ES2677895T3 - Ciclótidos como agentes inmunosupresores - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un ciclótido de tipo kalata B no injertado, siendo dicho ciclótido un péptido ciclado de cabeza a cola cuya cadena ciclotídica incluye seis restos de cisteína conservados capaces de formar tres enlaces disulfuro dispuestos en un motivo de nudo de cistina cíclica (CCK), para su uso en el tratamiento o en la prevención de un trastorno autoinmune o una inflamación mediada por linfocitos mediante inmunosupresión.

Description

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DESCRIPCION

Ciclotidos como agentes inmunosupresores

La presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un ciclotido de tipo kalata B no injertado para su uso en inmunosupresion. La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un ciclotido de tipo kalata B no injertado para su uso en el tratamiento o en la prevencion de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en (i) un trastorno autoinmune; e (ii) una inflamacion mediada por linfocitos. En el presente documento tambien se desvela un metodo de exploracion y/o seleccion de un ciclotido inmunosupresor o de una mutacion que da lugar a un ciclotido mutado que tiene una actividad inmunosupresora inducida o potenciada. En el presente documento, tambien se desvela un metodo para producir un ciclotido inmunosupresor o una composicion farmaceutica inmunosupresora. En el presente documento, tambien se desvela un ciclotido mutado que tiene actividad inmunosupresora y una composicion farmaceutica que comprende el mismo.

Se han encontrado peptidos circulares naturales con posibles aplicaciones farmaceuticas en diversos organismos (resumido en Craik, 2006, Science, 311, 1563-1564), tales como bacterias (por ejemplo, bacteriocina AS-48 (Martinez-Bueno, 1994, J Bacteriol, 176, 6334-6339) y Microcina J25 (Rosengren, 2O03, J Am Chem Soc, 125, 12464-12474)), plantas (por ejemplo, inhibidores de la tripsina de girasol (Luckett, 1999, J Mol Biol, 290, 525-533; Mylne, 2011, Nat Chem Biol, 7, 257-259)) y animales (por ejemplo, 0-defensinas de mono rhesus (Tang, 1999, Science, 286, 498-502)). Uno de los mayores grupos de peptidos circulares naturales, pero en su mayona inexplorados, son los ciclotidos vegetales (Gruber, 2010, Curr Pharm Des, 16, 3071-3088).

En general, los ciclotidos son peptidos ciclados de cabeza a cola que representan un grupo abundante y diverso de peptidos vegetales sintetizados (ribosomicamente), que contienen una estructura anudada de cistina dclica. Ademas, los ciclotidos son una peptidoteca combinatoria natural de peptidos circulares de nudos de cistina con gran estabilidad. Los ciclotidos se exploran para determinar su distribucion en las plantas, aunque se sabe poco sobre el contenido de peptidos individuales de una sola especie.

La cadena ciclotfdica circular habitualmente consiste en ~30 aminoacidos, que incluyen seis cistemas conservadas que forman tres enlaces disulfuro dispuestos en un motivo de nudo de cistina dclica (CCK) (Craik, 1999, J Mol Biol, 294, 1327-1336), mientras que las secuencias entre las cistemas pueden tolerar una amplia seleccion de sustituciones de restos y, por lo tanto, el armazon ciclotfdico puede servir como un molde peptfdico combinatorio natural (Clark, 2006, Biochem J, 394, 85-93).

Las notables caractensticas estructurales hacen que los ciclotidos sean sumamente resistentes a la degradacion enzimatica, qmmica y termica (Colgrave, 2004, Biochemistry, 43, 5965-5975). A diferencia de los metabolitos vegetales sintetizados sin ribosomas, los ciclotidos son verdaderos productos genicos, y su biosmtesis implica la smtesis de precursores ribosomicos, el procesamiento enzimatico (Gillon, 2008, Plant J, 53, 505-515; Saska, 2007, J Biol Chem, 282, 29721-29728) y plegamientos de protemas (Gruber, 2007, J Biol Chem, 282, 20435-20446). Ademas, los ciclotidos poseen una amplia seleccion de actividades biologicas, por ejemplo, actividades insecticida (Barbeta, 2008, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 105, 1221-1225; Gruber, 2007, Toxicon, 49, 561-575), nematocida (Colgrave, 2008, Biochemistry, 47, 5581-5589; Colgrave, 2009, Acta Trop, 109, 163-166), contra la obstruccion (Goransson, 2004, J Nat Prod, 67, 1287-1290) y anti-VIH (Wang, 2008, J Nat Prod, 71, 47-52; Irlanda, 2008, Biopolymers, 90, 51-60), asf como citotoxicidad hacia estirpes celulares de linfoma (Svangard, 2004, J Nat Prod, 67, 144-147; Lindholm, 2002, Mol Cancer Ther, 1, 365-369).

El descubrimiento del primer ciclotido, kalata B1, se baso en su presencia en el te/extracto de la especie de Rubiaceae Oldenlandia affinis (R & S) DC, usado en la medicina indfgena africana para acelerar el parto (Gran, 1970, Medd Nor Farm Selsk, 12, 173-180; 1973, Acta Pharmacol Toxicol (Copenh), 33, 400-408; Gruber, 2011, Planta Med, 77, 207-220). La planta O. affinis (Rubiaceae) es comunmente conocida por los cientfficos en el campo de la etnofarmacologfa y la qmmica de peptidos como una fuente prototfpica de ciclotidos.

Desde su descubrimiento en la familia del cafe (Rubiaceae), los ciclotidos se han estudiado ampliamente en las violetas (Violaceae), y se han encontrado recientemente en las leguminosas (Fabaceae) (Poth, 2011, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 108, 10127-10132; Poth, 2011, ACS Chem Biol, 6, 345-355; Nguyen, 2011, J Biol Chem, 286, 2427524287). Se esta haciendo esfuerzo creciente en la exploracion de plantas de diferentes familias en busca de la aparicion y distribucion de ciclotidos. Hoy en dfa, es evidente que existen otros muchos ciclotidos. Recientemente, se ha estimado que quedan al menos 50.000 nuevos ciclotidos por descubrir en Rubiaceae (Gruber, 2008, Plant Cell, 20, 2471-2483) y otros ~9.000 en Violaceae (Simonsen, 2005, Plant Cell, 17, 3176-3189; Trabi, 2004, J Nat Prod, 67, 806-810), pero los investigadores apenas estan comenzando a comprender su variedad y distribucion en las plantas (Gruber, 2010, Biopolymers, 94, 565-572). Biologicamente, los ciclotidos se exploran principalmente para aplicaciones en la agricultura y en el diseno de farmacos debido a su enorme estabilidad (Craik, 2001, Toxicon, 39, 1809-1813; Craik, 2007, Curr Opin Drug Discov Devel, 10, 176-184; Craik, 2006, Biopolymers, 84, 250-266; Craik, 2001, Toxicon, 39, 43-60). Recientemente, se ha informado que el ciclotido kalata B1 causa hemolisis y la alteracion de la membrana a concentraciones superiores a ~50 pM (Barry, 2003, Biochemistry, 42, 6688-6695; Henriques,

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2011, J Biol Chem, 286, 24231-24241).

Con respecto a las aplicaciones terapeuticas de los ciclotidos, la bibliograffa cientifica y de patentes se refiere principalmente al uso de armazones de nudos de cistina para la produccion de farmacos a base de peptidos. Por ejemplo, el documento US 7.960.340 B2 se basa en el concepto de que el armazon molecular de los ciclotidos es ultraestable y que es posible modificar bucles del armazon reemplazandolos por secuencias bioactivas farmaceuticamente relevantes, estabilizando asf estas secuencias bioactivas. Varios artmulos recientes han informado sobre ejemplos de esta estrategia de injerto de ciclotidos. Posteriormente, diversos estudios aplicaron ciclotidos como armazones para peptidos terapeuticamente activos (vease, por ejemplo, Smith, 2011, Expert Opin. Ther. Patents 21, 1657-1672; Gunasekera, 2008, J Med Chem, 51, 7697-704; Thonbyoo, 2008, Org Biomol Chem, 6, 1462-70; y Cemazar (20th American-Peptide-Society Symposium; Montreal, CANADA, 26-30 de junio, 2007), Biopolymers 88, 4, SI, 2007, 523). Los ejemplos incluyen el desarrollo de un inhibidor de la angiogenesis con aplicaciones en el tratamiento del cancer mediante el injerto de una secuencia antiangiogenica en el ciclotido kalata B1 (Gunasekera; 2008; J Med Chem; 51; 7697-704) y el desarrollo de un inhibidor de una proteasa del virus de la fiebre aftosa en el armazon del ciclotido MCoTI-II (Thonbyoo; 2008; Org Biomol Chem; 6; 1462-70). El documento US 2010/0298528 A1 desvela protemas cmlicas tales como kalata B1 para su uso como armazones moleculares en los que se han injertado secuencias de aminoacidos heterologas con actividades biologicas. Se propone el uso de dichas protemas dclicas injertadas en el tratamiento o la profilaxis de enfermedades o afecciones asociadas. Un ejemplo de dicha protema dclica injertada es kalata B1, en la que se ha injertado la secuencia de un inhibidor del receptor alfa C5, y se menciona el posible uso en tratamientos de afecciones inflamatorias asociadas al receptor alfa C5, incluyendo la artritis reumatoide. Tambien se ha demostrado que los ciclotidos tienen la actividad de inhibir la triptasa, la principal proteasa secretora de los mastocitos humanos (documento WO 06032436). Ademas, se ha demostrado que los ciclotidos presentan actividades citotoxicas, y su toxicidad selectiva hacia las estirpes celulares cancerosas ha abierto la posibilidad de aplicaciones contra el cancer (Hermann; 2008; Phytochemistry; 69; 939-52, Lindholm; 2002; Mol Cancer Ther; 1; 365-9, Svangard; 2004; J Nat Prod; 67; 144-7; Burman; 2010; Biopolymers Pept Sci; 94; 626-34; Gerlach; 2010; Biopolymers; 94; 617-25). Sin embargo, se sabe que los efectos citotoxicos causan efectos secundarios.

El sistema inmune del organismo es un arma muy poderosa contra los patogenos, pero el mal funcionamiento puede causar una sobrerreactividad de esta maquinaria de defensa y, en algunos casos, conducir a enfermedades autoinmunes, tales como la artritis reumatoide (AR) o la enfermedad de Crohn. La inmunosupresion, la reduccion dirigida de la activacion o eficacia del sistema inmune, es un posible enfoque para el tratamiento de estas afecciones. Dado que los linfocitos T tienen el impacto mas potente durante la respuesta de defensa del sistema inmune, la mayona de los medicamentos inmunosupresores estan dirigidos a actuar sobre estas celulas. Uno de los farmacos inmunosupresores escogidos para su uso clmico para tratar o suprimir una "sobreactividad" de los linfocitos, por ejemplo, tras una cirugfa de trasplante o en casos de AR grave, es el peptido dclico no ribosomico, fungico, ciclosporina A (de Mattos, 2000, Am J Kidney Dis, 35, 333-346; Matsuda, 2000, Immunopharmacology, 47, 119-125; Schreiber, 1991, Science, 251, 283-287). Sin embargo, la ciclosporina A tiene muchos efectos secundarios, a veces graves (de Mattos, 2000, Am J Kidney Dis, 35, 333-346). Ademas, los extractos foliares de Betula pendula se han usado tradicionalmente para tratar la AR o la artrosis. Ademas de esto, se debe hacer frente a mas problemas cuando se trata de suprimir el sistema inmune. Por ejemplo, la prueba de los efectos antiproliferativos al mantener las celulas en un estado "inactivo" en el que todavfa son viables, pero no son capaces de crecer y proliferar, sin causar muerte celular, es una condicion previa crucial para clasificar una sustancia como inmunosupresora, porque la citotoxicidad causana efectos secundarios. Ademas, los peptidos terapeuticos suelen carecer de biodisponibilidad oral debido a su rapida degradacion tras la ingestion, y tienen una escasa penetracion farmacologica debido a su naturaleza hidrofila.

Por lo tanto, el problema tecnico que subyace a la presente invencion es la provision de medios y metodos mejorados para suprimir el sistema inmune/para la inmunosupresion y para tratar/prevenir las enfermedades/los trastornos correspondientes.

El problema tecnico se resuelve proporcionando las realizaciones caracterizadas en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas.

En el contexto de la presente invencion, se realizo la prueba de principio de que se pueden usar ciclotidos y peptidos de nudos de cistina relacionados o mutantes/variantes de ciclotidos para suprimir el sistema inmune/inmunosupresion, como agentes inmunosupresores o para la supresion/reduccion de la eficacia del sistema inmune. Esto da la posibilidad de hacer uso de las caractensticas superiores y ventajosas (farmacologicas) de los ciclotidos tambien en el campo de la supresion del sistema inmune/inmunosupresion.

En particular, se encontro que, sorprendentemente, el contexto de la presente invencion, existen ciclotidos que son capaces de reducir o detener la proliferacion de celulas inmunes /celulas del sistema inmune (activadas) (por ejemplo, celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) o linfocitos (T)). Ademas, se demostro que el efecto antiproliferativo inducido por los ciclotidos no causa la muerte celular por apoptosis ni por necrosis, sino que inhibe el crecimiento de las celulas inmunes de forma citostatica. Ademas, la vacunacion con un ciclotido (por ejemplo, kalata B1) dio lugar a una reduccion de la incidencia y gravedad de la Encefalomielitis Autoinmune Experimental (EAE) en

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un modelo de raton de EAE para la esclerosis multiple (EM). Ademas, se demostro que la vacunacion con un ciclotido (por ejemplo kalata B1) conduce a la produccion de una respuesta de linfocitos T antiinflamatoria.

Por consiguiente, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende (como principio activo) un ciclotido de tipo kalata B no injertado, en particular, un ciclotido de tipo kalata B no injertado y proliferativo de celulas antiinmunes, siendo dicho ciclotido un peptido ciclado de cabeza a cola cuya cadena ciclotfdica incluye seis restos de cistema conservados capaces de formar tres enlaces disulfuro dispuestos en un motivo de nudo de cistina dclica (CCK), para su uso en el tratamiento o en la prevencion de un trastorno autoinmune o una inflamacion mediada por linfocitos mediante inmunosupresion.

En el contexto de la presente invencion, se caracterizaron por primera vez las propiedades inmunosupresoras de los ciclotidos (vegetales). En combinacion con las caractensticas estructurales unicas y la enorme estabilidad de los ciclotidos, estos resultados abren nuevos caminos para la aplicacion de los ciclotidos nativos y optimizados sinteticamente (plantas) en los trastornos relacionados con el sistema inmune, en particular, en la inmunosupresion. En particular, se demostro, en el contexto de la presente invencion, que existen efectos antiproliferativos de un extracto de planta de la familia del cafe O. affinis hacia las celulas del sistema inmune humano (por ejemplo, linfocitos). Ademas, Kalata B1 se identifico espedficamente como un componente activo responsable de los efectos citostaticos observados. Es mas, se demostro que, en un intervalo de concentraciones definido, no se produjo muerte celular por apoptosis ni necrosis. Es mas, se demostro que los ratones con EAE tratados con un ciclotido (por ejemplo, kalata B1) mostraron signos clmicos significativamente mas leves y una mejona en la gravedad de la enfermedad (veanse, por ejemplo, las Figuras 10A y B). Ademas, la vacunacion con un ciclotido (por ejemplo kalata B1) conduce a la produccion de una respuesta de linfocitos T antiinflamatoria.

Los resultados presentados tienen un impacto adicional en el campo general de los peptidos de nudos de cistina, y mejoran en gran medida las posibilidades para sus posibles aplicaciones terapeuticas. La biodisponibilidad oral de ciclotidos y peptidos de nudos de cistina, la disponibilidad de tecnicas de produccion recombinantes y sinteticas, asf como la plasticidad del armazon de nudos de cistina, que es susceptible a una amplia seleccion de sustituciones de aminoacidos, proporciona una base prometedora para futuros estudios mecanicistas de su actividad sobre las celulas inmunes (por ejemplo, linfocitos) y aplicaciones in vivo (por ejemplo, en sistemas modelo relacionados con el mal funcionamiento de las celulas inmunes en general y, en particular, la sobrerreactividad de los linfocitos).

Como se documenta a continuacion en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, los efectos antiproliferativos de los ciclotidos, en particular, de los ciclotidos vegetales, en celulas primarias del sistema inmune humano (PBMC humanas primarias o linfocitos T) se demostraron usando criterios de valoracion biologicos e inmunologicos en sistemas de prueba basados en celulas. Se demostro ademas que los efectos tienen un intervalo de concentraciones definido y que no se deben a efectos citotoxicos. Mas particularmente, la cuantificacion por LC- MS del extracto vegetal de O. affinis activo desencadeno la caracterizacion de la actividad antiproliferativa de kalata B1, uno de los ciclotidos mas abundantes en este extracto, sobre los linfocitos humanos activados primarios. Para este fin, se analizo un extracto en bruto de ciclotido de O. affinis usando un flujo de trabajo peptidomico alternativo y una tecnica rapida para la caracterizacion de ciclotidos en la planta.

Se mostro en los ejemplos adjuntos que un ciclotido (por ejemplo, el ciclotido mutante Kalata B1 T20K, un ciclotido que comprende la SEQ ID NO: 7; 4 |jM) es capaz de reducir el nivel de expresion del receptor de IL-2 y la produccion de IL-2. La magnitud del efecto fue similar al tratamiento con ciclosporina A (5 jg/ml), y este efecto antiproliferativo del ciclotido se pudo revertir mediante la adicion de IL-2 exogena. Ademas, se demostro que el ciclotido redujo la liberacion de moleculas efectoras IFN-gamma y TNF-alfa en PBMC, sin embargo, esta reduccion fue solo de naturaleza transitoria. esto se opone al tratamiento con CsA, que condujo a una reduccion sostenida de TNF-alfa e IFN-gamma a lo largo del tiempo. Tambien se mostro in vivo una reduccion de la liberacion de IL-2 tras el tratamiento con ciclotidos (por ejemplo, con el ciclotido mutante Kalata B1 T20K, un ciclotido que comprende la SEQ ID NO: 7; 200 jg/100 jl/raton) (por ejemplo, en un modelo de raton de EAE (C57BU6J)).

Sin quedar ligados a teona alguna, el efecto antiproliferativo mediado por ciclotidos esta mediado a traves de un mecanismo dependiente de la IL-2. Las funciones efectoras de las PBMC (activadas) (por ejemplo, linfocitos) tambien se redujeron mediante el tratamiento con ciclotido (por ejemplo, mediante el tratamiento con t20K).

Es mas, el efecto sobre la smtesis de IL-2 y la expresion del receptor de IL-2 puede estar directamente influido por los ciclotidos o mediado independientemente. Los ciclotidos definidos en el presente documento pueden tener un modo de accion similar al de CsA. Se sabe que CsA influye directamente en la produccion de IL-2. Ademas, CsA puede formar un complejo con la ciclofilina, y el complejo de CsA-ciclofilina puede unirse a la calcineurina e inhibir su funcion en la senalizacion de Ca. Esto conduce a una transcripcion de NFATc reducida y, por tanto, a la smtesis de IL-2. Por lo tanto, la accion inmunosupresora de CsA requiere que CsA entre en las celulas y forme un contacto directo con la ciclofilina y calcineurina. Como se muestra en los ejemplos adjuntos, T20K puede entrar en los linfocitos T, es decir, puede atravesar (activa o pasivamente) la membrana (vease la Figura 24). Por consiguiente y sin quedar ligados a teona alguna, T20K puede interactuar con una diana o un transportador extracelular, o puede entrar en el linfocito T de forma pasiva e interactuar con una diana intracelular. Tambien es posible una combinacion de actividad extracelular e intracelular de T20K. Sin quedar ligados a teona alguna, los ciclotidos definidos en el presente documento, en particular, kalata B1 o T20K, pueden entrar en las celulas y afectar a la smtesis de IL-2 de

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la manera de CsA o pueden permanecer en el exterior de sus celulas diana y conducir a un cambio en el potencial de membrana mediante la interaccion con moleculas superficiales, receptores o canales ionicos. Lo mas importante, los ciclotidos definidos en el presente documento, en particular, kalata B1 o T20K, pueden interactuar con un receptor de linfocitos T.

Sin quedar ligados a teona alguna, el mecanismo antiproliferativo puede deberse a la interaccion directa de los ciclotidos definidos en el presente documento con el receptor de IL-2 (por ejemplo, T20K puede regular a la baja la expresion del receptor CD25 de cadena alfa de IL-2 en la superficie de las PBMC como se muestra en los ejemplos adjuntos). Por ejemplo, y tambien sin quedar ligados a teona alguna, la union de los ciclotidos inmunosupresores definidos en el presente documento a la cadena alfa de IL-2 puede ocupar el sitio de interaccion para la union de la cadena beta y gamma y, por tanto, inhibir la formacion del complejo. Sin embargo, esta formacion del complejo de receptor de iL es importante para la activacion del linfocito T para recibir senales de la IL-2 liberada. Solo despues de la union de IL-2 a su receptor, los linfocitos T iniciaran una proliferacion normal. Si se inhibe la union, por ejemplo, mediante el mecanismo descrito anteriormente, los linfocitos T permanecen en un estado no proliferativo. Un farmaco del mercado farmaceutico, es decir, Simulect®, se usa como agente antiproliferativo basado en la interaccion del receptor CD25. El principio activo es un anticuerpo monoclonal quimerico, Basiliximab, que se une a la cadena alfa del receptor de IL-2 y, por tanto, inhibe la union de la IL-2 endogena.

En el contexto de la presente invencion, se caracterizaron los efectos antiproliferativos y citotoxicos de un extracto vegetal que contema ciclotido de O. affinis en bruto hacia los linfocitos humanos primarios activados. Para identificar los componentes peptfdicos moleculares individuales de esta mezcla de ciclotido inmunosupresor, se combino el analisis biologico in vitro con la caracterizacion qrnmica del contenido de peptidos individuales (ciclotidos) en el extracto en bruto de esta planta usando un flujo de trabajo peptidomico rapido optimizado.

En particular, se uso un protocolo optimizado para el analisis de extractos vegetales que contienen ciclotidos combinando LC-MS/MS de nanoflujo y analisis automatico de bases de datos para determinar el contenido de los distintos peptidos (por peso molecular y secuencia peptfdica) en la planta que contiene ciclotido O. affinis.

La combinacion de reconstruccion de nano LC-MS/Ms y LC-MS, asf como la busqueda automatica en bases de datos (por ejemplo, usando la herramienta ERA (Colgrave, 2010, Biopolymers. 94, 592-601)) es una tecnica rapida y util para la identificacion de ciclotidos en extractos en bruto.

En comparacion con un estudio anterior de Plan (2007, ChemBioChem, 8, 1001-1011), que describio el primer identificador genetico ciclotfdico de O. affinis usando la purificacion clasica de peptidos mediante HPLC analftica y secuenciacion de MS/MS fuera de lmea, se identificaron 8 ciclotidos conocidos adicionales y se demostro su capacidad para proporcionar una lista de ~50 masas peptfdicas correspondientes a ciclotidos de las que algunas pueden identificarse mediante identificacion genetica de peptidos en CyBase (base de datos de ciclotidos (Wang, 2008, Nucleic Acids Res, 36, D206-210)). Esto sugiere que el numero de ciclotidos que se pueden encontrar en una sola especie puede ser >70 y es, por lo tanto, al menos el doble del numero anticipado previamente de (en promedio) 34 ciclotidos por especie (Gruber, 2008, Plant Cell, 20, 2471-2483). Esto, por supuesto, tiene un gran impacto en la determinacion del numero total de ciclotidos del reino vegetal y, por consiguiente, dana lugar a la necesidad de revisar el numero de nuevos ciclotidos que se descubrieron en las plantas.

Usando el flujo de trabajo peptidomico mejorado descrito anteriormente, casi todos los ciclotidos actualmente conocidos y un numero todavfa mayor de nuevas masas peptfdicas correspondientes a otros ciclotidos conocidos o nuevos (por peso molecular) se podnan identificar en extracto de ciclotido en bruto de la planta O. affinis. Se descubrio que los ciclotidos kalata B1 y kalata B2 eran los principales componentes peptfdicos, representando aprox. el 34 % del contenido total de ciclotidos de O. affinis.

Usando analisis de dispersion lateral directa basado en citometna de flujo, se demostro ademas que el extracto que contiene ciclotidos muestra una reduccion dependiente de la dosis (50-100 pg/ml) de PBMC proliferantes activadas en comparacion con el control estimulado sin tratar (Figuras 2A y B). Simultaneamente, se observo un contenido constante de PBMC en reposo, viables, sin acumulacion de celulas muertas, lo que demuestra que las concentraciones aplicadas del extracto de ciclotido no son perjudiciales para las celulas.

Varias caractensticas adicionales con respecto al suministro de farmacos conducen al potencial inmunosupresor descrito anteriormente de los ciclotidos: (i) actividad sostenida tras la administracion oral como te/extracto (en seres humanos) (Gran, 1970, Medd Nor Farm Selsk, 12, 173-180), (ii) gran estabilidad en plasma y contra proteasas gastrointestinales (Colgrave, 2004, Biochemistry, 43, 5965-5975; Colgrave, 2005, J Chromatogr A, 1091, 187-193) e

(iii) presencia de parches hidrofobos expuestos en la superficie (Clark, 2006, Biochem J, 394, 85-93).

En general, los peptidos terapeuticos suelen carecer de biodisponibilidad oral debido a su rapida degradacion tras la ingestion, y tienen una escasa penetracion farmacologica debido a su naturaleza hidrofila (Vlieghe, 2010, Drug Discov Today, 15, 40-56; Werle, 2007, Int J Pharm, 332, 72-79). Es probable que los ciclotidos y los peptidos de nudo de cistina relacionados resuelvan estos problemas (Kolmar, 2009, Curr Opin Pharmacol, 9, 608-614). Como pruebas de hipotesis correspondientes, hay dos ejemplos en la literatura: (i) se ha confirmado recientemente una conotoxina dclica modificada sinteticamente como un farmaco peptido circular activo oral para el tratamiento del dolor neuropatico in vivo (Clark, 2010, Angew Chem Int Ed Engl, 49, 6545-6548), e (ii) se ha disenado un ciclotido sintetico que contiene el motivo de secuencia de un antagonista de bradiquinina B1 basandose en el molde de

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peptido kalata B1 nativo y se ha confirmado que es oralmente activo y biodisponible en un modelo murino de dolor inflamatorio (Wong, 2012, Angew Chem Int Ed Engl, 51(23), 5620-4). Otra caractenstica de los ciclotidos con respecto a las aplicaciones como farmacos peptfdicos es que son productos geneticos sintetizados (Jennings, 2001, Proc Natl Acad Sci, EE.UU., 98, 10614-10619) y, por tanto, pueden producirse en gran cantidad mediante tecnicas recombinantes (Kimura, 2006, Angew Chem Int Ed Engl, 45, 973-976) o en cultivos de suspension de plantas (Seydel, 2007, Appl. Microb. Biotechnol., 77, 275-284). Estas tecnicas de produccion de ciclotidos y la disponibilidad de estrategias de smtesis de peptidos en fase solida (Clark, 2010, Biopolymers, 94, 414-422) ofrecen oportunidades para la optimizacion del armazon ciclotfdico, que es susceptible de una amplia seleccion de sustituciones de aminoacidos (vease tambien la Figura 1).

