ES2682962T3 - Control y caracterización de estados psicóticos - Google Patents

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ES2682962T3 ES11838895.8T ES11838895T ES2682962T3 ES 2682962 T3 ES2682962 T3 ES 2682962T3 ES 11838895 T ES11838895 T ES 11838895T ES 2682962 T3 ES2682962 T3 ES 2682962T3
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Abstract

Un método de inducción de psicosis en un mamífero no humano, que comprende una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal, en donde la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO:1, comprendiendo dicho método la activación con luz de la opsina sensible a la luz, en el que la activación con luz de la opsina induce despolarización de la membrana celular, en virtud de lo cual se induce un estado psicótico en el mamífero.

Description

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DESCRIPCION
Control y caracterizacion de estados psicoticos Campo de la invencion
La presente solicitud se refiere a metodos para inducir psicosis en animales no humanos utilizando protelnas opsina sensibles a la luz, expresadas en las membranas plasmaticas de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal y a metodos para identificar o cribar un compuesto que puede utilizarse para tratar psicosis.
Antecedentes de la invencion
La esquizofrenia afecta a aproximadamente un 1 % de la poblacion mundial y se encuentra entre las 10 primeras causas de discapacidad en los palses desarrollados, sin embargo, las farmacoterapias actuales suelen ser ineficaces e inducen graves efectos secundarios que limitan el tratamiento. Esta muy extendida la creencia de que tras una disfuncion de la corteza prefrontal (CPF) subyacen muchos de los aspectos mas debilitantes de la esquizofrenia (1, 2); sin embargo, no ha sido posible establecer la relacion causal de aspectos especlficos de la fisiologla celular con la disfuncion prefrontal en la esquizofrenia. Para investigar un posible fundamento en las celulas de la conducta psicotica y la cognicion deteriorada observada en la esquizofrenia y las afecciones relacionadas, los autores de la invencion han tratado de identificar patrones de comportamiento celular que (1) tienen lugar en neuronas pertinentes para las conductas psicoticas, (2) derivan de multiples manipulaciones farmacologicas o geneticas relacionadas con la esquizofrenia y (3) retienen la validez aparente como endofenotipos celulares para psicosis.
Se cree que muchos aspectos debilitantes de la esquizofrenia son el resultado de una disfuncion de la corteza prefrontal, aunque la fisiologla de dicha disfuncion sigue siendo un misterio, ya que los patrones de actividad patogenicos especlficos en las neuronas prefrontales siguen siendo desconocidos. Identificar y comprender las rutas neuronales relacionadas con los patrones de actividad relacionados con la psicosis dentro de la region de la PFC puede ayudar a descubrir terapias farmacologicas para tratar a pacientes con esquizofrenia. Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de un sistema de modelo animal util para la esquizofrenia que permita identificar estas intrincadas rutas patogenicas neuronales. Dicho sistema de modelo animal permitirla el cribado y la identificacion de terapias farmacologicas para mejorar los patrones patogenicos de actividad neuronal que contribuyen a los slntomas de la esquizofrenia.
Arenkiel et al., Neuron 54, 205-218, 19 de abril de 2007, describe la activacion inducida por luz in vivo en un circuito neuronal en ratones transgenicos que expresan canal rodopsina-2. Wang et al., Proc Natl. Acad. Sci EE. UU. 104, 8143-8148, 2007 describe un mapeo de alta velocidad de conectividad sinaptica utilizando fotoestimulacion en ratones transgenicos con canalrodopsina-2. Miella et al., Psychophannacology (2010) 211:355-366, describe los papeles contrarios de dopamina y orexina en consumo excesivo de alcohol inducido por quinpirol en un modelo de rata con polidipsia psicotica. La patente estadounidense 2009/0088680 se refiere a un metodo de interfaz de tejido optico y un aparato para estimular celulas. La patente estadounidense 2008/0060088 se refiere a ratones en los que se ha desactivado fosfolipasa C beta como sistema de modelo para analizar farmacos de esquizofrenia. La patente internacional 2010/056970 describe la estimulacion optica de celulas diana utilizando luz, p.ej., in vivo o in vitro. Yizhar et al., Nature 477, 171-178, 2011 describe el equilibrio excitacion/inhibicion neocortical en el procesamiento de information y disfuncion social. La patente internacional WO 2012/061744 describe opsinas de funcion escalonada y metodos para su uso.
