ES2677698T3 - Péptidos derivados de la familia WNT y usos de estos - Google Patents

Péptidos derivados de la familia WNT y usos de estos Download PDF

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Abstract

Uso de un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:3 para promover el crecimiento capilar y mejorar la producción capilar, con la condición de que el uso no sea un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.

Description

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Peptidos derivados de la familia WNT y usos de estos ANTECEDENTES DE LA INVENClON CAMPO DE LA INVENClON
La presente invencion se refiere a un uso de un peptido derivado de la familia WNT.
descripciOn de la tecnica relacionada
El folfculo piloso es un organo cutaneo particular de los mamfferos, que se desarrolla desde el fondo de la epidermis primitiva hacia una capa cutanea muy interna. El cumulo de celulas conocidas como folfculo o papila dermica se encuentra en la base del folfculo piloso (Stenn y Paus, Physiol. Rev., 81: 449 (2002)), y la papila es esencial en la circulacion normal del folfculo piloso (Oliver, Embryo/. Exp. Morph. 15: 331 (1966), Oliver, Embryol. Exp. Moph. 16: 231 (1967)) y en el crecimiento del tallo capilar. El tallo capilar es un conjunto de celulas epiteliales con forma de hilo que se componen de filamentos de queratina y protefnas que se agregan a los filamentos estrechamente adheridas a ellos.
El cabello humano sigue un ciclo de crecimiento con tres fases diferenciadas: las fases anagena, catagena y telogena. El ciclo de crecimiento capilar esta regulado por hormonas o muchos factores de crecimiento. La malnutricion o estres graves pueden hacer avanzar las fases catagena y telogena, lo que da lugar a una perdida de cabello grave (alopecia) (Vladimir A. Botchkarev, American Journal of Pathology, 162 (3): 709-712 (2003)). En la calvicie de patron masculino, los folfculos pilosos en la parte delantera y superior del cuero cabelludo son sensibles al androgeno, el cual provoca la miniaturizacion de los folfculos, lo que da como resultado la perdida de cabello. En resumen, una secrecion excesiva de androgeno activa la 5-a reductasa, que hace que la testosterona se convierta en dihidrotestosterona (DHT). Posteriormente, la DHT reduce el numero de cabellos terminales oscuros gruesos acortando un periodo de crecimiento capilar y miniaturizando los folfculos pilosos, lo que da lugar a la perdida del cabello. Se ha supuesto que aproximadamente un 20% de las mujeres con perdida de cabello padecen unos pocos trastornos denominados “calvicie de patron femenino”, en los que a menudo el cabello se vuelve mas fino en la parte superior del cuero cabelludo. Ademas, la perdida de cabello se vuelve mas amplia con el envejecimiento. Por ejemplo, la perdida de cabello grave puede estar causada por diferentes trastornos tales como alopecia cicatrizal o estados cicatrizales que incluyen las quemaduras o la lesion por compresion. Sea cual sea la causa, aunque la presencia de las mujeres en la poblacion activa se ha aumentado y los hombres se han preocupado por su aspecto, la perdida de cabello puede tener impactos psicologicos, sociales y sexuales notables, asf como una perdida de amor propio y orgullo. Si bien se han utilizado varios medicamentos para tratar la perdida de cabello, estos son demasiado caros o producen efectos adversos muy diferentes entre individuos. Ademas, es necesario tomar estos farmacos de forma constante. En este sentido, uno de los inconvenientes importantes es que el cese de su uso puede provocar perdida de cabello. A la vez, otra desventaja es que sus eficacias y efectos secundarios pueden ser bastante diferentes entre individuos.
Por lo tanto, en este campo industrial es necesario el desarrollo de principios activos novedosos mas eficaces y baratos.
Las materias primas utilizadas en los productos cosmeticos tienen la ventaja de que son baratas, si bien no proporcionan buenos resultados, ya que estan compuestas por componentes derivados de extractos vegetales. Se ha tenido constancia hasta la fecha de que dos farmacos comerciales (minoxidil y finasterida) pueden retrasar solamente la perdida de cabello adicional. Sin embargo, no se dispone de medicamentos concretos que puedan ser utiles para inducir la regeneracion de nuevos folfculos pilosos en la practica. Muchos productos cosmeticos del cuero cabelludo para prevenir la perdida de cabello se han comercializado en el mercado, por ejemplo, incluidos: (a) un producto que incluye un extracto vegetal derivado de Sophora, pimiento picante, hierba Swertia, Morus alba, hoja de morera, ginseng, regaliz, peonfa, Digitalis, hinojo, Cornus officinalis, ajo y asf sucesivamente; (b) una composicion que contiene xantinas y hormonas de crecimiento para no solo mejorar el metabolismo celular suprimido por el exceso de dihidrotestosterona (DHT), sino tambien para facilitar el crecimiento capilar mediante la inhibicion de la perdida de cabello y la regeneracion capilar inducida por hormonas del crecimiento; (c) un producto que contiene minerales, vitaminas y extractos de te verde, romero, artemisa o regaliz, que proporciona nutrientes al cuero cabelludo y al cabello para prevenir la perdida de cabello y promover el crecimiento capilar y (d) se ha desarrollado un producto para la calvicie de patron masculino que mezcla las sustancias tales como vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E, acido nicotfnico, acido pantotenico, biotina, acido folico, etc., con extractos vegetales, que inhibe 5-a-reductasas para suprimir la produccion de DHT durante el metabolismo androgenico y para contribuir al metabolismo capilar. Sin embargo, apenas han tenido influencia en la produccion de cabello nuevo. Como otro ejemplo, un grupo de investigacion de la Facultad de Medicina de la Universidad Jikei de Tokio, Japon, ha desarrollado el producto utilizando acido corosolico, del que se tiene constancia que es eficaz en la diabetes, que inhibe las 5-a-reductasas y muestra un efecto excelente en el crecimiento capilar.