Al menos, la prueba de los efectos antiproliferativos al mantener las celulas en un estado "inactivo" en el que todavfa son viables, pero no son capaces de proliferar, sin causar muerte celular, en un cierto intervalo de dosis, es una condicion previa crucial para clasificar una sustancia como inmunosupresora, porque la citotoxicidad causana efectos secundarios.

Se demostro ademas en el contexto de la presente invencion que, tras el tratamiento (por ejemplo, de un modelo de raton con EAE (C57BL/6J)) con ciclotidos (por ejemplo, con el ciclotido mutante kalata B1 t20K, un ciclotido que comprende la SEQ ID NO: 7; 200 pg/100 pl/raton), la puntuacion clmica (por ejemplo, la puntuacion de eAe) disminuye significativamente (por ejemplo, el peso de los ratones con eAe). Es importante destacar que, el tratamiento con ciclotido no causa un efecto citotoxico, ya que el tratamiento con ciclotido conduce a una reduccion del peso corporal.

En general, el significado del termino "ciclotido" es conocido en la tecnica, y el termino "ciclotido" se usa correspondientemente en el presente documento. En particular, los "ciclotidos", como se usan en el presente documento, son peptidos ciclados de cabeza a cola cuya cadena ciclotfdica incluye seis restos de cistema conservados capaces de formar tres enlaces disulfuro dispuestos en un motivo de nudo de cistina dclica (CCK). Las secuencias entre cistemas de un ciclotido pueden tolerar una amplia seleccion de sustituciones de restos (vease, por ejemplo, Clark, citado anteriormente y Figura 1). En un aspecto, el termino "ciclotido" usado en el presente documento se refiere a ciclotidos como los descritos en Craik (1999, citado anteriormente), Clark (2006, citado anteriormente) y, en particular, en el documento US 7.592.533 B1.

En particular, un ciclotido para su uso en el contexto de la presente invencion comprende una secuencia de aminoacidos capaz de formar una estructura principal dclica, en el que dicha estructura principal dclica comprende la estructura de formula I:

Ciclo(C[X1 ... Xa C[Xl1 ... Xlb] C[XN1 ... X''c] C[XIN1 ... X"'d] C[XIV1 ... Xlve] C[Xv1 ... Xvf]) (I)

en la que

(i) C es cistema;

(ii) cada [X1 ... Xa], [X ... x'j, [X" ... x''c], [XN1 ... X'''d], [XIV1 ... XIVe], y [Xv1 ... Xvf] representa uno o mas restos de aminoacido, en la que cada uno o mas restos de aminoacido de dentro o de entre los restos de la secuencia pueden ser iguales o diferentes; y

(iii) a, b, c, d, e y f representan el numero de restos de aminoacido de cada secuencia respectiva y cada uno de a a f puede ser igual o diferente, y varia de 1 a aproximadamente 20.

Preferentemente, a es de 3 a 6, b es de 4 a 8, c es de 3 a 10, d es 1, e es de 4 a 8, y/o f es de 5 a 13.

Preferentemente, el ciclotido que se va a usar en la presente invencion comprende el tramo de aminoacidos de formula '' (SEQ 'D NO. 17)

Xxx1-Leu-Pro-Val-Cys-Gly-Glu-Xxx2-Cys-Xxx3-Gly-Gly-Thr-Cys-Asn-Thr-Pro-Xxx1-Cys-Xxx1-Cys-Xxx1-Trp-Pro- Xxx-i-Cys-Thr-Arg-Xxx1 (''),

en la que Xxx-i, Xxx2 y Xxx3 es cualquier aminoacido, aminoacido no natural o peptidomimetico, preferentemente, un aminoacido alifatico. En particular, Xxx2 puede ser cualquier aminoacido, aminoacido no natural o peptidomimetico, a excepcion de Lys ni/o Xxx3 puede ser cualquier aminoacido, aminoacido no natural o peptidomimetico, a excepcion de Ala o Lys. Preferentemente, Xxx2 y/o Xxx3 de formula '' no estan mutados en absoluto. Mas concretamente, Xxx1 puede ser Gly, Thr, Ser, Val, l'e, Asn, Asp o preferentemente, Lys, Xxx2 puede ser Thr, y/o Xxx3 puede ser Val o Phe. Aun mas concretamente, Xxx1 de la posicion 1 de la formula '' puede ser Gly, Xxx1 de la posicion 18 de la formula '' puede ser Lys o, preferentemente, Gly, Xxx1 de la posicion 20 de la formula '' puede ser Thr, Ser o preferentemente, Lys, Xxx1 de la posicion 22 de la formula '' puede ser Ser o Thr, Xxx1 de la posicion 25 de la formula '' puede ser Val o 'le, Xxx1 de la posicion 29 de la formula '' puede ser Asn, Asp o preferentemente, Lys, Xxx2 de la formula '' puede ser Thr y/o Xxx3 de la formula '' puede ser Val o Phe.

Los restos de aminoacidos espedficamente definidos de formula '' tambien pueden variar dependiendo del (tipo de)

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ciclotido en particular. De este modo, lo que se ha dicho con respecto a Xxxi, Xxx2 y/o Xxx3, no solo se aplica a la formula II, sino tambien a los restos de aminoacidos correspondientes de otros ciclotidos que no comprenden el tramo de aminoacidos particular de formula II. En este contexto, "correspondiente/s" significa en particular restos de aminoacidos de la/s misma/s posicion/es o similar/es.

Los ejemplos espedficos no limitantes de un ciclotido que se va a usar de acuerdo con la presente invencion es un ciclotido que comprende:

(i) una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 5, 1, 4, 6, 2 y 3;

(ii) una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 5, 1, 4, 6, 2 y 3; o

(iii) una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 %, preferentemente, al menos un 95 %, mas preferentemente al menos un 98 % e incluso mas preferentemente al menos un 99 % identica a cualquier secuencia de aminoacidos de (i) a (ii).

Ademas, los ejemplos no limitantes de ciclotidos que se van a usar son ciclotidos que consisten en una forma ciclada de cabeza a cola de una secuencia de aminoacidos como se define en cualquiera de (i) a (iii), supra.

En una realizacion preferida, el ciclotido que se va a usar es kalata B o un ciclotido de tipo kalata B. En aun otra realizacion preferida mas, el ciclotido es kalata B2 o, lo mas preferentemente, kalata B1. Los ciclotidos kalata B1 y B2 solo difieren en cinco posiciones de aminoacidos (vease la Figura 6), concretamente en Val a Phe (bucle 2) y sustituciones conservativas de Thr a Ser (bucle 4), Ser a Thr (bucle 5), Val a Ile (en el bucle 5) y Asn a Asp (en el bucle 6) en kalata B2. Estas sustituciones no tienen consecuencias estructurales significativas (RMSDestructura principal kB1/kB2 = 0,599 A, vease la Figura 6) y los dos peptidos tienen un perfil de bioactividad similar (Gruber, 2007, Toxicon, 49, 561-575).

Se entendera que para los diversos ciclotidos que se usaran en el contexto de la presente invencion, es posible una cierta flexibilidad y variabilidad en la secuencia primaria, es decir, la cadena principal de la secuencia de aminoacidos, siempre que se garantice la estructura secundaria y terciaria global de los respectivos peptidos, que se define por al menos algunos restos de aminoacidos fijos y por su disposicion espacial, (veanse, por ejemplo, las formulas I y II, supra).

Basandose en las ensenanzas proporcionadas en el presente documento, el experto esta, por un lado, facilmente en la posicion de descubrir/identificar mutantes/variantes correspondientes de los ciclotidos que actuan de acuerdo con la invencion. Por otro lado, el experto puede analizar si un mutante/variante de ciclotido dado todavfa tiene la funcion deseada, por ejemplo, al menos una de las funciones descritas en otra parte del presente documento. La grna experimental correspondiente para dichas pruebas, es decir, los respectivos ensayos, se proporciona y se describe de forma ilustrativa en el presente documento, en particular, en los ejemplos adjuntos.

De este modo, en un aspecto, en el contexto de la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la presente invencion tambien se pueden usar formas mutantes o variantes de los ciclotidos de tipo kalata B (nativos) no injertados definidos en el presente documento, en particular, formas mutantes o variantes de los ciclotidos de tipo kalata B no injertados como los representados en la Tabla 1, mas concretamente, formas mutantes o variantes de kalata B2 o, preferentemente, kalata B1. Las formas mutantes o variantes pueden optimizarse (sinteticamente), es decir, pueden ser mas adecuadas para la inmunosupresion en comparacion con su forma no mutante/no variante. Los ejemplos no limitantes de formas mutantes/variantes de ciclotidos son los ciclotidos representados en la Tabla 1, en los que se han realizado las mismas mutaciones que en una cualquiera de SEQ ID NO: 3 a 7, o mutaciones correspondientes en posiciones de aminoacidos que corresponden a las posiciones de aminoacidos que se han mutado en una cualquiera de SEQ ID NO: 3 a 7.

Si no se menciona de otro modo, se considera que el termino "ciclotido/s" cuando se usa en el presente documento tambien abarca "mutante/s/variante/s de ciclotido". En el apartado (iii), se dan ejemplos no limitantes de mutantes/variantes/ciclotidos modificados de acuerdo con la presente invencion, supra, o son ciclotidos que consisten en una forma ciclada de cabeza a cola de una secuencia de aminoacidos como se define en el apartado (iii), supra. Otros ejemplos de mutantes/variantes de ciclotidos son ciclotidos que comprenden una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 a 7, o ciclotidos que consisten en una forma ciclada cabeza a cola de una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 a 7.

En cuanto a los mutantes/las variantes de los ciclotidos, por ejemplo, se preve que uno o mas aminoacidos de dichos peptidos se reemplacen por uno o mas aminoacidos naturales o sinteticos. En este contexto, se prefiere que este/estos intercambio/s de aminoacidos sea/n uno o varios intercambios de aminoacidos conservativos, es decir, que el aminoacido de reemplazo pertenezca a la misma categona de aminoacidos que el aminoacido que se va a reemplazar. Por ejemplo, un aminoacido acido puede ser reemplazado por otro aminoacido acido, un aminoacido basico puede ser reemplazado por otro aminoacido basico, un aminoacido alifatico puede ser reemplazado por otro aminoacido alifatico y/o un aminoacido polar puede ser reemplazado por otro aminoacido polar.

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En particular, se contempla que los intercambios de aminoacidos que conducen a mutantes/variantes de los ciclotidos desvelados sean tales que el patron de polaridad y carga de dentro de la estructura terciaria del mutante/de la variante resultante siga imitando/corresponde (sustancialmente) a la estructura tridimensional del respectivo ciclotido.

Otros ejemplos de mutantes o variantes de ciclotidos son kalata B1 o kalata B2 (o los mutantes/las variantes de los mismos desvelados) o un ciclotido que consiste en una forma ciclada de cabeza a cola de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o 2 que tiene

(i) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de sus restos de aminoacidos acidos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido acidos;

(ii) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de sus restos de aminoacidos basicos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido basicos; y/o

(iii) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de sus restos de aminoacidos alifaticos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacidos alifaticos.

Otros mutantes/variantes de ciclotidos comprenden el tramo de aminoacidos de formula II, pero que tienen

(i) al menos 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los restos de aminoacidos acidos (espedficos restantes) reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido acidos;

(ii) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los restos de aminoacidos basicos (espedficos restantes) reemplazados

por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido

basicos; y/o

(i) al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 de los restos de aminoacidos alifaticos (espedficos restantes) reemplazados

por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido

alifaticos.

En general, el significado del termino "aminoacido" o de la expresion "resto de aminoacido" es conocido en la tecnica, y se usa en el presente documento correspondientemente. De este modo, cabe senalar que cuando un "aminoacido" es un componente de un peptido/una protema, el termino "aminoacido" se usa en el presente documento en el mismo sentido que "resto de aminoacido".

En particular, se considera que un "aminoacido" o "resto de aminoacido", como se menciona en el presente documento, es un aminoacido de origen natural, mas preferentemente, un L-aminoacido de origen natural. Sin embargo, aunque menos preferido, un "aminoacido" o "resto de aminoacido", en el contexto de la presente invencion, tambien puede ser un D-aminoacido o un aminoacido no natural (es decir, un aminoacido sintetico), como, por ejemplo, norleucina, p-alanina o selenocistema.

Tambien se conoce en la tecnica el significado de las expresiones "aminoacido/s acido/s", "aminoacido/s basico/s", "aminoacido/s alifatico/s" y "aminoacido/s polar/es" (vease, por ejemplo, Stryer, Biochemie, Spectrum Akad. Verlag, 1991, Artfculo I. 2). Estos terminos se usan de forma correspondiente a lo largo de la presente invencion. De este modo, tambien se aplican las condiciones particulares dadas en el presente documento con respecto a los ciclotidos de la invencion.

En particular, la expresion "aminoacido/s acido/s", como se usa en el presente documento, pretende significar un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Asp, Asn, Glu y Gln, la expresion "aminoacido/s basico/s", como se usa en el presente documento, pretende significar un aminoacido seleccionado del grupo que comprende Arg, Lys y His, la expresion "aminoacido/s alifatico/s", como se usa en el presente documento, pretende significar cualquier aminoacido seleccionado del grupo que comprende Gly, Ala, Ser, Thr, Val, Leu, lIe, Asp, Asn, Glu, Gln, Arg, Lys, Cys y Met, y la expresion "aminoacido/s polar/es", como se usa en el presente documento, pretende significar cualquier aminoacido seleccionado del grupo que comprende Cys, Met, Ser, Tyr, Gln, Asn y Trp.

En una realizacion preferida, los ciclotidos y mutantes/variantes de ciclotidos que se van a usar de acuerdo con la presente invencion son ciclotidos que tienen al menos uno de sus restos de aminoacidos correspondientes a Xxx1 de formula II, preferentemente correspondiente a Xxx1 de la posicion 20 y/o 29 de la formula II, reemplazado por uno o varios restos de aminoacidos diferentes. Asimismo, los ciclotidos y los mutantes/variantes de ciclotidos que se van a usar de acuerdo con la presente invencion tambien pueden ser ciclotidos que tienen al menos uno de sus restos de aminoacidos correspondientes a las posiciones de aminoacidos 1, 18, 20, 22, 25 y/o 29, preferentemente, correspondientes a la posicion de aminoacido 20 y/o 29, reemplazado por uno o varios restos de aminoacidos diferentes. En este contexto, "correspondiente/s a" significa en particular el/los mismo/s resto/s de aminoacidos y/o de la/s misma/s posicion/es o posicion/es similar/es. Dichos uno o varios restos de aminoacidos diferentes pueden, por ejemplo, tener utilidad en el marcaje de los respectivos mutantes/variantes de ciclotidos. Un ejemplo no limitante de dichos uno o varios restos de aminoacidos diferentes es Lys. Los ejemplos no limitantes de los mutantes/variantes de ciclotidos respectivos son mutantes/variantes de ciclotidos que comprenden o consisten en (una forma ciclada de cabeza a cola de) una secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 4 a 7, en los que se prefieren SEQ ID NO: 5 o 7.

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En un aspecto espedfico, los mutantes/las variantes de ciclotidos que se van a usar de acuerdo con la invencion son ciclotidos que no tienen reemplazado uno o mas de sus restos de aminoacidos encontrados entre la "primera" y la "segunda" Cys (correspondiente a la "primera» y "segunda» Cys, respectivamente, como se representa en la formula I, supra) y/o entre la "segunda" y la "tercera» Cys, respectivamente, como se muestra en formula I, supra). Preferentemente, en dichos mutantes/variantes de ciclotidos, ninguno de los restos de aminoacidos que flanquean la "segunda" Cys, en particular, el resto de aminoacido junto a la "segunda" Cys en la direccion N-terminal de formula I ni el resto de aminoacido junto a la "segunda" Cys en la direccion C-terminal de formula I, esta reemplazado por otro resto de aminoacido, en particular, no por un resto de Lys o Ala.

Se prefiere que los ciclotidos y los mutantes/variantes de los mismos carezcan de sitios susceptibles a la hidrolisis o escision por proteasas, como, por ejemplo, proteasas sericas. Los significados de los terminos "hidrolisis" y "proteasas (sericas)" y la estructura de los sitios son bien conocidos en la tecnica.

En un aspecto preferido, en los mutantes/las variantes de ciclotidos que se usaran de acuerdo con la presente invencion, en particular, en los mutantes/las variantes de ciclotidos definidos mas espedficamente en otra parte del presente documento (por ejemplo, los mutantes/las variantes de ciclotidos definidos en los artfculos (iii) e (i) a (iii), supra, o los artfculos (i) a (xii), infra), ninguno de los (seis) restos de Cys esta reemplazado por otro resto de aminoacido.

Sin embargo, con respecto a los mutantes/las variantes de los ciclotidos, uno o mas de los (seis) restos de Cys, en particular, la Cys definida en el presente documento, tambien pueden estar reemplazados por otro/s aminoacido/s, siempre que el reemplazo siga conduciendo a un enlace intramolecular individual, como el de un enlace disulfuro, dentro del ciclopeptido, es decir, a un mimetismo correcto del ciclotido nativo. Dicho aminoacido puede ser, entre otros, un aminoacido no natural, como un aminoacido no natural que tiene un grupo -SH capaz de formar un enlace disulfuro. Sin embargo, en el presente documento, se prefiere que la Cys, en particular, la Cys dada en la formula I, anteriormente, sea un aminoacido de origen natural, preferentemente, la propia Cys.

Los expertos en la materia tambien reconoceran que uno o varios de los aminoacidos que forman el ciclotido que se va a emplear de acuerdo con la presente invencion se pueden modificar. Por consiguiente, cualquier aminoacido usado/definido en el presente documento tambien puede representar su forma modificada. Por ejemplo, un resto de alanina, como se usa en el presente documento, puede comprender un resto de alanina modificado. Dichas modificaciones pueden ser, entre otras, una metilacion o acilacion, o similares, por lo que dicha modificacion o aminoacido modificado es preferible siempre que el aminoacido asf modificado, y mas concretamente, el ciclotido que contenga dicho aminoacido asf modificado siga funcionalmente activo segun lo definido en el presente documento. Los respectivos ensayos para determinar si dicho ciclotido, es decir, un ciclotido que comprende uno o varios aminoacidos modificados, cumple este requisito, son bien conocidos por un experto en la materia, entre otros, segun lo descrito en el presente documento, particularmente, en la parte de ejemplos.

En el contexto de la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la presente invencion, tambien se pueden usar derivados de los ciclotidos de tipo kalata B no injertados desvelados tales como sales con acidos organicos e inorganicos fisiologicos como HCl, H2SO4, H3PO4, acido malico, acido fumarico, acido citronico, acido tartarico, acido acetico.

En particular, se contempla que los ciclotidos definidos en el presente documento, y los mutantes y las variantes de ciclotidos definidos en el presente documento (vease, por ejemplo, el artfculo (iii), supra) tienen al menos una de las funciones deseadas de acuerdo con la presente invencion, en particular, una de las funciones mencionadas en los artfculos (i) a (xii) que se presentan a continuacion. Esta/s funcion/es hacen que los ciclotidos y los mutantes/las variantes de ciclotidos sean ciclotidos inmunosupresores y mutantes/variantes de ciclotidos inmunosupresores de acuerdo con la presente invencion.

En un aspecto, los ciclotidos y los mutantes/las variantes de ciclotidos que se van a usar de acuerdo con la presente invencion y como se define en el presente documento

(i) son ciclotidos antiproliferativos, es decir, tienen un efecto antiproliferativo (dependiente de la dosis) sobre una o varias celulas inmunes, y/o suprimen/reducen la/s funcion/es efectora/s de una o varias celulas inmunes;

(ii) son capaces de inhibir, disminuir o bloquear la proliferacion de celulas inmunes (sin la acumulacion de celulas muertas);

(iii) previenen (el inicio de) la activacion y/o la proliferacion de celulas inmunes;

(iv) conducen a una inhibicion, reduccion o bloqueo de celulas inmunes proliferantes (sin acumulacion de celulas muertas);

(v) son capaces de desencadenar el reposo de las celulas inmunes (viables) (sin acumulacion de celulas muertas);

(vi) tienen un efecto citostatico sobre las celulas inmunes proliferantes, preferentemente, que carece de un efecto citotoxico;

(vii) reducen o suprimen una sobreactividad de las celulas inmunes;

(viii) son capaces de suprimir/reducir la secrecion/produccion de citocinas, en particular, de IL-2, IFN-gamma y/o TNF-alfa;

(ix) son capaces de suprimir/reducir la desgranulacion/citotoxicidad de las PBMC, en particular, de las PBMC

5 CD107a+ CD8+;

(x) son capaces de suprimir/reducir la expresion del receptor superficial de IL-2 CD25 (en las PBMC);

(xi) son capaces de actuar de manera similar a la ciclosporina A, Muromonab-CD3 y/o Basiliximab; y/o

(xii) no inducen un cambio en la senalizacion de Ca2+ y/o no inducen/aumentan la liberacion de Ca2+ a partir de celulas (animales).

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Se prefiere que las funciones de los ciclotidos definidos en el presente documento se cumplan en el contexto de un esquema de administracion citostatica. En el contexto de este esquema de administracion, los ciclotidos, en particular, kalata B1 o T20K, son capaces de funcionar sin la acumulacion de celulas muertas, es decir, sin un efecto citotoxico. Esto se aplica particularmente a las funciones ciclotfdicas definidas en los apartados (ii), (iv) y (v), supra.

El experto esta facilmente en posicion de probar si un ciclotido o mutante/variante de ciclotido dado puede funcionar de acuerdo con la presente invencion, por ejemplo, tiene una o mas de las funciones definidas en los apartados (i) a (xii), supra. Para este fin, el experto puede, por ejemplo, confiar en los ensayos descritos en los ejemplos adjuntos (por ejemplo, ejemplos 3 y 5, mas adelante) y en los ensayos respectivos para determinar los efectos antiproliferativos segun lo descrito en la tecnica (Gruendemann, Journal of Ethnopharmacology 136, 3, SI, 2011, 444-451).

Al confiar en los medios y metodos descritos en el presente documento y en su conocimiento general comun, el experto tambien se encuentra en posicion de identificar y aislar ciclotidos o mutantes/variantes de ciclotidos adecuados, por ejemplo, en/de un extracto (vegetal). De este modo, el experto puede ademas identificar y aislar ciclotidos/mutantes/variantes de ciclotidos que todavfa sean desconocidos que se puedan usar de acuerdo con la presente invencion. El uso de dichos ciclotidos recientemente identificados/aislados de acuerdo con la presente invencion tambien se contempla en el presente documento.

El ciclotido que se va a usar de acuerdo con la presente invencion es un ciclotido no injertado (nativo o natural), es decir, un ciclotido "per se" sin ningun otro compartimento (farmaceuticamente) activo. Se sabe en la tecnica que los ciclotidos pueden actuar como armazones para otros compartimentos (farmaceuticamente) activos, como otros peptidos terapeuticos (vease, por ejemplo, Gunasehera, citado anteriormente). Dichos ciclotidos injertados, es decir, ciclotidos que comprenden un compartimento adicional (farmaceuticamente) activo, no se deben usar en el contexto de la presente invencion. En particular, se sabe que los ciclotidos injertados son ciclotidos que tienen al menos un bucle completo entre dos restos de cistema que esta reemplazado por un compartimiento adicional (farmaceuticamente) activo. Esto se debe ver en contraste con los ciclotidos y los mutantes/las variantes de ciclotidos que se van a usar en el contexto de la presente invencion. Espedficamente, estos mutantes/variantes de ciclotidos estan mutados de modo que no se introduce ningun compartimento adicional (farmaceuticamente) activo. En principio, tambien es posible con respecto a estos mutantes/variantes peptfdicos que uno o mas bucles enteros entre dos restos de cistema esten reemplazados por (un tramo de) mas restos de aminoacidos, siempre que no se introduzca un compartimento (farmaceuticamente) activo adicional. El experto se encuentra facilmente en posicion de distinguir entre un ciclotido injertado y un ciclotido no injertado o un mutante/variante de ciclotido injertado y no injertado.

Se prefiere que las celulas inmunes a las que se hace referencia en los artmulos (i) a (xii), supra, pero tambien las celulas inmunes a las que se hace referencia en otra parte del presente documento, sean celulas inmunes primarias. Ademas, se prefiere que las celulas inmunes a las que se hace referencia en los artmulos (i) a (xii), supra, pero tambien las celulas inmunes a las que se hace referencia en otra parte del presente documento, sean celulas inmunes activadas y/o proliferantes. Tambien se prefiere que las celulas inmunes (primarias) (activadas y/o proliferantes) sean de origen humano, es decir, sean celulas inmunes humanas (primarias) (activadas y/o proliferantes). Los ejemplos particulares de celulas inmunes a las que se hace referencia en el presente documento son PBMC (primarias, activadas y/o proliferantes) y linfocitos, preferentemente, linfocitos T. De nuevo, se prefiere que estas PBMC y linfocitos T sean de origen humano, es decir, PBMC humanas y linfocitos T humanos. En un aspecto particular, las PBMC son PBMC CD107a+ CD8+.

En un aspecto adicional, en el presente documento, se desvela el uso de una molecula de acido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica la estructura principal de aminoacidos/secuencia de aminoacidos primaria de un ciclotido como el desvelado en el contexto de la presente invencion. Por ejemplo, dicha molecula de acido nucleico puede comprender una secuencia de nucleotidos como la representada en una cualquiera de SEQ ID NO: 11, 12, 15 y 16 o una secuencia de nucleotidos como la comprendida en una cualquiera de SEQ ID NO: 11, 12, 15 y 16, y que corresponde al ciclotido maduro o a una secuencia de nucleotidos que difiere de la misma debido a la degeneracion del codigo genetico.

Los significados de las expresiones "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y "secuencia/s de nucleotidos" y similares son bien conocidos en la tecnica y se usan, por consiguiente, en el contexto de la presente invencion.