Sumario de la invencion
La presente invencion proporciona un metodo para inducir psicosis en un mamlfero no humano que comprende una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal, en el que la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1, comprendiendo dicho metodo la activacion de la opsina sensible a la luz con luz, en el que la activacion con luz de la opsina induce la despolarizacion de la membrana celular, en virtud de lo cual se induce un estado psicotico en el mamlfero.
La invencion proporciona asimismo un metodo de cribado de un compuesto que puede ser util para el tratamiento de psicosis, comprendiendo dicho metodo: medir un estado psicotico de un mamlfero no humano antes y despues de administrar el compuesto en la corteza prefrontal del mamlfero, en el que el mamlfero no humano comprende una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal, en el que la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1, y en el que el estado psicotico esta inducido por activacion de luz de la opsina sensible a la luz, en el que la activacion de luz de la opsina induce la despolarizacion de la membrana; en el que una mejora en una o mas mediciones del estado
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psicotico tras la administracion del compuesto indica que el compuesto puede ser util para el tratamiento de psicosis.
La invention proporciona asimismo un metodo de cribado de un compuesto que puede ser util para el tratamiento de psicosis, que comprende: medir la respuesta celular en un corte de tejido de corteza prefrontal, obtenido de un mamlfero no humano que comprende una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal antes y despues de incubar el corte de tejido con el compuesto, en el que la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1, en el que la respuesta celular esta inducida por la despolarizacion de la membrana de las neuronas inducidas por la activation de la opsina sensible a la luz; en el que una mejora en las lecturas de la respuesta celular tras la incubation con el compuesto indica que el compuesto puede ser util para el tratamiento de psicosis.
La presente divulgation establece tambien (“proporciona”) una serie de productos y metodos, tal como se explica en el presente documento a continuation, que pueden facilitar la comprension de la presente invencion, que se define en las reivindicaciones.
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento animales no humanos que comprenden una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal, en los que la activacion con luz de la opsina induce la despolarizacion de la membrana, y en los que la iluminacion del opsina con la luz induce la psicosis del animal. En algunas realizaciones, el subconjunto de neuronas piramidales de la capa V tiene una unica dendrita apical grande. En algunas realizaciones, la opsina se selecciona del grupo que consiste en ChR2, VChRI y DChR. En otra realization, la opsina se selecciona del grupo que consiste en SFO, SSFO, C1V1, C1V1-E122T, C1V1-E162T y C1V1-E122T / E162T.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento metodos para inducir psicosis en un animal no humano que comprenden expresar una opsina sensible a la luz en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal del animal, en los que la opsina induce la despolarizacion de la membrana con luz, y en los que la iluminacion de la opsina con la luz induce la psicosis del animal. En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento metodos para inducir psicosis en un animal no humano, que comprenden activar una opsina sensible a la luz con luz, en los que la opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal del animal, y en los que la activacion con luz de la opsina induce la despolarizacion de la membrana celular e induce psicosis en el animal. En algunas realizaciones, el subconjunto de neuronas piramidales de la capa V tiene una unica dendrita apical grande. En algunas realizaciones, la opsina se selecciona del grupo que consiste en ChR2, VChR1 y DChR. En otra realizacion, la opsina se selecciona del grupo que consiste en SFO, SSFO, C1V1, C1V1-E122T, C1V1-E162T y C1V1-E122T/E162T.
En otros aspectos, se proporcionan en el presente documento cortes de tejido de corteza prefrontal que comprenden un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V, en los que una opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de las dendritas apicales en las neuronas piramidales de la capa V y la activacion con luz de la opsina sensible a la luz induce la despolarizacion de la membrana. En algunas realizaciones, el subconjunto de neuronas piramidales de la capa V tiene una unica dendrita apical grande. En algunas realizaciones, la opsina se selecciona del grupo que consiste en ChR2, VChR1 y DChR. En otra realizacion, la opsina se selecciona del grupo que consiste en SFO, SSFO, C1V1, C1V1-E122T, C1V1-E162T y C1V1-E122T / E162T.
