ES2958720T3 - Células NK-92 modificadas para tratar el cáncer - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan células NK-92 que expresan al menos un CAR y al menos un receptor Fc. También se proporcionan métodos de tratamiento de un paciente que tiene o se sospecha que tiene una enfermedad que es tratable con células NK-92, tal como cáncer, que comprende administrar al paciente NK-92-Fc-CAR. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Células NK-92 modificadas para tratar el cáncer

Antecedentes

Las células asesinas naturales (NK) son linfocitos citotóxicos que constituyen un componente importante del sistema inmunológico innato. Las células NK, que generalmente representan alrededor del 10-15% de los linfocitos circulantes, se unen y matan a las células objetivo, incluidas las células infectadas por virus y muchas células malignas, de forma no específica con respecto al antígeno y sin sensibilización inmune previa. Herberman et al., Science 214:24 (1981). La muerte de las células objetivo se produce mediante la inducción de la lisis celular. Las células NK utilizadas para este propósito se aíslan de la fracción de linfocitos de sangre periférica ("PBL") de la sangre del sujeto, se expanden en cultivo celular para obtener un número suficiente de células y luego se reinfunden en el sujeto. Se ha demostrado que las células NK son algo efectivas tanto en la terapiaex vivocomo en el tratamientoin vivo.Sin embargo, dicha terapia se complica por el hecho de que no todas las células NK son citolíticas y la terapia es específica para el paciente tratado.

En el cáncer, los cambios fenotípicos que distinguen una célula tumoral de las células normales derivadas del mismo tejido a menudo se asocian con uno o más cambios en la expresión de productos génicos específicos, incluida la pérdida de componentes de la superficie celular normal o la ganancia de otros (es decir, antígenos no detectables en el correspondiente tejido normal no canceroso). Los antígenos que se expresan en células neoplásicas o tumorales, pero no en células normales, o que se expresan en células neoplásicas a niveles sustancialmente superiores a los encontrados en células normales, se han denominado "antígenos específicos de tumores" o "antígenos asociados a tumores". Estos antígenos específicos de tumores pueden servir como marcadores del fenotipo tumoral. Los antígenos específicos de tumores se pueden asignar a tres grupos principales: antígeno específico de cáncer/testículo (por ejemplo, MAGE, BAGE, GAGE, PRAME y NY-ESO-1), antígenos de diferenciación de melanocitos (por ejemplo, tirosinasa, Melan-A/MART, gplOO, TRP-1 y TRP-2) y antígenos mutados o expresados de forma aberrante (por ejemplo, MUM-1, CDK4, beta-catenina, gp100-in4, p15 y N-acetilglucosaminiltransferasa V).

Los antígenos específicos de tumores se han utilizado como dianas para inmunoterapias contra el cáncer. Una de esas terapias utiliza receptores de antígenos quiméricos (CAR) expresados en la superficie de las células inmunitarias, incluidas las células T y las células NK, para mejorar la citotoxicidad contra las células cancerosas. Los CAR comprenden un fragmento variable monocatenario (scFv) unido a al menos un dominio de señalización intracelular. El scFv reconoce y se une a un antígeno en la célula diana (por ejemplo, una célula cancerosa) y desencadena la activación de la célula efectora. Boissel et al., "Retargeting NK-92 cells by means of CD19- and CD20-specific chimeric antigen receptors compares favorably with antibody-dependent cellular cytotoxicity", Oncoimmunology 2013 Oct 1; 2(10): e26527, compara la eficacia de las células NK-92 genéticamente modificadas que expresan receptores de antígenos quiméricos (CAR) para matar células de leucemia linfoide B resistentes a las células NK con la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de las células NK-92 que expresan una alta afinidad variante del receptor Fc de IgG (FcγRIII). Los autores concluyen que las células NK-92 que expresan CAR pueden ser funcionalmente superiores a la ADCC (mediada por los mAb anti-CD20) en la eliminación de células primarias de CLL. Además, los autores proporcionan datos que demuestran que la administración sistémica de células NK-92 que expresan CAR puede controlar la leucemia linfoblástica en ratones inmunocomprometidos. Los resultados también sugieren que la inyección directa de células NK-92 que expresan CAR en lesiones neoplásicas podría ser una modalidad de tratamiento eficaz contra el linfoma.

Además, el tratamiento anticancerígeno con anticuerpos monoclonales (mAb) ha mejorado significativamente el resultado clínico en pacientes con cáncer, especialmente cuando se combina con quimioterapia. Sin embargo, se sabe que las células cancerosas escapan del rechazo mediado por el sistema inmunológico a pesar de la presentación de antígenos por parte de las células malignas y la presencia de células inmunitarias. Un mecanismo por el cual las células cancerosas escapan a la erradicación inmune es impidiendo su detección. Por ejemplo, los mecanismos de escape de los tumores incluyen una presentación de antígenos alterada o reducida (por ejemplo, mutación o subregulación de los antígenos tumorales), lo que reduce la eficacia de las terapias con un solo objetivo, como las células inmunitarias que expresan CAR y los mAb. Como tal, todavía se necesitan terapias y métodos mejorados para tratar las células cancerosas.

Breve resumen

La invención está definida por las reivindicaciones.

En el presente documento se describen células NK-92 modificadas genéticamente o líneas celulares modificadas para expresar múltiples transgenes. Por ejemplo, una célula NK-92 se modifica para expresar simultáneamente al menos un receptor Fc y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR), de manera que al menos un receptor Fc y al menos un CAR se presentan en la superficie celular de la célula NK-92.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una línea celular NK-92 en la que las células de la línea celular NK-92 se modifican para expresar al menos un receptor Fc y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR) de modo que el receptor Fc y el CAR se muestren en la superficie celular de las células NK-92.

La descripción general anterior y la siguiente descripción detallada son ejemplares y explicativas y están destinadas a proporcionar una explicación adicional de la divulgación.

Breve descripción de los dibujos

Los objetivos, características y ventajas se apreciarán más fácilmente haciendo referencia a la siguiente divulgación cuando se considere en conjunto con los dibujos adjuntos.

Las Figuras 1A, 1B y 1C son gráficos que muestran ensayos de citotoxicidadin vitro.La Figura 1A muestra la destrucción de líneas celulares diana mediante células NK-92 parentales no electroporadas. La Figura 1B muestra la destrucción de líneas celulares diana por células NK-92 parentales que expresan CD19-CAR. La Figura 1C muestra la destrucción de líneas celulares diana por células NK-92 CD16(158V)-ERIL2 que expresan CD19-CAR.

Descripción detallada

En el presente documento se proporcionan células NK-92 modificadas para expresar al menos un receptor Fc y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR), de modo que al menos un receptor Fc y el al menos un CAR se muestran en la superficie celular de la célula NK-92. Opcionalmente, el receptor Fc comprende FcyRIII-A (CD16). Opcionalmente, las células NK-92 se modifican genéticamente para expresar un receptor Fc que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la<s>E<q>ID NO: 1 (F<cy>RIII-A o CD16 que tiene una fenilalanina en la posición 158 (F-158); o al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 (CD16 que tiene una valina en la posición 158 (F158V), forma de mayor afinidad). En realizaciones típicas, el polipéptido CD16 tiene una valina en la posición 158. Opcionalmente, las células NK-92 se modifican genéticamente para expresar un CAR que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 8 (CD19), SEQ ID NO: 9 (CD19), SEQ ID NO: 10 (CD33), SEQ ID NO: 11 (CD33), SEQ ID NO: 12 (CSPG-4), o SEQ ID NO: 13 (CSPG-4). Opcionalmente, el CAR se dirige a un antígeno asociado a tumor, por ejemplo, CD19, CD20, ligandos NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, HER-2, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, MUC-1, ETA, MAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EG<f>R, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1 y CD33. En algunas realizaciones, las células NK-92 de la línea celular experimentan menos de 10 duplicaciones de población.

Opcionalmente, las células NK-92 expresan además una citocina, por ejemplo, interleucina 2 o una variante de la misma. En algunas realizaciones, las células NK-92 se modifican para expresar un polipéptido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 6 o la SEQ ID NO: 7. En realizaciones adicionales, la citocina está dirigida al retículo endoplásmico. Opcionalmente, las células NK-92 de la línea celular se cultivan en medios que contienen menos de 10 U/mLde IL-2. La presente divulgación proporciona una composición que comprende cualquiera de las células NK-92 descritas en el presente documento. Opcionalmente, la presente divulgación proporciona una composición de cualquiera de las células NK-92 de las realizaciones anteriores y al menos un anticuerpo, por ejemplo, alemtuzumab, rituxumab, trastuzumab, ibritumomab, gemtuzumab, brentuximab, adotranstuzumab, blinatunomab, daratumumab o elotuzumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal desnudo, un anticuerpo monoclonal conjugado o un anticuerpo monoclonal biespecífico.

La presente divulgación proporciona una cantidad eficaz de células de cualquiera de las realizaciones anteriores, para su uso en métodos de tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesita mediante la administración de las células al paciente. En algunas realizaciones, las células se administran al paciente mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste en intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. En algunas realizaciones, aproximadamente 1*108 a aproximadamente 1*1011 células por m2 de superficie corporal del paciente se administran al paciente. Opcionalmente, los métodos de la presente divulgación proporcionan además la administración al paciente de una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, alemtuzumab, rituxumab, trastuzumab, ibritumomab, gemtuzumab, brentuximab, adotranstuzumab, blinatunomab, daratumumab o elotuzumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal desnudo, un anticuerpo monoclonal conjugado o un anticuerpo monoclonal biespecífico. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal se administra al paciente mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste en intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. En una realización, el anticuerpo monoclonal y las células se administran simultáneamente. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal y las células se mezclan entre sí antes de administrarlo al paciente. En otras realizaciones, el anticuerpo monoclonal y las células se administran secuencialmente. En otras realizaciones, al sujeto se le administra el anticuerpo monoclonal y posteriormente se le administran las células NK-92 modificadas, por ejemplo, dentro de las 24 horas; o dentro de las 24 a 72 horas posteriores a la administración del anticuerpo monoclonal.

