ES2678094T3 - Líneas de células asesinas naturales genéticamente modificadas - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende: na célula NK-92 modificada para expresar un receptor de Fc en una superficie de la célula; un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno que se expresa mediante una célula tumoral o una célula infectada; donde el receptor de Fc comprende CD16 (FcγRIII-A).

Description

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Lmeas de celulas asesinas naturales geneticamente modificadas
Descripcion
CAMPO DE LA INVENCION
[0001] Ciertas lmeas de celulas asesinas naturales (NK) que han sido manipuladas geneticamente para expresar una protema de receptor de superficie celular que participa en las respuestas de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos se dan a conocer. Mas espedficamente, la presente descripcion se refiere a una lmea celular asesina natural NK-92 que, en una primera realizacion, se ha modificado para expresar una protema receptora de la superficie celular Fc tal como CD16, y en una segunda realizacion, se ha modificado para expresar tanto una protema receptora de superficie de celulas Fc tal como CD 16 como una o mas de las protemas de senalizacion accesorias asociadas tales como FcR-y o TCR-Z y/o una citocina tal como IL-2,
ANTECEDENTES
[0002] Un numero de anticuerpos, mas notablemente Rituximab (MabThera®; Hoffmann-LaRoche, Ltd; Basilea, Suiza) y Herceptin® (Genentech, Inc.; South San Francisco, CA), han demostrado valor terapeutico significativo como agentes antitumorales altamente selectivos y eficaces. Aunque estos anticuerpos se pueden unir a antigenos espedficos en las celulas tumorales, su actividad antitumoral depende al menos en parte de la union posterior de las celulas asesinas naturales (NK, una tabla de abreviaturas si se proporciona en la Tabla Z, situada despues de los Ejemplos) a la porcion Fc (constante) del anticuerpo con la consiguiente destruccion de la celula tumoral a traves de un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
[0003] Las celulas NK son una clase de linfocitos que tfpicamente comprenden aproximadamente 10% de los linfocitos en un ser humano. La funcion principal de las celulas NK es proporcionar una respuesta inmune celular innata contra el tumor y las celulas infectadas (diana). Tambien se han demostrado y/o se consideran probables los roles en el cebado y la regulacion de la respuesta inmune humoral, el desarrollo fetal y la eliminacion de celulas normales estresadas o danadas. Las celulas NK, que se caracterizan por tener un fenotipo CD3-/CD56+, muestran una variedad de receptores de superficie celular activadores e inhibidores. La union o ligacion de un receptor de celulas NK activador al ligando correspondiente en una celula diana hace que la celula NK ejerza un efecto citotoxico directamente contra la celula diana y secrete una variedad de citoquinas que realizan funciones tales como la estimulacion y el reclutamiento de otros elementos del sistema inmune para actuar contra el objetivo. Las celulas NK activadas lisan las celulas diana mediante la secrecion de las enzimas perforina y granzima, la estimulacion de los receptores iniciadores de la apoptosis y otros mecanismos menos bien caracterizados.
[0004] Los receptores inhibidores de celulas NK interaccionan predominantemente con las protemas del complejo de histocompatibilidad principal de clase I ("MHC-I") en la superficie de una celula normal. Cuando estan tan comprometidos, estos receptores inhibidores impiden que las celulas NK se activen. Las moleculas MHC-I definen las celulas como "pertenecientes" a un individuo en particular. Ya que la expresion de estas moleculas de MHC-I puede evitar la activacion de celulas NK hacia una celula diana, se cree que las celulas NK pueden activarse solo por celulas en las que estas moleculas "propias" de MHC-I faltan o son defectuosas, como suele ser el caso de celulas infectadas por tumores o virus. El fenotipo y el patron de activacion de las celulas NK son distintos de los exhibidos por los linfocitos T citotoxicos ("CTL", fenotipo CD3+/CD56VCD8+) que se activan por celulas diana que muestran pequenos fragmentos de peptidos extranos derivados de virus o celulas tumorales unidas a las moleculas MHC-I superficiales. Los cientfficos han especulado que las celulas NK evolucionaron como respuesta al tumor y a las celulas infectadas que evitan la destruccion por cTl a traves de la supresion o la interrupcion de la presentacion de moleculas de MHC-I presentadoras de peptidos.
[0005] Las celulas NK se han evaluado como un agente terapeutico en el tratamiento de ciertos canceres. Las celulas NK usadas para este fin se afslan de la fraccion de sangre de linfocitos de sangre periferica ("PBL") del sujeto, se expanden en cultivo celular para obtener cantidades suficientes de celulas, y luego se vuelven a infundir en el sujeto. Aunque los resultados de esta terapia han sido prometedores, la preparacion de las celulas NK autologas es costosa, laboriosa y lleva mucho tiempo. Ademas, el control de calidad de estas celulas se complica debido a que cada preparacion es espedfica del sujeto. En particular, la cantidad de celulas NK que pueden aislarse de un sujeto puede variar sustancialmente, y estas celulas son a menudo deficientes en capacidad proliferativa y/o actividad citotoxica. Otra limitacion en el uso de celulas NK como agente terapeutico resulta de la presencia de antfgenos de superficie en las celulas que pueden provocar una respuesta de rechazo inmune cuando las celulas se infunden en un sujeto distinto del que las aislo. Esto requiere un cuidadoso emparejamiento cruzado de MHC-I entre el donante y el receptor, asf como la necesidad de inmunosuprimir al receptor.
