ES2678023T3

ES2678023T3 - Factores extraídos de embriones de pez y uso de mezclas de los mismos en el control de la multiplicación y la diferenciación de células madre

Info

Publication number: ES2678023T3
Application number: ES15179955.8T
Authority: ES
Inventors: Piermario Biava
Original assignee: BIAVA MAURA; Biava Michele
Current assignee: Biava Maura; Biava Michele
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2015-08-06
Publication date: 2018-08-08
Anticipated expiration: 2035-08-06
Also published as: EP2982375B1; US9750773B2; US20160038546A1; EP2982375A1

Abstract

Un extracto de embriones de peces en estadios seleccionados de la diferenciación de células madre, caracterizado por que es una mezcla de extractos de embriones de peces cebra en el estadio de blástula-gástrula media, estadio de brote caudal, estadio de somitas, estadio de 20 somitas y estadio de faríngula.

Description

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DESCRIPCION

Factores extrafdos de embriones de pez y uso de mezclas de los mismos en el control de la multiplicacion y la diferenciacion de celulas madre

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a extractos de embriones de pez cebra y al uso de mezclas de los mismos en el control de la multiplicacion y la diferenciacion de celulas madre.

[0002] La presente invencion se origina en el campo epigenetico y sus aplicaciones en un contexto nutricional, cosmetico y medico.

[0003] Especfficamente, la presente invencion se refiere a factores de crecimiento y diferenciacion celular recogidos de embriones de pez cebra en estadios especfficos de diferenciacion de celulas madre.

Antecedentes de la invencion

[0004] El aumento considerable de la edad promedio expone segmentos de la poblacion cada vez mayores a los riesgos de desarrollar tumores y enfermedades degenerativas cronicas. Estas condiciones constituyen uno de los problemas de salud mas graves para los que todavfa no se dispone de una respuesta terapeutica efectiva, debido a la causalidad multifactorial y a la complejidad de los mecanismos patogenicos implicados en su genesis y desarrollo.

[0005] Se han realizado algunos progresos en los ultimos tiempos como resultado de los estudios de biologfa con celulas madre, de los que se desprende que la neoplasia tumoral podrfa ser, al menos en parte, atribuible a la presencia de celulas madre alteradas (celulas parecidas a las madre cancerfgenas). Este hallazgo ha dirigido numerosas lfneas de investigacion sobre la reprogramacion de las celulas parecidas a las madre cancerfgenas.

[0006] El uso de ciertos factores de crecimiento en el campo de la reprogramacion de celulas parecidas a las madre cancerfgenas y la investigacion del trasplante con celulas madre ha llevado a la hipotesis de que los factores de crecimiento y diferenciacion de celulas madre tambien podrfan ser utiles para determinar el destino de las celulas madre normales asf como alteradas, regenerarlas y/o diferenciarlas.

[0007] La presente invencion se origina precisamente en este campo de la investigacion cientffica.

[0008] Un objetivo general de la presente invencion es identificar y proporcionar factores de crecimiento y diferenciacion celular que desempenan un papel clave en la regulacion y diferenciacion de celulas madre y encontrar una aplicacion para estos factores en el contexto nutricional y/o medico. Otro objetivo de la invencion es identificar y seleccionar factores biologicos producidos por las celulas madre de especies de pez cebra en estadios especfficos del desarrollo embrionario y encontrar aplicaciones especfficas en el contexto medicinal, en particular, en la prevencion y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y/o formas tumorales.

Sumario de la invencion

[0009] La presente invencion se origina al identificar estadios de diferenciacion especfficos de las celulas madre de un embrion de pez cebra en el que se producen factores especfficos de crecimiento y/o diferenciacion de celulas madre, que encuentra aplicacion en el campo medico, nutricional o cosmetico.

[0010] Segun ciertos aspectos de la invencion, se proporciona un metodo innovador para dirigir el destino de las celulas madre normales o patologicas.

[0011] La presente descripcion tambien contiene ensenanzas destinadas a mejorar la eficacia y los resultados terapeuticos logrados con el trasplante de celulas madre e identifica rutas alternativas para el propio trasplante.

[0012] Segun algunos aspectos, la invencion se origina al haber encontrado que los efectos biologicos y terapeuticos consecuentes del trasplante de celulas madre no son tan atribuibles al trasplante de las propias celulas madre sino a la produccion de celulas madre debido a factores de crecimiento y/o diferenciacion celular.