En una realización, el cáncer es, por ejemplo, una leucemia (por ejemplo, leucemia crónica de células B, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica (CLL)), un linfoma (por ejemplo, linfoma no Hodgkin (NHL)), policitemia vera, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, sarcoma o carcinoma.

La presente divulgación proporciona kits para usar en cualquiera de los métodos anteriores para tratar el cáncer, en los que el kit comprende al menos uno de: (a) células NK-92 que se modifican para expresar al menos un receptor Fc en una superficie celular y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR) en la superficie celular y (b) instrucciones que describen al menos un método de la presente divulgación. En algunas realizaciones, los kits comprenden además al menos un anticuerpo monoclonal.

Después de leer esta descripción, resultará evidente para un experto en la técnica cómo implementar diversas realizaciones alternativas y aplicaciones alternativas. Sin embargo, no todas las realizaciones se describen en el presente documento. Se entenderá que las realizaciones presentadas en este documento se presentan a modo de ejemplo.

Terminología

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica.

En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán con los siguientes significados:

La terminología utilizada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares únicamente y no pretende ser limitante. Tal como se utilizan en este documento, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" pretenden incluir también las formas plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una célula asesina natural" incluye una pluralidad de células asesinas naturales.

Todas las designaciones numéricas, por ejemplo, pH, temperatura, tiempo, concentración, cantidades y peso molecular, incluidos los intervalos, son aproximaciones que varían (+) o (-) en incrementos de 0.1 o 1.0, cuando corresponda. Debe entenderse, aunque no siempre se indique explícitamente, que todas las designaciones numéricas pueden ir precedidas del término "aproximadamente".

Como entenderá un experto en la técnica, para todos y cada uno de los fines, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos divulgados en el presente documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Se puede reconocer fácilmente que cualquier intervalo enumerado describe suficientemente y permite dividir el mismo intervalo en al menos mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos, etc. Como ejemplo no limitante, cada intervalo discutido en el presente documento se puede descomponer fácilmente en un tercio inferior, un tercio medio y un tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la técnica, todas las expresiones tales como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que" y similares, incluyen el número citado y se refieren a intervalos que posteriormente pueden dividirse en subintervalos como se analizó anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada miembro individual. Así, por ejemplo, un grupo que tiene de 1 a 3 células se refiere a grupos que tienen 1, 2 o 3 células. De manera similar, un grupo que tiene de 1 a 5 células se refiere a grupos que tienen 1,2, 3, 4 o 5 células, y así sucesivamente.

También debe entenderse, aunque no siempre se indica explícitamente, que los reactivos descritos en el presente documento son meramente ejemplares y que se conocen equivalentes de los mismos en la técnica.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que el evento o circunstancia ocurre y casos en los que no.

El término "que comprende" pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero sin excluir otros. "Que consistente esencialmente en", cuando se utilice para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación. Por ejemplo, una composición que consiste esencialmente en los elementos definidos en el presente documento no excluiría otros elementos que no afecten materialmente a la o las características básicas y novedosas de las reivindicaciones. "Que consistente en" significará excluir más que una pequeña cantidad de otros ingredientes y etapas sustanciales del método. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de la divulgación.

Como se usa en el presente documento, "concurrente" o "de manera concurrente" se refiere a la administración de al menos dos agentes (por ejemplo, células NK-92-Fc-CAR y un anticuerpo monoclonal) al mismo tiempo o aproximadamente al mismo tiempo.

Como se usa en el presente documento, el término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una composición suficiente para lograr un efecto terapéutico deseado, por ejemplo, una cantidad que da como resultado la mejora de las células cancerosas o uno o más síntomas asociados con el cáncer. En el contexto de aplicaciones terapéuticas, la cantidad de células NK-92 o anticuerpo administrada al sujeto dependerá del tipo y progresión del cáncer y de las características del individuo, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a los medicamentos. También dependerá del grado, gravedad y tipo de enfermedad. El experto podrá determinar las dosis apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Las células NK-92 también se pueden administrar en combinación con uno o más compuestos terapéuticos adicionales (por ejemplo, anticuerpos).

Como se usa en el presente documento, el término "expresión" se refiere al proceso mediante el cual los polinucleótidos se transcriben en ARNm y/o el proceso mediante el cual el ARNm transcrito se traduce posteriormente en péptidos, polipéptidos o proteínas. Si el polinucleótido se deriva de ADN genómico, la expresión puede incluir el corte y empalme del ARNm en una célula eucariota. El nivel de expresión de un gen se puede determinar midiendo la cantidad de ARNm o proteína en una muestra de célula o tejido. En un aspecto, el nivel de expresión de un gen de una muestra se puede comparar directamente con el nivel de expresión de ese gen de una muestra de control o de referencia. En otro aspecto, el nivel de expresión de un gen de una muestra se puede comparar directamente con el nivel de expresión de ese gen de la misma muestra después de la administración de células NK-92.

Como se usa en el presente documento, "inmunoterapia" se refiere al uso de células NK-92, células NK o células T modificadas o no modificadas, de origen natural o modificadas, ya sea solas o en combinación, y que son capaces de inducir citotoxicidad cuando entran en contacto con una célula diana.

Como se usa en el presente documento, las "células asesinas naturales (NK)" son células del sistema inmunológico que matan células diana en ausencia de un estímulo antigénico específico y sin restricción de acuerdo con la clase del complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Las células diana pueden ser células cancerosas o tumorales. Las células NK se caracterizan por la presencia de CD56 y la ausencia de marcadores de superficie CD3.

El término "células NK endógenas" se utiliza para referirse a células NK derivadas de un donante (o del paciente), a diferencia de la línea celular NK-92. Las células NK endógenas son generalmente poblaciones heterogéneas de células dentro de las cuales se han enriquecido las células NK. Las células NK endógenas pueden estar destinadas al tratamiento autólogo o alogénico de un paciente.

"Células NK-92" se refieren a la línea de células NK inmortales, NK-92, que se obtuvo originalmente de un paciente que tenía linfoma no Hodgkin. El término "NK-92" pretende referirse a las líneas celulares NK-92 originales así como a las líneas celulares NK-92 que han sido modificadas (por ejemplo, mediante la introducción de genes exógenos). Las células NK-92 y modificaciones ejemplares y no limitantes de las mismas se describen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 7,618,817; 8,.034,332; y 8,313,943.

Una "célula NK-92 modificada" se refiere a una célula NK-92 que comprende además un vector que codifica un transgén, que incluye un receptor Fc, CAR, IL-2 y/o un gen suicida. En una realización preferida, la célula NK-92 modificada expresa al menos una proteína transgénica.

Como se usa en el presente documento, "células NK-92 no irradiadas" son células NK-92 que no han sido irradiadas. La irradiación deja a las células incapaces de crecer y proliferar. Se prevé que las células NK-92 se irradiarán en las instalaciones de tratamiento o en algún otro punto antes del tratamiento de un paciente, ya que el tiempo entre la irradiación y la infusión no debe ser superior a cuatro horas para preservar una actividad óptima. Alternativamente, las células NK-92 pueden inactivarse mediante otro mecanismo.

Como se usa en el presente documento, la "inactivación" de las células NK-92 las vuelve incapaces de crecer. La inactivación también puede estar relacionada con la muerte de las células NK-92. Se prevé que las células NK-92 puedan inactivarse después de haber purgado eficazmente una muestraex vivode células relacionadas con una patología en una aplicación terapéutica, o después de haber residido dentro del cuerpo de un mamífero un período de tiempo suficiente para efectivamente matar muchas o todas las células objetivo que residen dentro del cuerpo. La inactivación puede inducirse, a modo de ejemplo no limitante, administrando un agente inactivante al que las células NK-92 son sensibles.

Tal como se usan en el presente documento, se pretende que los términos "citotóxico" y "citolítico", cuando se usan para describir la actividad de células efectoras tales como células NK, sean sinónimos. En general, la actividad citotóxica se relaciona con la destrucción de células diana mediante cualquiera de una variedad de mecanismos biológicos, bioquímicos o biofísicos. La citólisis se refiere más específicamente a la actividad en la que el efector lisa la membrana plasmática de la célula diana, destruyendo así su integridad física. Esto da como resultado la muerte de la célula diana. Sin desear estar ligado a ninguna teoría, se cree que el efecto citotóxico de las células NK se debe a la citólisis.

El término "matar" con respecto a una célula/población celular pretende incluir cualquier tipo de manipulación que conduzca a la muerte de esa célula/población celular.

El término "receptor Fc" se refiere a una proteína que se encuentra en la superficie de ciertas células (por ejemplo, células asesinas naturales) que contribuye a las funciones protectoras de las células inmunitarias uniéndose a parte de un anticuerpo conocido como región Fc. La unión de la región Fc de un anticuerpo al receptor Fc (FcR) de una célula estimula la actividad fagocítica o citotóxica de una célula mediante fagocitosis mediada por anticuerpos o citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC). Los FcR se clasifican de acuerdo con el tipo de anticuerpo que reconocen. Por ejemplo, los receptores Fc-gamma (FcyR) se unen a la clase de anticuerpos IgG. F<cy>RIII-A (también llamado CD16) es un receptor Fc de baja afinidad que se une a los anticuerpos IgG y activa la ADCC. Los FcyRIII-A se encuentran típicamente en las células NK. Las células NK-92 no expresan FcyRIII-A. En la SEQ ID NO: 5 se muestra una secuencia de polinucleótidos representativa que codifica una forma nativa de CD16.

El término "receptor de antígeno quimérico" (CAR), como se usa en el presente documento, se refiere a un dominio de unión a antígeno extracelular que está fusionado a un dominio de señalización intracelular. Los CAR se pueden expresar en células T o células NK para aumentar la citotoxicidad. En general, el dominio de unión al antígeno extracelular es un scFv que es específico para un antígeno encontrado en una célula de interés. Una célula NK-92 que expresa CAR está dirigida a células que expresan ciertos antígenos en la superficie celular, de acuerdo con la especificidad del dominio scFv. El dominio scFv se puede modificar para reconocer cualquier antígeno, incluidos los antígenos específicos de tumores.

