ES2680143T3 - Composiciones y métodos para la detección de múltiples microorganismos - Google Patents

Composiciones y métodos para la detección de múltiples microorganismos Download PDF

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Craig Cummings
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Sharon MATHENY
Catherine O'CONNELL
Manohar Furtado
Rixun Fang
Olga Petrauskene
Sueh-Ning Liew
Michael SCHUMAKER
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Abstract

Un método para la detección de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia que comprende: a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia con al menos dos conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácidos nucleicos objetivo específicos para uno o más factores de virulencia; b) amplificar al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo específica para uno o más factores de virulencia mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos específicos de factor de virulencia amplificados; c) detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos; y d) identificar los ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia, en el que uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos es indicativa de la presencia de un microorganismo en la muestra que expresa uno o más factores de virulencia, en el que al menos dos conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con un ácido nucleico objetivo específico de toxina Shiga (stx) y al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de eae, en el que los cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de stx comprenden uno o más conjuntos de cebador seleccionados de un primer conjunto de cebador que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; o un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9 y los cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de eae comprenden uno o más conjuntos de cebadores seleccionados de un conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 o un conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 13.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones y métodos para la detección de múltiples microorganismos Campo técnico de la invención
Las presentes enseñanzas, en algunas realizaciones, se refieren a composiciones, métodos y kits para la detección de uno o múltiples microorganismos contaminantes en muestras. Algunas realizaciones describen composiciones, métodos y kits para detectar uno o más microorganismos que producen factores de virulencia tales como la toxina de Shiga o eae. En algunas realizaciones, las composiciones, métodos y kits pueden identificar y detectar además cepas y serotipos individuales de microorganismos productores de toxina Shiga. También se describen flujos de trabajo para detección e identificación de múltiples microbios.
Antecedentes
La identificación de la contaminación bacteriana en los alimentos a menudo ocurre después de un brote de una enfermedad transmitida por los alimentos. Las bacterias como Escherichia coli (E. coli) y Shigella (Shigella spp.) Se identifican con frecuencia como un contaminante alimentario de muchas enfermedades transmitidas por los alimentos. Algunos organismos E. coli y Shigella spp. producen una toxina llamada toxina Shiga.
Los organismos Shigella spp., si se consumen en alimentos contaminados, causan shigelosis que a menudo se caracteriza por disentería, náuseas, fiebre, vómitos y calambres estomacales.
E. coli productor de la toxina Shiga (STEC), a veces también denominado E. coli productor de verotoxina (VTEC), se encuentran en carnes poco cocidas, leche cruda y agua contaminada. Estas bacterias pueden causar enfermedades que van desde enfermedades intestinales leves hasta diarrea sanguinolenta o insuficiencia renal potencialmente mortal causada por una afección llamada síndrome urémico hemolítico (HUS).
Un serotipo de E. coli conocido como E. coli0157: H7 produce la toxina Shiga y con mayor frecuencia se asocia con brotes de enfermedades transmitidas por los alimentos en los Estados Unidos y en otras partes del mundo y causa colitis enterohemorrágica y posiblemente insuficiencia renal. La detección de E. coli patógena, en particular los serotipos causantes de colitis hemorrágica y HUS se han convertido en una prioridad de salud pública. Las regulaciones del gobierno de los Estados Unidos exigen que la carne y otros procesadores de alimentos examinen la presencia de cepas tales como O157: H7 en sus productos terminados y se están considerando directrices más estrictas en varios estados para la identificación de O157: H7 en otros productos básicos y productos alimenticios.
Como resultado de brotes repetidos y la naturaleza potencialmente mortal de la contaminación por STEC, las agencias gubernamentales de salud pública ahora requieren pruebas de múltiples microbios STEC para garantizar la seguridad de los alimentos. Específicamente, el USDA-FSIS ha identificado seis serotipos O de E. coli incluyendo O26, O45, O103, O111, O121, O145 para futuras pruebas, mientras que la Asociación Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) ha requerido la prueba de cuatro de estos serotipos de E. coli que incluyen O26, O103, O111, O145. Sin embargo, todavía faltan métodos rápidos para probar e identificar uno o más organismos STEC.
Los documentos US2010/267012, CN101113475, SHARMA V K ET AL, "Semi-automated fluorogenic PCR assays (TaqMan) for rapid detection of Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxigenic E. coli', MOLECULAR AND CELLULAR PROBES, ACADEMIC PRESS, LONDON, GB, (19990801), vol. 13, No. 4, páginas 291-302, e IBEKWE A M ET AL., "Multiplex fluorogenic real-time PCR for detection and quantification of Escherichia coli O157:H7 in dairy wastewater wetlands", APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, AMERICAN SOCIETY FOR MICROBIOLOGY, US., (20021001), vol. 68, No. 10, páginas 4853-4862, divulgan ensayos múltiples de PCR dirigidos, entre otros, al gen stxl. Los ensayos para la detección rápida, sensible y específica de patógenos infecciosos son extremadamente importantes desde una perspectiva de salud pública y económica. Existe la necesidad de nuevos ensayos y métodos para detectar y diferenciar organismos patógenos de otros organismos patógenos y no patógenos para analizar alimentos y otras muestras, y la identificación de patógenos, por ejemplo, para determinar un contaminante patógeno en una muestra y/o para hacer un diagnóstico diferencial de qué microbio está causando una enfermedad en particular.
Resumen
Según la presente invención, se proporcionan métodos y kits para la detección de uno o más microorganismos y/o cepas y/o serotipos de los mismos que expresan uno o más factores de virulencia (por ejemplo, un microbio que expresa factores de virulencia tales como la toxina Shiga y/o eae) de acuerdo con las reivindicaciones modificadas.
Algunas realizaciones se refieren a composiciones que comprenden secuencias aisladas de ácido nucleico que son operables para hibridarse con regiones de ácido nucleico que se encuentran de manera única en un microbio que expresa un factor de virulencia. Las regiones de ácido nucleico que corresponden a uno o más factores de virulencia y que se encuentran únicamente en microorganismos que expresan el factor de virulencia se denominan aquí ácidos
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nucleicos objetivo específicos del factor de virulencia.
Los factores de virulencia, en algunas realizaciones, comprenden uno o más genes, alelos y variantes de los mismos que codifican una toxina Shiga. En algunas realizaciones, se describen composiciones que comprenden secuencias de ácidos nucleicos de cebador y/o sonda que son específicas para hibridar con el gen stx (toxina Shiga), alelo, fragmento y/o complemento del mismo, que comprenden secuencias aisladas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de las la SEQ ID NOS: 1-10, complementos de los mismas y secuencias que tienen aproximadamente un 90% de identidad con las secuencias anteriores.
En algunas realizaciones, la detección de factores de virulencia en un microorganismo comprende la detección de uno o más genes, alelos y/o porciones y/o fragmentos y/o complementos de los mismos que codifican una toxina Shiga. Las composiciones de ácidos nucleicos aisladas se describen en el presente documento como cebadores y sondas que tienen las la SEQ ID NOS: 1-10 que son específicas para hibridar con una secuencia de ácido nucleico objetivo específica de toxina Shiga, que incluyen, pero no se limitan a, un gen stx, alelo, fragmento, variante y/o complementos de los mismos, así como un fragmento amplificado de cualquiera de los anteriores. Estas composiciones se pueden usar en métodos de detección descritos en este documento para detectar la presencia de un microbio que codifica/expresa toxina Shiga. Los microorganismos de diferentes especies y cepas que codifican un factor de virulencia de toxina Shiga, que incluye alelos stxl y stx2, pueden detectarse mediante composiciones y métodos descritos en este documento. Los ejemplos no limitantes de microorganismos detectados pueden incluir diversas E. coli spp. y Shigella spp. que producen toxina Shiga.
En algunas realizaciones, un factor de virulencia que puede detectarse mediante las presentes composiciones y métodos comprende uno o más genes, alelos y variantes de los mismos que codifican el gen de eae. En algunas realizaciones, la detección de factores de virulencia puede comprender la detección de uno o más ácidos nucleicos que codifican eae, un alelo de un gen eae, o fragmentos de los mismos. Las composiciones aisladas de ácidos nucleicos se describen en la presente memoria como cebadores y sondas que tienen las la SEQ ID NOS: 11-14 que son específicas para hibridar con una secuencia de ácido nucleico objetivo específica de eae, que incluyen, pero no se limitan a, un gen eae, alelo, fragmento, variante y/o complementos de los mismos, así como un fragmento amplificado de cualquiera de los anteriores. Estas composiciones se pueden usar en métodos de detección descritos en este documento para detectar la presencia de un microbio que codifica/expresa eae. Los microorganismos de diferentes especies y cepas que codifican/expresan el factor de virulencia de eae, incluyendo alelos y variantes de eae, pueden detectarse mediante composiciones y métodos descritos en este documento. Los ejemplos no limitantes de microorganismos detectados pueden incluir diversos E. coli spp. y Shigella spp que expresan eae.
Algunas realizaciones describen composiciones que comprenden secuencias de cebador y/o secuencias de sonda específicas para hibridar con un gen eae, alelo y/o fragmento de los mismos que comprenden secuencias aisladas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de las la SEQ ID NOS: 11-14, complementos de las mismas y secuencias que tienen aproximadamente 90% de identidad con las secuencias anteriores. Las la SEQ ID NOS: 11-14 se pueden usar en métodos de detección descritos en este documento para detectar la presencia de un microbio codificador de eae.
Algunas realizaciones describen cebadores oligonucleótidos para uso en la detección de factores de virulencia, comprendiendo el conjunto de cebadores oligonucleótidos: al menos un conjunto de cebadores, teniendo cada grupo al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, que son operables para hibridar con factores de virulencia tales como una o más variantes de ácidos nucleicos que codifican toxina Shiga, alelos, complementos y fragmentos de los mismos y/o ácidos nucleicos que codifican eae, alelos, complementos y fragmentos de los mismos.
Algunas realizaciones describen un conjunto de cebadores oligonucleótidos para uso simultáneo en un proceso de PCR múltiple para la detección de factores de virulencia, comprendiendo el conjunto de cebadores oligonucleótidos: al menos dos conjuntos de cebadores, teniendo cada conjunto al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso, que son operables para hibridar con factores de virulencia que comprenden todas las variantes de ácidos nucleicos que codifican toxina Shiga, alelos y fragmentos de los mismos. Los conjuntos de cebadores pueden estar dirigidos hacia un gen stx. Un gen stx puede ser un gen stxl, un gen stx2, un alelo de un gen stxl, un alelo de un gen stx2, o un fragmento de los mismos. Los conjuntos de cebadores en algunas realizaciones pueden ser cebadores degenerados.
Algunas realizaciones de la presente memoria descriptiva se refieren a composiciones que comprenden secuencias aisladas de ácido nucleico que son operables para hibridar con regiones de ácido nucleico que se encuentran de manera única en un microorganismo STEC. Las regiones de ácido nucleico encontradas exclusivamente en un microorganismo STEC específico se denominan en el presente documento ácidos nucleicos objetivo específicos de microorganismos o ácidos nucleicos objetivo específicos de microorganismos STEC.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe una secuencia aislada de ácido nucleico que comprende las la SEQ ID NO: 15-la SEQ ID NO: 32, fragmentos de las mismas, complementos de la mismas, secuencias que comprenden al menos un 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, derivados marcados y derivados químicos y/o biológicos de los mismos. Estos ácidos nucleicos aislados son secuencias de cebador y/o sonda que pueden hibridar con ácidos nucleicos objetivo específicos de microorganismos STEC y pueden amplificar y/o
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detectar ácidos nucleicos objetivo específicos de STEC en condiciones de amplificación y/o hibridación apropiadas.
Los fragmentos de secuencias de ácido nucleico descritas en la presente memoria incluyen, sin limitación, ácidos nucleicos que tienen al menos 10, al menos 15, o al menos 20 ácidos nucleicos contiguos de una secuencia de ácido nucleico como se describe en este documento. Las secuencias de ácido nucleico de la divulgación, en algunas realizaciones, son cebadores y/o sondas. En algunas realizaciones, los cebadores de la divulgación pueden ser cebadores degenerados. Los cebadores y las sondas pueden estar marcados. En algunas realizaciones, las composiciones de secuencia aisladas de ácido nucleico de la divulgación pueden comprender uno o más marcadores, tales como, pero no se limitan a, un colorante, un isótopo radiactivo, un marcador quimioluminiscente, una unidad estructural fluorescente, un marcador bioluminiscente, una enzima y combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los cebadores y las sondas pueden ser derivados químicos y/o biológicos de las secuencias descritas en la presente memoria.
La presente solicitud describe composiciones y métodos para detectar uno o más microorganismos en muestras. Uno o más microorganismos que pueden detectarse mediante un método de esta divulgación pueden ser cepas diferentes de E. coli tales como un organismo E. coli O157:H7, un organismo E. coli O26, un organismo E. coli O45, un organismo E. coli O103, un organismo E. coli O111, un organismo E. coli O121 y un organismo E. coli O145 y/o un organismo Shigella spp. Algunos métodos divulgados en la presente memoria son métodos sencillos y algunos métodos divulgados en este documento son métodos múltiples.
Las muestras que pueden analizarse mediante métodos de la divulgación para detectar un contaminante microbiano en las mismas incluyen, pero no se limitan a, una muestra de alimento (muestras de alimentos procesados y muestras de alimentos crudos), una muestra de bebida, una muestra agrícola, una muestra de producto, una muestra animal, una muestra clínica, una muestra ambiental, una muestra biológica, una muestra de agua y una muestra de aire.
Algunas realizaciones describen métodos para detectar un microorganismo E. coli (STEC) que produce toxina Shiga en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácido nucleico con un ácido nucleico objetivo STEC, un fragmento del mismo, un complemento del mismo, un alelo del mismo, o una variante del mismo, con al menos una primera secuencia de polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia de polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener al menos una secuencia amplificada de polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de un microorganismo STEC en la muestra. Ejemplos de organismos STEC detectados son E. coli O26, E. coli O45, E. coli O103, E. coli O111, E. coli O121 y/o E. coli O145.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O121 en una muestra que comprende: hibridar con al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácido nucleico que comprenden los ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia de polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener al menos una secuencia amplificada de polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en la que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O121 en la muestra. Un método para detectar E. coli O121 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en la que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O145 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia de polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener al menos una secuencia amplificada de polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O145 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O145 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en la que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O26 en una muestra y comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácido nucleico que comprende ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o
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un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O26 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O26 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O45 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácido nucleico que comprende ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia de polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O45 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O45 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 26, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O103 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácido nucleico que comprende ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos con al menos un primera secuencia polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia de polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en la que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O103 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O103 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 29, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de un E. coli O111 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácido nucleico que comprende ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia de polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O111 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O111 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 32, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
La memoria descriptiva, en algunas realizaciones, describe un método para la detección de uno o más microorganismos, expresando cada microorganismo uno o más factores de virulencia que comprenden: 1) detectar la presencia de uno o más factores de virulencia que comprenden: a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia con uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con porciones o porciones contiguas a uno o más factores de virulencia; b) amplificar al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo que codifica al menos uno de los factores de virulencia mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado; c) detectar uno o más ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado o fragmentos o complementos de los mismos; y d) identificar opcionalmente los ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado, en el que la detección de uno o más ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado o fragmentos o complementos de los mismos es indicativo de la presencia de un microorganismo en la muestra que expresa uno o más factores de virulencia; y 2) determinar la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia que comprende: a) poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con un objetivo específico de una cepa de uno o más microorganismos; b) amplificar conjuntamente al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo específica de una cepa que codifica para objetivos de ácido nucleico específicos para al menos una cepa del microorganismo mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos específicos de la cepa amplificada; c) detectar uno o más ácidos nucleicos específicos de la cepa amplificada o fragmentos o complementos de la misma; y d) identificar opcionalmente los ácidos nucleicos específicos de la cepa amplificada. En algunas realizaciones del método, cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia se marca con un
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marcador diferente. En algunas realizaciones del método, cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para una o más cepas del microorganismo se marca con un marcador diferente y en el que cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia se marca con un marcador diferente.