[0013] El solicitante ahora ha identificado factores de diferenciacion y crecimiento celular especfficos y las propiedades que los hacen aplicables para ralentizar los procesos de envejecimiento celular y normal y para el tratamiento de ciertas enfermedades, tales como enfermedades neurodegenerativas y tumores.

[0014] En particular, se ha descubierto que una mezcla de factores de crecimiento y diferenciacion celular de estadios seleccionados tiene una regeneracion celular eficaz y, por lo tanto, encuentra aplicacion para ralentizar el proceso de envejecimiento del cuerpo y tener una accion antienvejecimiento. Los factores extrafdos en tres estadios seleccionados pueden combinarse con otros factores extrafdos de estadios especfficos adicionales de diferenciacion

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de celulas madre, ampliando las posibilidades de uso previstas en el campo medico, nutricional y cosmetico para los factores extrafdos en los dos estadios seleccionados de diferenciacion. Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporcionan extractos de celulas madre embrionarias, de peces cebra, en estadios de diferenciacion de celulas madre embrionarias o de desarrollo embrionario segun la reivindicacion 1.

[0015] Se descubrio que las mezclas de factores de crecimiento y/o de diferenciacion celular extrafdos en estadios seleccionados de desarrollo embrionario, en particular de peces cebra, desempenan un papel en el proceso de regeneracion de celulas madre y por lo tanto encuentran aplicacion en todos los procesos en los que se requiere la accion de reparacion celular y regeneracion tisular, tal como por ejemplo en el caso de quemaduras, procesos de tejido necrotico, en particular, de la epidermis, en fistulas, ulceras por presion o como agentes antienvejecimiento, por ejemplo.

[0016] Durante la experimentacion con las celulas madre de especies de peces, tambien se observo que los factores de crecimiento y/o diferenciacion extrafdos en el estadio de diferenciacion de las celulas madre embrionarias a las/o 24 horas posteriores a la fertilizacion intervienen y ejercen una influencia en el estadio de diferenciacion celular.

[0017] En particular, la combinacion o mezcla de factores de crecimiento y/o diferenciacion celular segun la reivindicacion 1 encuentra aplicacion en la regulacion de procesos celulares que son la base del envejecimiento y muerte celular. Segun algunas realizaciones, la combinacion de factores recogidos en estos estadios encuentra aplicacion en la prevencion y/o el tratamiento de enfermedades degenerativas del sistema nervioso central, tales como Alzheimer o Parkinson y/o del sistema cardiocirculatorio, tal como en el caso de infarto de miocardio.

[0018] El solicitante ha descubierto, segun un aspecto de la invencion, que combinar extractos o factores de crecimiento y/o diferenciacion celular extrafdos de celulas madre embrionarias en el estadio de blastula-gastrula media y en el estadio de brote caudal con factores de crecimiento y/o diferenciacion celular extrafdos en los estadios de diferenciacion de 5 somitas, 20 somitas y en el estadio de diferenciacion de la farrngula, se obtiene una accion de diferenciacion combinada particularmente intensa y una regulacion celular.

[0019] Esta accion combinada encuentra aplicacion en el campo medico normalmente en la prevencion y tratamiento de afecciones asociadas con un aumento de la tasa de replicacion celular, como en el caso de tumores o enfermedades de la piel en las cuales las celulas epiteliales tienen una tasa de replicacion celular mayor de lo normal, como en el caso de psoriasis, eccema, lupus eritematoso, atopfa.

[0020] Segun algunas realizaciones de la invencion, los factores de crecimiento y diferenciacion utilizados en el contexto de la invencion se obtienen a partir de celulas madre de pez cebra.

[0021] Segun un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona una composicion que comprende factores de crecimiento y/o diferenciacion celular extrafdos de embriones de pez cebra segun uno de los aspectos de la invencion descritos anteriormente y un vehfculo comestible y/o farmaceuticamente aceptable.

[0022] Segun algunas realizaciones, la composicion de la invencion es una composicion farmaceutica en la que el vehfculo es o comprende un excipiente farmaceuticamente aceptable.

[0023] Segun otras realizaciones, la composicion de la invencion es un producto nutraceutico o dietetico o un alimento para fines especiales o una composicion cosmetica.

