede no ser suficiente para lograr y mantener un beneficio terapeutico en enfermedades inflamatorias complejas, donde la desregulacion de multiples vfas inmunoinflamatorias y adaptacion biologica pueden evitar el bloqueo de un mecanismo de un solo objetivo, dando como resultado la perdida de respuesta. Se puede argumentar que para enfermedades inflamatorias complejas tales como EPOC, artritis reumatoidea y EII, los inhibidores que se dirigen hacia un conjunto de quinasas que son cnticos para la regulacion de los diferentes mecanismos inmunoinflamatorios vinculados con la patologfa tendran mayor potencial para lograr eficacia y una respuesta terapeutica sostenida.
El rol de p38 MAPK-alfa en la regulacion de las vfas inflamatorias ha sido investigado extensamente y esta bien establecido. Menos se sabe acerca de las isoformas p38 MAPK gamma y delta, las cuales, a diferencia de las isozimas alfa y beta se expresan en tejidos y celulas espedficos. La isoforma p38 MAPK-delta es expresada mas altamente en el pancreas, testfculos, pulmon, intestino delgado y en el rinon. Es tambien abundante en macrofagos y detectable en neutrofilos, celulas T CD4+ y en celulas endoteliales (Shmueli, O. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10-11), 1067-1072; Smith, S. J. Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7), 4246-52; Wang, X. S. et al., J. Biol. Chem., 1997, 272(38), 23668-23674). Muy poco se sabe acerca de la distribucion de p38 MAPK gamma si bien se expresa mas altamente en el cerebro, musculo esqueletico y en el corazon, asf como tambien en linfocitos y macrofagos (Shmueli, O. et al., Comptes Rendus Biologies, 2003, 326(10- 11), 1067-1072; Hale, K. K., J. Immunol., 1999, 162(7), 4246-52; Court, N. W. et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 2002, 34(4), 413-26; Mertens, S. et al., FEBS Lett., 1996, 383(3), 273-6). La evidencia en cuanto a que las p38 MAPK- gamma y p38 MAPK-delta quinasas se expresan en tipos celulares inmunologicamente importantes y proinflamatorios ha suscitado interes en sus funciones con relacion a p38 MAPK-alfa. Los inhibidores selectivos de molecula pequena de p38 MAPK gamma y p38 MAPK delta no estan actualmente disponibles para evaluar los roles de estas quinasas farmacologicamente, si bien un compuesto previamente descrito, BIRB 796, se sabe que posee actividad inhibidora de isoforma pan. La inhibicion de las isoformas p38 MAPK gamma y delta es observada en concentraciones mas altas del compuesto que aquellas requeridas para inhibir p38 MAPK alfa y p38 beta (Kuma, Y., J. Biol. Chem., 2005, 280, 19472-19479). Ademas BIRB 796 tambien deterioro la fosforilacion de p38 MAPKs o JNKs por la quinasa corriente arriba MKK6 o MKK4. Kuma describio la posibilidad de que el cambio conformacional
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causado por la union del inhibidor a la protema MAPK puede afectar la estructura de ambos su sitio de fosforilacion y el sitio de acoplamiento para el activador corriente arriba, deteriorando de ese modo la fosforilacion de p38 MAPKs o JNKs.
Se cree que p38 MAP quinasa juega un rol pivotal en muchas de las vfas de senalizacion que estan involucradas en la iniciacion y mantenimiento de la inflamacion persistente, cronica en enfermedades humanas, por ejemplo, en asma severo y en EPOC (Chung, F., Chest, 2011, 139(6), 1470-1479). En la actualidad existe abundante bibliograffa la cual demuestra que p38 MAP quinasa es activada por un rango de citoquinas proinflamatorias y que su activacion da como resultado el reclutamiento y la liberacion de citoquinas proinflamatorias adicionales. Por ejemplo, Smith describe el efecto inhibidor de inhibidores de p38 MAP quinasa sobre la liberacion de TNFa de las PBMCs humanas. Sin embargo, la produccion de algunas citoquinas (IL-8 y GM-CSF) por macrofagos de tejido del pulmon aislados de fumadores y ex-fumadores fue relativamente insensible a los inhibidores de p38a/p MAPK y Smith sugiere que la abundancia de p38 MAPK-delta expresada en estas celulas podna dar cuenta de los efectos disminuidos de los compuestos (Smith et al., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404). Risco et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2012, 109, 11200-11205) han utilizado ratones con desactivacion genica de p38 MAPK-gamma y p38 MAPK-delta para investigar los roles de estas isoformas de p38 en vfas que regulan la produccion de citoquinas por macrofagos. Estos estudios establecieron que en ratones ambas quinasas son esenciales para respuestas inflamatorias inmunes innatas incluyendo la produccion de citoquinas proinflamatorias. Mas recientemente, Criado, G. et al., (Arthritis Rheum., 2014, 66(5), 1208-17) han demostrado que en un modelo de raton de artritis inflamatoria la severidad reducida de la enfermedad en ratones p38Y/6-/- estaba asociada con la produccion mas baja de citoquinas y con la activacion inmunologica que en ratones de control normales, lo cual indica que p38 MAPK gamma y p38 MAPK delta son reguladores cruciales de la patologfa articular inflamatoria. Estos descubrimientos sugieren que ademas de p38 MAPK alfa, p38 MAPK gamma y p38 MAPK delta son potenciales objetivos terapeuticos en enfermedades complejas que involucran respuestas inmunes innatas y adaptativas tal como EPOC.
El uso de inhibidores de p38 MAP quinasa en el tratamiento de la enfermedad pulmonar obstructiva cronica (EPOC) tambien ha sido investigado. Los inhibidores de molecula pequena dirigidos a p38 MAPK a/p han demostrado ser eficaces para reducir diversos parametros de inflamacion en celulas y en tejidos obtenidos de pacientes con EPOC, quienes son generalmente insensibles a los corticoides, (Smith, S.J., Br. J. Pharmacol., 2006, 149, 393-404) asf como tambien diversos modelos animales in vivo (Underwood, D.C. et al., Am. J. Physiol., 2000, 279, L895-902; Nath, P. et al., Eur. J. Pharmacol., 2006, 544, 160-167). Irusen y colaboradores tambien han sugerido el posible involucramiento de p38 MAPK a/p con la insensibilidad a los corticoides via la reduccion de la afinidad de union del receptor de glucocorticoide (RG) en los nucleos (Irusen, E. et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2002, 109, 649-657). La experiencia clmica con un rango de inhibidores de p38 MAP quinasa, incluyendo AMG548, BIRB 796, VX702, SCIO469 y SCIO323 ha sido descrita (Lee, M.R. y Dominguez, C., Current Med. Chem., 2005, 12, 2979-2994).
EPOC es una afeccion en la cual se informa sobre una inflamacion subyacente que es sustancialmente resistente a los efectos antiinflamatorios de los corticoides inhalatorios. Por lo tanto, una estrategia superior para tratar la EPOC sena desarrollar una intervencion que tenga tanto efectos antiinflamatorios inherentes como la capacidad de aumentar la sensibilidad de los tejidos pulmonares de pacientes con EPOC a los corticoides inhalados. Una publicacion reciente de Mercado (Mercado, N., et al., Mol. Pharmacol., 2011, 80(6), 1128-1135) demuestra que el silenciamiento de p38 MAPK-y tiene el potencial de restaurar la sensibilidad a los corticoides. Tambien se ha informado que P38 MAPK alfa (Mercado, N. et al., PLoS ONE, 2012, 7(7), e41582, 1-9) y JNK (Papi et al., J. Allergy Clin. Immunol., 2013, 132, 1075-1085) tienen roles en la regulacion de la insensibilidad a los corticoides y Armstrong et al. (JPET, 2011, 338, 732-740) han demostrado que el inhibidor de isoforma p38 mixto BIRB-796 y el corticoide dexametasona tienen efectos antiinflamatorios sinergicos sobre los macrofagos alveolares de EPOC. Por consiguiente puede haber un beneficio para los pacientes en el uso de un inhibidor de MAP quinasa menos p38 alfa-espedfico para el tratamiento de EPOC y del asma severo.
Muchos pacientes con diagnostico de asma o de EPOC continuan sufriendo smtomas no controlados y exacerbaciones de su afeccion medica que pueden derivar en hospitalizacion. Esto ocurre a pesar del uso de los regfmenes de tratamiento mas avanzados, actualmente disponibles, que comprenden productos de combinacion de un corticoide inhalatorio y un p-agonista de larga duracion. Los datos acumulados en la ultima decada indican que una imposibilidad del manejo eficaz del componente inflamatorio subyacente de la enfermedad en el pulmon es la razon mas probable para que se produzcan las exacerbaciones. Dada la eficacia establecida de los corticoides como agentes antiinflamatorios y, en particular, de los corticoides inhalatorios en el tratamiento del asma, estos descubrimientos han provocado una intensa investigacion. Los estudios resultantes han identificado que algunas agresiones ambientales invocan cambios inflamatorios insensibles a los corticoides en los pulmones de los pacientes. Un ejemplo es la respuesta que surge de infecciones del tracto respiratorio superior mediadas por virus (URTI, por sus siglas en ingles), que tienen particular importancia en el aumento de la morbidez asociada con asma y EPOC.
Las investigaciones epidemiologicas han revelado una fuerte asociacion entre infecciones virales del tracto respiratorio superior y un porcentaje sustancial de las exacerbaciones sufridas por pacientes que ya tienen un diagnostico de enfermedades respiratorias cronicas. Algunos de los datos mas convincentes sobre este tema derivan de estudios longitudinales de ninos que sufren de asma (Papadopoulos, N.G. et al., Paediatr. Respir. Rev., 2004, 5(3), 255-260). Diversos estudios adicionales respaldan la conclusion en cuanto a que una infeccion viral
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puede precipitar exacerbaciones y aumentar la severidad de la enfermedad. Por ejemplo, se ha informado que infecciones clmicas experimental con rinovirus causan hipersensibilidad bronquial a la histamina en pacientes asmaticos que no responde al tratamiento con corticoides (Grunberg, K., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2001, 164(10), 1816-1822). La evidencia adicional deriva de la asociacion observada entre las exacerbaciones de la enfermedad en pacientes con fibrosis qmstica e infecciones por VRH (Wat, D. et al., J. Cyst. Fibros., 2008, 7, 320328). Tambien consistente con este cuerpo de informacion es el descubrimiento de que las infecciones virales respiratorias, incluyendo rinovirus, representan un factor de riesgo independiente que se correlaciona negativamente con la tasa de supervivencia de 12 meses en receptores de trasplante pulmonar pediatricos (Liu, M. et al., Transpl. Infect. Dis, 2009, 11(4), 304-312).
TLR3 es un receptor de reconocimiento del patron de patogeno endosomico que detecta el dsRNA viral que es producido durante la infeccion viral. En celulas epiteliales bronquiales humanas (BEAS2B) la via de TLR3 es activada como respuesta a la infeccion por rinovirus (RV1B y RV39) (Wang et al., J. Immunol., 2009, 183, 69896997). El dsRNA inhalado y la infeccion por rinovirus provocan la exacerbacion de neutrofilos en ratones alergicos con asma experimental establecido (Mahmutovic-Persson et al., Allergy, 2014, 69(3), 348-358). En un modelo de asma alergico, ratones con desactivacion de TLR3 infectados con rinovirus demostraron una reduccion de la infiltracion de neutrofilos y macrofagos en los pulmones y una inflamacion de las vfas respiratorias significativamente inferior cuando se compara con los controles TLR3 positivos (Wang, Q. et al., PLoS Pathog., 7(5), e1002070). En conjunto, estas observaciones sugieren que la activacion de la via de TLR3 probablemente juega un rol importante en el desarrollo de la inflamacion de las vfas respiratorias y en las exacerbaciones de la enfermedad respiratoria como respuesta a las infecciones del tracto respiratorio mediadas por rinovirus
En celulas humanas infectadas con rinovirus, se ha demostrado que la activacion de TLR3 involucra el reclutamiento del receptor y la activacion de c-Src quinasa la cual interviene en multiples efectos celulares corriente abajo. Ha aparecido una pequena cantidad de estudios que vinculan a la activacion de la familia de quinasas Src (Src1 o p60- Src) o Src celular con respuestas espedficas luego de la infeccion con los virus. Estos estudios incluyen un informe que se refiere a que el adenovirus produce una activacion mediada por PI3 quinasa de Akt a traves de un mecanismo dependiente de c-Src. Se informa que la actividad de Syk quinasa es controlada por c-Src como una quinasa corriente arriba en la infeccion de VRH (Lau et al., J. Immunol., 2008, 180, 870-880). Se ha sugerido ademas que la produccion de IL-8 inducida por Rinovirus-39 en celulas epiteliales depende de la activacion de Src quinasa (Bentley, J.K. et al., J. Virol., 2007, 81, 1186-1194). Finalmente, se ha propuesto que la activacion de Src quinasa esta involucrada en la induccion de la produccion de mucina por rinovirus-14 en celulas epiteliales y glandulas de la sub-mucosa (Inoue, D. et al., Respir. Physiol. Neurobiol., 2006, 154(3),484-499).
Se ha descrito previamente que los compuestos que inhiben p59-HCK son eficaces contra la replicacion del virus de la gripe (Charron, C.E. et al., WO 2011/070369). Ciertos inhibidores de p38 MAPK tambien han sido descritos como inhibidores de la replicacion del virus sincicial respiratorio (Cass, L. et al., WO 2011/158039).
Por los motivos antes sintetizados, los compuestos disenados para tratar enfermedades respiratorias cronicas que combinan la inhibicion de c-Src y p59-HCK quinasas con la inhibicion de p38 MAPKs, se espera que sean particularmente eficaces.
Ademas de jugar roles clave en eventos de senalizacion celular los cuales controlan la actividad de las vfas proinflamatorias, ahora tambien se reconoce que las enzimas quinasas regulan la actividad de un rango de funciones celulares. Entre las que han sido descritas recientemente estan el mantenimiento de la integridad del ADN (Shilo, Y. Nat. Rev. Cancer, 2003, 3, 155-168) y la coordinacion de los procesos complejos de division celular. Una ilustracion de descubrimientos recientes es una publicacion que describe el impacto de un conjunto de inhibidores que da curso a las llamadas “Olaharsky quinasas” sobre la frecuencia de la formacion de micronucleos in vitro (Olaharsky, A.J. et al., PLoS Comput. Biol., 2009, 5(7), e1000446). La formacion de micronucleos esta implicada en, o asociada con, la disrupcion de los procesos mitoticos y es por lo tanto una manifestacion indeseable de potencial toxicidad. Se descubrio que la inhibicion de glucogeno sintasa quinasa 3a (GSK3a) era un factor particularmente significativo que aumenta la probabilidad de que un inhibidor de quinasa promueva la formacion de micronucleos. Recientemente, tambien se ha informado de que la inhibicion de la quinasa GSK3p con RNAi promueve la formacion de micronucleos (Tighe, A. et al., BMC Cell Biology, 2007, 8:34).
Puede ser posible atenuar los efectos adversos que surgen de las interacciones farmacologicas con Olaharsky quinasas, tales como GSK3a, mediante la optimizacion de la dosis y/o cambiando la ruta de administracion. Sin embargo, sena mas ventajoso identificar moleculas terapeuticamente utiles que demuestren actividad baja o indetectable contra estas enzimas fuera de objetivo y por consiguiente que produzcan poca o ninguna disrupcion de los procesos mitoticos, segun lo medido en ensayos de mitosis.
Resulta evidente a partir de la consideracion de la bibliografia citada en lo que antecede que sigue existiendo la necesidad de identificar y desarrollar nuevos inhibidores de p38 MAP quinasa que tienen potencial terapeutico mejorado con respecto a los tratamientos actualmente disponibles. Los compuestos deseables son aquellos que exhiben un mdice terapeutico superior ejerciendo, al menos, un efecto igualmente eficaz a los agentes previos pero, en uno o mas aspectos, que sean menos toxicos a la dosis terapeutica relevante. Un objetivo de la presente invencion por lo tanto, consiste en proporcionar ese tipo de compuesto novedoso que inhibe la actividad enzimatica
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de p38 MAP quinasa, por ejemplo con ciertas especificidades de subtipo (particularmente alfa y gamma), asf como tambien inhibiendo la actividad enzimatica de tirosina quinasa dentro de la familia de Src (tal como p59-HCK y particularmente c-Src) teniendo de ese modo buenas propiedades antiinflamatorias, y adecuadas para utilizar en terapia. El compuesto de la invencion exhibe actividad debil o no inhibitoria de Olaharsky quinasas, tal como GSK3a y exhibe actividad debil o ninguna actividad inhibitoria de SYK quinasa lo cual contribuye con su perfil esperado de seguridad favorable.
Smtesis de la invencion
De acuerdo con la invencion, se proporciona un compuesto de formula (I):
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Me (I)
o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
El compuesto de formula (I) junto con sus sales farmaceuticamente aceptables es algunas veces denominado en la presente “el compuesto de la presente invencion” o en forma similar.
Breve descripcion de las figuras
La Figura 1 muestra un espectro de IR (micro ATR) de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 2
Figure 2 muestra un patron de XRD en polvo de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 2
La Figura 3 muestra un patron de XRD en polvo de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 1
La Figura 4 muestra una curva de DSC de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 2
La Figura 5 muestra una curva de TGA de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 2
La Figura 6 muestra una superposicion de DVS de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 2
La Figura 7 muestra un grafico cinetico de DVS de una muestra del compuesto de formula (I), sal maleato, Forma 2
La Figura 8 muestra el resultado de los ensayos de estabilidad qmmica sobre diversas composiciones que contienen el compuesto de la invencion (en formas de base libre y sal maleato).
La Figura 9 muestra el efecto de los compuestos de ensayo sobre la Liberacion de IL-8 inducida por rinovirus en celulas BEAS2B
Descripcion detallada de la invencion
El compuesto de formula (I) puede ser preparado o empleado en la forma de una sal farmaceuticamente aceptable, incluyendo las sales de adicion de acido, no toxicas, terapeuticamente activas que el compuesto de formula (I) es capaz de formar. Estas sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables pueden ser obtenidas convenientemente tratando la forma de base libre con dichos acidos apropiados en un solvente adecuado o mezcla de solventes. Los acidos apropiados comprenden, por ejemplo, acidos inorganicos tales como acidos haltndridos, por ej. acido clortndrico o bromtndrico, sulfurico, mtrico, acidos fosforicos y acidos similares; o acidos organicos tales como, por ejemplo, acido acetico, propanoico, hidroxiacetico, lactico, piruvico, malonico, succmico, maleico,
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fumarico, malico, tartarico, cftrico, metansulfonico, etansulfonico, bencensulfonico, p-toluensulfonico, ciclamico, salidlico, p-aminosalidlico, pamoico y acidos similares. Preferentemente, el compuesto de formula (I) es empleado en la forma de su sal maleato. A la inversa dichas formas de sales pueden ser convertidas mediante tratamiento con una base apropiada en la forma de base libre.
La invencion proporcionada en la presente se extiende a todos los estereoisomeros del compuesto de formula (I). El termino estereoisomeros como se emplea en la presente se refiere a moleculas isomericas que tienen la misma formula molecular y secuencia de atomos unidos (constitucion), pero que difieren solamente en las orientaciones tridimensionales de sus atomos en el espacio.
Tal como se ha empleado en la presente, la definicion del compuesto de formula (I) tiene el proposito de incluir a todos los tautomeros de dichos compuestos, y solvatos de dichos compuestos (incluyendo los solvatos de las sales de dichos compuestos) a menos que el contexto indique espedficamente lo contrario. Los ejemplos de solvatos incluyen a los hidratos.
El compuesto descrito incluye un compuesto en el cual el atomo especificado es un isotopo natural o no natural. En una realizacion el isotopo es un isotopo estable. Por lo tanto el compuesto descrito incluye, por ejemplo, compuestos que contienen deuterio y similares.