Por ejemplo, cuando se usan a lo largo de la presente invencion, estas expresiones se refieren a todas las formas de secuencias de nucleotidos y/o secuencias/moleculas de acido nucleico naturales o generadas de forma recombinante, asf como a secuencias de nucleotidos y/o secuencias/moleculas de acidos nucleicos sintetizadas qmmicamente. Estas expresiones tambien abarcan analogos de acidos nucleicos y derivados de acidos nucleicos tales como, por ejemplo, ADN bloqueado, PNA, oligonucleotido tiofosfatos y ribooligonucleotidos sustituidos. Ademas, estas expresiones tambien se refieren a cualquier molecula que comprenda nucleotidos o analogos nucleotidicos.

Preferentemente, las expresiones "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y "secuencia/s de

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nucleotidos" y similares se refieren a acido desoxirribonucleico (ADN) o acido ribonucleico (ARN). La/s "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y "secuencia/s de nucleotidos" pueden prepararse mediante metodolog^a qmmica sintetica conocida por los expertos habituales en la materia, o mediante el uso de tecnologfa recombinante, o pueden aislarse a partir de fuentes naturales, o mediante una combinacion de los mismos. El ADN y ARN pueden comprender opcionalmente nucleotidos no naturales, y pueden ser monocatenarios o bicatenarios. La/s "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y "secuencia/s de nucleotidos" tambien se refieren a ADN y ARN sentido o antisentido, es decir, una secuencia de nucleotidos que es complementaria a una secuencia espedfica de nucleotidos en ADN y/o ARN.

Ademas, las expresiones "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y "secuencia/s de nucleotidos" y similares pueden referirse a ADN o ARN o tubridos de los mismos, o a cualquier modificacion de los mismos que se conozca en el estado de la tecnica (veanse, por ejemplo, los documentos US 5525711, US 4711955, US 5792608 o EP 302175 para ejemplos de modificaciones). Estas moleculas de la invencion pueden ser monocatenarias o bicatenarias, lineales o circulares, naturales o sinteticas, y sin limitacion de tamano. Por ejemplo, la/s "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y/o "secuencia/s de nucleotidos" pueden ser ADN genomico, ADNc, ARNm, ARN antisentido, ribozima o un ADN codificante de dichos ARN o quimeroplastos (Cole-Strauss, Science 1996 273 (5280) 1386-9). Pueden estar en forma de un plasmido, o de ADN o ARN vmco. La/s "molecula/s de acido nucleico", "secuencia/s de acido nucleico" y "secuencia/s de nucleotidos" y similares tambien pueden referirse a (un) oligonucleotido/s, en el/los que se incluyen cualquiera de las modificaciones del estado de la tecnica tales como fosfotioatos o acidos nucleicos peptfdicos (PNA).

Las moleculas de acido nucleico como se describen en el presente documento son particularmente utiles para producir un peptido dclico de la invencion, por ejemplo, mediante un metodo correspondiente desvelado en el presente documento.

La molecula de acido nucleico como se desvela en el presente documento y se describe en el presente documento puede estar comprendida en un vector.

Dicho vector puede ser un vector de clonacion o un vector de expresion, por ejemplo, un fago, plasmido, vector vmco o retrovmco. Los vectores retrovmcos pueden ser competentes en la replicacion o ser defectuosos en la replicacion. En este ultimo caso, la propagacion vmca, en general, solo ocurrira en el complemento de hospedador/celulas. La molecula de acido nucleico desvelada en el presente documento puede unirse a un determinado vector que contenga marcadores seleccionables para la propagacion en un hospedador. En general, se introduce un vector plasmfdico en un precipitado, tal como un precipitado de fosfato de calcio o precipitado de cloruro de rubidio, o en un complejo con un lfpido cargado o en grupos a base de carbono, tales como fulerenos. Si el vector fuera un virus, se puede empaquetar in vitro usando una estirpe celular de empaquetamiento apropiada antes de la aplicacion a las celulas hospedadoras.

Preferentemente, la molecula de acido nucleico desvelada se une operativamente a secuencias de control de la expresion (por ejemplo, dentro del vector desvelado en el presente documento), lo que permite la expresion en celulas procariotas o eucariotas o fracciones aisladas de las mismas. La expresion de dicho polinucleotido comprende la transcripcion de la molecula de acido nucleico, preferentemente, en un ARNm traducible. Los expertos en la materia conocen bien los elementos reguladores que garantizan la expresion en celulas eucariotas, preferentemente, las celulas de mairnfero. Por lo general, comprenden secuencias reguladoras que garantizan el inicio de la transcripcion y, opcionalmente, senales de poli-A que garantizan la terminacion de la transcripcion y la estabilizacion del producto de la transcripcion. Otros elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripcion, asf como de la traduccion. Los posibles elementos reguladores que permiten la expresion en celulas hospedadoras procariotas comprenden, por ejemplo, el promotor lac, trp o tac en E. coli, y son ejemplos de elementos reguladores que permiten la expresion en celulas hospedadoras eucariotas el promotor AOX1 o GAL1 en levadura o el promotor de CMV, SV40, RSV (virus del sarcoma de Rous), potenciador de CMV, potenciador de SV40 o un intron de globina en celulas de marnffero y otras celulas animales. Ademas de los elementos que son responsables del inicio de la transcripcion, dichos elementos reguladores tambien pueden comprender senales de terminacion de la transcripcion, tales como el sitio poli-A de SV40 o el sitio poli-A de tk, cadena abajo del polinucleotido. En este contexto, los vectores de expresion adecuados son conocidos en la tecnica, tales como el vector de expresion de ADNc de Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen), pSPORT1 (GIBCO BRL). Preferentemente, dicho vector es un vector de expresion y/o un vector de transferencia genica. Los vectores de expresion que proceden de virus tales como retrovirus, adenovirus, virus vaccinia, virus adenoasociados, virus del herpes o virus del papiloma bovino, se pueden usar para la administracion de los polinucleotidos o del vector de la invencion en una poblacion celular diana. Se pueden usar metodos bien conocidos por los expertos en la materia para construir un vector de acuerdo con la presente invencion; veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook, "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. y Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994). Como alternativa, los polinucleotidos y vectores desvelados se pueden reconstituir en liposomas para su administracion a celulas diana.

La expresion "fracciones aisladas de los mismos "se refiere a fracciones de celulas eucariotas o procariotas o tejidos que son capaces de transcribir o de transcribir y traducir ARN del vector. Dichas fracciones comprenden protemas que se requieren para la transcripcion de ARN o la transcripcion de ARN y la traduccion de dicho ARN en un

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polipeptido. Dichas fracciones aisladas pueden ser, por ejemplo, fracciones nucleares y citoplasmaticas de celulas eucariotas tales como reticulocitos. Los kits para transcribir y traducir ARN que abarcan dichas fracciones aisladas de celulas o tejidos estan disponibles en el mercado, por ejemplo, como reticulolizado TNT (Promega).

De nuevo, al igual que las moleculas de acido nucleico desveladas, tambien los vectores develados son particularmente utiles para producir un peptido dclico de la invencion, por ejemplo, mediante un metodo correspondiente desvelado en el presente documento.

En un aspecto adicional, en el presente documento, se desvela una celula hospedadora recombinante que comprende la molecula de acido nucleico y/o el vector como se desvela en el presente documento. En el contexto de este aspecto, la molecula de acido nucleico y/o el vector pueden usarse, entre otros, para disenar geneticamente celulas hospedadoras, por ejemplo, para expresar y aislar la cadena principal de aminoacidos/secuencia de aminoacidos primaria de los ciclotidos desvelados en la presente invencion.

Dicha celula hospedadora puede ser una celula procariota o eucariota; Vease supra. La molecula o vector de acido nucleico que esta presente en la celula hospedadora puede estar integrado en el genoma de la celula hospedadora o puede mantenerse extracromosomicamente.

La celula hospedadora puede ser cualquier celula procariota o eucariota, tal como una celula bacteriana, de insecto, fungica, vegetal, animal, de mairnfero o, preferentemente, humana. Las celulas fungicas preferidas son, por ejemplo, las del genero Saccharomyces, en particular, las de la especie S. cerevisiae, o las que pertenecen al grupo de hongos hifas, por ejemplo, varias cepas de la penicilina o aspergilla. El termino "procariota" pretende incluir todas las bacterias que pueden transformarse o transfectarse con una molecula de acido nucleico para la expresion de una cadena principal de aminoacidos/secuencia de aminoacidos primaria de los ciclotidos desvelados en el presente documento. Los hospedadores procariotas pueden incluir bacterias gram negativas, asf como gram positivas tales como, por ejemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens y Bacillus subtilis. Una molecula de acido nucleico que codifica una cadena principal de aminoacidos/secuencia de aminoacidos primaria de los ciclotidos dclicos desvelados en el presente documento puede usarse para transformar o transfectar un hospedador usando cualquiera de las tecnicas comunmente conocidas por los expertos en la materia. Los metodos para preparar genes unidos operativamente, fusionados, y expresarlos en celulas bacterianas o celulas animales son bien conocidos en la tecnica (Sambrook, supra). Las construcciones y los metodos geneticos descritos en el presente documento pueden usarse para la expresion de la cadena principal de aminoacidos/secuencia de aminoacidos primaria mencionada anteriormente en, por ejemplo, Hospedadores procariotas.

En general, los vectores de expresion que contienen secuencias promotoras que facilitan la transcripcion eficaz del polinucleotido insertado se usan en conexion con el hospedador. El vector de expresion normalmente contiene un origen de replicacion, un promotor y un terminador, asf como genes espedficos que son capaces de proporcionar seleccion fenotfpica de las celulas transformadas. Los hospedadores procariotas transformados pueden cultivarse en fermentadores y cultivarse de acuerdo con tecnicas conocidas en la materia para lograr un crecimiento celular optimo. Los peptidos expresados se pueden aislar luego del medio cultivado, lisados celulares o fracciones de la membrana celular. El aislamiento y la purificacion de los peptidos expresados de forma microbiana o de otro modo pueden realizarse mediante cualquier medio convencional tal como, por ejemplo, separaciones cromatograficas preparativas y separaciones inmunologicas tales como aquellas que implican el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales (Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y. (1994)).

De nuevo, al igual que las moleculas de acido nucleico y los vectores desvelados y descritos en el presente documento, tambien las celulas hospedadoras correspondientes son particularmente utiles para producir un ciclotido como se desvela en el presente documento, por ejemplo, mediante el metodo correspondiente desvelado en el presente documento.

El experto puede proporcionar facilmente, es decir, sintetizar, los ciclotidos que se van a usar de acuerdo con la presente invencion o aislarlos de, por ejemplo, extractos (por ejemplo, extractos biologicos como extractos de plantas, hongos, animales o microbios).

En particular, se pueden emplear enfoques de smtesis (bio)qmmica o generacion de ciclotidos a traves de tecnicas de recombinacion. Por ejemplo, un metodo de produccion de un ciclotido puede comprender las etapas de

a) (i) cultivar la celula hospedadora recombinante desvelada en el presente documento en condiciones tales que exprese la cadena principal de aminoacidos del ciclotido desvelado en el presente documento y recupere dicha cadena principal de aminoacidos; o

ii) sintetizar qmmicamente la cadena principal de aminoacidos del ciclotido desvelado en el presente documento; y

b) ciclar dicha cadena principal de aminoacido para formar el ciclotido desvelado en el presente documento.

Como se ha mencionado anteriormente, los peptidos lineales/cadenas principales de aminoacidos de los ciclotidos

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que se van a producir tambien se pueden producir mediante tecnicas de ingeniena recombinantes. Dichas tecnicas son bien conocidas en la materia (por ejemplo, Sambrook, supra). Como tambien se ha mencionado anteriormente, mediante este tipo de produccion de dichos peptidos lineales/cadenas principales de aminoacidos se pueden obtener determinadas ventajas de las moleculas de acidos nucleicos, los vectores y/o las celulas hospedadoras que se desvelan y/o describen en el presente documento. Las definiciones proporcionadas anteriormente se aplican en el presente documento, mutatis mutandis.

Se conocen en la tecnica varios enfoques de smtesis de peptidos y enfoques de smtesis particulares de peptidos dclicos, (por ejemplo, Williams, "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides", CRC-Press 1997; Benoiton: Chemistry of Peptide Synthesis. CRC-Press, 2005). El experto esta facilmente en posicion de aplicar el conocimiento de la tecnica anterior a los requisitos particulares del metodo desvelado para producir peptidos dclicos, Basandose en la ensenanza proporcionada en el presente documento.

En el presente documento, tambien se desvela el uso de un ciclotido obtenible u obtenido mediante los enfoques o metodo/s desvelados anteriormente de acuerdo con la divulgacion proporcionada en el presente documento.

Los terminos como "inmunosupresion", "supresion del sistema inmune" y "supresion/reduccion de la activacion o eficacia del sistema inmune" se usan en el presente documento de una manera comparable. El significado correspondiente es conocido en la tecnica, y los terminos se usan correspondientemente en el presente documento. En particular, estos terminos se refieren a la supresion o reduccion de uno o varios parametros del sistema inmune como, por ejemplo, celula/s inmune/s (activada/s y/o proliferante/s) como se define en el presente documento anteriormente.

De acuerdo con la presente divulgacion, uno o varios parametros del sistema inmune se pueden seleccionar del grupo que consiste en

(i) celulas inmunes (en particular, las definidas anteriormente en el presente documento), en particular, PBMC, mas en particular, linfocitos, incluso mas linfocitos T particulares;

(ii) una o varias funciones efectoras de celulas inmunes (en particular, de las definidas anteriormente en el presente documento);

(iii) citocinas, en particular, el nivel, la secrecion y/o la produccion de las mismas;

(iv) desgranulacion/citotoxicidad de celulas inmunes, en particular, de las PBMC CD107a+ CD8+; y

(v) expresion de (a) receptor superficial de citocinas (por ejemplo, receptor superficial de IL-2 cD25), en particular en PBMC.

Las citocinas de acuerdo con la presente invencion pueden ser IL-2, IFN-gamma y TNF-alfa, por lo que se prefiere IL-2.

"Supresion" o "reduccion", en el contexto de la presente invencion, significa particularmente que se reduce la respuesta de (defensa) del sistema inmune contra uno o varios antigenos/patogenos. En el contexto de la presente invencion, esto no solo se debe ver con respecto a un estado activado, es decir, el cuadro clmico, del sistema inmune, sino tambien con respecto al estado no activado, es decir normal, sano del sistema inmune. En este contexto, es evidente que, incluso en el estado normal y sano, el sistema inmune tiene un nivel basico de activacion debido a la lmea base comun de impacto de antigeno/patogeno.

De este modo, en una realizacion, la "supresion" del sistema inmune comienza desde un estado normal y sano del sistema inmune y, en otra realizacion, desde un estado activado y enfermo del sistema inmune.

En particular, se contempla en el contexto de la presente invencion que el sistema inmune, en particular, uno o mas parametros del mismo, se suprima/reduzca en al menos un 10%, preferentemente en al menos un 20%, mas preferentemente en al menos un 30 %, aun mas preferentemente en al menos un 50 %, aun mas preferentemente en al menos un 80 %, aun mas preferentemente en al menos un 90 %, aun mas preferentemente en al menos un 95 %, incluso mas preferentemente en al menos un 99 % y lo mas preferentemente en un 100 % del estado inicial del sistema inmune (que es un estado enfermo o no enfermo), en particular, de uno o mas parametros del mismo. En el presente documento, suprimir/reducir el sistema inmune significa, en particular, suprimir/reducir la proliferacion de las celulas inmunes. El experto esta facilmente en posicion de probar el grado de supresion del sistema inmune, por ejemplo, determinando la actividad proliferativa de las celulas inmunes o la fraccion de celulas inmunes activadas/proliferantes. Es mas, el experto esta facilmente en posicion de determinar para un farmaco inmunosupresor dado la CI50 para el/la respectivo/a efecto/actividad inmunosupresor/a.

Es evidente para el experto en la materia, de acuerdo con la presente invencion, que la composicion farmaceutica o el ciclotido desvelado puede administrarse en una dosis farmaceutica/terapeuticamente eficaz, lo que significa que se alcanza una cantidad farmaceutica/terapeuticamente eficaz del compuesto administrado. Preferentemente, una dosis farmaceutica/terapeuticamente eficaz se refiere a la cantidad del compuesto administrado (principio activo) que produce la mejona de los smtomas o una prolongacion de la supervivencia de un sujeto que puede ser determinada por un experto en la materia que realice pruebas de rutina.

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Cabe senalar que la pauta de dosificacion de los compuestos que se van a administrar de acuerdo con la presente invencion sera determinada por el medico tratante y los factores clmicos. Como se sabe en la tecnica medica, la dosis para un paciente cualquiera depende de diversos factores, incluyendo la talla del paciente, el area superficial corporal, la edad, el compuesto concreto que se vaya a administrar, el sexo, el tiempo y la via de administracion, el estado general de salud y otros farmacos que se esten administrando concurrentemente. Un experto en la materia conoce y es capaz de probar las dosis relevantes, los compuestos que se van a aplicar medicamente de acuerdo con la presente invencion que deben administrarse.

En el contexto de la composicion farmaceutica para el uso de acuerdo con la presente invencion, se preve particularmente que el ciclotido de tipo kalata B no injertado se administre de manera que se produzca una actividad/un efecto citostatico pero poco, preferentemente nada, citotoxico. Para este fin, el ciclotido puede, por ejemplo, administrarse de modo que se alcance una concentracion (en suero) en el intervalo de 1 a 50 pM, preferentemente, en el intervalo de 1 a 15 pM, mas preferentemente, en el intervalo de 3 a 10 pM, mas preferentemente, en una cantidad de 4 a 9 pM e incluso mas preferentemente en una cantidad de 5 a 9 pM. En particular, el ciclotido puede administrarse a traves de una determinada via de administracion y/o en una cantidad/dosis para alcanzar una concentracion (en suero) en el intervalo de 1 a 50 pM, preferentemente, en el intervalo de 1 a 15 pM, mas preferentemente, en el intervalo de 3 a 10 pM, todavfa mas preferentemente, en el intervalo de 4 a 9 y aun todavfa mas preferentemente en el intervalo de 5 a 9 pM.

Ademas, el ciclotido puede administrarse, por ejemplo, a una dosis en el intervalo de 0,1 a 15 mg/kg, preferentemente, en el intervalo de 0,1 a 12 mg/kg, mas preferentemente, en el intervalo de 1 a 12 mg/kg, mas preferentemente, en el intervalo de 1 a 10 mg/kg, mas preferentemente, en el intervalo de 5 a 10 mg/kg e incluso mas preferentemente, a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg.

La dosis puede administrarse una vez al dfa, mensualmente o preferentemente, semanalmente. El ciclotido se puede administrar en forma de 1 o mas dosis unicas; en particular, 1, 2, 3, 4 o 5 dosis unicas. El ciclotido puede, por ejemplo, administrarse por via intravenosa o intraperitoneal. Ejemplos no limitantes de esquemas de administracion particulares son 3 inyecciones intravenosas unicas de aproximadamente 10 mg/kg a intervalos semanales o una sola dosis intraperitoneal de aproximadamente 10 mg/kg. Otros esquemas de administracion posibles se describen a continuacion en el presente documento.

El experto esta facilmente en posicion de descubrir la via particular de administracion y la cantidad/dosis de un ciclotido dado que se debe aplicar para alcanzar una actividad citostatica, pero poca/ninguna actividad citotoxica.

En una realizacion espedfica, la composicion farmaceutica descrita en el presente documento puede comprender ademas uno o mas inmunosupresores adicionales. Preferentemente, este (estos) inmunosupresor/es adicional/es no forma/n parte de una forma injertada del ciclotido, sino que esta/n comprendido/s independientemente en la composicion farmaceutica. En otra realizacion espedfica, El/los inmunosupresor/es adicional/es se administra /n por separado. En otra realizacion espedfica, el ciclotido descrito en el presente documento se puede administrar junto con uno o mas inmunosupresores adicionales, es decir, antes, simultanea o posteriormente con respecto al/a los inmunosupresor/es adicional/es. Los ejemplos no limitantes de un inmunosupresor adicional se pueden seleccionar del grupo que consiste en ciclosporina A, Muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3®) y Basiliximab (Simulect®).

La composicion farmaceutica descrita en el presente documento tambien puede comprender uno o mas ciclotidos (proliferativas anti-celulas inmunes). De este modo, en una realizacion espedfica adicional, la composicion farmaceutica descrita en el presente documento puede comprender al menos dos, tres, cuatro o cinco ciclotidos como los descritos en el presente documento. En una realizacion espedfica adicional, uno de los ciclotidos descritos en el presente documento debe administrarse junto con, es decir, antes de, simultaneamente con, o posteriormente a, otro, diferente, de los ciclotidos descritos en el presente documento.

En una realizacion, la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la presente invencion puede comprender, o estar en forma de, un extracto (nativo), en particular, un extracto vegetal (nativo).

Los ejemplos no limitantes de plantas a partir de las que se puede obtener dicho extracto son Betula pendula, Oldenlandia affinis, plantas de la familia Violaceae (por ejemplo, Viola sp., preferentemente, V. odorata y V. tricolor), especies de las calabazas (familia Cucurbitaceae), especies de Ecballium, especies de leguminosas (familia Fabaceae) y especies de Psychotria (familia Rubiaceae; por ejemplo Psychotria polyphlebia, P. poeppigiana, P. chiapensis, P. borucana, P. buchtienii, P. pillosa, P. mortomiana, P. deflexa, P. makrophylla, P. elata, P. solitudinum, P. capitata).

En el presente documento, se describe (una composicion farmaceutica que comprende), un ciclotido para su uso en la supresion inmune o un metodo para la supresion inmune mediante la administracion de (una composicion farmaceutica que comprende) un ciclotido. En otro aspecto, en el presente documento, se describe (una composicion farmaceutica que comprende) un ciclotido para su uso en el tratamiento o en la prevencion de una

enfermedad o trastorno y un metodo para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno, estando dicha enfermedad o dicho trastorno causado por la actividad del sistema inmune, es decir, una enfermedad o un trastorno que puede tratarse, prevenirse o mejorarse mediante inmunosupresion. En este contexto, no solo se preve la supresion de un sistema inmune demasiado activo a un nivel inferior, por ejemplo, un nivel normal no enfermo, sino tambien la 5 supresion de un sistema inmune normal de estado sano. Esto ultimo es, por ejemplo, particularmente relevante con respecto a los enfoques de trasplante de organos. El experto conoce, o al menos puede probar, determinadas enfermedades que pueden tratarse o prevenirse suprimiendo el sistema inmune. Se dan ejemplos de dichas enfermedades o trastornos en Kumar ("Clinical Medicine", 3a edicion (1994), Bailliere Tindall).

10 En particular, la enfermedad o el trastorno que se va a tratar o prevenir de acuerdo con la presente invencion se selecciona del grupo que consiste en:

(i) trastornos autoinmunes; y

(ii) inflamaciones mediadas por celulas inmunes, en las que la celula inmune es un linfocito.

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El significado y el alcance de "trastorno autoinmune", "trastorno de hipersensibilidad" e "inflamacion mediada por celulas inmunes" se conocen en la tecnica y pueden, por ejemplo, deducirse de Kumar ("Clinical Medicine", 3a edicion, 1994, Bailliere Tindall).

20 Los ejemplos particulares de trastornos autoinmunes que se van a tratar o prevenir se seleccionan del grupo que

consiste en:

(i)

esclerosis multiple;

(ii)

psoriasis;

25 (iii)

lupus eritematoso sistemico;

(iv)

smdrome de Sjoegren;

(v)

artritis reumatoide (AR), en particular, AR grave:

(vi)

purpura trombocitopenica idiopatica;

(vii)

diabetes;

o CO

vasculitis; y

(ix)

enfermedad de Crohn.

Los ejemplos particulares de trastornos de hipersensibilidad que se van a tratar o prevenir como se describe en el presente documento son trastornos de injerto contra hospedador y dermatitis de contacto.

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Un ejemplo particular de una inflamacion mediada por celulas inmunes es una inflamacion mediada por linfocitos, en particular, una inflamacion mediada por linfocitos T. Los ejemplos particulares de inflamaciones mediadas por linfocitos que se van a tratar o prevenir son la queratoconjuntivitis seca y el smdrome del ojo seco (DES). La claridad corneal se necesita para una vision optima, y puede verse afectada gravemente por cualquier forma de inflamacion 40 de la cornea. Esto esta mediado por la infiltracion de los leucocitos y la formacion de vasos sangumeos patologicos a largo plazo. En general, cualquier inflamacion corneal que se produzca debe tratarse, en especial, si esta implicada la cornea central. Una vez que se establece una cicatriz corneal, la queratoplastia se vuelve necesaria para restablecer la transparencia corneal que es indispensable para una vision optima.

45 En una realizacion, se preve, en particular, que las enfermedades o los trastornos de un subgrupo de las enfermedades o trastornos definidos anteriormente (o en cualquier otra parte del presente documento) se traten/prevengan, comprendiendo dicho subgrupo de enfermedades o trastornos aquellas enfermedades o trastornos que

50 (i) vienen acompanados y/o estan causados por un sistema inmune (sobre)activado y/o uno o varios parametros

(sobre)activados/aumentados del sistema inmune o

(ii) que pueden tratarse/prevenirse mediante la supresion del sistema inmune (a partir de un estado (sobre)activado, enfermo o de un estado normal y sano). Dentro de este subgrupo, en particular, estan aquellas enfermedades/trastornos que deben tratarse/prevenirse que vienen y/o estan causados por celulas 55 inmunes (sobre)activadas o que pueden tratarse/prevenirse mediante la reduccion de la actividad

(proliferante) de la celulas inmunes.

Lo que se ha dicho con respecto al significado de "celulas inmunes" y "parametros/s del sistema inmune" en otra parte del presente documento tambien se aplica en el presente documento, mutatis mutandis.

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En otra realizacion, las celulas inmunes, en particular, la proliferacion de las mismas, se van a suprimir en el contexto del tratamiento/de la prevencion de la presente invencion. Preferentemente, dichas celulas inmunes son linfocitos T (primarios) activados y/o celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC). De nuevo, lo que se ha dicho con respecto al significado de "celulas inmunes" en otra parte del presente documento tambien se aplica en el 65 presente documento mutatis mutandis.

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En otra realizacion, uno o varios parametros del sistema inmune se suprimen/reducen en el contexto del tratamiento/de la prevencion de la presente invencion. Lo que se ha dicho con respecto al significado de "parametros/s del sistema inmune" en otra parte del presente documento tambien se aplica en el presente documento, mutatis mutandis.

En un aspecto espedfico, la enfermedad o el trastorno que se va a tratar/revenir de acuerdo con la presente invencion es una enfermedad o un trastorno mediado por una via de las citocinas, en particular, la via de IL-2 (a traves de CD25).

En otro aspecto espedfico, la enfermedad o el trastorno que se va a tratar/prevenir es una enfermedad o un trastorno

(i) que no puede tratarse o no debe tratarse mediante una induccion o aumento de la liberacion de Ca2+; y/o

(ii) que no aparece o no esta relacionado con un cambio en la senalizacion de Ca2+.