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Muchos factores se asocian entre si en el crecimiento y la degeneracion del cabello. Para la produccion del cabello, los investigadores de la presente han estudiado factores de crecimiento seriales que tienen una actividad para: (a) promover la proliferacion de queratinocitos, que es de suma importancia para la produccion de la rafz capilar; (b) inducir diferenciacion capilar; (c) suministrar nutrientes a las proximidades del cabello y (d) activar factores de crecimiento endotelial vascular.
De estos, el WNT de origen humano afecta de forma especffica al desarrollo del cabello transfiriendo una senal a una celula. La via de transduccion de senales de WNT se activa mediante una interaccion entre la protefna WNT secretada y la protefna Frizzled, que es un receptor de esta. En este sentido, las protefnas relacionadas con receptores LDL (LRP5 y LRP6) funcionan como un correceptor (Clin Cancer Res 2007; 13(14), 15 de Julio de 2007, WNT Signaling Pathway and Stem Cell Signaling Network). Los efectos posteriores en la via de transduccion de senales de WNT incluyen la participacion del complejo axina-p-catenina-GSK3 p mediante la activacion de la protefna DVL (Disheveled) y Akt (Fukumoto et al., J. Biol. Chem. 276: 17479-17483 (2001)). Posteriormente, GSK3 p se inactiva mediante fosforilacion, lo que da como resultado la inhibicion de la fosforilacion y la degradacion de p- catenina. Las p-cateninas acumuladas se traslocan a un nucleo y posteriormente interaccionan con factores de transcripcion del factor potenciador linfoide-factor de linfocitos T (LEF-TCF), lo que permite inducir la transcripcion de genes diana. Las protefnas resultantes pueden desempenar una funcion crftica para el crecimiento y la diferenciacion capilar, y permiten que se produzcan celulas capilares nuevas. Ademas, disminuyen las actividades de DHT producida por la hormona masculina (androgeno) para suprimir la perdida de cabello.
El documento WO2011/088127 divulga agentes de union a WNT y su uso en, por ejemplo, el crecimiento de celulas tumorales cancerosas.
El documento KR20110023991A divulga peptidos derivados de WNT10, una composicion para mejorar la perdida de cabello y las condiciones cutaneas.
El documento WO2008/093646 divulga peptidos que tienen al menos una actividad de activacion de la senalizacion de WNT util para la regulacion de la proliferacion o diferenciacion de una celula madre tal como una celula madre neural y una celula madre hematopoyetica o el tratamiento del cancer, una patologfa neurologica u otras patologfas tales como la diabetes.
DESCRIPCION DETALLADA DE ESTA INVENCION
Con el fin de desarrollar peptidos que tengan acciones identicas a la protefna WNT humana de origen natural, asf como que tengan una actividad, estabilidad y penetracion cutanea mas potenciadas que la protefna WNT de origen natural, los inventores de la presente han llevado a cabo investigaciones intensivas. Como resultado, los inventores de la presente han descubierto varios peptidos relacionados con WNT que tienen las caracterfsticas excelentes descritas anteriormente sobre la base de la secuencia de aminoacidos de la protefna WNT de origen natural, con lo cual han conseguido en ultima instancia la presente invencion.
Por consiguiente, es un objeto de esta invencion proporcionar un peptido que conste esencialmente de una secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3.
Es otro objeto de esta invencion proporcionar el uso de una composicion para promover el crecimiento capilar o mejorar la produccion capilar que contenga el peptido mencionado anteriormente de esta invencion como un principio activo.
Es otro objeto mas de esta invencion proporcionar el uso de una composicion para mejorar la perdida de cabello que contenga el peptido mencionado anteriormente de esta invencion como un principio activo.
Es otro objeto mas de esta invencion proporcionar el uso de una composicion para mejorar las condiciones cutaneas que contenga el peptido mencionado anteriormente de esta invencion como un principio activo.
Otros objetos y ventajas de la presente invencion se haran evidentes a partir de la siguiente descripcion detallada junto con las reivindicaciones y dibujos adjuntos.
En un aspecto de esta invencion, se proporciona un peptido que consta esencialmente de una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo compuesto por secuencias de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3.
Con el fin de desarrollar peptidos que tengan acciones identicas a la protefna WNT humana de origen natural, asf como que tengan una actividad, estabilidad y penetracion cutanea mas potenciadas que la protefna WNT de origen natural, los inventores de la presente han llevado a cabo investigaciones intensivas. Como resultado, los inventores de la presente han descubierto varios peptidos relacionados con WNT que tienen las caracterfsticas excelentes descritas anteriormente sobre la base de la secuencia de aminoacidos de la protefna WNT de origen natural, con lo cual han conseguido en ultima instancia la presente invencion.
El termino utilizado en la presente “peptido” se refiere a una molecula lineal formad a por la union entre residuos
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aminoacfdicos mediante enlaces peptfdicos.