En algunas realizaciones, las etapas descritas en el método anterior de 1) detectar la presencia de uno o más factores de virulencia y 2) determinar la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia se pueden realizar simultáneamente, de forma secuencial y/o en cualquier orden.
En algunas realizaciones de un método para la detección de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia, uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia comprenden cada uno: al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con uno o más factores de virulencia. Los factores de virulencia en algunas realizaciones comprenden, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: todas las variantes que codifican ácidos nucleicos que codifican la toxina Shiga (stx), alelos y fragmentos de los mismos; y/o todas las variantes de ácidos nucleicos que codifican al gen eae, alelos y fragmentos de los mismos. El ácido nucleico que codifica stx puede comprender un gen stxl, un gen stx2, un alelo de un gen stxl, un alelo de un gen stx2, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, véase la Tabla 1 que enumera varios subtipos y variantes de stxl y stx2. Los ácidos nucleicos que codifican eae pueden comprender un gen eae, un alelo de un gen eae, o fragmentos de los mismos. Hay más de 25 alelos definidos del gen eae, que codifica la proteína intimina. Véase http:Honlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1574-6968.2006.00328.x/full para obtener más detalles.
Los microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia incluyen, por ejemplo, E. coli que produce toxina Shiga (STEC) y Shigella spp.
En algunas realizaciones de un método descrito anteriormente, uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia comprenden y pueden seleccionarse de: un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; y/o un quinto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11, la SeQ ID NO: 12; y la SEQ ID NO: 13. Un método puede comprender además las etapas de detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos que comprende hibridar uno o más ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado o fragmentos o complementos de los mismos con un sonda seleccionada de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, y/o la SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, no se puede detectar ningún producto amplificado usando los métodos descritos anteriormente para excluir la presencia de un microorganismo que expresa un factor de virulencia en una muestra.
En algunas realizaciones de un método como se describió anteriormente, al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para la cepa de uno o más microorganismos comprende y puede seleccionarse de: un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, un quinto conjunto de cebador que tiene la sEq ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28; un sexto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID No: 30 y la SEQ iD NO: 31; un séptimo conjunto de cebadores que tiene la sEq ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34; y/o un octavo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, las etapas de detectar uno o más ácidos nucleicos específicos de la cepa amplificada o fragmentos o complementos de los mismos comprende hibridar uno o más ácidos nucleicos específicos de las cepas amplificadas o fragmentos o complementos de los mismos con una sonda seleccionada de la SeQ ID NO: 17, la SeQ ID nO: 20, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 38.
En algunas realizaciones, no se puede detectar ningún producto amplificado usando los métodos descritos anteriormente para excluir la presencia de un microorganismo de una cepa particular en una muestra.
En algunas realizaciones, la detección de un ácido nucleico amplificado comprende uno o más métodos tales como, pero sin limitarse a, hibridación, espectrometría de masas, nanocuerdas, microfluidos, quimioluminiscencia, tecnologías enzimáticas y combinaciones de los mismos. Algunas realizaciones también pueden comprender identificar un microbio y pueden comprender métodos tales como la secuenciación de ADN. En algunos métodos de realizaciones descritos en la presente memoria se pueden ácidos nucleicos (ARN/ADN) de una muestra que se sospecha que contiene un microorganismo a detectar antes de la amplificación o detección.
En algunas realizaciones, la divulgación describe métodos para detectar e identificar uno o más microorganismos E. coli productores de toxina Shiga (STEC) en una muestra que comprende las etapas de: a) enriquecer opcionalmente los microorganismos STEC; b) extraer ácidos nucleicos de (microorganismos STEC y otros presentes en) la muestra; c) realizar una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) en los ácidos nucleicos de la muestra extraída para amplificar y detectar la presencia de al menos un ácido nucleico seleccionado de: ácidos nucleicos que codifican para un gen de toxina Shiga, incluidos ácidos nucleicos que codifican stxl y stx2; ácidos nucleicos que codifican un gen eae; y ácidos nucleicos específicos para una cepa de E. coli O157:H7, en el que la detección de al menos un ácido nucleico
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anterior indica la presencia de un microorganismo STEC o la presencia de un microorganismo E. coli 0157:H7 o ambos; y d) si se detecta un ácido nucleico en la etapa c) realizar una segunda ronda de PCR múltiple con cebadores específicos para amplificar y detectar la presencia de uno o más ácidos nucleicos que codifican regiones objetivo asociadas con uno o más microorganismos STEC que incluyen una E. coli O157:H7, una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145, detectando o identificando por lo tanto la cepa del microorganismo STEC.
En otras realizaciones, no se puede detectar ningún producto amplificado usando los métodos descritos anteriormente para excluir la presencia de un microorganismo STEC en una muestra.
Se pueden detectar ácidos nucleicos objetivo amplificados de objetivos que incluyen ácido nucleico objetivo amplificado de stxl, stx2, eae, una E. coli O157:H7, una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y/o una E. coli O145 usando una pluralidad de marcadores en cada conjunto diferente de cebadores y/o sondas. Por ejemplo, en la etapa c) anterior, se pueden usar cebadores y/o sondas con un marcador diferente para cada uno de: stxl, sxt2, eae y E. coli O157:H7 y en la etapa d) se pueden usar cebadores y/o sondas con un marcador diferente para cada uno de los diferentes microorganismos.
En algunas realizaciones, los métodos de la divulgación pueden realizarse en un sistema automatizado. La automatización disminuye el tiempo y la eficiencia y permite procesar múltiples muestras. Los sistemas automatizados pueden comprender plataformas magnéticas tales como, pero sin limitarse a, el procesador de partículas magnéticas MagMAXMR Express-96 de Life Technologies Corporation y el sistema Pathatrix (
http://www.matrixmsci.com/ pathatrix.htm).
La detección en los métodos anteriores puede realizarse por una variedad de métodos, tales como, pero sin limitarse a, mediante una reacción de amplificación de ácido nucleico, la reacción de amplificación es una determinación de punto final, la reacción de amplificación es cuantitativa, la cuantificación es una PCR en tiempo real, la PCR en tiempo real es un ensayo SYBR® Green o la PCR en tiempo real es un ensayo TaqMan®. La detección puede en algunos casos realizarse mediante hibridación usando sondas específicas para secuencias de ácido nucleico amplificadas que codifican una secuencia objetivo. Las combinaciones de amplificación e hibridación pueden usarse para la detección de acuerdo con algunas realizaciones.
En algunas realizaciones, la hibridación puede comprender al menos una primera sonda y una segunda sonda, comprendiendo además la primera sonda un primer marcador y dicha segunda sonda que comprende además un segundo marcador, en el que ambos marcadores se seleccionan de un colorante, un isótopo radiactivo, un marcador quimioluminiscente, y una enzima, el colorante comprende un colorante de fluoresceína, un colorante de rodamina o un colorante de cianina, el colorante es un colorante de fluoresceína y la primera sonda está marcada con colorante FAMRM y dicha segunda sonda está marcada con colorante VIC® .
Algunas realizaciones describen kits adecuados para identificar la presencia de un organismo productor de toxina Shiga. Tal kit puede comprender al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos para usar en un proceso de amplificación (tal como PCR y en algunas realizaciones una PCR múltiple) para la detección de factores de virulencia stx, el conjunto de cebadores que comprende cebadores operables para hibridar con factores de virulencia que comprenden todas las variantes, genes, alelos y/o fragmentos y complementos de toxina Shiga. Un kit puede comprender adicionalmente secuencias de sonda para detectar ácidos nucleicos amplificados objetivo stx. En un ejemplo de realización, un kit para detectar microorganismos que expresan stx comprende cebadores y sondas que tienen las la SEQ ID NOS: 1-10.
Algunas realizaciones describen kits adecuados para identificar la presencia de un organismo que codifica eae. Tal kit puede comprender al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos para uso en un procedimiento de PCR para la detección de un factor de virulencia eae, el conjunto de cebadores que comprende cebadores operables para hibridar con genes que codifican eae, alelos, regiones complementarias de los mismo y fragmentos de los mismos que comprenden todas las variantes de eae. Un kit puede comprender adicionalmente secuencias de sonda para detectar ácidos nucleicos amplificados objetivo de eae. En un ejemplo de realización, un kit para detectar microorganismos que se expresan eae comprende cebadores y sondas que tienen las la SEQ ID NOS: 11-14.
Algunos kits de la divulgación pueden detectar factores de virulencia que incluyen stx y eae y comprenden conjuntos de cebadores seleccionados de: un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ iD NO: 7; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; un quinto conjunto de cebadores que tiene como cebador directo la SEQ ID NO: 11 y como cebadores inversos la SEQ iD NO: 12 o la SEQ ID NO: 13; y además opcionalmente adicionalmente al menos una sonda más seleccionada entre las sondas que tienen la SEQ ID NO: 3, la sEq ID NO: 10, y la SEQ ID NO: 14, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la misma, o un derivado marcado de las mismas.
En algunas realizaciones, se describen kits para detección de organismos STEC que incluyen una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145. En una realización de ejemplo, kits
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para la detección de microorganismos E. coli que producen toxina Shiga (STEC) comprenden: uno o más pares de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) directa e inversa seleccionados de un primer conjunto cebador que tiene la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, un quinto conjunto de cebador que tiene la SEQ ID No: 27 y la SEQ ID NO: 28; un sexto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de las mismas, o un derivado marcado de las mismas; opcionalmente al menos una sonda seleccionada de la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 23, la SEQ iD NO: 26, la SEQ ID NO: 29 y la SEQ ID NO: 32 o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de las mismas, o un derivado marcado de las mismas; y uno o más componentes seleccionados de un grupo que consiste en: al menos una enzima; dNTP, al menos un regulador, al menos una sal, al menos una muestra de ácido nucleico de control y un protocolo de instrucciones. El kit descrito anteriormente se puede usar para detectar uno o más organismos STEC, que incluyen una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli 0111, una E. coli O121 y una E. coli O145.
En algunas realizaciones, el kit descrito anteriormente también puede comprender cebadores y sondas para detectar un factor de virulencia. Por consiguiente, un kit de la divulgación también puede comprender uno o más pares de cebadores de PCR directos e inversos seleccionados adicionalmente de un séptimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 13; un octavo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un noveno conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un décimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ iD NO: 7; un undécimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; y además opcionalmente adicionalmente al menos una sonda más, seleccionada de sondas que tienen la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, o un derivado marcado de las mismas.
En algunas realizaciones, los kits de la divulgación pueden comprender además cebadores para hibridar con, amplificar y, por lo tanto, detectar una E. coli 0157:H7. Tal kit puede comprender adicionalmente uno o más pares de cebadores de PCR directos e inversos seleccionados adicionalmente de un duodécimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34; un decimotercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 37; y opcionalmente adicionalmente al menos otra sonda más, seleccionada entre las sondas que tienen la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 38, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, o derivados marcados de las mismas.
Se pueden marcar diferentes cebadores y sondas con diferentes marcadores para permitir la detección de diferentes productos amplificados y/o productos hibridados.
En la siguiente descripción detallada, serán evidentes ciertos aspectos y realizaciones. Debe entenderse que una realización dada no necesita tener todos los aspectos y características descritos en este documento. Debe entenderse que estos aspectos y realizaciones son meramente ilustrativos y explicativos y no son restrictivos de la invención. Debe entenderse que tanto la descripción general anterior como la siguiente descripción detallada son solo ilustrativas y explicativas y no son restrictivas de la invención, como se reivindica.
Las Figuras adjuntas, que se incorporan y constituyen una parte de esta memoria descriptiva, ilustran varios ejemplos realizaciones de la divulgación y junto con la descripción, sirven para explicar ciertas enseñanzas. Estas y otras características de las presentes enseñanzas se exponen en la presente memoria.
Descripción de los dibujos
El experto en la materia entenderá que los dibujos que se describen a continuación son únicamente ilustrativos. Los dibujos no pretenden limitar el alcance de las presentes enseñanzas de ninguna manera.
La Fig. 1 ilustra los resultados de un ensayo múltiple usando E. coli 0157:H7, de acuerdo con una realización de la divulgación;
La Fig. 2 ilustra los resultados de un ensayo múltiple usando E. coli 0104:H4, de acuerdo con una realización de la divulgación;
La Fig. 3 ilustra la detección de stxl de un panel de 161 cepas de bacterias (146 cepas de E. coli y 15 cepas que no son de E. coli), de acuerdo con una realización de la divulgación;
La Fig. 4 ilustra la detección de stx2 de un panel de 161 cepas de bacterias (146 cepas de E. coli y 15 cepas que no son de E. coli), de acuerdo con una realización de la divulgación;
Las Figuras 5A y 5B ilustran las pruebas de inclusión y exclusión, de eae de acuerdo con una realización de la divulgación;
Las Figuras 6A y 6B ilustran los resultados de un ensayo múltiple frente a un ensayo sencillo, de acuerdo con una realización; y
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Las Figuras 7A y 7B muestran los resultados de los ensayos de confirmación de STEC de acuerdo con una realización. Descripción detallada
Para los fines de la interpretación de esta memoria descriptiva, pueden aplicarse las siguientes definiciones y, cuando sea apropiado, los términos utilizados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que cualquier definición establecida a continuación entre en conflicto con el uso de esa palabra en cualquier otro documento, la definición establecida a continuación siempre primará a los efectos de la interpretación de esta memoria descriptiva y sus reivindicaciones asociadas, a menos que un significado contrario sea claramente evidente (por ejemplo, en el documento donde el término se usa originalmente). Se observa que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que se limiten expresamente e inequívocamente a un referente. El uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. El uso de "comprende", "que comprende", "incluye" y "que incluye" son intercambiables y no pretenden ser limitantes. Además, cuando la descripción de una o más realizaciones usa el término "que comprende", los expertos en la técnica entenderán que, en algunos casos específicos, la realización o realizaciones se pueden describir alternativamente usando la expresión "que consiste esencialmente en" y/o "que consiste en".
Como se usa en el presente documento, la frase "ácido nucleico", "secuencia de ácido nucleico", "oligonucleótido" y "polinucleótidos" son intercambiables y no se pretende que sean limitantes.