En otros aspectos mas, se proporcionan en el presente documento metodos de selection de un compuesto que puede ser util para tratar la psicosis, que comprende medir el estado psicotico de un animal no humano antes y despues de administrar el compuesto a la corteza prefrontal del animal, en el que el estado psicotico es inducido por la activacion con luz de una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular en las neuronas piramidales de la capa V de un sujeto animal, y la activacion de la opsina induce la despolarizacion de la membrana; en el que una mejora en una o mas de las mediciones del estado psicotico despues de la administracion del compuesto indica que el compuesto puede ser util para tratar la psicosis. En algunas realizaciones, la medicion del estado psicotico es una medicion de la conducta. En algunas realizaciones, la medicion del estado psicotico es una medicion celular. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas una etapa de administracion de un agonista de D2 al animal antes de la administracion del compuesto.
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento metodos de seleccion de un compuesto que puede ser util para tratar la psicosis, que comprende: medir un estado psicotico de un corte de tejido de corteza prefrontal antes y despues de incubar el corte de tejido con el compuesto, en los que el corte de tejido de corteza prefrontal comprende neuronas piramidales de la capa V del sujeto y se expresa una opsina sensible a la luz en la membrana celular de las neuronas piramidales de la capa V del sujeto, en los que el estado psicotico es inducido por la despolarizacion de la membrana de las neuronas inducida por la activacion de la opsina sensible a la luz; en los que una mejora en una o mas de las lecturas del estado psicotico tras la incubacion con el compuesto indica que el compuesto puede ser util para tratar psicosis. En algunas realizaciones, la medicion del estado psicotico es una medicion celular. En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas una etapa de incubacion de un agonista de D2 con el corte de tejido de la corteza prefrontal antes de la incubacion con el compuesto.
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La presente divulgacion se refiere a la identificacion de poblaciones de celulas neuronales relacionadas con diversos trastornos psiquiatricos, tal como se describe en el presente documento. Si bien la presente divulgacion no se limita necesariamente a dichos contextos, es posible apreciar diversos aspectos de la invencion a traves de la explicacion de ejemplos en los que se aplican estos y otros contextos.
Los aspectos de la presente divulgacion estan dirigidos a un metodo para identificar poblaciones de celulas neuronales relacionadas con diversos trastornos psiquiatricos. El metodo incluye proporcionar estimulacion optica a una poblacion de neuronas diana que expresa una opsina sensible a la luz. Se mide un primer patron electrico de una poblacion de celulas neuronales diana como respuesta a la estimulacion optica. A continuacion, se introduce un farmaco, conocido por inducir un trastorno de interes, en la poblacion de celulas neuronales diana. Se vuelve a proporcionar estimulacion optica a la poblacion de neuronas diana. Se mide un subsiguiente patron electrico de la poblacion de celulas neuronales diana, como respuesta a la estimulacion optica. Se comparan el primer patron electrico y el subsiguiente patron electrico. La comparacion de los patrones electricos puede servir para determinar, por ejemplo, que neuronas participan en la creacion de un estado de tipo patologico. Una vez identificada una poblacion especlfica de neuronas, pueden focalizarse los posibles tratamientos posteriores en la poblacion especlfica de neuronas. Alternativamente, se pueden realizar otros estudios de la poblacion especlfica de neuronas para determinar los mecanismos que se esconden tras la conducta aberrante, por ejemplo.
Los aspectos de la presente divulgacion estan dirigidos a comparar la actividad electrica de una poblacion de neuronas diana de interes antes y despues de introducir un farmaco conocido por inducir un trastorno de interes. Se proporciona un estlmulo antes y despues de introducir el farmaco y se comparan los patrones de respuesta electrica con el farmaco. El estlmulo puede ser, por ejemplo, un estlmulo optico, un estlmulo electrico o un estlmulo magnetico.
En ciertas realizaciones especlficas, se selecciona un area de interes dentro del cerebro. Dicha seleccion puede realizarse sobre la base del conocimiento previo en lo que respecta a la funcion del cerebro y los mecanismos por los cuales funcionan los farmacos focalizados en los trastornos psiquiatricos. Por ejemplo, anteriormente, se han relacionado las neuronas piramidales de la capa V con ciertas formas de psicosis. Los aspectos de la presente divulgacion permitieron identificar un subconjunto de neuronas piramidales relacionadas con la conducta psicotica examinando las neuronas piramidales de la capa V aplicando una combinacion de estimulacion optica e induccion de la conducta aberrante en un sujeto mediante la introduccion de sustancias que, segun se ha observado previamente inducen la conducta aberrante.