Breve descripcion de los dibujos

[0024] Algunas de las caractensticas y ventajas de la presente invencion resultaran evidentes a partir de los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 ilustra el analisis de las protemas de los factores extrafdos de las celulas madre del pez cebra en 5 estadios de desarrollo y la mezcla de los 5 estadios;

La Figura 2 ilustra un grafico que notifica los resultados de un ensayo de proliferacion (MTT) a las 24 horas en celulas madre mesenquimales humanas (CMMh) de factores de crecimiento individuales (PC1-PC5) y de la mezcla de los mismos (PC6) en 4 concentraciones;

La Figura 3 muestra un grafico que notifica los resultados de un ensayo de proliferacion (MTT) a las 72 horas en celulas madre mesenquimales humanas (CMMh) de factores de crecimiento individuales (PC1-PC5) y de la mezcla de los mismos (PC6) en 4 concentraciones;

La Figura 4 muestra graficos de barras que ilustran el nivel de inmunofluorescencia con yoduro de propidio del area CA1 del hipocampo 24 h despues de 1 h de privacion de suero en presencia o ausencia de la mezcla ABC de factores del ejemplo 2.

La Figura 5 ilustra la inmunofluorescencia con yoduro de propidio del area CA1 del hipocampo 24 h despues de 1 h de tratamiento con NMDA (50 pM) en presencia o ausencia de la mezcla ABC.

La Figura 6 ilustra la inmunofluorescencia con yoduro de propidio del area CA1 del hipocampo 24 h despues de 1

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h de tratamiento con NMDA (300 pM) en presencia o ausencia de la mezcla ABC.

La Figura 7 ilustra la cuantificacion de la inmunofluorescencia con yoduro de propidio del area CA1 del hipocampo 24 h despues de 1 h de privacion de suero en presencia o ausencia de los extractos A, B o mezcla C. La Figura 8 ilustra la cuantificacion de la inmunofluorescencia con yoduro de propidio del area CA1 del hipocampo despues de 24 h de tratamiento con NMDA (50 pM, 1 h) en presencia o ausencia de los extractos A, B o mezcla C.

Descripcion detallada de la invencion

[0025] El solicitante, al estudiar la diferenciacion de las celulas madre embrionarias de los peces cebra en particular, ha identificado los factores de crecimiento y diferenciacion de celulas madre que son utiles para regenerar y/o diferenciar las celulas madre.

[0026] En particular, la invencion se origina a partir de:

A) haber identificado los momentos mas significativos de la diferenciacion de varios tipos de celulas madre,

B) haber analizado y seleccionado los dos estadios tempranos de diferenciacion de celulas madre en los que se producen factores esenciales para la regeneracion celular,

C) haber identificado la distribucion porcentual especffica de las fracciones proteicas presentes en los dos estadios seleccionados y las protefnas producidas en esos estadios tempranos especfficos de diferenciacion celular, en particular en el momento en que las celulas madre se diferencian de totipotente a pluripotente;

D) haber encontrado aplicaciones especfficas en el campo medico para factores de crecimiento y diferenciacion celular identificados mediante la realizacion de estudios in vitro, por ejemplo, mediante el analisis de los efectos sobre la multiplicacion, proliferacion y diferenciacion de celulas madre mesenquimales humanas recogidas de tejido adiposo.

[0027] Segun algunos aspectos de la invencion, se descubrio que al proporcionar extractos de embriones de peces cebra, en particular que contienen celulas madre en estadios especfficos de desarrollo embrionario o diferenciacion de celulas madre, se esta interviniendo en la regulacion y/o diferenciacion de celulas humanas.

[0028] Este enfoque revoluciona el enfoque convencional del uso de celulas madre para intervenir en algunos mecanismos celulares considerados en el origen de enfermedades que originan un crecimiento celular descontrolado.

[0029] Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un extracto obtenido por extraccion de embriones de pez cebra en estadios seleccionados de diferenciacion de celulas madre segun la reivindicacion 1. Segun ciertas realizaciones i) los extractos o ii) factores de crecimiento y/o diferenciacion celular extrafdos de embriones de peces cebra en el estadio de blastula-gastrula media y en el estadio del brote caudal y farfngula tienen la siguiente distribucion porcentual de fracciones proteicas, refiriendose a las protefnas totales que tienen un peso molecular inferior a 100 Kdaltons

fraccion proteica de 14 kilodaltons: 14,6 % fraccion proteica de 20 kilodaltons: 4,2 % fraccion proteica de 25-30 kilodaltons: 28,4 % fraccion proteica de 45 kilodaltons: 14,8 % fraccion proteica de 97 kilodaltons: 38 %.