Como se usa en el presente documento, la frase "condiciones de hibridación rigurosas" se refiere a condiciones de hibridación que pueden tener lugar bajo varias condiciones de pH, sal y temperatura. El pH puede variar de 6 a 9, preferiblemente de 6,8 a 8,5. La concentración de sal puede variar desde 0,15 M de sodio hasta 0,9 M de sodio, y se pueden usar otros cationes siempre que la fuerza iónica sea equivalente a la especificada para el sodio. La temperatura de la reacción de hibridación puede variar de 30°C a 80°C, preferiblemente de 45°C a 70°C. Adicionalmente, se pueden añadir otros compuestos a una reacción de hibridación para promover la hibridación específica a temperaturas más bajas, tales como a temperatura ambiente o próxima a la misma. Entre los compuestos contemplados para reducir los requisitos de temperatura se encuentra la formamida. De este modo, un polinucleótido es típicamente "sustancialmente complementario" a un segundo polinucleótido si se produce hibridación entre el polinucleótido y el segundo polinucleótido. Como se usa en el presente documento, "hibridación específica" se refiere a la hibridación entre dos polinucleótidos en condiciones de hibridación rigurosa.
Como se usa en este documento, el término "polinucleótido" se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea ribonucleótidos, desoxinucleótidos o ácidos nucleicos peptídicos (PNA), e incluye tanto ARN de cadena doble como de cadena sencilla, ADN y PNA. Un polinucleótido puede incluir secuencias de nucleótidos que tienen diferentes funciones, que incluyen, por ejemplo, regiones codificantes y regiones no codificantes tales como regiones reguladoras. Se puede obtener un polinucleótido directamente de una fuente natural, o se puede preparar con la ayuda de técnicas recombinantes, enzimáticas o químicas. Un polinucleótido puede ser lineal o circular en topología. Un polinucleótido puede ser, por ejemplo, una porción de un vector, tal como un vector de expresión o clonación, o un fragmento. Un "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido de la presente invención, típicamente un cebador y/o una sonda.
Como se usa en la presente memoria, un "polinucleótido específico del objetivo" se refiere a un polinucleótido que tiene un segmento de unión al objetivo que es perfecta o sustancialmente complementario a una secuencia objetivo, de manera que el polinucleótido se une específicamente a un objetivo pretendido sin unión significativa a secuencias no objetivo en condiciones de hibridación suficientemente rigurosas. El polinucleótido específico del objetivo puede ser, por ejemplo, un cebador o sonda y el sujeto de hibridación con su secuencia objetivo complementaria.
El término "secuencia objetivo", "secuencia de firma objetivo", "ácido nucleico objetivo", "objetivo" o "secuencia de polinucleótido objetivo" se refiere a un ácido nucleico de interés. Ejemplos de objetivos de interés en algunas realizaciones de esta solicitud incluyen ácidos nucleicos que codifican stx y fragmentos, complementos y secuencias con un 90% de homología con los mismos; ácidos nucleicos que codifican eae; ácidos nucleicos específicamente encontrados en organismos STEC tales como una E. coli O157:H7, una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145; y/o secuencias de ácido nucleico específicas de Shigella spp. La secuencia objetivo puede ser una secuencia de polinucleótidos que es el sujeto de la hibridación con un polinucleótido complementario, por ejemplo, un cebador o sonda. La secuencia objetivo puede estar compuesta de ADN, ARN, un análogo de las mismas, e incluye combinaciones de las mismas. La secuencia objetivo puede ser conocida o desconocida, en términos de su secuencia real y su amplificación puede ser deseada. La secuencia objetivo puede ser o no de importancia biológica. Típicamente, aunque no siempre, es el significado de la secuencia objetivo que se estudia en un experimento particular. Como ejemplos no limitantes, las secuencias objetivo pueden incluir regiones de ADN genómico, regiones de ADN genómico que se cree que contienen uno o más sitios polimórficos, ADN que codifica o se cree que codifica genes o porciones de genes de función conocida o desconocida, ADN que codifica o se cree que codifica proteínas o porciones de proteínas de función conocida o desconocida, ADN que codifica o se cree que codifica regiones reguladoras tales como secuencias promotoras, señales de empalme, señales de poliadenilación, etc.
Como se usa en este documento, un "producto de secuencia amplificada del polinucleótido objetivo" se refiere al
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amplicón resultante de una reacción de amplificación tal como una reacción en cadena de la polimerasa. El producto de amplicón resultante surge de la hibridación de cebadores complementarios con una secuencia del polinucleótido objetivo en condiciones de hibridación adecuadas y la repetición de manera cíclica de la reacción en cadena de la polimerasa catalizada por ADN polimerasa para amplificación de ADN o ARN polimerasa para amplificación de ARN.
Como se usa en este documento, la "reacción en cadena de polimerasa" o PCR es una amplificación de ácido nucleico que consiste en una etapa inicial de desnaturalización que separa las cadenas de una muestra de ácido nucleico de doble cadena, seguido de la repetición de (i) una etapa de hibridación, que permite que los cebadores de amplificación se hibriden específicamente con las posiciones que flanquean una secuencia objetivo; (ii) una etapa de extensión que extiende los cebadores en una dirección 5' a 3' formando así un polinucleótido de amplicón complementario a la secuencia objetivo, y (iii) una etapa de desnaturalización que provoca la separación del amplicón de la secuencia objetivo (Mullis et al., editores, The Polymerase Chain Reaction, BirkHauser, Boston, Mass. (1994)). Cada uno de las etapas anteriores puede realizarse a una temperatura diferente, preferiblemente utilizando un termociclador automático (Applied Biosystems LLC, una división de Life Technologies Corporation, Foster City, CA). Si se desea, las muestras de aRN se pueden convertir a heterodúplex de ADN/ARN o en dúplex de ADNc mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica.
Como se usa en el presente documento, "amplificar" y "amplificación" se refieren a una amplia gama de técnicas para incrementar las secuencias de polinucleótidos, ya sea lineal o exponencialmente. Los ejemplos de técnicas de amplificación incluyen, pero no se limitan a, PCR o cualquier otro método que emplee una etapa de extensión de cebadores. Otros ejemplos no limitantes de amplificación incluyen, pero no se limitan a, reacción de detección de ligasa (LDR) y reacción en cadena de ligasa (LCR). Los métodos de amplificación pueden comprender ciclos térmicos o pueden realizarse isotérmicamente. En diversas realizaciones, el término "producto de amplificación" o "producto amplificado" incluye productos de cualquier número de ciclos de reacciones de amplificación.
En ciertas realizaciones, los métodos de amplificación comprenden al menos un ciclo de amplificación, por ejemplo, pero sin limitarse a, los procedimientos secuenciales de: hibridación de cebadores con porciones específicas de cebadores de la secuencia objetivo o productos de amplificación de cualquier número de ciclos de un reacción de amplificación; sintetizar una cadena de nucleótidos de una manera dependiente de la plantilla usando una polimerasa; y desnaturalizar el dúplex de ácido nucleico recién formado para separar las cadenas. El ciclo puede o no repetirse.
Las descripciones de ciertas técnicas de amplificación pueden encontrarse, entre otros lugares, en H. Ehrlich et al., Science, 252: 1643-50 (1991), M. Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Nueva York, NY (1990), R. Favis et al., Nature Biotechnology 18: 561-64 (2000), y HF Rabenau et al., Infection 28: 97102 (2000); Sambrook y Russell, Molecular Cloning, tercera edición, Cold Spring Harbor Press (2000) (en lo sucesivo, "Sambrook y Russell"), Ausubel et al., Current Protocols en Molecular Biology (1993) incluyendo suplementos hasta septiembre de 2005, John Wiley & Sons ( en lo sucesivo, "Ausubel et. al.").
El término "marca" se refiere a cualquier unidad estructural que se puede unir a una molécula y: (i) proporciona una señal detectable; (ii) interactúa con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por el segundo marcador, por ejemplo, FRET; (iii) estabiliza la hibridación, es decir, formación del dúplex; o (iv) proporciona una unidad estructural de captura, es decir, afinidad, anticuerpo/antígeno, complejación iónica. La marcación se puede lograr usando cualquiera de una gran cantidad de técnicas conocidas que emplean marcadores conocidos, enlaces, grupos de enlace, reactivos, condiciones de reacción y métodos de análisis y purificación. Los marcadores incluyen compuestos emisores de luz que generan una señal detectable por fluorescencia, quimioluminiscencia o bioluminiscencia (Kricka, L. en Nonisotopic ADN Probe Techniques (1992), Academic Press, San Diego, páginas. 3-28). Otra clase de marcadores son unidades estructurales estabilizadores de la hibridación que sirven para potenciar, estabilizar o influir en la hibridación de dúplex, por ejemplo, intercaladores, ligantes de surco menor y grupos funcionales de entrecruzamiento (Blackburn, G. y Gait, M. Eds. "DNA and RNA Structure" en Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2da Edición, (1996) Oxford University Press, páginas 15-81). Aún otra clase de marcadores efectúa la separación o inmovilización de una molécula mediante captura específica o no específica, por ejemplo, biotina, digoxigenina y otros haptenos (Andrus, A. "Chemical methods for 5' non-isotopic labelling of PCR probes and primers" (1995) en PCR 2: A Practical Approach, Oxford University Press, Oxford, páginas 39-54).
Los términos "hibridación" y "apareamiento" se usan indistintamente y significan la interacción de emparejamiento de bases de un ácido nucleico con otro ácido nucleico que da como resultado la formación de un dúplex u otra estructura de orden superior. La interacción primaria es específica de una base, es decir, A/T y G/C, mediante enlaces de hidrógeno de tipo Watson/Crick y Hoogsteen.
El término "análisis de punto final" se refiere a un método en el que la recopilación de datos se produce solo cuando una reacción se completa sustancialmente.
El término "análisis en tiempo real" se refiere a la monitorización periódica durante la PCR. Ciertos sistemas como el Sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems 7500 (Applied Biosystems, Foster City, California) conducen el monitoreo durante cada ciclo térmico en un punto predeterminado o definido por el usuario. El análisis en tiempo real de PCR con sondas FRET mide los cambios de la señal de colorante fluorescente de ciclo a ciclo, preferiblemente menos
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cualquier señal de control interno.
El término "atenuación" se refiere a una disminución en la fluorescencia de una primera unidad estructural (colorante informador) causada por una segunda unidad estructural (atenuador) independientemente del mecanismo.
Un "cebador", como se usa en el presente documento, es un oligonucleótido que es complementario a una porción del polinucleótido objetivo y, después de la hibridación con el polinucleótido objetivo, puede servir como punto de partida para una reacción de amplificación y la síntesis de un producto de amplificación. Los cebadores incluyen, pero no se limitan a, cebadores que se extienden. Un "par de cebadores" se refiere a dos cebadores que pueden usarse juntos para una reacción de amplificación. Un "cebador de PCR" se refiere a un cebador en un conjunto de al menos dos cebadores que son capaces de amplificar exponencialmente una secuencia de ácido nucleico objetivo en la reacción en cadena de la polimerasa.
El término "sonda" comprende un polinucleótido que comprende una porción específica diseñada para hibridar de una manera específica de la secuencia con una región complementaria de una secuencia de ácido nucleico específica, por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico objetivo. En ciertas realizaciones, la porción específica de la sonda puede ser específica para una secuencia particular, o alternativamente, puede ser degenerada, por ejemplo, específica para un conjunto de secuencias. En ciertas realizaciones, la sonda está marcada. La sonda puede ser un oligonucleótido que es complementario a al menos una porción de un producto de amplificación formado usando dos cebadores.
Los términos "complemento" y "complementario" tal como se usan en la presente memoria, se refieren a la capacidad de dos polinucleótidos de cadena sencilla (por ejemplo, un cebador y un polinucleótido objetivo) para formar pares de bases entre sí, donde una adenina en una cadena de un polinucleótido emparejará las bases con una timina o un uracilo en una cadena de un segundo polinucleótido y una citosina en una cadena de un polinucleótido emparejará las bases con una guanina en una cadena de un segundo polinucleótido. Dos polinucleótidos son complementarios entre sí cuando una secuencia de nucleótidos en un polinucleótido puede formar pares de bases con una secuencia de nucleótidos en un segundo polinucleótido. Por ejemplo, 5'-ATGC y 5'-GCAT son complementarios.
Un "marcador" se refiere a una unidad estructural unida (covalente o no covalentemente), o capaz de unirse, a un oligonucleótido, que proporciona o es capaz de proporcionar información sobre el oligonucleótido (por ejemplo, información descriptiva o de identificación sobre el oligonucleótido) u otro polinucleótido con el que interactúa el oligonucleótido marcado (por ejemplo, se hibrida). Los marcadores se pueden usar para proporcionar una señal detectable (y opcionalmente cuantificable). Los marcadores también se pueden usar para unir un oligonucleótido a una superficie.
Un "fluoróforo" es una unidad estructural que puede emitir luz de una longitud de onda particular después de la absorbancia de luz de longitud de onda más corta. La longitud de onda de la luz emitida por un fluoróforo particular es característica de ese fluoróforo. De este modo, se puede detectar un fluoróforo particular detectando luz de una longitud de onda apropiada después de la excitación del fluoróforo con luz de longitud de onda más corta.
El término "atenuador" tal como se usa en el presente documento se refiere a una unidad estructural que absorbe la energía emitida por un fluoróforo, o interfiere de otro modo con la capacidad del colorante fluorescente para emitir luz. Un atenuador puede volver a emitir la energía absorbida desde un fluoróforo en una señal característica para ese atenuador, y así un atenuador también puede actuar como fluoróforo (un atenuador de fluorescencia). Este fenómeno se conoce generalmente como transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET). Alternativamente, un atenuador puede disipar la energía absorbida de un fluoróforo como calor (un atenuador no fluorescente).
Como se usa en este documento, el término "muestra" se refiere a un material de partida que se sospecha que alberga un microorganismo o grupo de microorganismos particulares. Una "muestra contaminada" se refiere a una muestra que alberga un microbio patógeno que comprende por lo tanto material de ácido nucleico del microbio patógeno. Ejemplos de muestras incluyen, pero no se limitan a, muestras de alimentos (incluyendo, pero sin limitarse a, muestras de alimentos destinados al consumo humano o animal, tales como producción de alimentos procesados, materiales de alimentos crudos, (por ejemplo, frutas y verduras), legumbres, carnes (de animales de ganado y/o animales de caza), pescado, mariscos, nueces, bebidas, caldos de fermentación y/o una matriz de alimentos enriquecida selectivamente que comprenda cualquiera de los alimentos enumerados anteriormente), muestras de agua, muestras ambientales (por ejemplo, muestras de suelo, muestras de suciedad, muestras de basura, muestras de aguas residuales, muestras de efluentes industriales, muestras de aire o muestras de agua de una variedad de cuerpos de agua tales como lagos, ríos, estanques etc.), muestras de aire (del medio ambiente o de una habitación o una construcción), muestras forenses, muestras agrícolas, muestras farmacéuticas, muestras biofarmacéuticas, muestras de superficies de procesamiento y fabricación de alimentos, y/o muestras biológicas.