Dicha identificacion de una poblacion de neuronas relacionada con la conducta psicotica permite el examen eficiente de posibles tratamientos para diversas conductas psicoticas. Una vez conocida la reaccion de una neurona en particular durante la psicosis y que se ha comparado con la reaccion cuando no se ha introducido la psicosis, es posible examinar diversos tratamientos basados en la capacidad del tratamiento para devolver la reaccion neuronal a su estado basal.
Ciertos aspectos de la presente divulgacion tambien estan dirigidos tambien a obtener una mejor comprension de los mecanismos dentro del cerebro y una poblacion de neuronas en particular que causa psicosis. Una vez identificada una neurona de interes en particular, pueden estudiarse con mayor detalle los canales dentro de la neurona, as! como las rutas que conectan la neurona con otras neuronas. Esto puede conducir a una nueva introspeccion en lo que respecta a la causa de diversas formas de psicosis.
La presente divulgacion se refiere ademas a poblaciones de celulas neuronales especlficas relacionadas con diversos trastornos psiquiatricos, incluyendo psicosis (y/o slntomas de psicosis), tal como se describe en el presente documento. Si bien la presente divulgacion no esta necesariamente limitada en estos contextos, es posible apreciar diversos aspectos de la invencion a traves de la explicacion de ejemplos en los que se utilizan estos y otros contextos.
Aspectos de la presente divulgacion estan dirigidos a un metodo para implicar una poblacion de celulas neuronales especlfica relacionada con diversos trastornos psiquiatricos, incluyendo psicosis (y/o los slntomas de psicosis). Dicho metodo incluye proporcionar estimulacion optica a una poblacion de neuronas diana que expresa una opsina sensible a la luz. Se mide un primer patron electrico de una poblacion de celulas neuronales diana como respuesta a la estimulacion optica. A continuacion, se introduce un farmaco, conocido por inducir los slntomas de la psicosis, en la poblacion de celulas neuronales diana. Se vuelve a proporcionar estimulacion optica a la poblacion de neuronas diana. Se mide un subsiguiente patron electrico de la poblacion de celulas neuronales diana, como respuesta a la estimulacion optica. Se comparan el primer patron electrico y el subsiguiente patron electrico. La comparacion de los patrones electricos puede emplearse para determinar, por ejemplo, que neuronas participan para crear un estado de tipo patologico. Una vez identificada una poblacion de neuronas especlfica, los posibles tratamientos posteriores pueden dirigirse a la poblacion de neuronas especlfica. Alternativamente, se pueden realizar otros estudios de la poblacion de neuronas especlfica para determinar los mecanismos que se esconden tras la conducta aberrante, por ejemplo. En ciertas realizaciones, los estudios adicionales pueden realizarse utilizando diversos estlmulos que incluyen estlmulos opticos, estlmulos electricos y/o estlmulos magneticos.
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Aspectos de la presente divulgacion estan dirigidos a inducir una patologla controlando las propiedades de una poblacion de neuronas diana conocida por su relacion con la psicosis. Las neuronas de la poblacion de neuronas diana tienen una unica dendrita apical grande. La poblacion de neuronas diana se modifica con una molecula sensible a la luz. Se proporciona luz a la poblacion de neuronas diana, activando as! la molecula sensible a la luz. Se introduce un farmaco en la poblacion de neuronas diana, lo que provoca que el potencial de membrana de las neuronas permanezca elevado despues de la eliminacion de la luz. El potencial de membrana elevado tiene como resultado una respuesta celular modificada al estlmulo, as! como la activacion de la neurona cuando no esta presente el estlmulo. Los resultados experimentales muestran que un sujeto, que tiene esta actividad neuronal inducida en ciertas poblaciones de neuronas que tienen una unica dendrita apical grande presenta conductas que se corresponden con la psicosis.
En realizaciones mas especlficas, dicha actividad neuronal modificada se emplea para ayudar a determinar posibles tratamientos para la psicosis. Es posible inducir la patologla antes de examinar diversos posibles tratamientos. Las pruebas pueden incluir introducir el tratamiento en las neuronas, estimular las neuronas y comparar la respuesta en presencia del tratamiento con la respuesta en ausencia de tratamiento.