La descripcion se extiende ademas a todas las formas polimorficas de los compuestos definidos en la presente.
Un primer proceso para preparar un compuesto de formula (I) o un derivado protegido del mismo comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (II)
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o un derivado protegido del mismo donde LG1 representa un grupo saliente; con un compuesto de formula (III)
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o un derivado protegido del mismo;
y opcionalmente desproteger el producto para proporcionar un compuesto de formula (I).
En los compuestos de formula (II), los ejemplos de grupos salientes LG incluyen halo (especialmente Cl, Br) y ariloxi-, especialmente fenoxi-.
Los grupos protectores adecuados y medios para su remocion son descritos infra.
Las condiciones adecuadas para la reaccion de los compuestos de formula (II) y (III) incluyen tratar una mezcla de (II) y (III) en un solvente adecuado tal como THF, DCM o acetato de isopropilo con trietilamina o base de Hunig y calentar la reaccion hasta una temperatura tal como 40°C.
Un segundo proceso para preparar un compuesto de formula (I) comprende hacer reaccionar un compuesto de 5 formula (IV)
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O
A
H H
imagen5
NH
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(IV)
o un derivado protegido del mismo, con un compuesto de formula (V)
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An
LG
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(V)
10 donde LG2 representa un grupo saliente, tal como halo y especialmente Cl
o un derivado protegido del mismo
y opcionalmente desproteger el producto para dar un compuesto de formula (I).
Los grupos protectores adecuados y medios para su remocion son descritos infra.
Las condiciones adecuadas para la reaccion de los compuestos de formula (IV) y (V) incluyen aquellas normalmente 15 empleadas para la reaccion de Buchwald, es decir, tratamiento de una solucion de (IV) y (V) en un solvente tal como 1,4-dioxano con una fuente de paladio y ligando tal como Pd2(dba)3 y BINAP y una base tal como terc-butoxido de sodio o carbonato de cesio a temperatura elevada.
Los ligandos alternativos incluyen difenilfosfinoferroceno y trifenilfosfina; las fuentes de paladio alternativas incluyen acetato de paladio (II) y tetrakis(trifenilfosfina)paladio(0); las bases alternativas incluyen bis(trimetilsilil)amida de litio 20 y fosfato potasico; los solventes alternativos incluyen THF y tolueno. Para un rango mas amplio de condiciones, ver Surry, D.S., Buchwald, S.L. (2008), "Biaryl Phosphane Ligands in Palladium-Catalyzed Amination", Angew. Chem. Int. Ed., 47, 6338-6361, y sus referencias.
Los compuestos de formula (II) pueden ser preparados mediante reaccion de un compuesto de formula (VI)
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con un compuesto de formula LG1C(=O)LG3 donde LG3 representa un grupo saliente tal como halo y especialmente Cl.
Las condiciones adecuadas para la reaccion de un compuesto de formula (VI) con un compuesto de formula LG- 5 1C(=O)LG3 donde LG1 es PhO y LG3 es Cl comprenden el tratamiento de una mezcla de una solucion de compuesto
de formula (VI) en un solvente tal como acetato de isopropilo y una solucion acuosa de una base inorganica tal como carbonato sodico con cloroformiato de fenilo.
Los compuestos de formula (VI) son conocidos o se pueden preparar mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica.
10 Un primer proceso para preparar un compuesto de formula (III) comprende reducir un compuesto de formula (VII)
imagen10
Las condiciones adecuadas para la reduccion de un compuesto de formula (VII) incluyen tratamiento con gas hidrogeno sobre catalizador de platino en carbono. Esta reaccion puede llevarse a cabo a presion elevada en un solvente tal como THF acidificado con acido acetico. Alternativamente puede llevarse a cabo en un solvente tal 15 como DCM/MeOH bajo condiciones de flujo usando un hidrogenador H-Cube.
Un segundo proceso para preparar un compuesto de formula (III) comprende desproteger un compuesto de formula (VIII)
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donde Pi representa un grupo protector de amina.
20 Los grupos protectores adecuados y medios para su remocion son descritos mas adelante. Un grupo protector mas adecuado es Boc el cual puede ser eliminado mediante tratamiento con acido tal como TFA o HCl.
Un primer proceso para preparar un compuesto de formula (VII) comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (IX)
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(IX)
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con un compuesto de formula (X)
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(X)
donde Hal representa halogeno, especialmente Cl.
Las condiciones adecuadas para la reaccion de los compuestos de formula (IX) y (X) incluyen aquellas mencionadas con anterioridad para la reaccion de los compuestos de formula (IV) y (V).
Un segundo proceso para preparar un compuesto de formula (VII) comprende hacer reaccionar un compuesto de 10 formula (XI)
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(XI)
Hal
donde Hal representa halogeno, especialmente Cl con un compuesto de formula (XII)
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15 Las condiciones adecuadas para la reaccion de los compuestos de formula (XI) y (XII) incluyen el tratamiento de una solucion de (XI) y (XII) en un solvente tal como 1,4-dioxano con una fuente de paladio y ligando tal como Pd2(dba)3 y BINAP y una base tal como terc-butoxido de sodio o carbonato de cesio a temperatura elevada.
Un primer proceso para preparar un compuesto de formula (VIII) comprende hacer reaccionar un compuesto de formula (XIII)
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nh2
con un compuesto de formula (X)
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(X)
donde Hal representa halogeno, especialmente Cl.
Las condiciones adecuadas para la reaccion de los compuestos de formula (XIII) y (X) son las mismas a las descritas con anterioridad para la reaccion de los compuestos de formula (IX) y (X).
Un segundo proceso para preparar los compuestos de formula (VIII) comprende hacer reaccionar un compuesto de 10 formula (XIV)
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Hal
donde Hal representa halogeno, especialmente Cl con un compuesto de formula (XII)
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15 Las condiciones adecuadas para la reaccion de los compuestos de formula (XIV) y (XII) son las mismas a las descritas con anterioridad para la reaccion de los compuestos de formula (XI) y (XII).
Los compuestos de formula (IX) pueden ser preparados como se muestra en el esquema a continuacion:
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(IX)
Los reactivos de este proceso son compuestos conocidos. Las condiciones de Mitsunobu incluyen el tratamiento de una mezcla de un fenol y un alcohol con trifenilfosfina y diisopropilazodicarboxilato en un solvente tal como THF. Para un rango mas amplio de condiciones, ver Swamy, K. C.; Kumar, N. N.; Balaraman, E.; Kumar, K. V. (2009). "Mitsunobu and Related Reactions: Advances and Applications" Chemical Reviews 109 (6): 2551-2651, y las referencias alli citadas.
Los compuestos de formula (XI) pueden ser preparados como se muestra en el esquema que aparece a continuacion:
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(XI)
Los reactivos de este proceso son compuestos conocidos. Las condiciones de Mitsunobu incluyen aquellas proporcionadas anteriormente.
Los compuestos de formula (XIII) pueden ser preparados como se muestra en el esquema que aparece a continuacion:
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Los reactivos de este proceso son compuestos conocidos. Las condiciones de alquilacion incluyen el tratamiento de una mezcla de un fenol y un haluro de alquilo con una base tal como carbonato de cesio o de potasio en un solvente tal como acetonitrilo o DMF opcionalmente a temperatura elevada.
Los compuestos de formula (XIV) pueden ser preparados como se muestra en el esquema que aparece a continuacion:
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donde LG5 es un grupo saliente tal como aquellos mencionados con anterioridad para LG4.
Los reactivos de este proceso son compuestos conocidos. Las condiciones de alquilacion incluyen aquellas proporcionadas con anterioridad.
Los compuestos de formula (IV), (V), (VI), (X) y (XII) son conocidos o pueden ser preparados mediante metodos conocidos por el experto en la tecnica. Con respecto al compuesto de formula (IV) ver, por ejemplo, WO2010/067131, y espedficamente la estructura del compuesto a la que se hace referencia como “Intermedio A”. Con respecto al compuesto de formula (VI) ver, por ejemplo, WO00/043384, y espedficamente el compuesto de formula LXVII.
Una forma no solvatada cristalina aparentemente estable de la forma de base libre del compuesto de la invencion se puede obtener por recristalizacion de la solucion (preferentemente temperatura caliente, por ej. de reflujo) en acetonitrilo. En el caso de que se produzca otra forma, esta forma puede ser obtenida suspendiendo en acetonitrilo.
Segun lo senalado con anterioridad, la sal maleato es una forma del compuesto de la invencion de particular interes. La sal maleato puede ser preparada tratando la forma de base libre del compuesto de la invencion con acido maleico en un solvente adecuado.
En un proceso preferido, la sal maleato es preparada tratando una solucion del compuesto de la invencion en 2- butanona con una solucion de acido maleico en 2-butanona. Se deja que se produzca la cristalizacion, la cual puede ser asistida con sembrado. La sal maleato como su polimorfo cristalino Forma 2 se prepara de este modo. La forma 2 polimorfo cristalino puede obtenerse ademas enfriando una solucion caliente de la sal maleato del compuesto de la invencion en 2-butanona, por ej. entre 50 °C y temperatura ambiente. Se deja que se produzca la cristalizacion, la cual puede ser asistida con sembrado.
El polimorfo cristalino Forma 2 de la sal maleato del compuesto de la invencion se caracteriza por tener posiciones de los picos en un patron de XRD en polvo a 4.2, 8.4, 8.7, 11.0, 11.5, 12.6, 14.4, 14.9, 16.0, 17.0, 17.4, 18.8,
19.5, 20.2, 21.7, 22.4, 23.8, 25.8 y 26.3 (± 0.2) grados en 2-theta (ver la Figura 2). Los picos (el doblete) en 8.4 y
8.7 (± 0.2) grados en 2-theta son especialmente caractensticos para el polimorfo cristalino Forma 2 puesto que los picos en estas posiciones estan ausentes en el patron de XRD del polimorfo cristalino de Forma 1.
El polimorfo cristalino Forma 2 tiene un elevado punto de fusion (aprox. 199 °C) con una morfologfa tipo placa.
Otra forma cristalina de la sal maleato del compuesto de la invencion fue identificada luego de la recristalizacion a partir de THF el cual tiene propiedades menos favorables que aquellas de la Forma 2. Tiene una morfologfa tipo aguja y un punto de fusion inferior, aprox. 148 °C. Se hace referencia a esta forma cristalina como la Forma 1.
El polimorfo cristalino Forma 1 de la sal maleato del compuesto de la invencion se caracteriza por tener posiciones de los picos en un patron de XRD en polvo en 3.8, 6.3, 7.8, 9.3, 9.9, 10.7, 11.2, 12.7, 15.4, 16.5, 17.9, 19.2 y
19.6 (± 0.2) grados (vease la Figura 3). Los picos en 6.3, 7.8 y 9.9 (± 0.2) grados en 2-theta son especialmente
caractensticos para el polimorfo cristalino de Forma 1 puesto que los picos en estas posiciones estan ausentes en el patron de XRD del polimorfo cristalino de Forma 2.
Por lo tanto el polimorfo de Forma 2 se caracteriza por tener un patron de difraccion de XRD que contiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o mas preferentemente 19 posiciones de los picos seleccionadas entre 4.2, 8.4, 8.7, 11.0, 11.5, 12.6, 14.4, 14.9, 16.0, 17.0, 17.4, 18.8, 19.5, 20.2, 21.7, 22.4, 23.8, 25.8 y 26.3 (± 0.2) grados en 2-theta que incluyen preferentemente picos en 8.4 y 8.7 (± 0.2) grados en 2-theta y que no contienen picos en 6.3,
7.8 y 9.9 (± 0.2) grados en 2-theta.
Con relacion a las Figuras 2 y 3, se entendera que pueden ocurrir variaciones de intensidad en los patrones de XRD debido a procesos los cuales influyen sobre las intensidades, tales como la historia de procesamiento de la muestra.
Las sales del compuesto de la invencion las cuales son cristalinas pero de menor interes que la sal maleato incluyen las sales bromhidrato, fosfato, tartrato, fumarato y mesilato.
Pueden ser necesarios grupos protectores para proteger a los grupos qmmicamente sensibles durante una o mas de las reacciones descritas con anterioridad, para asegurar que el proceso sea eficaz. Por lo tanto, si se desea o resulta necesario, los compuestos intermedios (incluyendo los compuestos de formula (II) a (V) como se resaltaron con anterioridad asf como tambien los compuestos de formula (VI) a (XIV)) se pueden proteger mediante el uso de grupos protectores convencionales. Los grupos protectores y medios para su remocion son descritos en “Protective Groups in Organic Synthesis”, por Theodora W. Greene y Peter G.M. Wuts, publicado por John Wiley & Sons Inc; 4ta Rev Ed., 2006, ISBN-10: 0471697540. Por lo tanto, los ejemplos de grupos protectores de amina incluyen Boc el cual puede ser eliminado por TFA y los ejemplos de grupos protectores de alcohol son THP el cual puede ser eliminado por HCl.
Los compuestos de formula (III) (junto con sus derivados en los cuales el grupo amino esta protegido, tal como el compuesto de formula (VIII)) y el compuesto de formula (VII) son novedosos. Estos compuestos novedosos, junto
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con sus sales (incluyendo las sales farmaceuticamente aceptables) son reivindicados como aspectos de la invencion.
El compuesto de formula (I) es un inhibidor de p38 MAP quinasa (especialmente un inhibidor del subtipo alfa) y en un aspecto el compuesto de la presente invencion es proporcionado para utilizar como un medicamento, por ej., en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, por ejemplo EPOC y/o asma.
El compuesto de formula (I) se espera que sea potente in vivo.
En general, los compuestos de la tecnica previa desarrollados hasta la fecha han sido destinados a la administracion oral. Esta estrategia involucra optimizar el perfil farmacocinetico de sustancias farmacologicas a fin de lograr una duracion de accion adecuada. De este modo, se establece y se mantiene una concentracion de farmaco suficientemente elevada entre las dosis para proporcionar un beneficio clmico sostenido. La consecuencia inevitable de este enfoque es que todos los tejidos del cuerpo, y especialmente el tngado y el intestino, son probablemente expuestos a concentraciones del farmaco supra-terapeuticamente activas, ya sea que sean afectados adversamente o no por la enfermedad que se esta tratando.
Una estrategia alternativa consiste en disenar paradigmas de tratamiento en los cuales el farmaco es dosificado directamente al organo inflamado, es decir, para explotar la administracion topica. Si bien este enfoque no es adecuado para tratar todas las enfermedades inflamatorias cronicas, ha sido explotado en trastornos pulmonares, tales como asma y EPOC; en enfermedades cutaneas, por ejemplo contra la dermatitis atopica y la soriasis; para afecciones nasales, tipificadas por la rinitis alergica; y en enfermedades gastrointestinales, tales como colitis ulcerativa, EII y enfermedad de Crohn y enfermedades inflamatorias del ojo, tal como uveitis.
En la terapia topica, un modo en el cual se puede lograr eficacia es mediante el uso de un farmaco que tiene una duracion de accion sostenida y es retenido en el organo relevante, reduciendo de ese modo al mmimo el riesgo de toxicidad sistemica. Alternativamente, en algunos casos, se puede desarrollar una formulacion que genera un “deposito” del farmaco activo el cual esta disponible para sostener sus efectos deseados. El primer enfoque es ejemplificado por el farmaco anticolinergico tiotropio (Spiriva). Este compuesto es administrado topicamente al pulmon como un tratamiento para EPOC, y tiene una afinidad excepcionalmente elevada para su receptor objetivo dando como resultado una constante de disociacion (off rate) muy lenta y por consiguiente exhibe una duracion de accion sostenida.
En un aspecto de la descripcion del compuesto de formula (I) es particularmente adecuado para la administracion topica, tal como la administracion topica a los pulmones, en particular para el tratamiento de la enfermedad respiratoria, por ejemplo enfermedades respiratorias cronicas tal como EPOC y/o asma.
En una realizacion, el compuesto de formula (I) es adecuado para sensibilizar a los pacientes al tratamiento con corticoides quienes se han vuelto refractarios a dichos regfmenes de tratamiento.
El compuesto de formula (I) puede tener propiedades antivirales, por ejemplo la capacidad de prevenir la infeccion de celulas (tales como celulas epiteliales respiratorias) con un picornavirus, en particular un rinovirus, virus de la gripe o virus sincicial respiratorio.
Por lo tanto, se cree que los compuestos son agentes antivirales, en particular adecuados para la prevencion, tratamiento o mejora de infecciones de picornavirus, tal como la infeccion de rinovirus, gripe o virus sincicial respiratorio.
En una realizacion el compuesto de formula (I) es capaz de reducir la inflamacion inducida por la infeccion viral, tal como la infeccion por rinovirus y en particular infecciones virales que dan como resultado la liberacion de citoquinas tal como IL-8, especialmente in vivo. Esta actividad puede ser analizada, por ejemplo, in vitro empleando un ensayo de IL-8 inducida por rinovirus segun lo descrito en los Ejemplos de la presente invencion.
En una realizacion el compuesto de formula (I) es capaz de reducir la expresion de ICAM1 inducida por rinovirus, especialmente in vivo. ICAM1 es el mecanismo receptor empleado por los llamados serotipos de rinovirus de surco mayor para infectar celulas. Esta actividad puede ser medida, por ejemplo mediante un metodo descrito en los Ejemplos de la presente invencion.
Se espera que las propiedades antes mencionadas tornen al compuesto de formula (I) particularmente adecuado para utilizar en el tratamiento (incluyendo profilaxis) de las exacerbaciones de enfermedades inflamatorias, en particular exacerbaciones virales, o en el tratamiento de las infecciones virales, en pacientes con una o mas afecciones cronicas tales como insuficiencia cardfaca congestiva, EPOC, asma, diabetes, cancer y/o en pacientes inmunosuprimidos, por ejemplo postrasplante de organo. Dicho uso puede ser en combinacion con agentes antivirales tales como zanamivir, oseltamivir (por ejemplo fosfato de oseltamivir) peramivir o laninamivir.
En general, el compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de una o mas afecciones que tienen un componente inflamatorio el cual, adecuadamente, puede ser tratado por terapia topica o local.
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En particular, el compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de uno o mas trastornos respiratorios incluyendo EPOC (incluyendo bronquitis cronica y enfisema), asma, asma pediatrico, fibrosis qmstica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopatica, rinitis alergica, rinitis y sinusitis, especialmente asma, o EPOC (incluyendo bronquitis cronica y enfisema).
Por lo tanto el compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de la inflamacion pulmonar (y sus smtomas) en sujetos que sufren de fibrosis qmstica.
El compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de enfermedades o trastornos oculares incluyendo queratoconjuntivitis seca (sequedad ocular), conjuntivitis alergica, conjuntivitis, retinopatfa diabetica, edema macular (incluyendo edema macular humedo y edema macular seco), inflamacion por catarata posoperativa o, particularmente, uveitis (incluyendo posterior, anterior y panuvettis).
El compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de enfermedades o trastornos cutaneos que incluyen dermatitis alergica, dermatitis por contacto, dermatitis atopica o soriasis.
El compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de enfermedades o trastornos gastrointestinales que incluyen colitis ulcerativa, EII o enfermedad de Crohn.
El compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de enfermedades o trastornos articulares que incluyen artritis reumatoidea u osteoartritis y en particular articulaciones inflamadas secundarias a dichas afecciones.
El compuesto de formula (I) puede ser util en el tratamiento de canceres que incluyen cancer del estomago y en la inhibicion del crecimiento y la metastasis de tumores que incluyen canceres pulmonares tales como carcinoma de pulmon de celulas no pequenas, carcinoma gastrico, carcinomas colorrectales y melanoma maligno.
Se espera tambien que el compuesto de formula (I) pueda ser util en el tratamiento de ciertas otras afecciones que incluyen periodontitis, gingivitis y faringitis.
El Compuesto de formula (I) tambien puede resensibilizar la afeccion del paciente al tratamiento con un corticoide, cuando la afeccion del paciente se ha vuelto refractaria al mismo.