Se divulgan composiciones, ensayos, métodos y kits para la detección específica de microorganismos que expresan factores de virulencia, así como organismos STEC a partir de muestras que incluyen muestras clínicas, muestras de alimentos, matrices complejas de alimentos, agua, una muestra de bebida, un caldo de fermentación, un muestra forense, una muestra ambiental (por ejemplo, tierra, suelo, basura, aguas residuales, aire o agua), incluidas las superficies de procesamiento y fabricación de alimentos, o una muestra biológica.
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Una muestra puede analizarse directamente, o puede prepararse o procesarse de alguna manera antes de la prueba. Por ejemplo, una muestra puede procesarse para enriquecer cualquier microbio contaminante y puede procesarse adicionalmente para separar y/o lisar las células microbianas contenidas en la misma. Las células microbianas lisadas de una muestra pueden procesarse adicionalmente o prepararse para separar, aislar y/o extraer material genético del microbio para análisis para detectar y/o identificar el microbio contaminante. En algunas realizaciones descritas en este documento, la muestra puede someterse a separación para separar inicialmente microbios de interés de otros microbios y otros componentes de la muestra. Por ejemplo, para muestras complejas de alimentos con componentes complejos, se pueden usar métodos de separación para separar microorganismos de los alimentos. Los microbios separados de las muestras también se pueden enriquecer antes del análisis. El análisis de una muestra puede incluir uno o más métodos moleculares. Por ejemplo, de acuerdo con algunos ejemplos de realizaciones de la presente divulgación, una muestra puede someterse a amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, mediante PCR) usando cebadores oligonucleótidos apropiados que son específicos para una o más secuencias de ácido nucleico microbiano con los cuales se sospecha está contaminada la muestra. Los productos de amplificación pueden someterse luego a pruebas con sondas específicas (o sondas informadoras) para permitir la detección de secuencias de ácidos nucleicos microbianos que se han amplificado a partir de la muestra. En algunas realizaciones, si se amplifica una secuencia de ácido nucleico microbiana a partir de una muestra, se puede realizar un análisis adicional sobre el producto de amplificación para identificar, cuantificar y analizar adicionalmente el microbio detectado (determinar parámetros tales como, pero sin limitarse a, cepa microbiana, patogenicidad, cantidad etc.).
Como se usa en la presente memoria, "preparar" o "preparar una muestra" o "procesar" o "procesar una muestra" se refiere a uno o más de las siguientes etapas para lograr la separación de microbios de los componentes de la muestra y en algunas realizaciones opcionalmente extracción y/o separación de un ácido nucleico de una muestra: (1) separación opcional de células bacterianas de componentes de la muestra (tal como una muestra de alimento), (2) enriquecimiento bacteriano opcional, (3) lisis celular opcional, y/o (4) opcionalmente extracción y/o purificación del ácido nucleico (por ejemplo, extracción de ADN, extracción total de ácidos nucleicos (es decir, ADN y ARN), extracción de ADN genómico, extracción de ARN). Los tipos de ácido nucleico extraídos incluyen, pero no se limitan a, ADN, ARN, ARNm y miARN.
Como se usa en este documento, "presencia" se refiere a la existencia (y por lo tanto a la detección) de una reacción, un producto de un método o un proceso (que incluye, pero no se limita a, un producto de amplificación resultante de una reacción de amplificación). O a la "presencia" y "detección" de un organismo tal como un organismo patógeno o una cepa o especie particular de un organismo.
Como se usa en el presente documento, "detección" o "detectar" se refiere a la divulgación o revelación de la presencia o ausencia en una muestra de una secuencia de polinucleótido objetivo o producto de la secuencia amplificada del polinucleótido objetivo. La detección puede ser por punto final, enzimática en tiempo real, y resolviendo el producto de amplificación en un gel y determinando si está presente el producto de amplificación esperado, u otros métodos conocidos por un experto en la técnica.
La presencia o ausencia de un producto amplificado se puede determinar o se puede medir su cantidad. La detección de un producto amplificado se puede llevar a cabo mediante métodos estándar bien conocidos en la técnica y usados rutinariamente. La detección puede ocurrir, por ejemplo, después de que se hayan ejecutado múltiples ciclos de amplificación (típicamente denominado como un análisis de punto final), o durante cada ciclo de amplificación (típicamente denominado como en tiempo real). La detección de un producto de amplificación después de que se hayan realizado múltiples ciclos de amplificación se logra fácilmente, por ejemplo, resolviendo el producto de amplificación en un gel y determinando si está presente el producto de amplificación esperado. Para facilitar la detección o cuantificación en tiempo real de los productos de amplificación, se pueden marcar uno o más de los cebadores y/o sondas utilizados en la reacción de amplificación, y hay varios formatos disponibles para generar una señal detectable que indique que está presente un producto de amplificación. Por ejemplo, un marcador conveniente es típicamente un marcador que es fluorescente, que se puede usar en diversos formatos que incluyen, pero no se limitan a, el uso de marcadores fluoróforos donantes, marcadores fluoróforos aceptores, fluoróforos, atenuadores y combinaciones de los mismos. Los ensayos que utilizan estos diversos formatos pueden incluir el uso de uno o más cebadores que están marcados (por ejemplo, cebadores de escorpiones, cebadores Ampliflúor), una o más sondas que están marcadas (por ejemplo, sondas adyacentes, sondas TaqMan®, sondas de encendido, balizas moleculares), o una combinación de las mismas. El experto en la materia a la vista de las presentes enseñanzas comprenderá que, además de estos formatos conocidos, se divulgan de forma rutinaria nuevos tipos de formatos. La presente invención no está limitada por el tipo de método o los tipos de sondas y/o cebadores usados para detectar un producto amplificado. Usando marcadores apropiados (por ejemplo, fluoróforos diferentes) es posible combinar (multiplexar) los resultados de varios pares de cebadores diferentes (y, opcionalmente, sondas si están presentes) en una sola reacción. Como alternativa a la detección usando un cebador y/o sonda marcados, se puede detectar un producto de amplificación usando un colorante de unión a polinucleótido tal como un colorante fluorescente de unión a ADN. Los ejemplos incluyen, por ejemplo, colorante SYBR® Green o colorante SYBR® Gold (Molecular Probes). Tras la interacción con el producto de amplificación de doble cadena, dichos colorantes de unión a polinucleótidos emiten una señal de fluorescencia después de la excitación con luz a una longitud de onda adecuada. También se puede usar un colorante de unión a polinucleótido tal como un colorante de intercalación de polinucleótido.
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Como se usa en este documento, un "polinucleótido específico objetivo" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que es capaz de hibridarse específicamente con un gen y/o un alelo y/o una porción del mismo y/o un complemento del mismo que codifica un objetivo ( toxina Shiga, eae, o un objetivo específico para un patógeno Big 6 o para E. coli O157: H7), bajo condiciones de hibridación adecuadas y que no hibridan con otras secuencias de ácido nucleico que no codifican para el objetivo o porciones del mismo o complementos del mismo. En algunas realizaciones, un "polinucleótido específico del objetivo" de la divulgación puede ser una secuencia de sonda o cebador descrita en las SEQ ID NOS: 1-38. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica, usando las presentes enseñanzas, determinar condiciones de hibridación adecuadas con base en la longitud de la sonda, el contenido de G+C, y el grado de rigurosidad requerido para una aplicación particular.
Se espera que variaciones de secuencia menores en secuencias de nucleótidos objetivo específicas del factor de virulencia y secuencias de nucleótidos objetivo específicas de microorganismos asociadas con adiciones, eliminaciones y mutaciones de nucleótidos, ya sean naturales o introducidas in vitro, no interfieran con la utilidad de las diversas secuencias de ácido nucleico del cebador y la sonda divulgadas en la presente memoria, como entendería un experto en la técnica. Por lo tanto, el alcance de la presente invención según se reivindica pretende abarcar variaciones menores en las secuencias de las descritas en el presente documento y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con las secuencias de cebador y sonda divulgadas en la presente memoria.
Una sonda puede ser ARN o ADN. Dependiendo de los medios de detección empleados, la sonda puede estar sin marcar, radiomarcada, marcada en forma quimioluminiscente, marcada con enzima o marcada con un colorante. La sonda puede hibridarse con una muestra en solución o inmovilizarse sobre un soporte sólido tal como nitrocelulosa, un microarreglo o una membrana de nailon, o la sonda puede inmovilizarse en un soporte sólido, tal como un chip de silicio o un microarreglo.
Las condiciones que "permiten" que ocurra un evento o condiciones que son "adecuadas" para que ocurra un evento, tales como hibridación, extensión de cadena y similares, o condiciones "adecuadas" son condiciones que no evitan que tales eventos ocurran. Por lo tanto, estas condiciones permiten, mejoran, facilitan y/o son propicias para el evento. Tales condiciones, conocidas en la técnica y descritas en este documento, pueden depender de, por ejemplo, la naturaleza de la secuencia de nucleótidos, la temperatura y las condiciones del regulador. Estas condiciones también pueden depender de qué evento se desee, tal como hibridación, escisión o extensión de la cadena. Un polinucleótido "aislado" se refiere a un polinucleótido que se ha removido de su entorno natural. Un polinucleótido "purificado" es uno que esta al menos aproximadamente 60% libre, preferiblemente al menos aproximadamente 75% libre, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90% libre de otros componentes con los que está asociado de forma natural.
Las palabras "preferido" y "preferiblemente" se refieren a realizaciones de la invención que pueden proporcionar ciertos beneficios, en ciertas circunstancias. Sin embargo, también se pueden preferir otras formas de realización, bajo las mismas u otras circunstancias. Además, la mención de una o más realizaciones preferidas no implica que otras realizaciones no sean útiles, y no pretende excluir otras realizaciones del alcance de la invención.
Los términos "comprende" y variaciones de los mismos no tienen un significado limitante cuando estos términos aparecen en la descripción y las reivindicaciones. A menos que se especifique lo contrario, "un", "uno, una", "el, la" y "al menos uno" se usan indistintamente y significan uno o más de uno.
También en este documento, las menciones de rangos numéricos por puntos extremos incluyen todos los números que están dentro de ese intervalo (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1; 1,5; 2; 2,75; 3; 3,80; 4; 5, etc.). El término "y/o" significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados.
Hay muchos métodos conocidos para amplificar secuencias de ácido nucleico que incluyen, por ejemplo, PCR. Véase, por ejemplo, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res. 19, 4967 (1991); Eckert et al., PCR Methods and Applications 1, 17 (1991); PCR (eds. McPherson et al., IRL Press, Oxford); y las patentes de Estados Unidos Nos. 4.683.202, 4.683.195, 4.800.159, 4.965.188 y 5.333.675.
Las técnicas de amplificación de ácido nucleico se clasifican tradicionalmente de acuerdo con los requisitos de temperatura del proceso de amplificación. Las amplificaciones isotérmicas se realizan a temperatura constante, en contraste con las amplificaciones que requieren ciclos entre altas y bajas temperaturas. Ejemplos de técnicas de amplificación isotérmica son: amplificación por desplazamiento de cadena (SDA; Walker et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392 396; Walker et al., 1992, Nuc. Acids. Res. 20: 1691-1696; y el documento EP 0 497 272, replicación de secuencia autosostenida (3SR; Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. Usa 87: 1874-1878), el sistema Qp replicasa (Lizardi et al., 1988, BioTechnology 6: 1197-1202) y las técnicas divulgadas en los documentos WO 90/10064 y WO 91/03573.
Ejemplos de técnicas que requieren ciclos de temperatura son: reacción en cadena de la polimerasa (PCR, Saiki et al., 1985, Science 230: 1350-1354), reacción en cadena de la ligasa (LCR; Wu et al., 1989, Genomics 4: 560-569 Barringer et al., 1990, Gene 89: 117-122, Barany, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189-193), amplificación basada en la
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transcripción (Kwoh et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173-1177) y amplificación de restricción (Patente de los Estados Unidos No. 5.102.784).
Otros ejemplos de técnicas incluyen amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico ("NASBA"; véase la patente de Estados Unidos No. 5.130.238), el sistema Qp replicasa (véase Lizardi et al., BioTechnology 6: 1197 (1988)), y amplificación por circulo rodante (véase Lizardi et al., Nat Genet 19: 225-232 (1998)). Los cebadores de amplificación de la presente invención se pueden usar para llevar a cabo, por ejemplo, pero sin limitarse a, PCR, SDA o tSDA. Cualquiera de las técnicas y métodos de amplificación divulgados en la presente memoria se pueden usar para practicar la invención reivindicada como entenderán los expertos en la técnica.
La PCR es una técnica extremadamente poderosa para amplificar secuencias específicas de polinucleótidos, que incluyen ADN genómico, ADNc de cadena sencilla y ARNm, entre otros. Los expertos en la técnica conocerán diversos métodos para llevar a cabo la amplificación por PCR y el diseño y construcción de cebadores para la amplificación por PCR. En general, en la PCR, se desnaturaliza el ADN de doble cadena que se va a amplificar calentando la muestra. A continuación, se ceba la nueva síntesis de ADN hibridando cebadores con la secuencia objetivo en presencia de ADN polimerasa y dNTP en exceso. En ciclos posteriores, los cebadores hibridan con el ADN recién sintetizado para producir productos discretos con las secuencias de cebador en cada extremo. Los productos se acumulan exponencialmente con cada ronda sucesiva de amplificación.
La ADN polimerasa utilizada en la PCR es a menudo una polimerasa termoestable. Esto permite que la enzima continúe funcionando después de ciclos repetidos de calentamiento necesarios para desnaturalizar el ADN de doble cadena. Las polimerasas que son útiles para la PCR incluyen, por ejemplo, aDn polimerasa Taq, ADN polimerasa Tth, ADN polimerasa Tfl, ADN polimerasa Tma, ADN polimerasa Tli y ADN polimerasa Pfu. Hay muchas formas modificadas disponibles comercialmente de estas enzimas, que incluyen: AmpliTaq® y AmpliTaq Gold®, ambas disponibles a través de Applied Biosystems. Muchas están disponibles con o sin una actividad de exonucleasa de corrección de 3' a 5'. Véase, por ejemplo, Vent® y Vent® (exo-) disponibles a través de New England Biolabs.
Otros métodos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (por ejemplo, Wu y Wallace, Genomics 4, 560 (1989) y Landegren et al., Science 241, 1077 (1988)), amplificación de la transcripción (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1173 (1989)), y replicación de secuencia autosostenida (Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87, 1874 (1990)) amplificación de secuencia basada en ácido nucleico (NABSA). (Véanse las patentes de Estados Unidos Nos 5.409.818, 5.55517 y 6.063.603). Los dos últimos métodos de amplificación incluyen reacciones isotérmicas basadas en la transcripción isotérmica, que producen tanto ARN de cadena sencilla (ARNcs) como ADN de cadena doble (ADNcd) como los productos de amplificación en una relación de aproximadamente 30 o 100 a 1, respectivamente.
La presente divulgación, en algunas realizaciones, describe composiciones, kits y métodos para la detección de uno o más microorganismos que expresan el factor de virulencia tal como eae y/o stx. La presente divulgación, en algunas realizaciones también describe composiciones, kits y métodos para la detección de uno o más microbios STEC que incluyen microorganismos STEC E. coli O157:H7 y sin-O157:H7. Algunos microbios STEC sin O157:H7 incluyen una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145.