El término "antígeno específico de tumor" como se usa en el presente documento se refiere a antígenos que están presentes en una célula cancerosa o neoplásica pero no detectables en una célula normal derivada del mismo tejido o linaje que la célula cancerosa. Los antígenos específicos de tumores, como se usan en el presente documento, también se refieren a antígenos asociados a tumores, es decir, antígenos que se expresan a un nivel más alto en una célula cancerosa en comparación con una célula normal derivada del mismo tejido o linaje que la célula cancerosa. Los términos "polinucleótido", "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento de gen (por ejemplo, una sonda, un cebador, una etiqueta EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. Si están presentes, se pueden impartir modificaciones a la estructura del nucleótido antes o después del ensamblaje del polinucleótido. La secuencia de nucleótidos puede verse interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse aún más después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente marcador. El término también se refiere a moléculas tanto bicatenarias como monocatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de dos formas monocatenarias complementarias que se sabe o se predice que constituirán la forma bicatenaria.

Un polinucleótido está compuesto por una secuencia específica de cuatro bases nucleotídicas: adenina (A); citosina (C); guanina (G); timina (T); y uracilo (U) para timina cuando el polinucleótido es ARN. Por tanto, el término "secuencia de polinucleótidos" es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido.

Como se usa en el presente documento, "porcentaje de identidad" se refiere a la identidad de secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. El porcentaje de identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que puede alinearse con fines de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Como se usa en el presente documento, la frase secuencia de nucleótidos "homóloga" o "variante", o secuencia de aminoácidos "homóloga" o "variante" se refiere a secuencias caracterizadas por la identidad, a nivel de nucleótidos o de aminoácidos, de al menos un porcentaje específico. Las secuencias de nucleótidos homólogas incluyen aquellas secuencias que codifican variantes alélicas naturales y mutaciones de las secuencias de nucleótidos expuestas en el presente documento. Las secuencias de nucleótidos homólogas incluyen secuencias de nucleótidos que codifican una proteína de una especie de mamífero distinta de los humanos. Las secuencias de aminoácidos homólogas incluyen aquellas secuencias de aminoácidos que contienen sustituciones de aminoácidos conservadoras y cuyos polipéptidos tienen la misma unión y/o actividad. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos o aminoácidos homóloga tiene al menos un 60 % o más, por ejemplo al menos un 70 %, o al menos un 80 %, al menos un 85 % o más, con una secuencia comparadora. En algunas realizaciones, una secuencia de nucleótidos o aminoácidos homóloga tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad con una secuencia comparadora. En algunas realizaciones, una secuencia de aminoácidos homóloga tiene no más de 15, ni más de 10, ni más de 5 o no más de 3 sustituciones de aminoácidos conservadoras. El porcentaje de identidad se puede determinar, por ejemplo, mediante el programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versión 8 para UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando configuraciones predeterminadas, que usa el algoritmo de Smith y Waterman (Av. Appl. Math., 1981,2, 482-489).

El término "expresión" se refiere a la producción de un producto génico. El término "transitorio" cuando se refiere a expresión significa que un polinucleótido no está incorporado al genoma de la célula.

El término "citocina" o "citocinas" se refiere a la clase general de moléculas biológicas que afectan a las células del sistema inmunológico. Las citocinas ejemplares incluyen, entre otras, interferones e interleucinas (IL), en particular IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 e IL-21. En realizaciones preferidas, la citocina es IL-2.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a un ácido nucleico no cromosómico que comprende un replicón intacto de modo que el vector pueda replicarse cuando se coloca dentro de una célula permisiva, por ejemplo mediante un proceso de transformación. Un vector puede replicarse en un tipo de célula, como las bacterias, pero tiene una capacidad limitada para replicarse en otra célula, como las células de mamíferos. Los vectores pueden ser virales o no virales. Los vectores no virales ejemplares para administrar ácido nucleico incluyen ADN desnudo; ADN complejado con lípidos catiónicos, solo o en combinación con polímeros catiónicos; liposomas aniónicos y catiónicos; complejos de ADN-proteína y partículas que comprenden ADN condensado con polímeros catiónicos tales como polilisina heterogénea, oligopéptidos de longitud definida y polietilenimina, en algunos casos contenidos en liposomas; y el uso de complejos ternarios que comprenden un virus y polilisina-ADN.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "dirigido" pretende incluir, entre otros, dirigir proteínas o polipéptidos a destinos apropiados en la célula o fuera de ella. El direccionamiento se logra típicamente a través de péptidos señal o péptidos de direccionamiento, que son un tramo de residuos de aminoácidos en una cadena polipeptídica. Estos péptidos señal pueden ubicarse en cualquier lugar dentro de una secuencia polipeptídica, pero a menudo se ubican en el extremo terminal N. También se pueden modificar polipéptidos para que tengan un péptido señal en el extremo terminal C. Los péptidos señal pueden dirigir un polipéptido para la sección extracelular, su ubicación en la membrana plasmática, Golgi, endosomas, retículo endoplásmico y otros compartimentos celulares. Por ejemplo, los polipéptidos con una secuencia de aminoácidos particular en su extremo terminal C (por ejemplo, KDEL) se retienen en el lumen del RE o se transportan de regreso al lumen del RE.

El término "gen suicida" es aquel que permite la selección negativa de las células. Se utiliza un gen suicida como sistema de seguridad, permitiendo que las células que expresan el gen mueran mediante la introducción de un agente selectivo. Esto es deseable en caso de que el gen recombinante provoque una mutación que conduzca a un crecimiento celular descontrolado. Se han identificado varios sistemas de genes suicidas, incluido el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple, el gen de la citosina desaminasa, el gen de la timidina quinasa del virus de la varicela-zoster, el gen de la nitroreductasa, el gen gpt deEscherichia coliy el gen Deo deE. coli(véase también, por ejemplo, Yazawa K, Fisher WE, Brunicardi FC: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. julio de 2002; 26(7): 783-9). En una realización, el gen suicida es caspasa 9 inducible (iCas9) (Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Engl J Med 365: 1673-1683. Véase también Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13). El gen TK puede ser un gen TK de tipo silvestre o mutante (por ejemplo, tk30, tk75, sr39tk). Las células que expresan la proteína TK pueden destruirse utilizando ganciclovir.

Los términos "paciente", "sujeto", "individuo" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a cualquier animal, o células del mismo, ya seain vitrooin situ,susceptible de los métodos descritos en el presente documento. En una realización preferida, el paciente, sujeto o individuo es un mamífero. En una realización particularmente preferida, el paciente, sujeto o individuo es un ser humano.

El término "tratar'' o "tratamiento" cubre el tratamiento de una enfermedad o trastorno descrito en el presente documento, en un sujeto, tal como un ser humano, e incluye: (i) inhibir una enfermedad o trastorno, es decir, detener su desarrollo; (ii) aliviar una enfermedad o trastorno, es decir, provocar la regresión del trastorno; (iii) ralentizar la progresión del trastorno; y/o (iv) inhibir, aliviar o ralentizar la progresión de uno o más síntomas de la enfermedad o trastorno. El término "administrar" o "administración" de un anticuerpo monoclonal o una célula asesina natural a un sujeto incluye cualquier ruta de introducción o administración del anticuerpo o las células para realizar la función prevista. La administración puede realizarse por cualquier vía adecuada para la administración de las células o del anticuerpo monoclonal. Por lo tanto, las rutas de administración pueden incluir administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea. En algunas realizaciones, un anticuerpo monoclonal y/o células NK-92 se administran directamente al tumor, por ejemplo, mediante inyección en el tumor. La administración incluye la autoadministración y la administración por otro.

Por dosis o cantidad eficaz como se usa en el presente documento se entiende una dosis de un agente o composición que contiene el agente que produce el efecto o efectos deseados (por ejemplo, tratar o prevenir una enfermedad). La dosis exacta y la formulación de las nanopartículas dependerán del propósito del tratamiento y serán determinables por un experto en la técnica utilizando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington (2005); y Pickar, Dosage Calculations (novena edición) (1999)). Por ejemplo, para el parámetro dado, una cantidad terapéuticamente eficaz mostrará un aumento o disminución de al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 90%, o al menos el 100%. La eficacia terapéutica también se puede expresar como "las veces que" aumenta o disminuye. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz puede tener al menos un efecto de 1.2 veces, 1.5 veces, 2 veces, 5 veces o más sobre un control estándar. Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz puede mejorar uno o más síntomas de una enfermedad. Una dosis o cantidad terapéuticamente eficaz puede prevenir o retrasar la aparición de una enfermedad o uno o más síntomas de una enfermedad cuando el efecto por el que se administra es tratar a una persona que está en riesgo de desarrollar la enfermedad.

Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una inmunoglobulina o fragmento de la misma. El anticuerpo puede ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgA, IgM, IgE o IgD). Preferiblemente, el anticuerpo es IgG. Un anticuerpo puede ser no humano (por ejemplo, de ratón, cabra o cualquier otro animal), completamente humano, humanizado o quimérico. Un anticuerpo puede ser policlonal o monoclonal. Opcionalmente, el anticuerpo es monoclonal.