En otra realizacion espedfica, la enfermedad que se va a tratar/prevenir no es una enfermedad que pueda tratarse/prevenirse inhibiendo la actividad de la triptasa, es decir, es una enfermedad o un trastorno independiente de la triptasa.

Cada una o mas de las realizaciones/los aspectos anteriores se aplica/n particularmente a las enfermedades o a los trastornos definidos o ilustrados anteriormente (o en otra parte del documento), en particular, a las enfermedades o los trastornos definidos o ilustrados en los apartados (i) a (ii)) o (i) a (ix), supra. Mas concretamente, cada una o mas de las realizaciones/los aspectos anteriores se aplica/n a un subgrupo de estas enfermedades o estos trastornos.

Ademas de su cadena principal de aminoacidos, los ciclotidos que se van a usar de acuerdo con la invencion pueden comprender tambien (por ejemplo, unirse covalentemente a) uno o varios sustituyentes adicionales, como marcadores, anclajes (como anclajes de membrana proteica), etiquetas (como etiquetas HIS). El/los sustituyente/s se pueden unir de forma covalente o no covalente a los ciclotidos, y directamente o mediante enlaces. El experto en la materia esta facilmente en condiciones de encontrar enlaces apropiados para emplearlos en este contexto. Es mas, los expertos en la materia conocen los sustituyentes y los metodos apropiados para anadirlos a un ciclotido.

Los ejemplos de marcadores incluyen, entre otros, fluorocromos (como fluor-18, fluorescema, rodamina, Rojo Texas, etc.), enzimas (como la peroxidasa de rabano picante, p-galactosidasa, fosfatasa alcalina), radio/isotopos radioactivos (como 32P, 33P, 35S, 125I o 123I, 135l, 124I, 1lC, 150), biotina, digoxigenina, metales coloidales, compuestos qdmicos o bioluminiscentes (como dioxetanos, luminol o acridinios). Uno ejemplo no limitante de un marcador que puede unirse al ciclotido es un fluorocromo, como un fluorocromo FRET, por ejemplo, una variante de GFP, YFP o CFP (por ejemplo, GFP, YFP, CFP, eGFP, EYFP o ECFP). Hay disponibles una variedad de tecnicas para marcar biomoleculas, y comprenden, entre otras, el acoplamiento covalente de enzimas o grupos biotinilo, fosforilaciones, biotinilaciones, cebado aleatorio, traducciones de mellas, rastreos (usando transferasas terminales). Dichas tecnicas se describen, por ejemplo, en Tijssen, "Practice and theory of enzyme immunoassays", Burden and von Knippenburg (Eds), Volumen l5 (1985); "Basic methods in molecular biology", Davis L. G., Dibmer M. D., Battey Elsevier (1990); Mayer, (Eds) "Immunochemical methods in cell and molecular biology" Academic Press, Londres (1987); o en la serie "Methods in Enzymology", Academic Press, Inc. Los metodos de deteccion correspondientes comprenden, pero sin limitacion, autorradiograffa, microscopia de fluorescencia, reacciones enzimaticas directas e indirectas, etc.

Los ciclotidos como los descritos y definidos en el presente documento, en particular, los ciclotidos marcados descritos anteriormente pueden emplearse en estudios de biodistribucion, es decir, estudios resultantes en un patron de distribucion del ciclotido, por ejemplo, en un animal o, preferentemente, un sujeto/paciente humano. Por ejemplo, dichos estudios de biodistribucion pueden comprender generacion de imagenes mediante dispositivos de formacion de imagenes de foton unico o PET.

La administracion de la composicion farmaceutica o el/los ciclotido/s de acuerdo con la presente invencion se puede efectuar por diferentes vfas. Dichas vfas pueden ser, por ejemplo, oral, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intravesical o subcutanea, o administracion por inhalacion, asf como administracion transdermica. Otros ejemplos son administracion parenteral, tal como subcutanea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, inyeccion intratecal, transdermica, transmucosal, subdural transpulmonar, administraciones locales o topicas y administraciones mediante iontoferesis, administraciones sublinguales, administraciones mediante pulverizacion por inhalacion, o administracion en aerosol o rectal, y similares.

En particular, para pacientes y/o para su usos medicos particulares, pueden estar indicadas vfas de administracion particulares como la infusion sangumea (por ejemplo, infusion intravenosa), administracion rectal (por ejemplo, en forma de enemas o supositorios) o las vfas de administracion topica (en particular, cuando se deben tratar enfermedades oculares como el smdrome del ojo seco).

Un vehfculo opcionalmente comprendido en la composicion farmaceutica de la invencion o que se administrara junto con la composicion farmaceutica o el ciclotido de la invencion puede ser, en particular, un vehfculo, excipiente o

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diluyente farmaceuticamente aceptable.

Dichos vehfculos son bien conocidos en la tecnica. El experto en la materia esta facilmente en condiciones de descubrir dichos vehnculos que son particularmente adecuados para emplearlos de acuerdo con la presente invencion.

Los vehnculos/excipientes farmaceuticamente aceptables que pueden usarse en la formulacion de las composiciones farmaceuticas que comprenden los compuestos activos definidos en el presente documento (o una sal de los mismos), en general, pueden comprender portadores, vehfculos, diluyentes, disolventes tales como alcoholes monohndricos tales como etanol, isopropanol y alcoholes polihfdricos tales como glicoles y aceites comestibles tales como aceite de soja, aceite de coco, aceite de oliva, aceite de cartamo, aceite de semilla de algodon, esteres oleosos tales como oleato de etilo, miristato de isopropilo; aglutinantes, adyuvantes, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizantes, disgregantes, emolientes, agentes lubricantes, agentes tamponadores, emulsionantes, agentes humectantes, agentes de suspension, agentes edulcorantes, colorantes, aromas, agentes de recubrimiento, conservantes, antioxidantes, agente de procesamiento, modificadores de la administracion de farmacos y potenciadores como fosfato de calcio, estearato de magnesio, talco, monosacaridos, disacaridos, almidon, gelatina, celulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica, dextrosa, hidroxipropil-p-ciclodextrina, polivinilpirrolidona, cera de bajo punto de fusion, resinas de intercambio ionico. Los vehfculos/excipientes farmaceuticamente aceptables adecuados se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1991).

A continuacion, se describen varios esquemas de administracion no limitantes y el uso de vehfculos farmaceuticamente aceptables correspondientemente adecuados.

Para una administracion de la composicion farmaceutica o los ciclotidos de acuerdo con la presente invencion por inyeccion subcutanea (s.c.) o intravenosa (i.v.)/intraarterial (i.a.), los ciclotidos (o secuencias codificantes) se pueden formular en solucion acuosa, preferentemente, en tampones fisiologicamente compatibles tales como solucion de Hanks, solucion de Ringer o tampon salino fisiologico. Para la administracion transmucosa y transpulmonar, se usan en la formulacion agentes penetrantes adecuados para la barrera que va a atravesarse. Dichos penetrantes se conocen en general en la tecnica.

El uso de vehfculos farmaceuticamente aceptables para formular los ciclotidos en formulaciones o composiciones farmaceuticas adecuadas para la administracion sistemica, es decir, intravenosa/intraarterial o subcutanea, esta dentro del alcance de la presente invencion. Con la eleccion adecuada del vehfculo y la practica de fabricacion adecuada, las composiciones de la presente invencion, en particular, las formuladas como soluciones, se pueden administrar por via parenteral, tal como mediante inyeccion intravenosa. Los compuestos pueden formularse facilmente usando vehfculos farmaceuticamente aceptables bien conocidos en la tecnica a dosis adecuadas para la administracion subcutanea u oral. Dichos vehfculos permiten que los compuestos de acuerdo con la presente invencion se formulen en forma de comprimidos, pfldoras, capsulas, grageas, lfquidos, geles, jarabes, suspensiones acuosas, suspensiones y similares, para su ingestion oral por un sujeto que se va a tratar.

Los compuestos desvelados y descritos en el contexto de la presente invencion, o los medicamentos o las composiciones farmaceuticas que los comprenden, destinados a administrarse intracorporal/intracelularmente pueden administrarse usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, dichos agentes pueden encapsularse en liposomas, luego administrarse como se ha descrito anteriormente. Los liposomas son bicapas lipfdicas esfericas con interiores acuosos. Todas las moleculas presentes en una solucion acuosa en el momento de la formacion del liposoma se incorporan al interior acuoso. Los contenidos liposomicos estan protegidos del microambiente externo y, debido a que los liposomas se fusionan con las membranas celulares, se administran eficazmente cerca de la superficie de la celula. En la patente de EE.UU. n.° 4.880.635 de Janoff et al., se desvelan sistemas de administracion que incluyen liposomas. Las publicaciones y patentes proporcionan descripciones utiles de tecnicas para la administracion de farmacos liposomicos.

Las composiciones farmaceuticas que comprenden un compuesto como el desvelado o descrito en el contexto de la presente invencion para la administracion parenteral y/o subcutanea incluyen soluciones acuosas del/de los compuesto/s activo/s en forma hidrosoluble. Ademas, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos en forma de suspensiones oleosas para inyeccion adecuadas. Los disolventes o vehfculos lipofilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sesamo o aceite de ricino, o esteres de acidos grasos sinteticos, tales como oleato de etilo o trigliceridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyeccion pueden contener compuestos que aumenten la viscosidad de la suspension, tales como carboximetilcelulosa sodica, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, La suspension tambien puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparacion de soluciones muy concentradas y para permitir una liberacion constantemente lenta de la sustancia en el organismo.

Un "pacienteVsujeto" para los fines de la presente invencion, es decir, a quien se le va a administrar una composicion farmaceutica o un ciclotido de acuerdo con la presente invencion o que padece la enfermedad o el trastorno definido o descrito en el presente documento, incluye tanto seres humanos como animales y otros organismos. Por lo tanto, las composiciones de la presente invencion son aplicables al, o estan en conexion tanto

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con, el tratamiento humano como aplicaciones tratamiento/prevencion. En la realizacion preferida, preferida, el paciente/sujeto es un ser humano.

Se desvela ademas en el presente documento inmunosupresor que comprende la etapa de

i) poner en contacto un ciclotido o un extracto (vegetal) que contiene un ciclotido con (una muestra de) una celula (activada) del sistema inmune; y determinar la actividad proliferativa de dicha celula,

en el que una actividad proliferativa suprimida o reducida (en comparacion con un control) es indicativo de la actividad inmunosupresora del ciclotido; o

ii) administrar a un modelo animal una cantidad farmaceuticamente eficaz de un ciclotido o un extracto (vegetal) que contenga un ciclotido; y determinar el (uno o varios parametros del) sistema inmune o uno o varios signos clmicos/la presencia de una enfermedad o de un trastorno segun lo definido en el presente documento,

en el que la supresion o reduccion (de los parametros) del sistema inmune o la disminucion del/de los signo/s clmico/s/mejona de la enfermedad o del trastorno (en comparacion con un control) es indicativo de la actividad inmunosupresora del ciclotido.

El metodo de exploracion y/o seleccion puede comprender ademas la etapa de aislar y/o identificar el ciclotido inmunosupresor (procedente del extracto (vegetal)). Por ejemplo, dicha etapa de aislamiento y/o identificacion puede comprender (nano) reconstruccion de LC-MS/MS o de LC-MS, preferentemente, una combinacion de ambas, (nano) reconstruccion de LC-MS/MS y de LC-MS. Opcionalmente, dicha etapa puede comprender ademas la busqueda en bases de datos (automatica) y/o la secuenciacion manual de peptidos de novo asignando iones de fragmentos b e y de espectros de MS/MS.

Es mas, el metodo de exploracion y/o seleccion puede comprender ademas una etapa de determinacion del patron de biodistribucion del ciclotido inmunosupresor (aislado y/o identificado) en (una muestra de) un sujeto humano o animal. Los ejemplos de tecnicas de biodistribucion correspondientes se han descrito en el presente documento anteriormente.

Un control adecuado del metodo desvelado en el presente documento para explorar y/o seleccionar un ciclotido inmunosupresor puede ser (una muestra de) una celula (activada) del sistema inmune que

(i) no se haya puesto en contacto con el ciclotido o el extracto (vegetal) que contiene un ciclotido; o

(ii) se haya puesto en contacto con un ciclotido que no tenga actividad inmunosupresora.

Otro control adecuado del metodo desvelado en el presente documento para explorar y/o seleccionar un ciclotido inmunosupresor puede ser un modelo animal al que

(i) no se haya administrado dicho ciclotido o extracto (vegetal) que contiene un ciclotido; o

(ii) se haya administrado un ciclotido que no tenga actividad inmunosupresora (a una cantidad comparable o la

misma cantidad).

Se desvela ademas en el presente documento un metodo de exploracion y/o seleccion de una mutacion que, cuando se introduce en un ciclotido, da lugar a un ciclotido mutado que tiene una actividad inmunosupresora inducida o potenciada en comparacion con el ciclotido no mutado, comprendiendo dicho metodo las etapas de

(i) introducir una mutacion en un ciclotido; y

(ii) poner en contacto el ciclotido asf mutado con (una muestra de) una celula (activada) del sistema inmune; y determinar la actividad proliferativa de dicha celula, en el que una actividad proliferativa reducida en comparacion con un control indica que la mutacion confiere actividad inmunosupresora (potenciada) al ciclotido; o administrar a un modelo animal una cantidad farmaceuticamente eficaz del ciclotido asf mutado; y determinar el (uno o varios parametros del) sistema inmune o uno o varios signos clmicos/la presencia de una enfermedad o de un trastorno segun lo definido en el presente documento, en el que la supresion o reduccion (de los parametros) del sistema inmune o la disminucion del/de los signo/s clmico/s/mejona de la afeccion/del trastorno en comparacion con un control confiere actividad inmunosupresora (potenciada) al ciclotido.

Un control adecuado del metodo desvelado en el presente documento para explorar y/o seleccionar una mutacion puede ser (una muestra de) una celula (activada) del sistema inmune que

(i) no se haya puesto en contacto con el ciclotido mutado; o

(ii) se haya puesto en contacto con la forma no mutada del ciclotido o con un ciclotido que no tenga actividad inmunosupresora.

Otro control adecuado del metodo desvelado en el presente documento para explorar y/o seleccionar una mutacion

veterinarias que incluyen procedimientos y metodos de el paciente/sujeto es un mairnfero, y en la realizacion mas

un metodo de exploracion y/o seleccion de un ciclotido

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puede ser un modelo animal al que

(i) no se haya administrado dicho ciclotido mutado; o

(ii) se haya administrado la forma no mutada del ciclotido o un ciclotido que no tenga actividad inmunosupresora.

Los ejemplos no limitantes de ciclotidos que no tienen actividad inmunosupresora se seleccionan del grupo que consiste en los mutantes Kalata B1 T8K, V10A y V10K segun lo desvelado en el presente documento.

La supresion o reduccion de la actividad proliferativa, (el/los parametro/s de) el sistema inmune o la disminucion del/de los signo/s clmico/s/mejona de la afeccion/del trastorno en comparacion con un control significa preferentemente una supresion o reduccion en al menos un 20 %, mas preferentemente en al menos un 30 %, mas preferentemente en al menos un 40 %, mas preferentemente en al menos un 50 %, mas preferentemente en al menos un 60 %, mas preferentemente en al menos un 70 %, mas preferentemente en al menos un 80 %, mas preferentemente, al menos en un 90 % y lo mas preferentemente, al menos en un 95 % en comparacion con un control.

Se desvela ademas en el presente documento un metodo para producir un ciclotido inmunosupresor que comprende la etapa de introducir una mutacion rastreada y/o seleccionada de acuerdo con el metodo anterior en un ciclotido.

En general, "mutacion" en el contexto de la presente invencion significa cualquier cambio en la estructura del ciclotido (nativo o de tipo silvestre), en particular, en la secuencia de aminoacidos primaria de la misma. Mas concretamente, "mutacion" significa que uno o mas restos de aminoacidos del ciclotido (nativo o de tipo silvestre) se reemplazan, sustituyen o anaden. En un aspecto espedfico, "mutacion" se refiere a una mutacion puntual, es decir, al reemplazo, la sustitucion o la adicion de un resto de aminoacido. En un aspecto mas espedfico, "mutacion" se refiere al reemplazo de un resto de aminoacido. Lo que se ha dicho con respecto a las formas mutadas/variantes que se usaran de acuerdo con la presente invencion en otra parte del presente documento tambien se aplica al significado del termino "mutacion", mutatis mutandis.

Si no se especifica de manera diferente, "induccion", "inducir" o "inducido", en el contexto de la presente invencion, significa partir de un valor inicial que es casi cero. "Aumento'V'aumentar" o "potenciarVpotenciado/a" no significan necesariamente comenzar desde un valor inicial de casi cero, sino que tambien puede significar comenzar desde un nivel que ya este por encima de cero. Por ejemplo, una actividad inmunosupresora inducida se refiere a cuando inicialmente no hubo actividad inmunosupresora en absoluto; una actividad inmunosupresora potenciada/aumentada se refiere a cuando inicialmente ya existfa alguna actividad inmunosupresora que luego se potencio/aumento.

Un modelo animal preferido para su aplicacion en el contexto del metodo de exploracion y/o seleccion desvelado en el presente documento es un modelo animal para una cualquiera de las enfermedades o trastornos definidos en el presente documento. Los modelos animales correspondientes son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, dicho modelo animal puede ser un modelo animal para una enfermedad autoinmune, como, por ejemplo, eM. Un ejemplo no limitante para un modelo animal de EM es un modelo animal de EAE, por ejemplo, un modelo de raton de eAe. Otro ejemplo de un modelo animal que se puede aplicar en este contexto es un modelo (raton, rata y similar) para el smdrome del ojo seco (DES), como, por ejemplo, un modelo para DES que usa ratas Fisher y/o Lewis.

El uso de dichos modelos animales en el contexto de los metodos de exploracion/seleccion desvelados en el presente documento se describe con mas detalle en el siguiente ejemplo no limitante.

La claridad corneal se necesita para una vision optima, y puede verse afectada gravemente por cualquier forma de inflamacion de la cornea. Esto esta mediado por la infiltracion de los leucocitos y la formacion de vasos sangumeos patologicos a largo plazo. Independientemente de las razones, cualquier inflamacion corneal que se produzca debe tratarse, en especial, si esta implicada la cornea central. Una vez que se establece una cicatriz corneal, la queratoplastia se vuelve necesaria para restablecer la transparencia corneal que es indispensable para una vision optima. Se puede realizar un trasplante corneal ortotopico entre las ratas Fisher y Lewis. Las ratas receptoras pueden tratarse con un control o con el componente (es decir, ciclotido) de interes. El tratamiento puede administrarse por via intraperitoneal (u otro metodo descrito anteriormente) durante, por ejemplo, 14 dfas. Todos los tratamientos pueden controlarse en un entorno singenico. Los injertos de cornea pueden repararse con ocho suturas interrumpidas y protegerse con una blefarorrafia durante los 3 dfas iniciales posteriores al trasplante. Tras la extirpacion de la blefarorrafia, los injertos pueden ser examinados por dos investigadores independientes para detectar los signos de opacidad, vascularizacion y edema de acuerdo con una puntuacion aceptada internacionalmente. La opacidad del injerto se puede puntuar de la siguiente manera: 0 = sin opacidad; 1 = ligera opacidad, detalles del iris claramente visibles; 2 = opacidad moderada, algunos detalles del iris ya no son visibles; 3 = fuerte opacidad, pupila aun reconocible; 4 = opacidad total. El rechazo se puede definir como la opacidad completa del injerto (grado 4). Ademas, todos los animales pueden controlarse diariamente para detectar signos de efectos secundarios toxicos, tales como la perdida de peso. Las ratas pueden sacrificarse por la caracterizacion histologica del infiltrado leucocitario en el injerto. Ademas, se pueden preparar los ganglios linfaticos submandibulares drenantes y no drenantes, asf como el bazo para el analisis de citometna de flujo de la activacion de los linfocitos T y la apoptosis de los linfocitos T. Finalmente, se puede determinar la fuerza inducida sistemicamente de la respuesta de los linfocitos T mediante una reaccion de leucocitos mixtos en ambos ganglios mencionados.

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El experto en la materia esta en posicion de aplicar y adaptar el uso ilustrativo descrito de un modelo de DES tambien a otros modelos animales de cualquiera de las enfermedades o trastornos definidos en el presente documento.

En un aspecto espedfico, (una muestra de) una celula (activada) del sistema inmune se puede ver como un "modelo animal" de acuerdo con la presente descripcion.

Se preve particularmente que el ciclotido que se va a explorar/seleccionar sea un ciclotido como se define en el presente documento. Las respectivas definiciones se aplican en el presente documento mutatis mutandis.

En el contexto de los metodos de exploracion/seleccion desvelados en el presente documento, la celula (activada) o el parametro del sistema inmune puede ser una celula inmune o un parametro del sistema inmune como se define y se describe en otra parte del presente documento. Las respectivas definiciones tambien se aplican en el presente documento, mutatis mutandis.

Una "muestra" adecuada de acuerdo con la presente descripcion incluye, aunque sin limitacion, una o varias muestras biologicas o medicas, como, por ejemplo, una o varias muestras que comprenden celula/s o tejido/s. Por ejemplo, Dichas una o varias muestras pueden comprender material biologico de biopsias. El significado de "biopsias" es conocido en la tecnica. Por ejemplo, las biopsias comprenden la/s celula/s o tejido/s tomado/s, por ejemplo, por el medico responsable, de un paciente/sujeto como se describe en el presente documento. De manera ilustrativa, pero sin limitaciones, la muestra biologica o medica que se va a analizar en el contexto de la presente invencion es o se obtiene de sangre, plasma, globulos blancos, orina, semen, esputo, lfquido cefalorraqmdeo, linfa, o tejidos o celulas linfaticas, celulas musculares, celulas del corazon, celulas de venas o arterias, celulas nerviosas, celulas de la medula espinal, celulas del cerebro, celulas hepaticas, celulas renales, celulas del tracto intestinal, celulas del testfculo, celulas del tracto urogenital, celulas del colon, piel, hueso, medula osea, placenta, fluido amniotico, cabello, cabello y/o folfculos, celulas madre (embrionarias, neuronales y/u otras) o estirpes celulares primarias o inmortalizadas (linfocitos, macrofagos o estirpes celulares). Las "muestras" preferidas de acuerdo con la presente descripcion son las derivadas de sangre o plasma. La muestra biologica o medica definida en el presente documento tambien puede derivarse de biopsias, por ejemplo, biopsias derivadas de tejido cardfaco, venas o arterias.

En un aspecto de la composicion farmaceutica o de los metodos desvelados y descritos en el presente documento, el efecto antiproliferativo o la supresion/reduccion esta mediado de una manera dependiente de las citocinas, por ejemplo, de una manera dependiente de IL-2, IFN-gamma y/o TNF-alfa, y/o puede ser antagonizado por una citocina, por ejemplo, por IL-2.

En el presente documento, se desvela ademas un metodo para producir una composicion farmaceutica inmunosupresora que comprende la etapa de mezclar

(i) un ciclotido como se define en el presente documento; o

(ii) un ciclotido explorado, seleccionado, producido, aislado o identificado como se describe en el presente documento

con en un veldculo farmaceuticamente aceptable.

En el presente documento, se desvela ademas un ciclotido mutado que tiene actividad inmunosupresora y, en particular, un ciclotido mutado como se define y describe en el presente documento (por ejemplo, un ciclotido mutado que comprende una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 a 7 o un ciclotido que consiste en una forma ciclada de cabeza a cola de una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 3 a 7).

Ademas, en el presente documento, se desvela una composicion farmaceutica que comprende un ciclotido mutado que tiene actividad inmunosupresora y, opcionalmente, un veldculo, excipiente o diluyente farmaceuticamente aceptable. Tambien en este contexto, se preve, en particular, que el ciclotido mutado sea un ciclotido mutado como se define en el presente documento anteriormente.

La presente invencion se describe ademas por referencia a las siguientes figuras y ejemplos no limitantes.

Las Figuras muestran:

Figura 1. Diversidad de estructura y secuencia de los ciclotidos. Se muestra la estructura del ciclotido kalata B1 tfpico se muestra en un dibujo en blanco y negro. Las seis cistemas conservadas estan marcadas con numeros romanos, y se muestra la conectividad del disulfuro de nudo de cistema resultante ((Ci-Civ, Cii-Cv y Ciii-Cvi). La secuencia de aminoacidos y la conectividad del disulfuro de kalata B1 se muestran bajo el dibujo de la estructura. Los numeros (n) indican la longitud posible (en aminoacidos) de los bucles inter-cistema que comprenden todos los ciclotidos actualmente conocidos (de acuerdo con Ireland, 2010, J Nat Prod, 73, 1610-1622)). Los bucles inter-

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cistema pueden tolerar una amplia variedad de sustituciones de aminoacidos y son un indicador de la diversidad combinatoria del armazon ciclotidico. Las posiciones de las mutaciones sinteticas que se han introducido durante este estudio estan indicadas por el codigo de aminoacido de una letra, el numero y el asterisco. El punto natural de ciclacion esta indicado por una flecha.

Figura 2. Efectos del extracto de ciclotido de O. affinis en la proliferacion celular de celulas mononucleares de sangre periferica humanas activadas. Se activaron PBMC humanas primarias marcadas con CFSE con anticuerpos (anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28) y se cultivaron en presencia de medio (ctrl), camptotecina (CPT, 30 |jg/ml) o diferentes concentraciones (50-100 jg/ml) de extracto de ciclotido de O. affinis. Las celulas se analizaron ademas para determinar la viabilidad celular y la capacidad de proliferacion usando un analisis de citometna de flujo basado en la dispersion de flujo lateral directo (A y B). El analisis de division celular se evaluo mediante FACS y se ilustro como graficos de puntos representativos (C). Se resumen los resultados de tres experimentos independientes en (D) y los datos se presentan como la media ± ETM.

Figura 3. Cromatograma de nano LC-MS de ciclotidos de O. affinis. se controlo el perfil de elucion de nanoflujo de ciclotidos de O. affinis con la absorbancia UV a 214 nm y espectrometna de masas. Se muestra el grafico de HPLC de un extracto de ciclotido en bruto representativo, y sus ciclotidos principales se indican por el nombre y la abundancia relativa. Se determino el contenido relativo de ciclotido (media ± ETM) mediante la integracion maxima de cinco experimentos independientes (vease la Tabla 6). Las condiciones de HPLC y MS para el analisis de los ciclotidos se muestran en el apartado de Metodos.