Algunas especies de Escherichia coli (E. coli) tienen el potencial de ser patógenas para los seres humanos. Entre estos se encuentran el grupo Shigatoxigénico de E. coli (conocido como STEC o VTEC) que produce toxinas Shiga (también conocidas como verotoxinas). Estas toxinas son proteínas codificadas por genes stx (stxl y/o stx2) y pueden producir síntomas que van desde simple diarrea hasta diarrea hemorrágica. Algunos STEC pueden ser letales para los humanos, especialmente los bebés menores de cinco años y los humanos inmunocomprometidos. Algunos STEC no solo producen una o más toxinas Shiga, sino que también se pueden unir a la pared intestinal debido a una proteína intimina (una adhesina) codificada por un gen llamado eae. E. coli que porta estos dos genes (stx y eae) se han identificado previamente como responsables del síndrome urémico y hemolítico (UHS). Se conocen comúnmente como Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC). La presente especificación se refiere a las toxinas Shiga y a los genes eae como factores de virulencia, ya que contribuyen a la virulencia de los microorganismos STEC.
Además de E. coli O157:H7, el USDA-FSIS ha identificado recientemente seis cepas STEC E. coli sin -O157:H7 incluyendo los serotipos de E. coli O26, O45, O103, O111, O121, O145 como microbios que deben analizarse como contaminantes de los alimentos para prevenir y reducir la incidencia de brotes y muertes por patógenos transmitidos por los alimentos. La Asociación Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) también exige pruebas de al menos cuatro de estos serotipos de E. coli que incluyen O26, O103, O111, O145.
Las composiciones, kits y métodos de la presente divulgación proporcionan pruebas rápidas para detectar estos contaminantes microbianos en muestras que incluyen muestras de alimentos complejos.
Algunas realizaciones describen composiciones, kits y métodos para la detección de microorganismos que expresan un factor de virulencia. Los factores de virulencia comprenden uno o más genes, alelos y/o variantes que codifican aun stx y/o un eae. En algunas realizaciones, la detección de factores de virulencia en un microorganismo puede comprender la detección de uno o más genes, alelos y/o porciones y/o fragmentos y/o complementos de los mismos que codifican una
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toxina Shiga y/o un eae.
Las toxinas Shiga son una familia de toxinas relacionadas con dos grupos principales, Stx1 y Stx2, cuyos genes codificados por los loci denominados stxl y stx2 respectivamente se consideran parte del genoma de los profagos lambdoides. Estas toxinas se describieron por primera vez para explicar el origen bacteriano de la disentería causada por Shigella dysenteriae. Las fuentes más comunes para las toxinas Shiga son las bacterias S. dysenteriae y el grupo Shigatoxigénico de Escherichia coli (STEC), que incluye los serotipos O157:H7, O104:H4 y otros E. coli enterohemorrágicos (EHEC).
En una realización de la especificación actual, se llevaron a cabo comparaciones bioinformáticas y secuenciación directa de ADN de varios organismos que expresan toxinas Shiga en un esfuerzo por identificar secuencias codificantes de toxina Shiga, denominadas colectivamente como loci de stx. La alineación de estas secuencias utilizando algoritmos personalizados identificó varias regiones objetivo de stx para las que se diseñaron pares de cebadores de la divulgación para cada una de las regiones objetivo de stx identificadas para amplificar específicamente solo las secuencias objetivo únicas de stx tanto contra la inclusión (organismo que se va a detectar, es decir, organismos productores de toxina Shiga) como genomas de exclusión (organismos que no se van a detectar, organismos que no producen toxina Shiga).
Varios programas para el diseño de cebadores tales como Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) "Primer3" en la World Wide Web para usuarios generales y para programadores biólogos como se publica en: Krawetz S, Misener S (editores) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology, Human Press, Totowa, NJ, páginas 365-386), el software Primer Express® (Applied Biosystems), y OLIGO 7 (Wojciech Rychlik (2007). "OLIGO 7 Primer Analysis Software". Methods Mol. Biol. 402: 35-60) y variaciones de los mismos se pueden usar para el diseño de cebadores. Los cebadores y sondas de PCR diseñados posteriormente para uso en ensayos mediante PCR en tiempo real detectaron inequívocamente, específicamente y con gran sensibilidad a los organismos productores de toxinas Shiga y a los organismos que codifican eae.
En algunas realizaciones, se describen composiciones que comprenden secuencias de cebador y/o sonda que comprenden secuencias aisladas de ácido nucleico que tienen la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID NOS: 1-14, complementos de las mismas y secuencias que tienen aproximadamente 90% de identidad con las secuencias anteriores. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe el diseño de cebadores degenerados. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe el diseño de cebadores múltiples que pueden ser adecuados para el tipo de ensayos de PCR múltiples. En algunas realizaciones, las composiciones de secuencia aislada de ácido nucleicos de la divulgación pueden comprender adicionalmente uno o más marcadores, tales como, pero sin limitarse a, un colorante, un isótopo radiactivo, un marcador quimioluminiscente, una unidad estructural fluorescente, un marcador bioluminiscente, una enzima y combinaciones de los mismos.
La memoria descriptiva también describe métodos para la detección de un organismo productor de toxina Shiga a partir de una muestra y describe métodos para excluir la presencia de un organismo productor de toxina Shiga en una muestra, donde la detección de al menos una secuencia de ácido nucleico que se expresa en un organismo productor de toxina Shiga es indicativo de la presencia de un organismo productor de toxina Shiga y la ausencia de detección de cualquier secuencia de ácido nucleico única para el organismo productor de toxina Shiga es indicativa de la ausencia de un organismo productor de toxina Shiga en la muestra.
En algunas realizaciones, se describen métodos para detectar en una muestra la presencia de microorganismos de diferentes especies, serotipos y cepas que codifican un factor de virulencia de toxina Shiga. En algunas realizaciones, los métodos para detectar la presencia de cepas de E. coli que producen toxina Shiga (se describen organismos STEC). En algunas realizaciones, se describen métodos para detectar la presencia de cepas de Shigella productoras de toxina Shiga.
Un método de la divulgación, en algunas realizaciones, puede comprender detectar, en una muestra, al menos una (o más) secuencias de ácido nucleico que tienen al menos 10 a al menos 25 ácidos nucleicos de uno (o más) loci que codifican toxina Shiga tales como stxl y/o stx2 y/o secuencias complementarias de los mismos, en donde la detección de al menos una secuencia de ácido nucleico indica la presencia de un organismo que produce toxina Shiga en la muestra. Los métodos de detección también pueden comprender etapas de identificación y pueden comprender además etapas de preparación de la muestra. Estas realizaciones se describen en detalle en otras secciones de esta solicitud.
La detección de organismos productores de toxina Shiga mediante el uso de métodos descritos en este documento pueden usar una reacción en cadena de la polimerasa para una detección rápida. En general, todos los métodos de la divulgación pueden incluir la comparación de la presencia de un organismo que expresa stx usando controles adecuados, por ejemplo, puede usarse un control positivo interno en una reacción de PCR que tendrá una señal detectable/resultado positivo, también puede ser utilizado un control negativo adecuado que no tendrá señal detectable.
En una realización, un método para la detección de un organismo productor de toxina Shiga a partir de una muestra puede comprender: detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica Stxl y/o un fragmento o un complemento del mismo que comprende: poner en contacto ácidos nucleicos presentes en la muestra con al menos un conjunto de cebadores, que tiene un cebador directo y un cebador inverso, que comprende cebadores que tienen la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 en condiciones adecuadas para la amplificación; amplificar un ácido nucleico que codifica para el Stxl
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y/o un fragmento o un complemento del mismo; y detectar un ácido nucleico amplificado, donde la detección/presencia de un ácido nucleico amplificado usando dichos cebadores confirma la presencia de un organismo productor de stxl en una muestra y no detectar un ácido nucleico amplificado indica la ausencia de organismo productor de stxl. Se puede usar una sonda que tiene la SEQ ID NO: 3 para detectar un producto de amplificación stxl amplificado mediante cebadores con la SeQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2, respectivamente.
Otro método de realización para la detección de un organismo productor de toxina Shiga a partir de una muestra puede comprender: detectar la presencia de un ácido nucleico que codifica stx2 y/o un fragmento o un complemento del mismo que comprende: poner en contacto ácidos nucleicos presentes en la muestra con al menos un conjunto de cebadores, teniendo cada conjunto de cebadores un cebador directo y un cebador inverso, que comprende al menos un conjunto de cebadores seleccionado entre: un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; y/o un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la sEq ID NO: 7; y/o un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; proporcionar condiciones adecuadas para una reacción de amplificación de ácido nucleico para amplificar un ácido nucleico que codifica stx2 y/o un fragmento o un complemento del mismo; y detectar un ácido nucleico amplificado, en el que la detección de un ácido nucleico amplificado usando dichos cebadores confirma la presencia de un organismo productor de stx2 en una muestra y la no detección de un ácido nucleico amplificado indica la ausencia de un organismo productor de stx2. En algunas realizaciones, se pueden usar al menos dos conjuntos de cebadores para detectar un microbio con stx2. Se puede usar una sonda que tiene la SEQ ID NO: 10 para detectar el producto de amplificación de stxl amplificado por cada uno de los conjuntos de cebadores de stx2 descritos en la presente memoria.
Algunas realizaciones describen un método para la detección de un organismo productor de toxina Shiga a partir de una muestra que comprende: detectar la presencia de uno o más ácidos nucleicos que codifican stx incluyendo la detección de un ácido nucleico que codifica stxl y/o un fragmento o un complemento del mismo que comprende y/o detecta un ácido nucleico que codifica stx2 y/o un fragmento o un complemento del mismo que comprende: a) amplificar a partir de una muestra ácido nucleico que codifica stxl y/o un fragmento o un complemento del mismo poniendo en contacto ácidos nucleicos presentes en la muestra con al menos un conjunto de cebadores, que tiene un cebador directo y un cebador inverso, que comprende cebadores que tienen la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; y b) amplificar simultáneamente a partir de la misma muestra un ácido nucleico que codifica stx2 y/o un fragmento o un complemento del mismo poniendo en contacto simultáneamente ácidos nucleicos presentes en la muestra con al menos un conjunto de cebadores, teniendo cada conjunto de cebadores un cebador directo y un cebador inverso, que comprende el al menos un conjunto de cebadores seleccionado entre: un primer conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; y/o un segundo conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; y/o un tercer conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9, en la que el contacto se realiza en condiciones adecuadas para una reacción de amplificación de ácido nucleico; y detectar al menos un ácido nucleico amplificado, amplificado por las reacciones de amplificación ya se de las etapas a) y/o b), en la que la detección de al menos un ácido nucleico amplificado indica la presencia de un organismo productor de toxina Shiga en la muestra.
En una realización, el método para la detección de un organismo productor de toxina Shiga a partir de una muestra puede comprender: detectar la presencia de uno o más de los ácidos nucleicos que codifican stxl y/o stx2 y/o un fragmento o un complemento del mismo que comprende: poner en contacto ácidos nucleicos presentes en un muestra con un múltiplex de conjuntos de cebadores que comprende al menos dos conjuntos de cebadores, teniendo cada conjunto de cebadores un cebador directo y un cebador inverso, teniendo el primer conjunto de cebadores la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2 y el segundo conjunto de cebadores seleccionado de: un conjunto de cebadores que tienen la SEQ iD NO: 4 y la SEQ iD NO: 5; y/o un conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; y/o un conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 8 y la SEQ iD NO: 9; proporcionar condiciones óptimas para una reacción de amplificación para obtener uno o más ácidos nucleicos amplificados; y detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados, en la que la detección de un ácido nucleico amplificado usando el primer conjunto de cebadores indica la presencia de un organismo productor de stxl y la detección de un ácido nucleico amplificado usando el segundo conjunto de cebadores indica la presencia un alelo de stx2 en la muestra.
En otras realizaciones, se puede usar no detectar ningún producto amplificado usando los métodos descritos anteriormente para excluir la presencia de un organismo productor de toxina Shiga en una muestra.
En algunas realizaciones de los presentes métodos, un solo ensayo no puede ser definitivo para detectar un organismo productor de toxina Shiga debido a la similitud genómica entre las regiones genómicas de otros organismos productores de toxina no Shiga. Sin embargo, cuando dos (o más) ensayos tales como, pero sin limitarse a, los ensayos mostrados en la Tabla 1 se usan ya sea en paralelo o como un ensayo múltiple, por ejemplo, en un ensayo TaqMan® en tiempo real, donde cada sonda en cada uno de los dos (o más) ensayos tiene una marca diferente para distinguir los resultados en un instrumento de PCR en tiempo real, por ejemplo, un sistema de PCR rápida en tiempo real 7500 (Applied Biosystems), un resultado positivo de dicho ensayo es indicativo de la presencia de un organismo productor de toxina Shiga.
En otras realizaciones, puede usarse un enfoque de ensayo doble o múltiple (más de 2 conjuntos de ensayos) para detectar y distinguir el organismo productor de toxina Shiga. En algunas realizaciones, el ensayo puede comprender detectar la presencia de genes, alelos y/o fragmentos de dichos genes/alelos que codifican uno o más loci génicos que
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codifican la toxina Shiga tales como, pero sin limitarse a, stxl y stx2. Algunas realizaciones describen la detección de todos estos loci génicos como la identificación positiva de un organismo productor de toxina Shiga. Algunas realizaciones describen la detección de al menos dos de estos loci génicos como identificación positiva de un organismo productor de toxina Shiga.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe una secuencia aislada de ácido nucleico que comprende las SEQ ID NO: 11-SEQ ID NO: 14, fragmentos de las mismas, complementos de las mismas, secuencias que comprenden al menos un 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico y derivados marcados de las mismas. Estas incluyen secuencias de cebador y sonda operables para unirse y/o amplificar y/o detectar y/o identificar cualquiera de los aproximadamente 25 alelos del gen eae que codifica intimina.
En una realización, el método para la detección de un organismo que expresa eae a partir de una muestra puede comprender: detectar la presencia de uno o más ácidos nucleicos que codifican eae y/o un fragmento o un complemento del mismo que comprende: poner en contacto ácidos nucleicos presentes en una muestra con al menos un conjunto de cebadores seleccionado entre: un primer conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12, y/o un segundo cebador que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 13; proporcionar condiciones óptimas para una reacción de amplificación para obtener uno o más ácidos nucleicos amplificados; y detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados, en el que la detección de un ácido nucleico amplificado usando dichos cebadores confirma la presencia de un organismo que expresa eae en la muestra. Un ácido nucleico amplificado correspondiente a un gen eae o un fragmento del mismo puede detectarse mediante una secuencia de sonda que tiene la SEQ ID NO: 14.
Algunas realizaciones se refieren a composiciones que comprenden secuencias aisladas de ácido nucleico que son operables para hibridar con regiones de ácido nucleico que se encuentran de manera única en un microorganismo STEC. Las regiones de ácido nucleico encontradas exclusivamente en un microorganismo específico STEC se denominan en la presente memoria como ácidos nucleicos objetivo específicos de microorganismos o ácidos nucleicos objetivo específicos de microorganismos STEC.