El término "anticuerpo monoclonal", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un anticuerpo puro, específico de la diana, producido a partir de un único clon de células cultivadas en cultivo y que es capaz de proliferar indefinidamente. Los anticuerpos monoclonales que pueden usarse incluyen anticuerpos desnudos, que se unen a los antígenos de las células cancerosas y los bloquean. En una realización, el anticuerpo monoclonal desnudo es alemtuzumab, que se une al antígeno CD52 en los linfocitos. También se incluyen en los anticuerpos monoclonales que pueden usarse, anticuerpos monoclonales conjugados, tales como anticuerpos etiquetados, marcados o cargados. Específicamente, los anticuerpos pueden marcarse o cargarse con un medicamento o una toxina, o marcarse radiactivamente. Ejemplos de tales anticuerpos incluyen, entre otros, ibritumomab, que se dirige al antígeno CD20; brentuximab, que se dirige al antígeno CD30, y trastuzumab, que se dirige a la proteína HER2. Otros anticuerpos monoclonales que pueden usarse son anticuerpos monoclonales biespecíficos, como blinatunomab, que se dirige a CD19 en células de linfoma y a CD3 en células T

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier porción del anticuerpo que reconoce un epítopo. Los fragmentos de anticuerpos pueden estar glicosilados. A modo de ejemplo no limitante, el fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento rIgG, un fragmento de anticuerpo funcional, formas recombinantes de cadena sencilla de los anteriores y similares. F(ab')2, Fab, Fab' y Fv son fragmentos de unión a antígeno que pueden generarse a partir de la región variable de IgG e IgM. Varían en tamaño, valencia y contenido de Fc. Los fragmentos pueden generarse mediante cualquier método, incluida la expresión de los constituyentes (por ejemplo, porciones de cadena pesada y ligera) por una célula o línea celular, o múltiples células o líneas celulares. Preferiblemente, el fragmento de anticuerpo reconoce el epítopo y contiene una porción suficiente de una región Fc de modo que sea capaz de unirse a un receptor Fc.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "cáncer" se refiere a todos los tipos de cáncer, neoplasia o tumores malignos que se encuentran en mamíferos, incluyendo leucemia, carcinomas y sarcomas. Los ejemplos de cánceres incluyen cáncer de cerebro, mama, cuello uterino, colon, cabeza y cuello, hígado, riñón, pulmón, pulmón de células no pequeñas, melanoma, mesotelioma, ovario, sarcoma, estómago, útero y meduloblastoma. Ejemplos adicionales incluyen enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer de ovario, rabdomiosarcoma, trombocitosis primaria, macroglobulinemia primaria, tumores cerebrales primarios, cáncer, insulanoma pancreático maligno, carcinoide maligno, cáncer de vejiga urinaria, lesiones cutáneas premalignas, cáncer testicular, linfomas, cáncer de tiroides, neuroblastoma, cáncer de esófago, cáncer del tracto genitourinario, hipercalcemia maligna, cáncer de endometrio, cáncer de corteza suprarrenal, neoplasias del páncreas endocrino y exocrino y cáncer de próstata.

Se pueden utilizar títulos o subtítulos en la memoria descriptiva para comodidad del lector, que no pretenden influir en el alcance de la presente divulgación. Además, algunos términos utilizados en esta memoria descriptiva se definen más específicamente a continuación.

Células NK-92

La línea celular NK-92 es una línea celular única que se descubrió que prolifera en presencia de interleucina 2 (IL-2). Gong et al., Leukemia 8: 652-658 (1994). Estas células tienen una alta actividad citolítica contra una variedad de cánceres. La línea celular NK-92 es una población de células NK cancerosas homogéneas que tiene una amplia citotoxicidad antitumoral con un rendimiento predecible después de la expansión. Los ensayos clínicos de fase I han confirmado su perfil de seguridad. NK-92 fue descubierto en la sangre de un sujeto que padecía un linfoma no Hodgkins y luego se inmortalizaronex vivo.Las células NK-92 se derivan de las células NK, pero carecen de los principales receptores inhibidores que presentan las células NK normales, aunque conservan la mayoría de los receptores activadores. Sin embargo, las células NK-92 no atacan a las células normales ni provocan una respuesta de rechazo inmunológico inaceptable en humanos. La caracterización de la línea celular NK-92 se divulga en el documento WO 1998/49268 y en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2002-0068044. Se descubre que la línea celular NK-92 exhibe los marcadores de superficie CD56brillante, CD2, CD7, CD11a, CD28, CD45 y CD54. Además, no muestra los marcadores CD1, CD3, CD4, CD5, CD8, CD10, CD14, CD16, CD19, CD20, CD23 y CD34. El crecimiento de las células NK-92 en cultivo depende de la presencia de interleucina 2 recombinante (rIL-2), siendo suficiente una dosis tan baja como 1 UI/mL para mantener la proliferación. La IL-7 y la IL-12 no favorecen el crecimiento a largo plazo, ni tampoco otras citocinas analizadas, incluidas la IL-1a, la IL-6, el factor de necrosis tumoral a, el interferón a y el interferón y. NK-92 tiene una alta citotoxicidad incluso con una proporción baja de efector:diana (E:T) de 1:1. Gong, et al., citado anteriormente. Las células NK-92 se depositan en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), designación CRL-2407.

Hasta ahora, los estudios sobre células NK endógenas han indicado que la IL-2 (1000 ILT/mL) es fundamental para la activación de las células NK durante el envío, pero que no es necesario mantener las células a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono. Koepsell, et al., Transfusion 53: 398-403 (2013).

Las células NK-92 modificadas son conocidas e incluyen, entre otras, las descritas en, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos Nos. 7,618,817, 8,034,332, y 8,313,943, la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2013/0040386, tales como NK-92, NK-92-CD16, NK-92-CD16-Y, NK-92-CD16-Z, NK-92-CD16(F157V), NK-92mi y NK-92ci de tipo silvestre.

Aunque las células NK-92 retienen casi todos los receptores activadores y las vías citolíticas asociadas con las células NK, no expresan CD16 en sus superficies celulares. CD16 es un receptor Fc que reconoce y se une a la porción Fc de un anticuerpo para activar las células NK para la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Debido a la ausencia de receptores CD16, las células NK-92 no pueden lisar las células diana mediante el mecanismo de ADCC y, como tales, no pueden potenciar los efectos antitumorales de los anticuerpos endógenos o exógenos (es decir, Rituximab y Herceptina).

Los estudios sobre células NK endógenas han indicado que la IL-2 (1000 UI/mL) es fundamental para la activación de las células NK durante el envío, pero que no es necesario mantener las células a 37 °C y 5 % de dióxido de carbono. Koepsell, et al., Transfusion 53: 398-403 (2013). Sin embargo, las células NK endógenas son significativamente diferentes de las células NK-92, en gran parte debido a sus distintos orígenes: NK-92 es una línea celular derivada de cáncer, mientras que las células NK endógenas se recolectan de un donante (o del paciente) y se procesan para su infusión en un paciente. Las preparaciones de células NK endógenas son poblaciones de células heterogéneas, mientras que las células NK-92 son una línea celular clonal homogénea. Las células NK-92 proliferan fácilmente en cultivo manteniendo la citotoxicidad, mientras que las células NK endógenas no lo hacen. Además, una población endógena heterogénea de células NK no se agrega a alta densidad. Además, las células NK endógenas expresan receptores Fc, incluidos los receptores CD-16 que no expresan las células NK-92.

Receptores Fc

Los receptores Fc se unen a la porción Fc de los anticuerpos. Se conocen varios receptores Fc y se diferencian de acuerdo con su ligando preferido, afinidad, expresión y efecto tras la unión al anticuerpo.

Tabla 1. Rece tores Fc ilustrativos

En algunas realizaciones, las células NK-92 se modifican para expresar una proteína del receptor Fc en la superficie celular.

En algunas realizaciones, el receptor Fc es CD16. Para los fines de esta divulgación, los residuos de aminoácidos específicos de CD16 se designan con referencia a la SEQ ID NO: 2, o a la SEQ ID NO: 1, que difiere en una posición con respecto a SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, un residuo de aminoácido "en la posición 158" de un polipéptido CD16 es el residuo de aminoácido que corresponde a la posición 158 de la SEQ ID NO: 2 (o la SEQ ID NO: 1), cuando el polipéptido CD16 y la SEQ ID NO: 2 están alineados al máximo. En algunas realizaciones, las células NK-92 se modifican para expresar una CD16 humana que tiene una fenilalanina en la posición 158 de la forma madura de la proteína. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 1. En realizaciones típicas, las células NK-92 se modifican para expresar una forma de alta afinidad de CD16 humano que tiene una valina en la posición 158 de la forma madura de la proteína, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2. La posición 158 de la proteína madura corresponde a la posición 176 de la secuencia de CD16 que incluye el péptido señal nativo. En algunas realizaciones, un polipéptido CD16 está codificado por un polinucleótido que codifica la secuencia polipeptídica precursora (es decir, que tiene un péptido señal nativo) de la SEQ ID NO: 3 o de la SEQ ID NO: 4.

En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 tiene al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de polinucleótido con una secuencia de polinucleótido que codifica una CD16 de longitud completa, incluido el péptido señal, de origen natural que tiene una fenilalanina en la posición 176 de la CD16 de longitud completa (que corresponde a la posición 158 de la proteína CD16 madura). En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 tiene al menos aproximadamente un 70 % de identidad de secuencia de polinucleótido con una secuencia de polinucleótido que codifica un CD16 de longitud completa, incluido el péptido señal, de origen natural que tiene una valina en la posición 176 (que corresponde a la posición 158) de la proteína madura). En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica CD16 tiene al menos un 70 % de identidad con la SEQ ID NO: 5 y comprende un codón que codifica valina en la posición del polinucleótido que codifica la posición 176 del polipéptido CD16 de longitud completa, incluido el péptido señal. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica CD16 tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 5 y comprende un codón que codifica valina en la posición 176 del CD16 de longitud completa. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica CD16 comprende la SEQ ID NO: 5, pero con un codón que codifica valina en la posición 176 del CD16 de longitud completa.

En algunas realizaciones, el polinucleótido CD16 codifica un polipéptido que tiene al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos un 70 % de identidad, o al menos un 80 % de identidad, con la SEQ ID NO: 2 y comprende una valina en la posición 158 según lo determinado con referencia a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 y comprende una valina en la posición 158 según lo determinado con referencia a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica un polipéptido que tiene al menos un 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 2 y comprende una valina en la posición 2 según lo determinado con referencia a la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, el polinucleótido codifica la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, un polinucleótido CD16 codifica un dominio extracelular de CD16 con o sin la secuencia señal, o cualquier otro fragmento de un CD16 de longitud completa, o un receptor quimérico que abarca al menos una secuencia parcial de CD16 fusionada a una secuencia de aminoácidos de otra proteína. En otras realizaciones, se puede agregar un péptido etiqueta de epítopo, tal como FLAG, myc, polihistidina o V5 al dominio terminal amino del polipéptido maduro para ayudar a la detección en la superficie celular mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales del péptido etiqueta anti-epítopo.