Los peptidos de la presente invencion se pueden preparar mediante procesos de sfntesis qufmica convencional conocidos para un experto en la tecnica, en particular, tecnicas de sfntesis en fase solida (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54 (1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2.a ed., Pierce Chem. Co:. Rockford, 111 (1984)).
Los peptidos de la presente invencion se pueden preparar prediciendo en primer lugar una parte que pueda unirse a una protefna receptora mediante sfntesis parcial aleatoria de varias partes en la protefna WNT y posteriormente optimizando una secuencia aminoacfdica de la parte predicha. Posteriormente, los peptidos candidatos que tengan la actividad mas excelente se criban para aislar los peptidos de esta invencion.
El peptido de la SEQ ID NO: 3 (peptido-3) no solo tiene actividades similares a la protefna WNT de origen natural, sino que tambien muestra actividades de factor de crecimiento mediante la union a un receptor.
Los peptidos de esta invencion de por sf tienen una estabilidad superior a la protefna WNT de origen natural.
De acuerdo con una realizacion preferible, los peptidos de esta invencion tienen en su extremo N-terminal un grupo protector seleccionado a partir del grupo compuesto por un grupo acetilo, un grupo fluorenilmetoxicarbonilo, un grupo formilo, un grupo palmitoflo, un grupo miristilo, un grupo estearilo y polietilenglicol (PEG).
Las modificaciones de los peptidos descritos anteriormente aumentan enormemente la estabilidad de los peptidos de esta invencion. El termino utilizado en la presente “estabilidad” se refiere a la estabilidad in vivo y tambien a la estabilidad de almacenamiento (por ejemplo, estabilidad de almacenamiento a temperatura ambiente). El grupo protector descrito anteriormente protege los peptidos del ataque de proteasas in vivo.
En otro aspecto de esta invencion, se proporciona el uso de una composicion para promover el crecimiento capilar o mejorar la produccion capilar que contenga el peptido de esta invencion como un principio activo.
En otro aspecto mas de esta invencion, se proporciona un metodo para promover el crecimiento capilar o mejorar la produccion capilar que comprende administrar a un sujeto el peptido de esta invencion.
Como la presente composicion comprende los peptidos relacionados con factores de crecimiento de esta invencion como principios activos descritos anteriormente, las descripciones comunes entre ellos se omiten para evitar una redundancia excesiva que diese lugar a la complejidad de esta memoria descriptiva.
Tal como se demuestra en los Ejemplos mas adelante, los peptidos relacionados con factores de crecimiento de la presente invencion tienen actividad estimuladora de la proliferacion celular en queratinocitos, fibroblastos o folfculos pilosos y siguen la senalizacion de p-catenina como una via de senalizacion representativa de la protefna WNT. Se pudo comprobar que el peptido de la presente invencion permite que la via de senalizacion de WNT este activa a pesar de la presencia de DKK-1 como inhibidor de WNT. Ademas, la expresion de fibronectina como un gen diana de WNT fue aumentada por el peptido de la presente. Ademas, se pudo demostrar que el peptido de la presente invencion contribuye a una expresion de fibronectina aumentada incluso en presencia de DKK-1. De acuerdo con experimentos en animales basados en los resultados mencionados anteriormente, se pudo apreciar que el peptido de la presente invencion promueve el crecimiento capilar de forma significativa.
En otro aspecto de esta invencion, se proporciona el uso de una composicion para mejorar la perdida de cabello que contiene el peptido de esta invencion como un principio activo.
En otro aspecto mas de esta invencion, se proporciona un metodo para mejorar la perdida de cabello que comprende administrar a un sujeto el peptido de esta invencion.
El peptido de esta invencion induce la proliferacion y diferenciacion de celulas madre en folfculos pilosos de la piel y permite ademas que migren hacia la rafz capilar y se conviertan en folfculos nuevos. Ademas, el peptido de esta invencion puede aumentar la expresion de un gen que estimula la produccion capilar mediante la activacion de la senalizacion de p-catenina incluso en la condicion en la que la senalizacion de WNT este inhibida por la presencia del gen DKK-1 (Dickkopf-1) estimulador de la perdida de cabello, cuya expresion ha sido inducida por DHT (dihidrotestosterona). Ademas, el peptido de esta invencion tiene una funcion de promover la fase de crecimiento del ciclo capilar, en la cual se genera cabello y crece, e impide que el ciclo de crecimiento capilar entre en la fase telogena, que es inducida por varios factores medioambientales desfavorables. Mediante las acciones mencionadas anteriormente, el peptido de esta invencion tiene la funcion de prevenir la perdida de cabello, estimular el crecimiento capilar y proporcionar un cabello sano mas nutrido. Por consiguiente, la composicion de la presente invencion es muy eficaz en el crecimiento capilar y la mejora de las condiciones cutaneas.
En otro aspecto de esta invencion, se proporciona el uso de una composicion para mejorar las condiciones cutaneas que contiene el peptido de esta invencion como un principio activo.
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En otro aspecto mas de esta invencion, se proporciona un metodo para mejorar las condiciones cutaneas que comprende administrar a un sujeto el peptido de esta invencion.
De acuerdo con una realizacion preferida, la mejora en las condiciones cutaneas por parte del peptido de la presente es una mejora en las arrugas o la elasticidad cutanea, prevencion del envejecimiento cutaneo, mejora en la hidratacion cutanea, eliminacion de heridas o regeneracion cutaneas.
De acuerdo con una realizacion preferible, la composicion es una composicion cosmetica que contiene: (a) una cantidad cosmeticamente eficaz del peptido relacionado con factores de crecimiento de la presente invencion y (b) un portador cosmeticamente aceptable.