[0030] La preparacion de los factores de crecimiento o extractos embrionarios que los contienen se puede lograr siguiendo tecnicas convencionales. En ciertas realizaciones, la preparacion de los extractos embrionarios de la invencion comprende las siguientes etapas:

a) los embriones se recogen en un estadio especffico del desarrollo embrionario;

b) se anade un disolvente;

c) la mezcla obtenida en la etapa b) se somete a agitacion, con un turbo-emulsionante, por ejemplo;

d) la mezcla se filtra opcionalmente, por medio de filtros de 90 micrometres por ejemplo y

e) con filtros de 5-10 micrometros, por ejemplo.

[0031] Se obtiene una solucion madre de la etapa c), que se puede diluir con uno o mas disolventes biocompatibles convencionales para obtener soluciones con diferentes grados de dilucion dependiendo de las necesidades y usos.

[0032] Segun algunas realizaciones, el disolvente utilizado en la etapa b) se basa en una mezcla de glicerina y una solucion acuosa de alcohol etflico, por ejemplo 30 % v/v, normalmente en una relacion glicerol/alcohol de 85:15 v/v.

[0033] La relacion en peso de dicho disolvente y dichos embriones esta comprendida preferentemente entre 20:1 y 2:1.

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[0034] La agitacion de la etapa c) se lleva a cabo preferentemente a temperature ambiente, tambien se aplica a las otras operaciones, durante un periodo de tiempo que normalmente varfa de 1 a 2 horas.

[0035] Segun algunas realizaciones, la etapa c) de mezcla o agitacion se realiza con un turbo-emulsionante, emulsionando cada uno de ellos 1 a 3 veces durante 1-4 minutos.

[0036] Segun otro aspecto, la presente invencion proporciona una mezcla o combinacion de factores de crecimiento y/o diferenciacion celular extrafdos o recogidos de embriones de peces cebra en el estadio de diferenciacion de celulas madre embrionarias de blastula-gastrula media y en el estadio del brote caudal con factores en el estadio de diferenciacion seleccionado en los estadios de 5 somitas, 20 somitas y en el estadio de diferenciacion de la farfngula, en particular en el estadio de la farfngula temprana.

[0037] En ciertas realizaciones, la mezcla de extractos de embriones de peces cebra o factores de crecimiento y/o diferenciacion celular contiene 5 % en peso de factores extrafdos en el estadio de blastula-gastrula media, 10 % de factores extrafdos en el estadio del brote caudal, 10 % de factores extrafdos en el estadio de 5 somitas, 25 % de factores extrafdos en el estadio de 20 somitas, 50 % de factores extrafdos en el estadio de la farfngula.

[0038] La mezcla de factores segun este ultimo aspecto de la invencion encuentra aplicacion en el campo medico en el tratamiento de afecciones con tasa de replicacion celular anormal como en el caso de tumores o de ciertas afecciones de la piel, tales como en casos de psoriasis, eccema, lupus eritematoso, atopfa.

[0039] El solicitante ha observado ademas experimentalmente que los factores de crecimiento y diferenciacion

celular, en particular en las mezclas de estadios 1 y 2 con los estadios de 5 somitas, 20 somitas y en el estadio de la farfngula, determinan una ralentizacion de la proliferacion celular y un aumento en la muerte celular programada, o apoptosis, mientras que los estadios tempranos incluso han resaltado un efecto multiplicativo.

[0040] Ninguno de los estadios y dosis ensayadas conducen a la muerte por necrosis o a toxicidad para las

celulas. Los extractos han demostrado ser en consecuencia inofensivos y seguros.

[0041] Los experimentos llevados a cabo tambien han demostrado que cuando la informacion es suficientemente completa, se obtienen resultados inesperados, en proteccion contra los ataques que causan degeneracion y dano tisular. Este hecho fue confirmado por los experimentos que se relacionaron con la proliferacion o, por el contrario, con la ralentizacion de la multiplicacion de celulas madre mesenquimales, que demuestran que pueden dirigirse tanto hacia la regeneracion como hacia la diferenciacion, a traves del uso especffico y selectivo de la diversas redes de protefnas identificadas en los estadios de diferenciacion individual del embrion de peces cebra, y sobre todo, mediante el uso de las mezclas de los mismos, o de las mezclas de los estadios de diferenciacion multiple. Los datos experimentales notificados en los ejemplos demuestran que los diversos factores de crecimiento y diferenciacion estudiados tienen la capacidad de regular selectiva y especfficamente diversos genes que son la expresion de la estaminalidad o diferenciacion celular.

[0042] En la presente descripcion, la terminologfa extracto(s) de embrion(es) de peces cebra tiene esencialmente el mismo significado que factores de crecimiento y/o diferenciacion celular. Normalmente, los factores de crecimiento y/o diferenciacion celular mencionados en la presente descripcion son extractos de embriones de peces cebra.