Se realizaron comparaciones bioinformáticas y secuencia directa de ADN de varios organismos STEC en un esfuerzo para identificar diversas secuencias de ácido nucleico objetivo específicas de STEC, también denominadas aquí ácidos nucleicos objetivo específicos de microorganismos (o regiones de ácido nucleico o regiones objetivo). La alineación de estas secuencias usando algoritmos personalizados identificó varias regiones de ácido nucleico objetivo de STEC con las cuales se diseñaron pares de cebadores descritos en este documento para cada una de las regiones objetivo de STEC identificadas, para amplificar específicamente solo las secuencias objetivo únicas de STEC contra ambas inclusiones (organismo a detectar, es decir, organismos STEC) y genomas de exclusión (organismos que no se van a detectar, organismos no STEC). Las regiones objetivo específicas de STEC también se usaron para diseñar sondas que se pueden usar para hibridar y detectar objetivos amplificados específicos de STEC o regiones específicas de STEC en ácidos nucleicos microbianos aislados.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe una secuencia aislada de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 15-SEQ ID NO: 32, fragmentos de las misma, complementos de las misma, secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos y derivados marcados de los mismos. Estos incluyen secuencias de cebador y sonda operables para unirse a y/o amplificar y/o detectar y/o identificar una STEC E. coli de una cepa que incluye O26, O45, O103, O111, O145 y O121.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe el diseño de cebadores degenerados. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe el diseño de cebadores múltiples que pueden ser adecuados para el tipo de ensayos de PCR múltiple. En algunas realizaciones, las composiciones de secuencias aisladas de ácido nucleico de la divulgación incluyen cebadores y sondas que pueden comprender además uno o más marcadores, tales como, pero sin limitarse a, un colorante, un isótopo radiactivo, un marcador quimioluminiscente, una unidad estructural fluorescente, un marcador bioluminiscente, una enzima y sus combinaciones.
Secuencias de cebadores y sondas operables para unirse a y/o amplificar y/o detectar y/o identificar un microorganismo E. coli O157:H7 se describen en la SEQ ID NOS: 33-SEQ ID NO: 38. Secuencias, composiciones de los mismos y métodos para la detección de una E. coli O157:H7 también se describen en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos, serie No. 61/178.931, presentada el 15 de mayo de 2009 (No. de registro del abogado LT00032Pro); la solicitud de patente, número de serie 12/780,707 presentada el 14 de mayo de 2010 (No. de registro del abogado LT00032US); solicitud PCT serial No. PCT/US2010/034998, presentada el 14 de mayo de 2010 (No. de registro del abogado LT00032PCT); y la solicitud de patente europea con número de serie 10720105.5, presentada el 14 de mayo de 2010 (No. de registro del abogado LT00032EP).
La presente solicitud, en algunas realizaciones, describe métodos para detectar diversas cepas de STEC de E. coli tales como una E. coli O157:H7, una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145 en una muestra, en la que la detección de al menos una secuencia de ácido nucleico que se expresa en un organismo STEC es indicativa de la presencia de un organismo STEC en la muestra. Métodos para excluir la presencia de E. coli STEC en una muestra también se describen en los que la ausencia de detección de cualquier secuencia de ácido nucleico única para un organismo STEC es indicativa de la ausencia de un organismo STEC en la muestra.
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Algunos métodos divulgados en la presente memoria son métodos sencillos y algunos métodos divulgados en la presente memoria son métodos multiples.
Un método de la divulgación, en algunas realizaciones, puede comprender detectar, en una muestra, al menos una (o más) secuencias de ácido nucleico que tienen de al menos 10 a al menos 25 ácidos nucleicos de uno (o más) ácidos nucleicos únicos para un organismo STEC, o una secuencia complementaria de los mismos, en la que la detección de al menos una secuencia de ácido nucleico única para un microbio STEC indica la presencia de un organismo STEC en la muestra. Los métodos de detección también pueden comprender etapas de identificación. Estas realizaciones se describen en detalle en las secciones a continuación de esta solicitud.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O121 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos,
complementos de los mismos, y las secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos
una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O121 en la muestra. Un método para detectar E. coli O121 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de SEQ ID NO: 17, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O145 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos,
complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma, con al menos una
primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O145 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O145 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo donde la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O26 en una muestra y comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido
objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido
objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O26 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O26 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en la que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O45 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido
objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido
objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O45 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O45 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 26, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O103 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de
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homología con los mismos, con al menos un primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O103 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O103 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 29, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
Algunas realizaciones describen métodos para la detección de una E. coli O111 en una muestra que comprende: hibridar al menos un primer par de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos que comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada de polinucleótidos objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de una E. coli O111 en la muestra. Un método para detectar una E. coli O111 puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 32, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de la misma, complementos de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
La detección de las cepas de STEC descritas en la presente memoria pueden usar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la amplificación rápida y la detección de regiones objetivo. En general, todos los métodos de la divulgación pueden incluir comparar la detección o ausencia de un organismo STEC utilizando un control adecuado, por ejemplo, un control positivo interno puede usarse en una reacción de PCR que tendrá una señal detectable/resultado positivo y también se puede usar un control negativo adecuado que no tendrá señal detectable.
En algunas realizaciones, los métodos para detectar en una muestra la presencia de microorganismos STEC pueden comprender además detectar la presencia de ácido nucleico que codifica stx y/o un ácido nucleico que codifica eae.
La memoria descriptiva, en algunas realizaciones, describe un método para la detección de uno o más microorganismos, cada microorganismo que expresa uno o más factores de virulencia que comprende: 1) detectar la presencia de uno o más factores de virulencia que comprenden: a) contactar una muestra sospechosa de contener uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia con uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con secuencias objetivo de uno o más factores de virulencia; b) amplificar al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo que codifica al menos uno de los factores de virulencia mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos específicos de factor de virulencia amplificados; c) detectar uno o más ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado o fragmentos o complementos de os mismos; y d) identificar opcionalmente los ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado, donde detectar uno o más ácidos nucleicos específicos del factor de virulencia amplificado o fragmentos o complementos de los mismos es indicativo de la presencia de un microorganismo en la muestra que expresa uno o más factores de virulencia; y 2) determinar la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia que comprenden: a) poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácidos nucleicos objetivo específicos para una cepa de uno o más microorganismos; b) amplificar conjuntamente al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo específica de la cepa que codifica para objetivos de ácido nucleico específicos para al menos una cepa del microorganismo mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa; c) detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa o fragmentos o complementos de los mismos; y d) identificar opcionalmente los ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa. En algunas realizaciones del método, cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia se marca con un marcador diferente. En algunas realizaciones del método, cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para una o más cepas del microorganismo se marca con un marcador diferente y en la que cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia se marca con un marcador diferente.
En algunas realizaciones, las etapas descritas en el método anterior de 1) detectar la presencia de uno o más factores de virulencia y 2) determinar la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia se pueden realizar simultáneamente o en consecuencia y/o en cualquier orden.
En algunas realizaciones de un método para la detección de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia, uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia comprenden cada uno: al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operables para hibridar con uno o más factores de virulencia y en condiciones de amplificación apropiadas forman un producto de ácido nucleico específico del factor de virulencia amplificado. Los factores de virulencia en algunas realizaciones comprenden, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: todas las variantes de los ácidos nucleicos que codifican la toxina Shiga (stx) alelos y fragmentos de los mismos; y/o todas las variantes de ácidos nucleicos que codifican al gen eae,
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alelos y fragmentos de los mismos. Un ácido nucleico que codifica stx puede comprender un gen stxl, un gen stx2, un alelo de un gen stxl y un alelo de un gen stx2, o fragmentos de los mismos. La Tabla 1 a continuación enumera varios subtipos y variantes de stxl y stx2 que se detectan mediante los métodos descritos en este documento.
Tabla 1:
Tipo de Stx
Subtipo de Stx Variantes de Stx
Stxl
3 1a, 1c, 1d
Stx2
7 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f, 2g
Un método de detección de todas las variantes de stx, incluyendo stxl (1a, 1c y 1d) y stx2 (2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 2f y 2g) comprende detectar todas las variantes conocidas de stxl y stx2 y comprende realizar un ensayo múltiple que comprende hibridar al menos dos pares de cebadores de PCR, un primer par de cebadores de PCR que tienen secuencias de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; y el segundo conjunto de cebadores seleccionado entre los conjuntos de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 4 y la SeQ ID NO: 5; y/o la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7 y/o la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9, (así como los cebadores que tienen fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos a las secuencias descritas anteriormente, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con los mismos), con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de un ácido nucleico que codifica stx en la muestra. En algunas realizaciones, todos los cuatro pares de cebadores descritos anteriormente se usan para amplificar una o más secuencias de ácido nucleico objetivo de stx en la muestra y en los que la detección de al menos un ácido nucleico amplificado de stx objetivo es indicativo de la presencia de un microorganismo que tiene loci que codifica stx en sus ácidos nucleicos. Un método para detectar un microbio que expresa un gen stx puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo, donde la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 3 para detectar el producto amplificado de ácido nucleico de stxl usando un par de cebadores que tienen la SEQ. ID NO. 1 y la SEQ ID NO. 2, en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 10 para detectar el producto amplificado de ácido nucleico de stx2 mediante el uso de un par de cebadores que tienen la SEQ ID NO. 4 y la SEQ ID NO. 5; y/o la SEQ ID NO. 6 y la SEQ ID NO. 7 y la SEQ ID NO. 8 y la SEQ ID NO. 9. Las sondas que tienen la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 10 también pueden comprender fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos. Todas las variantes de stx pueden detectarse usando estos métodos debido a cebadores y sondas degenerados que contienen bases no coincidentes en sitios polimórficos conocidos.
Un ácido nucleico que codifica eae puede comprender un gen eae, un alelo de un gen eae, o uno de sus fragmentos. Los microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia incluyen, por ejemplo, E. coli que produce toxina Shiga (STEC).
Un método para detectar la presencia de un microbio que expresa eae en una muestra comprende hibridar al menos un par de cebadores de PCR tales como un cebador que tiene secuencias de ácido nucleico de la SEQID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 y/o la SEQ ID NO: 13, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de los mismos, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos, con al menos una primera secuencia del polinucleótido objetivo presente en la muestra; amplificar al menos la primera secuencia del polinucleótido objetivo o un fragmento o un complemento de la misma para obtener una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; y detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo; en el que la detección de al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo es indicativa de la presencia de un ácido nucleico que codifica eae en la muestra. Un método para detectar un microbio que expresa un gen eae puede comprender además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo, en la que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 14 (para detectar un producto de ácido nucleico amplificado de eae usando pares de cebadores que tienen la SEQ. ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 o la SEQ ID NO: 13), fragmentos de los mismos y complementos de los mismos y secuencias que tienen al menos 90% de homología de secuencia con los mismos.
En algunas realizaciones de un método descrito anteriormente la etapa 1) de determinación de la presencia de uno o más factores de virulencia, uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia pueden comprender: un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ iD NO: 7; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; y/o un quinto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12; y la SEQ ID NO: 13. Un método puede comprender además las etapas de detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos comprende hibridar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos con una sonda seleccionada de la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, y la SEQ ID NO: 14.
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En otras realizaciones, puede utilizarse no detectar ningún producto amplificado usando los métodos descritos anteriormente para excluir la presencia de un microorganismo que expresa un factor de virulencia en una muestra.
En algunas realizaciones de un método como se describió anteriormente, la etapa 2) de determinación de la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia, al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para la cepa de uno o más microorganismos pueden comprender un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, un quinto conjunto de cebador que tiene la SEQ ID No: 27, la SEQ ID No: 28; un sexto conjunto de cebadores que tiene la SEQ iD NO: 30 y la SeQ ID NO: 31; un séptimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34; y/o un octavo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 37. En algunas realizaciones, las etapas de detección de uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa o fragmentos o complementos del mismo comprende hibridar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa o fragmentos o complementos de los mismos con una sonda seleccionada de la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 35 y la SEQ ID NO: 38.
En algunas realizaciones, la detección de un ácido nucleico amplificado comprende uno o más métodos tales como, pero sin limitarse a, hibridación, espectrometría de masas, códigos de barras moleculares, microfluidos, quimioluminiscencia, tecnologías enzimáticas y combinaciones de los mismos. Algunas realizaciones también pueden comprender identificar un microbio y pueden comprender métodos tales como la secuenciación de ADN.
En algunas realizaciones de los presentes métodos, un ensayo solo puede no ser definitivo para detectar un organismo STEC (o cualquier microbio que exprese un factor de virulencia tal como Shigella spp.) debido a la similitud genómica entre las regiones genómicas de otros organismos no STEC (o no Shigella spp.). Sin embargo, cuando dos (o más) ensayos tales como, pero sin limitarse a, los ensayos (combinaciones de cebadores para detectar tsxl y stx2) descritos en este documento, se usan en paralelo o como un ensayo múltiple, por ejemplo, en un ensayo TaqMan® en tiempo real, por ejemplo, donde cada sonda en cada uno de los dos (o más) ensayos tiene un marcador diferente para distinguir los resultados en un instrumento de PCR en tiempo real, por ejemplo, un sistema de PCR rápida en tiempo real 7500 (Applied Biosystems), un resultado positivo de tal ensayo es indicativo de la presencia de un organismo STEC.
En otras realizaciones, el enfoque de ensayo doble o múltiple (más de 2 conjuntos de ensayo) se puede usar para detectar y distinguir cepas de organismo STEC entre sí, así como para detectar y distinguir la expresión de alelos/variantes de stx y/o eae. En algunas realizaciones, el ensayo puede comprender detectar la presencia de genes, alelos y/o fragmentos de tales genes/alelos que codifican uno o más loci génicos que codifican toxina Shiga tales como, pero sin limitarse a stxl y stx2. Algunas realizaciones describen la detección de todos estos loci génicos como identificación positiva de un organismo que produce toxina Shiga. Algunas realizaciones describen la detección de al menos dos de estos loci génicos como identificación positiva de un organismo productor de toxina Shiga. Algunas realizaciones describen la detección de un loci de eae. Algunas realizaciones describen la detección de diferentes productos de amplificación para diferentes cepas de STEC tales como una E. coli O157:H7, una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145.
Los métodos pueden incluir ensayos múltiples tales como reacciones en cadena de la polimerasa, en los que la hibridación y amplificación de dicho primer par de cebadores de polinucleótidos se produce en un primer recipiente y dicha hibridación y amplificación de dicho segundo par de cebadores de polinucleótidos se produce en un segundo recipiente, o la hibridación y la amplificación de dicho primer par de cebadores de polinucleótidos y dicha hibridación y amplificación de dicho segundo par de cebadores de polinucleótidos se produce en un solo recipiente, la detección es un ensayo en tiempo real, el ensayo en tiempo real es un ensayo con colorante SYBR® Green o Ensayo TaqMan®. Los métodos también pueden comprender el uso de cebadores adicionales tales como un tercer par de cebadores y un cuarto par de cebadores, y así sucesivamente.