La expresion utilizada en la presente “cantidad cosmeticamente eficaz” se refiere a una cantidad suficiente para conseguir eficacias en mejoras en las condiciones cutaneas descritas anteriormente en la presente.
Las composiciones cosmeticas de esta invencion se pueden formular en una amplia variedad de formas, por ejemplo, que incluyen una solucion, una suspension, una emulsion, una pasta, un unguento, un gel, una crema, una locion, un polvo, un jabon, un limpiador que contiene tensioactivos, un aceite, una base de maquillaje en polvo, una base de maquillaje en emulsion, una base de maquillaje en cera y un aerosol. De forma especffica, las composiciones cosmeticas de esta invencion se pueden formular en forma de suavizante para la piel, lfquido nutritivo, crema nutritiva, crema de masaje, esencia, crema oftalmica, crema limpiadora, espuma limpiadora, agua limpiadora, compresa, aerosol o polvo.
Cuando la composicion cosmetica se encuentra en forma de pasta, crema o gel, puede incluir grasas animales y vegetales, ceras, parafinas, almidon, tragacanto, derivados de celulosa, polietilenglicoles, siliconas, bentonitas, sflice, talco, oxido de zinc o mezclas de estas sustancias.
En la formulacion de polvo o aerosol, puede incluir lactosa, talco, sflice, hidroxido de aluminio, silicato de calcio, polvo poliamfdico y mezclas de estas sustancias. El aerosol puede comprender adicionalmente los propelentes habituales, por ejemplo, clorofluorohidrocarburos, propano/butano o eter dimetflico.
La formulacion de la solucion y la emulsion puede incluir disolvente, solubilizante y emulsificante, por ejemplo, agua, etanol, isopropanol, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencflico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3- butilglicol, aceites, esteres grasos de glicerol, polietilenglicol y esteres de acidos grasos de sorbitan.
La formulacion de suspension puede contener diluyentes lfquidos, por ejemplo, agua, etanol o propilenglicol, agentes de suspension, por ejemplo, alcoholes isostearicos etoxilados, esteres de sorbitol y polioxietileno y esteres de polioxietileno y sorbitan, celulosa microcristalina, metahidroxido de aluminio, bentonita, agar y tragacanto o mezclas de estas sustancias.
La formulacion de composiciones limpiadoras con tensioactivo puede contener sulfato de alcoholes alifaticos, eter sulfato de alcoholes alifaticos, monoester de sulfosuccinato, isotinato, derivados de imidazol, metiltaurato, sarcocinato, eter sulfato de acidos grasos y amida, alquilamidobetafna, alcohol alifatico, glicerido de acidos grasos, dietanolamida de acidos grasos, aceite vegetal, derivados de lanolina, ester de acidos grasos y glicerol etoxilado o mezclas de estos ingredientes.
Ademas, las composiciones cosmeticas de esta invencion pueden contener auxiliares, asf como peptidos como principios activos y portadores. Los ejemplos no limitantes de auxiliares incluyen conservantes, antioxidantes, estabilizantes, solubilizantes, vitaminas, colorantes, agentes para mejorar el olor o mezclas de estas sustancias.
Las caracterfsticas y ventajas de la presente invencion se resumiran como sigue:
(i) el peptido derivado de WNT de la presente invencion posee actividades identicas o similares al WNT de
origen natural;
(ii) los peptidos de la presente invencion tienen una estabilidad y potencia de penetracion cutanea muy
superiores al WNT de origen natural;
(iii) por lo tanto, la composicion que contiene el peptido de la presente no solo muestra efectos excelentes
sobre la mejora en la perdida de cabello (por ejemplo, promocion de crecimiento capilar o produccion capilar), sino que tambien tiene eficacias superiores en el tratamiento de un trastorno relacionado con la via de transduccion de senales de WNT; y
(iv) la destacada actividad y estabilidad del peptido de la presente descrito anteriormente puede ser
enormemente ventajosa en la aplicacion a composiciones farmaceuticas, cuasifarmacos y cosmeticos.
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La Fig. 1 representa los resultados del analisis por HPLC (cromatograffa liquida de alta resolucion) de los peptidos de SEQ ID NO:1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4) preparados en el Ejemplo de Preparacion.
La Fig. 2a es un grafico que representa un efecto estimulador en el crecimiento de queratinocitos tratados con los peptidos de SEQ ID NO:1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido- 4) preparados en el Ejemplo de Preparacion.
La Fig. 2b es un grafico que representa un efecto estimulador en el crecimiento de fibroblastos tratados con los peptidos de SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido- 4) preparados en el Ejemplo de Preparacion.
La Fig. 2b es un grafico que representa un efecto estimulador en el crecimiento de celulas de folfculos pilosos tratadas con los peptidos de SEQ ID NO:1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SeQ ID NO:4 (peptido-4) preparados en el Ejemplo de Preparacion.
La Fig. 3a es una imagen de microscopio que demuestra los efectos de los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO:1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SeQ ID NO:4 (peptido-4)] para promover el crecimiento de los queratinocitos.
La Fig. 3b es una imagen de microscopio que demuestra los efectos de los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SeQ ID NO:4 (peptido-4)] para promover el crecimiento de los fibroblastos.
La Fig. 3c es una imagen de microscopio que demuestra los efectos de los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SeQ ID NO:4 (peptido-4)] para promover el crecimiento de celulas en los folfculos pilosos.