Por anadidura, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de acuerdo con la descripcion opcionalmente en combinacion con uno o mas diluyentes o portadores farmaceuticamente aceptables.
Los diluyentes y portadores pueden incluir aquellos adecuados para la administracion parenteral, oral, topica, por la mucosa y rectal.
La presente invencion provee ademas un proceso para preparar ese tipo de composicion farmaceutica (por ejemplo una composicion farmaceutica para la administracion parenteral, oral, topica, por la mucosa o rectal), comprendiendo dicho proceso mezclar los ingredientes.
Segun lo mencionado con anterioridad, dichas composiciones pueden ser preparadas, por ej., para la administracion parenteral, subcutanea, intramuscular, intravenosa, intra-articular o peri-articular, particularmente en la forma de soluciones o suspensiones lfquidas; para la administracion oral, particularmente en la forma de comprimidos o capsulas o en la forma de soluciones o suspensiones lfquidas; para la administracion topica, por ej. pulmonar o intranasal, particularmente en la forma de polvos, soluciones o suspensiones acuosas, gotas nasales o aerosoles acuosos o no acuosos, y para la administracion transdermica, por ej. parches, cremas, unguentos; para la administracion por mucosa por ej. a la mucosa bucal, sublingual o vaginal, y para la administracion rectal por ej. en la forma de un supositorio, crema, unguento o espuma.
Las composiciones pueden ser convenientemente administradas en formas de dosificacion unitaria o de multiples dosis y se pueden preparar mediante cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica, por ejemplo segun lo descrito en Remington's Pharmaceutical Sciences, ed. no. 17, Mack Publishing Company, Easton, PA., (1985). Las formulaciones para la administracion parenteral pueden contener como excipientes agua esteril o solucion salina, alquilenglicoles tales como propilenglicol, polialquilenglicoles tales como polietilenglicol, aceites de origen vegetal, naftalenos hidrogenados y similares. Las formulaciones para la administracion nasal pueden ser solidas y pueden contener excipientes, por ejemplo, lactosa o dextrano, o pueden ser soluciones o suspensiones acuosas u oleosas para utilizar en la forma de gotas nasales o pulverizaciones medidas. Para la administracion bucal los excipientes tfpicos incluyen azucares, estearato de calcio, estearato de magnesio, almidon pregelatinizado, y similares.
Las composiciones adecuadas para la administracion oral pueden comprender uno o mas portadores y/o excipientes fisiologicamente compatibles y pueden estar en forma solida o lfquida. Los comprimidos y las capsulas pueden ser preparados con agentes aglutinantes, por ejemplo, jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, o poli- vinilpirrolidona; agentes de relleno, tales como lactosa, sacarosa, almidon de mafz, fosfato de calcio, sorbitol, o glicina; lubricantes, tales como estearato de magnesio, talco, polietilenglicol, o sflice; y surfactantes, tales como lauril
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sulfato sodico. Las composiciones Ifquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspension, por ejemplo jarabe de sorbitol, metil celulosa, jarabe de azucar, gelatina, carboximetil-celulosa, o grasas comestibles; agentes emulsionantes tales como lecitina o acacia; aceites vegetales tales como aceite de almendra, aceite de coco, aceite de fngado de bacalao, o aceite de mam; conservantes tales como hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitolueno butilado (BHT). Las composiciones lfquidas pueden estar encapsuladas en, por ejemplo, gelatina para proporcionar una forma de dosificacion unitaria.
Las formas de dosificacion oral solidas incluyen comprimidos, capsulas de vaina dura de dos piezas y capsulas de gelatina elastica blanda (SEG, por sus siglas en ingles).
Una formulacion de vaina seca en general comprende entre aproximadamente 40% y 60% p/p de concentracion de gelatina, aproximadamente una concentracion del 20% al 30% de plastificante (tales como glicerina, sorbitol o propilenglicol) y aproximadamente una concentracion del 30% al 40% de agua. Puede haber otros materiales tales como conservantes, tintes, agentes de la opacidad y saborizantes tambien. El material de relleno Kquido comprende un farmaco solido que ha sido disuelto, solubilizado o dispersado (con agentes de suspension tales como cera de abeja, aceite de ricino hidrogenado o polietilenglicol 4000) o un farmaco lfquido en vefnculos o combinaciones de vefnculos tales como aceite mineral, aceites vegetales, trigliceridos, glicoles, polioles y agentes tensioactivos.
Adecuadamente, un compuesto de formula (I) es administrado topicamente al pulmon, al ojo o al intestino. Por lo tanto nosotros proporcionamos de acuerdo con la invencion una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la presente invencion opcionalmente en combinacion con uno o mas diluyentes o portadores topicamente aceptables.
La administracion topica al pulmon puede lograrse mediante el uso de una formulacion en aerosol. Las formulaciones en aerosol en general comprenden el ingrediente activo suspendido o disuelto en un propulsor en aerosol adecuado, tal como un clorofluorocarbono (CFC) o un hidrofluorocarbono (HFC). Los propulsores de CFC adecuados incluyen tricloromonofluormetano (propulsor 11), diclorotetrafluormetano (propulsor 114), y diclorodifluormetano (propulsor 12). Los propulsores de HFC adecuados incluyen tetrafluoretano (HFC-134a) y heptafluorpropano (hFc-227). En general, el propulsor comprende 40%-99,5% por ej. 40%-90% en peso de la composicion total para inhalacion. La formulacion puede comprender excipientes que incluyen cosolventes (por ej. etanol) y surfactantes (por ej. lecitina, trioleato de sorbitan y similares). Otros excipientes posibles incluyen polietilenglicol, polivinilpirrolidona, glicerina y excipientes similares. Las formulaciones en aerosol son envasadas en depositos y se administra una dosis adecuada por medio de una valvula de medicion (por ej. segun lo provisto por Bespak, Valois o 3M o alternativamente por Aptar, Coster o Vari).
La administracion topica al pulmon tambien puede ser lograda por el uso de una formulacion no presurizada tal como una solucion o suspension acuosa. Se pueden administrar por medio de un nebulizador por ej. uno que puede ser sostenido manualmente o portatil o para uso en el hogar o en el hospital (es decir, no portatil). La formulacion puede comprender excipientes tales como agua, tampones, agentes reguladores de la tonicidad, agentes reguladores del pH, surfactantes y cosolventes. Las formulaciones lfquidas en suspension y en aerosol (ya sea presurizadas o no presurizadas) en general contendran el compuesto de la invencion en forma finamente dividida, por ejemplo con un D50 de 0,5-10 pm por ej. alrededor de 1-5 pm. Las distribuciones del tamano de partfcula pueden ser representadas usando valores D10, D50 y D90. El valor medio D50 de las distribuciones del tamano de partfcula se define como el tamano de partfcula en micrones que divide la distribucion a la mitad. La medicion derivada de difraccion laser es descrita en forma mas precisa como una distribucion de volumen, y por consiguiente se hace referencia al valor D50 obtenido usando este procedimiento de manera mas significativa como un valor Dv50 (mediana para una distribucion de volumen). Tal como se utiliza en la presente, los valores Dv se refieren a distribuciones del tamano de partfcula medidas usando difraccion laser. Similarmente, los valores D10 y D90, usados en el contexto de la difraccion laser, significan los valores Dv™ y Dv90 y hacen referencia al tamano de partfcula por lo cual 10% de la distribucion se encuentra por debajo del valor D10, y el 90% de la distribucion se encuentra por debajo del valor D90, respectivamente.
La administracion topica al pulmon tambien puede ser lograda mediante el uso de una formulacion en polvo seco. Una formulacion de polvo seco contendra el compuesto de la descripcion en forma finamente dividida, tipicamente con un diametro medio masal (MMAD, por sus siglas en ingles) de 1-10 pm o un D50 de 0,5-10 pm por ej. alrededor de 1-5 pm. Los polvos del compuesto de la invencion en forma finamente dividida pueden ser preparados mediante un proceso de micronizacion o proceso de reduccion de tamano similar. La micronizacion puede llevarse a cabo usando un molino de chorro tal como aquellos fabricados por Hosokawa Alpine. La distribucion del tamano de partfcula resultante se puede medir usando difraccion laser (por ej. con un instrumento Malvern Mastersizer 2000S). La formulacion en general contendra un diluyente topicamente aceptable tal como lactosa, glucosa o manitol (preferentemente lactosa), en general de tamano de partfcula comparativamente grande por ej. un diametro medio masal (MMAD) de 50 pm o mas, por ej. 100 pm o mas o un D50 de 40-150 pm. Tal como se utiliza en la presente, el termino “lactosa” se refiere a un componente que contiene lactosa, incluyendo monohidrato de a-lactosa, monohidrato de p-lactosa, a-lactosa anhidra, p-lactosa anhidra y lactosa amorfa. Los componentes de lactosa pueden ser procesados por micronizacion, tamizado, molienda, compresion, aglomeracion o secado por atomizacion. Las formas comercialmente disponibles de lactosa en diversas formas son tambien abarcadas, por ejemplo los productos Lactohale® (lactosa de grado de inhalacion; DFE Pharma), InhaLac®70 (lactosa tamizada para
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inhalador de polvo seco; Meggle), Pharmatose® (DFE Pharma) y Respitose® (lactosa de grado de inhalacion tamizada; DFE Pharma). En una realizacion, el componente de lactosa se selecciona del grupo que consiste en monohidrato de a-lactosa, a-lactosa anhidra y lactosa amorfa. Con preferencia, la lactosa es monohidrato de a- lactosa.
Las formulaciones de polvo seco tambien pueden contener otros excipientes. Por lo tanto, en una realizacion, una formulacion de polvo seco de acuerdo con la presente descripcion comprende magnesio o estearato de calcio. Dichas formulaciones pueden tener estabilidad qmmica y/o ffsica superior especialmente cuando dichas formulaciones tambien contienen lactosa.
Una formulacion de polvo seco es tfpicamente administrada usando un dispositivo inhalador de polvo seco (DPI, por sus siglas en ingles). Los ejemplos de sistemas de administracion de polvo seco incluyen SPINHALER®, DISKHALER®, TURBOHALER®, DISKUS®, SKYEHALER®, ACCUHALER® y CLICKHALER®. Otros ejemplos de sistemas de administracion de polvo seco incluyen ECLIPSE, NEXT, ROTaHaLER, HANDIHALER, aErOLISER, CYCLOHALER, BREEZHALER/NEOHALER, MONODOSE, FLOWCAPS, TWINCAPS, X-CAPS, TURBOSPIN, ELPENHALER, MIATHALER, TWISTHALER, NOVOLIZER, PRESSAIR, ELLIPTA, el inhalador de polvo seco ORIEL, MICRODOSE, PULVINAL, EASYHALER, ULTRAHALER, TAIFUN, PULMOJET, OMNIHALER, GYROHALER, TAPER, CONIX, XCELOVAIR y PROHALER.
En una realizacion un compuesto de la presente invencion es proporcionado como una formulacion de polvo seco micronizada, por ejemplo que comprende lactosa de un grado adecuado.
Por consiguiente, como un aspecto de la invencion, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de la invencion en forma particulada en combinacion con lactosa particulada, comprendiendo opcionalmente dicha composicion estearato de magnesio.
En una realizacion se provee un compuesto de la presente invencion como una formulacion de polvo seco micronizada, que comprende lactosa de un grado adecuado y estearato de magnesio, cargada en un dispositivo tal como DISKUS. Adecuadamente, dicho dispositivo es un dispositivo de multiples dosis, por ejemplo la formulacion es cargada en blfsteres para usar en un dispositivo de multiples dosis unitarias tal como DISKUS.
En otra realizacion se provee un compuesto de la presente invencion como una formulacion de polvo seco micronizada, por ejemplo que comprende lactosa de un grado adecuado, cargada en capsulas de vaina dura para utilizar en un dispositivo de una sola dosis tal como AEROLISER.
En otra realizacion se provee un compuesto de la presente invencion como una formulacion de polvo seco micronizada, que comprende lactosa de un grado adecuado y estearato de magnesio, cargada en capsulas de vaina dura para utilizar en un dispositivo de una sola dosis tal como AEROLISER.
En otra realizacion se provee un compuesto de la presente invencion como un polvo fino para utilizar en una forma de dosificacion para inhalacion donde el polvo esta en partfculas finas con un D50 de 0,5-10 pm por ej. alrededor de 1-5 pm, que se han producido mediante un proceso de reduccion de tamano que no es micronizacion por molino de chorro por ej. secado por atomizacion, congelacion por atomizacion, microfluidificacion, homogenizacion a presion elevada, cristalizacion de fluidos supercnticos, cristalizacion ultrasonica o combinaciones de estos metodos, u otros metodos de formacion de partfculas adecuados conocidos en la tecnica que se usan para producir partfculas finas con un tamano de partfcula aerodinamico de 0,5-10 pm. La distribucion del tamano de partfcula resultante se puede medir usando difraccion laser (por ej. con un instrumento Malvern Mastersizer 2000S). Las partfculas pueden comprender el compuesto por sf solo o en combinacion con otros excipientes adecuados que pueden ayudar al procesamiento. Las partfculas finas resultantes pueden formar la formulacion final para la administracion a seres humanos o pueden opcionalmente ser formuladas adicionalmente con otros excipientes adecuados para facilitar la administracion en una forma de dosificacion aceptable.
El compuesto de la invencion tambien puede ser administrado por via rectal, por ejemplo en la forma de supositorios o enemas, que incluyen soluciones acuosas u oleosas asf como tambien suspensiones y emulsiones y espumas. Dichas composiciones se preparan siguiendo procedimientos estandares, bien conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, pueden prepararse supositorios mezclando el ingrediente activo con una base de supositorio convencional tal como manteca de cacao u otros gliceridos. En este caso, el farmaco es mezclado con un excipiente adecuado que no irrita el cual es solido a temperaturas normales pero es lfquido a la temperatura rectal y por ende se derretira en el recto para liberar el farmaco. Dichos materiales son la manteca de cacao y los polietilenglicoles.
En general, para las composiciones destinadas a ser administradas topicamente al ojo en la forma de gotas oculares o unguentos oculares, la cantidad total del compuesto de la presente invencion sera de aproximadamente 0,0001 a menos de 4,0% (p/p).
Con preferencia, para la administracion topica ocular, las composiciones administradas de acuerdo con la presente invencion seran formuladas como soluciones, suspensiones, emulsiones y otras formas de dosificacion. Las soluciones acuosas son generalmente preferidas, en base a la facilidad de formulacion, asf como tambien a la capacidad del paciente de administrar dichas composiciones facilmente por medio de la instilacion de una a dos
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gotas de las soluciones en los ojos afectados. Sin embargo, las composiciones tambien pueden ser suspensiones, geles viscosos o semiviscosos, u otros tipos de composiciones solidas o semisolidas. Las suspensiones pueden ser preferidas para los compuestos que son escasamente solubles en agua.
Una alternativa para la administracion al ojo es la inyeccion intravttrea de una solucion o suspension del compuesto de la presente invencion. Por anadidura, el compuesto de la presente invencion tambien puede ser introducido por medio de implantes oculares o insertos.
Las composiciones administradas de acuerdo con la presente invencion tambien pueden incluir diversos otros ingredientes, incluyendo, entre otros, agentes de la tonicidad, tampones, surfactantes, polfmero estabilizante, conservantes, cosolventes y agentes mejoradores de la viscosidad. Las composiciones farmaceuticas adecuadas de la presente invencion incluyen un compuesto de la invencion formulado con un agente de la tonicidad y un tampon. Las composiciones farmaceuticas de la presente invencion pueden incluir opcionalmente ademas un surfactante y/o un agente paliativo y/o un polfmero estabilizante.
Se pueden emplear diversos agentes de la tonicidad para regular la tonicidad de la composicion, con preferencia a aquella de las lagrimas naturales para composiciones oftalmicas. Por ejemplo, se pueden agregar a la composicion cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, azucares simples tales como dextrosa, fructosa, galactosa, y/o simplemente polioles tales como los alcoholes de azucar manitol, sorbitol, xilitol, lactitol, isomaltitol, maltitol, e hidrolizados de almidon hidrogenado para aproximarse a la tonicidad fisiologica. Dicha cantidad de agente de tonicidad variara, dependiendo del agente en particular que sera agregado. En general, sin embargo, las composiciones tendran un agente de tonicidad en una cantidad suficiente para hacer que la composicion final tenga una osmolalidad oftalmicamente aceptable (en general de aproximadamente 150-450 mOsm, con preferencia 250-350 mOsm y con maxima preferencia a aproximadamente 290 mOsm). En general, los agentes de la tonicidad de la invencion estaran presentes en el rango de 2 a 4% p/p. Los agentes de la tonicidad preferidos de la invencion incluyen los azucares simples o los alcoholes de azucar, tales como D-manitol.
Un sistema tampon apropiado (por ej. fosfato sodico, acetato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio o acido borico) puede ser agregado a las composiciones para evitar oscilaciones del pH en condiciones de almacenamiento. La concentracion particular variara, dependiendo del agente empleado. Sin embargo, preferentemente, el tampon sera escogido para mantener un pH objetivo dentro del rango de pH 5 a 8, y mas preferentemente hasta un pH objetivo de pH 5 a 7.
Pueden emplearse opcionalmente surfactantes para administrar concentraciones mas elevadas de compuesto de la presente invencion. Los surfactantes funcionan para solubilizar el compuesto y estabilizar la dispersion de coloides, tales como solucion micelar, microemulsion, emulsion y suspension. Los ejemplos de surfactantes los cuales pueden utilizarse opcionalmente incluyen polisorbato, poloxamero, estearato de poliosil 40, aceite de ricino de polioxilo, tiloxapol, Triton, y monolaurato de sorbitan. Los surfactantes preferidos a ser empleados en la invencion tienen un equilibrio hidrofilo / lipofilo (HLB por sus siglas en ingles) en el rango de 12,4 a 13,2 y son aceptables para el uso oftalmico, tales como TritonX114 y tiloxapol.
Los agentes adicionales que pueden ser agregados a las composiciones oftalmicas de los compuestos de la presente invencion son demulcentes los cuales funcionan como un polfmero estabilizante. El polfmero estabilizante debena ser un ejemplo ionico/ cargado con preferencia para uso ocular topico, mas espedficamente, un polfmero que porta carga negativa en su superficie que puede exhibir un potencial zeta de (-)10-50 mV para estabilizacion ffsica y que sea capaz de realizar una dispersion en agua (es decir, que sea soluble en agua). Un polfmero estabilizante preferido de la invencion sena un polielectrolito, o polielectrolitos si mas de uno, de la familia de los poliacrilatos entrecruzados, tales como carbomeros y Pemulen(R), espedficamente Carbomero 974p (acido poliacnlico), a 0,1-0,5% p/p.
Otros compuestos tambien pueden ser agregados a las composiciones oftalmicas del compuesto de la presente invencion para aumentar la viscosidad del portador. Los ejemplos de agentes de aumento de la viscosidad incluyen, entre otros: polisacaridos, tales como acido hialuronico y sus sales, sulfato de condroitina y sus sales, dextranos, diversos polfmeros de la familia de las celulosas; polfmeros de vinilo; y polfmeros de acido acnlico.
Los productos oftalmicos topicos son tfpicamente envasados en forma de multiples dosis. Por ende se necesitan conservantes para evitar la contaminacion microbiana durante el uso. Los conservantes adecuados incluyen: cloruro de benzalconio, clorobutanol, bromuro de benzododecinio, metil parabeno, propil parabeno, feniletil alcohol, edentato disodico, acido sorbico, poliquaternio-1, u otros agentes conocidos por los expertos en la tecnica. Dichos conservantes son tfpicamente empleados a un nivel de entre 0,001 y 1,0% p/v. Las composiciones de dosis unitaria de la presente invencion seran esteriles, pero tfpicamente no preservadas. Dichas composiciones, por lo tanto, en general no contienen conservantes.