[0006] La lmea de tipo NK celular NK-92 fue descubierta en la sangre de un sujeto que padece un linfoma no Hodgkins. Las celulas NK-92 carecen de los principales receptores inhibidores que se muestran en las celulas NK normales, pero retienen la mayona de los receptores activadores. La caracterizacion de la lmea celular NK-92 (Gong et al., 1994; Yan et al., 1998) revelo que las celulas NK-92 son citotoxicas para un espectro significativamente mas amplio de tipos de celulas tumorales e infectadas que las celulas NK, y ademas que a menudo exhiben niveles mas
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altos de citotoxicidad hacia estos objetivos. Las celulas NK-92, sin embargo, no atacan a las celulas normales ni provocan una respuesta de rechazo immune. Ademas, las celulas NK-92 pueden cultivarse rapida y establemente y mantenerse en cultivo celular continuo y, por lo tanto, se pueden preparar en grandes cantidades bajo un control de calidad compatible con c-GMP. Esta combinacion de caractensticas ha dado lugar a que NK-92 ingrese en ensayos clmicos actualmente en curso para el tratamiento de multiples tipos de cancer.
[0007] Aunque las celulas NK-92 conservan casi todos los receptores activadores y las vfas citolfticos asociadas con las celulas NK, que no expresan el receptor CD16 y, por lo tanto, no pueden lisar celulas diana a traves del mecanismo de ADCC. Esto significa que a pesar de sus otros beneficios, las celulas NK-92 no pueden potenciar los efectos antitumorales y antiinfecciosos de los anticuerpos endogenos o exogenos a la manera de las celulas NK. Tambien se conocen otras lmeas celulares similares a NK ademas de NK-92. Algunas de estas otras lmeas celulares similares a NK expresan CD16, pero esta expresion es inestable; las celulas son tipicamente diffciles de cultivar en cultivo celular; y pocas exhiben actividad citotoxica robusta. Por estas razones, solo NK-92 de las lmeas celulares de tipo NK actualmente conocidas es un candidato viable como agente terapeutico aunque carece de CD16 y, en consecuencia, la capacidad de matar celulas diana a traves del mecanismo de ADCC.
[0008] Por lo tanto, sena una ventaja para restaurar la expresion CD16 y la capacidad de actuar a traves del mecanismo de ADCC con las celulas NK-92, permitiendo de este modo que esas celulas se utilicen en concierto con anticuerpos para fines terapeuticos y relacionados. Sin embargo, se ha encontrado que las lmeas celulares NK son recalcitrantes a la transferencia de genes, una caractenstica que ha obstaculizado el desarrollo de dichas lmeas celulares con fines de investigacion o terapeuticos. Para las celulas NK-92, se han logrado eficiencias de transformacion de solo 5-15% y 10-20% usando transferencia genica mediada por partmulas o transduccion retroviral (Nagashima et al., 1998; Tarn et al., 1999). Las lmeas celulares NK-92 que expresan establemente el receptor de superficie celular CD16 no estan actualmente disponibles.
RESUMEN
[0009] Las diversas realizaciones de la descripcion proporcionan o utilizan una celula NK-92 modificada para expresar un receptor de Fc, tales como CD16 (FcyRIII-A), o mas en general, cualquier otro receptor de Fc, en la superficie de la celula.
[0010] Se dan a conocer las celulas NK-92 modificadas para expresar un receptor de Fc sobre la superficie de la celula; el receptor Fc es un receptor activador Fcy, CD16 (FcyRIII-A), o cualquier miembro de una clase de receptor de Fc, tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FCyRIII, FcRn, Fca y Fce. Los receptores Fc pueden ser de cualquier afinidad de union por sus ligandos, o fragmentos de sus ligandos, incluyendo formas de afinidad de union baja y alta. Las celulas NK-92 pueden modificarse introduciendo un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad con las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2; uno de tales polinucleotidos incluye la SEQ ID NO:3. Las celulas NK-92 pueden modificarse adicionalmente para expresar uno o mas polipeptidos de senalizacion accesorios asociados, citocinas o fragmentos de los mismos; dicha expresion puede correlacionarse con una expresion superficial aumentada del receptor de Fc. Polipeptidos de senalizacion de accesorios asociados incluyen FceRI-y (SEQ ID NO:5) o TCR-Z(SEQ ID NO:7). La expresion de una citoquina (como la interleucina-2) tambien puede correlacionarse con la viabilidad o citotoxicidad de las celulas NK-92 modificadas.