La Fig. 4 son datos que demuestran el aumento de la fosforilacion de LRP5 mediante el tratamiento con los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4)].
La Fig. 5a son datos que demuestran el aumento de la actividad de p-catenina mediante el tratamiento con los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4)].
La Fig. 5b es un analisis de inmunotransferencia de Western que representa la expresion de p-catenina a pesar de la presencia de DKK-1 (un inhibidor de WNT y gen de la perdida de cabello) mediante el tratamiento con los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y sEq ID NO:4 (peptido-4)].
La Fig. 6 son datos que representan la actividad del factor de transcripcion LEF-1 mediante el tratamiento con los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4)].
La Fig. 7a es un grafico que representa que la expresion de fibronectina se eleva gradualmente mediante el tratamiento con los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SeQ ID NO:4 (peptido-4)] con el paso del tiempo.
La Fig. 7b representa un grafico que mide los cambios de expresion de fibronectina mediante el presente peptido. Se mostro que la expresion de fibronectina inhibida por DKK-1 (un inhibidor de WNT y gen de la perdida de cabello) se restitufa y aumentaba mediante la adicion de los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4)].
La Fig. 7c es una imagen de inmunotincion que representa la presencia del peptido en las celulas cuando se tratan con los peptidos de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4)].
La Fig. 8 representa que el peptido de la presente invencion [SEQ ID NO: 1 (peptido-1), SEQ ID NO:2 (peptido-2), SEQ ID NO:3 (peptido-3) y SEQ ID NO:4 (peptido-4)] tiene una actividad para promover el crecimiento capilar en la piel del lomo de raton.
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EJEMPLOS
EJEMPLO DE PREPARACION 1: Sfntesis de Leu-Cys-Cys-Gly-Arg-Gly-His-Arg-Thr-Arg-Thr-Gln-Arg (SEQ ID NO:1) y otros peptidos
Se introdujeron 700 mg de resina de cloruro de clorotritilo (resina CTL, Nova Biochem n.° de cat. ) en un reactor, al que se anadieron 10 mL de cloruro de metileno (MC) y despues se agito durante 3 min. Despues de retirar la disolucion, se anadieron 10 mL de dimetilformamida (DMF) al resultante y a continuacion se agito durante 3 min, tras lo cual se retiro el disolvente. Se anadieron 10 mL de diclorometano al reactor y despues se anadieron 200 mmol de Fmoc-Arg(pbf)-OH (Bachem, Suiza) y 400 mmol de DIEA (W,W-diisopropiletilamina) al reactor, tras lo cual la mezcla se disolvio mediante agitacion y la reaccion se llevo a cabo con agitacion durante 1 h. Despues de lavar, el metanol y la DIEA (2:1) disueltos en DCM (diclorometano) se hicieron reaccionar con la resina durante 10 min, y a continuacion el resultante se lavo utilizando un exceso de DCM/DMF (1:1). Despues de retirar la disolucion, se anadieron 10 mL de DMF al resultante y se agito durante 3 minutos y despues se retiro el disolvente. Se anadieron 10 mL de una solucion de desproteccion (20% de piperidina/DMF) al reactor y se agitaron durante 10 min a temperatura ambiente y despues se retiro la solucion. Tras anadir el mismo volumen de la solucion de desproteccion, se llevo a cabo la reaccion durante 10 min y se retiro la solucion y despues se lavo secuencialmente con DMF (3 veces), MC (1 vez) y DMF (1 vez) para proporcionar resinas CTL-Arg(pbf). Se anadieron 10 mL de solucion de DMF a un reactor nuevo y posteriormente se anadieron 200 mmol de Fmoc-Gln(trt)-OH (Bachem, Suiza), 200 mmol de HoBt y 200 mmol de Bop, seguidos de agitacion para su solubilizacion. Se anadieron 400 mmol de DIEA al reactor dos veces como una fraccion y se agito durante al menos 5 min para disolver todos los contenidos solidos. La solucion de aminoacidos disueltos se introdujo en el reactor que contenfa la resina desprotegida y se llevo a cabo la reaccion con agitacion durante 1 h a temperatura ambiente. Tras retirar la solucion de reaccion, el resultante se agito tres veces (cada una durante 5 min) con solucion de DMF para eliminar componentes residuales que no hubieran reaccionado. Se tomo una pequena cantidad de la resina que habfa reaccionado para evaluar el grado de las reacciones con la prueba de la ninhidrina. Utilizando la solucion de desproteccion, la desproteccion se llevo a cabo dos veces de la misma manera tal como se ha descrito anteriormente para proporcionar la resina CTL- Arg(pbf)-Gln(trt). Tras lavar con DMF y MC, se llevo a cabo una prueba de la ninhidrina adicional y los acoplamientos secuenciales de los aminoacidos a continuacion se llevaron a cabo tal como se ha descrito anteriormente. Basandose en la secuencia de aminoacidos disenada por los inventores de la presente, Fmoc-Thr(tBu), Fmoc- Arg(pbf), Fmoc-Thr(tBu), Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-His(trt), Fmoc-Gly, Fmoc-Arg(pbf), Fmoc-Gly, Fmoc-Cys, Fmoc-Cys, y Fmoc-Leu se acoplaron secuencialmente a las resinas. El grupo protector Fmoc se elimino mediante una incubacion exhaustiva con la solucion de desproteccion dos veces durante 10 min. Para la acetilacion, se incubaron anhfdrido acetico, DIEA y HoBt con Las resinas peptidflicas durante 1 h. Las resinas peptidflicas preparadas se lavaron tres veces con dMf, MC y metanol, respectivamente, y se secaron gradualmente en atmosfera de nitrogeno, tras lo cual se secaron al vacfo completamente con P2O5. Las resinas secadas se hicieron reaccionar con 30 mL de una solucion de salida [que contenfa un 95% de acido trifluoroacetico (TFA), un 2.5% de agua destilada, un 2.5% de tioanisol] durante 2 h a temperatura ambiente con agitacion intermitente. La resina se filtro y lavo con un volumen pequeno de solucion de TFA, tras lo cual el filtrado se combino con las aguas madre. Tras una destilacion a presion reducida para reducir el volumen total a la mitad, se indujo la precipitacion utilizando 50 mL de eter frfo y se recogieron los precipitados formados por centrifugacion, seguida de lavado dos veces con eter frfo. Tras retirar las aguas madre, el resultante se seco completamente en atmosfera de nitrogeno para proporcionar 0.65 g de peptido no purificado 1, Leu-Cys-Cys-Gly-Arg-Gly-His-Arg-Thr-Arg-Thr-Gln-Arg (tasa de rendimiento; 92.6%). Se determino que el peso molecular del producto final era 1543.8 (Pm teorico: 1543.81) utilizando un analizador de masas. Los demas peptidos de SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3 y SEQ ID NO:4 tambien se sintetizaron mediante el proceso descrito anteriormente (Fig. 1).