En algunas realizaciones, los polinucleótidos CD16 homólogos pueden tener una longitud de aproximadamente 150 a aproximadamente 700, aproximadamente 750 u aproximadamente 800 polinucleótidos, aunque las variantes de CD16 que tienen más de 700 a 800 polinucleótidos están dentro del alcance de la divulgación.

Las secuencias de polinucleótidos homólogos incluyen aquellas que codifican secuencias de polipéptidos que codifican variantes de CD16. Las secuencias de polinucleótidos homólogas también incluyen variaciones alélicas de origen natural relacionadas con la SEQ ID NO: 5. Transfección de una célula NK-92 con cualquier polinucleótido que codifique un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de las SEQ ID. NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, una variante natural de la misma, o una secuencia que es al menos un 70 % idéntica, o al menos un 80 %, 90 % o un 95 % idéntica a la SEQ ID. NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 está dentro del alcance de la divulgación. En algunas realizaciones, las secuencias de polinucleótidos homólogas codifican sustituciones de aminoácidos conservadoras en la SEQ ID. NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, las células NK-92 se transfectan usando una secuencia de polinucleótidos CD16 homóloga degenerada que difiere de una secuencia de polinucleótidos nativa, pero que codifica el mismo polipéptido.

En otros ejemplos, se usan secuencias de ADNc que tienen polimorfismos que cambian las secuencias de aminoácidos de CD16 para modificar las células NK-92, tales como, por ejemplo, las variaciones alélicas entre individuos que exhiben polimorfismos génicos en los genes CD16. En otros ejemplos, se usan genes CD16 de otras especies que tienen una secuencia de polinucleótidos que difiere de la secuencia de la SEQ ID NO: 5 para modificar células NK-92.

En ejemplos, se elaboran polipéptidos variantes usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), escaneo de alanina y mutagénesis por PCR. Se pueden realizar mutagénesis directa de sitio (Carter, 1986; Zoller y Smith, 1987), mutagénesis en casete, mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., 1985) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir variantes de CD16 (Ausubel, 2002; Sambrook y Russell, 2001).

En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica CD16 se muta para alterar la secuencia de aminoácidos que codifica para CD16 sin alterar la función de CD16. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de polinucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2.

Sustituciones conservadoras en la SEQ ID. NO: 1 o la SEQ ID NO: 2, por lo cual un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido de la misma clase, caen dentro del alcance de las variantes de CD16 divulgadas siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad del polipéptido. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica. Sustituciones no conservadoras que afectan (1) la estructura de la cadena principal del polipeptídico, tal como una conformación de lámina p o de hélice a, (2) la carga, (3) la hidrofobicidad o (4) la mayor parte de la cadena lateral del sitio diana puede modificar la función del polipéptido CD16 o la identidad inmunológica. Las sustituciones no conservadoras implican intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones pueden introducirse en sitios de sustitución conservadoras o más preferiblemente en sitios no conservados.

En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido CD16 tienen al menos 200 aminoácidos de longitud y tienen al menos un 70 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, o al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido CD16 tienen al menos 225 aminoácidos de longitud y tienen al menos un 70 % de identidad en la secuencia de aminoácidos, o al menos un 80 % o al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En algunas realizaciones, las variantes del polipéptido CD16 tienen una valina en la posición 158 de acuerdo con lo determinado con referencia a la SEQ ID NO: 2.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica un polipéptido CD16 puede codificar una proteína de fusión CD16. Un polipéptido de fusión CD16 incluye cualquier porción de CD16 o un CD16 completo fusionado con un polipéptido que no es CD16. Los polipéptidos de fusión se crean convenientemente usando métodos recombinantes. Por ejemplo, un polinucleótido que codifica un polipéptido CD16 tal como la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2 se fusiona en el marco con un polinucleótido que no codifica CD16 (tal como una secuencia de polinucleótidos que codifica un péptido señal de una proteína heteróloga). En alguna realización, se puede crear un polipéptido de fusión<en el que una secuencia polipeptídica heteróloga se fusiona con el extremo terminal C de CD>16<o se coloca>internamente en el CD16. Normalmente, se puede reemplazar hasta aproximadamente el 30 % del dominio citoplasmático de CD16. Dicha modificación puede mejorar la expresión o mejorar la citotoxicidad (por ejemplo, capacidad de respuesta de ADCC). En otros ejemplos, proteínas quiméricas, tales como dominios de otros receptores activadores de linfocitos, incluidos, entre otros, Ig-a, Ig-B, CD3-e, CD3-d, DAP-12 y DAP-10, reemplazan una porción del dominio citoplasmático de CD16.

Los genes de fusión se pueden sintetizar mediante técnicas convencionales, incluidos sintetizadores de ADN automatizados y amplificación por PCR utilizando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que posteriormente pueden hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia de gen quimérico (Ausubel, 2002). Hay muchos vectores disponibles comercialmente que facilitan la subclonación de CD16 en marco con una fracción de fusión.

Receptor de antígeno quimérico

[0077]Como se describe en el presente documento, las células NK-92 se modifican adicionalmente para expresar un receptor de antígeno quimérico (CAR) en la superficie celular. Opcionalmente, el CAR es específico para un antígeno específico de tumor. Los antígenos específicos de tumores se describen, a modo de ejemplo no limitante, en Estados Unidos 2013/0189268; WO 1999024566 A1; Estados Unidos 7098008 ; y Documento WO 2000020460 A1. Los antígenos específicos de tumores incluyen, entre otros, NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, ETA, MAGE, CAGE, BAGE, HAGE, LAGE, PAGE, NY-SEO-1, GAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1, AFP, CEA, CTAG1B, CD19 y CD33. En la Tabla 1 se pueden encontrar antígenos asociados a tumores adicionales no limitantes, y las neoplasias malignas asociadas con los mismos.

Tabla 1: Antí enos es ecíficos de tumores neo lasias mali nas asociadas

En algunas realizaciones, el CAR se dirige a CD19, CD33 o CSPG-4. Se proporcionan secuencias de polinucleótidos y polipéptidos representativas para los CAR CD19, CD33 y CSPG-4 en la s Eq ID NO: 8 (polinucleótido CAR CD19), la SEQ ID NO: 9 (polipéptido CAR CD19), la SEQ ID NO: 10 (polinucleótido CAR CD33), la SEQ ID NO: 11 (polipéptido CAR CD33), la SEQ ID NO: 12 (polinucleótido CAR CSPG-4) y la SEQ ID NO: 13 (polipéptido CAR CSPG-4). En algunas realizaciones, el polinucleótido CAR CD19 codifica un polipéptido que tiene al menos un 70 %, 80 %, 90%o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 9. Opcionalmente, el polipéptido CAR CD19 tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 9. En algunas realizaciones, el polinucleótido CAR CD33 codifica un polipéptido que tiene al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 11. Opcionalmente, el polipéptido CAR CD33 tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 11. En algunas realizaciones, el polinucleótido CAR CSPG-4 codifica un polipéptido que tiene al menos un 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad con la SEQ ID NO: 13. Opcionalmente, el polipéptido C<a>R CSPG-4 tiene al menos un 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con la SEQ ID NO: 13. En algunas realizaciones, se puede agregar un péptido marcador de epítopo, tal como FLAG, myc, polihistidina o V5 al dominio terminal amino del polipéptido para ayudar en la detección de la superficie celular mediante el uso de anticuerpos monoclonales o policlonales del péptido con etiqueta anti-epítopo.

En ejemplos, se elaboran polipéptidos variantes usando métodos conocidos en la técnica tales como mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida al sitio), escaneo de alanina y mutagénesis por PCR. Se pueden realizar mutagénesis dirigida al sitio (Carter, 1986; Zoller y Smith, 1987), mutagénesis en casete, mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., 1985) u otras técnicas conocidas en el ADN clonado para producir variantes de CD16 (Ausubel, 2002; Sambrook y Russell, 2001).

En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica un CAR se muta para alterar la secuencia de aminoácidos que codifica un CAR sin alterar la función del CAR. Por ejemplo, se pueden realizar sustituciones de polinucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos "no esenciales" en las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13.

Las sustituciones conservadoras en las SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11 o SEQ ID NO: 13, mediante las cuales un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido de la misma clase, caen dentro del alcance de las variantes divulgadas siempre que la sustitución no altere materialmente la actividad del polipéptido. Las sustituciones conservadoras son bien conocidas por los expertos en la técnica. Sustituciones no conservadoras que afectan (1) la estructura de la cadena principal del polipéptido, tal como una conformación de lámina p o de hélice a, (2) la carga, (3) la hidrofobicidad o (4) la mayor parte de la cadena lateral del sitio diana puede modificar la función del polipéptido o la identidad inmunológica. Las sustituciones no conservadoras implican intercambiar un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones pueden introducirse en sitios de sustitución conservadores o más preferiblemente en sitios no conservados.

Opcionalmente, el CAR se dirige a un antígeno asociado con un tipo de cáncer específico. Opcionalmente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en leucemia (que incluye leucemias agudas (por ejemplo, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (que incluye mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica y eritroleucemia)) y leucemias crónicas (por ejemplo, leucemia mielocítica crónica (granulocítica) y leucemia linfocítica crónica), policitemia vera, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin y enfermedad no Hodgkin), mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de las cadenas pesadas, tumores sólidos que incluyen, entre otros, sarcomas y carcinomas tales como fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, cáncer de páncreas, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de glándulas sudoríparas, carcinoma de glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cáncer de cuello uterino, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma. Los CAR pueden modificarse como se describe, por ejemplo, en las publicaciones de patentes Nos. WO 2014039523; US 20140242701; US 20140274909; US 20130280285; y WO 2014099671. Opcionalmente el CAR es un CAR CD19, un CAR CD33 o un CAR CSPG-4.

Modificaciones adicionales - Citocinas

La citotoxicidad de las células NK-92 depende de la presencia de citocinas (por ejemplo, interleucina 2 (IL-2)). El coste de usar IL-2 agregada exógenamente necesaria para mantener y expandir las células NK-92 en cultivos a escala comercial es significativo. La administración de IL-2 a sujetos humanos en cantidad suficiente para continuar la activación de las células NK-92 provocaría efectos secundarios adversos.