Las personas especializadas en la materia podran apreciar diversas realizaciones relacionadas y/o en las que se aplique esta metodologla y estos aparatos, particularmente a la vista de las figuras y/o la siguiente explication. La description general expuesta no pretende describir todas las realizaciones ilustradas ni todas las implementaciones de la presente divulgacion. Para mayor information sobre los detalles de otras realizaciones, experimentos y aplicaciones que pueden combinarse en diversos grados con las directrices del presente documento, se remite a las directrices y referencias que subyacen en ellas proporcionadas en los ejemplos que forman parte del presente documento de patente.
Breve descripcion de los dibujos
Las distintas realizaciones ilustrativas podran comprenderse mas exhaustivamente considerando la siguiente descripcion detallada en conexion con los dibujos adjuntos, en los que:
La FIG. 1 demuestra conductas de tipo psicotico inducidas por estimulacion optica de neuronas piramidales de la capa V infrallmbica en ratones transgenicos Thy1::ChR2. A) Representation esquematica de la colocation de fibra optica unilateral sobre la corteza infrallmbica. B) Imagenes confocales de cortes coronales de corteza prefrontal en ratones Thy1::ChR2-EYFP, que muestran la colocacion de fibra optica sobre la corteza infrallmbica de la capa V (panel izquierdo) y la expresion de ChR2-EYFP en neuronas de capa V (panel derecho). C) La estimulacion optica de baja frecuencia de neuronas de capa V con 473 nm de luz azul (10 Hz, duration de pulso 5 ms) disminuyo significativamente la exploration social de crlas jovenes en 6 de 6 animales Thy1::ChR2-EYFP examinados (p = 0,03 ; intercalando perlodos de luz encendida / luz apagada ). D) Compendio de los datos de los efectos de la estimulacion de 10 Hz en la exploracion social, tal como se muestra en (A). E) Compendio de los datos de campo abierto que no presentan ningun efecto de la estimulacion optica de 10 Hz sobre la velocidad total (izquierda) o la longitud del rastro (derecha) de los animales Thy1::ChR2. F) La estimulacion optica de banda gamma de las neuronas de capa V con 473 nm de luz azul (40 Hz, duracion de pulso 5 ms) elimino con mas potencia aun la exploracion social de una crla joven en 6 de 6 animales examinados (p <0,01; intercalando perlodos luz encendida / sin luz epocas). G) Compendio de los datos de los efectos de la estimulacion de 40 Hz en la exploracion social tal como se muestra en (F). H) La estimulacion optica de 40 Hz aumento
significativamente el tiempo pasado en una postura rlgida catatonica en 3 de 6 ratones examinados (p <0,05), y se observo una tendencia a aumentar el tiempo dedicado a movimientos repetitivos de la cabeza de un lado a otro en 2 de 6 ratones examinados (p = 0,13).
La FIG. 2 muestra que el agonista de D2 quinpirol modula las respuestas de las redes prefrontales in vitro a la estimulacion de ChR2 en ratones transgenicos Thy1::ChR2. A) Respuestas de una neurona piramidal de capa V a una sucesion de destellos de luz (470 nm, 1 ms) en condiciones de control (superior, rastro negro) y con quinpirol (20 pM, rastro inferior morado). Despues de aplicar quinpirol, algunos destellos de luz que
anteriormente suscitaban potenciales de action dejan de hacerlo (flechas), aparecen algunos potenciales de
action nuevos no relacionados con los destellos de luz ("+") y se observan potenciales estables ("p"). B)