TABLA 1
SEQ ID NO
Secuencia de aminoacidos Valores analizados (analizador de masas)
Valores analizados
Valores teoricos
1 (Peptido-1)
LCCGRGHRTRTQR 1240.4 1239.5
2 (Peptido-2)
LCCGRGHNAR 1447.6 1446.5
3 (Peptido-3)
AERRRELCRC 1240.4 1239.5
4 (Peptido-4)
LCCGRGHNVL 1447.6 1446.5
EJEMPLO EXPERIMENTAL 1: Influencia de los peptidos en el crecimiento celular
Con el fin de evaluar los tres peptidos preparados en los Ejemplos de Preparacion 1-2 en cuanto a si tienen actividades similares de factores de crecimiento, se llevo a cabo un ensayo colorimetrico de SRB (sulforodamina B;
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Sigma-Aldrich) utilizando queratinocitos HaCaT (banco de lineas celulares coreano) y fibroblastos NIH3T3 (banco de lineas celulares coreano) de acuerdo con el metodo de Rizzino et al. (Rizzino, et al. Cancer Res., 48: 4266 (1988)).
Se cultivaron queratinocitos HaCaT, fibroblastos NIH3T3 y celulas de folfculo piloso HHFDPC (Cell science) en matraces de 250 mL que contenfan DMEM (medio esencial mfnimo de Eagle modificado de Dulbecco; Gibco, EE. UU.) suplementado con un 10% de FBS (suero bovino fetal; Sigma). Las celulas cultivadas se trataron con un 1% de solucion de tripsina para desprender las celulas del fondo de los matraces de cultivo y se centrifugaron para recoger los sedimentos celulares. Despues de que las celulas se resuspendieran en DMEM que no contenfa FBS, su alfcuota (3 x 103 celulas) se anadio a cada pocillo de placas de 96 pocillos y se cultivo con un 5% de CO2 durante 24 h a 37 °C. Tras un cultivo de 24 h, el medio se cambio por medio fresco sin suero y las celulas se incubaron con muestra vacfa (para su normalizacion) y los peptidos sintetizados (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1pg/ml y 10 pg/ml) se disolvieron de forma aseptica en un 10% de DMSO durante 72 h en las mismas condiciones descritas anteriormente. Tras retirar los sobrenadantes, las celulas se fijaron con etanol y a continuacion se lavaron tres veces utilizando PBS (solucion salina tamponada con fosfato), y despues se incubaron con solucion de SRB. Las celulas se lavaron lo suficiente con acido acetico al 1% y se observaron con un microscopio para determinar la condicion de celulas vivas. Ademas, se midio la absorbancia a 590 nm para analizar la viabilidad celular. Mientras tanto, tras un cultivo en las mismas condiciones, el tejido se inmunotino mediante un ensayo inmunohistoqufmico con anticuerpo para ki-67 (SantaCruz, EE. UU.) y se observo la cantidad de protefna ki-67 como un marcador de la proliferacion celular.
La Fig. 2 demuestra que el peptido de la presente invencion aumenta notablemente el crecimiento de queratinocitos (Fig. 2a), fibroblastos (Fig. 2b) y celulas de folfculos pilosos (Fig. 2c). La Fig. 3 es un resultado que representa que se observa un cambio en la forma celular al microscopio despues de que las celulas se traten con el peptido de la presente durante 72 h.