El profesional medico, u otro experto, podra determinar una dosificacion adecuada para el compuesto de la presente invencion, y por ende la cantidad del compuesto de la invencion que debena incluirse en cualquier formulacion farmaceutica particular (ya sea en forma de dosificacion unitaria o en otro tipo de forma).
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Un compuesto de formula (I) tiene actividad terapeutica. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un compuesto segun lo descrito en la presente para utilizar en el tratamiento de una o mas de las afecciones mencionadas con anterioridad.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona el uso de un compuesto segun lo descrito en la presente para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de una o mas de las afecciones mencionadas con anterioridad.
La palabra “tratamiento” tiene el proposito de abarcar la profilaxis asf como tambien el tratamiento terapeutico. El tratamiento de afecciones o trastornos tambien abarca el tratamiento de sus exacerbaciones.
Un compuesto de la presente invencion tambien puede ser administrado en combinacion con uno o mas ingredientes activos diferentes por ej. ingredientes activos adecuados para el tratamiento de las afecciones mencionadas con anterioridad.
Por ejemplo, las posibles combinaciones para el tratamiento de los trastornos respiratorios incluyen combinaciones con esteroides (por ej. budesonide, dipropionato de beclometasona, propionato de fluticasona, furoato de mometasona, furoato de fluticasona, ciclesonide), agonistas beta (por ej. terbutalina, salbutamol, salmeterol, formoterol, vilanterol, olodaterol, indacaterol, reproterol, fenoterol), xantinas (por ej. teofilina), anticolinergicos o antagonistas muscarrnicos (por ej. ipratropio, tiotropio, aclidinio, umeclidinio o glicopirronio por ejemplo como la sal bromuro), inhibidores de PI3 quinasa y agentes antivirales (por ej. zanamivir, oseltamivir, por ejemplo como el fosfato, peramivir y laninamivir).
En una realizacion se proporciona un compuesto de la invencion para utilizar como un medicamento que sera administrado en combinacion con uno o mas ingredientes activos adicionales por ej. seleccionados entre corticoides, agonistas beta, xantinas, antagonistas muscarrnicos e inhibidores de PI3 quinasa. Adecuadamente el agonista beta es un agonista beta2.
En una realizacion el compuesto de la descripcion es administrado por inhalacion y se administra un corticoide oralmente o por inhalacion ya sea en combinacion o por separado.
En una realizacion el compuesto de la descripcion es administrado por inhalacion y se administra un agonista beta2 oralmente o por inhalacion ya sea en combinacion o por separado.
En una realizacion el compuesto de la descripcion es administrado por inhalacion y un antagonista muscarmico es administrado oralmente o por inhalacion ya sea en combinacion o por separado.
En una realizacion el compuesto de la descripcion es administrado por inhalacion ya sea en combinacion o por separado con uno o mas de un corticoide, un agonista beta2 y un antagonista muscarmico, todos administrados ya sea por via oral o por inhalacion.
Adicionalmente, para el tratamiento de los trastornos gastrointestinales (tales como enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa), las posibles combinaciones incluyen combinaciones con, por ejemplo, uno o mas agentes seleccionados de la lista que comprende:
- acido 5-aminosalidlico, o un profarmaco del mismo (tal como sulfasalazina, olsalazina o bisalazida);
- corticoides (por ej. prednisolona, metilprednisolona, o budesonide);
- inmunosupresores (por ej. ciclosporina, tacrolimus, metotrexato, azatioprina o 6-mercaptopurina);
- anticuerpos anti-TNFa (por ej. infliximab, adalimumab, certolizumab pegol o golimumab);
- anticuerpos anti-IL12/IL23 (por ej. ustekinumab) o inhibidores de IL12/IL23 de molecula pequena (por ej., apilimod);
- anticuerpos anti-a4p7 (por ej. vedolizumab);
- bloqueadores de MAdCAM-1 (por ej. PF-00547659);
- anticuerpos contra a4-integrina de molecula de adhesion celular (por ej. natalizumab);
- anticuerpos contra la subunidad a del receptor de IL2 (por ej. daclizumab o basiliximab);
- inhibidores de JAK3 (por ej. tofacitinib o R348);
- inhibidores de Syk y profarmacos de los mismos (por ej. fostamatinib y R-406);
- Inhibidores de fosfodiesterasa-4 (por ej. tetomilast);
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- HMPL-004;
- probioticos;
- Dersalazina;
- semapimod/CPSI-2364; y
- inhibidores de la protema quinasa C (por ej. AEB-071).
Para el tratamiento de los trastornos oculares (tales como queratoconjuntivitis seca o uveftis), las posibles combinaciones incluyen combinaciones con, por ejemplo, uno o mas agentes seleccionados de la lista que comprende:
- corticoides (por ej. dexametasona, prednisolona, acetonido de triamcinolona, difluprednato o acetonido de fluocinolona);
- inmunosupresores (por ej. ciclosporina, voclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato de mofetilo o tacrolimus);
- anticuerpos anti-TNFa (por ej. infliximab, adalimumab, certolizumab pegol, ESBA-105 o golimumab);
- anticuerpos anti-IL-17A (por ej. secukinumab);
- inhibidores de mTOR (por ej. sirolimus);
- VGX-1027;
- inhibidores de JAK3 (por ej. tofacitinib o R348); y
- inhibidores de protema quinasa C (por ej. AEB-071).
Por ende, otro aspecto de la invencion provee un compuesto de formula (I) en combinacion con uno o mas ingredientes activos adicionales, por ejemplo uno o mas ingredientes activos descritos anteriormente.
Similarmente, otro aspecto de la invencion provee un producto combinado que comprende:
(A) un compuesto de la presente invencion; y
(B) uno o mas agentes terapeuticos diferentes,
donde cada uno de los componentes (A) y (B) es formulado en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
En este aspecto de la invencion, el producto combinado puede ser una sola formulacion farmaceutica (combinacion) o un kit de partes.
Por lo tanto, este aspecto de la invencion abarca una formulacion farmaceutica que incluye un compuesto de la presente invencion y otro agente terapeutico, en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable (formulacion a la cual se hace referencia mas adelante en la presente invencion como una “preparacion combinada”).
Tambien abarca un kit de partes que comprende componentes:
(i) una formulacion farmaceutica que incluye un compuesto de la presente invencion en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable; y
(ii) una formulacion farmaceutica que incluye uno o mas agentes terapeuticos diferentes, en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable,
dichos componentes (i) y (ii) son provistos, cada uno, en una forma que es adecuada para la administracion en conjunto con el otro.
El componente (i) del kit de partes es por ende el componente (A) antes mencionado en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable. Similarmente, el componente (ii) es el componente (B) antes mencionado en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
El uno o mas agentes terapeuticos diferentes (es decir el componente (B) antes mencionado) puede ser, por ejemplo, cualquiera de los agentes mencionados anteriormente en relacion con el tratamiento de trastornos respiratorios, gastrointestinales y oculares.
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Si el componente (B) es mas de un agente terapeutico adicional, estos agentes terapeuticos adicionales pueden ser formulados entre sf o pueden ser formulados con el componente (A) o pueden ser formulados por separado.
En una realizacion el componente (B) es un agente terapeutico diferente. En otra realizacion el componente (B) es dos agentes terapeuticos diferentes.
El producto combinado (ya sea una preparacion combinada o kit de partes) de este aspecto de la invencion puede ser utilizado en el tratamiento o prevencion de una enfermedad inflamatoria por ej. las enfermedades inflamatorias mencionadas con anterioridad, tales como:
- trastornos respiratorios que incluyen EPOC (incluyendo bronquitis cronica y enfisema), asma, asma pediatrico, fibrosis qmstica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopatica, rinitis alergica, rinitis y sinusitis, especialmente asma, o EPOC (incluyendo bronquitis cronica y enfisema);
- enfermedades o trastornos oculares que incluyen conjuntivitis alergica, conjuntivitis, queratoconjuntivitis seca (sequedad ocular), glaucoma, retinopatfa diabetica, edema macular (incluyendo edema macular diabetico), oclusion de la vena central de la retina (OVCR), degeneracion macular relacionada con la edad seca y/o humeda (DMAE), inflamacion por catarata posoperativa o, particularmente, uveitis (incluyendo uveitis posterior, anterior y panuvettis), rechazo de trasplante de celulas limbares e injerto de cornea;
- enfermedades o trastornos de la piel que incluyen dermatitis alergica, dermatitis por contacto, dermatitis atopica o soriasis; y
- enfermedades o trastornos gastrointestinales que incluyen enteropatfa sensible al gluten (enfermedad celfaca), esofagitis eosinofila, enfermedad intestinal de injerto versus huesped o, particularmente, colitis ulcerativa o enfermedad de Crohn.
Los aspectos de la invencion descritos en la presente invencion (por ej. el compuesto, las combinaciones, los metodos y los usos mencionados con anterioridad) pueden tener la ventaja de que, en el tratamiento de las afecciones descritas en la presente invencion, pueden ser mas convenientes para el medico y/o para el paciente que, pueden ser mas eficaces que, menos toxicos que, pueden ser de accion mas prolongada que, pueden tener mejor selectividad con respecto a, pueden tener un rango mas amplio de actividad que, pueden ser mas potentes que, pueden producir menos cantidad de efectos secundarios que, pueden tener un mejor perfil farmacocinetico y/o farmacodinamico que, pueden tener propiedades mas adecuadas en estado solido que, pueden tener mejor estabilidad que, o pueden tener otras propiedades farmacologicas utiles con respecto a, compuestos, combinaciones, metodos (tratamientos) o usos similares conocidos en el estado de la tecnica anterior para utilizar en el tratamiento de dichas afecciones o pueden ser mas ventajosos de algun otro modo.
Con relacion a los compuestos del estado de la tecnica anterior, en al menos algunas realizaciones, el compuesto de formula (I) se espera que tenga uno o mas de los siguientes atributos:
- exhibe propiedades que son particularmente adecuadas para la administracion topica/ local (por ej. luego de la administracion topica/ local, la generacion de altas concentraciones en tejidos objetivo pero bajas concentraciones en plasma o sistemicas del compuesto de formula (I) y/o rapida eliminacion del compuesto de formula (I) del plasma o de la circulacion sistemica);
- tiene un riesgo reducido de exposicion extravascular luego de la administracion intravenosa (por ej. debido a un bajo volumen de distribucion para el compuesto de formula (I));
- exhibe potencia superior con respecto a quinasas seleccionadas y/o un panel de quinasas, tales como p38 MAPKa, p38 MAPKy, Src y p59-HCK;
- exhibe baja actividad inhibitoria o ninguna contra Olaharsky quinasas, particularmente GSK3a;
- exhibe baja actividad inhibitoria o ninguna contra Syk quinasa;
- exhibe induccion de p-catenina reducida y/o inhibicion de la mitosis en celulas;
- no exhibe inhibicion dependiente del tiempo o menor inhibicion dependiente del tiempo de miembros de la
superfamilia del citocromo P450; y/o
- produce menos metabolitos problematicos (por ej. menos toxicos), por ej. despues de la administracion a un paciente.
SECCION EXPERIMENTAL
Las abreviaturas utilizadas en la presente invencion son definidas a continuacion (Tabla 1). Cualquier abreviatura no definida tiene el proposito de transmitir su significado generalmente aceptado.
Tabla 1: Abreviaturas
AcOH
acido acetico glacial
AC2O
anhndrido acetico
Ac
Acuoso
b
Amplio
BEH
hforido con puente de etileno
BINAP
1,1 '-binaftil-2,2'-diamina
Boc
ferc-butoxicarbonilo
CSH
hforido con superficie cargada
d
Doblete
A
desviacion qmmica
DCM
diclorometano
DIAD
azodicarboxilato de diisopropilo
DMF
W,W-dimetilformamida
DMSO
sulfoxido de dimetilo
(ES+)
ionizacion por electrospray, modo positivo
(ES-)
ionizacion por electrospray, modo negativo
Et
Etilo
EtOAc
acetato de etilo
EtOH
Etanol
h
hora(s)
HATU
hexafluorofosfato de 3-oxido de 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5- b]piridinio
base de Hunig
W,W-diisopropiletilamina
IPA
alcohol isoprc^lico
PrOAc
acetato de isopropilo
m
multiplete
(M+H)+
ion molecular protonado
(M-H)-
ion molecular desprotonado
Me
Metilo
MeCN
acetonitrilo
MeOH
Metanol
MHz
megahertz
min
minuto(s)
m/z
relacion masa-a-carga
RMN
resonancia magnetica nuclear (espectroscopia)
Pd2(dba)3
tris(dibencilidenacetona)dipaladio(0)
Ph
Fenilo
q
Cuartete
TA
temperatura ambiente
HPLC
cromatograffa de Ifquidos de alto rendimiento
s
Singlete
Sat
Saturado
SCX
intercambio de cationes soportados por solido (resina)
t
Triplete
lBu
ferc-butilo
THF
tetrahidrofurano
TFA
acido trifluoroacetico
UV
ultra-violeta
AKT
homologo 1 del oncogen viral de timona murino v-akt
ATP
adenosina-5'-trifosfato
BALF
fluido de lavado bronquioalveolar
BSA
albumina de suero bovino
EPOC
enfermedad pulmonar obstructiva cronica
CXCL1
ligando 1 de quimioquina (motivo C-X-C)
COX2
subunidad II de oxidasa c del citocromo
DSC
calorimetna diferencial de barrido
DSS
dextrano sulfato sodico
DTT
Ditiotreitol
celulas d-U937
celulas U-937 PMA diferenciadas
DVS
absorcion dinamica de vapores
dsRNA
ARN de doble hebra
ELISA
ensayo de inmunoabsorbancia vinculado con enzimas
FACS
clasificacion celular activada por fluorescencia
FBS
suero bovino fetal
FRET
transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia
GM-CSF
CSF2: factor de estimulacion de colonias de granulocitos-macrofagos
GSK3a
glucogeno sintasa quinasa 3a
GSK3P
glucogeno sintasa quinasa 3p
HBSS
solucion salina equilibrada de Hank
HCK
quinasa de celulas hemopoyeticas
HRV
rinovirus humano
EII
enfermedad intestinal inflamatoria
IC50
ICAM-1
IFN
IL-2
IL—8
JNK
KC
LPMC
LPS
MAPK
MAPKAP-
MKK4
MKK6
MOI
MTT
OD
PBMC
PBS
PHA
PI3
PMA
REC50
ARN
RNAi
RSV
SDS
SMS
SRC
Syk
TCID50
TGA
TLR3
TNBS
TNFa
URTI
XPD
50% concentracion Inhibitoria
molecula 1 de adhesion inter-celular
Interferon
interleuquina 2
interleuquina 8
quinasa N-terminal c-Jun
quimioatrayente de queratinocitos
celula mononuclear de la lamina propria
lipopolisacarido
protema quinasa activada por mitogeno
K2 protema quinasa activada por mitogeno -protema quinasa activada -2
protema quinasa activada por mitogeno quinasa 4 protema quinasa activada por mitogeno quinasa 6 multiplicidad de infeccion
bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio densidad optica
celula mononuclear de sangre periferica
solucion salina tamponada con fosfato de Dulbecco
fitohemaglutinina
fosfoinositida 3 quinasa
forbol 12-miristato 13-acetato
concentracion eficaz 50% relativa
acido ribonucleico
interferencia de ARN
virus sincicial respiratorio
dodecilsulfato sodico
sistemas de mediciones de superficie
homologo del oncogen de v-src sarcoma (Schmidt-Ruppin A-2) viral (aviar)
tirosina quinasa del bazo
50% de la dosis infecciosa de cultivo tisular
analisis termogravimetrico
receptor 3 tipo toll
acido 2,4,6-trinitrobencensulfonico
factor alfa de necrosis tumoral
infeccion del tracto respiratorio superior
difraccion de rayos X de polvo
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XRD difraccion de rayos X
Ejemplos Quimicos Procedimientos Generales
Todos los materiales de partida y los solventes fueron obtenidos ya sea de fuentes comerciales o fueron preparados de acuerdo con la bibliograffa citada. A menos que se indique lo contrario, todas las reacciones se agitaron. Las soluciones organicas se secaron de la manera habitual sobre sulfato magnesico anhidro. Las hidrogenaciones se llevaron a cabo en un reactor de flujo Thales H-cube bajo las condiciones indicadas.
Se realizo cromatograffa en columna sobre cartuchos de silice preempaquetada (230-400 de malla, 40-63 pm) usando la cantidad indicada. SCX se adquirio en Supelco y se trato con acido clorlmdrico 1M antes del uso. A menos que se indique lo contrario, la mezcla de reaccion a ser purificada fue primero diluida con MeOH y se acidifico con unas pocas gotas de AcOH. Esta solucion se cargo directamente sobre el SCX y se lavo con MeOH. Luego, el material deseado fue eluido lavando con NH3 0.7 M en MeOH.
Cromatografia de L^quidos de Alto Rendimiento en Fase Inversa Preparativa
Se llevo a cabo usando deteccion UV a 215 y 254 nm con una columna Waters X-Select Prep-C18, 5 pm, 19x50 mm eluyendo con un gradiente de H2O-MeCN que contema acido formico 0,1% v/v durante 10 min, o una columna Waters X-Bridge Prep-C18, 5 pm, 19x50 mm eluyendo con un gradiente de H2O-MeCN que contema bicarbonato amonico al 0,1% durante 10 min.
Metodos Analiticos
Cromatografia de L^quidos de Alto Rendimiento en Fase Inversa
Metodo 1: Waters XSelect CSH C18 2.5 pm (4.6 x 30 mm) a 40 °C; mdice de flujo 2,5-4,5 mL min-1 eluido con un gradiente de H2O-MeCN que contema acido formico 0,1% v/v durante 4 min empleando deteccion UV a 254 nm. Informacion del gradiente: 0-3,00 min, subio desde 95% H2O-5% MeCN hasta 5% H2O-95% MeCN; 3,00-3,01 min, se mantuvo a 5% H2O-95% MeCN, mdice de flujo aumento hasta 4,5 mL min-1; 3,01-3,50 min, se mantuvo a 5% H2O-95% MeCN; 3,50-3,60 min, volvio a 95% H2O-5% MeCN, mdice de flujo disminuyo hasta 3,50 mL min-1; 3,603,90 min, se mantuvo a 95% H2O-5% MeCN; 3,90-4,00 min, se mantuvo a 95% H2O-5% MeCN, mdice de flujo se redujo a 2,5 mL min-1.
Metodo 2: Waters XBridge BEH C18, 2,5 pm (4,6 x 30 mm) a 40 °C; mdice de flujo 2,5-4,5 mL min-1 eluido con un gradiente de H2O-MeCN que contema bicarbonato de amonio 10 mM durante 4 min empleando deteccion UV a 254 nm. Informacion del gradiente: 0-3,00 min, subio desde 95% H2O-5% de MeCN hasta 5% de H2O-95% de MeCN; 3,00-3,01 min, se mantuvo a 5% de H2O-95% de MeCN, mdice de flujo aumento hasta 4,5 mL min-1; 3,01-3,50 min, se mantuvo a 5% de H2O-95% de MeCN; 3,50-3,60 min, volvio a 95% de H2O-5% de MeCN, mdice de flujo disminuyo hasta 3,50 mL min-1; 3,60-3,90 min, se mantuvo a 95% de H2O-5% de MeCN; 3,90-4,00 min, se mantuvo a 95% de H2O-5% de MeCN, mdice de flujo disminuyo hasta 2,5 mL min-1.
Espectroscop^a de 1H RMN
Los espectros de 1H RMN fueron adquiridos en un espectrometro Bruker Avance III a 400 MHz usando solvente no deuterado residual como referencia y a menos que se especifique lo contrario se corrieron en DMSO-d6.