Despues de aplicar quinpirol (20 pM, rastro central morado), esta neurona piramidal de la capa V presenta una despolarizacion prolongada que dura mas que el perlodo de estimulacion con luz y produce potenciales de accion. Tras la eliminacion por lavado del quinpirol y la aplicacion haloperidol (1 pM, rastro inferior verde) se elimina la despolarizacion prolongada. C) La informacion que aporta la tasa de potenciales de accion transmite el Indice de destellos de luz en las neuronas piramidales de la capa V en la que el quinpirol provoca una despolarizacion dependiente de actividad (n = 8 celulas en control y 20 pM quinpirol; n = 4 celulas en haloperidol 0.2- 2 pM o sulpirida 5 pM). D) La tasa de potenciales de accion en funcion del Indice de destellos de luz, para las neuronas piramidales de la capa V en las que el quinpirol provoca una despolarizacion dependiente de la actividad (tal como se ilustra en B) (n = 4 celulas en cada condition, haloperidol 0,2-2 pM; sulpirida 5 pM). El control (rastro superior que termina en la portion derecha de (D)), el rastro de quinpirol (rastro central que termina en la porcion derecha de (D)) y haloperidol / sulpirida (rastro inferior que termina en la porcion derecha de (D)) se muestran en (D). E) El numero de potenciales de accion en funcion del intervalo entre disparos para las mismas celulas representadas en C. El control (rastro superior que comienza desde la porcion izquierda de
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(E)), quinpirol (rastro central que comienza desde la porcion izquierda de (E)), y el rastro de haloperidol / sulpirida (el rastro inferior que comienza en la porcion derecha de (E)) se muestra en (E). F) respuestas de una neurona piramidal de la capa V (en la que quinpirol provoca una despolarizacion dependiente de la actividad) a una combinacion de ChR2 y actividad activada por red despues de un solo destello de luz de 1 ms en condiciones de control (rastro negro; rastro superior que termina en la porcion derecha de (F)), quinpirol (20 pM, rastro morado, rastro inferior que termina en la porcion derecha de (F)) y quinpirol + sulpirida (5 pM; rastro verde; rastro central que termina en la porcion derecha de (F)) Las flechas indican el pico AHP.
La FIG. 3 demuestra que la activacion del receptor D2 provoca una despolarizacion dependiente de la actividad mediada por canales de Ca2+ de tipo L. A, C, G) Respuestas de las neuronas piramidales de la capa V a los pulsos de corriente hiperpolarizantes y/o despolarizantes en diversas condiciones farmacologicas. B) Morfologla de las neuronas piramidales de la capa V que presentan (izquierda) y no presentan (derecha) despolarizacion dependiente de actividad y la postdespolarizacion durante las respuestas a los pulsos de corriente despolarizante en quinpirol (respuestas a pulsos de corriente despolarizantes e hiperpolarizantes debajo de cada celula). D) Arriba: constantes de tiempo para la desintegracion del potencial de membrana en un 63 % o 90 % hacia el valor basal despues de un pulso de corriente despolarizante de 250 pA en condiciones de control (negro, barra izquierda) o quinpirol (morado, barra derecha). Debe advertirse que se han excluido 3 celulas que se vuelven biestables en quinpirol (es decir, el potencial de la membrana no vuelve al valor basal durante > 1 segundo). Abajo: el potencial de membrana (relativo a el valor basal) 10 ms despues del final de un pulso de corriente despolarizante de 250 pA en condiciones de control (negro) o quinpirol (morado). E) Fraccion de neuronas piramidales de la capa V con un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote que presento una postdespolarizacion (ADP) despues de la inyeccion de corriente despolarizante, bloqueo de despolarizacion de los pulsos de accion (bloque de despol.), biestabilidad o disparo persistente que duro mas que el perlodo de inyeccion de corriente despolarizante, tras la aplicacion de 20 pM de quinpirol. F) Espectro de potencia de la actividad persistente observada en quinpirol despues de un pulso de corriente despolarizante (calculado a partir del rastro en el panel A).