[0011] En un segundo aspecto, la divulgacion se refiere a procedimientos para la evaluacion in vitro de la eficacia de un anticuerpo para inducir la muerte celular. Dichos metodos pueden incluir los pasos de exponer una celula diana a un anticuerpo (monoclonal (purificado o en superematos de hibridoma), policlonal, quimerico (tal como uno que tiene al menos dos dominios de union a antfgenos diferentes (en el que un dominio de union puede adaptarse para unirse al receptor de Fc)), o cualquier otra forma de anticuerpo), exponiendo la celula diana a una celula NK-92 modificada que expresa un receptor de Fc; y luego monitorear la citotoxicidad, citolisis o apoptosis de la celula diana, o una combinacion de las mismas. Se pueden usar pluralidades de celulas y anticuerpos. Las celulas diana utilizadas en los metodos pueden tener una tasa de lisis o aptotica de aproximadamente 5%-30% en presencia de las celulas NK- 92 modificadas en ausencia de anticuerpo. Efector: las proporciones diana incluyen 0,5:1 a 100:1, incluyendo 1:1 y 20:1. Las celulas diana en los metodos incluyen SKOV-3, P815, THP-I, U373MG, T98G, A ML193, SR91, ALL1 y REH; estas y cualesquiera otras celulas diana pueden modificarse para aumentar la expresion del antfgeno al que se une el anticuerpo. Los controles negativos apropiados incluyen el uso de celulas NK-92 no modificadas.
[0012] Las celulas NK-92 en este aspecto pueden incluir aquellas modificadas para expresar un receptor de Fc en una superficie de la celula; el receptor Fc puede ser una activacion de receptor Fcy, CD16 (FcyRIII-A), o cualquier miembro de una clase de receptor de Fc, tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII, FcRn, Fca y Fce. Los receptores Fc pueden ser de cualquier afinidad de union por sus ligandos, o fragmentos de sus ligandos, incluyendo formas de afinidad de union baja y alta. Las celulas NK-92 pueden modificarse introduciendo un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad con las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2; uno de tales polinucleotidos incluye la SEQ ID NO:3. Las celulas NK-92 pueden modificarse adicionalmente para expresar uno o mas polipeptidos de senalizacion accesorios asociados, citoquinas o fragmentos de los mismos; dicha expresion puede correlacionarse con una expresion
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superficial aumentada del receptor de Fc. Polipeptidos de senalizacion asociados accesorios incluyen FceRI-y (SEQ ID NO:5) o TCR-Z(SEQ ID NO:7). La expresion de una citoquina (como la interleucina-2) tambien puede correlacionarse con la viabilidad o citotoxicidad de las celulas NK-92 modificadas. Las citocinas tambien se pueden agregar al ataque de fuentes exogenas.
[0013] En un tercer aspecto, la descripcion se refiere a metodos para detectar citolftica y la actividad inductora de la apoptosis, incluyendo el metodo las etapas de exponer una celula diana en ausencia de anticuerpos a una celula NK-92 que expresa un receptor Fc, y luego, se monitorea la celula diana para detectar citotoxicidad, citolisis o apoptosis. La monitorizacion puede incluir la determinacion de los niveles de expresion de IFN-y o de citocina. El metodo puede incluir ademas la aplicacion de agentes bloqueantes, tales como la activacion de anticuerpos o polipeptidos enmascaradores del receptor (o fragmentos de estos) para suprimir uno o mas receptores activadores en la celula NK-92.
[0014] En un cuarto aspecto, la descripcion esta dirigida a metodos de ensayo de la eficacia de un anticuerpo para tratar un tumor, infeccion u otra lesion, incluyendo el metodo las etapas de administrar un anticuerpo (o una pluralidad de anticuerpos) a un sujeto, administrando celulas modificadas NK-92 que expresan un receptor de Fc al sujeto; y luego monitorear el tumor, infeccion o lesion. La eficacia del anticuerpo en el tratamiento se correlaciona con la supresion del tumor, infeccion o lesion en el sujeto. La monitorizacion puede incluir la determinacion de los niveles de expresion de IFN-y o de citocina. El metodo puede incluir ademas la aplicacion de agentes bloqueantes, tales como la activacion de anticuerpos o polipeptidos enmascaradores del receptor (o fragmentos de estos) para suprimir uno o mas receptores activadores en la celula NK-92.
[0015] El anticuerpo puede ser monoclonal (purificado o en sobrenadantes de hibridoma), policlonal, quimerico (tal como uno que tiene al menos dos dominios diferentes de union a antfgeno (en donde un dominio de union puede adaptarse para unirse al receptor Fc)), o cualquier otra forma de anticuerpo. Las citocinas (tales como la interleucina-2), o fragmentos de las mismas, se pueden expresar a partir de celulas NK-92 modificadas o se pueden administrar exogenamente. Los sujetos incluyen bovinos (por ejemplo, vacas), cerdos (por ejemplo, chanchos, puercos), conejos, alpacas, caballos, caninos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gatos), hurones, ratas, ratones, aves de corral (pollos, pavos) y bufalo. Los sujetos tambien pueden ser humanos.