Tal como se muestra en las Figs. 2 y 3, se podrfa apreciar que los peptidos de la presente invencion promueven la proliferacion de queratinocitos, fibroblastos y celulas de folfculos pilosos, y modifican sus formas morfologicas.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 2: Influencia de los peptidos en la cantidad elevada de receptor y gen de senalizacion
Se incubaron queratinocitos HaCaT cultivados durante 48 h con los peptidos sintetizados en el Ejemplo de preparacion 1 durante 5 h. Se examinaron respectivamente el nivel de fosforilacion de LRP5, que es el receptor de la protema WNT y el nivel de expresion de la p-catenina, que es la molecula de senalizacion de la protefna WNT. Las cantidades de fosfo-LRP5 y p-catenina se midieron mediante analisis por inmunotransferencia de Western utilizando un anticuerpo contra fosfo-LRP5 (Cell signaling) y p-catenina (SantaCruz, EE. UU.). Ademas, tambien se observo el nivel de expresion del factor de transcripcion LEF-1, que es aumentado por la p-catenina. El peptido de la presente invencion elevo significativamente el nivel de fosforilacion de LRP5 (Fig. 4) y tambien aumento significativamente el nivel de expresion de p-catenina (Fig. 5a). En primer lugar, se mostro que se observa activdad de p-catenina mediante el tratamiento con el peptido de la presente invencion a pesar de la presencia de DKK-1 como inhibidor de WNT e inhibidor de la senalizacion de p-catenina (Fig. 5b). Tambien se observo que el nivel de expresion del factor de transcripcion LEF-1 fue aumentado por el tratamiento de los presentes peptidos (Fig. 6).
Considerando en conjunto los resultados de los Ejemplos experimentales 1 y 2, se pudo apreciar que los peptidos de la presente invencion ejercen efectos excelentes en la promocion del crecimiento capilar y la inhibicion de la perdida de cabello y tambien tienen una actividad antienvejecimiento.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 3: Influencia de los peptidos en la produccion de fibronectina
Con el fin de comprobar si los peptidos sintetizados en el Ejemplo de preparacion 1 aumentan la expresion de fibronectina como protefna diana de WNT, se anadieron fibroblastos NIH3T3 (4 x 103 celulas) a cada pocillo de placas de 96 pocillos y se cultivaron con un 5% de CO2 durante 24 h a 37 °C. Despues de un cultivo de 24 h, el medio se cambio por un medio nuevo sin suero y las celulas se trataron con muestra vacfa (para su normalizacion), los tres peptidos sintetizados (1 pg/mL) y complejo peptfdico (1 pg/mL) se disolvieron asepticamente en un 10% de DMSO durante 3 h, 10 h, 24 h o 48 h en las mismas condiciones que se han descrito anteriormente. Tras 72 h de incubacion, el cultivo celular se recogio y se midio el nivel de expresion de fibronectina utilizando un kit ELISA para fibronectina (R&D systems, EE. UU.).
Tal como se ha demostrado en la Fig. 7a, se revelo que los peptidos de la presente invencion elevaban el nivel de fibronectina en los fibroblastos con el paso del tiempo. Ademas, despues de que la protefna DKK-1 se tratara y cultivara en las mismas condiciones, se examino el nivel de expresion de fibronectina. Tal como se muestra en la Fig. 7b, el nivel de expresion de la fibronectina se restituyo y aumento incluso en el tratamiento con tanto la protefna DKK-1 como el presente peptido.
La Fig. 7c es una imagen de inmunotincion que representa la presencia del peptido en las celulas cuando los fibroblastos se trataron con los peptidos de esta invencion y la existencia de los presentes peptidos en las celulas se
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demostro mediante la tincion de los peptidos.
Considerados en conjunto, estos resultados demuestran que los peptidos de la presente invencion inducen la via de senalizacion de p-catenina-WNT a pesar de la presencia de protefna DKK-1 conocida para un inhibidor de WNT y gen de la perdida de cabello, lo que contribuye a la promocion del crecimiento capilar, la inhibicion de la perdida de cabello y el antienvejecimiento.
EJEMPLO EXPERIMENTAL 4: Analisis de los efectos de los peptidos en el crecimiento capilar del raton
Los peptidos sintetizados en el Ejemplo de preparacion 1 se formularon en un nanosoma. Posteriormente, se elimino parcialmente el lomo de un raton C57BL/6 y a continuacion se administro a la piel el nanosoma por via topica dos veces cada dfa durante 15 dfas. A los 10 dfas de tratamiento, se observo crecimiento capilar en la piel del lomo del raton y la cantidad de pelo en la piel del lomo del raton aumento de forma muy significativa a los 15 dfas de tratamiento, en comparacion con un grupo de control (Fig. 8).
EJEMPLO 1: Preparacion de nanopeptidos
Se disolvieron 50 mg de cada peptido sintetizado en los Ejemplos de preparacion en 500 mL de agua destilada mediante una agitacion suficiente. La solucion peptfdica se mezclo con 5 g de lecitina, 0.3 mL de oleato sodico, 50 mL de etanol y una pequena cantidad de aceites, y su volumen se ajusto con agua destilada hasta 1 L. La solucion resultante se sometio a un microfluidizador a presion elevada para su emulsificacion, lo que proporciono asf nanosomas que tenfan aproximadamente 100 nm de tamano. Los nanosomas se prepararon de forma que tuvieran una concentracion final de aproximadamente 50 ppm y se utilizaron como ingredientes para cosmeticos.