[0043] El termino factores debe ser entendido como factores de crecimiento y/o diferenciacion celular.

[0044] Los factores de crecimiento y diferenciacion estudiados que se constituyen son epigeneticamente capaces de regular la expresion genica de celulas madre, para dirigirlos hacia la regeneracion y/o hacia la diferenciacion. Este hallazgo es muy importante en la medicina regenerativa, donde los tejidos deben regenerarse, como en el caso de las ulceras, heridas, etc., o los tejidos que deben regenerarse en el caso de enfermedades degenerativas.

[0045] Estos datos apoyan el uso de los factores relacionados con la invencion en los trasplantes de celulas madre, teniendo en cuenta que, al ser moleculas pequenas que tienen un bajo peso molecular, como lo demuestran los estudios de proteomica notificados en la presente memoria, tienen una absorcion sublingual o percutanea.

[0046] Un estudio clfnico aleatorizado y controlado de 179 casos de carcinoma hepatocelular intermedio en estadio avanzado, en el que otros tratamientos ya no eran posibles y, por lo tanto, tratados compasivamente con estos factores, sublingualmente, demostro una regresion del 20 % y no progresion del 16 % con un aumento en la supervivencia de los pacientes tratados. Por lo tanto, existe una absorcion percutanea de estos factores en pacientes con psoriasis, en quienes el tratamiento unilateral de las lesiones ha resultado en una mejorfa o en la desaparicion de lesiones incluso contralaterales.

[0047] Los factores de diferenciacion celular o extractos de embriones de peces cebra de la invencion pueden, por consiguiente, encontrar aplicacion

a) como agentes antienvejecimiento

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b) como factores de regeneracion tisular para tratar cicatrices, ulceras por presion, ulceras varicosas, etc.

c) junto con los trasplantes de celulas madre para mejorar el efecto clfnico de los trasplantes

d) para prevenir o tratar diversas enfermedades degenerativas cronicas, tales como enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, enfermedad de Parkinson, Alzheimer, esclerosis multiple, ELA, cardiovasculares, por ejemplo, cardiopatfa isquemica, infarto de miocardio, apoplejfa y tumor. El extracto de la invencion encuentra aplicacion en el tratamiento de la apoplejfa (Therapeutic Effects of hMAPC and hMSC Transplantation after Stroke in Mice, 2012 Silvia Mora-Lee et al. en PLoS ONE 7(8): e43683. doi:10.1371/journal.pone.0043683 editor: Brahim Nait-Oumesmar, Universidad Pierre et Marie Curie - Paris 6, INSERM, CNRS, Francia).

e) en afecciones oculares relacionadas con el envejecimiento, tales como maculopatfa exudativa. Segun ciertos aspectos, la invencion se refiere a extractos o a los factores y las mezclas de los mismos segun una cualquiera de las realizaciones y composiciones descritas anteriormente que los contienen, para su uso en combinacion con un trasplante de celulas madre o para reemplazar el trasplante de celulas madre.

[0048] Segun ciertos aspectos, la presente invencion proporciona por lo tanto una composicion que comprende extractos o factores de crecimiento y/o diferenciacion celular extrafdos de embriones de peces cebra segun uno cualquiera de los aspectos y realizaciones descritos anteriormente.

[0049] Segun algunas realizaciones, la composicion de la invencion es una composicion farmaceutica, un suplemento dietetico o un nutraceutico que se puede introducir en el regimen dietetico de un individuo que padece una o mas de las afecciones o condiciones descritas previamente.

[0050] En algunas realizaciones, la composicion de la invencion es un producto nutraceutico que comprende las mezclas de factores segun las realizaciones descritas previamente y un vehfculo comestible. El producto nutraceutico de la invencion encuentra uso para mejorar las condiciones nutricionales del cuerpo humano o el estado funcional y la calidad de vida.

[0051] En algunas realizaciones, la composicion de la invencion puede comprender ademas sustancias activas, vitaminas, sustancias nutritivas, micronutrientes y/o minerales.

[0052] El termino "vehfculo", como se utiliza en la presente memoria, indica un medio, excipiente, diluyente con el que se administra la combinacion de sustancias terapeuticas o activas.

[0053] Se contempla el uso de cualquier vehfculo y/o excipiente adecuado para la forma de preparacion deseada para su administracion a seres humanos con los compuestos descritos en la presente invencion.