[0016] Las celulas NK-92 en este aspecto pueden incluir aquellas modificadas para expresar un receptor de Fc sobre la superficie de la celula; el receptor Fc puede ser una activacion de receptor Fcy, CD16 (FcyRIII-A), o cualquier miembro de una clase de receptor de Fc, tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII, FcRn, Fca y Fce. Los receptores Fc pueden ser de cualquier afinidad de union por sus ligandos, o fragmentos de sus ligandos, incluyendo formas de afinidad de union baja y alta. Las celulas NK-92 pueden modificarse introduciendo un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad con las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2; uno de tales polinucleotidos incluye la SEQ ID NO:3. Las celulas NK-92 pueden modificarse adicionalmente para expresar uno o mas polipeptidos de senalizacion accesorios asociados, citoquinas o fragmentos de los mismos; dicha expresion puede correlacionarse con una expresion superficial aumentada del receptor de Fc. Polipeptidos de senalizacion asociados accesorios incluyen FceRI-y (SEQ ID NO:5) o TCR-Z (SEQ ID NO:7).
[0017] En aun otro quinto aspecto, la descripcion se refiere a metodos de tratamiento de un sujeto, teniendo el sujeto un tumor, infeccion u otra lesion, incluyendo el metodo la administracion a un sujeto de anticuerpos que se unen espedficamente al tumor, infeccion u otra lesion; y luego administrar al sujeto celulas NK-92 modificadas que expresan un receptor de Fc. Una reduccion en el tumor, infeccion o lesion indica una respuesta terapeutica. La monitorizacion puede incluir la determinacion de los niveles de expresion de IFN-y o de citocina. El metodo puede incluir ademas la aplicacion de agentes bloqueadores, tales como la activacion de anticuerpos o polipeptidos enmascaradores del receptor (o fragmentos de estos) para suprimir uno o mas receptores activadores en la celula NK-92.
[0018] El anticuerpo puede ser monoclonal (purificado o en sobrenadantes de hibridoma), policlonal, quimerico (tal como uno que tiene al menos dos dominios diferentes de union a antfgeno (en la que un dominio de union puede adaptarse para unirse al receptor Fc)), o cualquier otra forma de anticuerpo. Las citocinas (tales como la interleucina-2), o fragmentos de las mismas, se pueden expresar a partir de celulas NK-92 modificadas o se pueden administrar exogenamente. Los sujetos incluyen bovinos (por ejemplo, vacas), cerdos (por ejemplo, chanchos, puercos), conejos, alpacas, caballos, caninos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gatos), hurones, ratas, ratones, aves de corral (pollos, pavos) y bufalo. Los sujetos tambien pueden ser humanos.
[0019] Las celulas NK-92 en este aspecto pueden incluir aquellas modificadas para expresar un receptor de Fc sobre la superficie de la celula; el receptor Fc puede ser una activacion de receptor Fcy, CD16 (FcyRIII-A), o cualquier miembro de una clase de receptor de Fc, tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII, FcRn, Fca y Fce. Los receptores de Fc pueden ser de cualquier afinidad de union por sus ligandos, o fragmentos de sus ligandos, incluyendo formas de afinidad de union baja y alta. Las celulas NK-92 pueden modificarse introduciendo un polinucleotido que codifica un polipeptido que tiene al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% de identidad con las secuencias de aminoacidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2; uno de tales polinucleotidos incluye la SEQ ID
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NO:3. Las celulas NK-92 pueden modificarse adicionalmente para expresar uno o mas polipeptidos de senalizacion accesorios asociados, citoquinas o fragmentos de los mismos; dicha expresion puede correlacionarse con una expresion superficial aumentada del receptor de Fc. Polipeptidos de senalizacion accesorios asociados incluyen FceRI-y (SEQ ID NO:5) o TCR-Z (SEQ ID NO:7).
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
[0020] Los objetos, caractensticas y ventajas de la presente invencion se apreciaran mas facilmente por referencia a la siguiente descripcion cuando se considera en conjuncion con los dibujos adjuntos.
La Figura 1 muestra diagramas de dispersion de citometro de flujo de celulas NK-92 transducidas con ADNc de CD16 usando el vector pBMN-IRES-EGFP despues de la tincion sin anticuerpo primario (Figura 1A) y con anticuerpo primario (anti-CD 16) y secundario (Figura 1B) La expresion de EGFP se evalua en el eje x, y la expresion de CD16 en la superficie esta en el eje y.
La Figura 2 muestra diagramas de dispersion de citometro de flujo que muestran la expresion de CD16 por celulas NK-92 transducidas con CD16 solo (Figura 2A) y el aumento en la expresion de CD16 cuando las celulas NK-92 se transducen con ADNc de CD16 en combinacion con FceRI-y AdNc (y; en vector pBMN-IRES-EGFP (Figura 2B), o CD3 Z ADNc (Figura 2C).
La Figura 3 es un diagrama grafico que muestra la citotoxicidad redirigida de celulas diana FcyRII/III+ P815 por las celulas NK-92-CD16 inducidas por anticuerpo anti-CD16 (3G8), pero no los anticuerpos hacia CD56 (B159) o KIR (DX9). Las celulas fueron analizadas usando liberacion 51Cr de las celulas diana P8l5 en el efector indicado a relaciones diana.