En algunas realizaciones, las células NK-92 que expresan FcR se modifican adicionalmente para expresar al menos una citocina y un gen suicida. En realizaciones específicas, al menos una citocina es IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 o una variante de las mismas. En realizaciones preferidas, la citocina es IL-2 (SEQ ID NO: 6). En determinadas realizaciones, la IL-2 es una variante que está dirigida al retículo endoplásmico y el gen suicida es iCas9.

En una realización, la IL-2 se expresa con una secuencia señal que dirige la IL-2 al retículo endoplásmico. En algunas realizaciones, un polinucleótido que codifica IL-2 codifica un polipéptido que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 7. Sin querer limitarse a ninguna teoría, pero dirigir la IL-2 al retículo endoplásmico permite la expresión de IL-2 a niveles suficientes para la activación autocrina, pero sin liberar IL-2 extracelularmente. Véase Konstantinidis et al., "Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells", Exp Hematol. 2005 febrero; 33(2): 159-64. La activación continua de las células NK-92 que expresan FcR se puede prevenir, por ejemplo, mediante la presencia del gen suicida.

Modificaciones adicionales - Gen suicida

El término "gen suicida" es aquel que permite la selección negativa de las células. Se utiliza un gen suicida como sistema de seguridad, permitiendo que las células que expresan el gen mueran mediante la introducción de un agente selectivo. Esto es deseable en caso de que el gen recombinante provoque una mutación que conduzca a un crecimiento celular descontrolado. Se han identificado varios sistemas de genes suicidas, incluido el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple, el gen de la citosina desaminasa, el gen de la timidina quinasa del virus de la varicela-zoster, el gen de la nitroreductasa, el gen gpt deEscherichia coliy el gen Deo deE. coli(véase también, por ejemplo, Yazawa K, Fisher WE, Brunicardi FC: Current progress in suicide gene therapy for cancer. World J. Surg. julio de 2002; 26(7): 783-9). Tal como se utiliza en el presente documento, el gen suicida está activo en las células NK-92. Normalmente, el gen suicida codifica una proteína que no tiene efectos nocivos en la célula pero que, en presencia de un compuesto específico, la matará. Por lo tanto, el gen suicida suele ser parte de un sistema.

En una realización, el gen suicida es el gen de la timidina quinasa (TK). El gen TK puede ser un gen TK de tipo silvestre o mutante (por ejemplo, tk30, tk75, sr39tk). Las células que expresan la proteína TK pueden destruirse utilizando ganciclovir.

En otra realización, el gen suicida es la citosina desaminasa que es tóxica para las células en presencia de 5-fluorocitosina. Garcia-Sanchez et al. "Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1 million-fold when they contaminate hematopoietic cells: a potential purging method for autologous transplantation". Blood, 15 de julio de 1998; 92 (2): 672-82.

En otra realización, el gen suicida es el citocromo P450 que es tóxico en presencia de ifosfamida o ciclofosfamida. Véase por ejemplo, Touati et al., "A suicide gene therapy combining the improvement of cyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumor immune response". Curr Gene Ther. 2014; 14(3): 236-46.

En otra realización, el gen suicida es iCas9. Di Stasi, (2011) "Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy." N Engl J Med 365: 1673-1683. Véase también Morgan, "Live and Let Die: A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic" Molecular Therapy (2012); 20: 11-13. La proteína iCas9 induce la apoptosis en presencia de una pequeña molécula AP1903. AP1903 es una molécula pequeña biológicamente inerte, que en estudios clínicos ha demostrado ser bien tolerada y se ha utilizado en el contexto de la terapia celular adoptiva.

En una realización, las células NK-92 modificadas se irradian antes de la administración al paciente. La irradiación de células NK-92 se describe, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos No. 8,034,332. En una realización, se irradian células NK-92 modificadas que no han sido modificadas para expresar un gen suicida.

Expresión de transgenes

Los transgenes (por ejemplo, CD19 CAR y CD16) pueden modificarse en un vector de expresión mediante cualquier mecanismo conocido por los expertos en la técnica. Los transgenes pueden modificarse en el mismo vector de expresión o en un vector de expresión diferente. En realizaciones preferidas, los transgenes se modifican en el mismo vector.

En algunas realizaciones, el vector permite la incorporación del transgén o transgenes en el genoma de la célula. En algunas realizaciones, los vectores tienen un marcador de selección positiva. Los marcadores de selección positiva incluyen cualquier gen que permita que la célula crezca en condiciones que matarían a una célula que no expresa el gen. Los ejemplos no limitantes incluyen resistencia a antibióticos, por ejemplo, geneticina (gen Neo de Tn5).

Puede usarse cualquier cantidad de vectores para expresar el receptor Fc y/o el CAR. En algunas realizaciones, el vector es un plásmido. En una realización, el vector es un vector viral. Los vectores virales incluyen, entre otros, vectores retrovirales, vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados, vectores virales del herpes simple, vectores virales de la viruela y otros.

Los transgenes se pueden introducir en las células NK-92 usando cualquier método de transfección conocido en la técnica, incluyendo, a modo de ejemplo no limitante, infección, electroporación, lipofección, nucleofección o "pistola de genes".

Anticuerpos

Opcionalmente, se pueden usar anticuerpos para atacar células cancerosas o células que expresan marcadores asociados al cáncer. Se han aprobado varios anticuerpos solo para el tratamiento del cáncer.

Tabla 2. Ejemplo de anticuerpos monoclonales terapéuticos aprobados por la FDA

Los anticuerpos pueden tratar el cáncer mediante varios mecanismos. La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) ocurre cuando las células inmunes, como las células NK, se unen a anticuerpos que están unidos a células diana a través de receptores Fc, como el CD16.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, las células NK-92 que expresan CD16 y/o un CAR se administran a un paciente junto con una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal dirigido contra una proteína específica asociada al cáncer, por ejemplo, alemtuzumab, bevacizumab, ibritumomab tiuxetano, ofatumumab, rituximab y trastuzumab. En algunas realizaciones, el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal desnudo, un anticuerpo monoclonal conjugado o un anticuerpo monoclonal biespecífico. En una realización, se puede usar un anticuerpo biespecífico que se une a la célula cancerosa y también se une a una proteína de la superficie celular presente en la superficie de las células NK-92.

Los anticuerpos específicos del cáncer se unen a antígenos proteicos particulares que se expresan en la superficie de las células cancerosas. Las células NK-92 se pueden modificar de manera que un anticuerpo se asocie con la superficie de la célula NK-92. En una realización preferida, el anticuerpo es específico para el cáncer. De esta manera, la célula NK-92 puede dirigirse específicamente al cáncer. También se pueden aislar anticuerpos neutralizantes. Por ejemplo, una glicoproteína secretada, YKL-40, está elevada en múltiples tipos de cánceres humanos avanzados. Se contempla que podría usarse un anticuerpo contra YKL-40 para frenar el crecimiento tumoral, la angiogénesis y/o la metástasis. Faibish et al., (2011) Mol. Cancer Ther. 10(5): 742-751.

El anticuerpo se puede administrar junto con la administración de células NK-92. Se puede administrar un anticuerpo específico para el cáncer a tratar antes, simultáneamente y/o después de la administración de las células NK-92. Los anticuerpos contra el cáncer pueden adquirirse de fuentes comercialmente disponibles o pueden producirse mediante cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos obteniendo células B, médula ósea u otras muestras de uno o más pacientes previamente infectados por el cáncer y que se recuperaron o se estaban recuperando cuando se tomó la muestra. Se conocen métodos para identificar, detectar y cultivar anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales) a partir de estas muestras. Por ejemplo, se puede preparar una biblioteca de presentación en fagos aislando ARN de la muestra o de las células de interés, preparando AdNc a partir del ARN aislado, enriqueciendo el ADNc para ADNc de cadena pesada y/o cadena ligera y creando bibliotecas usando un vector de presentación en fagos. Las bibliotecas se pueden preparar y seleccionar como se describe, por ejemplo, en Maruyama, et al., Los anticuerpos se pueden producir mediante métodos recombinantes o cualquier otro método. El aislamiento, la detección, la caracterización y la producción de anticuerpos monoclonales humanos también se describen en Beerli, et al., PNAS (2008) 105(38): 14336-14341.

Tratamiento

También se describen métodos para tratar pacientes con células NK-92 modificadas como se describe en el presente documento. En una realización, el paciente padece cáncer y el CAR expresado por la célula NK-92 es específico para un antígeno expresado en la superficie de ese cáncer. La nK-92 expresa un receptor Fc además de un CAR específico para un antígeno expresado en la superficie de ese cáncer (es decir, NK-92-Fc-CAR). Por ejemplo, la célula NK-92 podría expresar CD16 y MAGE en su superficie celular (es decir, NK-92-CD16-MAGE). Opcionalmente, el paciente es tratado con la célula NK-92 modificada y también con un anticuerpo.

Las células NK-92 se pueden administrar a un individuo mediante números absolutos de células, por ejemplo, a dicho individuo se le pueden administrar desde aproximadamente 1000 células/inyección hasta aproximadamente 10 mil millones de células/inyección, tal como aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente 1*108, 1x107, 5*107, 1*106, 5*106, 1*105, 5*105, 1*104, 5*104, 1*103, 5*103 (y así sucesivamente) células NK-92 por inyección, o cualquier intervalo entre dos números cualesquiera, incluidos los puntos finales. En otras realizaciones, a dicho individuo se le puede administrar aproximadamente 1000 células/inyección/m2 hasta aproximadamente 10 mil millones de células/inyección/m2, tal como aproximadamente, al menos aproximadamente o como máximo aproximadamente 1*108/m2, 1*107/m2, 5*107/m2, 1*106/m2, 5*106/m2, 1*105/m2, 5*105/m2, 1*104/m 2, 5*104/m2, 1*103/m2, 5*103/m2 (y así sucesivamente) células NK-92 por inyección, o cualquier intervalo entre dos números cualesquiera, incluidos los puntos finales.