Figura 4. Efectos de kalata B1 en la proliferacion celular de celulas mononucleares de sangre periferica humanas activadas. Se midio la influencia del medio (ctrl), de la camptotecina (CPT, 30 jg/ml) o de las diferentes concentraciones de kalata B1 (1,8-14 jM) sobre la proliferacion de PBMC primarias humanas activadas por anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28 CFSE+ mediante analisis de division celular usando citometna de flujo. Los datos se presentan como la media ± ETM de cuatro experimentos independientes.

Figura 5. Efectos de kalata B1 en la citotoxicidad de celulas mononucleares de sangre periferica humanas activadas. Se activaron PBMC primarias humanas con anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28 en presencia de medio (ctrl), camptotecina (CPT, 30 jg/ml), Triton-X 100 (T-x) o diferentes concentraciones de kalata B1 (1,8-14 jM) y se analizo el contenido de ADN "subG1" (A) mediante citometna de flujo. Se tineron las celulas con anexina V y yoduro de propidio (PI) para evaluar los porcentajes de celulas viables (anexina V'/PI'), apoptoticas (anexina V+/PI- o anexina V+/PI+) y necroticas (anexina V7PI+). Se analizaron los diagramas de puntos, y se muestran graficos representativos en (B). Se resumen los resultados de tres experimentos independientes, y los datos se presentan como la media ± ETM (C y D). nd = no detectable.

Figura 6. Alineacion estructural de kalata B1 y B2. Se alinearon estructuralmente las estructuras de solucion de RMN de kalata B1 (codigo PDB: 1NB1) y kalata B2 (1PT4) usando PyMol. La alineacion de todos los atomos (A) da lugar a una RMSD de 0,725 A (solo se resaltan en negrita los cinco restos diferentes, los restos restantes se muestran sin resaltar) y los atomos de la estructura (B) se ajustan a una RMSD de 0,599 A. Las secuencias de ambos ciclotidos se muestran debajo de las estructuras alineadas con los diferentes restos indicados por recuadros negros.

Figura 7. Determinacion de CI50 para el efecto antiproliferativo de Kalata B1 en PBMC. La CI50 de los efectos antiproliferativos de kalata B1 (vease la Figura 4) se ha determinado mediante analisis de regresion no lineal (inhibidor logantmico frente a la respuesta normalizada) usando GraphPad Prism.

Figura 8. Efectos de la melitina sobre la proliferacion celular y la citotoxicidad de las celulas mononucleares de sangre periferica humanas activadas. Se cultivaron linfocitos primarios humanos activados por anticuerpos (anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28) en presencia de medio (ctrl), camptotecina (CPT, 30 jg/ml), Triton-X 100 (T-x) o diferentes concentraciones de melitina (0,05-1,6 jM) para el analisis por citometna de flujo de la division celular (A), del contenido de ADN "subG1" (B) o del contenido de celulas apoptoticas (C) y necroticas (D). Para la deteccion apoptotica y necrotica, las celulas se tineron con anexina V y yoduro de propidio para evaluar los porcentajes de celulas viables (anexina V7PT), celulas apoptoticas (anexina V+/PI- o anexina V+/PI+) y necroticas (anexina V7PI+). Los datos se presentan como la media ± ETM de tres a cuatro experimentos independientes, n.d. = no detectable.

Figura 9. Efectos de mutantes ciclotidicos sobre la proliferacion celular de celulas mononucleares de sangre periferica humanas activadas (PBMC). Se midio la influencia de no activado (0), medio (ctrl), camptotecina (CPT, 30 jM), ciclosporina A (CsA, 1 jg/ml) o de diferentes concentraciones de ciclotidos (1,8-14 jM) sobre la proliferacion de PBMC primarias humanas activadas por anticuerpos monoclonales anti-CD3/CD28 CFSE+ (100 ng/ml de cada) mediante analisis de division celular usando citometna de flujo. Los datos se representan como la media + DT de al menos dos donantes y experimentos independientes. Los mutantes de ciclotido G18K, N29K y T20K muestran capacidad antiproliferativa. T20K + G1K es citotoxico a 14 jM. Los controles son similares en cada diagrama de barras. Los resultados con las celulas purificadas de CD3 estan de acuerdo con esos datos (vease la Tabla 2).

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Figura 10. Actividad de kalata B1 in vivo en la encefalomielitis autoinmune experimental en ratones. (A) Se

determino la puntuacion clmica de ratones con EAE tras la vacunacion con kalata B1 (lmea clara) o control de PBS (lmea negra) como se indica en el apartado de Materiales y Metodos. La vacunacion con el ciclotido produjo una reduccion en la incidencia y gravedad de la EAE. (B) Se examino la influencia de la vacunacion con kalata B1 en la formacion de lesiones inflamatorias y desmielinizantes del SNC mediante estudios histologicos de tejido fijado usando tincion con hemotoxilina/eosina, Luxol azul rapido y plata Bielshowsky. El SNC de todos los ratones tratados con PBS mostro lesiones inflamatorias, desmielinizacion y dano axonal que fueron particularmente llamativos en el cerebelo y en la medula espinal (indicados por flechas). La vacunacion con kalata B1 conduce a una reduccion tanto de los signos clmicos como de las lesiones histologicas de EAE. (C) La proliferacion de celulas del bazo en respuesta al gen de la encefalitis MOG35-55 y la estimulacion por los activadores policlonales, anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 muestra, independientemente del regimen de tratamiento, esplenocitos de todos los ratones vacunados proliferados a MOG, y estos esplenocitos mostraron fuertes respuestas proliferativas hacia los anticuerpos anti- CD3/CD28. (D) La supresion de la EAE por kalata B1 no se asocia con una supresion de la produccion de anticuerpos anti-MOG. Como se muestra, se detectaron anticuerpos anti-MOG en todos los sueros independientemente del regimen de vacunacion. (E, F) los linfocitos T reactivos con MOG en animales protegidos no cambiaron a un fenotipo de linfocito T antiinflamatorio. Se demostraron niveles significativamente reducidos de la quimiocina MIG (E) y TNFa (F) en sobrenadantes de celulas de bazo no estimuladas generados a partir de animales tratados con kalata Bl.

Figura 11. Expresion de la cadena alfa CD25 del receptor de IL-2 en PBMC tras el tratamiento con ciclotido.

Se trataron previamente las PBMC con ciclosporina A (CsA; 5 pg/ml) o diferentes ciclotidos (4 pM; T20K, V10A, V10K, T8K) y se cultivaron en presencia de medio (SC) o se estimularon con PHA-L (10 pg/ml; CTRL). El dfa 1 (A y B) o el dfa 2 (C y D) despues del cultivo, las celulas se tineron en la superficie con anticuerpo monoclonal anti-CD25 humano y se analizaron mediante citometna de flujo. Los resultados representativos se representaron como graficos de puntos (A y C) y los resultados de tres experimentos independientes se presentan como la media y desviacion tfpica (DT) de tres experimentos independientes. Los asteriscos representan diferencias significativas solo de las celulas estimuladas no tratadas. Los porcentajes indicados en los graficos de puntos representan las PBMC CD25+.

Figura 12. A. Secrecion de IL-2 a partir de PBMC activadas tratadas con ciclotido. Se trataron previamente las PBMC con ciclosporina A (CsA; 5 pg/ml) o un ciclotido (4 pM; T20K), y se cultivaron en presencia de medio (SC) o se estimularon con PHA-L (10 pg/ml; CTRL). 24 horas despues del cultivo, se volvieron a estimular las PBMC con PMA/lonomicina durante 6 horas mas. Despues, se midio la cantidad de IL-2 en el sobrenadante usando una tecnica de citometna de flujo basada en ELISA. Los datos se presentan como la media y la desviacion tfpica (DT) de tres experimentos independientes.

B. Liberacion de IL2 en linfocitos T humanos tras el tratamiento con ciclotido. Se sembraron linfocitos T humanos (proporcionados por A. Dohnal, PhD, de CCRI, Viena) 4 x 106/ml en placas de fondo plano de 96 pocillos (100 pl/pocillo) y se incubaron durante dos horas a 37 °C antes de que se estimularan con CsA (5 mg/ml), T20K (4 pM) and V10K (4 pM). Tras otras dos horas, se anadio PHA-L (10 pg/ml) a los pocillos apropiados y se incubo durante la noche a 37 °C. Al dfa siguiente, se volvieron a estimular los linfocitos T con lonomicina (500 ng/ml) y PMA (50 ng/ml) durante 6 horas a 37 °C. Las celulas se centrifugaron luego a 3.000 rpm durante 5 minutos para obtener sus sobrenadantes. Los sobrenadantes de los linfocitos T estimulados se analizaron para determinar su liberacion de IL2 usando un kit de ELISA de IL-2 humana de eBioscience de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reaccion de color se evaluo a una densidad optica de 450 nm mediante el lector de microplacas Synergy H4 (BioTek). La estimulacion con PHA-L de los linfocitos T humanos ilustro la liberacion mas alta de IL2, tambien la estimulacion con V10K y PMA + lonomicina lograron resultados comparables, mientras que las celulas no tratadas y tratadas con CsA no mostraron la produccion de esta citocina. Ademas, los linfocitos T incubados con el ciclotido T20K demostraron una inhibicion significativa de la proliferacion celular de acuerdo con el nivel de IL2.

C. Analisis de la expresion del gen IL-2 usando RT-PCR. Se aislo ARN celular total de celulas activadas con PHA-L que se incubaron con medio, CsA o T20K durante 4 horas. La RT-PCR se llevo a cabo usando cebadores espedficos para el gen indicado. Los datos se normalizaron con respecto al valor de Ct del ARNr 18s del gen constitutivo, y se uso el nivel relativo de ARNm en el grupo estimulado no tratado como calibrador. Los datos se expresaron como la media + DT de tres experimentos independientes.

Figura 13. Capacidad de proliferacion de PBMC tratadas con ciclotido en presencia de IL-2 exogena. Se

trataron previamente PBMC marcadas con CFSE con ciclosporina A (CsA; 5 pg/ml) o diferentes ciclotidos (4 pM; T20K, V10A, V10K, T8K) y se cultivaron en presencia de medio (SC) o se estimularon con PHA-L (10 pg/ml; CtRl). Las celulas se cultivaron sin IL-2 exogena (10 U/ml) (A y B) o en presencia de IL-2 (C y D). Las celulas marcadas con CFSE se midieron tras un penodo de cultivo de 3 dfas mediante citometna de flujo y los datos representativos se presentan en graficos de puntos (A y C). Los datos se presentan como la media y la desviacion tfpica (DT) de tres experimentos independientes.

Figura 14. Secrecion de IFN-y por PBMC tratadas con ciclotido. Se incubaron previamente PBMC purificadas con un ciclotido (4 pM; T20K) o ciclosporina A (CsA; 5 pg/ml), y se estimularon con PHA-L (10 pg/ml). Se usaron celulas sin tratar como controles. Tras 24 horas o 36 horas de cultivo, se volvieron a estimular las celulas con

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PMA/lonomicina durante 6 horas mas. Se midio la cantidad de IFN-y en el sobrenadante de celulas cultivadas usando un metodo de citometna de flujo basado en ELISA. Los datos se presentan como la media y la desviacion tipica (DT) de tres experimentos independientes.

Figura 15. Secrecion de TNF-alfa por PBMC tratadas con ciclotido. Se incubaron previamente PBMC purificadas con un ciclotido (4 jM; T20K) o ciclosporina A (CsA; 5 |jg/ml), y se estimularon con PHA-L (10 jg/ml). Se usaron celulas sin tratar como controles. Tras 24 h o 36 h de cultivo, se volvieron a estimular las celulas con PMA/lonomicina durante 6 horas mas. Se midio la cantidad de TNF-alfa en el sobrenadante de celulas cultivadas usando un metodo de citometna de flujo basado en ELISA. Los datos se presentan como la media y la desviacion tipica (DT) de tres experimentos independientes.

Figura 16. Capacidad de desgranulacion de PBMC humanas activadas tratadas con ciclotido. Se trataron previamente las PBMC con ciclosporina A (CsA; 5 jg/ml) o un ciclotido (4 jM; T20K), y se cultivaron en presencia de medio (SC) o se estimularon con PHA-L (10 jg/ml; CTRL). Tras 36 horas de cultivo, se volvieron a estimular las celulas con PMA/lonomicina durante 2,5 horas en presencia de anticuerpos CD107a y reactivo GolgiStop para determinar la cantidad de desgranulacion mediante citometna de flujo. Los datos representativos se muestran en graficos de puntos (A ) y (B) y los datos se presentan como la media y la desviacion tfpica (DT) de tres experimentos independientes.

Figura 17. Liberacion de Ca2+ en celulas Jurkat y linfocitos T humanos. Se cargaron 1x106 celulas Jurkat (A) y los linfocitos T (B) con Fura-2 1 jM y Puronic F-127 al 0,02% durante 30 minutos a 37 °C. Las celulas se centrifugaron durante 5 minutos a 1.200 rpm y se volvieron a suspender en medio [RPMI 1640 con FCS al 10 %, penicilina (100 U/ml ) estreptomicina(100 U/ml)]. Se transfirieron 100 jl de suspension celular a una placa negra de 96 pocillos con un fondo plano transparente. En resumen, antes del analisis, se atempero a 37 °C el fluorometro Synergy H4 (BioTek). El curso del tiempo de fluorescencia se midio entonces con: extincion a 340/380 nm y emision a 510 nm en intervalos de 30 segundos, agitando continuamente. La afluencia de Ca2+ se inicio al anadir compuestos a las celulas (ilustrado por la flecha). Para recibir la liberacion maxima de Ca2+, se estimularon las celulas con PMA (50 ng/ml) y lonomicina (500 ng/ml), y los linfocitos T ademas con PHA-L (10 jg/ml). Para los niveles mas bajos de Ca2+, las celulas no se trataron. La estimulacion de CsA (5 mg/ml), T20K (4 jM) y V10K (4 jM) no indujo un cambio en la senalizacion de Ca2+ en las celulas Jurkat. Por el contrario, los linfocitos T primarios humanos demuestran una liberacion de Ca2+ creciente tras la incubacion con los ciclotidos T20K.

Figura 18. Esquema de inmunizacion (vease tambien el Ejemplo 14)

Figura 19. Efecto en la puntuacion clinica de la EAE. Tras la induccion de la EAE, se puntuaron los ratones tratados con T20K y los ratones sin tratamiento previo cada segundo dfa, comenzando el dfa 10. El grupo no tratado previamente, que no recibio T20K, desarrollo el peor curso de la enfermedad, mientras que los ratones tratados con T20K mostraron smtomas tardfos y menores de EAE referidos al punto de tiempo de la inyeccion de ciclotidos. En especial, los ratones tratados siete dfas antes de la induccion de la EAE demuestran significativamente el efecto profilactico del mutante kalata B1 (de acuerdo con la prueba de comparacion multiple de Dunnett).

Figura 20. Efecto sobre el peso de ratones con EAE inducida. Se midio el peso de los ratones inmunizados el dfa (-7), 0, 7 y cada dfa ademas de la puntuacion. Los ratones que recibieron inyecciones de ciclotidos al dfa (-7) aumentaron de peso en los dfas siguientes. Mientras que los ratones no tratados o ratones que se trataron el dfa 7 permanecieron constantes o incluso perdieron peso corporal de acuerdo con el curso de la enfermedad. Aproximadamente el dfa 20, la EAE en estos dos grupos mejoro y, por lo tanto, estos ratones recuperaron el peso corporal.

Figura 21. Efecto sobre la liberacion de citocinas de PBMC aisladas ex vivo el dia 3. Se aislaron esplenocitos de ratones sacrificados y se volvieron a estimular con MOG35-55 (30 jg/ml) durante tres dfas o se dejaron sin tratar. Los sobrenadantes de estas celulas se usaron para analizar la liberacion de citocinas en los ELISA. En (A), la liberacion de interleucina 2 fue mayor en los linfocitos T esplenicos aislados del grupo de ratones sin tratamiento previo que en los que se volvieron a estimular con MOG, en correlacion con el curso de la enfermedad. En los ratones tratados con T20K (7), la liberacion de IL2 fue menor que en el grupo sin tratamiento previo tras la estimulacion con MOG. Los esplenocitos de ratones previamente tratados (T20K -7, 0) muestran una inhibicion significativa de la produccion de IL2 (de acuerdo con la prueba de comparacion multiple de Dunnett). Este efecto inhibidor tambien podna demostrarse hacia el citocinas IL17, IL22 e INF-y en linfocitos T de ratones tratados con T20K (-7, 0), aunque no significativamente (B-D). Casi no se detecto ninguna citocina IL4 (E), en oposicion a una respuesta inmune Th2, como era de esperar.

Figura 22. Efecto sobre la liberacion de citocinas de PBMC aisladas ex vivo en el dia 1 y 2. Se aislaron linfocitos T esplenicos del grupo de ratones no tratados previamente sacrificados, y se estimularon con T20K (4 jM) en diferentes momentos, con MOG35-55 (30 jg/ml), y, para propositos de control, con CsA (5 jg/ml) y V10K (4 jM), como se indica en el presente documento. La liberacion de IL2 se inhibe significativamente tras una incubacion de 48 h de las celulas con T20K, independientemente de los diferentes puntos de tiempo de la adicion de ciclotido.

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incluso tras 24 h, la inhibicion de IL2 no es significativa para el agente inmunosupresor CsA. Tambien V10K muestra una capacidad inhibidora hacia la liberacion de IL2 en los linfocitos T de raton tras 48 h de incubacion (A, B). La produccion de la citocina IL17 tambien es inhibida por T20K tras 48 h, en relacion con el punto de tiempo de la adicion del compuesto (C, D). Ademas, la liberacion de citocinas INF-y y IL22 se suprime de manera significativa, dependiendo de la adicion de ciclotido (E-H). Para aprobar este sesgo de Th de EAE hacia los linfocitos Th17 y Th1, se analizo de nuevo la liberacion de IL4, pero esta citocina Th2 no fue detectable (I, J), como ya se indico en (D).

Figura 23. Efecto de los ciclotidos en la expresion de proteina de NFATIc. Se incubaron linfocitos T humanos con CsA (5 pg/ml), T20K (4 pM) y V10K (4 pM) durante dos horas. Pero en lugar de estimular con PHA-L y PMA/ionomicina, se estimulo una parte de las celulas con PHA-L (10 pg/ml) y la otra con PMA (50 ng/ml)/ionomicina (500 ng/ml) durante una noche. La incubacion de CsA y T20K muestra una senal reducida de NFATcl en comparacion con las celulas estimuladas con V10K, PHA-L y PMA/lonomicina (A). los linfocitos T esplenicos aislados del grupo de ratones sin tratamiento previo se estimularon como se ha descrito anteriormente. Las celulas incubadas con los ciclotidos T20K demuestran una senal reducida de NFATcl en comparacion con las celulas incubadas con V10K y las celulas estimuladas con el antigeno natural MOG. Sin embargo, las celulas tratadas con el compuesto inmunosupresor CsA que tiene NFAcl como una diana molecular principal, muestran una senal potente (B).

Figura 24. Captacion celular de T20K. Se incubaron linfocitos T humanos con T20K 4 pM marcado con FITC para realizar microscopfa de fluorescencia. (A) demuestra una vision general de los linfocitos T con los ciclotidos T20K incorporados en su citosol. Parece que el peptido se encuentra principalmente alrededor de la membrana del nucleo, pero tambien en la membrana de los compartimentos vesiculares, como el aparato de Golgi o el retfculo endoplasmico (B, C). Por el contrario, la incubacion de celulas Jurkat (D) con el peptido marcado no mostro esta fluorescencia intracelular, en cambio, los ciclotidos solo tineron las celulas muertas.

Los ejemplos ilustran la invencion.

Ejemplo 1: Materiales y metodos

Preparacion de extraccion y purificacion de ciclotidos de plantas. Se cultivaron plantas de Oldenlandia affinis (R & S) DC en el invernadero del Departamento de Farmacognosia (Universidad de Viena) a partir de semillas que fueron obsequio de David Craik (Instituto de Biociencias Moleculares, Universidad de Queensland). Se cosecharon las partes aereas de las plantas y se secaron. Se pulverizo el material vegetal usando una trituradora de rotor y se extrajo dos veces durante una noche en diclorometano:metanol (1:1 v/v). Los extractos se concentraron en un rotavaporizador y se liofilizaron. Se disolvieron los extractos secos en disolvente A (ddH2O con TFA al 0,1 %) y se purificaron previamente en lote con extraccion en fase solida C-is (ZEOprep 60 A, C-is irregular 40-63 pm; ZEOCHEM, Uetikon, Suiza). Para separar los compuestos hidrofilos no ciclotidos de los compuestos hidrofobos ciclotidos, se lavaron las perlas C-is con disolvente B al 10 % (acetonitrilo al 90 % en ddH2O con TFA al 0,08 %) y se eluyeron con disolvente B al 80 %. Se analizo la fraccion eluida que contema ciclotidos por MALDI-TOF-MS y se reconstituyo en ddH2O a 10 mg/ml para los ensayos biologicos o se uso para el analisis nano LC-MS/MS y la posterior purificacion. Se purifico Kalata B1 del extracto en bruto de O. affinis mediante HPLC usando un sistema Perkin Elmer Serie 200 con columnas de HPLC RP-C18 preparativa (Phenomenex Jupiter, 10 pm, 300 A, 250 x 21,2 mm; 8 ml/min) y semipreparativa (Kromasil C18, 5 pm, 100 A, 250 x 10 mm; 3 ml/min) y gradientes lineales de 0-80 % de disolvente B en 80 min. Los peptidos de elucion se controlaron con absorbancia UV (A280), se recogieron manualmente y se liofilizaron. Se evaluaron la pureza y la calidad de kalata B1 mediante HPLC analttica y MALDI-TOF MS.

Analisis de Nano LC-MS y LC-MS/MS. Se analizaron extractos vegetales preparados o digeridos ZipTip™, en bruto, (extracto de O. affinis previamente purificado con C18, vease mas arriba) mediante nano LC-MS o LC-MS/MS en un sistema de nano HPLC Ultimate 3000 controlado por el software Chromeleon 6.8 (Dionex, Amsterdam, Pafses Bajos). Para el analisis de LC, se inyectaron muestras de extracto de O. affinis (1-5 pl), se concentraron previamente usando cartuchos Dionex PepMap™ C18 (300 pm x 5 mm, 5 pm, 100 A) y se separaron mediante nano-RP-HPLC antes del analisis en lmea de MS usando una columna Dionex Acclaim PepMap™ C18 (150 mm) x 75 pm, 3 pm, 100A; 300 nl/min). La fase movil consistio en disolvente C (acido formico acuoso al 0,1 %) y disolvente D (acetonitrilo/acido formico acuoso al 0,08 % 90/10). Los peptidos se eluyeron usando un gradiente lineal de D al 490 % en 35 min, retencion de 5 min a D al 90 %, seguido de un retorno a D al 4 % para un equilibrio de 20 min. Para el analisis de LC-MS/MS, se concentraron previamente alfcuotas (1-10 pl) de extractos vegetales digeridos con tnptico o endo-GluC, y se separaron mediante nano LC C18 como se ha descrito anteriormente, usando varios gradientes de LC de hasta 120 min de duracion (por ejemplo B al 4-60 % en 100 min, B al 60-90 % en 1 min y, finalmente, una retencion de 5 min en B al 90 %, seguido de un retorno a B al 4 % para un equilibrio de 10 min). Los peptidos eluidos se introdujeron directamente en la fuente de nanopulverizacion. Los experimentos de espectrometna de masas se realizaron en un sistema hforido de MS/MS de cuadrupolo/trampa de iones lineal 4000 qTrAP (ABSciex, Foster City, CA, EE. UU.) que se ejecuta con el paquete de software Analyst 1.5.1. El 4000 QTRAP dotado de una fuente de nano-pulverizacion se opero en modo de ionizacion positiva. Los analisis de LC-MS para la cuantificacion e identificacion de ciclotidos segun el peso molecular se realizaron usando la adquisicion de barrido multiple mejorada (EMS) con una velocidad de exploracion de 1.000 UMA/segundo en el intervalo de masas

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de 400-1400 Da. Los datos de LC-MS se analizaron mediante "reconstruccion de LC-MS" en el intervalo de PM de 2.700 a 3.500 Da y mediante el uso de varios ajustes de filtro de senal-ruido para obtener el peso molecular y la puntuacion de validez de todos los maximos peptfdicos. Los analisis de LC-MS/MS se realizaron usando la adquisicion dependiente de la informacion (IDA). El protocolo de adquisicion usado para proporcionar datos espectrales de masa para la busqueda en bases de datos implico el siguiente procedimiento: perfilado de masas del eluyente de HPLC usando EMS; los iones sobre el umbral de fondo se sometieron a examen usando el barrido de resolucion mejorada (ER) para confirmar los estados de carga de los iones moleculares con carga multiple. Los iones mas abundantes y los siguientes mas abundantes de cada uno de estos barridos con un estado de carga de +2 a +4 o con carga desconocida fueron sometidos a CID usando energfa de colision rodante. Se uso un barrido de iones de producto mejorado para clasificar los iones de fragmentos y presentar el espectro de los iones de producto para busquedas posteriores en las bases de datos.

Digestion enzimatica y secuenciacion de peptidos usando analisis de bases de datos. Se prepararon ciclotidos de extracto de O. affinis previamente purificados con C18 para la secuenciacion de MS/MS como se ha descrito anteriormente (Chen, 2005, J Biol Chem, 280, 22395-22405; Irlanda, 2006, Biochem J, 400, 1-12). Se redujo el extracto, se alquilo con yodoacetamida y se digirio enzimaticamente usando tripsina o endo-GluC (Sigma-Aldrich, Austria). Los extractos de peptidos digeridos se analizaron con nano LC-MS/MS como se ha descrito anteriormente, y los datos de IDA se usaron para analisis adicionales. La busqueda en bases de datos de los datos de LC-MS/MS se llevo a cabo usando el software ProteinPilot™ y el algoritmo Paragon con la herramienta de base de datos ERA para la identificacion de ciclotidos (Colgrave, 2010, Biopolymers, 94, 592-601).

Cuantificacion relativa de ciclotidos usando analisis de nano LC-MS. Se separo el extracto de O. affinis previamente purificado con C18 mediante nano LC-MS unidimensional como se ha descrito anteriormente. Se cuantificaron los maximos de ciclotido por area relativa bajo la curva (todos los maximos se procesaron a 214 nm de absorbancia de 15 a 55 minutos) usando el asistente de cuantificacion del software Chromeleon 6.8. Los maximos del cromatograma de LC se identificaron por el peso molecular y el tiempo de retencion de los maximos de LC-MS correspondientes. La cuantificacion se realizo en cinco experimentos de LC-MS independientes y la abundancia relativa de los ciclotidos se presenta como la media ± ETM.