[0054] Para los fines de la presente solicitud, la expresion "fisiologicamente aceptable" o "comestible" indica sustancias comestibles que estan aprobadas por las autoridades sanitarias para su uso en aplicaciones farmaceuticas, nutricionales o dieteticas.

[0055] Un vehfculo fisiologicamente aceptable puede ser un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

[0056] Las composiciones de la presente invencion comprenden cualquier composicion producida administrando el extracto o los factores de crecimiento y diferenciacion celular de la presente invencion y un vehfculo fisiologica o farmaceuticamente aceptable. Estas composiciones son adecuadas para su uso dietetico, nutricional, farmaceutico o dietetico en mamfferos, en particular en seres humanos.

[0057] Segun algunas realizaciones, la composicion de la invencion es un alimento para fines medicos especiales.

[0058] Segun otro aspecto, se describe un metodo de tratamiento terapeutico de una enfermedad seleccionada entre enfermedad degenerativa, en particular enfermedad neurodegenerativa, enfermedad cardiovascular o tumoral, que comprende la administracion de una cantidad terapeuticamente eficaz de un extracto de embrion de pez cebra en los estadios de blastula-gastrula media, brote caudal y farfngula, y 5 somitas y 20 somitas de diferenciacion celular.

[0059] La composicion de la invencion puede adoptar una amplia variedad de formas de preparacion, dependiendo de la via de administracion deseada.

[0060] Por ejemplo, para administracion oral, la composicion puede encontrarse en forma solida, como comprimidos, capsulas, polvos, en granulos, formulaciones de liberacion prolongada de las sustancias activas, por ejemplo. Las composiciones en forma solida, en particular en forma granular o en polvo, se prefieren con respecto a los otros tipos de preparaciones.

[0061] Las preparaciones en forma solida pueden comprender uno o mas vehfculos tales como almidones, azucares, celulosa microcristalina, y opcionalmente diluyentes, agentes de granulacion, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes, por ejemplo.

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[0062] Los comprimidos, pfldoras, capsulas, granulos tambien pueden contener un aglutinante tal como tragacanto, goma arabiga, almidon de mafz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicalcico; un agente disgregante tal como almidon de mafz, almidon de patata, acido algfnico; un lubricante tal como estearato de magnesio; un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con tecnicas tradicionales.

[0063] Cuando la forma unitaria farmaceutica es una capsula, puede contener, ademas de los materiales del tipo mencionado anteriormente, un vehfculo lfquido tal como un aceite adiposo.

[0064] En el caso de preparaciones en forma lfquida para administracion oral, tales como por ejemplo en el caso de suspensiones, emulsiones, soluciones, un vehfculo adecuado puede seleccionarse entre agua, glicoles, aceites, alcohol y mezclas de los mismos.

[0065] Los agentes aromatizantes, conservantes, agentes colorantes y similares tambien pueden estar presentes en la composicion.

[0066] En algunas realizaciones, los factores de crecimiento contenidos en la composicion de la presente invencion se pueden combinar o mezclar como sustancias activas en una mezcla fntima con un vehfculo y/o excipiente comestible adecuado segun la industria farmaceutica y alimentaria o las tecnicas nutricionales tradicionales.

[0067] Las composiciones para uso farmaceutico, cosmetico o nutricional pueden presentarse de forma adecuada en forma farmaceutica unica y prepararse mediante cualquier tecnica bien conocida de la tecnica farmaceutica o dietetica.

[0068] En algunas realizaciones, las composiciones o preparaciones de la invencion pueden contener al menos 0,0001 % de cada factor de crecimiento. La cantidad de factores de crecimiento presentes en estas composiciones es tal que se obtendra una dosificacion profilactica o terapeuticamente eficaz.

[0069] En algunas realizaciones, la composicion de la invencion comprende ademas uno o mas componentes adicionales tales como aditivos, materiales de relleno, estabilizantes, emulsionantes, texturizadores, agentes formadores de pelfcula, plastificantes, humectantes y espesantes.

[0070] Otros materiales pueden estar presentes, tales como revestimientos o modificar la forma ffsica de la unidad farmaceutica. Por ejemplo, los comprimidos pueden recubrirse con goma laca, azucar o ambos. Para prevenir la disgregacion durante el transito a traves de la parte superior del tubo digestivo, la composicion puede ser una formulacion con recubrimiento enterico.

[0071] Un jarabe o elixir puede contener, ademas de la sustancia activa, sacarosa como agente edulcorante, conservantes adecuados, un colorante y un agente aromatizante tal como sabor de cereza o naranja.