Ejemplos
Ejemplo 1A: 1-(3-(terc-but/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-il)ammo)piridm-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea
Compuesto Intermedio A: 3-terc-but/7-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amma
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A una solucion agitada de clorhidrato de p-tolilhidrazina (100 g, 630 mmol) en EtOH (1251 mL) se le agrego 4,4- dimetil-3-oxopentanonitrilo (88 g, 699 mmol) y HCl (62,5 mL, 750 mmol). La mezcla resultante se agito a reflujo durante toda la noche. La mezcla de reaccion se enfrio hasta temperatura ambiente y se concentro in vacuo hasta
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casi 1/3 del volumen original. La mezcla de reaccion luego se enfrio en un bano con hielo y se llevo a cerca de pH 89 con NaOH ac. 6M. La mezcla de reaccion se extrajo con eter dietilico (500 mL) y la fase organica se lavo con agua (2 x 300 mL) antes de secarse sobre sulfato de magnesio y se concentro in vacuo para obtener un solido naranja. El solido se suspendio en iso-hexano y se agito a reflujo durante 2,5 h antes de enfriarse y filtrarse mientras aun se encontraba caliente para obtener el producto del subtftulo 3-terc-but/l-1-p-tolil-1H-pirazol-5-amina como un solido de color marron claro (76,5 g, 52%); R* 1,31 min (Metodo 1); m/z 230 (M+H)+ (ES+); 1H RMN 8: 1,20 (9H, s), 2,32 (3H, s), 5,10 (2H, br s), 5,35 (1H, s), 7,24 (2H, d), 7,42 (2H, m).
Compuesto Intermedio B: (3-(terc-but//)-1-(p-tolN)-1H-pirazol-5-M)carbamato de fenilo
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Una solucion de 3-(terc-but/l)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-amina (Compuesto intermedio A) (20 g, 87,0 mmol) en acetato de isopropilo (240 mL) se agrego a una solucion agitada de carbonato sodico (11,3 g, 106 mmol) en agua (80 mL). Despues de 10 min se agrego cloroformiato de fenilo (12,1 mL, 96 mmol) y la mezcla resultante se agito a temperatura ambiente durante toda la noche. La mezcla de reaccion se diluyo con agua (160 mL), las capas se separaron y y los organicos se lavaron con agua (2 x 80 mL), salmuera (80 mL), se secaron (MgSO4) y se concentraron in vacuo. El solido amarillo resultante se suspendio en 10% eter/isohexano (320 mL) y se agito hasta que se obtuvo una suspension uniforme. El solido se recolecto por filtracion y se lavo con isohexano para obtener el compuesto del subtftulo (3-(terc-but/l)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)carbamato de fenilo como un polvo blanco (27,3 g, 88%); R*2,65 min (Metodo 1); m/z 350 (M+H)+ (ES+); 1H RMN 8:1,29 (9H, s), 2,37 (3H, s), 6,35 (1H, s), 7,10-7,23 (3H, m superpuesto), 7,33-7,46 (6H, m superpuesto), 9,99 (1H, s).
Compuesto intermedio C: (4-((2-cloropiridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-but//o
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A una mezcla de 2-cloro-4-(clorometil)piridina (30 g, 185 mmol) y (4-hidroxinaftalen-1-il)carbamato de terc-but/lo (40,0 g, 154 mmol) en acetonitrilo (200 mL) se le agrego carbonato de cesio (75 g, 231 mmol) y la mezcla resultante se calento hasta 55 °C. Despues de 16 h la mezcla de reaccion se diluyo con 30% MeOH en DCM (600 mL) y agua (400 mL). Las capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con una cantidad adicional de 30% MeOH en DCM (2 x 600 mL) y las fases organicas se concentraron in vacuo para obtener el producto en bruto. El producto en bruto se trituro con MeOH (200 mL), se sonico durante cerca de 5 min y se suspendio durante 1 dfa. El solido resultante se recolecto por filtracion y se lavo con MeOH (2 x 10 mL) para obtener el compuesto del subtftulo (4-((2-cloropiridin- 4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-but/lo como un solido amarillo (43 g, 70%); R* 2,60 min (Metodo 1); m/z 383 (M-H)- (ES-); 1H RMN 8:1,47 (9H, s), 5,41 (2H, s), 6,98 (1H, d), 7,36 (1H, d), 7,55-7,61 (3H, m superpuesto), 7,65 (1H, m), 7,94 (1H, m), 8,29 (1H, m), 8,45 (1H, m), 9,00 (1H, bs).
Compuesto intermedio D (protegido): (4-((2-((6-etMpirazm-2-N)ammo)piridm-4-N)metoxi)naftalen-1- il)carbamato de terc-but//o
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Una mezcla de (4-((2-cloropiridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butilo (Compuesto intermedio C) (1050 mg, 2,73 mmol), 6-etilpirazin-2-amina (437 mg, 3,55 mmol), y carbonato de cesio (1333 mg, 4,09 mmol) en 1,4-dioxano (15 mL) se desgasifico con nitrogeno durante 5 min. Se agrego una solucion de Pd2(dba)3 (125 mg, 0,136 mmol) y BINAP (170 mg, 0,273 mmol) en 1,4-dioxano (5 mL), y la mezcla de reaccion se agito a 90 °C durante 6 h. La mezcla de reaccion se dejo enfriar y se agito at temperatura ambiente durante 16 h, luego se diluyo con 10% MeOH/DCM (25 mL) y se filtro a traves de un tapon de Celite, lavando con mas 10% MeOH/DCM (15 mL). El solvente se elimino in vacuo y el producto en bruto se combino con MeOH (15 mL) y se suspendio durante 3 h. El solido naranja resultante se aislo por filtracion, luego se combino con solucion de MeOH/EtOH (5 mL) y se agito durante 72 h. Nuevamente el solido naranja resultante se aislo por filtracion, luego se agrego acetona (20 mL) y la mezcla se suspendio durante 2 h. El solido residual se separo por filtracion, y el ftquido filtrado se evaporo para proporcionar el compuesto del subtftulo (4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butilo (360 mg, 27%); Rt 2,6 min (Metodo 2); m/z 472 (M+H)+ (ES+); 1H RMN 8: 1,18 (3H, t), 1,47 (9H, s), 2,63 (2H, q), 5,36 (2H, s), 6,99 (1H, d), 7,06 (1H, d), 7,36 (1H, d), 7,53-7,63 (2H, m), 7,90-8,06 (3H, superposicion de m), 8,29 (1H, d), 8,36 (1H, m), 8,91 (1H, s), 8,96 (1H, s), 10,06 (1H, s).
Compuesto intermedio D: W-(4-(((4-ammonaftalen-1-il)oxi)metil)piridm-2-il)-6-etilpirazm-2-amma
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Se agrego TFA (1,485 mL, 19,09 mmol) a una solucion de (4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butilo (Compuesto intermedio D (protegido)) (360 mg, 0,763 mmol) en DCM (15 mL), y la mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 4 h, luego se concentro in vacuo. El residuo se combino con solucion de hidrogenocarbonato sodico sat. y se agito a temperatura ambiente durante 16 h. El solido se filtro, lavando con acetonitrilo, y se seco bajo vado para proporcionar el compuesto del subtftulo N-(4- (((4-aminonaftalen-1-il)oxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina como un solido beige (200 mg, 69%); Rt 2,14 min (Metodo 2); m/z 372 (M+H)+ (ES+); 1H RMN 8: 1,20 (3H, t), 2,64 (2H, q), 5,18-5,24 (4H, m superpuesto), 6,59 (1H, d), 6,82 (1H, d), 7,03 (1H, d), 7,41-7,51 (2H, m superpuesto), 7,98-8,01 (2H, m), 8,04 (1H, m), 8,22-8,29 (2H, m superpuesto), 8,91 (1H, s), 10,04 (1H, s).
1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-il)ammo)piridm-4-il)metoxi)naftalen-
1-il)urea
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Se agrego trietilamina (0,013 mL, 0,093 mmol) a una solucion de (3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5- il)carbamato de fenilo (Compuesto intermedio B) (0,042 g, 0,121 mmol) y N-(4-(((4-aminonaftalen-1- il)oxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina (Compuesto intermedio D) (0,093 g, 0,250 mmol) en THF (1,5 mL) a 40 °C. La mezcla de reaccion se agito a 40 °C durante 40 min y luego se enfrio hasta TA y se agito durante 3 dfas, y luego se concentro in vacuo. El producto en bruto se purifico por cromatograffa en gel de sflice (columna 12 g, 0 a 5% MeOH en DCM) para proporcionar un solido de color marron - blancuzco. El producto se volvio a purificar por HPLC preparativa (Gilson, Addica (Acido formico al 0,1%), Addica, columna Waters X-Select Prep-C18, 5 pm, 19x50 mm, 45-75% MeCN en agua) para obtener el compuesto del tftulo 1-(3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H-pirazol- 5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea como un solido blancuzco (0,029 g, 49%); R* 2,26 min (Metodo 1); m/z 627 (M+H)+ (ES+), 625 (M-H)- (ES-); 1H RMN 8: 1,18 (3H, t), 1,28 (9H, s), 2,40 (3H, s), 2,63 (2H, q), 5,36 (2H, s), 6,36 (1H, s), 7,02 (1H, d), 7,07 (1H, dd), 7,37 (2H, m), 7,45 (2H, m), 7,56-7,67 (3H, m superpuesto), 7,94 (1H, m), 7,99 (1H, s), 8,02 (1H, s), 8,30 (1H, d), 8,39 (1H, m),8,60 (1H, s), 8,81 (1H, s), 8,92 (1H, s), 10,08 (1H, s).
Ejemplo 1B: 1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-il)ammo)piridm-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea (lote diferente)
1-(3-(terc-but/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1- il)urea (10,0 g) se agito en acetonitrilo (770 mL) a 22 °C. La mezcla heterogenea se calento hasta temperatura de reflujo a una velocidad de 3 °C/min y se mantuvo el reflujo durante 2,5 h. La mezcla se sembro con 1-(3-(terc- but/7)—1—(p—tolil)—1H—pirazol—5—il)—3—(4—((2—((6—etilpirazin—2—il)amino)piridin—4—il)metoxi)naftalen—1—il)urea cristalina 5 (100 mg). La mezcla se enfrio linealmente hasta 20 °C durante 18 h luego se calento nuevamente hasta temperatura
de reflujo y se calento a reflujo durante 2 h y luego se enfrio linealmente hasta 22 °C durante 18 h. El producto solido se filtro, se lavo con acetonitrilo (77 mL) y se seco durante 18 h a 45 °C /n vacuo para obtener 1-(3-(terc- but/7)—1 —(p—tolil)—1H—pirazol—5—il)—3—(4—((2—((6—etilpirazin—2—il)amino) piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (8,73 g).
10 Ejemplo 2A: maleato de 1-(3-(terc-but/7)-1-(p-toMl)-1H-pirazol-5-M)-3-(4-((2-((6-etMpirazm-2-
N)ammo)piridm-4-N)metoxi)naftalen-1-N)urea (Forma 2)
Compuesto intermedio C: (4-((2-cloropiridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-but/7o
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Se agrego acetonitrilo (420 mL) a 2-cloro-4-(clorometil)piridina (1,05 eq, 59,5 g), y la mezcla se agito a 20 °C. Se 15 agrego (4-hidroxinaftalen-1-il)carbamato de terc-but/7o (90,8 g) a la mezcla y luego se agrego carbonato de potasio (72,6 g). La mezcla heterogenea se calento hasta 55 °C a una velocidad de 1,0 K/min.
La mezcla se agito durante 16 h a 55 °C y luego la mezcla de reaccion se enfrio hasta 22 °C. Se agrego agua (1260 mL) durante 30 min y la mezcla se agito durante 30 min a 22 °C.
El precipitado se filtro y se lavo dos veces con 200 mL de agua. El producto se seco /n vacuo a 50 °C durante 20 h 20 para obtener (4-((2-cloropiridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-but/7o (100,0 g, 90,6%).
Compuesto intermedio D (protegido): (4-((2-((6-etNpirazm-2-N)ammo)piridm-4-N)metoxi)naftalen-1-
il)carbamato de terc-but/7o
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Se agrego dioxano (125 mL) a (4-((2-cloropiridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-but/7o (Compuesto 25 intermedio C) (9,6 g) y la mezcla se agito a 20 °C. Se agregaron carbonato de cesio (2 eq, 16,3 g) y 2-amino-6- etilpirazina (1,5 eq, 4,8 g) a la mezcla agitada a 20 °C. Se purgo argon a traves de la mezcla de reaccion. Se agregaron tr/s(dibencilidenacetona)dipaladio(0) (0,05 eq, 1,14 g) y BINAP racemico (0,10 eq, 1,56 g) a la mezcla de reaccion. La mezcla se agito durante 15 min adicionales a 20 °C. La mezcla se calento hasta 90 °C a una velocidad de 1,5 K/min luego se agito durante 12 h a 90 °C. La mezcla se enfrio hasta 20 °C y se siguio agitando durante unas 30 6 h adicionales. La mezcla heterogenea se filtro sobre Celite, y el filtro se lavo con dioxano (dos veces 5 mL). El
lfquido filtrado se concentro /n vacuo a 20 mbar y 50 °C. El residuo se disolvio en etanol (150 mL). Se produjo la cristalizacion espontanea. La mezcla heterogenea se agito durante 3 h a 22 °C. El precipitado se filtro y se lavo con etanol (10 mL). El producto se seco /n vacuo a 50 °C durante 20 h para obtener (4-((2-((6-etilpirazin-2- il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-but/7o (9,05 g, 76,8%).
35 Compuesto intermedio D: W-(4-(((4-ammonaftalen-1-N)oxi)metN)piridm-2-M)-6-etMpirazm-2-amma
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Se agrego acetonitrilo (200 mL) a (4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)carbamato de terc-butilo (Compuesto intermedio D (protegido)) (10,5 g) y la mezcla heterogenea se agito a 20 °C. Se agrego acido sulfurico (4,5 eq, 5,5 mL) durante 2 h a 20 °C. La mezcla heterogenea se agito durante unas 2 h mas a 20 °C. Se 5 agrego amomaco acuoso (10 eq, 17 mL) a la mezcla de reaccion durante 15 min y la temperatura se mantuvo a 20
°C por enfriamiento. Se agrego agua (33,4 mL) a la mezcla heterogenea durante 5 min a 20 °C. Despues de la agitacion durante 30 min a 20 °C, la mezcla se enfrio hasta 5 °C y se agito durante unas 2 h adicionales a 5 °C. El precipitado se filtro y se lavo con agua (33,4 mL) y 2-propanol (18 mL). El producto se seco a 50 °C in vacuo durante 24 h para obtener W-(4-(((4-aminonaftalen-1-il)oxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2-amina (6,2 g, 75%).
10 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolN)-1H-pirazol-5-N)-3-(4-((2-((6-etNpirazm-2-N)ammo)piridm-4-N)metoxi)naftalen-
1-il)urea
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Se agrego 2-metiltetrahidrofurano (1809 mL) a W-(4-(((4-aminonaftalen-1-il)oxi)metil)piridin-2-il)-6-etilpirazin-2- amina (Compuesto intermedio D) (41,3 g) y la mezcla se agito a 20 °C. Se agrego (3-(terc-butil)-1-(p-tolil)-1H- 15 pirazol-5-il)carbamato de fenilo (1,2 eq, 51,3 g) a la mezcla. Se agrego trietilamina (0,25 eq, 3,9 mL) y la mezcla se agito durante unos 10 min adicionales a 20 °C. La mezcla de reaccion heterogenea se calento hasta 48 °C durante 30 min y se mantuvo a 48 °C durante 3,5 h. Despues de 10 min a 48 °C, la mezcla se volvio homogenea, y se sembro con 1-(3-(terc-buti|)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea cristalina (60 mg). La mezcla de reaccion se dejo enfriar hasta 20 °C y se agito durante 20 unas 16 h adicionales. El precipitado formado se filtro y se lavo con 2-metiltetrahidrofurano (dos veces 139 mL). El producto se seco durante 18 h a 45 °C in vacuo para obtener 1-(3-(terc-buti/)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4- ((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (54,1 g, 77,5%).
25
maleato de 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolN)-1H-pirazol-5-N)-3-(4-((2-((6-etNpirazm-2-N)ammo)pmdm-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea (Forma 2)
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Se agrego 2-butanona (4442 mL) a 1-(3-(terc-buti/)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2- il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (111,04 g) y se agito a 20 °C. La mezcla heterogenea se calento hasta 65 °C y se volvio una solucion homogenea. Se agrego SilicaMetS Thiol (depurador de metal) (5,55 g) y la mezcla se agito durante 30 min a 65 °C. Se agrego Norit A Supra (carbon activado) (5,55 g) y la mezcla se agito durante unos 30 20 min adicionales a 65 °C. La mezcla se filtro en caliente sobre Celite. El filtro se lavo con 2-butanona caliente
(1555 mL) (60 °C). Se agrego 2-butanona (2887 mL) al liquido filtrado y se llevo hasta 60 °C agitando al mismo tiempo.
Se disolvio acido maleico (1,0 eq, 20,56 g) en 2-butanona (555 mL). La solucion de acido maleico se agrego a la solucion de 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea durante 80 min a 65 °C. Despues de agregarse el 10% de la solucion del acido maleico, la mezcla se sembro con maleato de 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2- 5 il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea cristalino (Forma 2). La mezcla se mantuvo bajo agitacion durante 1 h a 60 °C, luego se enfrio no linealmente con un exponente de 2,3 durante 6 h a 5 °C. El precipitado se filtro y lavo dos veces con 2-butanona (278 mL). El producto se seco a 45 °C /n vacuo durante 20 h para obtener maleato de 1- (3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)na1:talen-1-il)urea (Forma 2) (113,8 g, 86,5%).
10 Ejemplo 2B: Maleato de 1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-
il)ammo)piridm-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (Forma 2) (lote diferente)
Se agrego 2-butanona (750 mL) a 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2- il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (7,50 g) y la mezcla se agito. La mezcla se calento hasta 60 °C durante 20 min. Se agrego una solucion de acido maleico (1,39 g) en 2-butanona (12 mL) a la mezcla durante 5 15 min. Se produjo la cristalizacion espontanea despues de agregarse aproximadamente la mitad de la solucion de acido maleico. La mezcla se agito durante 30 min a 60 °C y luego se enfrio hasta 5 °C durante 6 h con una subida exponencial (exponente = 2,3) luego se agito durante 30 min a 5 °C luego se calento hasta 65 °C durante 30 min y luego se agito durante 30 min a 65 °C luego se enfrio hasta 5 °C durante 6 h con un ascenso exponencial (exponente = 2,3) luego se agito durante 30 min a 5 °C luego se calento hasta 65 °C durante 30 min luego se agito 20 durante 30 min a 65 °C luego se enfrio hasta 5 °C durante 6 h con un ascenso exponencial (exponente = 2,3). El producto se filtro y se lavo dos veces con 2-butanona (50 mL), posteriormente se seco a 45 °C /n vacuo para obtener maleato de 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4- il)metoxi)naftalen-1-il)urea (Forma 2) (7,0 g).
Ejemplo 2C: maleato de 1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-
25 il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (Forma 1)
Se disolvio el maleato de 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin- 4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (15 mg) en THF (100 vol.) a 50 °C y la temperatura tuvo ciclos entre 50 °C y temperatura ambiente durante 24 h (4 h a cada temperatura). La solucion luego se guardo en el refrigerador durante 24 h despues de lo cual se aislo el material solido (Forma 1).
30 Ejemplo 2D: maleato de 1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-
il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea (Forma 1) (lote diferente)
Se disolvio 1-(3-( terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea en THF (40 vol.) a 50 °C y se agrego 1 eq de acido maleico. La muestra se dejo madurar entre TA y 50 °C (4 h a cada temperatura) durante 2 dfas. Se aislo el material solido (Forma 1).