Preparacion de celulas mononucleares de sangre periferica humanas y cultivo celular. Se aislaron celulas mononucleares de sangre periferica humanas (PBMC) de la sangre de donantes adultos sanos obtenida del Centro de Transfusiones de Sangre (University Medical Center, Friburgo, Alemania). Se centrifugo la sangre venosa en un gradiente LymphoPrep™ (densidad: 1,077 g/cm3, 20 min, 500 x g, 20 °C; Progen, Heidelberg, Alemania). Tras ello, las celulas se lavaron dos veces con medio, y se determinaron la viabilidad celular y la concentracion usando el ensayo de exclusion con azul de tnpano. Las PBMC se cultivaron en medio RPMI 1640 complementado con suero fetal bovino inactivado por calor al 10 % (PAA, Coelbe, Alemania), L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina (todas de Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Las celulas se cultivaron a 37 °C en una incubadora humidificada con una atmosfera de CO2 al 5 %/aire al 95%. Todos los experimentos realizados con material humano fueron aprobados por el Comite de Etica de la Universidad de Freiburg.

Purificacion alternativa de celulas mononucleares perifericas humanas (PBMC). Se aislaron PBMC de muestras de sangre de adultos sanos que fueron proporcionadas por el centro de transfusiones del hospital universitario de Freiburg (Alemania). La sangre venosa se diluyo a 1:2 (v/v) con PBS y se centrifugo con un gradiente de LymphoPrep (usando 15 ml de sangre diluida y 20 ml de solucion de LymphoPrep); densidad: 1,077 g/cm3, 20 min, 500 x g, 20 °C). Se transfirio la capa enriquecida en linfocitos a un nuevo recipiente, y se lavo tres veces con PBS y se centrifugo de nuevo (10 min, dos veces con 300 xg y la ultima vez con 800 rpm, 20 °C). Para los siguientes experimentos, las celulas se tineron con CFSE o se diluyeron con un medio de 4 x 106 celulas/ml. Las celulas se contaron en un microscopio electronico usando tincion con azul de tnpano y un hemocitometro.

Activacion y tratamiento de PBMC. Se estimularon celulas PBMC (105) con anticuerpos monoclonales anti-CD3 humano (clon OKT3) y anti-CD28 humano (clon 28.2) (ambos de eBioscience, Frankfurt, Alemania) durante 72 horas en presencia de medio, los agentes de control camptotecina (CPT; 30 pg/ml: Tocris, Eching, Alemania) y Triton-X 100 (0,5%; Carl Roth, Karlsruhe, Alemania) o diferentes concentraciones de extracto de O. affinis, melitina (PolyPeptide, Estrasburgo, Francia) o kalata B1, respectivamente. Tras el cultivo, las celulas se evaluaron en bioensayos como se describe en el texto.

Activacion y tratamiento alternativos de PBMC. Tras la purificacion, las PBMC se equilibraron durante 2 horas a 37 °C. Tras ello, se incubaron previamente 100 pl de PBMC (4 x 106 celulas/ml) en una placa de 96 pocillos durante 2 horas con CsA (ciclosporina A) o ciclotidos, se transfirieron a una placa nueva y se estimularon con 10 pg/ml de PHA-L durante 1 hora. A esto, le siguio el lavado de cada pocillo con 100 pl de PBS (centrifugacion durante 5 minutos, 1.000 rpm, 20 °C) y la resuspension de las celulas en 100 pl de medio para ensayos adicionales.

Determinacion de la proliferacion celular y division celular. Para el analisis de seguimiento de la proliferacion celular y de la division celular, se recogieron PBMC y se lavaron dos veces en PBS fno, y se volvieron a suspender en PBS a una concentracion de 5 x 106 celulas/ml. Las celulas se incubaron durante 10 minutos a 37 °C con ester

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succinimidflico de diacetato de carboxifluorescema (CFSE; 5 pM: Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). La reaccion de tincion se detuvo lavando dos veces con medio completo. Despues, se analizo el progreso de la division celular usando analisis de citometna de flujo.

Analisis alternativo de proliferacion celular y division celular usando tincion con CFSE. Se incubaron PBMC purificadas (5 x 106 celulas/ml) con 0,5 mM del colorante fluorescente CFSE (5-carbofluorescein-diacetato- succinilester) durante 10 minutos a 37 °C. Se detuvo la reaccion usando medio, las celulas se lavaron una vez con medio por centrifugacion (10 min, 300 x g, 20 °C) y se diluyeron con un medio de 4 x 106 celulas/ml.

Determinacion de apoptosis y necrosis de PBMC usando tincion con anexina V y yoduro de propidio. Se

determinaron los niveles de apoptosis usando el kit de deteccion de apoptosis anexina V-FITC (eBioscience, Frankfurt, Alemania ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Tras la tincion con anexina V, se anadio una solucion de yoduro de propidio (PI; eBioscience) y las celulas se incubaron a oscuras, seguido de un analisis de citometna de flujo para determinar la cantidad de apoptosis y necrosis. Se usaron CPT (30 pg/ml) y Triton-X 100 (0,5 %) como controles positivos para la apoptosis y la necrosis, respectivamente.

Ratones. Se criaron ratones C57BL/6 (10-16 semanas de vida) y se mantuvieron en las instalaciones del Servicio de Animales de la Universidad de Monash. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el codigo australiano de practicas para el cuidado y uso de animales con fines ciendficos (NHMRC, 1997), tras la aprobacion del Comite de Etica Animal de la Universidad de Monash (Clayton/Melbourne, Australia).

Induccion y evaluacion clinica de la EAE. Se inyecto por via subcutanea en los costados un total de 200 pg del peptido encefalitogenico MOG35-55 (MEVGWYRSpFsRwHlYRNGK; GL Biochem, Shanghai, China) emulsionado en CFA (Sigma) complementado con 4 mg/ml de Mycobacterium tuberculosis (BD). A continuacion, los ratones recibieron de inmediato mediante inyeccion por via intravenosa 350 ng de vacuna de pertussis (List Biological Laboratories, Campbell, EE. UU.) y, de nuevo, 48 horas despues (Bernard, J Mol Med 75, 1997, 77-88; Albouz-Abo Eur J Biochem 246, 1997, 59-70; Hvas Scand J Immunol 46, 1997, 195-203; Johns Mol Immunol 34, 1997, 33-38; Menon J Neurochem 69, 1997, 214-222). Los animales se controlaron diariamente, y se cuantifico el deterioro neurologico en una escala clinica arbitraria: 0, sin deterioro detectable; 1, cola flacida; 2, debilidad de los miembros posteriores; 3, paralisis de los miembros posteriores; 4, paralisis de los miembros posteriores y paralisis ascendente; 5, moribundo o fallecido (Liu Nat Med 4, 78-83 1998; Slavin Autoimmunity 28, 109-120 1998). Bajo la recomendacion del comite de etica animal, los ratones fueron sacrificados tras alcanzar una puntuacion clinica de 4.

Anticuerpos y proteinas recombinantes. Se purifico el anticuerpo monoclonal anti-MOG de raton (clon 8-18C5) a partir de sobrenadantes de cultivo de hibridoma en la columna de Protema G-Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se genero antisuero contra el peptido MOG35- 55(Ichikawa Int Immunol 8, 1996, 1667-1674; Ichikawa J Immunol 157, 1996, 919-926) en conejos mediante procedimientos similares a los descritos previamente (Bernard Clin Exp Immunol 52, 1983, 98-106; Pedersen J Neuroimmunol 5, 1983, 251-259). Se produjo el dominio extracelular de MOG de raton (restos de aminoacidos 1-117 de la protema madura) (rMOG) en la cepa M15pREP4 de E. coli usando el vector de expresion pQE9 (Qiagen, Australia) para incorporar una etiqueta de histidina amino-terminal segun las instrucciones del fabricante. Se cargo un lisado bacteriano clarificado que contema rMOG en una columna Ni-NTA Superflow (Qiagen, Australia) en condiciones desnaturalizantes (Guanidina-HCl 6 M, NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0) segun las instrucciones del fabricante usando un sistema de cromatograffa LP BioLogic (Bio-Rad Laboratories, Australia). La protema unida se lavo secuencialmente con Tampon A (Urea 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0), Tampon A (a pH 6,3), Tris 10 mM pH 8/isopropanol al 60 %(para eliminar la endotoxina) y, de nuevo, con Tampon A. Se llevo a cabo el replegamiento de la protema unida aplicando un gradiente lineal de Tampon A que contema 2-mercaptoetanol 14 mM (100%-0%) frente a Tampon B (NaH2PO4 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, glutation reducido 2 mM, glutation oxidado 0,2 mM) (0% -100%). A este, le siguio un segundo gradiente lineal de Tampon B (100%-0%) frente a Tampon C (NaH2PO4100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0) (0 %-100 %). La protema unida se eluyo usando Tampon C que contema imidazol 300 mM, luego se dializo extensamente frente a NaCl 50 mM/Tris 10 mM pH 8. Se estimaron la concentracion de protema y la pureza usando un ensayo Micro BCA (Bio-Rad Laboratories, Australia) y SDS-PAGE, respectivamente. Se verifico la protema producida como rMOG mediante analisis de transferencia Western usando anticuerpos espedficos para MOG nativo. Los niveles de endotoxina se determinaron usando un ensayo de lisado de amebocito Limulus (Associates of Cape Cod, Falmouth, MA).

Vacunacion con el peptido MOG. Se emulsionaron 200 pg del peptido MOG con un volumen igual de IFA (Difco) y se inyectaron por via subcutanea en los costados superiores (100 pl divididos por igual) tres semanas antes la exposicion encefalitogenica. A esto, se siguieron dos inyecciones mas a intervalos semanales (200 pg/IFA/100 pl).

Histopatologia y evaluacion de la inflamacion, la desmielinizacion y el dano axonal. Al finalizar los experimentos, se anestesiaron los ratones, se recogio su sangre (para la posterior determinacion de los anticuerpos) y se extrajeron cuidadosamente el cerebro y la medula espinal, antes de la inmersion en una solucion de paraformaldelmdo al 4 % y tampon fosfato 0,1 M. Se embebieron segmentos de cerebro, cerebelo y medula espinal en parafina. Se tineron cortes con hematoxilina/eosina, Luxol azul rapido y Bielshowsky en busca de evidencias de

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inflamacion, desmielinizacion y dano axonal, respectivamente (McQualter, 2001 J Exp Med. 1 de octubre; 194(7), 873-82). Se realizo una evaluacion histologica semicuantitativa de la inflamacion y la desmielinizacion, y se puntuo con ocultacion de la siguiente manera: 0, sin inflamacion; 1, infiltrado celular solo en las zonas perivasculares y las meninges; 2, infiltrado celular leve en el parenquima; 3, infiltrado celular moderado en el parenquima; y 4, infiltrado celular grave en el parenquima (Bettadapura J Neurochem 70, 199, 1593-1599 8; Okuda J Neuroimmunol 131, 2002, 115-125).

Determinacion de anticuerpos especificos de MOG. Se midio la actividad de los anticuerpos contra rMOG y MOG35-55 en suero de raton mediante ELISA, como se ha descrito previamente en Ichikawa Cell Immunol 191, 1999, 97-104). Brevemente, se recogio suero al final de los experimentos y se analizo mediante ELISA con placas recubiertas con peptido rMOG y MOG35-55 (Maxisorp, Nunc).

Proliferacion de linfocitos T y produccion de citocinas. Se extrajeron los bazos de ratones sacrificados 32-46 dfas despues de la inmunizacion con MOG35-55. Se dispersaron suavemente las celulas a traves de una malla de nailon de 70 pm (BD) en una suspension de celulas individuales, se lavaron y cultivaron a 2,5 x 106 celulas/ml en RPMI completo (RPMI 1640 que contema suero de ternera fetal inactivado por calor al 10% (Sigma), L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 pM y piruvato sodico 1 mM. Luego, se anadieron doscientos microlitros de suspensiones celulares a placas de microtitulacion de 96 pocillos, solo con MOG35-55 (20 pg/ml) o anti-CD3e y anti-CD28 (20 pg/ml de cada uno), y se incubaron durante 66 horas a 37 °C con CO2 al 5 %. Se anadieron microlitros de [3H]timidina (1 pCi/pocillo; Amersham, Australia; diluidos 1/10 en medio) a cada pocillo durante las ultimas 18 h. Las placas se recogieron en filtros de fibra de vidrio y se anadio una gota de Microscint Scintillant (Perkin Elmer) a cada pocillo. Los recuentos se leyeron usando un contador de centelleo Top Count NXT (Perkin Elmer). Los valores presentados son la media de tres pocillos. Para los ensayos de citocinas, se anadieron 2 ml de celulas (5 x 106 celulas/ml) de bazos aislados 32-46 dfas despues de la inmunizacion a placas de 24 pocillos, ya sea solas o con MOG35-55 (10 pg/ml) o con anti-CD3e y anti-CD28 (20 pg/ml de cada uno). Los sobrenadantes se recogieron a las 48 y 72 h. La cuantificacion del contenido de citocinas de raton que inclrnan citocinas Th1, Th2, y quimiocina (IFNy, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10, IL-12p70, IL-13, GM-CSF, KC, MCP-1, MIG y TNF) se determinaron simultaneamente usando un ensayo de perlas multiplexado (ajustes de Cytometric Bead Array Flex [CBA]) de acuerdo con el protocolo recomendado por el fabricante (Becton Dickinson). Se realizo la adquisicion de 4.500 eventos usando un citometro de flujo FACScanto II (Becton Dickinson, San Jose, EE. UU.) y el software Diva, y los datos se analizaron y se ajustaron a una ecuacion logfstica de 4 parametros usando el software FCAP array (Soft Flow, Pecs, Hungna). Los niveles mmimos de deteccion de cada citocina fueron: IFNy, 5,2 pg/ml; IL-2, 1,5 pg/ml; IL-3, 4,2 pg/ml; IL-4, 0,8 pg/ml; IL-5, 4,8 pg/ml; IL-6, 6,5 pg/ml; IL-9, 10,5 pg/ml; IL-10, 16,4 pg/ml; IL- 12p70, 9,2 pg/ml; IL-13, 7,3 pg/ml; GM-CSF, 9,9 pg/ml; KC, 16,2 pg/ml; MCP-1, 29 pg/ml; MIG, 11,4 pg/ml y TNF, 17,1 pg/ml.

Analisis del receptor superficial de IL-2. Se transfirieron celulas activadas a una placa de 96 pocillos, se centrifugaron (5 min, 1.000 rpm, 20 °C), se lavaron una vez con 100 pl de tampon FACS y se tineron con CD25 PE durante 15 min a 4 °C. Luego, se lavaron las celulas dos veces con tampon fCs y se volvieron a suspender en 100 pl de tampon FACS, se transfirieron a viales de FACS con un volumen total de 250 pl, y se midio la expresion del receptor superficial de IL2 CD25 mediante analisis FACS usando un instrumento FACSCalibur (BD Biosciences).

Determinacion de la liberacion de citocina usando ELISA. Se volvieron a suspender celulas activadas en 50 pl de medio, se transfirieron a una placa de 96 pocillos y se trataron con 10 pg/ml de PHA-L. Tras la incubacion durante 24 horas, se volvieron a estimular las celulas con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml) durante 6 h. A continuacion, se transfirieron las celulas a tubos Eppendorf, se centrifugaron (5 min, 3.000 RPM, 20 °C) y se transfirieron de nuevo 50 pl del sobrenadante a tubos nuevos y se almacenaron a -20 °C. La produccion de citocinas se midio y se cuantifico usando el kit FlowCytomix™ de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

CD107a - Analisis de desgranulacion. Se cultivaron celulas activadas durante 36 h y luego se trataron para la repeticion de la estimulacion con PMA (50 ng/ml) e ionomicina (500 ng/ml), y se tineron con CD107a PE. Tras 1 h, la reaccion se detuvo con 2 pl de Golgi-Stop (1:10) y se incubo durante 2,5 h a 37 °C. Se transfirieron celulas a una placa de 96 pocillos, se centrifugaron (5 min, 1.000 RPM, 20 °C) y se lavaron con 100 pl de tampon FACS. Despues, se tineron las celulas PBMC con CD8 PE-Cy5 durante 15 minutos a 4 °C y, tras ciclos de lavado con tampon FACS, las celulas se volvieron a suspender en 100 pl, se transfirieron a viales de FACS con un volumen total de 250 pl y se midio la desgranulacion mediante analisis FACS.

Produccion intracelular de IFN-gamma y TNF-alfa. Se cultivaron celulas activadas durante 36 h y luego se trataron para la repeticion de la estimulacion con PMA (50 ng/ml), ionomicina (500 ng/ml) y brefeldina A durante 6 horas a 37 °C. Tras transferir las celulas a una placa de 96 pocillos, se centrifugaron (5 min, 1.000 RPM, 20 °C) y se lavaron con 100 pl de tampon FACS. Despues, se tineron las PBMC con CD8 PE-Cy5 durante 15 minutos a 4 °C y se lavaron nuevamente dos veces con tampon de FACS. Las celulas se trataron con 50 pl de paraformaldefndo al 4 % durante 10 min a 4 °C, se lavaron dos veces con 100 pl de tampon de FACS y luego se permeabilizaron mediante incubacion con 100 pl de solucion de permeabilizacion/lavado (1:10) durante 15 min a 4 °C. Tras la centrifugacion (5 min, 1.000 rpm, 20 °C), las PBMC se incubaron con IFN-gamma PE o TNF-alfa PE,

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respectivamente, durante 30 min a 4 °C. Los anticuerpos libres se lavaron con solucion de permeabilizacion/lavado y las PBMC se volvieron a suspender en 100 jl de tampon de FACS. La produccion de IFN-gamma y TNF-alfa se determino individualmente mediante analisis FACS.

Extraccion de ARN total y transcripcion inversa. Se extrajo el ARN total de los controles o las celulas tratadas (2 x 106) congeladas a -80 °C. Se realizo la purificacion del ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante para los kits de digestion RNeasy mini y Rnase-Free Dnase Set (Qiagen, Hilden, Alemania). La cantidad y pureza del ARN extrafdo se midio por espectrofotometna (Nanodrop, Peqlab, Erlangen, Alemania) y el ARN purificado se transcribio de forma inversa usando el kit RT2 First Stand (Qiagen, Hilden, Alemania).

PCR en tiempo real. Se llevaron a cabo reacciones de RT-PCR en un BioRad MyiQ, Munich, Alemania) en un volumen final de 25 jl usando el ensayo de cebadores de qPCR RT2 (para IL-2) y la mezcla maestra de qPCR SYBR® Green (ambos de Qiagen, Hilden, Alemania). Cada determinacion se realizo por duplicado y el ARNr 18s del gen constitutivo se uso como control interno. El programa del termociclador en tiempo real consistio en una etapa inicial de desnaturalizacion a 95 °C durante 10 minutos, seguida de un programa de ciclos de dos etapas con 40 ciclos (95 °C, 15 s; y 60 °C, 60 s). Los resultados se expresaron como la expresion genica relativa de IL-2, y se determinaron mediante el metodo Ct comparativo. Los datos se normalizaron con respecto al valor de Ct del ARNr 18s del gen constitutivo, y se uso el nivel relativo de ARNm en el grupo no tratado (activado con PHA-L sin tratar) como calibrador.

Analisis de datos y analisis estadistico. Para la Figura 10, el analisis estadfstico se realizo usando la prueba t de Student, considerados los valores de p < 0,05 significativos. Todos los demas graficos se prepararon usando el software GraphPad Prism™ y los datos se presentan como la media ± error tfpico (ETM). Cuando fue aplicable, los datos se analizaron estadfsticamente usando el ensayo de Kruskal Wallis de ANOVA de una via y el analisis posterior de comparacion multiple de Dunn.

Los graficos y los resultados de FACS se prepararon usando el software CellQuest Pro (BD Biosciences) y se presentan como la media + DT o ETM. Todos los datos pertenecientes a los Ejemplos 8-12 se evaluaron estadfsticamente mediante ANOVA y la prueba post hoc de Dunnet usando SPSS v19.0 (IBM, NY, EE.UU.).

Ejemplo 2: Analisis qmmico de extracto vegetal de Oldenlandia affinis

Se analizo qmmicamente el extracto en bruto de la planta de la familia del cafe Oldenlandia affinis usando un flujo de trabajo peptidomico rapido utilizando nano-LC-MS, reconstruccion de peptido con identificacion de base de datos y analisis de secuencias automatico de MS/MS para determinar su contenido de ciclotido.

Se cultivaron plantas de O. affinis y se aislaron las partes aereas de acuerdo con protocolos de laboratorio bien conocidos usando la extraccion durante una noche con diclorometano y metanol, seguida de la extraccion en fase solida C18 de la parte acuosa. Este procedimiento convencional comunmente produce muchos gramos de extracto de ciclotido en bruto por kilogramo de peso de hoja de planta nueva (Gruber, 2007, Toxicon, 49, 561-575; Gran, 1970, Medd Nor Farm Selsk, 12, 173-180), mientras que el contenido de diversos ciclotidos depende de las condiciones de crecimiento (por ejemplo, del habitat) de las plantas y otros factores ambientales (Trabi, 2004, J Nat Prod, 67, 806-810; Seydel, 2007, Appl. Microb. Biotechnol., 77, 275-284).

En general, la secuenciacion de aminoacidos solo es viable a partir de fracciones ciclotfdicas puras o semipurificadas. Por lo tanto, se uso un enfoque peptidomico alternativo para diseccionar el contenido de ciclotido de un extracto vegetal en bruto mediante la combinacion de LC-MS de nanoflujo y la reconstruccion de peptidos (identificacion por peso molecular), asf como la digestion proteolftica, la LCMS/MS y el analisis automatico de bases de datos (identificacion por secuencia de aminoacidos) usando la herramienta de base de datos de ciclotidos ERA recientemente publicada (Colgrave, 2010, Biopolymers, 94, 592-601). El extracto de ciclotido en bruto se analizo con diversos gradientes lineales en nano LC C18 de fase inversa acoplada en lmea a un espectrometro de masas tubrido triple cuadripolar/ESI-QqLIT de ionizacion por electronebulizacion, que se opero en modo de MS mejorada con velocidades de barrido de 1.000 y 4.000 UMA/segundo, respectivamente. La aplicacion de una herramienta de reconstruccion de LC-MS automatica produjo inicialmente unos cuantos cientos de masas peptfdicas en el intervalo de 2.700 a 3.500 Da (PM tfpico para ciclotidos). Es probable que el numero alto represente algunos aciertos falsos positivos debido a la inclusion de datos abundantes bajos en el calculo. De este modo, se ajusto el factor de senal a ruido en el algoritmo y normalmente se obtuvieron entre 50-100 masas peptfdicas reconstruidas con puntuaciones significativas superiores a 0,99. Los datos reconstruidos de LC-MS representativos (de al menos tres experimentos independientes) se enumeran en la Tabla 4. Se identifico un total de 72 masas peptfdicas en el intervalo de 2.7003.500 Da. Al comparar esas masas peptfdicas con la base de datos de ciclotidos (CyBase (Wang, 2008, Nucleic Acids Res, 36, D206-210)), se identificaron 23 ciclotidos conocidos de O. affinis, 24 masas peptfdicas correspondientes a peptidos de otras especies de plantas ciclotfdicas y 25 nuevas masas ciclotfdicas (no descritas previamente). Los experimentos de LC-MS se analizaron ademas con la reconstruccion manual de peptidos extrayendo los iones cargados doble y triplemente de los maximos de ciclotido respectivos y calculando el peso molecular medio (datos no publicados). El analisis manual fue util como control interno para garantizar la integridad de los datos automatizados generados.

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Ademas del analisis de los ciclotidos de O. affinis por peso molecular y la comparacion de las bases de datos, se realizaron varias modificaciones qmmicas del extracto en bruto, es decir, reduccion y alquilacion seguidas de proteolisis con tripsina y endo-GluC. Debido a la naturaleza estructural y a la alta estabilidad de los ciclotidos, estas modificaciones qmmicas son necesarias para producir iones precursores susceptibles para la secuenciacion mediante MS/MS. Las mezclas modificadas y digeridas se analizaron con un flujo de trabajo peptidomico usando nano LC y secuenciacion de peptidos mediante la adquisicion dependiente de la informacion (para mas detalles, vease el apartado de Metodos). Los datos resultantes de MS y MS/Ms se usaron para la identificacion automatica de ciclotidos usando el algoritmo Paragon™ con una base de datos de ciclotidos ERA adaptada (una herramienta que esta disponible gratuitamente en la web). Usando este analisis peptidomico de ciclotidos, se pudieron identificar 14 ciclotidos conocidos por secuencia de aminoacidos (vease la Tabla 5). En resumen, usando el flujo de trabajo peptidomico descrito anteriormente, se pudieron identificar casi todos los ciclotidos actualmente conocidos y un numero todavfa mayor de nuevas masas peptfdicas correspondientes a otros ciclotidos conocidos o nuevos (por peso molecular) en extracto de ciclotido en bruto de la planta O. affinis (vease la Tabla 1).

La combinacion de reconstruccion de nano LC-MS/MS y LC-MS, asf como la busqueda automatica en bases de datos es una tecnica rapida y util para la identificacion de ciclotidos en extractos en bruto. Comparado con un estudio anterior de Plan et al., (Plan, 2007, ChemBioChem, 8, 1001-1011), que describio el primer identificador genetico ciclotfdico de O. affinis usando la purificacion clasica de peptidos mediante HPLC analftica y secuenciacion de MS/MS fuera de lmea, se han identificado 8 ciclotidos conocidos adicionales y se ha proporcionado una lista de ~50 masas peptfdicas correspondientes a ciclotidos de los que algunas pueden identificarse mediante analisis de identificacion genetica de peptidos en CyBase (base de datos de ciclotidos (Wang, 2008, Nucleic Acids Res, 36, D206-210)). Esto sugiere que el numero de ciclotidos que se pueden encontrar en una sola especie puede ser >70 y es, por lo tanto, al menos el doble del numero anticipado previamente de (en promedio) 34 ciclotidos por especie (Gruber, 2008, Plant Cell, 20, 2471-2483). Esto, por supuesto, tiene un gran impacto en la determinacion del numero total de ciclotidos del reino vegetal y, por consiguiente, dana lugar a la necesidad de revisar el numero de nuevos ciclotidos que se descubrieron en las plantas.