La Figura 4 es un diagrama grafico que ilustra la citotoxicidad redirigida de celulas diana FcyRII/III+ THP-1 por celulas NK-92-CD16 (sfmbolos rellenos) inducidos por anticuerpo anti-CD 16 (3G8; cuadros), pero no anticuerpo anti-NKR-P1 (B199, triangulos). La citotoxicidad redirigida no fue inducida por anti-CD16 en celulas NK-92 transducidas con ADNc de IgM de raton (sfmbolos abiertos).
La Figura 5 es un diagrama grafico que ilustra la citotoxicidad redirigida de celulas diana SKOV-3 por celulas NK- 92-CD16 (triangulos), pero no NK-92 transducida por IgM de raton (cuadrados), inducida por anticuerpo 2B1 biespedfico (sfmbolos rellenos). 2B1 contiene dominios F(ab) que reconocen el antfgeno HeR2/neu en celulas SKOV-3 y CD16 en NK-92-CD16.
La Figura 6 es un diagrama grafico que ilustra la citotoxicidad redirigida de celulas NoGFP NK-92-CD16, NK-92- CD16-y, y NK-92-CD16-Z contra las celulas diana P815 en combinacion con la concentracion indicada de anticuerpo monoclonal bi-espedfico quimerico 2B1.
descripcion DETALLADA DE la invencion
[0021] Aunque la presente invencion es susceptible de realizacion en muchas formas diferentes, se muestran en los dibujos, y se describiran aqu en detalle, realizaciones y ejemplos espedficos de la misma, en el entendimiento de que la presente descripcion ha de ser considerada como una ejemplificacion de los principios de la invencion y no pretende limitar la invencion a las realizaciones espedficas ilustradas.
[0022] Se dan a conocer lmeas celulares y metodos que potencian y amplfan el alcance efectivo de la respuesta de ADCC. Se describe una lmea celular NK-92 que expresa de forma estable una protema receptora de superficie de celulas Fc, tal como CD16. (Varios nomenclaturas diferentes han evolucionado para referirse a ciertos receptores de Fc, que se usan indistintamente en el presente documento, incluyendo CD16, FcyRIII-A, y sus polimorfismos u otras formas que tienen niveles de afinidad variados). La invencion proporciona una composicion que comprende:
una celula NK-92 modificada para expresar un receptor de Fc en una superficie de la celula; y
un anticuerpo que se une espedficamente a un antfgeno que se expresa mediante una celula tumoral o una celula infectada;
en donde el receptor de Fc comprende CD16 (FcyRIII-A).
[0023] Muchas empresas de biotecnologfa estan desarrollando actualmente nuevos anticuerpos monoclonales para uso en inmuno-terapias para el cancer. La intencion de este esfuerzo de desarrollo es la de preparar anticuerpos que se unan a antfgenos proteicos particulares que se expresan de forma unica en las superficies de tipos espedficos de celulas tumorales. Las celulas NK citotoxicas pueden, a su vez, unirse a la region Fc (constante) de estos anticuerpos unidos al tumor a traves de los receptores CD16 mostrados en las celulas NK e iniciar la lisis de la celula tumoral a traves del mecanismo ADCC. La alta eficacia y especificidad de los agentes terapeuticos basados en este enfoque se ha demostrado clmicamente mediante el uso del anticuerpo monoclonal Herceptin (anti-ErbB2)
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para el tratamiento de carcinomas de mama que expresan ErbB2 y el uso del anticuerpo monoclonal Rituximab (anti- CD20).) para el tratamiento de linfomas de celulas B. Numerosos otros anticuerpos terapeuticos que se dirigen a una amplia variedad de antigenos espedficos de tumores adicionales estan en desarrollo.
[0024] Una parte esencial del desarrollo de terapias contra el cancer basadas en anticuerpos es la determinacion in- vitro de la eficacia y la especificidad de NK ADCc mediada por celulas que se imparte por la union del anticuerpo a la celula tumoral diana. Estas pruebas se realizan tfpicamente usando linfocitos de sangre periferica (PBL) obtenidos de donantes humanos normales o celulas NK aisladas de la fraccion de sangre PBL como celulas efectoras. Ademas de la engorrosa carga inherente a la obtencion y el procesamiento rutinario de muestras de sangre humana, existe una considerable variabilidad en la actividad y cantidad de celulas efectoras obtenidas de diferentes donantes y una variabilidad similar entre las muestras obtenidas del mismo donante. Parte de esta variabilidad es intrmseca y surge de la naturaleza policlonal de las celulas NK. En particular, las variaciones alelicas en la porcion extracelular del gen CD 16 pueden dar lugar a diferencias significativas en la afinidad CD 16 por las porciones Fc de anticuerpos y las diferencias en el estado de activacion de las celulas donantes NK pueden alterar el nivel de expresion CD 16 en la celula superficie. La concentracion de celulas NK en la fraccion de PBL tambien vana, en parte por razones geneticas y en parte como un reflejo del estado fisiologico del donante. Esta variabilidad de celulas efectoras complica en gran medida la evaluacion de anticuerpos monoclonales como posibles agentes terapeuticos. Ademas, aunque las celulas NK que expresan la baja afinidad de union de CD16 son las mas comunes, el isotipo de alta afinidad es suficientemente comun como para que las pruebas de anticuerpos se realicen utilizando celulas NK de ambas formas (Koene et al., 1997). La identificacion de donantes homocigotos para formas alelicas bajas y altas de CD16 es una tarea diffcil. La disponibilidad de una poblacion clonal de celulas NK humanas que exprese un nivel constante de actividad de CD16 proporcionana un beneficio sustancial como efector estandar en la evaluacion de anticuerpos para la actividad y especificidad de ADCC.