35 Ejemplo 3: Lotes micronizados
Ejemplo 3A: 1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-il)ammo)piridm-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea en forma micronizada
Se preparo 1-(3-( terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino)piridin-4-
il)metoxi)naftalen-1-il)urea micronizada micronizando material del Ejemplo 1B en un dispositivo de micronizacion 40 Hosokawa Alpine Spiral Jet Mill 50 AS (5 cm) (presion 1.0 bar) (alimentacion manual). Los parametros de volumen de tamano de partfcula determinados por difraccion laser usando un Malvern Mastersizer 2000S (dispersion en agua/Tween80, 0.1%p/v) se proporcionan en la tabla que aparece a continuacion:
Dv10 (micron)
Dv50 (micron) Dv90 (micron)
0.15
1.54 10.76
Ejemplo 3B: maleato de 1-(3-(fercHbuf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazm-2-
il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea Forma 2 en forma micronizada
45 Se preparo maleato de 1-(3-(terc-but//)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5-il)-3-(4-((2-((6-etilpirazin-2-il)amino) piridin-4- il)metoxi)naftalen-1-il)urea micronizado (Forma 2) micronizando el material del Ejemplo 2B en un dispositivo de micronizacion Hosokawa Alpine Spiral Jet Mill 50 AS (5 cm) (presion 1.0 bar) (alimentacion manual). Los parametros de volumen de tamano de partfcula determinados por difraccion laser usando un Malvern Mastersizer 2000S (dispersion en agua/Tween80, 0.1%p/v) para el material de entrada y salida se proporcionan en la tabla que aparece 50 a continuacion:
Dv10 (micron) Dv50 (micron) Dv90 (micron)
material de entrada
3 9 128
(Ejemplo 2B)
material de salida
1.21 2.18 4.00
(Ejemplo 3B)
Ejemplo 4: Composiciones que contienen lactosa que contiene 1-(3-(ferc-buf/7)-1-(p-tolil)-1H-pirazol-5- M)-3-(4-((2-((6-etMpirazin-2-il)amino)piridin-4-il)metoxi)naftalen-1-il)urea como la base libre y maleato 5 (Forma 2), adecuadas para inhalacion
Las composiciones se prepararon mezclando los ingredientes de la siguiente manera:
Ejemplo
Ingrediente activo (Ejemplo 3B) (maleato (Forma 2), micronizado) Lactosa monohidratada * Estearato de magnesio **
4a
75mg 75mg —
4b
75mg — 75mg
4c
75mg 35mg 35mg
Ejemplo
Ingrediente activo (Ejemplo 3A) (forma de base libre, micronizada)** Lactosa monohidratada * Estearato de magnesio **
4d
10pg 25mg —
4e
10pg 25mg 1%
4f
100|jg 25mg —
Ejemplo
Ingrediente activo (Ejemplo 3B) (maleato (Forma 2), micronizado) Lactosa monohidratada * Estearato de magnesio **
4g
10pg 25mg —
4h
10pg 25mg 1%
4i
100|jg 25mg —
*Lactohale LH200 **Fuente: Peter Greven (Grado: Ligamed MF-2V; grado vegetal)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Ejemplo 5: Ensayos de caracterizacion y estabilidad Caracterizacion fisica del ingrediente activo
Espectrometrfa de infrarrojos (IR) - Micro Reflectancia Total Atenuada (microATR) Las muestras se analizaron usando un accesorio microATR adecuado.
cantidad de barridos:
resolucion:
rango de longitud de
onda:
aparato:
detector:
divisor de haz:
accesorio micro ATR:
32
1 cm-
4000 a 400 cm-1
espectrometro Thermo Nexus 670 FTIR DTGS con ventanas KBr Ge en KBr
Harrick Split Pea con cristal de Si
El espectro de IR de una muestra del material del Ejemplo 2A, mostrado en la Figura 1, refleja los modos vibracionales de la estructura molecular del Ejemplo 1 como su sal maleato.
XRD de polvo
El analisis de difraccion de rayos X de polvo (XPD) sobre el material de la Forma 2 se llevo a cabo en un difractometro PANanalytical (Philips) X'PertPRO MPD. El instrumento esta equipado con un tubo de rayos X Cu LFF.
El compuesto se esparcio sobre un soporte de muestra de fondo cero.
Parametros del instrumento:
voltaje del generador: amperaje del generador: geometna: etapa:
Condiciones de medicion:
modo de barrido: rango de barrido: tamano de etapa: tiempo de conteo: tiempo de revolucion del
spinner:
tipo de radiacion:
Trayectoria de haz incidente:
program. hendidura de divergencia: hendidura de Soller: mascara de haz: hendidura anti dispersion: cuchilla de haz:
45 kV 40 mA
Bragg-Brentano etapa de spinner
continuo 3 a 50° 20 0.02°/etapa 30 seg/etapa
1 seg CuKa
Trayectoria de haz difractado:
15 mm proteccion anti dispersion larga: +
0.04 rad hendidura de Soller: 0.04 rad
15 mm filtro de Ni: +
1° detector: X'Celerator
+
Se llevo a cabo el analisis de difraccion de rayos X de polvo (XPD) sobre el material de Forma 1 en un difractometro Bruker AXS C2 GADDS. El compuesto fue presionado ligeramente sobre una platina de vidrio.
Parametros del Instrumento:
voltaje del generador: amperaje del generador: geometna:
etapa:
Condiciones de medicion:
modo de barrido: continuo rango de barrido: 3 a 30° 20 tamano de etapa:0.05°/etapa tiempo de conteo: 120 seg
tipo de radiacion: CuKa
40 kV 40 mA
reflexion (=Bragg-Brentano) etapa XYZ automatizada
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15
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50
detector:HiStar bidimensional
Espejo multicapas Gobel simple acoplado con un colimador de orificio pequeno “pinhole” de 0,3 mm
El patron de XRD en polvo de una muestra del material del Ejemplo 2A, que se muestra en la Figura 2, muestra picos de difraccion sin la presencia de un halo, lo cual indica que el compuesto esta presente como un producto cristalino. Este patron de XRD es caractenstico del polimorfo cristalino Forma 2.
El patron de XRD en polvo de una muestra del material del Ejemplo 2D, mostrado en la Figura 3, muestra picos de difraccion sin la presencia de un halo, lo cual indica que el compuesto esta presente como un producto cristalino. Este patron de XRD es caractenstico del polimorfo cristalino Forma 1.
Calorimetna diferencial de barrido (DSC, por sus siglas en ingles)
Se transfirieron alrededor de 3 mg del compuesto de ensayo a un recipiente de muestra del instrumento TA de aluminio estandar. El recipiente de la muestra se cerro con la cubierta apropiada y se registro la curva de DSC en un TA-Instruments Q1000 MTDSC equipado con una unidad de refrigeracion RCS.
Se utilizaron los siguientes parametros:
temperatura inicial: 25°C
mdice de calentamiento: 10°C/min
temperatura final:300°C
flujo de nitrogeno: 50 mL /min
La curva de DSC de una muestra de material del Ejemplo 2A, mostrado en la Figura 4, revela la fusion con descomposicion del producto a aproximadamente 198,6 °C (Forma 2).
Analisis termogravimetrico (TGA, por sus siglas en ingles)
El compuesto de ensayo fue transferido a un recipiente de muestra de aluminio. Se registro la curva termogravimetrica en un aparato termogravimetrico TA Instruments Q500. Se utilizaron los siguientes parametros:
temperatura inicial: temperatura ambiente
velocidad de calentamiento: 20°C/min
factor de resolucion: 4
condicion final: 300°C o <80[(p/p)%]
Un grafico de TGA de una muestra del material del Ejemplo 2A es mostrado en la Figura 5. No se registro perdida de peso en la region de temperatura desde temperatura ambiente hasta 175 °C. La perdida de peso por encima de 175 °C se debe a la evaporacion y a la descomposicion del producto.
Absorcion dinamica de vapores (DVS, por sus siglas en ingles)
Aproximadamente 20 mg del compuesto de ensayo se transfirio a un aparato de absorcion dinamica de vapores SMS y se registro el cambio de peso con respecto a la humedad atmosferica a 25 °C.
Se utilizaron los siguientes parametros:
secado: 60 min. bajo nitrogeno seco
equilibrio: 60 min/Etapa.
Puntos de medicion de HR (%):
primer conjunto: 5,10,20,30,40,50,60,70,80,90,95,90,80,70,60,50,40,30,20,10,5
segundo conjunto: 10,20,30,40,50,60,70,80,90,95,90,80,70,60,50,40,30,20,10,5,0
Se realizo el ensayo de DVS sobre una muestra del material del Ejemplo 2A (vease las Figuras 6 y 7). Durante la etapa de secado inicial, se registro una perdida de peso de 0,3%. El producto no parece ser higroscopico.
El producto despues de DVS, fue investigado por XRD e IR y permanecio en la misma forma en estado solido antes del ensayo y despues del ensayo (datos no mostrados). No se observo indicacion alguna para la disociacion de la sal.
Microscopia Electronica de Barrido (SEM, por sus siglas en ingles)
Para los experimentos de SEM, los datos fueron recogidos en un Microscopio Electronico de Barrido Phenom Pro Scanning Electron Microscope. Una pequena cantidad de muestra fue montada sobre un portaobjetos de aluminio usando cinta adhesiva de dos lados conductora. Se aplico una delgada capa de oro usando un revestidor por pulverizacion catodica (20 mA, 120 seg).
Las muestras del material de la Forma 1 y la Forma 2 de la sal maleato del compuesto de la invencion fueron inspeccionadas por SEM. El producto de la forma 1 tema una morfologfa tipo aguja. El producto de la forma 2 tema
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una morfologfa tipo placa. La morfologfa tipo placa de la Forma 2 es mas adecuada para la preparacion de un producto inhalado que la morfologfa tipo aguja de la Forma 1.
Sntesis de los resultados de la caracterizacion fisica del ingrediente activo
El material analizado era cristalino en base a XRD y se derrite con descomposicion a alrededor de 198.6 °C. No se observo perdida de peso alguna entre la temperatura ambiente y 175 °C por TGA. El material pareda no ser higroscopico. No habfa evidencia alguna de conversion de estado solido o disociacion de la sal. Estas propiedades confirman la conveniencia de la sal maleato del compuesto de formula (I) como un farmaco candidato.
Caracterizacion fisica del ingrediente activo en forma micronizada
Una muestra del material del Ejemplo 3B fue estudiada por IR, XRD de polvo, DSC, TGA y DVS de modo similar a aquel descrito con anterioridad para el material del ejemplo 2A. Los resultados de IR y XRD de polvo fueron sustancialmente iguales (datos no mostrados). El material analizado era cristalino en base a XRD y se derrite con la descomposicion a alrededor de 194,6 °C de acuerdo con DSC. El material pareda no ser higroscopico (datos no mostrados). No hada evidencia alguna de la conversion del estado solido o disociacion de la sal (datos no mostrados). Estas propiedades confirman la conveniencia de la sal maleato del compuesto de formula (I) en forma micronizada como un farmaco candidato.
Ensayos de estabilidad fisica - estabilidad de mezclas de lactosa
Las composiciones de los Ejemplos 4a, 4b y 4c se almacenaron durante 3, 6 y 13 semanas bajo condiciones de 40 °C/75% HR, 50 °C/80% HR y 50 °C/ HR del ambiente. Los patrones de XRD y los espectros de IR se obtuvieron en tiempo cero y en los tres puntos en el tiempo (los parametros de ensayo fueron iguales a lo descrito para la caracterizacion del ingrediente activo, mas arriba). No se observaron diferencias relevantes en los patrones de XRD o en los espectros de IR entre tiempo cero y cualquiera de los puntos de tiempo (datos no mostrados). No se observaron cambios a la forma en estado solido o disociacion de la sal.
Ensayos de estabilidad qumica - estabilidad de ingrediente activo y mezclas
UPLC Metodo para determinacion de la degradacion
Se extrajeron las muestras con mezcla de solventes (DMSO/agua 80:20) (7 mL) en un frasco de 10 mL.
Se realizo la cromatograffa UPLC usando los siguientes parametros:
Columna: Supelco Ascentis Express C18, 150 mm de largo x 3.0 mm i.d., tamano de partfcula 2,7 pm
Temperatura de la Columna: 30 °C
Temperatura del Automuestreador: 5 °C
fndice de flujo: 0.40 mL /min
Fase Movil:
Solvente A: acetato de amonio 10 mM (0,771 g/L) + 0,1% v/v de acido trifluoracetico en agua Solvente B: acetonitrilo/ alcohol isopropflico 70:30 (v/v)
Gradiente:
Solvente
Tiempo en minutos
0 20 25 30 31 36
%A
90 35 0 0 90 90
%B
10 65 100 100 10 10
Tiempo de realizacion del analisis: 36 min Tiempo de recoleccion de datos: 30 min Volumen de inyeccion: 5 pL Longitud de onda: barrido entre 200 y 400 nm
Longitud de onda usada para calculos de uniformidad del contenido: 334,0 nm
Las composiciones de los Ejemplos 4d, 4e, 4f, 4g, 4h y 4i se almacenaron durante 14 y 30 dfas bajo condiciones de 50 °C/75% de HR, 60 °C/30% de HR, 60 °C/50% de HR, 70 °C/10% de HR, 70 °C/ 75% de HR y 80 °C/50% de HR.
Se midio la degradacion en tiempo cero y en los puntos de tiempo de 7, 14 y 30 dfas por UPLC y los resultados son mostrados en la Figura 8, placas A a F.
El porcentaje de degradacion total para las composiciones que conteman la sal maleato, Forma 2 del ingrediente activo era siempre mas bajo que el de las composiciones equivalentes que contienen la base libre del ingrediente activo lo cual indica que la sal maleato, Forma 2 es mas estable en estas formulaciones. El porcentaje de degradacion total para las composiciones que contienen la sal maleato, Forma 2 del ingrediente activo en
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concentraciones mas altas era mas bajo que aquel para las composiciones que contienen la sal maleato, Forma 2 del ingrediente activo en concentracion mas baja en estas formulaciones.
En estudios similares sobre material del Ejemplo 1B y Ejemplo 2B (es decir, material no micronizado y no mezclado) en donde las muestras se almacenan durante hasta 30 d^as bajo condiciones de 50oC/75% de HR, 60 °C/50% de HR, 70 °C/10% de HR, 70 °C/75% de HR y 80 °C/50% de HR, se obtuvieron resultados cualitativamente similares, es decir, el porcentaje de degradacion total para la sal maleato fue siempre mas bajo que aquel para la base libre (datos no mostrados).
A partir de estos resultados, parece ser que la sal maleato del compuesto de la invencion es mas qmmicamente estable (sola y en combinacion con lactosa) que la forma de base libre.
Ejemplo 6: Ensayos biologicos
Metodos experimentales para ensayos biologicos
Ensayos de Inhibicion Enzimatica
Las actividades de inhibicion enzimatica del compuesto descrito en la presente invencion fueron determinadas por FRET usando peptidos sinteticos etiquetados con fluoroforos donantes y aceptores (Z-LYTE, Life Technologies, Paisley, Reino Unido).
Inhibicion de Enzima p38 MAPKa
Las actividades inhibitorias del compuesto de la invencion contra la isoforma p38 MAPKa (MAPK14: Life Technologies), fueron evaluadas indirectamente determinando el nivel de activacion / fosforilacion del peptido objetivo de la molecula corriente abajo de p38 MAPKa, MAPKAP-K2. La enzima (40 ng/mL, 2,5 jL) se incubo con el compuesto de ensayo (2,5 jL de 40 jg/mL, 12 jg/mL, 4 jg/mL, 1,2 jg/mL, 0,4 jg/mL, 0,12 jg/mL, 0,04 jg/mL, 0,012 jg/mL, 0,004 jg/mL o 0,0012 jg/mL) durante 2 h a tA. Los peptidos de la FRET (8 pM, 2,5 jL) y la MaPkAP- K2 p38a inactiva objetivo (Life Technologies, 2000 ng/mL), y solucion apropiada de ATP (2,5 pL, 40 pM) luego se agregaron a la mezcla de enzima / compuesto y se incubo durante 1 h a TA. Se agrego reactivo de elaboracion (proteasa, 5 jL) durante 1 h antes de la deteccion en un lector de microplacas de fluorescencia (EnVision, Perkin Elmer, Waltham, MA, EE. UU.).
Inhibicion de Enzima p38 MAPKv
Las actividades de inhibicion del compuesto de la invencion contra p38MAPKY (MAPK12: Life Technologies), se evaluaron determinando el nivel de activacion / fosforilacion del peptido objetivo. La enzima (800 ng/mL, 2,5 jL) se incubo con el compuesto del ensayo (2,5jL a 40 jg/mL, 12 jg/mL, 4 jg/mL, 1,2 jg/mL, 0,4 jg/mL, 0,12 jg/mL, 0,04 jg/mL, 0,012 jg/mL, 0,004 jg/mL o 0,0012 jg/mL) durante 2 h a TA. Los peptidos de la FRET (8 pM, 2,5 jL), y solucion apropiada de ATP (2,5 pL, 400 pM) luego se agregaron a las mezclas de enzimas / compuesto y se incubo durante 1 h a TA. Se agrego reactivo de elaboracion (proteasa, 5 jL) durante 1 h antes de la deteccion en un lector de microplacas de fluorescencia (EnVision, Perkin Elmer).
Inhibicion de Enzimas Hck, c-Src y Syk
Las actividades de inhibicion del compuesto de la invencion contra las enzimas Hck, c-Src y Syk (Life Technologies) se evaluaron de manera similar a la descrita anteriormente en esta invencion. La enzima relevante (1000 ng/mL, 1400 ng/mL o 2000 ng/mL respectivamente, 2,5 jL) se incubo con el compuesto del ensayo (ya sea 40 jg/mL, 12 jg/mL, 4 jg/mL, 1,2 jg/mL, 0,4 jg/mL, 0,12 jg/mL, 0,04 jg/mL, 0,012 jg/mL, 0,004 jg/mL o 0,0012 jg/mL, 2,5 jL cada una) durante 2 h a TA. Los peptidos de FRET (8 pM, 2,5 jL), y soluciones apropiadas de ATP (2,5 pL, 800 pM para c-Src, y 60 pM ATP para HCK y Syk) luego se agregaron a las mezclas de enzima / compuesto y se incubo durante 1 h a TA. Se agrego reactivo de elaboracion (proteasa, 5 jL) durante 1 h antes de la deteccion en un lector de microplacas de fluorescencia (EnVision, Perkin Elmer).
Inhibicion de Enzima GSK 3a
Las actividades de inhibicion del compuesto de la invencion contra la isoforma de la enzima GSK 3a (Life Technologies) se evaluaron de modo similar al descrito con anterioridad en la presente invencion. La protema GSK3a (500 ng/mL, 2,5 jL) se incubo con el compuesto del ensayo (2,5 jL a ya sea 40 jg/mL, 12 jg/mL, 4 jg/mL, 1,2 jg/mL, 0,4 jg/mL, 0,12 jg/mL, 0,04 jg/mL, 0,012 jg/mL, 0,004 jg/mL o 0,0012 jg/mL) durante 2 h a TA. El peptido de FRET (8 pM, 2,5 jL), el cual es un objetivo de fosforilacion para GSK3a, y ATP (40 pM, 2,5 jL) luego se agregaron a la mezcla de enzima / compuesto y la mezcla resultante se incubo durante 1 h a tA. Se agrego reactivo de elaboracion (proteasa, 5 jL) durante 1 h antes de la deteccion en un lector de microplacas de fluorescencia (EnVision, Perkin Elmer).
En todos los casos, la proteasa sitio espedfica disocia al peptido no fosforilado solamente y elimina la senal de FRET. Se calcularon los niveles de fosforilacion de cada reaccion usando la relacion de emision de cumarina (donante) con respecto a la emision de fluorescema (aceptor), para lo cual las relaciones bajas indican fosforilacion
elevada y las relaciones elevadas indican niveles bajos de fosforilacion. Se calculo el porcentaje de inhibicion de cada reaccion con relacion al control no inhibido y luego se calculo la concentracion inhibitoria del 50% (valor IC50) de la curva concentracion - respuesta.