[0072] En algunas realizaciones, la composicion de la invencion es una composicion cosmetica que comprende un vehfculo cosmeticamente aceptable.

[0073] Las composiciones cosmeticas adecuadas se encuentran en forma de una crema, locion, suero o emulsiones del tipo aceite/agua.

[0074] Las composiciones cosmeticas de la invencion encuentran aplicacion en el tratamiento del envejecimiento de la piel, en el tratamiento cosmetico de arrugas, manchas en la piel y en la piel seca y descamada, por ejemplo.

[0075] Segun ciertas realizaciones, la composicion farmaceutica es para uso en medicina en combinacion con un trasplante de celulas madre o para reemplazar el trasplante de celulas madre.

[0076] En algunas realizaciones, la formulacion contendra cantidades de factores de crecimiento que dependeran de la gravedad de los sfntomas asociados, la afeccion, las terapias adicionales en curso, el estado de salud del individuo y la respuesta a la combinacion de sustancias activas. En algunas realizaciones, la dosis esta en el intervalo de 0,0000l % en peso a aproximadamente 10 %, de 0,0001 a 5 %, de 0,001 a 1 %, de 0,10 a 1 % en peso de la formulacion.

[0077] La presente invencion se describira ahora a continuacion con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan solo con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos de la presente invencion.

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Ejemplos Ejemplo 1

[0078] Efecto de los factores de crecimiento y diferenciacion celular extrafdos en los estadios de blastula-gastrula media, brote caudal, 5 somitas, 20 somitas y en el estadio de farfngula del embrion de pez cebra tomados individualmente y en mezclas, sobre la proliferacion y diferenciacion de las celulas madre mesenquimales (CMMh).

Materiales y metodos:

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1. Modelo celular: celulas madre mesenquimales humanas adultas aisladas de tejido adiposo (CMMh) mediante el sistema Lipogems,

2. Determinacion de la concentracion proteica en los extractos de pez cebra (PC) y ensayo con BCA,

3. Identificacion de las diferentes protefnas individuales: analisis de Nano-LC-MS/MS (cromatograffa lfquida combinada con espectrometrfa de masas)

4. Estudio de la proliferacion celular: ensayo con MTT

5. Analisis de la expresion genica: RT-PCR cuantitativa relativa

1. Celulas madre mesenquimales humanas (CMMh) adultas aisladas del tejido adiposo por medio de Lipogems

[0080] CMMh se aislaron del tejido adiposo humano utilizando Lipogems. Este es un dispositivo para recoger celulas madre de los lipoaspirados utilizando un enfoque mecanico en lugar de la digestion enzimatica.

2. Ensayo con BCA (determinacion proteica en los extractos)

[0081] El contenido proteico en los extractos de pez cebra se determino mediante el ensayo BCA, que es un ensayo colorimetrico para la cuantificacion de protefnas. El contenido proteico en cada extracto se evaluo por cuadruplicado utilizando albumina serica bovina (ASB) como patron. La concentracion proteica en los extractos vario de 1,5-2,7 mg/ml.

3. Analisis de Nano-LC-MS/MS

[0082] Las protefnas se identificaron mediante analisis LC-MS/MS. El analisis MS/MS de peptidos generados en gel por digestion en gel se realizo mediante un aparato nano-LC-ESI-Q-TOF (QSTAR Elite, Applied Biosystem). La HPLC se realizo en un sistema LC Packings Ultimate 3000 nanoflow (Dionex, Sunnyvale, CA). Se inyectaron muestras (5 pL) en una trampa de cartucho C18, 5 pm, 100A, 300 pm I.D. x 5 mm (LC Packing, Dionex) a 30 pL/min durante 5 min (2 % de ACN, 0,1 % de acido formico) para enriquecer y purificar los peptidos. La separacion capilar de los peptidos atrapados se realizo utilizando una columna Vydac (Grace) C18, 5 pm, 300A, 75 pm, I.D. x 15 cm. Las condiciones cromatograficas y los parametros de masa se ajustaron de la siguiente manera: tampon A (2 % de ACN, 0,1 % de acido formico) y tampon B (2 % de agua, 0,1 % de acido formico en ACN) con un gradiente de 850 % de tampon B en 35 min, 50-80 % en 15 min, 80 % durante los siguientes 15 min y 80-8 % en 5 min; por ultimo, la columna se volvio a equilibrar a 8 % de B durante 10 min. Para cada exploracion TOF MS (350-1300 m/z), los dos iones con carga doble o triple mas intensa se seleccionaron para las exploraciones ionicas del producto potencial (110-1600 m/z). El voltaje de pulverizacion de iones fue de 1,6 kV, la barrera de gases se ajusto a 15 y el potencial de pulverizacion catodica fue de 80 V. Se utilizo el software Mascot V1.6b20 (Matrix Science, Londres) para la busqueda de bases de datos de protefnas. Las busquedas se realizaron utilizando la base de datos CNIB y los siguientes parametros convencionales: pez cebra; digestion trfptica con como maximo un fallo de escision; carbamidometilacion de cistefna, oxidacion parcial de metionina y una tolerancia de masa de 100 ppm. Para los datos de MS/MS, las busquedas se realizaron con los siguientes criterios adicionales: tolerancia maxima de 0,3 Da para datos de MS/MS y la busqueda de carga de peptido 2+ y 3+.