Ejemplo 3: Efectos antiproliferativos del extracto de ciclotido de O. affinis

Una vez finalizado el analisis qmmico, se ensayaron diferentes concentraciones del extracto de ciclotido de O. affinis en bruto para determinar su capacidad antiproliferativa en PBMC primarias humanas activadas (Figura 2). Usando analisis de dispersion lateral directa basado en citometna de flujo, se demostro que el extracto muestra una reduccion dependiente de la dosis (50-100 pg/ml) de PBMC proliferantes activadas en comparacion con el control estimulado sin tratar (Figuras 2A y B). Simultaneamente, se observo un contenido constante de PBMC en reposo, viables, sin acumulacion de celulas muertas, lo que demuestra que las concentraciones aplicadas del extracto de ciclotido no son perjudiciales para las celulas. Por encima de este intervalo de concentraciones, el extracto mostro un efecto citotoxico creciente. En esta lmea, la camptotecina (CPT, 30 pg/ml), que se uso como control positivo de la proliferacion inhibidora, produjo una alta proporcion de celulas muertas, lo que indica que el efecto antiproliferativo observado, en contraste con el extracto de ciclotido de O. affinis, se debfa principalmente a la citotoxicidad.

Se evaluo ademas el impacto del preparado de ciclotido de O. affinis en bruto en el nivel de division celular de PBMC activadas. Para este fin, las celulas se marcaron con el colorante de ester succinimidflico de diacetato de carboxifluorescema (CFSE), que no influye en la viabilidad de las celulas tenidas y es heredado por las celulas hijas tras la division celular, y cada celula en division pierde consecuentemente intensidad fluorescente. Estos datos, mostrados en las Figuras 2C y D, indican que el extracto causo una inhibicion dependiente de la dosis de la division celular de las PBMC activadas, lo que confirma que el preparado de ciclotido de O. affinis en bruto tiene la capacidad de inhibir la proliferacion de PBMC sin provocar dano celular.

Ejemplo 4: Cuantificacion relativa de ciclotidos y aislamiento de kalata B1

Como se obtuvo una actividad antiproliferativa prometedora del extracto de ciclotido total de O. affinis, se determino la cantidad relativa de los ciclotidos principales, y se purificaron ademas los componentes principales para la caracterizacion biologica. Con este fin, el extracto de ciclotido en bruto se uso para el analisis cuantitativo de nano LC-MS, de manera similar a la descrita anteriormente. Se separaron almuotas diluidas del extracto mediante nano RP-HPLC C18 acoplada en lmea al espectrometro de masas. Los peptidos eluidos se controlaron tanto con absorbancia a 214 nm como en peso molecular. El area bajo la curva de los principales maximos de ciclotido de O. affinis se determino por integracion automatica (y, en caso necesario, mediante el posterior procesamiento manual). El analisis de cuantificacion relativa del contenido de ciclotido se ha llevado a cabo a partir de cinco experimentos de LC-MS independientes (vease la Tabla 6) y, en la Figura 3, se muestra un perfil de elucion de O. affinis representativo, que indica los maximos ciclotfdicos principales y su abundancia relativa (media ± ETM).

Como se ha presentado anteriormente, y de acuerdo con estudios anteriores (Plan, 2007, ChemBioChem, 8, 10011011), los ciclotidos kalata B1 y kalata b2 son los principales componentes peptfdicos, representando aprox. el 34 % del contenido total de ciclotidos de O. affinis. Kalata B1 y B2 solo difieren en cinco posiciones de aminoacidos (vease la Figura 6), concretamente en Val a Phe (bucle 2) y sustituciones conservativas de Thr a Ser (bucle 4), Ser a Thr

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(bucle 5), Val a Ile (en el bucle 5) y Asn a Asp (en el bucle 6) en kalata B2. Dado que estas sustituciones no tienen consecuencias estructurales significativas (RMSDcadena principal kB1/kB2 = 0,599 A, vease la Figura 6), y dado que los dos peptidos tienen un perfil de bioactividad similar (Gruber, 2007, Toxicon, 49, 561-575), se uso kalata B1 (que comprende ~14 % del extracto total) para analisis biologicos adicionales y su potencial antiproliferativo en PBMc primarias humanas activadas.

Ejemplo 5: Efectos antiproliferativos y citotoxicos de kalata B1

Para analizar si kalata B1 tiene la capacidad de inhibir la proliferacion de PBMC primarias humanas activadas, se marcaron las celulas con el colorante fluorescente CFSE y se analizaron las propiedades de division celular en presencia de las concentraciones de kalata B1 en el intervalo de 1,8 a 14 mM usando citometna de flujo. Tras la exposicion de PBMC a kalata B1, se observo una disminucion dependiente de la dosis de la capacidad de division celular, en comparacion con los controles de PBMC estimulados no tratados, como se muestra en la Figura 4. La concentracion inhibidora CI50 para el efecto antiproliferativo de kalata B1 fue de 3,9 ± 0,5 pM (Figura 7), que se compara con otros efectos de kalata B1, tal como el nematocida (Huang, 2010, J Biol Chem, 285, 10797-10805) y actividades citotoxicas (Svangard, 2004, J Nat Prod, 67, 144-147; Lindholm, 2002, Mol Cancer Ther, 1, 365-369; Daly, 2004, FEBS Lett, 574, 69-72) como se resume en la Tabla 3.

Para analizar si el efecto antiproliferativo se debfa al dano celular, se examino la influencia de Kalata B1 sobre la induccion de la apoptosis o necrosis de PBMC (Figura 5). Se midieron los marcadores apoptoticos y necroticos celulares mediante el ensayo de la fragmentacion de ADN internucleosomico (celulas subG1+) y el analisis superficial de fosfatidilserina a traves de la tincion con anexina V unica y combinatoria y la tincion con yoduro de propidio. Este doble proceso de tincion permitio la diferenciacion entre celulas viables (anexina'/PI'), apoptoticas (anexina+/PI- y anexina +/PI+) o necroticas (anexina7PI+). Los datos mostrados en la Figura 5 A a C demuestran que kalata B1 no tuvo una influencia significativa en la induccion de la apoptosis. La necrosis se aumento ligeramente a una concentracion mas alta (14 pM) de kalata B1, en comparacion con un control sin tratar (Figura 5D). Los controles positivos para la apoptosis y la necrosis, CPT (30 pg/ml) y detergente (Triton-X 100), respectivamente, aumentaron significativamente las fracciones de estas celulas.

La actividad antiproliferativa de kalata B1 desencadeno experimentos de validacion y control para determinar la naturaleza del efecto observado. El analisis de dispersion lateral directa basado en citometna (datos no mostrados) proporciono pruebas solidas de que el efecto antiproliferativo inducido por el ciclotido no causa la muerte celular ni por apoptosis ni por necrosis, sino que inhibe el crecimiento de los linfocitos de forma citostatica. Las concentraciones superiores a 14 pM del peptido son citotoxicas para las celulas (datos no mostrados). Esto era de esperar ya que, recientemente, se ha informado que el ciclotido kalata B1 causa hemolisis y la alteracion de la membrana a concentraciones superiores a ~50 pM (Barry, 2003, Biochemistry, 42, 6688-6695; Henriques, 2011, J Biol Chem, 286, 24231-24241). Por lo tanto, se realizaron experimentos de control con el componente de veneno de abeja melitina, un potente agente peptfdico que rompe la membrana comunmente usado.

Se analizaron las concentraciones a las que se describieron los efectos citotoxicos sobre los linfocitos humanos, para garantizar que la configuracion experimental de los presentes inventores fuera lo suficientemente sensible como para detectar los posibles efectos citotoxicos de kalata B1 (Pratt, 2005, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 41, 349355) (vease la Figura 8). Los datos revelaron que, en contraste con Kalata B1, la melitina causo una reduccion de las PBMC proliferantes a 1,6 pM (Figura 8A), pero este efecto se debfa principalmente a la induccion de la apoptosis, segun lo indicado por los resultados del analisis de la fragmentacion de ADN internucleosomico (Figura 8B) y por la induccion de celulas apoptoticas espedficas a estas concentraciones (Figura 8C). Ademas, hubo un ligero efecto sobre la induccion de la necrosis a altas concentraciones de melitina (Figura 8D).

A partir de estos datos de control, se concluyo que kalata B1, a diferencia de la melitina, tiene una capacidad antiproliferativa, que no se debe a los efectos citotoxicos ni a la capacidad de lisis de la membrana de kalata B1, ya que, de otro modo, cabna esperar observaciones similares del peptido citotoxico melitina mucho mas potente. La prueba de los efectos antiproliferativos al mantener las celulas en un estado "inactivo" en el que todavfa son viables, pero no pueden crecer ni proliferar sin causar la muerte celular en un cierto intervalo de dosis, es una condicion previa crucial para clasificar una sustancia como inmunosupresora, porque la citotoxicidad causana efectos secundarios.

Ejemplo 6: Prueba de mutantes/variantes de ciclotidos en ensayos antiproliferativos en celulas PBMC y linfocitos T aislados

El efecto antiproliferativo de los mutantes/variantes de ciclotido se probo de acuerdo con el Ejemplo 5. En resumen, se estimularon PBMC marcadas con CFSE, o linfocitos CD3+ purificados magneticamente con anticuerpos monoclonales anti-CD3/28, en presencia de medio (ctrl), camptotecina (CPT, 30 pg/ml), ciclosporina A (CsA, 1 pg/ml) o diferentes concentraciones de ciclotidos (1,8-14 pM) durante 72 h. Posteriormente, se evaluo la proliferacion celular mediante el analisis de la division celular usando el analisis de histograma basado en citometna de flujo. Se han probado los siguientes peptidos (1,8-14 pM) tanto en PBMC como en linfocitos T purificados con CD3 (n > 2):

Kalata B1:

Kalata B2: D-kalataB2: all-D Kalata T8K: Kalata V10A:

GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWPVCTRN GLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRD GLPVCGETCFGGTCNTPGCSCTWPICTRD GLPVCGEKCVGGTCNT PGCTCSVf PVCTRN GLPVCGETCAGGTCNTPGCTCSWPVCTRN

Kalata V10K: Kalata G18K: Kalata N29K: Kalata T20K, G1K: Kalata T20K:

GLPVCGETCKGGTCHT PGCTCSWPVCTRH GLPVCGETCVGGTCH TPKCTCSWPVCTRN GLPVCGETCVGGTCNTPGCTCSWFVCTRK KLPVCGEXCVGG'TCKTPGCKCSWPVCTRN G L P VCGET CVGGT C N T PGCKC S W P VCI' RN

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Los valores de CI50 correspondientes se pueden encontrar en la Tabla 2:

Tabla 2. Comparacion de los efectos inhibidores de kalata B1 (y otros ciclotidos) sobre PBMC y proliferacion de los linfocitos T purificados con CD3.

Peptido

CI50 (|JM) ± DT Actividad relativa en otros ensayos (Diferencia con kB1) nematocida | hemolitica insecticida

PBMC

Kalata B1

2,9 ± 1,3a 1,0 0,7 1,0

Kalata B2

0,2 ± 0,1c - - -

all-D kalata B2

2,3 ± 0,8c - - -

Kalata B1 T8K

no activo (n.a.)b < 0,2 T8A: 0,1 0,2

V10A

n.a.b - 0,5 1,1

V10K

n.a.b < 0,2 - -

G18K

4,4 ± 0,5b 2,4 G18A: 0,6 1,2

N29K

3,2 ± 0,6b 7,0/3,8 N29A: 0,5 1,0

T20K, G1K

1,9 ± 0,1*b 6,5/6,8

O O X 0 4—< O 4—< O

T20K

1,9 ± 0,6c 3,0/2,6

MCo59

n.a.b - -

MCo-CC1

n.a.b - - -

MCO-CC2

n.a.b - - -

Linfocitos purificados con CD3

Kalata B1

2,4 ± 0,5d - - -

Kalata B2

0,6 ± 0,02d - - _

all-D kalata B2

2,9 ± 0,4d - - -

G18K

3,2 ± 1,8c - - -

N29K

2,1 ± 0,9c - - -

T20K, G1K

1,1 ± 0,7c (citotoxico) - - -

T20K

2,7 ± 0,6d - - -

*Este compuesto es citotoxico a 14 pM; Todos los datos se han normalizado y analizado con regresion no lineal (pendiente fija) usando Graph Pad, a: n = 7, b: n = 4, c: n = 3, d: n=2; los peptidos distintos de kalata B1 han sido suministrados por David Craik (Instituto de Biociencia Molecular, Australia).

Ejemplo 7. Actividad in vivo en el modelo de raton con EAE de EM

Se ensayo la actividad in vivo de los ciclotidos en el modelo de raton con EAE de EM, como se ha descrito previamente (Okuda J Interferon Cytokine Res 18, 1998, 415-421). Se examino la capacidad de los ratones para recuperarse del deficit motor tras desarrollar una forma progresiva cronica de EAE vacunando a los ratones con kalata B1. Se uso el modelo de enfermedad similar a EM MOG en ratones C57BL/6 (Bernard J Mol Med 75, 1997, 77-88), en el que se vacunaron ratones adultos hembra C57BL/6 (10-12 semanas) con tres inyecciones subcutaneas (s.c.) sucesivas de ciclotidos (200 mg cada vez) en adyuvante de Freund incompleto (IFA) a intervalos semanales antes de inducir la EAE con MOG35-55. Los ratones de control se trataron de manera similar, pero recibieron PBS en IFA. Los animales se evaluaron diariamente para detectar signos clmicos de EAE durante un penodo de 43 dfas.

La vacunacion con kalata B1 produjo una reduccion en la incidencia y gravedad de la EAE (Figuras 10A). Los ratones tratados con kalata B1 mostraron signos clmicos significativamente mas leves (puntuacion acumulativa media de 42,2 ± 13,0; p < 0,01) en comparacion con el grupo de control de PBS (puntuacion acumulativa: 96,6 ± 7,1; duracion de la enfermedad: 29,1 ± 0,9).

Se examino la influencia de la vacunacion con kalata B1 en la formacion de lesiones inflamatorias y desmielinizantes del SNC mediante estudios histologicos de tejido fijado usando tincion con hemotoxilina/eosina, Luxol azul rapido y plata Bielshowsky. El SNC de todos los ratones tratados con PBS mostro lesiones inflamatorias extendidas, caracterizadas por celulas inflamatorias mononucleares, que eran particularmente llamativas en el cerebelo y la medula espinal (Figura 10B). La tincion con LFB y plata Bielshowsky revelo una notable perdida de mielina y una grave lesion axonal, respectivamente, particularmente alrededor del tejido lesionado en las tres regiones del SNC examinadas. Los ratones tratados con Kalata B1 mostraron alguna mejona en la gravedad de la enfermedad segun

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se juzgo por la reduccion de las lesiones histologicas de EAE (Figura 10B).

La capacidad de las celulas del bazo para proliferar en respuesta al gen de la encefalitis MOG35-55 para determinar si el efecto supresor sobre la EAE tras la vacunacion con kalata B1 se asocio con una reduccion de las respuestas de linfocitos T espedficas de MOG. Ademas, para abordar si esta supresion de la EAE era espedfica del antfgeno y/o el resultado de un defecto en la activacion o funcion de los linfocitos T, se estimulo la misma poblacion de esplenocitos por los activadores policlonales, anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28. La Figura 10C muestra que, independientemente del regimen de tratamiento, los esplenocitos de todos los ratones vacunados proliferaron a MOG con indices de estimulacion (IE) de 2,9 ± 0,4 y 2,7 ± 0,5 para los grupos tratados con kalata B1 y PBS, respectivamente. Estos esplenocitos mostraron fuertes respuestas proliferativas a los anticuerpos anti-CD3/CD28 con IE que variaron de 17 a 47.

Se examino si la supresion de la EAE en ratones vacunados con kalata B1 se asocio con una disminucion en la produccion de anticuerpos espedficos contra MOG. Por consiguiente, se recogieron sueros de los ratones tratados con kalata B1 y PBS al finalizar el experimento (dfa 43) y se analizaron en cuanto a su reactividad hacia MOG35-55. Como se indica en la Figura 10D, se detectaron anticuerpos anti-MOG en todos los sueros independientemente del regimen de vacunacion.

Esta bien establecido que el desarrollo de EAE esta asociado con la secrecion de citocinas proinflamatorias por linfocitos T espedficos de los antfgenos del SNC (Owens Curr Opin Neurol 16, 2003, 259-265). Dado que la supresion de la EAE tras la vacunacion con kalata B1 no se asocio con una disminucion de la reactividad de los linfocitos T hacia MOG, se investigo si los linfocitos T reactivos con MOG en animales protegidos pueden haber cambiado a un fenotipo de linfocitos T antiinflamatorios. Por consiguiente, se evaluaron los medios acondicionados generados a partir de cultivos de celulas de bazo estimulados in vitro y no estimulados en ensayos de matriz de perlas de citocinas. Se analizo un total de 15 citocinas simultaneamente, que incluyeron, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL9, IL10, IL12p70, IL13, IFNy, GM-CSF, KC, MCP1, MIG y TNFa. No hubo cambios marcados en el contenido de citocinas en los sobrenadantes estimulados con MOG35-55 o CD3/38 entre los grupos de animales tratados con ciclotido y de control (datos no mostrados). Por el contrario, se demostraron niveles significativamente reducidos de quimiocina MIG, conocida por desempenar un papel en el trafico de linfocitos T, y de TNFa, una citocina proinflamatoria conocida por su participacion en la patogenesis de la EAE (Nicholson, Curr Opin Immunol 8, 1996, 837-842) en sobrenadantes de celulas de bazo no estimuladas generados a partir de animales tratados con kalata B1 (Figuras 10E y 10F). Basandose en este perfil de citocinas, se puede deducir que la vacunacion con ciclotido, conduce a la produccion de una respuesta T antiinflamatoria.

Ejemplo 8. Influencia/efecto de diversos ciclotidos sobre la expresion de la cadena alfa CD25 de IL-2.

Entre otras rutas, la proliferacion de los linfocitos T se determina mediante la union de la citocina IL-2 a su receptor de superficie celular. Por lo tanto, se probo la influencia de los ciclotidos en la expresion del receptor de IL-2. Los compuestos de ensayo fueron T20K, V10A, V10K y T8K y, por tanto, las PBMC se trataron con estos ciclotidos, tras la estimulacion con PHA-L para determinar la expresion de los receptores de superficie de IL-2 CD25 tras 24 y 48 horas de cultivo, respectivamente, usando analisis FACS (Fig. 11). Como sustancia de control, se uso CsA. El tratamiento de las PBMC con CsA conduce a una reduccion de la expresion superficial de CD25, y produce un 76 % ± 10,7 tras 24 horas, y el tratamiento con T20K produce un 79 % ± 10,1 en comparacion con celulas no tratadas, es decir, PBMC estimuladas (CTRL, 100%) (Fig. 11B). El tratamiento con V10A produce un 114% ± 12,5, V10K produce un 112% ± 16,3 y T8K produce un 114% ± 17,3 de expresion superficial de CD25 tras 24 h en comparacion con el control (Fig. 11B). Esta tendencia continua tras 48 h, es decir, la expresion de CD25 se reduce aun mas mediante el tratamiento con CsA (62 % ± 7,3) y T20K (46 % ± 18,2), mientras que el tratamiento con V10A, V10K y T8K no conduce a cambios significativos en la expresion del receptor (Fig. 11C y D). En resumen, el tratamiento con CsA (p < 0,01) y el ciclotido T20K (p < 0,001) conduce a una reduccion significativa de la expresion de CD25, mientras que los ciclotidos V10A, V10K y T8K no influyen en el nivel de expresion del receptor CD25.

Ejemplo 9. Influencia de los ciclotidos sobre la liberacion de IL-2 y la expresion genica.

Para analizar el mecanismo de la antiproliferacion de linfocitos T mediada por ciclotidos, se determino su efecto sobre la liberacion directa de IL-2 en celulas PBMC. Las celulas se trataron con un ciclotido y se activaron con PHA- L. Tras 24 h, se volvieron a estimular las celulas con PMA e ionomicina y se midio la concentracion de IL-2 en el sobrenadante (IL-2 liberada) con una metodologfa de FACS basada en ELISA (Fig. 12A). La liberacion de IL-2 fue significativamente (p < 0,01) reducida por el tratamiento con CsA (18% ± 15,7) y T20K (24% ± 18,6) en comparacion con las celulas de control. El ciclotido V10K no tuvo efecto sobre la liberacion de IL-2 (datos no mostrados).

Es mas, los sobrenadantes de los linfocitos T estimulados se analizaron para determinar su liberacion de IL2 usando un kit de ELISA de IL-2 humana de eBioscience de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reaccion de color se evaluo a una densidad optica de 450 nm por el lector de microplacas Synergy H4 (BioTek) (Fig. 12B).

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Para determinar si los ciclotidos tienen un impacto en la expresion genica, se examino el nivel de expresion del gen il-2 (como control, se uso ARNr 18s) en celulas PBMC mediante PCR cuantitativa en tiempo real (Fig. 12C). El ciclotido T20K disminuye claramente el nivel de ARNm de IL-2 en contraste con el control, por lo que, como control de inhibicion positivo, se uso ciclosporina A.

Ejemplo 10. Influencia de la adicion de IL-2 exogena a PBMC tratadas con ciclotido

Para determinar la validez de la reduccion significativa de la liberacion de IL-2 tras el tratamiento con ciclotido, se probo la influencia de la adicion exogena de IL-2 tras el tratamiento. Si la smtesis de IL-2 se reduce mediante el tratamiento con CsA y ciclotidos, cabna esperar que este efecto pueda revertirse mediante la adicion exogena de IL- 2 a las celulas tratadas. Por lo tanto, se trataron PBMC con ciclotidos y CsA, y las celulas se activaron con PHA-L. En paralelo, se cultivaron las celulas con la adicion de IL-2 exogena (Fig. 13). El pretratamiento de PBMC con CsA y ciclotido T20K conduce a un efecto antiproliferativo (13 % ± 17,6 y 29 % ± 24, respectivamente) en comparacion con las celulas de control (Fig. 13A y B), mientras que el tratamiento con los ciclotidos V10A, V10K y T8K no tiene ningun efecto sobre la proliferacion. Al anadir IL-2 exogena, fue posible revertir el efecto antiproliferativo de CsA en parte (54 % ± 19,3) y de T20K casi por completo (91 % ± 1,4) (Fig. 13C y D). La adicion de IL-2 a las PBMC tratadas con V10A, V10K o T8K no modifico el efecto sobre la proliferacion (Fig. 13).

Ejemplo 11. Influencia de los ciclotidos en la produccion de IFN-gamma o TNF-alfa

A partir de los resultados obtenidos hasta ahora, es evidente que el tratamiento de PBMC activadas con CsA o ciclotido T20K influye en la expresion del receptor de superficie de IL-2 CD25 (figura 11), asf como en la secrecion de IL-2 (Fig. 12). Ademas, el efecto antiproliferativo de t20K en las PBMC puede antagonizarse mediante la adicion de IL-2 exogena (Fig. 13). Por lo tanto, es de interes determinar si los ciclotidos solo tienen efectos antiproliferativos o tambien afectan a la funcion efectora de los linfocitos T, o que se relacionana directamente con los cambios en la produccion de IFN-gamma y TNF-alfa. Por lo tanto, se probo la produccion de ambas citocinas de PBMC activadas tratadas con ciclotido en un punto de tiempo temprano tras la activacion de las PBMC. Se trataron previamente las PBMC con CsA o ciclotidos, seguido de la activacion con PHA-L. Tras 24 h, se volvieron a estimular las celulas durante 6 h con PMA e ionomicina y, despues, se midieron las concentraciones de IFN-gamma (Fig. 14) y TNF-alfa (Fig. 15) en el sobrenadante celular usando un metodo de FACS basado en ELISA. La concentracion de IFN-gamma de las celulas tratadas con CsA se redujo a 14 % ± 3,4 en comparacion con el control, y tambien el tratamiento con ciclotido T20K produjo una reduccion de IFN-gamma (21 % ± 13,2). En resumen, la produccion de IFN-gamma tras 24 h fue reducida significativamente por CsA (p < 0,01) y T20K (p < 0,001) (Fig. 14), pero no por V10K (datos no mostrados).

CsA (23 % ± 1,8) y T20K (23 % ± 10,6) tambien condujeron a una expresion de TNF-alfa reducida significativa (p < 0,001) en comparacion con el control (Fig. 15). Para evaluar si la funcion efectora de los linfocitos T sigue comprometida tras el tratamiento con T20K, se midio la liberacion de IFN-gamma y de TNF-alfa en un punto de tiempo posterior, es decir, 36 horas despues de la estimulacion. Las celulas tratadas con Cs experimentaron una reduccion significativa (p < 0,01) en la produccion de IFN-gamma del 23 % ± 2 en comparacion con el control (Fig. 14), mientras que todos los ciclotidos (T20K, V10A, V10K, T8K) no indujeron cambios significativos en el nivel de IFN-gamma (Fig. 14). La produccion de TNF-alfa se redujo significativamente (p < 0,001) tras el tratamiento con CsA (20 % ± 14,4), mientras que todas las celulas tratadas con ciclotido no dieron lugar a ningun cambio en el nivel de TNF-alfa (Fig. 15). Por lo tanto, es evidente que el tratamiento con ciclotido T20K conduce a una reduccion inicial de la funcion efectora, como lo indica la produccion reducida de IFN-gamma y TNF-alfa, pero el nivel de ambas citocinas se estabiliza con el tiempo. Esto indica ademas que T20K y CsA tienen un mecanismo de accion diferente.

Ejemplo 12. Influencia de los ciclotidos en la actividad de desgranulacion de PBMC activadas

Tras determinar la influencia del tratamiento con ciclotido sobre la funcion efectora de las PBMC basandose en la medicion de los niveles de citocinas IFN-gamma y TNF-alfa, es de interes determinar un efecto de los ciclotidos sobre la actividad de desgranulacion. La activacion de los linfocitos CD8+ citotoxicos conduce a una liberacion de granulos citoltticos, que contienen/expresan la protema 1 de la membrana asociada a los lisosomas (CD107; LAMP- 1). Durante la desgranulacion, las membranas de las vesmulas granulares se fusionan con las membranas de los linfocitos CD8+ activados y, por lo tanto, LAMP-1 puede usarse como una protema marcadora para la actividad citotoxica de los linfocitos T, que puede medirse con FACS. Tras 36 h, el 42 % de ± 21,4 de las celulas tratadas con CsA y el 49% ± 16,8 de las celulas tratadas con T20K contienen el marcador de desgranulacion LAMP-1 en comparacion con el control (Fig. 16). Esto puede interpretarse en la forma en que las celulas tratadas con CsA y T20K tienen una citotoxicidad reducida. Los ciclotidos V10K y T8K no tuvieron influencia en la actividad de desgranulacion de las PBMC activadas (datos no mostrados).

Ejemplo 13. Liberacion de Ca2+ de celulas Jurkat

Los linfocitos T de las celulas Jurkat se trataron como se describe para la Figura 17, supra. Para las celulas Jurkat, la estimulacion con CsA (5 mg/ml), T20K (4 |jM) and V10K (4 |jM) no indujo un cambio en la senalizacion de Ca2+ en las celulas Jurkat. Dado que ni CsA ni los ciclotidos conducen a ningun cambio en la senalizacion de Ca2+, es

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evidente que cualquiera de los compuestos actuara secuencia abajo de la liberacion de Ca2+ y, por lo tanto, esto indica un mecanismo inmunosupresor similar de los ciclotidos en comparacion con la CsA en estas celulas. Por el contrario, los linfocitos T primarios humanos demuestran una liberacion de Ca2+ creciente tras la incubacion con el ciclotido T20K y, por lo tanto, el mecanismo de accion puede depender del tipo de celula.