[0025] De la misma manera, las terapias basadas en anticuerpos pueden beneficiarse de la presencia de celulas NK que tienen altos niveles conocidos de la actividad citotoxica de la capacidad y dentro del sujeto Fc vinculante. Ademas de las variabilidades descritas anteriormente, a menudo se encuentra que las celulas NK aisladas de sujetos con cancer se han vuelto defectuosas, deficientes o ineficaces por las acciones de las celulas tumorales. Algunos tipos de celulas tumorales, por ejemplo, son capaces de matar o desactivar las celulas NK de un modo espedfico. De forma similar, otros tipos de celulas tumorales pueden interferir con la produccion, la actividad y/o la especificidad de las celulas NK. Dicha variabilidad hace que la dependencia de las celulas NK sujeto sea problematica en un entorno terapeutico y sugiere que la administracion conjunta de cantidades conocidas de celulas NK exogenas que tienen un nivel conocido de actividad junto con un anticuerpo apropiado puede dar como resultado efectos terapeuticos mas consistentes. De nuevo, se espera que la disponibilidad de una poblacion clonal de celulas NK humanas que exprese un nivel constante de actividad de CD16 proporcione un beneficio sustancial.
[0026] Una limitacion importante en la utilidad de las celulas NK es que expresan un repertorio de receptores de superficie celular que, cuando se une al correspondiente ligando MHC-I sobre una celula diana normal, fuerte y espedficamente prevenir la destruccion de la celula diana mediante la inhibicion de la activacion de celulas NK, citotoxicidad y respuesta de citocinas. Esta inhibicion puede derogar la activacion de las celulas NK causada por la union de los receptores activadores de las celulas NK a sus ligandos conjugados en la celula diana. Por tanto, una celula NK destruira una celula diana que muestra solo ligandos activadores, pero ahorrara una celula diana que muestra ligandos inhibidores de MHC-I incluso si tambien estan presentes ligandos activadores.
[0027] Casi todas las celulas de los mairnferos presentan deltas protemas de superficie celular polimorficas de los MHC-I en sus superficies. Estas protemas MHC-I tienen la funcion principal de mostrar antfgenos peptfdicos que son fragmentos derivados de protemas expresadas dentro de una celula y se clasifican como complejos MHC-I. Los complejos de MHC que se muestran en las celulas normales son unicos para cada individuo y, a menudo, se los denomina marcadores de "auto" para ese individuo. Las celulas exogenas introducidas por trasplante muestran moleculas MHC y peptidos asociados que difieren de los del individuo huesped y, por lo tanto, se denominan "no propios". Los complejos MHC-peptidicos no propios tambien pueden aparecer en celulas aberrantes como resultado de procesos que alteran los peptidos presentados en las moleculas MHC. En particular, muchas, pero no todas, las celulas tumorales y celulas infectadas muestran peptidos que no son propios.
[0028] Los receptores inhibidores de celulas NK consisten en varias familias de protemas que reconocen, se unen y se disparan para enviar "senales intracelulares negativas" al encontrar protemas MHC-I propias en la superficie de una celula diana normal. Por lo tanto, se impide que las celulas NK ataquen y destruyan las celulas normales que muestran la constelacion de MHC-I propia. El tumor y las celulas infectadas que muestran esta autocontencion del MHC-I tambien son inmunes al ataque. Solo las celulas que muestran MHC-I no propia o sin MHC-I estan sujetas a destruccion por las celulas NK. Sin embargo, algunos tipos de celulas tumorales y infectadas que no muestran complejos MHC-I propios han desarrollado mecanismos que les permiten escapar de este destino. Los ejemplos de tales mecanismos de escape incluyen la expresion de ligandos del receptor inhibidor de celulas NK similares a MHC- I, y la secrecion de ligandos solubles que suprimen las funciones de las celulas NK. El tumor y las celulas infectadas que implementan tales mecanismos de escape son refractarios a la lisis mediada por celulas NK. La eficacia de las celulas NK como un agente para la destruccion de las celulas cancerosas esta por lo tanto limitada por la presencia de ligandos de MHC-I apropiados para los receptores inhibidores de las celulas NK. La disponibilidad de una
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poblacion de celulas NK humanas que no exprese receptores inhibidores de celulas NK expandina de manera beneficiosa el rango de canceres e infecciones que pueden tratarse usando agentes terapeuticos basados en anticuerpos.