[0083] Compuestos y reactivos qufmicos.

[0084] Los compuestos qufmicos generales se obtuvieron de Sigma-Aldrich (Poole, Reino Unido). Todos los compuestos qufmicos y bioqufmicos utilizados fueron de grado analftico.

4. Ensayo con MTT (proliferacion celular)

[0085] La proliferacion de celulas madre mesenquimales humanas despues del tratamiento con extractos de pez cebra se determino mediante el ensayo con MTT. En las celulas metabolicamente activas, MTT se convierte en formazan, que se puede evaluar espectrofotometricamente. La cantidad de formazan es proporcional a la cantidad de celulas en el pocillo.

5

10

15

20

25

Qptimizacion

[0086] Inicialmente, se realizaron estudios preliminares para determinar la densidad celular optima, asf como el tiempo para el metabolismo de MTT. Las siguientes condiciones experimentales fueron seleccionadas sobre la base de estos estudios:

Numero de celulas: 4.000 o 5.000 celulas sembradas por cm2 en una placa de 48 pocillos.

Tratamiento: las celulas fueron tratadas con extractos de pez cebra en los siguientes estadios:

estadio 1: estadio de blastula-gastrula media estadio 2: estadio del brote caudal estadio 3: estadio de 5 somitas estadio 4: estadio de 20 somitas

estadio 5: estadio de diferenciacion temprana (normalmente alrededor de 24 horas despues de la fertilizacion)

del estadio de farfngula

estadio 6: mezcla de los estadios 1-5;

cada estadio en cuatro concentraciones diferentes: 10, 1, 0,1, 0,01 |jg/ml e incubados durante 24 o 72 h respectivamente.

Tiempo de metabolismo de MTT: 3 h

Estadfsticas: los datos se presentan como absorbancia media comparada con respecto al control (celulas no tratadas).

Resultados

[0087] Los resultados sobre las fracciones que tienen diferente peso molecular para los diferentes estadios de diferenciacion se indican en la Figura 1.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un extracto de embriones de peces en estadios seleccionados de la diferenciacion de celulas madre, caracterizado por que es una mezcla de extractos de embriones de peces cebra en el estadio de blastula-gastrula

5 media, estadio de brote caudal, estadio de 5 somitas, estadio de 20 somitas y estadio de farfngula.
2. El extracto segun la reivindicacion 1, para su uso como medicamento.
3. El extracto segun la reivindicacion 1, para su uso en la prevencion o el tratamiento de enfermedades 10 neurodegenerativas.
4. Una composicion farmaceutica que comprende un extracto segun la reivindicacion 1 y un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

imagen1

Anahsis de las proteinas del extracto de pez cebra:

5 estadios de desarrollo (PC1-PC5) y una mezcla de los 5 estadios (PC6)

SDS-PAGE de los extractos de pez cebra embrionarios

M PC1 PC2 PC3

PC4 PC5 PC6

2 50 k Da

150 kD*

100 Oa

75 kOa

WkOa

37 kDa

25 kOa

20 KOa

15 k Da

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Figura 1

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Ensayo de prohferacion:

Extractos de pez cebra: 6 estadios (PC1-PC6) en 4 concentraciones,

despues de 24 horas de tratamiento

Ensayo de prohferacion

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Extractos de pez cebra embrionarios

Figura 2

Numero de celulas (*/. de control)

Ensayo de proliferacion:

Extractos de pez cebra: 6 estadios (PC1- PC6) en 4 concentraciones, despues de 72 horas de tratamiento

Ensayo de proliferacion

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Extractos de pez cebra embrionarios . > •_ i,i, •• u.'J I

Figura 3

Figura 4

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Figura 7

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