Ejemplo 14. Efecto de los ciclotidos en ratones C57BU6J

Materiales

Se adquirieron ratones C57BL/6J hembra de siete semanas de vida del Departamento de Zoologfa y Genetica (Himberg, Austria). Todos los experimentos fueron aprobados de acuerdo con las normas de la Comunidad Europea de cuidado de animales con el permiso del Ministerio de Ciencia de Austria. T20K y V10K fueron proporcionados por D. J. Craik, de la Universidad de Queensland, Instituto de Biociencia Molecular (Brisbane, Australia). La 5- carboxifluorescema-N-hidroxisuccinimida se adquirio en Sigma-Aldrich (Viena, Austria).

Inmunizacion

Se trataron ratones (n = 10/grupo) el dfa (-7), 0, 7 con 200 pg/100 pl/raton de T20K solubilizados en PBS esteril por via intraperitoneal (i.p.), como se indica en la figura. El dfa 0, se inmunizaron por via subcutanea con glicoprotema de oligodendrocitos de mielina (MOG35-55, 1 mg/ml), y el adyuvante completo de Freud (CFA, 10 mg/ml) se mezclo a partes iguales. Por lo tanto, se inyectaron 70 pl en el costado izquierdo y derecho. Ademas, los ratones recibieron 100 pl de toxina de pertussis (2 pl /ml) i. p. el dfa 0 y nuevamente el dfa 2. Comenzando el dfa 10, los ratones se puntuaron cada dos dfas. El peso tambien se midio el dfa (-7), 0, 7, y el mismo dfa durante la puntuacion. Los ratones se sacrificaron el dfa 24 tras alcanzar puntuaciones altas.

Aislamiento y estimulacion de esplenocitos

Se extrajeron los bazos de ratones sacrificados y se transfirieron a una placa Petri de 6 cm con 5 ml de PBS esteril. Para recibir una suspension de esplenocitos, se enmallaron los bazos y se filtraron a traves de un tamiz de nailon de 70 pm. Las celulas se centrifugaron a 1.200 rpm durante 5 minutos y se volvieron a suspender en medio RPMI 1640 complementado con suero de ternera fetal al 10 % (FCS), L-glutamina 2 mM, penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml). Los esplenocitos se cultivaron a una concentracion de 3 x 106/ml en una placa de fondo plano de 48 pocillos (500 pl/pocillo). Las celulas se estimularon con 30 pg/ml de MOG35-55 o se dejaron sin tratar y se incubaron a 37 °C durante tres dfas. Los sobrenadantes y las celulas se almacenaron a -20 °C hasta nuevos experimentos. Las celulas aisladas del grupo de ratones sin tratamiento previo se cultivaron ademas en una placa de 96 pocillos de fondo plano (100 pl/pocillo) y se estimularon con T20K (4 pM), T20K + MOG, T20K (12 h), V10K (4 pM, 12 h), CsA (5 pg/ml; 12 h), MOG (12 h) o se dejaron sin tratar. Tras 12 horas, se anadio MOG o T20K a los pocillos apropiados. Los sobrenadantes se almacenaron tras 24 horas y tras 48 horas a -20 °C.

Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima

Se analizaron los sobrenadantes de esplenocitos estimulados para determinar su liberacion de citocinas IL2, IL17, INFy, IL4 e IL22 usando anticuerpos anti-raton para ELISA de eBioscience de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La reaccion de color se evaluo a una densidad optica de 450 nm mediante el lector de microplacas Synergy H4 (BioTek).

SDS-PAGE y transferencia Western para NFATIc

Se estimularon los linfocitos T humanos proporcionadas por CCRI de A. Dohnal, PhD de acuerdo con el protocolo para la liberacion de IL2 descrito anteriormente. Se volvieron a suspender los linfocitos estimulados en TBS y se mezclaron a partes iguales con tampon de muestra y se calentaron durante cinco minutos a 95 °C. Se preparo un gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio para separar las protemas obtenidas de los linfocitos T lisados. Tras la electroforesis, las protemas se transfirieron desde el gel a una membrana. Tras bloquear la membrana con BSA al 3 % en TBST durante una noche a 4 °C, el primer anticuerpo anti-NFATc1 de raton se incubo durante 2 horas a temperatura ambiente. Tras cinco lavados con TBST y Tween al 0,1 %, la membrana se incubo con el segundo anticuerpo anti-HRP IgG de raton durante una hora a temperatura ambiente. La membrana se seco y se trato con Solucion West Pico o West Femto Super Signal de acuerdo con el protocolo del fabricante para evaluar la senal de quimioluminiscencia.

Ejemplo 15. Permeabilidad celular de los ciclotidos T20K (marcaje quimico y microscopia)

Se disolvieron 1,5 mg de T20K en 1,5 ml de tampon de carbonato de sodio 100 mM de pH 8,8. Se anadio ester de 5- carboxifluorescema-N-hidroxisuccinimida (5-CFSE) en un exceso de 10 veces como compuesto solido (2,5 mg). Se dejo que la reaccion prosiguiera durante 120 min a temperatura ambiente. Despues, la mezcla de reaccion se calento a 50 °C durante 30 minutos para completar la hidrolisis del ester de N-hidroxisuccinimida (NHS). La

purificacion se realizo usando cromatograffa semipreparativa, aplicando una columna Kromasil RP 250 x 10 de DI, 5 pm 100 A. El eluyente A fue ddH2O/TFA al 99,9/0,1 % (v/v), el eluyente B fue AcN/H2O/TFA al 90/10/0,08 % (v/v/v). Se uso el gradiente lineal desde eluyente B al 5 % hasta eluyente B al 80 % en 50 min. El analisis Maldi-TOF-MS de las fracciones recogidas arrojo una masa de 3.276,3 Da en una de las fracciones. El maximo de masa de 3.276,3 Da 5 se identifico como las especies mono-derivatizadas de T20K con 5-carboxifluorescema con un desplazamiento de masa de 357 Da. Se incubaron linfocitos T humanos y celulas Jurkat con una solucion 4 pM del derivado de T20K en medio RPMI 1640 suplementado con los aditivos descritos anteriormente durante 20 minutos. El microscopio de fluorescencia era del microscopio confocal Zeiss LSM 510. La longitud de excitacion fue de 488 nm y la longitud de onda de emision fue de 520 nm.

10

Ejemplo 16.

La presente invencion se refiere a las siguientes tablas suplementarias:

15 Tabla 1. Ciclotidos del extracto de O. affinis identificados por nano LC-MS y MS/MS

Ciclotido1

PM (media) Da2 PM (mono.) Da2 Puntuacion3 Evidencia4 PM teorico Da5 A PM Da6

kalata B1

2892,85 2890,39 1 ICP 2892,33 0,52

kalata B2

2956,14 2953,74 1 ICS 2955,38 0,76

kalata B3

3083,31 3080,64 1 ICS 3082,48 0,83

kalata B4

2893,24 2890,56 1 IS 2893,31 0,07

kalata B5

- - - P 3061,59 -

kalata B6

3029,96 3027,66 0,9999 IS 3029,42 0,54

kalata B7

3072,26 3069,74 0,9998 IS 3071,59 0,67

kalata B8

3284,34 3281,75 1 ICS 3283,79 0,55

kalata B9

- - - P 3272,72 -

kalata B9 lin

- - - P 3290,74 -

kalata B10

3030,21 3027,53 1 ICS 3030,41 0,20

kalata B10 lin

3048,54 3046,50 1 ICS 3048,43 0,11

kalata B11

2884,48 2881,44 0,9999 I 2884,26 0,22

kalata B12

- - - P 2880,27 -

kalata B13

3036,06 3033,58 1 IC 3036,46 0,40

kalata B14

3023,74 3021,17 0,9987 I 3022,43 1,31

kalata B15

2977,00 2974,56 1 ICS 2976,40 0,60

kalata B18

3147,33 3145,02 0,9977 I 3145,67 1,66

kalata S

2878,81 2875,93 0,9993 I 2878,30 0,51

ciclotido Oak6 1

3035,87 3033,49 1 IC 3035,47 0,40

[G-A] kalata B17

2906,47 2904,75 0,9995 I 2906,35 0,12

kalata b1-1

2724,12 2722,28 1 IC 2724,18 0,06

[L2A] kalata B1

2851,88 2849,54 1 IC 2850,25 1,63

Ac-[desGly]-KB1-Am

2854,31 2851,68 0,9996 I 2853,30 1,01

kalata B1 adclico

2911,32 2908,36 1 IC 2910,35 0,97

ciclotido Oak6 2

3093,29 3090,61 1 IC 3092,56 0,73

11dentificacion mediante reconstruccion de LC-MS de al menos 3 experimentos de LC-MS representativos (±1 Da, 20-70 min, EMS 1000 2 barridos) o identificacion mediante digestion (tripsina o endo-GluC), nano LC-MS/MS y busqueda en base de datos (ERA); 2Peso molecular observado; 3Puntuacion que indica la calidad del peptido reconstruido por LC-MS (< 1,0); 4Evidencias para los ciclotidos identificados, I = patron de isotipo, C = patron de 5 carga, S = secuencia completa, P = secuencia parcial o etiqueta de secuencia; 5Datos tornados de CyBase (Wang, 2008, Nucleic Acids Res, 36, D206-210); 6A PM determinada con respecto al peso molecular medio; 7 posicion del aminoacido no especificada (reemplazo de G-A).

Tabla 3. Comparacion de los valores de CI50 de los efectos inhibidores de kalata B1 (y otros ciclotidos) en diversos sistemas de ensayo celular

Sistema de ensayo

Celulas

CMhM)

Referencias

kalata B1

Actividad antiproliferativa Actividad nematocida

Citotoxicidad

otros ciclotidos*

Citotoxicidad

Citotoxicidad

celulas mononucleares de sangre periferica humanas nematodos H. contortus nematodos T. colibriformus

linfocitos linfoblasticos T humanos

estirpe celular de linfoma humano (U-937)

estirpe celular de mieloma humano (RPMI-8226/s)

3,9 ± 0,5

Grundemann et al., 2012

2,7

Huang et al., 2010

4,5

Huang et al., 2010

3,5

Daly et al., 2004

0,6-6

Svangard et al., 2004

0,3-7

Lindholm et al., 2002

1-4

Svangard et al., 2004

0,1-6

Lindholm et al., 2002

5 *Se informo de la actividad de diversos ciclotidos (varv A, varv E, varv F, vitri A, cicloviolacina O2) de Viola arvensis, V. odorata y V. tricolor

Tabla 4. Reconstruccion de LC-MS de ciclotidos de O. affinis. Se analizan mediante nano LC-MS los datos en bruto (marcados) de la reconstruccion de LC-MS de extractos de O. affinis.

10

Reconstruccion de LC-EM. EMS 1000 Da/segundo

Reconstruccion de 2.700-3.500 Da, senal a ruido: 4, 25, 50; conjuntos de datos combinados de al menos 3 ciclos de LC-MS independientes Comparaciones con CyBase:

15 PM +/-1 Da

* = otro ciclotido detectado (no Oaffinis)

** = PM +/- 2 Da

N.°

ciclotido Masa Da (media) Da (mono.) Puntuacio n Evidencia Masa teorica Da (media) A Masa Da

1

nuevo 2706,63 2704,37 0,9997 I

2

nuevo 2723,22 2721,27 1 I

3

kalata b1-1 2724,12 2722,28 1 IC 2724,18 0,0559

4

nuevo 2821,78 2819,36 1 IC

5

nuevo 2822,30 2820,55 0,9995 I

6

nuevo 2833,30 2831,41 1 I

7

[L2A] kalata B1 Ac-[desGly]-KB1- 2851,88 2849,54 1 IC 2850,25 1,6322

8

Am 2854,31 2851,68 0,9996 I 2853,3 1,0072

9

nuevo 2873,73 2871,13 0,9996 I

10

kalata S 2878,81 2875,93 0,9993 I 2878,30 0,5141

11

nuevo 2879,82 2877,46 1 IC

12

kalata B12** 2882,30 2880,83 0,9969 I 2880,27 2,0256

13

kalata B11 2884,48 2881,44 0,9999 I 2884,26 0,2236

14

nuevo 2891,45 2888,50 1 IC

15

kalata B1 2892,85 2890,39 1 IC 2892,33 0,5228

16

kalata B4 2893,24 2890,56 1 I 2893,31 0,0718

17

nuevo* 2896,70 2894,45 0,9999 I

N.°

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

ciclotido

Masa Da (media) Da (mono.) Puntuacio n Evidencia Masa teorica 1 (media)

nuevo

2897,11 2894,57 1 IC

[G-A] kalata B1

2906,47 2904,75 0,9995 I 2906,35

nuevo

2909,53 2906,90 1 IC

kalata B1 adclico

2911,32 2908,36 1 IC 2910,35

nuevo*

2912,90 2911,43 0,9999 I

nuevo*

2922,95 2920,48 1 IC

nuevo*

2925,32 2922,40 1 IC

nuevo*

2926,80 2923,70 1 IC

nuevo

2927,30 2924,66 1 IC

nuevo

2937,91 2935,50 0,9998 I

nuevo

2942,99 2940,48 1 IC

kalata B2

2956,14 2953,74 1 IC 2955,38

nuevo*

2959,95 2957,56 1 IC

nuevo

2960,36 2958,24 0,9996 I

nuevo

2969,25 2968,13 0,9997 I

nuevo*

2971,44 2969,50 1 IC

nuevo

2973,80 2970,55 1 IC

nuevo

2974,14 2971,51 1 IC

nuevo*

2975,38 2973,49 1 IC

kalata B15

2977,00 2974,56 1 IC 2976,40

nuevo*

2986,57 2983,80 1 I

nuevo

2988,28 2985,60 1 IC

nuevo

2990,37 2987,51 1 IC

nuevo

2994,11 2991,86 1 IC

nuevo*

3006,25 3003,50 1 IC

nuevo*

3010,97 3008,88 1 IC

kalata B14

3023,74 3021,17 0,9987 I 3022,43

nuevo*

3028,61 3025,92 0,9998 I

kalata B6

3029,96 3027,66 0,9999 I 3029,42

kalata B10

3030,21 3027,53 1 IC 3030,41

ciclotido Oak6 1

3035,87 3033,49 1 IC 3035,47

kalata B13

3036,06 3033,58 1 IC 3036,46

nuevo

3039,91 3037,45 1 IC

nuevo

3040,05 3036,62 1 IC

nuevo*

3045,78 3043,50 1 IC

nuevo*

3046,32 3044,95 1 IC

nuevo*

3047,97 3046,60 0,9999 I

kalata B10 lin

3048,54 3046,50 1 IC 3048,43

nuevo*

3051,82 3048,48 1 IC

nuevo*

3052,72 3049,57 1 IC

nuevo*

3065,79 3063,36 0,9997 I

kalata B7

3072,26 3069,74 0,9998 I 3071,59

nuevo*

3073,89 3072,70 0,9999 I

N.°

ciclotido Masa Da (media) Da (mono.) Puntuacio n Evidencia Masa teorica Da (media) A Masa Da

61

kalata B3 3083,31 3080,64 1 IC 3082,48 0,8309

62

nuevo* 3087,22 3084,61 1 IC

63

nuevo 3089,27 3086,96 0,9997 I

64

nuevo 3091,00 3089,03 0,9997 I

65

ciclotido Oak6 2 3093,29 3090,61 1 IC 3092,56 0,7328

66

nuevo* 3097,63 3094,57 1 IC

67

nuevo* 3099,85 3096,60 1 IC

68

kalata B18** 3147,33 3145,02 0,9977 I 3145,67 1,6615

69

nuevo* 3266,81 3264,99 0,9997 I

70

kalata B8 3284,34 3281,75 1 IC 3283,79 0,5453

71

nuevo* 3300,96 1 C

72

nuevo 3446,88 3444,98 0,9998 I

Total:

72

Nuevos:

25

Nuevos*:

24

Claims (25)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica que comprende un ciclotido de tipo kalata B no injertado, siendo dicho ciclotido un peptido ciclado de cabeza a cola cuya cadena ciclotfdica incluye seis restos de cistema conservados capaces de formar tres enlaces disulfuro dispuestos en un motivo de nudo de cistina dclica (CCK), para su uso en el tratamiento o en la prevencion de un trastorno autoinmune o una inflamacion mediada por linfocitos mediante inmunosupresion.
2. 2. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicho ciclotido no incluye otro peptido terapeutico.
3. 3. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que dicho ciclotido comprende el tramo de aminoacidos (formula II)

   Xxxi-Leu-Pro-Val-Cys-Gly-Glu-Xxx2-Cys-Xxx3-Gly-Gly-Thr-Cys-Asn-Thr-Pro-Xxxi-Cys-Xxxi-Cys-Xxxi-Trp-Pro-Xxxi-

   Cys-Thr-Arg-Xxxi, (SEQ ID NO: i7)

   en el que Xxxi es cualquier aminoacido, aminoacido no natural o peptidomimetico; Xxx2 es cualquier aminoacido, aminoacido no natural o peptidomimetico, excepto Lys; y Xxx3 es cualquier aminoacido, aminoacido no natural o peptidomimetico, a excepcion de Ala o Lys.
4. 4. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 3, en la que dicho ciclotido comprende el tramo de aminoacidos de formula II segun lo definido en la reivindicacion 3, que tiene

   (i) al menos i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o i0 de los restos de aminoacidos acidos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido acidos;

   (ii) al menos i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o i0 de los restos de aminoacidos basicos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido basicos; y/o

   (iii) al menos i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o i0 de los restos de aminoacidos alifaticos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacidos alifaticos.
5. 5. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 4, en la que dicho ciclotido tiene un efecto antiproliferativo sobre una o varias celulas inmunes, y/o suprime/reduce la/s funcion/es efectora/s de una o varias celulas inmunes.
6. 6. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 6, en la que dicho ciclotido comprende:

   (i) una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 5, i, 4, 6, 2 y 3;

   (ii) una secuencia de aminoacidos codificada por una secuencia de nucleotidos que codifica una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 7, 5, i, 4, 6, 2 y 3; o

   (iii) una secuencia de aminoacidos que es al menos un 90 % identica a cualquier secuencia de aminoacidos de (i)

   a (ii).
7. 7. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 6, en la que dicho ciclotido consiste en una forma ciclada de cabeza a cola de la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: i o 2 que tiene

   (i) al menos i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o i0 de sus restos de aminoacidos acidos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido acidos;

   (ii) al menos i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o i0 de sus restos de aminoacidos basicos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacido basicos; y/o

   (iii) al menos i, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o i0 de sus restos de aminoacidos alifaticos reemplazados por uno o varios restos de aminoacidos diferentes seleccionados del grupo que consiste en restos de aminoacidos alifaticos.
8. 8. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 7, en la que dicho ciclotido es kalata Bi o kalata B2.
9. 9. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 8, en la que dicho ciclotido se va a administrar de modo que se produzca actividad citostatica, pero no citotoxica.
10. 10. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones i a 9, en la que dicho ciclotido se va a administrar en una cantidad de modo que se alcance una concentracion (en suero) en el intervalo de i a 50 pM, preferentemente, en el intervalo de 3 a i0 pM, mas preferentemente, de 4 a 9 pM, y todavfa mas preferentemente en el intervalo de 5 a 9 pM.

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    35

    40

    45

    50

    55

    60
11. 11. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que dicha composicion farmaceutica comprende ademas uno o mas inmunosupresores adicionales.
12. 12. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 11, en la que dicho inmunosupresor adicional es uno o mas inmunosupresores seleccionados del grupo que consiste en Ciclosporina A, Muromonab- CD3 y Basiliximab.
13. 13. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicho trastorno autoimnue se selecciona del grupo que consiste en:

    (i) esclerosis multiple;

    (ii) soriasis;

    (iii) lupus eritematoso sistemico;

    (iv) smdrome de Sjoegren;

    (v) artritis reumatoide;

    (vi) purpura trombocitopenica idiopatica;

    (vii) diabetes;

    (viii) vasculitis; y

    (ix) enfermedad de Crohn.
14. 14. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que dicha inflamacion mediada por linfocitos es una inflamacion mediada por linfocitos T.
15. 15. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la reivindicacion 14, en la que dicha inflamacion mediada por linfocitos es queratoconjuntivitis seca o smdrome del ojo seco (DES).
16. 16. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en la que dicha secuencia de aminoacidos de dicho ciclotido esta marcada (radiactivamente, fluorescentemente o con biotina).
17. 17. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que

    (i) la proliferacion de una o varias celulas inmunes;

    (ii) la/s funcion/es efector/as de una o varias celulas inmunes;

    (iii) la desgranulacion/citotoxicidad de una o varias celulas inmunes;

    (iv) la expresion de un receptor superficial de citocinas en una o varias celulas inmunes;

    (v) la proliferacion de linfocitos activados (primarios);

    (vi) la proliferacion de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC);

    (vii) la secrecion/produccion de IL-2, IFN-gamma y/o TNF-alfa;

    (viii) la desgranulacion/citotoxicidad de PBMC CD107a+ CD8+; y/o

    (ix) la expresion del receptor superficial de IL-2 CD25

    se va/n a suprimir.
18. 18. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en la que dicho ciclotido

    (i) es capaz de suprimir/reducir la secrecion/produccion de IL-2, IFN-gamma y/o TNF-alfa;

    (ii) es capaz de suprimir/reducir la desgranulacion/citotoxicidad de PBMC CD107a+ CD8+; y/o

    (iii) es capaz de suprimir/reducir la expresion del receptor superficial de IL-2 CD25.
19. 19. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que el efecto antiproliferativo o la supresion/reduccion estan mediados de una manera dependiente de IL-2, IFN- gamma y/o TNF-alfa y/o pueden ser antagonizados por IL-2.
20. 20. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y 9 a 19, en la que dicho ciclotido de tipo kalata B no injertado es un ciclotido mutado que tiene la misma mutacion que una cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 7.

    imagen1

    imagen2

    proliferados

    muertos

    Figura 2

    CRT

    50

    M g/ ml

    on

    [jg/m!

    70

    Mg'ml

    80

    lig/ml

    90

    Mg/ml

    100

    MO'ml

    ssc

    inuertos

    VIVOS

    proliferados

    reposo

    otri

    CPI

    pin

    100

    ssc

    imagen3

    (vnw)tuu nzy/

    Figura 3

    imagen4

    O)

    K)

    |jM kalata B1

    % de linfocitos proliferados {para el control)

    imagen5

    (£>

    C

    T

    Cl)

    CD

    CO

    imagen6

    1,8 UM 3,5 uM 7[JM 14 jjM

    imagen7

    Anexina V

    c- i

    j

    , viable

    ■c O

    ’O '

    -

    O'-

    ieer6ticos

    o ©

    </r>

    imagen8

    >

    Celulas subG1+ (diferencias con el control)

    o -* fO w

    imagen9

    T1

    (Q

    c

    T

    D)

    Ol

    CD

    Celulas necroticas+

    (diferencias con el control)

    imagen10

    □ o

    Celulas apoptoticas+especificas

    (diferencias con el control)

    © NJ 4*. © « ©

    imagen11

    Figura 5 (continuacion)

    % de linfocitos proliferados (con respecto al control)

    w qi n

    O Of O U!

    imagen12

    10(H

    imagen13

    CD

    CD

    CD

    Celulas subG1 + (diferencias con el control)

    imagen14

    % de linfocitos proliferados (con respecto al control)

    >

    imagen15

    Figura &

    CD

    3

    cp

    3'

    0)

    imagen16

    Celulas necroticas* (diferencias con el control)

    imagen17

    D

    Celulas apoptoticas* especificas (diferencias con el control)

    o to 4k o>

    imagen18

    Figura 8 (continuacion)

    CD

    CO

    % de PBMC proliferadas del total

    imagen19

    Jl

    cq‘

    c

    m

    (P

    Kalata B1 - T8K G18K

    imagen20

    kalats

    Control de PBS

    Dias

    nf amacion

    Destine inacion

    Dano axona

    kalata B1

    Contro de

    ■, PBS

    imagen21

    MOG UCD3/28

    imagen22

    % de PBMC CD25

    Figura 11

    Dia 1

    SC

    CTRL CsA

    .11! j

    M. ,32

    w"

    or ‘IE_________

    M jr

    T20K V10A V10K T8K

    imagen23

    imagen24

    Peptido .

    T20K V10A V10K T8K

    imagen25

    imagen26

    imagen27

    imagen28

    imagen29

    imagen30

    “D

    EL

    O

    o

    in

    >

    T)

    X

    >

    % de PBMC CD8+ TNF-a* (con respecto a\ control)

    ro -p- a> o? o o o o o o o

    ---------J_________________I____________L

    I I I

    00

    120

    Peptido - T20K

    co

    <J>

    ro

    T1

    p*

    CQ

    3"

    C

    cn

    O “0

    £ X

    > >

    I +

    + +

    +

    % de secrecion de TNF-a (con respecto al control)

    -1 —*■ N) ro

    fji o cn O ui

    imagen31

    imagen32

    Figura 17 A

    Jurkat con liberacion de Ca2+

    imagen33

    imagen34

    1,42-1-------------------r...........................i--------------------r-

    0 1(90 200 300

    Tiempo en segundos

    PHA- L+PMA+lono -m- CsA -A- T20K V10K Celulas

    400

    imagen35

    Inyeccion de MOGj5.55/CFA

    (B] T20K

    a
21. 1e.10.12

    jC] T2CK

    (A T20K

    7
22. 33.10.12

    9-11.12
23. 9.10-12

    Dios
24. 15.117.10 12.

    Inyeccion de Pertussis a 2 (ig/ml

    D=10

    A. T2QK

    10 mg/kg T20K

    PBS

    PBS

    n=1Q

    B. T2QK

    10 mg/kg T2QK

    n=10

    10 mg/kg T20K

    PBS

    C.T20K

    0 No tratado previamente

    n=10

    Figura 19

    Puntuacion de EAE

    2 5*

    Dia 20
25. 2.0-

    T20K (-7)

    T20K 0)

    1.5

    T20K (7)

    No tratado

    previamente

    0,5-

    Dias

    imagen36

    T20K (-7) T20K (0) T20K (7)

    No tratado previamente

    Peso

    de

    EAE

    Dias

    imagen37

    imagen38

    imagen39

    imagen40

    imagen41

    imagen42

    imagen43

    imagen44

    Figura 23 A

    imagen45

    imagen46

    imagen47

    imagen48