Un método de la divulgación puede comprender además proporcionar una primera sonda y una segunda sonda (y sondas adicionales tales como una tercera sonda y una cuarta sonda, y así sucesivamente), en el que la primera y la segunda sondas son diferentes entre sí, la primera sonda operable para identificar la primera secuencia amplificada del polinucleótido objetivo y la segunda sonda operable para identificar la segunda secuencia amplificada de nucleótidos objetivo, la primera sonda comprende además una primera marca y dicha segunda sonda comprende además una segunda marca, en la que ambos marcadores se seleccionan de un colorante, un isótopo radiactivo, un marcador quimioluminiscente y una enzima, el colorante comprende un colorante de fluoresceína, un colorante de rodamina o un colorante de cianina, el colorante es un colorante de fluoresceína y la primera sonda está marcada con colorante FAMMR y dicha segunda sonda está marcada con colorante VIC®; e hibridar la primera y la segunda sondas con los fragmentos amplificados por PCR para detectar la presencia de la primera secuencia amplificada del polinucleótido objetivo y la segunda secuencia amplificada del polinucleótido objetivo de la muestra.
En algunas realizaciones, una muestra para ser analizada por contaminación potencial por un microbio que expresa un factor de virulencia y/o un microbio STEC, puede analizarse directamente o puede "prepararse" o "procesarse" de
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alguna manera antes de la prueba y análisis molecular (tal como mediante PCR). Por ejemplo, una muestra puede procesarse para separar y/o enriquecer un microbio contaminante. Una muestra también puede procesarse adicionalmente para separar ácidos nucleicos microbianos del resto de la muestra mediante lisis de células microbianas. La lisis se puede lograr usando una variedad de reguladores que pueden comprender agentes de lisis tales como, pero sin limitarse a, agentes caotrópicos y/o agentes enzimáticos y/o proteasas. Las células microbianas lisadas de una muestra pueden procesarse adicionalmente para separar, aislar y/o extraer material genético del microbio antes de los métodos de análisis de amplificación descritos en la presente memoria mediante varios métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, la extracción de ácido nucleico puede realizarse mediante kits y reactivos de Life Technologies Corporation, tal como el kit de preparación de muestras por centrifugación rápida PrepSEQMR que se puede usar para preparar ADN de muestras de alimentos y/o ambientales para su uso en reacciones de amplificación por PCR. Usando un protocolo de centrifugación simple, la centrifugación rápida PrepSEQMR inactiva eficientemente los inhibidores de la PCR. El kit proporciona una solución rápida y rentable para extraer ADN de alta calidad de una amplia gama de tipos de muestras. El kit de extracción de ácido nucleico PrepSEQ® de Life Technologies también produce muestras de ADN bacteriano de alta calidad para la detección basada en PCR de una amplia gama de muestras de alimentos y medioambientales.
Algunas realizaciones pueden comprender una o más de las siguientes etapas para lograr la separación de microbios y/o sus ácidos nucleicos de los componentes de la muestra antes del análisis de ácidos nucleicos microbianos como se describe en la presente memoria: (1) enriquecimiento bacteriano opcional para enriquecer ciertos tipos de bacterias (por ejemplo, proporcionando condiciones para aumentar selectivamente un tipo bacteriano), (2) lisis opcional de células bacterianas, (3) extracción y/o purificación opcional de ácidos nucleicos (por ejemplo, extracción de ADN, extracción total de ácido nucleico (es decir, ADN y ARN), extracción de ADN genómico, extracción de ARN usando columnas de centrifugación y/o reguladores y/u otros métodos conocidos en la técnica).
En algunas realizaciones, la divulgación describe flujos de trabajo de métodos para detectar e identificar uno o más microorganismo E. coli que producen toxina Shiga (STEC) en una muestra que comprende las etapas de: a) enriquecer opcionalmente los microorganismos STEC separados; b) extraer ácidos nucleicos de STEC; c) realizar una reacción en cadena de polimerasa múltiple (PCR) en los microorganismos STEC separados para amplificar y detectar la presencia de al menos un ácido nucleico seleccionado de: ácidos nucleicos que codifican para un gen de toxina Shiga, incluyendo ácidos nucleicos que codifican stxl y stx2; ácidos nucleicos que codifican un gen eae; ácidos nucleicos específicos para una cepa de E. coli O157:H7, en la que la detección de al menos un ácido nucleico anterior indica la presencia de un microorganismo STEC o E. coli 0157:H7 o ambos; y d) si se detecta un ácido nucleico en la etapa c) realizar una segunda ronda de PCR múltiple con cebadores específicos para amplificar y detectar la presencia de uno o más ácidos nucleicos que codifican regiones objetivo asociadas con uno o más microorganismos STEC que incluyen una E. coli O157:H7, una E. coli 026, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145. En algunas realizaciones, la divulgación describe un flujo de trabajo para detectar los microorganismos Big 6 STEC identificados por el USDA.
En otras realizaciones, no se puede detectar ningún producto amplificado usando los métodos descritos anteriormente para excluir la presencia de un microorganismo STEC en una muestra.
Amplificación de ácidos nucleicos objetivo de objetivos que incluyen stxl, stx2, eae, E. coli O157:H7, una E. coli 026, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145 pueden detectarse usando una pluralidad de marcadores en cada conjunto diferente de cebadores y/o sondas. Por ejemplo, en la etapa c) anterior, cebadores y/o sondas con un marcador diferente para cada uno de los siguientes: stx1, sxt2, eae y E. coli 0157:H7 puede usarse y en la etapa d) se pueden usar cebadores y/o sondas con un marcador diferente para cada uno de los diversos microorganismos.
En algunas realizaciones, los métodos de la divulgación se pueden realizar en un sistema automatizado. La automatización disminuye el tiempo y la eficiencia y permite procesar muestras múltiples. Los sistemas automatizados pueden comprender una plataforma de separación magnética tal como, pero sin limitarse a, la plataforma procesadora de partículas magnéticas MagMAXMR Express-96 (Life Technologies Corporation), Pathatrix (Matrix Microsciences).
Las composiciones y métodos de la presente divulgación son idealmente adecuadas para la preparación de kits. Un ejemplo es un kit adecuado para detectar la presencia de un microorganismo que expresa un factor de virulencia. Tal kit puede comprender al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos para uso en un proceso de amplificación de ácido nucleico para la detección de factores de virulencia asociados con microbios, comprendiendo dicho conjunto de cebadores un conjunto de cebadores operables para hibridar con factores de virulencia que comprenden todas las variantes de toxina Shiga y/o eae.
Algunas realizaciones describen kits adecuados para identificar la presencia de un organismo productor de toxina Shiga. Tal kit puede comprender al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos para usar en un proceso de amplificación (tal como PCR y en algunas realizaciones una PCR múltiple) para la detección de factores de virulencia de stx, el conjunto de cebadores que comprende cebadores operables para hibridar con factores de virulencia que comprenden todas las variantes, genes, alelo y/o fragmentos y complementos de toxina Shiga. El kit de detección de stx puede comprender además secuencias de sonda para detectar ácidos nucleicos objetivo stx amplificados. En un ejemplo de
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realización, un kit para detectar microorganismos que expresan las variantes stxl y stx2 comprende cebadores y sondas que tienen las SEQ ID NOS: 1-10.
Algunas realizaciones describen kits adecuados para identificar la presencia de un organismo que codifica eae. Tal kit puede comprender al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos para uso en un procedimiento de PCR para la detección de un factor de virulencia de eae, el conjunto de cebadores que comprende cebadores operables para hibridar con genes que codifican eae, alelos, regiones complementarias de los mismos y fragmentos de los mismos que comprenden todas las variantes de eae. Un kit puede comprender adicionalmente secuencias de sonda para detectar ácidos nucleicos objetivo de eae amplificados. En un ejemplo de realización, un kit para detectar microorganismos que se expresan eae comprende cebadores y sondas que tienen las SEQ ID NOS: 11-14.
Algunos kits de la divulgación pueden detectar factores de virulencia que incluyen stx y eae y comprenden conjuntos de cebadores seleccionados de: un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ iD NO: 7; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; un quinto conjunto de cebadores que tiene como cebador directo la SEQ ID NO: 11 y como cebadores inversos la SEQ iD NO: 12 o la SEQ ID NO: 13; y además opcionalmente adicionalmente al menos una sonda más seleccionada entre las sondas que tienen la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, y la SEQ ID NO: 14, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, o derivados marcados de las mismas.
En algunas realizaciones, un kit de la divulgación puede, solo o además del cebador y las sondas del factor de virulencia descritos anteriormente, comprender además uno o más conjuntos de cebadores operables para hibridar con objetivos de ácido nucleico únicos de una o más cepas de STEC tales como, pero sin limitarse a una E. coli O157:H7, una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145.
Todos los kits de la divulgación pueden comprender adicionalmente uno o más reactivos tales como, pero sin limitarse a, reguladores, trifosfatos de nucleótidos, ADN polimerasas, colorantes de intercalación, cebadores, sondas, sales e instrucciones para el uso del kit.
Un ejemplo de un kit para la detección de un microorganismo E. coli que produce toxina Shiga (STEC) comprende: dos o más pares de cebadores de reacción en cadena de polimerasa directa e inversa (PCR) seleccionados de un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SeQ ID NO: 18 y la SeQ ID NO: 19; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, un quinto conjunto de cebador que tiene la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28; un sexto conjunto de cebadores que tiene la SEQ iD NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico con las mismas, fragmentos que tienen al menos 10 nucleótidos contiguos de las mismas, o un derivado marcado de las mismas; opcionalmente al menos una sonda y uno o más componentes seleccionados de un grupo que consiste en: al menos una enzima; dNTP, al menos un regulador, al menos una sal, al menos una muestra de ácido nucleico de control y un protocolo de instrucciones. Tal como un kit puede detectar la presencia de uno o más organismos STEC incluyendo una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145.
En algunas realizaciones, un kit de la divulgación también puede también o alternativamente comprende uno o más pares de cebadores de PCR directos e inversos seleccionados adicionalmente de un séptimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 13; un octavo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un noveno conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un décimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; un undécimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9; y además opcionalmente adicionalmente al menos una sonda más seleccionada de sondas que tienen la SEQ ID NO: 14, la SeQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, o derivados marcados de las mismas. Tal kit puede detectar la presencia de uno o más organismos STEC que expresan factores de virulencia stx y eae. Estos kits también pueden detectar la presencia de la cepa STEC específica tal como si el contaminante es una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 y una E. coli O145.
En algunas realizaciones, los kits de la divulgación pueden comprender además adicionalmente uno o más pares de cebadores de PCR directa e inversa además seleccionados de un duodécimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34; un decimotercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 37; y opcionalmente adicionalmente al menos otra sonda más seleccionada entre las sondas que tienen la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 38, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico de las mismas, o derivados marcados de las mismas. Tal kit puede detectar adicionalmente la presencia de una E. coli 0157:H7 en la muestra.
En algunas realizaciones, los cebadores del kit pueden marcarse. Un kit que comprende múltiples pares de cebadores
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puede tener pares de cebadores, cada uno marcado con diferentes marcadores que pueden detectarse por separado. Las sondas incluidas en los kits de la divulgación pueden estar marcadas. Si un kit comprende múltiples sondas, cada sonda puede marcarse con un marcador diferente para permitir la detección de diferentes productos que pueden ser el objetivo de cada sonda diferente. Los componentes pueden proporcionarse como soluciones o como polvos liofilizados que pueden reconstituirse posteriormente si es necesario en soluciones y/o reguladores que también pueden proporcionarse.
Los componentes de kits pueden estar individualmente y en diversas combinaciones comprendidas en uno o una pluralidad de medios contenedores adecuados. Está dentro del alcance de estas enseñanzas proporcionar kits de prueba para usar en aplicaciones manuales o kits de prueba para usar con la preparación automática de muestras, la configuración de la reacción, los detectores o los analizadores. En algunas realizaciones, un producto de amplificación del kit puede analizarse adicionalmente por métodos tales como, pero sin limitarse a, electroforesis, hibridación, espectrometría de masas, códigos de barras moleculares, microfluidos, quimioluminiscencia y/o tecnologías enzimáticas.
Los expertos en la técnica, a la luz de esta memoria descriptiva, comprenderán que son posibles muchas modificaciones, alternativas y equivalentes de las realizaciones descritas anteriormente. Todas las modificaciones, alternativas y equivalentes de este tipo pretenden incluirse en este documento.
Ejemplos
Los siguientes procedimientos son ejemplos representativos de realizaciones de acuerdo con la divulgación que pueden emplearse para la detección de un organismo STEC y/o un organismo que expresa un factor de virulencia. Estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de las reivindicaciones y/o la divulgación de ninguna manera.
Ejemplo 1: Composiciones y métodos para detectar organismos productores de toxina Shiga
El presente ejemplo describe ejemplos de ensayos diseñados para detectar organismos productores de toxina Shiga utilizando secuencias de sonda y cebador diseñadas por los presentes inventores. Las secuencias de cebador que comprenden pares de cebadores directo e inverso y secuencias de sonda correspondientes se muestran en la Tabla 2 a continuación.
Un ejemplo de un método para detectar la presencia de un organismo productor de toxina Shiga en una muestra comprende: extraer (y/o aislar) ácido nucleico de una muestra y detectar la presencia de al menos un locus de stxl o stx2 o un fragmento del mismo o un complemento del mismo como se muestra usando un ensayo descrito en la Tabla 2 a continuación. En algunas realizaciones, las células microbianas pueden someterse directamente a la detección de loci o fragmentos de ácido nucleico de stx objetivo sin ninguna extracción de ácido nucleico.
Como se muestra en la Tabla 2, se asigna un número de ID del ensayo (tal como 14252, 14254, etc.) para describir un par de cebadores asociados (o pares de cebadores para ensayos múltiples) y sondas asociadas que pueden usarse para la detección de una secuencia de stx objetivo (véase stxl, stx2, tanto stxl como stx2 en la Tabla 2). Estas combinaciones específicas de pares de cebadores y secuencias de sonda se han diseñado para amplificar selectivamente los genes presentes de loci de stx. En algunas realizaciones, estos pares de cebadores son degenerados.
Como se muestra en la Tabla 2, un par de cebadores directo e inverso se muestra en una fila, si se usa en una reacción de amplificación, amplificará el correspondiente ácido nucleico de stxl o stx2 objetivo. Por ejemplo, el número de ID del ensayo número 14252 puede usarse para detectar la presencia de un organismo productor de toxina Shiga que tiene un gen stxl mediante: la puesta en contacto de una muestra sospechosa de estar contaminada con un cebador directo que tiene la secuencia de ácido nucleico GTGACAGTAGCTATACCACGTTACA (SEQ ID NO: 1) y un cebador inverso que tiene la secuencia de ácido nucleico AGTGTTGTACGAAATCCCCTCT (SEQ ID NO: 2) en condiciones para amplificar una secuencia de ácido nucleico objetivo de loci del gen stxl (o fragmento o complemento del mismo). Las temperaturas de fusión Tm para cebadores directos e inversos también se muestran en la Tabla 2. En algunas realizaciones, un producto amplificado, que usa los cebadores de una fila puede detectarse usando un cebador descrito en la misma fila, por ejemplo, en el ensayo ID 14252, puede usarse una sonda que tiene la secuencia de ácido nucleico ATGGCGATTTATCTGCATCCC (SEQ ID NO: 3).