En otras realizaciones, las células NK-92 se pueden administrar a dicho individuo en números relativos de células, por ejemplo, a dicho individuo se le pueden administrar aproximadamente 1000 células hasta aproximadamente 10 mil millones de células por kilogramo del individuo, tal como aproximadamente, al menos aproximadamente, o como máximo aproximadamente, 1*108, 1*107, 5*107, 1*106, 5*106, 1*105, 5*105, 1*104, 5*104, 1*103, 5*103 (y así sucesivamente) células NK-92 por kilogramo del individuo, o cualquier intervalo entre dos números cualesquiera, incluidos los puntos finales.

En otras realizaciones, la dosis total puede calcularse por m2 de superficie corporal, incluyendo aproximadamente 1*1011, 1x101°, 1*109, 1*108, 1*107, por m2, o cualquier intervalo entre dos números cualesquiera, incluidos los puntos finales. La persona promedio mide entre 1.6 hasta aproximadamente 1.8 m2. En una realización preferida, se administran a un paciente entre aproximadamente mil millones y aproximadamente 3 mil millones de células NK-92. En otras realizaciones, la cantidad de células NK-92 inyectadas por dosis se puede calcular por m2 de superficie corporal, incluyendo 1*1011, 1x1010, 1*109, 1*108, 1*107, por m2. La persona promedio mide 1.6-1.8 m2.

Las células NK-92, y opcionalmente otros agentes anticancerígenos, se pueden administrar una vez a un paciente con cáncer, se pueden administrar varias veces, por ejemplo, una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22 o 23 horas, o una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 días, o una vez cada 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más semanas durante la terapia, o cualquier intervalo entre dos números cualquiera, incluidos los puntos finales.

En algunas realizaciones, las células NK-92 se administran en una composición que comprende células NK-92 y un medio, tal como suero humano o un equivalente del mismo. En algunas realizaciones, el medio comprende albúmina de suero humano. En algunas realizaciones, el medio comprende plasma humano. En algunas realizaciones, el medio comprende aproximadamente del 1 % a aproximadamente el 15 % de suero humano o equivalente de suero humano. En algunas realizaciones, el medio comprende aproximadamente del 1 % a aproximadamente el 10 % de suero humano o equivalente de suero humano. En algunas realizaciones, el medio comprende aproximadamente del 1 % a aproximadamente el 5 % de suero humano o equivalente de suero humano. En una realización preferida, el medio comprende aproximadamente un 2.5 % de suero humano o equivalente de suero humano. En algunas realizaciones, el suero es suero AB humano. En algunas realizaciones, se usa un sustituto de suero que es aceptable para su uso en terapéutica humana en lugar de suero humano. Dichos sustitutos del suero pueden ser conocidos en la técnica o desarrollarse en el futuro. Aunque se pueden usar concentraciones de suero humano superiores al 15 %, se contempla que concentraciones superiores a aproximadamente el 5 % tendrán un coste prohibitivo. En algunas realizaciones, las células NK-92 se administran en una composición que comprende células nK-92 y una solución líquida isotónica que respalda la viabilidad celular. En algunas realizaciones, las células NK-92 se administran en una composición que se ha reconstituido a partir de una muestra crioconservada.

Las composiciones farmacéuticamente aceptables pueden incluir una variedad de vehículos y excipientes. Se pueden utilizar diversos vehículos acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Estas soluciones son estériles y generalmente están libres de materias indeseables. Los vehículos y excipientes adecuados y sus formulaciones se describen en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, edición 21, David B. Troy, ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005). Por vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende un material que no es biológicamente o de otra manera indeseable, es decir, el material se administra a un sujeto sin causar efectos biológicos indeseables o interactuar de manera perjudicial con los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. Si se administra a un sujeto, el vehículo se selecciona opcionalmente para minimizar la degradación del ingrediente activo y minimizar los efectos secundarios adversos en el sujeto. Como se usa en el presente documento, el término farmacéuticamente aceptable se usa como sinónimo de fisiológicamente aceptable y farmacológicamente aceptable. Una composición farmacéutica generalmente comprenderá agentes para tamponamiento y conservación durante el almacenamiento y puede incluir tampones y vehículos para una administración adecuada, dependiendo de la vía de administración.

Estas composiciones para usoin vivooin vitropueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales bien conocidas. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares aceptables según sea necesario para aproximarse a las condiciones fisiológicas tales como agentes de tamponamiento y ajuste del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, lactato de sodio y similares. La concentración de células en estas formulaciones y/u otros agentes puede variar y se seleccionará principalmente en función de los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del sujeto.

En una realización, las células NK-92 se administran al paciente junto con uno o más tratamientos diferentes para el cáncer que se está tratando. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que el tratamiento conjunto de un paciente con células NK-92 y otra terapia para el cáncer permitirá que las células NK-92 y la terapia alternativa le den al sistema inmunológico endógeno la oportunidad de eliminar el cáncer que hasta entonces había anulado tal acción endógena. En algunas realizaciones, dos o más tratamientos diferentes para el cáncer que se está tratando incluyen, por ejemplo, un anticuerpo, radiación, quimioterapia, trasplante de células madre o terapia hormonal.

En una realización, se administra un anticuerpo al paciente junto con las células NK-92. En una realización, las células NK-92 y un anticuerpo se administran al paciente juntos, por ejemplo, en la misma formulación; por separado, por ejemplo, en formulaciones separadas, al mismo tiempo; o se puede administrar por separado, por ejemplo, en diferentes esquemas de dosificación o en diferentes momentos del día. Cuando se administra por separado, el anticuerpo se puede administrar por cualquier vía adecuada, tal como administración intravenosa u oral.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se contempla que las células NK-92 que expresan una combinación de un receptor Fc y un CAR y cuando se administran con un anticuerpo monoclonal anticiparán más fácilmente los mutantes de escape y también evitarán la selección de mutantes de escape. Además, las propias células efectoras del paciente pueden participar en ADCC con el anticuerpo monoclonal dirigido a las células cancerosas. Este sistema dual (tanto un receptor Fc como un CAR) también puede ser más selectivo para las células cancerosas que para las células no cancerosas (fuera del tumor, en el objetivo). Pocos antígenos asociados a tumores se expresan exclusivamente en células cancerosas, pero es raro que una célula no cancerosa sobreexprese dos antígenos específicos/asociados a tumores. Por ejemplo, los linfocitos suelen expresar CD19 y CD20, a menudo uno está sobrerregulado mientras que el otro está subregulado y viceversa. Un NK-92-CD16-CD19 en combinación con ibritumomab tiuxetano o rituximab podría ser eficaz en el tratamiento de determinados linfomas.

Kits

También se divulgan kits para el tratamiento del cáncer que utilizan composiciones que comprenden una cantidad de células NK-92 que se modifican para expresar al menos un receptor Fc en una superficie celular y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR) en la superficie celular e instrucciones para su uso en el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, los kits de la presente divulgación también pueden incluir al menos un anticuerpo monoclonal. Los componentes del kit pueden estar contenidos en uno o diferentes recipientes tales como uno o más viales. El anticuerpo puede estar en forma líquida o sólida (por ejemplo, después de la liofilización) para mejorar la vida útil. Si están en forma líquida, los componentes pueden comprender aditivos tales como estabilizadores y/o conservantes tales como prolina, glicina o sacarosa u otros aditivos que mejoran la vida útil.

En determinadas realizaciones, el kit puede contener compuestos adicionales tales como compuestos o medicamentos terapéuticamente activos que se van a administrar antes, al mismo tiempo o después de la administración de las células NK-92 modificadas o de las células NK-92 y el anticuerpo. Ejemplos de tales compuestos incluyen vitaminas, minerales, fludrocortisona, ibuprofeno, lidocaína, quinidina, quimioterapéuticos, etc.

En diversas realizaciones, las instrucciones de uso de los kits incluirán instrucciones para usar los componentes del kit en el tratamiento de un cáncer. Las instrucciones pueden contener además información sobre cómo preparar (por ejemplo, diluir o reconstituir, en el caso de proteína liofilizada) el anticuerpo y las células NK-92 (por ejemplo, descongelar y/o cultivar). Las instrucciones pueden incluir además orientación sobre la dosis y la frecuencia de administración.

Se divulgan materiales, composiciones y componentes que se pueden usar, se pueden usar junto con, se pueden usar en preparación o son productos de los métodos y composiciones divulgados. Estos y otros materiales se divulgan en el presente documento, y se entiende que cuando se divulgan combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales, si bien la referencia específica de cada una de las diversas combinaciones y permutaciones individuales y colectivas de estos compuestos puede no divulgarse explícitamente, cada uno de ellos se contempla y describe específicamente en el presente documento. Por ejemplo, si se divulga y analiza un método y se analizan varias modificaciones que se pueden realizar en varias moléculas, incluido el método, todas y cada una de las combinaciones y permutaciones del método, y las modificaciones que son posibles, se contemplan específicamente a menos que se indique específicamente lo contrario. Asimismo, también se contempla y divulga específicamente cualquier subconjunto o combinación de éstos. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgación, incluidos, entre otros, etapas en los métodos que utilizan las composiciones divulgadas. Por lo tanto, si hay una variedad de etapas adicionales que se pueden realizar, se entiende que cada una de estas etapas adicionales se puede realizar con cualquier etapa de método específico o combinación de etapas de método de los métodos divulgados, y que cada una de dicha combinación o subconjunto de combinaciones se contempla específicamente y debe considerarse divulgada.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos tienen únicamente fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitaciones. Hay una variedad de técnicas y procedimientos alternativos disponibles para los expertos en la técnica que de manera similar permitirían realizar con éxito los ejemplos siguientes.

Ejemplo 1: Supervivencia prolongada después del tratamiento con NK-92-Fc-CAR

Las células leucémicas positivas para CD19 derivadas de un paciente con leucemia linfoblástica aguda (ALL) de linaje T, un paciente con leucemia mieloide aguda (AML) y un paciente pre-B-ALL se cultivan y expanden de forma adoptiva en ratones NSG mediante inoculación SC. Se utilizan células leucémicas recuperadas de los nódulos leucémicos en los ratones (primer pase). Los ratones NSG de cada grupo se inoculan IP con 5 * 106 células leucémicas del primer pase en 0.2 mL de PBS. Todas las leucemias humanas crecen agresivamente en ratones NSG. Veinticuatro horas después con (a) rituximab (b) células NK-92-CD16-CD19 o (c) rituximab y células NK-92-CD16-CD19. Los tratamientos se administran a los ratones todas las semanas durante cuatro meses. Se contempla que el tratamiento con células NK-92-CD16-CD19 o una combinación de rituximab y células NK-92-CD16-CD19 prolonga significativamente la vida y extiende la supervivencia de los ratones en comparación con el tratamiento con rituximab únicamente.