Ensayos Celulares (empleados en los Ejemplos)
5 Se emplearon los siguientes ensayos celulares para evaluar el compuesto de la presente invencion y los resultados son proporcionados mas adelante.
Liberacion de TNFa/IL-8 inducida por LPS en Celulas d-U937
Las celulas U937, una lmea celular monocftica humana, fueron diferenciadas en celulas tipo macrofago por incubacion con PMA (100 - 200 ng/mL) durante 48 a 72 hr. Las celulas fueron previamente incubadas con 10 concentraciones finales de compuesto de ensayo durante 2 h y luego fueron estimuladas con LPS (0,1 pg/mL; de E. Coli: O111:B4, Sigma) durante 4 h. El sobrenadante se recolecto para la determinacion de las concentraciones de TNFa e IL-8 por ELISA sandwich (Duo-set, R&D systems). La inhibicion de la produccion de TNFa se calculo como un porcentaje de lo logrado por 10 pg/mL de BIRB796 en cada concentracion de compuesto de ensayo mediante comparacion contra vetnculo de control. Se determino el 50% de la concentracion eficaz relativa (REC50) a partir de 15 la curva resultante de concentracion - respuesta. Se calculo la inhibicion de la produccion de IL-8 en cada concentracion de compuesto de ensayo mediante comparacion con vetnculo de control. Se determino el 50% de concentracion de inhibicion (IC50) a partir de la curva resultante de concentracion - respuesta.
Expresion de ICAM-1 inducida por poli I:C en celulas BEAS2B
Se utilizo poli I:C en estos estudios como una simple imitacion del virus de ARN. La mezcla de poli I:C-
20 Oligofectamina (2% Oligofectamina ± 1 pg/mL Poli I:C, 25 pL; Life Technologies e Invivogen Ltd., San Diego, CA,
respectivamente) se transfecto en celulas BEAS2B (celulas epiteliales bronquiales humanas, ATCC). Las celulas fueron previamente incubadas con concentraciones finales de compuestos de ensayo durante 2 h y se determino el nivel de expresion de ICAM-1 en la superficie celular por ELISA basado en celulas. En el punto de tiempo de 18 h luego de la transfeccion de poli I:C, las celulas se fijaron con 4% de formaldehndo en PBS (100 pL) y se apago la
25 peroxidasa endogena mediante la adicion de tampon de lavado (100 pL, 0,05% Tween en PBS: PBS-Tween) que
contema azida de sodio al 0,1% y peroxido de hidrogeno al 1%. Las celulas se lavaron con tampon de lavado (3 x 200 pL). Despues del bloqueo de los pocillos con 5% de leche en PBS-Tween (100 pL) durante 1 h, las celulas se incubaron con anticuerpo ICAM-1 antihumano (50 pL; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) en 1% BSA PBS durante toda la noche a 4°C.
30 Las celulas se lavaron con PBS-Tween (3 x 200 pL) y se incubaron con el anticuerpo secundario (100 pL; IgG anticonejo conjugado a HRP, Dako Ltd., Glostrup, Dinamarca). Luego, las celulas se incubaron con sustrato (50 pL) durante 2-20 min, seguido por la adicion de solucion de interrupcion (50 pL, 1N de H2SO4). Se detecto la senal de ICAM-1 mediante la lectura de la absorbancia a 450 nm contra una longitud de onda de referencia de 655 nm usando un espectrofotometro. Luego, las celulas se lavaron con PBS-Tween (3 x 200 pL) y se determinaron las 35 cantidades celulares totales en cada pocillo mediante la lectura de la absorbancia a 595 nm despues de la tincion con Violeta Cristal (50 pL de una solucion al 2% en PBS) y elucion mediante solucion de SDS al 1% (100 pL) en PBS. Se corrigieron las lecturas medidas de OD450-655 para numero de celulas dividiendo con la lectura OD595 en cada pocillo. La inhibicion de la expresion de ICAM-1 se calculo en cada concentracion de compuesto de ensayo por comparacion con vetnculo de control. Se determino el 50% de la concentracion inhibitoria (IC50) a partir de la 40 curva resultante de concentracion - respuesta.
Ensayo de Mitosis Celular
Se separaron de la sangre entera los mononucleocitos de sangre periferica (PBMCs, por sus siglas en ingles) de sujetos sanos (Quintiles, Londres, Reino Unido) usando un gradiente de densidad (Histopaque®-1077, Sigma- Aldrich, Poole, Reino Unido). Los PBMCs (3 millones de celulas por muestra) fueron tratados posteriormente con 2% 45 PHA (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) durante 48 h, seguido por una exposicion de 20 h a concentraciones variables de compuestos de ensayo. A 2 h antes de la recoleccion, los PBMCs fueron tratados con demecolcina (0,1 pg/mL; Life Technologies, Paisley, Reino Unido) para detener las celulas en metafase. Para observar las celulas mitoticas, PBMCs fueron permeabilizados y fijados agregando Intraprep (50 pL; Beckman Coulter, Francia), y se tineron con anti-fosfo-histona 3 (0,26 ng/L; #9701; Cell Signalling) y yoduro de propidio (1 mg/mL; Sigma-Aldrich 50 segun lo descrito previamente (Muehlbauer P.A. et al., Mutation Res., 2003, 537, 117-130). Se observo la fluorescencia usando un citometro de flujo ATTUNE (Life Technologies), que se vincula con los linfocitos. Se calculo el porcentaje de inhibicion de la mitosis para cada tratamiento con relacion al tratamiento con vetnculo (0,5% de DMSO).
El Efecto de los Compuestos de Ensayo sobre la Viabilidad Celular: Ensayo de MTT
55 Las celulas U937 diferenciadas fueron previamente incubadas con cada compuesto de ensayo (concentracion final 10 pg/mL en 200 pL de medio indicado mas abajo) bajo dos protocolos: el primero para 4 h en 5% FCS medio RPMI1640 y el segundo en 10% FCS medio RPMI1640 para 24 h. Se reemplazo el sobrenadante con medio nuevo
(200 |jL) y se agrego solucion inicial de MTT (10 jL, 5 mg/mL) a cada pocillo. Despues de la incubacion durante 1 h, se elimino el medio, se agrego DMSO (200 jL) a cada pocillo y las placas se agitaron ligeramente durante 1 h antes de la lectura de la absorbancia a 550 nm. Se calculo el porcentaje de perdida de la viabilidad celular para cada pocillo con relacion al tratamiento con vehnculo (0,5% de DMSO). Por lo tanto, se tabula un aumento aparente de la 5 viabilidad celular para el tratamiento farmacologico con relacion al vehnculo como un porcentaje negativo.
Produccion de citoquinas en macrofagos de esputo tratados con LPS de pacientes con EPOC
Los pacientes con EPOC inhalaron una solucion nebulizada de 3% (p/v) solucion salina hipertonica usando un nebulizador ultrasonico (Devilbiss, Carthage, MO) con respiracion a volumen corriente durante 5 min. Este procedimiento fue repetido un maximo de tres veces hasta que se obtuvo suficiente esputo. Las muestras de esputo 10 fueron homogenizadas y mezcladas vigorosamente usando un mezclador de vortice en 0,02% v/v de solucion de ditiotreitol (DTT). Las muestras se resuspendieron en PBS (40 mL) seguido por centrifugacion a 1500 rpm a 4°C durante 10 min para obtener pellets celulares de esputo. Los pellets se lavaron con PBS (40mL). Luego las celulas de esputo se resuspendieron en 4 mL de medio libre de suero de macrofagos (macrofago-SFM, Life technologies, que contema 20 U/mL de penicilina, 0,02 mg/mL de estreptomicina y 5 jg/mL de anfotericina B) y se sembraron en 15 placa de 96 pocillos de elevada union, seguido por incubacion durante 1 h a 37 °C y a 5% de CO2 para permitir que los macrofagos se adhieran al fondo de la placa. Las celulas en la placa se lavaron con macrofago nuevo-SFM (200 jL/pocillo) para eliminar a los neutrofilos y otras celulas contaminadas. Se utilizaron las celulas adherentes (principalmente los macrofagos de esputo) en la placa para el analisis posterior. Se llevaron a cabo inducciones de esputo en la Unidad de Investigacion de Farmacos de Quintiles en Guys Hospital y se obtuvo de parte de Quintiles 20 la aprobacion de etica y el consentimiento informado por escrito.
En caso apropiado, se agrego 1 jL de una solucion que contema ya sea el compuesto de ensayo o el artfculo de referencia en las concentraciones indicadas (ya sea 0,1 pg/mL, 0,01 pg/mL, o 0,001 pg/mL) o alternativamente 1 jL de DMSO como el control vehicular en cada pocillo (200 jL en medio) y las celulas se incubaron durante 2 h. Las celulas fueron estimuladas con solucion de lPs (50 jL, concentracion final: 1 jg/mL) y se incubaron durante 18 h a 25 37 °C y 5% CO2. Luego, el sobrenadante se recolecto y se guardo a -80 °C. Se utilizaron kits luminex adecuados
para medir los analitos seleccionados. Despues de descongelar el sobrenadante, se multiplexaron y se incubaron las perlas magneticas de anticuerpo en una placa de 96 pocillos con solucion estandar de base o el volumen apropiado de muestra durante toda la noche con agitacion a 4 °C. Despues de lavar dos veces con 200 jL de tampon de lavado proporcionado por el kit por pocillo usando un lavador de placa magnetico, las perlas se incubaron durante 1 30 h a TA con solucion de anticuerpo conjugado con biotina proporcionada por el kit con agitacion. Se agrego solucion de estreptavidina durante 30 min con agitacion a TA. Despues del lavado con 200 jL de tampon de lavado por pocillo, las perlas se resuspendieron en fluido envolvente (150 jL) y se analizaron de inmediato. Se calculo el nivel de cada analito en el sobrenadante usando el programa informatico Xcel Fit con una ecuacion de 4 o 5 parametros usando cada curva estandar. Se calcularon las inhibiciones de cada produccion de citoquinas en cada concentracion 35 por comparacion con el vehnculo de control.
Liberacion de IL-8 inducida por Rinovirus
Se obtiene rinovirus humano RV16 de la Recoleccion Americana de Cultivos Tipificados (American Type Culture Collection) (Manassas, VA). Se generan cepas virales infectando celulas MRC5 con HRV hasta que el 80% de las celulas eran citopaticas.
40 Se infectan celulas BEAS2B con HRV a un MOI de 1.2 y se incuban durante 1 h a 33 °C con suave agitacion para promover la absorcion. Luego las celulas se lavan con pBs, se agrega medio nuevo y las celulas se incuban durante otras 72 h. Se recolecta el sobrenadante para ensayo de las concentraciones de IL-8 usando un kit de elaboracion de ELISA Duoset (R&D systems, Minneapolis, MN). Los compuestos son agregados 2 h antes de la infeccion con HRV y 1 h despues de la infeccion cuando se lava HRV no infectado.
45 Ensayos Celulares (no empleados en los Ejemplos)
Los siguientes ensayos celulares pudieron ser empleados para evaluar el compuesto de la presente invencion:
Liberacion de IL-8 inducida por Rinovirus (variacion del metodo antes expuesto) y Expresion de ICAM-1
Se obtiene rinovirus humano RV16 de la Recoleccion Americana de Cultivos Tipificados (Manassas, VA). Se generan cepas virales infectando celulas Hela con HRV hasta que el 80% de las celulas eran citopaticas.
50 Se infectan celulas BEAS2B con HRV a un MOI de 5 y se incuban durante 1 a 2 h a 33 °C con agitacion suave para promover la absorcion. Luego las celulas se lavan con PBS, se agrega medio nuevo y las celulas se incuban durante otras 72 h. Se recolecta el sobrenadante para ensayo de las concentraciones de IL-8 usando un kit de elaboracion de ELISA Duoset (R&D systems, Minneapolis, MN).
Se determina el nivel de expresion de ICAM-1 de superficie celular mediante ELISA basado en celulas. A 72 h 55 despues de la infeccion, las celulas se fijaron con 4% de formaldehndo en PBS. Despues de templar la peroxidasa endogena agregando azida sodica al 0,1% y peroxido de hidrogeno al 1%, los pocillos se lavan con tampon de
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lavado (0,05% Tween en PBS: PBS-Tween). Despues del bloqueo del pocillo con 5% de leche en PBS-Tween durante 1 h, las celulas se incuban con anticuerpo ICAM-1 antihumano en 5% BSA PBS-Tween (1:500) durante toda la noche. Los pocillos se lavan con PBS-Tween y se incuban con el anticuerpo secundario (igG anticonejo conjugado con HRP, Dako Ltd.). La senal de ICAM-1 se detecta agregando sustrato y por la lectura a 450 nm con una longitud de onda de referencia de 655 nm usando un espectrofotometro. Luego, los pocillos se lavan con PBS- Tween y se determinaron las cantidades celulares totales en cada pocillo por la lectura de la absorbancia a 595 nm despues de la tincion con Violeta Cristal y elucion mediante solucion de sDs al 1%. Las lecturas medidas de OD450- 655 son corregidas para el numero de celulas dividiendo con la lectura de OD595 en cada pocillo. Los compuestos son agregados 2 h antes de la infeccion con HRV y 1 a 2 h despues de la infeccion cuando se lava el HRV no infectado.
Liberacion de TNFa / IL-8 inducida por LPS en Celulas PBMC
Se separan de la sangre entera celulas mononucleares de sangre periferica (PBMCs) de sujetos sanos usando un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare). Las PBMCs son sembradas en placas de 96 pocillos y tratadas con los compuestos a la concentracion deseada durante 2 h antes de la adicion de 1 ng/mL de LPS (Escherichia Coli 0111:B4 de Sigma Aldrich) durante 24 h bajo condiciones normales de cultivo tisular (37°C, 5% de CO2). El sobrenadante es recolectado para la determinacion de las concentraciones de TNFa por ELISA sandwich (Duo-set, R&D systems) y se leen en el lector de microplacas por fluorescencia (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). La concentracion a 50% de inhibicion (IC50) de la produccion de IL-8 y TNFa se calcula a partir de la curva de respuesta a la dosis.
Liberacion de IL-2 e IFN gamma en celulas PBMC estimuladas con CD3/CD28
PBMCs de sujetos sanos son separadas de sangre entera usando un gradiente de densidades (Lymphoprep, Axis- Shield Healthcare). Las celulas se agregan a una placa de 96 pocillos previamente recubierta con una mezcla de anticuerpos monoclonales CD3/CD28 (0,3 pg/mL eBioscience y 3 pg/mL BD Pharmingen respectivamente). Luego se agrega el compuesto a la concentracion deseada a los pocillos y la placa se deja durante 3 dfas bajo condiciones normales de cultivo de tejidos. Se recolectan los sobrenadantes y se determina la liberacion de IL-2 e IFN gamma por ELISA Sandwich (Duo-set, R&D System). Se determina la IC50 a partir de la curva de respuesta a la dosis.
Liberacion de IL-8 inducida por IL-1B en celulas HT29
Las celulas HT29, una lmea celular humana de adenocarcinoma de colon, se plaquean en una placa de 96 pocillos (24 h) y son pretratadas con los compuestos a la concentracion deseada durante 2 h antes de la adicion de 5 ng/mL de IL-1p (Abcam) durante 24 h. Los sobrenadantes son recolectados para la cuantificacion de IL-8 por ELISA Sandwich (Duo-set, R&D System). Se determina la IC50 a partir de la curva de respuesta a la dosis.
Proliferacion de celulas T
PBMCs de sujetos sanos son separadas de sangre entera usando un gradiente de densidades (Lymphoprep, Axis- Shield Healthcare). La fraccion de linfocitos es primero enriquecida para celulas T CD4+ mediante clasificacion celular magnetica negativa de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec 130-091-155). Luego las celulas T CD4+ no sometidas anteriormente al tratamiento de ensayo (naive) se separan usando seleccion magnetica positiva de celulas CD45RA+ usando microperlas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (130045-901). Las celulas se colocan en placa a 2x105 celulas por pocillo en 100 pL de RPMI/10%FBS en una placa con fondo plano de 96 pocillos (Corning Costar). Se diluyen 25 pL de compuesto de ensayo hasta la concentracion apropiada (8x conc. final) en medio normal y se agregan a pocillos por duplicado en la placa para lograr un rango de respuesta a la dosis de 0,03 ng/mL - 250 ng/mL. Se agrega DMSO como un control negativo. Las placas se dejan preincubar durante 2 h antes de la estimulacion con 1 pg/mL de anti-CD3 (OKT3; eBioscience). Despues de 72 h, el medio en cada pocillo es reemplazado por 150 pL de medio nuevo que contiene 10 pM de BrdU (Roche). Luego de 16 h, se retira el sobrenadante, la placa se seca y las celulas se fijan agregando 100 pL de solucion fijadora/ desnaturalizadora a cada pocillo durante 20 min de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche). Las placas se lavan una vez con PBS antes de la adicion del anticuerpo de deteccion anti-BrdU y se incuban durante 90 min a temperatura ambiente. Luego, las placas son lavadas suavemente 3x con el tampon de lavado provisto y elaborado por la adicion de 100 pL de solucion de sustrato. La reaccion se detiene mediante la adicion de 50 pL de H2SO4 1 M, y se lee para absorbancia a 450 nm en un lector de placas (Varioskan® Flash, ThermoFisher Scientific). Se determina la IC50 a partir de la curva de respuesta a la dosis.
Ensayo de Biopsia Humana
Se obtienen biopsias de la mucosa intestinal de las regiones inflamadas del colon de pacientes con EII. El material de biopsia se corta en pequenos pedazos (2-3 mm) y se coloca sobre mallas de acero en una camara de cultivo organico a 37 °C en una atmosfera de 5% CO2/95% O2 en medio libre de suero. Se agregan el control de DMSO o los compuestos de ensayo a la concentracion deseada al tejido y se incuba durante 24 h en la camara de cultivo de organos. El sobrenadante se recolecta para la determinacion de los niveles de IL-6, IL-8, IL-1p y TNFa mediante R&D ELISA. Se calcula el porcentaje de inhibicion de la liberacion de citoquinas mediante los compuestos de ensayo con relacion a la liberacion de citoquinas determinada para el control de DMSO (100%).
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Liberacion de IL-2 e IFNy en celulas LPMC estimuladas con CD3/CD28 de pacientes con EII (Enfermedad Inflamatoria Intestinal)
Las celulas mononucleares de la lamina propria (LPMCs) se afslan y se purifican de la mucosa de EII inflamada de muestras quirurgicas o de la mucosa normal de las muestras quirurgicas de la siguiente manera:
La mucosa es retirada de las capas mas profundas de las muestras quirurgicas con un escalpelo y se corta en fragmentos de 3-4 mm de tamano. El epitelio se remueve lavando los fragmentos de tejido tres veces con EDTA 1 mM (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) en HBSS (Sigma-Aldrich) con agitacion usando un agitador magnetico, descartando el sobrenadante despues de cada lavado. La muestra es posteriormente tratada con colagenasa tipo 1A (1 mg/mL; Sigma-Aldrich) durante 1 h con agitacion a 37 °C. Luego, la suspension celular resultante se filtra usando un filtro celular de 100 pm, se lava dos veces, se resuspende en medio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) que contiene suero de ternero fetal 10%, 100 U/mL de penicilina y 100 pg/mL de estreptomicina, y se utiliza para el cultivo celular.
Las LPMCs recientemente aisladas (2x105 celulas/ pocillo) son estimuladas con 1 pg/mL de a-CD3/a-CD28 durante 48 h en presencia de control de DMSO o concentraciones apropiadas de compuesto. Despues de 48 h, el sobrenadante es retirado y ensayado para determinar la presencia de TNFa e IFNy por R&D ELlSA. Se calcula el porcentaje de inhibicion de la liberacion de citoquinas mediante los compuestos de ensayo con relacion a la liberacion de citoquinas determinada para el control de DMSO (100%).