[0029] NK-92 es una lmea celular de tipo NK que inicialmente fue aislada de la sangre de un sujeto que sufre de un gran linfoma granular y posteriormente se propaga en cultivo celular. Se ha descrito la lmea celular NK-92 (Gong et al., 1994; Klingemann, 2002). Las celulas NK-92 determinadas tienen un fenotipo CD3-/CD56+ que es caractenstico de las celulas NK. Expresan todos los receptores activadores de celulas NK conocidos, excepto CD16, pero carecen de todos los receptores inhibidores de celulas NK conocidos excepto NKG2A/CD94 e ILT2/LIR1, que se expresan en niveles bajos. Ademas, NK-92 es una lmea celular clonal que, a diferencia de las celulas policlonales NK aisladas de la sangre, expresa estos receptores de manera consistente con respecto al tipo y la concentracion de la superficie celular. De forma similar, las celulas NK-92 no son inmunogenicas y no provocan una respuesta de rechazo immune cuando se administran terapeuticamente a un sujeto humano. De hecho, las celulas NK-92 son bien toleradas en humanos sin efectos perjudiciales conocidos en tejidos normales. Mientras que las celulas NK-92, a diferencia de las celulas NK y las celulas de la mayona de las otras lmeas celulares conocidas como NK, se han disenado para expresar nuevas protemas mediante la transduccion usando vectores retrovirales (Campbell et al., 2004; Kikuchi- Maki et al.., 2003; Klingemann, 2002; Yusa y Campbell, 2003; Yusa et al., 2002; Yusa et al., 2004), tal ingeniena ha demostrado ser diffcil, como lo demuestran numerosos fallos en el diseno de celulas NK-92 para expresar un receptor Fc. Mas particularmente, a pesar de los claros beneficios potenciales que podnan anticiparse a partir de una lmea celular NK-92 modificada para expresar CD16, tal modificacion genetica no se habfa logrado de hecho hasta la presente invencion.
[0030] Esta combinacion unica de caractensticas hace que NK-92 sea una plataforma adecuada sobre la cual la presente invencion puede ser construida. En particular, la falta de receptores inhibidores significa que NK-92 no esta restringido por MHC y puede actuar eficazmente contra cualquier celula que muestre un ligando activante apropiado independiente de cualquier ligando inhibidor de MHC-I que tambien pueda expresarse. La falta de inmunogenicidad junto con la relativa facilidad con la que las celulas NK-92 pueden cultivarse en cultivo significa que pueden prepararse a granel y administrarse a cualquier sujeto a medida que surja la necesidad. La estabilidad y consistencia de NK-92 lo hace adecuado para uso como material de referencia y agente terapeutico. Ademas, la presente descripcion proporciona la capacidad de transducir NK-92 con genes para nuevas protemas, tales como receptores Fc, junto con la capacidad de NK-92 para expresar de forma estable estas protemas, como se explica con mayor detalle a continuacion.
[0031] El uso de celulas NK-92 como una terapia para el cancer esta siendo evaluado actualmente con resultados prometedores en ensayos clmicos humanos. Los beneficios de las celulas NK-92 se explotan aun mas mediante el desarrollo de variantes geneticamente modificadas de NK-92 que expresan una construccion proteica que une covalentemente un dominio de union similar a un anticuerpo a un dominio de senalizacion como tCR-Z (Genbank N° de acceso J04132; SEQ ID NO:6) (TCR-Z (N° de acceso Genbank J04132; SEQ ID NO:6)) (Klingemann, 2002; Maki et al., 2001; Uherek et al., 2001; Uherek et al., 2002). En estas construcciones, el dominio similar a anticuerpo esta estructurado para unirse espedficamente a un antfgeno que se expresa mediante una celula diana, mientras que el dominio de senalizacion es uno que se sabe que desencadena la actividad de las celulas NK y NK-92 cuando se estimula. Se ha demostrado, hasta la fecha, en modelos in vitro y en animales que la union del dominio similar a anticuerpo de dicha construccion a su antfgeno en una celula diana activa la celula NK-92 de tal forma que destruye rapida y eficientemente la celula diana a traves de la conjugacion directa. La utilidad de estos constructos como agentes terapeuticos esta, sin embargo, limitada por la necesidad de disenar, preparar y validar una construccion unica para cada tipo espedfico de cancer o infeccion a tratar. La disponibilidad de una unica variante NK-92 que se puede usar para tratar una amplia gama de canceres e infecciones es de utilidad beneficiosa.
[0032] Una de las areas en las que las celulas NK-92 pueden ser mejoradas se refiere al uso de las celulas NK-92 en sujetos, en que se ha demostrado que se aumenta la citotoxicidad, la concentracion de receptor de superficie celular y la supervivencia de las celulas NK-92, asf como la gama de tumor y tipos de celulas infectadas que son atacadas por la presencia de bajas concentraciones de la interleucina-2 de citoquina (IL-2). El costo de la IL-2 anadida exogenamente necesaria para mantener y expandir NK-92 en cultivo a escala comercial es significativo, mientras que la administracion de IL-2 a sujetos humanos en cantidad suficiente para lograr los efectos deseados tambien es conocida por causar efectos secundarios adversos. Esta limitacion se ha abordado mediante el desarrollo de las lmeas celulares NK-92mi y NK-92ci secretoras de IL-2 mediante la transduccion retroviral de NK-92 con el gen para IL-2 (Klingemann, 2002; Nagashima et al., 1998). Los niveles de IL-2 secretados por estas lmeas celulares son suficientes para optimizar la supervivencia y actividad de NK-92, pero estan por debajo del nivel generalmente asociado con la aparicion de efectos secundarios adversos.