EJEMPLO DE FORMULACION 1: Suavizante para la piel
Un suavizante para la piel que comprendfa los nanosomas que contenfan peptidos preparados en el Ejemplo 1 se formulo de acuerdo con la siguiente composicion:
TABLA 2
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma peptfdico
2.5
1,3-butilenglicol
6.0
Glicerina
4.0
PEG 1500
1.0
Hialuronato sodico
1.0
Polisorbato 20
0.5
Etanol
8.0
Conservante, pigmento
Cantidad apropiada
Benzofenona-9
0.05
Perfume
Cantidad minima
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
EJEMPLO DE FORMULACION 2: Crema nutritiva
Una crema nutritiva que comprendfa los nanosomas que contenfan peptidos preparados en el Ejemplo 1 se formulo de acuerdo con la siguiente composicion:
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma peptfdico
2.5
Aceite de Limnanthes alba
3.0
Alcohol cetearflico
1.5
Acido estearico
1.5
Estearato de glicerilo
1.5
Parafina lfquida
10.0
Cera
2.0
Polisorbato 60
0.6
Sesquiolato de sorbitan
2.5
Escualano
3.0
1,3-butilenglicol
3.0
Glicerina
5.0
Trietanolamina
0.5
Acetato de tocoferilo
0.5
Conservante, pigmentos
Cantidad apropiada
Perfume
Cantidad apropiada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
EJEMPLO DE FORMULACION 3: Lfquido nutritivo
Un lfquido nutritivo que comprendfa los nanosomas que contenfan peptidos preparados en el Ejemplo 1 se formulo 5 de acuerdo con la siguiente composicion:
TABLA 4
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma peptfdico
2.5
1,3-butilenglicol
4.0
Glicerina
4.0
Alcohol cetearflico
0.8
Estearato de glicerilo
1.0
Trietanolamina
0.13
Acetato de tocoferilo
0.3
Parafina lfquida
5.0
Escualano
3.0
Aceite de nuez de macadamia
2.0
Polisorbato 60
1.5
Sesquiolato de sorbitan
0.5
Polfmero carboxivinflico
1.0
Conservante, pigmentos
Cantidad apropiada
Perfume
Cantidad apropiada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
EJEMPLO DE FORMULACION 4: Esencia
Una esencia que comprendfa los nanosomas que contenfan peptidos preparados en el Ejemplo 1 se formulo de acuerdo con la siguiente composicion:
5 TABLA 5
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma peptfdico
2.5
Glicerina
10.0
1,3-butilenglicol
5.0
PEG 1500
2.0
Alantofna
0.1
DL-pantenol
0.3
EDTA-2Na
0.02
Hidroxietilcelulosa
0.1
Hialuronato sodico
8.0
Polfmero carboxivinflico
0.2
Trietanolamina
0.18
Octildodecet-16
0.4
Etanol
6.0
Perfume, conservante, pigmentos
Cantidad apropiada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
EJEMPLO DE FORMULACION 5: Serum para el cabello
Un serum para el cabello que comprendfa los nanosomas que contenfan peptidos preparados en el Ejemplo 1 se formulo de acuerdo con la siguiente composicion:
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma peptfdico
1
Glicerina
10.0
1,3-butilenglicol
5.0
PEG 1500
2.0
Alantofna
0.1
DL-pantenol
0.3
EDTA-2Na
0.02
Hidroxietilcelulosa
0.1
Hialuronato sodico
8.0
Polfmero carboxivinflico
0.2
Trietanolamina
0.18
Octildodecet-16
0.4
Etanol
6.0
Perfume, conservante, pigmentos
Cantidad apropiada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100
EJEMPLO DE FORMULACION 6: Tonico para el cabello
Un tonico para el cabello que comprendfa los nanosomas que contenfan peptidos preparados en el Ejemplo 1 se 5 formulo de acuerdo con la siguiente composicion:
TABLA 6
Ingredientes
Contenido (% en peso)
Nanosoma peptfdico
1
Glicerina
2.0
1,3-butilenglicol
2.0
PEG 1500
2.0
Alantofna
0.1
DL-pantenol
0.3
EDTA-2Na
0.02
Hialuronato sodico
8.0
Polfmero carboxivinflico
0.2
Trietanolamina
0.18
Octildodecet-16
0.4
Etanol
10.0
Perfume, conservante, pigmentos
Cantidad apropiada
Agua destilada
Cantidad residual
Total
100

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
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    1. Uso de un peptido que consta de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:3 para promover el crecimiento capilar y mejorar la produccion capilar, con la condicion de que el uso no sea un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
  2. 2. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el peptido tiene en su extremo N-terminal un grupo protector seleccionado a partir del grupo compuesto por grupo acetilo, grupo fluorenilmetoxicarbonilo, grupo formilo, grupo palmitoflo, grupo miristilo, grupo estearilo y polietilenglicol (PEG).
  3. 3. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el peptido procede de una protefna WNT humana.
  4. 4. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el peptido facilita la proliferacion celular en fibroblastos, queratinocitos o celulas de folfculo piloso.
  5. 5. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el peptido promueve la senalizacion de p-catenina.
  6. 6. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el peptido promueve la senalizacion de p-catenina a pesar de la presencia de la protefna DKK-1 (Dickkopf-1), que esta implicada en un proceso de perdida de cabello.
  7. 7. El uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde el peptido promueve la expresion de fibronectina, que es una diana de la protefna WNT e importante para el crecimiento capilar.
  8. 8. Uso de un peptido que consta de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:3 para prevenir la perdida de cabello, con la condicion de que el uso no sea un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
  9. 9. Uso de un peptido que consta de la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:3 para mejorar las condiciones cutaneas, donde la mejora en las condiciones cutaneas es una mejora en la elasticidad cutanea, mejora en la hidratacion cutanea o regeneracion cutanea, con la condicion de que el uso no sea un metodo de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia.
ES15198599.1T 2011-08-04 2012-05-09 Péptidos derivados de la familia WNT y usos de estos Active ES2677698T3 (es)

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