Inhibicion de la liberacion de citoquinas de miofibroblastos aislados de pacientes con EII
Los miofibroblastos de la mucosa inflamada de Ell se afslan de la siguiente manera:
La mucosa se disecciona y se descarta y se cultivan muestras de mucosa de 1 mm de tamano a 37 °C en una incubadora de CO2 humidificada en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en ingles, Sigma-Aldrich) suplementado con 20% FBS, 1% aminoacidos no esenciales (Invitrogen, Paisley, Reino Unido), 100 U/mL de penicilina, 100 pg/mL de estreptomicina, 50 pg/mL de gentamicina, y 1 pg/mL de anfotericina (Sigma- Aldrich). Las colonias establecidas de miofibroblastos se siembran en frascos de cultivo de 25 cm2 y se cultivan en DMEM suplementado con 20% FBS y antibioticos hasta por lo menos pasaje 4 para proporcionar una cantidad suficiente para utilizar en experimentos de estimulacion.
Luego las monocapas subconfluentes de miofibroblastos se siembran en placas de 12 pocillos a 3x105 celulas por pocillo se privan de alimento en medio libre de suero durante 24 h a 37 °C, 5% CO2 antes de su cultivo durante 24 h en presencia de control de DMSO o concentraciones apropiadas de compuesto. Despues de 24 h el sobrenadante es retirado y analizado para determinar la presencia de lL-8 e IL-6 por R&D ELISA. Se calcula el porcentaje de inhibicion de la liberacion de citoquina mediante los compuestos de ensayo con relacion a la liberacion de citoquina determinada para el control de dMsO (100%).
Desgranulacion de neutrofilos humanos
Los neutrofilos son aislados de sangre periferica humana de la siguiente manera:
Se recolecta sangre por venopuncion y es anticoagulada por la adicion de 1:1 EDTA: solucion salina tamponada con fosfato esteril (PBS, sin Ca+/Mg+). Se agrega dextrano (3% p/v) (1 parte de solucion de dextrano a 4 partes de sangre) y la sangre se deja reposar durante aproximadamente 20 min a TA. El sobrenadante es cuidadosamente colocado sobre un gradiente de densidad (Lymphoprep, Axis-Shield Healthcare) y se centrifuga (15 min, 2000 rpm, sin freno). El sobrenadante se separa por aspiracion y el pellet celular se resuspende en solucion salina esteril (0,2%) durante no mas de 60 segundos (para lisar los globulos rojos contaminantes). Luego se agrega 10 veces el volumen de PBS y las celulas se centrifugan (5 min, 1200 rpm). Las celulas se resuspenden en HBSS+ (solucion salina equilibrada de Hank (sin rojo fenol) que contiene citocalasina B (5 pg/mL) y CaCl2 1 mM) para lograr 5 x 106 celulas/mL.
Se agregan 5 x 104 celulas a cada pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V y se incuban (30 min, 37 °C) con la concentracion apropiada de compuesto de ensayo (0,3-1000 ng/mL) o vehfculo (DMSO, 0,5% de conc. final). La desgranulacion es estimulada por la adicion de fMLP (conc, final 1 pM) y luego de una incubacion adicional (30 min, 37 °C) las celulas son removidas por centrifugacion (5 min, 1500 rpm) y los sobrenadantes son transferidos a una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se agrega un volumen igual de tetrametilbenzidina (TMB) y despues de 10 min la reaccion es terminada mediante la adicion de un volumen igual de acido sulfurico (0,5 M) y se lee la absorbancia a 450 nm (fondo a 655 nm sustrafdo). Se determina el 50% de la concentracion inhibitoria (IC50) a partir de la curva resultante de concentracion - respuesta.
Ensayo de citotoxicidad celular
Se agregan 5 x 104 celulas TK6 (lmea de celulas T linfoblasticas) a la cantidad apropiada de pocillos de una placa de 96 pocillos en 195 pL de medio (RPMI suplementado con suero bovino fetal al 10%). Se agregan 5 pL de control de DMSO (concentracion final 0,5% v/v) o compuesto de ensayo (concentracion final ya sea 5 o 1 pg/mL) a los pocillos
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y se incuban a 37 °C, 5% CO2. Despues de 24 h, la placa se centrifuga a 1300 rpm durante 3 min y el sobrenadante se descarta. Luego, las celulas son resuspendidas en 7,5 pg/mL de yoduro de propidio (PI, por sus siglas en ingles) en PBS. Despues de 15 min, las celulas son analizadas mediante citometna de flujo (BD accuri). Se calcula el % de viabilidad como el % de celulas que son PI negativas en los pocillos de ensayo normalizados al control de DMSO.
Analisis In Vivo: Farmacodinamica y Actividad Antiinflamatoria (empleado en los Ejemplos)
Se emplearon los siguientes analisis in vivo para evaluar el compuesto de la presente invencion y los resultados son proporcionados mas adelante.
Acumulacion de neutrofilos inducida por LPS en ratones
Ratones Balb/c no privados de alimento recibieron dosis, por ruta intratraqueal, de vehnculo, o de la sustancia de ensayo en los tiempos indicados (dentro del rango de 2-8 h) antes de la estimulacion de la respuesta inflamatoria por aplicacion de un desaffo con LPS. En T = 0, los ratones fueron colocados en una camara de exposicion y fueron expuestos a LPS (7,0 mL, 0,5 mg/mL de solucion en PBS durante 30 min). Despues de otras 8 h los animales fueron anestesiados, sus traqueas fueron canuladas y se extrajo BALF por infusion y luego se extrajo de sus pulmones 1,0 mL de PBS v^a el cateter traqueal. Se midieron los recuentos de globulos blancos totales y diferenciales en las muestras de BALF usando un hemocitometro Neubaur. Se prepararon frotis Cytospin de las muestras de BALF por centrifugacion a 200 rpm durante 5 min a TA y se tineron usando un sistema de tincion DiffQuik (Dade Behring). Las celulas fueron contadas usando microscopfa de inmersion en aceite. Los datos para las cantidades de neutrofilos en BAL se muestran como media ± S.E.M. (error estandar de la media). Se calculo el porcentaje de inhibicion de la acumulacion de neutrofilos para cada tratamiento con relacion al tratamiento con vehnculo.
Modelo de Humo de Cigarrillo
Ratones A/J (machos, 5 semanas de edad) fueron expuestos al humo de cigarrillo (4% humo de cigarrillo, diluido con aire) durante 30 min/dfa durante 11 dfas usando un Sistema de Experimentos de Inhalacion de Humo de Tabaco para animales pequenos (Modelo SIS-CS; Sibata Scientific Technology, Tokio, Japon). Se administraron las sustancias del ensayo por via intranasal (35 pL de solucion en 10% de DMSO/PBS) una vez al dfa durante 3 dfas despues de la exposicion final al humo del cigarrillo. A las 12 h despues de la ultima dosis, cada uno de los animales fue anestesiado, la traquea canulada y se recolecto fluido de lavado bronquioalveolar (BALF, por sus siglas en ingles). Se determinaron las cantidades de macrofagos alveolares y neutrofilos por analisis FACS (EPICS® ALTRA II, Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, EE. UU.) usando anticuerpo MOMA2 antiraton (macrofago) o anticuerpo 7/4 antiraton (neutrofilo). BALF se centrifugo y el sobrenadante se recolecto. Se cuantifico el nivel de quimioatrayente de queratinocitos (KC; CXCL1) en BALF usando un kit de ELISA Quantikine® de raton KC (R&D systems, Inc., Minneapolis, MN, EE. UU.).
Analisis In Vivo: Farmacodinamica y Actividad Antiinflamatoria (no empleado en los Ejemplos)
Se podnan haber empleado los siguientes analisis in vivo para evaluar el compuesto de la presente invencion.
Colitis inducida por DSS en ratones
Ratones BDF1 macho, de 10-12 semanas de edad, no sometidos a ayuno reciben dosificacion por via oral mediante sonda dos veces al dfa de vehnculo, artfculo de referencia (5-ASA) o compuesto de ensayo un dfa antes (Dfa 1) de la estimulacion de la respuesta inflamatoria por tratamiento con DSS. En el Dfa 0 del estudio se administra DSS (5% p/v) en el agua para beber seguido por dosificacion dos veces al dfa del vehnculo (5 mL/kg), referencia (100 mg/kg) o compuesto de ensayo (5 mg/kg) durante 7 dfas. El agua para beber con DSS se repone cada 3 dfas. Durante el estudio los animales son pesados todos los dfas y se realizan observaciones de las heces fecales y se registran como un resultado, en base a la consistencia de las heces fecales. Al momento del sacrificio en el Dfa +6 se extrae el intestino grueso y se registra la longitud y el peso. Se toman secciones del colon para el analisis MPO para determinar la infiltracion de neutrofilos o para el resultado de histopatologfa para determinar la severidad de la enfermedad.
Colitis inducida por TNBS en ratones
Ratones BDF1 macho, de 10-12 semanas de edad, no sometidos a ayuno reciben dosificacion por via oral mediante sonda dos veces al dfa de vehnculo (5 mL/kg), artfculo de referencia (Budesonide 2,5 mg/kg) o compuesto de ensayo (1, 5 o 50 mg/kg) un dfa antes (Dfa -1) de la estimulacion de la respuesta inflamatoria por tratamiento con acido 2,4,6-trinitrobencensulfonico (TNBS) (15 mg/mL en 50% de etanol / 50% de solucion salina). En el Dfa 0 del estudio se administra TNBS (200 pL) por via intracolonica por un cateter de plastico seguido por la dosificacion dos veces al dfa del vetnculo, el artfculo de referencia o del compuesto de ensayo durante 2 o 4 dfas. Durante el estudio, los animales son pesados todos los dfas y se realizan observaciones de las heces fecales y se registran como un resultado, en base a la consistencia de las heces fecales. Al momento del sacrificio en el Dfa 2 (o Dfa 4) se extrae el intestino grueso y se registra el largo y el peso. Se toman secciones del colon para el analisis MPO para determinar la infiltracion de neutrofilos o para el resultado que involucra histopatologfa para determinar la severidad de la enfermedad.
Transferencia adoptiva en ratones
En el dfa 0 del estudio, se liquidan ratones Balb/C hembra y se obtienen los bazos para aislamiento celular CD45RBelevado (Usando el protocolo de Separacion celular EII SCID). Aproximadamente 4x105 celulas/mL de celulas CD45RBelevado son luego inyectadas IP (100 pL/raton) en animales SciD hembra. En el dfa 14 del estudio, los 5 ratones se pesan y se distribuyen al azar en grupos de tratamiento en base al peso corporal. En el dfa 21, los compuestos son administrados dos veces al dfa, por via oral mediante sonda, en un velmculo de aceite de mam en los niveles de dosis expuestos a continuacion y un volumen de dosis de 5 mL/kg. El tratamiento continua hasta el dfa 42 del estudio, punto en el cual los animales son sometidos a necropsia 4 h despues de la administracion a.m. Se registra el largo y el peso del colon y se utiliza como un criterio de valoracion secundario en el estudio como una 10 medicion del edema de colon. El colon es luego dividido en seis secciones transversales, cuatro de las cuales se utilizan para el resultado histopatologico (criterio de valoracion primario) y dos se homogenizan para el analisis de citoquina. Los datos mostrados son el % de inhibicion de la ventana de induccion entre animales no expuestos previamente al tratamiento de ensayo (naive) y animales vehfculo, donde una inhibicion superior indica mas cercama al fenotipo, sin tratamiento previo (naive), sin enfermedad.
15 Resultados del Analisis in vitro e in vivo
Los resultados del analisis in vitro para el compuesto de la invencion (forma de base libre) son mostrados en la Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5 a continuacion y en la Figura 9. Se realiza una comparacion con un Compuesto de Referencia estructuralmente relacionado N-(4-(4-(3-(3-terc-butil-1-p-tolil-1H-pirazol-5-il)ureido)na1:talen-1- iloxi)piridin-2-il)-2-metoxiacetamida (Ejemplo 1 de WO2010/112936), el cual ha sido previamente descrito como un 20 potente agente antiinflamatorio con efectos antivirales, asf como tambien con propionato de fluticasona el cual es un agente antiinflamatorio bien conocido.
Tabla 2: Perfil Enzimatico de p38 MAPKa y y, HCK, c-Src, Syk y GSK3a de los Compuestos de Ensayo
Valores IC50 para Inhibicion Enzimatica (nM)
Compuesto de Ensayo
p38 MAPKa p38 MAPKy HCK c-Src Syk GSK3a
Compuesto de referencia
10 87 7 11 42 18
Compuesto de la invencion
26 152 55 199 >15955 >15105
Tabla 3: Inhibicion de Liberacion de TNFa e IL-8 inducida por LPS y Expresion de ICAM Inducida por PolilC para los Compuestos de Ensayo
Liberacion Inducida por LPS (nM)
IL-8
TNFa
PolilC / ICAM1 (nM)
Compuesto de ensayo
IC50 (dU937) REC50 (dU937) IC50 (BEAS2B)
Compuesto de referencia
1,2 0,7 3,8
Compuesto de la invencion
11,4 5,5 61,1
Tabla 4: Efecto de los compuestos de ensayo sobre la Viabilidad Celular
Ensayo MTT1
Ensayo de Mitosis2 * * 5 * * * * 10 * * * * 15
Viabilidad celular en punto de tiempo Inhibicion
(%) de
indicado en celulas d-U937 mitosis
Compuesto de ensayo
4h 24h A 5 ug/mL
Compuesto de referencia
- + 93 ± 5
Compuesto de la invencion
- - 18 ± 7
1. Analisis de viabilidad celular: -ve y +ve indican que el valor esta por debajo o por encima, respectivamente,
del umbral de efecto no significativo definido como 30% de inhibicion a 10 pg/mL en el punto de tiempo indicado.
2. Media ± SEM
5 Tabla 5: Efecto de los compuestos de ensayo sobre la produccion de citoquina en macrofagos de esputo tratados con LPS de pacientes con EPOC
Porcentaje de inhibicion a 0,1 pg/mL
Compuesto de ensayo
IL-6
Propionato de fluticasona
29 ± 21
Compuesto de la invencion
48 ± 9
Sintesis de Resultados del Analisis in vitro e in vivo
El compuesto de la invencion demuestra un perfil en ensayos in vitro e in vivo consistente con una buena actividad antiinflamatoria. Tiene actividad muy debil en Syk y GSK3a quinasas (Tablas 2 y 3).
10 El compuesto de la invencion muestra una actividad marcadamente inferior en sistemas de ensayo que miden su
impacto sobre la viabilidad celular lo cual indica que probablemente posea un mdice terapeutico superior con
respecto al Compuesto de referencia (Tabla 4).
El compuesto de la invencion mostro una actividad antiinflamatoria superior en comparacion con el propionato de
fluticasona en el sistema de ensayo empleado (Tabla 5).
15 El compuesto de la invencion muestra una inhibicion dependiente de la dosis de IL-8 inducida por HRV (Figura 9).
Resumidamente, estos resultados sugieren que el compuesto de la invencion tiene propiedades antiinflamatorias similares al Compuesto de referencia descrito con anterioridad y, ventajosamente, se asocia con un mdice terapeutico superior.

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto de formula (I):
    imagen1
    Me (I)
    o una sal farmaceuticamente aceptable del mismo.
  2. 2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 1 en la forma de su sal maleato.
  3. 3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicacion 2 en la forma de su polimorfo cristalino Forma 2.
  4. 4. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de formula (I) de acuerdo con una cualquiera
    de las reivindicaciones 1-3 opcionalmente en combinacion con uno o mas diluyentes o portadores farmaceuticamente aceptables.
  5. 5. Una composicion farmaceutica que comprende un compuesto de formula (I) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en forma particulada en combinacion con lactosa particulada.
  6. 6. Un producto combinado que comprende:
    (A) un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3; y
    (B) uno o mas agentes terapeuticos diferentes,
    donde cada uno de los componentes (A) y (B) es formulado en mezcla con un adyuvante, diluyente o portador farmaceuticamente aceptable.
  7. 7. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para usar como un medicamento en combinacion con uno o mas ingredientes activos diferentes.
  8. 8. Un producto combinado de acuerdo con la reivindicacion 6 o un compuesto para usar de acuerdo con la reivindicacion 7, donde el o los diferentes agentes terapeuticos o ingredientes activos se seleccionan del grupo que consiste en esteroides, agonistas beta, xantinas, anticolinergicos, antagonistas muscarmicos, inhibidores de PI3 quinasa y agentes antivirales.
  9. 9. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una composicion de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5 o un producto combinado de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 8 para usar como un medicamento.
  10. 10. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una composicion de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, o un producto combinado de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 8 para utilizar en el tratamiento de EPOC (incluyendo bronquitis cronica y enfisema), asma, asma pediatrico, fibrosis qrnstica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopatica, rinitis alergica, rinitis, sinusitis, conjuntivitis alergica, conjuntivitis, queratoconjuntivitis seca (sequedad ocular), glaucoma, retinopatfa diabetica, edema macular (incluyendo edema macular diabetico), oclusion de la vena central de la retina (OVCR), degeneracion macular relacionada con la edad seca y/o humeda (DMAE), inflamacion causada por catarata posoperatoria, uveftis (incluyendo uveftis posterior, anterior y panuveftis), rechazo de injerto de cornea y de trasplante de celulas limbares, enteropatfa sensible al gluten (enfermedad ceftaca), esofagitis eosinofila, enfermedad intestinal de injerto versus huesped, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, EII, artritis reumatoidea u osteoartritis.
  11. 11. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una composicion de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, o un producto combinado de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 8 para utilizar en el tratamiento de EPOC, asma, queratoconjuntivitis seca (sequedad ocular), uveftis (incluyendo uveftis posterior, anterior y panuveftis), enfermedad de Crohn o colitis ulcerativa, especialmente EPOC o
    5 asma.
  12. 12. Un compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, una composicion de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, o un producto combinado de acuerdo con la reivindicacion 6 o la reivindicacion 8 para utilizar en el tratamiento de las exacerbaciones de enfermedades inflamatorias, en particular de las exacerbaciones virales, o en el tratamiento de las infecciones virales, en pacientes con una o mas afecciones
    10 cronicas tales como insuficiencia cardfaca congestiva, EPOC, asma, diabetes, cancer y/o en pacientes inmunosuprimidos, por ejemplo luego de un trasplante de organo.
  13. 13. Un compuesto, una composicion o un producto combinado de acuerdo con la reivindicacion 12 para utilizar en combinacion con terapia antiviral tales como zanamivir, oseltamivir (por ejemplo fosfato de oseltamivir) peramivir o laninamivir.
    15 14. Un compuesto de formula (III)
    imagen2
    o un derivado del mismo en el cual el grupo amino esta protegido, o una sal del mismo; o un compuesto de formula (VII)
    imagen3
  14. 15. Un compuesto de formula (III) de acuerdo con la reivindicacion 14, el cual es un compuesto de formula (VIII)
    imagen4
    donde Pi representa un grupo protector de amina; o una sal del mismo.
    imagen5
    Numeros de ondas (cm-1)
    imagen6
    Intensidad (conteos)
    (o)
    1500
    imagen7
    Intensidad (conteos)
    <D
    E
    imagen8
    Flujo de Calor (W/g)
    4^
    CD
    imagen9
    hd
    CD
    CO
    o
    a*
    CD
    imagen10
    n
    Universal V4.5A TA Instruments
    Temperatura (°C)
    fl)
    Ol
    □
    Grafico de Isotermia de DVS
    <Q
    C
    0)
    o>
    -•— Ciclo 1 Absorc.
    M— Ciclo 1 desabsorc.
    — *— Ciclo 2 absorc.
    — ■- — Ciclo 2 Desabsorc.
    ui
    o
    imagen11
    HR objetivo (%)
    DVS - La Solucion de Absorcion
    © Surface Measurement Systems Ltd UK 1996-2008
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