Las ID del ensayo de la Tabla 2 se pueden combinar para formar ensayos múltiples. Por ejemplo, un ensayo múltiple combina ensayos con el ID del ensayo 14252 o con el ensayo ID 14254, 29133 y/o 29134 de la Tabla 2 y puede detectar todos los alelos stxl y stx2. Los ensayos múltiples se pueden realizar poniendo en contacto simultáneamente una muestra con uno o más pares de cebadores. En algunas realizaciones, los ensayos múltiples se pueden realizar en paralelo o se pueden realizar secuencialmente.

Claims (16)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un método para la detección de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia que comprende:
    a) poner en contacto una muestra sospechosa de contener uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia con al menos dos conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácidos nucleicos objetivo específicos para uno o más factores de virulencia;
    b) amplificar al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo específica para uno o más factores de virulencia mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos específicos de factor de virulencia amplificados;
    c) detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos; y
    d) identificar los ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia, en el que uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos del factor de virulencia o fragmentos o complementos de los mismos es indicativa de la presencia de un microorganismo en la muestra que expresa uno o más factores de virulencia, en el que al menos dos conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con un ácido nucleico objetivo específico de toxina Shiga (stx) y al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de eae,
    en el que los cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de stx comprenden uno o más conjuntos de cebador seleccionados de un primer conjunto de cebador que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un segundo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la sEq ID NO: 5; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; o un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9 y los cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de eae comprenden uno o más conjuntos de cebadores seleccionados de un conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 o un conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 13.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, que comprende detectar un organismo STEC o Shigella spp.
  3. 3. Un método de la reivindicación 1, en el que uno o más factores de virulencia es una toxina Shiga que comprende:
    a) poner en contacto ácidos nucleicos presentes en la muestra con al menos un conjunto de cebadores stxl, que tiene un cebador directo y un cebador inverso, que comprende cebadores que tienen la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO 2 bajo condiciones para amplificar a partir de la muestra un ácido nucleico que codifica stxl, un fragmento o un complemento del mismo por; y
    b) amplificar simultáneamente a partir de la misma muestra un ácido nucleico que codifica stx2, un fragmento o un complemento del mismo poniendo en contacto simultáneamente ácidos nucleicos presentes en la muestra con al menos un conjunto de cebadores específicos de stx2, cada conjunto de cebadores de stx2 con un cebador directo y uno inverso, seleccionados de: un primer conjunto de cebadores de stx2 que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO 5; y/o un segundo conjunto de cebadores de stx2 que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; y/o un tercer conjunto de cebadores de stx2 que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9, en el que el contacto se realiza bajo condiciones adecuadas para una reacción de amplificación de ácido nucleico; y
    c) detectar al menos un ácido nucleico amplificado, amplificado ya sea mediante las reacciones de amplificación de las etapas a) y/o b), en las que la detección de al menos un ácido nucleico amplificado indica la presencia de un organismo productor de toxina Shiga en la muestra.
  4. 4. El método de la reivindicación 1, que comprende, además:
    determinar la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia que comprende:
    a) poner en contacto la muestra con al menos un conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para la cepa de uno o más microorganismos;
    b) amplificar conjuntamente al menos una secuencia de ácido nucleico objetivo específica de la cepa que codifica para objetivos de ácido nucleico específicos para al menos una cepa del microorganismo mediante un método de amplificación múltiple para obtener uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa;
    c) detectar uno o más ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa o fragmentos o complementos de los mismos; y
    d) identificar los ácidos nucleicos amplificados específicos de la cepa.
  5. 5. El método según la reivindicación 4, en el que cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia se marca con un marcador diferente y/o en el que cada conjunto de cebadores oligonucleótidos específicos para una o más cepas del microorganismo se marca con un marcador diferente.
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  6. 6. El método de la reivindicación 4, en el que el microorganismo es una E. coli O26, una E. coli O45, una E. coli O103, una E. coli O111, una E. coli O121 o una E. coli O145.
  7. 7. El método de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una E. coli O121 y en el que los cebadores
    oligonucleótidos específicos para la cepa comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16,
    complementos de los misma, y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con los mismos; y
    el método comprende opcionalmente además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo de E. coli O121 en la que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 17, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
  8. 8. El método de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una E. coli O145 y en el que los cebadores
    oligonucleótidos específicos para la cepa comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19,
    complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con los mismos; y
    el método que comprende opcionalmente además usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo de E. coli O145 en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 20, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
  9. 9. El método de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una E. coli O26 y en el que los cebadores
    oligonucleótidos específicos para la cepa comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22,
    complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos; y
    el método comprende opcionalmente además usar una sonda para detectar al menos un secuencia amplificado del polinucleótido objetivo de E. coli O26 en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 23, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
  10. 10. El método de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una E. coli O45 y en el que los cebadores
    oligonucleótidos específicos para la cepa comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25,
    complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con los mismos; y
    el método que además comprende opcionalmente usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo de E. coli O45 en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 26, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
  11. 11. El método de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una E. coli O103 y en el que los cebadores oligonucleótidos específicos para la cepa comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con los mismos; y
    el método que además comprende opcionalmente usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo de E. coli O103 en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 29, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
  12. 12. El método de la reivindicación 6, en el que el microorganismo es una E. coli O111 y en el que los cebadores oligonucleótidos específicos para la cepa comprenden ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, complementos de los mismos, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos; y
    el método que comprende opcionalmente usar una sonda para detectar al menos una secuencia amplificada del polinucleótido objetivo de E. coli O111 en el que la sonda comprende una secuencia de la SEQ ID NO: 32, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma.
  13. 13. Un kit para la detección de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia que comprende:
    al menos dos conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para hibridar con ácidos nucleicos objetivo específicos para uno o más factores de virulencia, en el que los cebadores oligonucleótidos específicos para uno o más factores de virulencia comprenden al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con un ácido nucleico objetivo específico de toxina Shiga (stx) y al menos un cebador directo y al menos un cebador inverso operable para hibridar con ácido nucleico objetivo específico de eae,
    en el que uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para el organismo productor de ácido nucleico objetivo específico de toxina Shiga (stx) comprenden:
    al menos un par de conjuntos de cebadores de PCR directos e inversos seleccionados de un primer conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO 2; y/o un segundo conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 4 y la SeQ ID NO 5; y/o un tercer conjunto de cebadores que tienen la SeQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; y/o un cuarto conjunto de cebadores que tienen la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO 9, y/o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de las mismas, o un derivado marcado de las mismas; y que comprende opcionalmente al menos una sonda seleccionada de las sondas seleccionadas de la SEQ ID NO: 3, y la SEQ ID NO: 10 o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de la mismas, o un derivado marcado de las mismas; y
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    en el que uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para el organismo productor de ácidos nucleicos objetivo específicos de eae comprenden:
    al menos un par de conjuntos de cebadores de PCR directo e inverso seleccionados de un primer conjunto de cebadores que tienen la SeQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12; o que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID No: 13 o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de las mismas, o un derivado marcado de las mismas; y
    opcionalmente al menos una sonda se selecciona adicionalmente de la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, o secuencias complementarias de las mismas, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de las mismas, o un derivado marcado de las mismas; y
    uno o más componentes seleccionados de un grupo que consiste en: al menos una enzima, dNTP, al menos un regulador, al menos una sal, al menos una muestra de ácido nucleico de control y un protocolo de instrucciones.
  14. 14. El kit de la reivindicación 13, adicionalmente útil para determinar la cepa de uno o más microorganismos que expresan uno o más factores de virulencia, que comprende:
    uno o más conjuntos de cebadores oligonucleótidos específicos para la cepa de uno o más microorganismos seleccionados de:
    a) la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16, complementos de las mismas, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con las mismas y derivados marcados de las mismas y el kit que comprende opcionalmente además una sonda que tiene la SEQ ID NO: 17, complementos de la misma, un derivado marcado de la misma y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con la misma para detección de una cepa de E. coli O121;
    b) la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19 complementos de las mismas, derivados marcados de las mismas y secuencias que tienen al menos 90% de homología con las mismas; y el kit que comprende opcionalmente además una sonda que tiene la SEQ ID NO: 20, complementos de la misma, derivados marcados de la misma y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma para la detección de una cepa de E. coli O145;
    c) la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22, complementos de las mismas, derivados marcados de las mismas y secuencias que tienen al menos 90% de homología con las mismas; y el kit que comprende opcionalmente además una sonda que tiene la SEQ ID NO: 23, complementos de la misma, derivados marcados de la misma y secuencias que tienen al menos un 90% de homología con la misma para la detección de una cepa de E. coli O26;
    d) la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, complementos de las mismas, derivados marcados de los mismas y secuencias que tienen al menos 90% de homología con las mismas: y el kit que comprende opcionalmente además una sonda que tiene la SEQ ID NO: 26, complementos de la misma, derivados marcados de la misma y secuencias que tienen al menos un 90% de homología de la misma para la detección de una cepa de E. coli O45;
    e) la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28, complementos de las mismas, derivados marcados de los mismas y secuencias que tienen al menos 90% de homología con los mismos; y el kit que comprende opcionalmente además una sonda que tiene la SEQ ID NO: 29, complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma para la detección de una cepa de E. coli O103;
    f) la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, complementos de las mismas, derivados marcados de las mismas y secuencias que tienen al menos 90% de homología con las mismas; y el kit que comprende opcionalmente además una sonda que tiene la SEQ ID NO: 32, derivados marcados de la misma complementos de la misma, y secuencias que tienen al menos 90% de homología con la misma para la detección de una cepa de E. coli O111.
  15. 15. El kit de la reivindicación 14 que comprende:
    dos o más pares de cebadores de reacción en cadena de la polimerasa directa e inversa (PCR) seleccionados de un primer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 15 y la SEQ ID NO: 16; un segundo cebador que tiene la SEQ ID NO: 18 y la SEQ ID NO: 19; un tercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 21 y la SEQ ID NO: 22; un cuarto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 24 y la SEQ ID NO: 25, un quinto conjunto de cebador que tiene la SEQ ID NO: 27 y la SEQ ID NO: 28; un sexto conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 30 y la SEQ ID NO: 31, o secuencias complementarias del mismo, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácido nucleico con el mismo, o un derivado marcado del mismo;
    opcionalmente al menos una sonda seleccionada de la SEQ ID NO: 17; la SEQ ID NO: 20; la SEQ ID NO: 23; la SEQ ID NO: 26; la SEQ ID NO: 29; y la SEQ ID NO: 32 y/o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la misma, o un derivado marcado de la misma;
    y opcionalmente además en el que los dos o más pares de cebadores de PCR directos e inversos se seleccionan adicionalmente de un séptimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 11 y la SEQ ID NO: 12 y la SEQ ID NO: 13; un octavo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2; un noveno conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 4 y la SEQ ID NO: 5; un décimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 7; un undécimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 8 y la SEQ ID NO: 9 y/o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de los mismos, o un derivado marcado de los mismos; y
    opcionalmente al menos una sonda adicional se selecciona la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 10, o secuencias complementarias de la misma, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la misma, o un derivado marcado de la misma; y
    adicionalmente, opcionalmente, en el que los dos o más pares de cebadores de PCR directa e inversa se seleccionan además de un duodécimo conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 33 y la SEQ ID NO: 34; un decimotercer conjunto de cebadores que tiene la SEQ ID NO: 36 y la SEQ ID NO: 37 y/o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos de los mismos, o un derivado marcado de los mismos; y 5 opcionalmente, al menos una sonda se selecciona adicionalmente de la SEQ ID NO: 35, la sEq ID NO: 38; o secuencias complementarias a la misma, o secuencias que comprenden al menos 90% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos con la misma, o un derivado marcado de la misma.
    HG, 1:
    Datos múltiples usando E. coli 0157:H7 (ATCC BAA-460) como molde (10.000 Copias)
    imagen1
    ...... ... .......
    ::...........
    .......
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    ■■ ■ ■:
    * 0157:H7 es positivo tanto para stx1 como para stx2
    - stx'l VIC Ct ~ 31.3 “ Stx2 FAM Ct ~ 30.3
    - IPC NED Ct ~ 33
    FIG. 2:
    Datos múltiples usando E. coli O104:H4 (Cepa de brote alemán 2011) como molde (10.000 copias)
    imagen2
    * E. coli O104:H4 es negativa para stx1 y positiva para stx2
    - stxl VIC Ct es "indeterminado"
    - Stx2 FAM Ct ~ 28.5 ~ ¡PC NED Ct ~ 33
    imagen3
    imagen4
    FIG 5Ay FIG 5B: prueba de ¡nclusión/exclusión de eae
    F!G 5A:
    i eae (Ensayo 29128) i 43 r................................. ■ ...........................................................................................................—...........................................•............................................................ ■ .....................-................-.................................................................... - ■ i
    ....................... ................i.........T...............................................................................................................................................................................................
    1£ 1 -ii i-í................Mi..........illlll iíl........................4 5 ¡(¡!¡ í ¡ »t 11- i-‘V,’A',J r K O N ¡N 5! r nj ri 7 J 7 N N -i ** '5 ^ N. W _¡ JV - _ O i*- ('• LO CS o l* »— * St ?'* i.-' r: C' S >: p- J- C. S 'Z « r~ r» ¡T C -r — s * ______-T__________ _ - ___________________. ^ ^ «t SE OE
    i................¡:” i : - isr;..........1..................................................................iviííí't:"ti't4ÉinÍ....................VÍsnv;;;Tí.............¡i; ........*..............................................................................................................................................................................................................................¡h ........|...............|^p5tHpi‘..........................................................................................................................................................................p j «! o ¿1 o .T, ri w s í í n ^ rs 3 «• O n o H S" M S r? « Ci >• Si zf- .’■» 5Í O ■j'- C LO tó » IT vv O ¡C Z O n O w 5Í 7- C* * » ® —• •£ &■ «« — ?-«• S■ T -* C- S a. « K ft e¡ -ci; í_¡ u¿ w '■+* r U.’ u.' -t LaJ u. uj r- — W w *r L«. L— lf ^ ¿ ¿ i ¿ ^ a. Ct ce ce cc «*£ ,(c
    FiG 53:
    eae (Ensayo 29131)
    : i ;
    . ¡; ; ,jl j j ;
    h:
    .....PUlp:, Si;i!lí,ísl !i íl! ■ : ll ¡í¡|],s# i |
    ¡}1
    III I-- ..... íhílESílíi ■■Rlfet .... .... ‘i iíi.:i;p : lpTl-h i Sííü^íis t ..L.,.Ü>.«S iLL:,.L...
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    o:
    —
    i. .uj.í............
    FIG. 6: Ensayos múltiples frente a sencillos del DOE F1G 6A:
    Valores de Ct
    imagen5
    0157 stcl SSt¡2 C3
    Objetivo
    FIGfiB-
    Valores de Rn
    imagen6
    I 0157;?!/ sti} ts; PC
    Objetivo
  16. 100.000 copias (lisado)
    FIG: 7Ay 7B
    Múltiplex de confirmación del desempeño de STEC (n = 7 experimentos, no ICP)
    imagen7
    Múltiplex de confirmación del desempeño de STEC (n = 7 experimentos, no ICP)
    imagen8
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