Ejemplo 2. Las células NK-92 son capaces de expresar un receptor Fc y un CAR.

Para analizar células NK-92 que expresan un receptor Fc y un CAR, se realizaron ensayos de citotoxicidadin vitrode células NK-92 electroporadas con ARNm que codifica CD19-CAR contra las líneas celulares K562 (sensible a NK-92, negativas para CD19), SUP-B15 (resistentes a NK-92, positivas para CD19) y SR-91 (resistentes a NK-92, negativas para CDl9). Los resultados se muestran en las Figuras 1A, 1B y 1C. La Figura 1A muestra la destrucción de líneas celulares diana mediante células NK-92 parentales no electroporadas. La Figura 1B muestra la destrucción de líneas celulares diana por células NK-92 parentales que expresan CD19-CAR. La Figura 1C muestra la destrucción de líneas celulares diana por células NK-92 CD16(158V)-ERlL2 que expresan CD19-CAR. Las células SUP-B15 positivas para CD19, resistentes a NK, se vuelven sensibles a las células NK-92 que expresan CD19-CAR y a las células NK-92 CD16(158V)-ERIL2, mientras que las células SR-91 negativas para CDl9, resistentes a NK, siguen siendo resistentes. La destrucción de K562 no se ve afectada por la expresión de CD19-CAR.

Ejemplo 3. La electroporación de ARNm para receptores de antígenos quiméricos (CAR) en líneas de células NK humanas da como resultado una alta eficiencia de transfección y una citotoxicidad específica del objetivo.

Datos sobre transfección, expresión y citotoxicidad de ARNm de tres CAR diferentes: Se proporcionan CD19, CD33 y CSPG-4 basados en una construcción CAR de primera generación. Las líneas celulares diana para la transfección de ARNm fueron aNK (células NK-92 parentales) y haNK (NK-92 que expresan FcR con alta afinidad). La secuencia scFv se hizo por encargo mediante GeneArt (codón optimizado) y el ARNm se transfectó con MaxCyte GT para generar taNK (célula NK activada por objetivo). La expresión se determinó mediante inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos correspondientes y la citotoxicidad se midió utilizando un ensayo de citometría de flujo estándar.

Después de optimizar el protocolo de transfección con respecto al voltaje y el tiempo del pulso eléctrico, se determinó que tanto aNK como haNK podrían transfectarse efectivamente con las tres construcciones del CAR de ARNm. La viabilidad de las células NK transfectadas después de la transfección fue consistentemente superior al 80 % y la expresión del CAR correspondiente fue del 55-60 % a las 6 horas, del 80-95 % a las 24 horas y superior al 80 % a las 48 horas. Se determinó la citotoxicidad específica contra líneas celulares resistentes a aNK (SUP-B15 para CD19, SR-91 para CD33 y SK-MEL para CSPG-4). Después de la transfección, la citotoxicidad contra líneas celulares resistentes a aNK a las 24 horas fue consistentemente superior al 80 %.

Tanto aNK como haNK pueden transfectarse de manera confiable y consistente con ARNm para diversas construcciones de CAR manteniendo una alta viabilidad de las células NK transfectadas, una excelente expresión de CAR así como una citotoxicidad específica de las células diana durante al menos 48 horas. Esta tecnología se puede ampliar fácilmente hasta la producción de grado clínico de líneas de células NK que expresan CAR. El hecho de que haNK pueda transfectarse eficazmente (para convertirse en t-haNK) abre la posibilidad de una focalización sin reacción cruzada del receptor dual (es decir, CD19 CAR con anticuerpo CD20) de neoplasias malignas.

Secuencias ilustrativas

SEQ ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos del receptor III-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina de baja afinidad (forma madura). La fenilalanina en la posición 158 está subrayada.

SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos del receptor III-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina F158V variante de alta afinidad (forma madura). La valina en la posición 158 está subrayada.

SEQ ID NO: 3 Secuencia de aminoácidos del receptor III-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina de baja afinidad (forma precursora). La posición 176 de la forma precursora corresponde a la posición 158 de la forma madura. La Phe en la posición 176 está subrayada.

SEQ ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos del receptor III-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina variante de alta afinidad (forma precursora). La posición 176 de la forma precursora corresponde a las posiciones 158 de la forma madura. La Val en la posición 176 está subrayada.

SEQ ID NO: 5 Polinucleótido que codifica el receptor III-A de la región Fc de gamma inmunoglobulina de baja afinidad (Precursor) (Codifica fenilalanina en la posición 158)

a tg tg g c a g c tg c tc c tc c c a a c tg c tc tg c tac ttc ta g tttc a g c tg g c a tg c g g a c t g a a g a tc tc c c a aag g c tg t

SEQ ID NO: 6 IL-2 de tipo silvestre

SEQ ID NO: 7 IL-2-ER

SEQ ID NO: 8 secuencia de ADN de CD19-CAR

SEQ ID NO: 9 Secuencia de aminoácidos de CD19-CAR

SEQ ID NO: 10 Secuencia de ADN de CD33-CAR

SEQ ID NO: 11 Secuencia de aminoácidos de CD33-CAR

SEQ ID NO: 12 Secuencia de ADN de CSPG4-CAR

SEQ ID NO: 13 Secuencia de aminoácidos de CSPG4-CAR

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una célula o línea celular NK-92 que se modifica para expresar al menos un receptor Fc y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR), de manera que al menos un receptor Fc y el al menos un CAR se presentan en la superficie celular de la célula N<k>-92.

2. La célula o línea celular de la reivindicación 1, en la que el receptor Fc es F<cy>RIII-A (CD 16) o un polipéptido CD16 que tiene una valina en la posición 158 de la forma madura del CD16, opcionalmente en la que el receptor Fc comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 y comprende valina en la posición 158, o el receptor Fc comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

3. La célula o línea celular de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el CAR tiene al menos un 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, o SEQ ID NO: 13, opcionalmente en la que el CAR se dirige a un antígeno asociado a tumor seleccionado del grupo que consiste en CD 19, CSPG-4, CD20, ligandos de NKG2D, CS1, GD2, CD138, EpCAM, HER-2, EBNA3C, GPA7, CD244, CA-125, MUC-1, ETA, MAGE, CEA, CD52, CD30, MUC5AC, c-Met, EGFR, FAB, WT-1, PSMA, NY-ESO1 y CD33.

4. La célula o línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que expresa además una citocina, opcionalmente en la que la citocina es interleucina 2 o una variante de la misma, y/o la citocina está dirigida al retículo endoplásmico.

5. La célula o línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el receptor Fc y el CAR están codificados en vectores diferentes.

6. La célula o línea celular de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que las células de la línea celular experimentan menos de 10 duplicaciones de población, opcionalmente en la que las células se cultivan en medios que contienen menos de 10 U/mL de IL-2.

7. Una composición que comprende células de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, opcionalmente en la que la composición comprende además al menos un anticuerpo monoclonal, opcionalmente en la que al menos un anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal desnudo, un anticuerpo monoclonal conjugado o un anticuerpo monoclonal biespecífico, o el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en alemtuzumab, rituxumab, trastuzumab, ibritumomab, brentuximab, gemtuzumab, adotranstuzumab, blinatunomab, avelumamab, daratumumab y elotuzumab.

8. Una célula o línea celular de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición de la reivindicación 7, para uso en un método de tratamiento del cáncer, comprendiendo el método administrar a un paciente que lo necesita una cantidad eficaz de una cualquiera de las células o líneas celulares de las reivindicaciones. 1-6 o la composición de la reivindicación 7, tratando así el cáncer, opcionalmente en el que las células, línea celular o composición se administran al paciente mediante una ruta seleccionada del grupo que consiste en intravenosa, intraperitoneal y subcutánea, que comprende además opcionalmente la administración al paciente una cantidad eficaz de al menos un anticuerpo monoclonal, opcionalmente en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal desnudo, un anticuerpo monoclonal conjugado o un anticuerpo monoclonal biespecífico, o el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en alemtuzumab, rituxumab, trastuzumab, ibritumomab, brentuximab, gemtuzumab, adotranstuzumab, blinatunomab, avelumamab, daratumumab y elotuzumab, opcionalmente en el que (i) el anticuerpo monoclonal y las células se administran simultáneamente, (ii) el anticuerpo monoclonal y las células se mezclan antes de administrarse al paciente, o (iii) el anticuerpo monoclonal y las células se administran secuencialmente.

9. La célula, línea celular o composición para uso de la reivindicación 8, en la que el cáncer se selecciona del grupo que consiste en una leucemia, un linfoma, policitemia vera, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad de cadenas pesadas, un sarcoma y un carcinoma.

10. La célula, línea celular o composición para uso de la reivindicación 8, en la que aproximadamente 1x108 a aproximadamente 1*1011 células por m2 de área de superficie corporal del paciente se administran al paciente.

11. Un kit para tratar el cáncer, en el que el kit comprende (a) células NK-92 que están modificadas para expresar al menos un receptor Fc en una superficie celular y al menos un receptor de antígeno quimérico (CAR) en la superficie celular y (b) instrucciones de uso, opcionalmente en el que el kit comprende además (c) al menos un anticuerpo monoclonal, opcionalmente en el que el anticuerpo monoclonal es un anticuerpo monoclonal desnudo, un anticuerpo monoclonal conjugado o un anticuerpo monoclonal biespecífico, o el anticuerpo monoclonal se selecciona del grupo que consiste en alemtuzumab, rituxumab, trastuzumab, ibritumomab, brentuximab, gemtuzumab, adotranstuzumab, blinatunomab, avelumamab, daratumumab y elotuzumab.