[0033] Otra area en la que las celulas NK-92 se pueden mejorar, y el foco de la presente descripcion, se refiere al hecho de que NK-92 no modificada no expresa CD16 y por lo tanto es ineficaz en matar celulas diana mediante el mecanismo de ADCC. Aunque las celulas NK-92 son ampliamente utilizadas como un sistema modelo para el estudio de la activacion, accion e inhibicion de celulas NK, la falta de expresion de CD16 impide el uso de celulas NK-92 para la evaluacion de la eficacia de anticuerpos como agentes terapeuticos y el uso de NK-92 como un agente terapeutico que se coadministra con un anticuerpo. Esta limitacion se ha abordado haciendo que las celulas
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NK-92 expresen CD16. La utilidad adicional y los beneficios de esto seran evidentes en las siguientes descripciones. Modificacion de celulas NK-92
[0034] CD16 se encuentra mas comunmente en una forma que tiene una afinidad de union relativamente baja para la porcion Fc de las moleculas de IgG. En algunos individuos se encuentra una forma alternativa que exhibe una mayor afinidad de union. Las formas de baja y alta afinidad de CD16 difieren solo por la sustitucion de valina (alta afinidad) por fenilalanina (baja afinidad) en la posicion 157 en la cadena polipeptidica. Las secuencias completas de las formas de baja y alta afinidad se pueden encontrar en la base de datos SwissProt como entradas P08637 (SEQ ID NO:1) y VAR_008801 (SEQ ID nO:2), respectivamente, y se presentan en las Tablas 1 y 2; el polinucleotido que codifica la SEQ ID NO:1 (SeQ ID NO:3) se presenta en la Tabla 3.
[0035] CD16 se introdujo en celulas NK-92 por medio de la transduccion retroviral de la siguiente manera. El ADN complementario que codifica el gen para la forma de baja o alta afinidad de CD16 se subclono en un vector de expresion retroviral bicistronico, pBMN-IRES-EGFP (obtenido de G. Nolan, Stanford University, Stanford, CA) usando los sitios de restriccion BamHI y NotI de acuerdo con metodos estandar {por ejemplo, (Ausubel, 2002; Sambrook y Russell, 2001)). Este vector de expresion se transfecto luego en la lmea celular de empaquetado retroviral Phoenix-Amphotropic y el sobrenadante que contiene el virus resultante se uso para transducir celulas NK- 92, aunque los metodos alternativos incluyen aquellos en los que los vectores incorporan EGFP u otras protemas fluorescentes (amarillo, rojo, cian, etc.) y la lmea celular de empaquetado retroviral Phoenix-Amphotropic se obtuvieron y estan disponibles para el publico de la Universidad Leland Stanford, Stanford, California, EE.UU.; (Kinsella y Nolan, 1996; Nolan y Kinsella, 1998)). Como se indica a continuacion, se pueden usar otros vectores y lmeas celulares de empaquetamiento, tanto las actualmente conocidas como las que pueden desarrollarse en el futuro. Las celulas NK-92 transducidas que expresan CD16 en su superficie (NK-92-CD16, tambien conocido como CD16/FceRIy-NK-92) se separaron de las celulas NK-92 no transducidas residuales utilizando un clasificador de celulas activado por fluorescencia (FACS). Cuando fue apropiado para el uso previsto, las celulas NK-92-CD16 se subclasificaron adicionalmente sobre la base del nivel de expresion de CD16 usando un FACS, basado en la expresion coordinada de protema fluorescente verde mejorada (EGFP). Las celulas NK-92-CD16 resultantes expresan establemente CD16 en cultivo celular sin la necesidad de seleccion antibiotica periodica.
Tabla 1
Secuencia polipeptidica para SEQ ID NO:1 (receptor de la region Fc gamma de inmunoglobulina de baja afinidad III-
A Precursor!)

Claims (1)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Una composicion que comprende:
    una celula NK-92 modificada para expresar un receptor de Fc en una superficie de la celula; y
    un anticuerpo que se une espedficamente a un antigeno que se expresa mediante una celula tumoral o una
    celula infectada; donde el receptor de Fc comprende CD16 (FcyRIII-A).
    imagen1
    rU-H.CC1«3B1)
    A B C
    NoGFP CD16.NK-92 CD16/FceRI-y.NK-92 CD16/CD3-zeta.NK-92
    imagen2
    FL1-H H1-M OfPfOfr) FUH GfF(GW
    Citotoxicidad redirigida hacia
    100 t— ' ' ' ' ' ' ' ' 1
    imagen3
    % Citotoxicidad especifica
    Citotoxicidad redirigida hacia las celulas diana THP-1
    imagen4
    imagen5
    % Citotoxicidad
    imagen6
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