La FIG. 4 muestra que la fenciclidina (PCP) tambien provoca una despolarizacion dependiente de actividad a traves de canales de Ca2+ de tipo L. A) Respuestas de una neurona piramidal de capa V a los pulsos de corriente despolarizantes. Despues de aplicar PCP (5 pM, dos rastros centrales), la neurona presenta una postdespolarizacion y disparo persistente que duran mas que el perlodo de inyeccion de corriente. Estos no son revertidos por el del antagonista D2 sulpirida (5 pM; rastro verde), sino que son bloqueados por el antagonista del canal de Ca2+ del tipo L nifedipina (10 pM; rastro gris). B) Fraccion de las neuronas piramidales de la capa V con un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote que presento postdespolarizacion (ADP) despues de la inyeccion de corriente despolarizante, bloqueo de despolarizacion de potenciales de accion (bloque de despol), biestabilidad o disparo persistente que duro mas que el perlodo de inyeccion de la corriente despolarizante tras la aplicacion de 5 pM de PCP. C) Arriba: nifedipina deteriora la exploracion social de una manera dependiente de la dosis (n = 8 ratones en cada grupo). Abajo: PCP deteriora la exploracion social, pero la nifedipina mejora dicho deficit en ratones tratados con PCP de una manera dependiente de la dosis (n = 8 ratones en cada grupo). D) Respuestas de neuronas piramidales de la capa V a los pulsos de corriente hiperpolarizante y despolarizante en un raton de tipo silvestre, y en el raton en el que se ha activado TS2neo disenado como una ganancia CACNA1C funcion genica (20). * = p <0,05, ** = p <0,01. El efecto estuvo presente en 4/4 de las celulas mutantes y 0/5 de las celulas de tipo silvestre con un gran combamiento y despolarizacion de rebote como respuesta a la inyeccion de corriente hiperpolarizante (p <0,01 por la prueba exacta de Fisher).
La FIG. 5 muestra un modelo, de acuerdo con una realizacion ilustrativa de la presente divulgacion.
La FIG. 6 muestra un metodo de identificacion de una celula de interes, de acuerdo con una realizacion ilustrativa.
La FIG. 7 muestra un modelo para caracterizar trastornos neuronales, de acuerdo con una realizacion ilustrativa de la presente divulgacion.
La FIG. 8 muestra un metodo para determinar la eficacia de un tratamiento, de acuerdo con una realizacion ilustrativa.
Si bien la divulgacion es susceptible de varias modificaciones y formas alternativas, en los dibujos se muestran y se describiran con detalle elementos especlficos de la misma a modo de ejemplos. Sin embargo, debera entenderse que no se pretende limitar la divulgacion a las realizaciones particulares descritas. Por el contrario, se pretende cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que entren dentro del alcance de la divulgacion, incluyendo los aspectos definidos en las reivindicaciones.
Descripcion detallada de la invencion
En el presente documento, se describen animales no humanos con psicosis inducida por activacion de una opsina sensible a la luz expresada en la membrana plasmatica de neuronas piramidales de la capa V de la corteza prefrontal de un sujeto, en los que la activacion de la opsina sensible a la luz induce la despolarizacion de la membrana. Se proporcionan tambien los cortes de tejido de la corteza prefrontal de los animales no humanos. La divulgacion proporciona asimismo metodos de induccion de psicosis en animales no humanos y metodos para identificar o seleccionar un compuesto que puede utilizarse para tratar psicosis utilizando animales no humanos y los cortes de tejido descritos en el presente documento.
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Tal como se utiliza en el presente documento, un "animal" es un mamlfero. Los mamlferos incluyen, pero sin limitarse a ellos, seres humanos, animales de granja, animales de competicion, mascotas (p.ej., perros y gatos), primates, ratones, ratas y otros roedores.
Tal como se usa en el presente documento, la forma singular "un", "una" y "el/la" incluye las referencias en plural a no ser que se indique lo contrario.
Tecnicas generates
La puesta en practica de la presente invencion empleara, a no ser que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologla molecular, microbiologla, biologla celular, bioqulmica, qulmica de acidos nucleicos, inmunologla, fisiologla, urologla y la fisiopatologla de la adiccion a las drogas y conductas relacionados con la recompensa, muy conocidos entre las personas especializadas en la materia. Dichas tecnicas estan explicadas exhaustivamente en la bibliografla, como por ejemplo Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion (Sambrook y Russel, 2001) (a las que se hace referencia de forma conjunta en el presente documento como "Sambrook"); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., Eds., 1987, incluyendo los suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., Eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York; Harlow y Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (a las que se hace referencia de forma conjunta en el presente documento como "Harlow and Lane"), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000), Handbook of Experimental Immunology, 4a edicion (D.M. Weir & Cc Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); y Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987). Otras referencias utiles incluyen Principles of Internal Medicine de Harrison (McGraw Hill; J. Isseleacher et al., Eds.) y Addiction Research Methods, (Miller et al., Eds., 2010, Wiley-Blackwell, Reino Unido).
Protelnas opsina sensibles a la luz
En el presente documento se proporcionan composiciones de tipo optogenetico y metodos para despolarizar selectivamente neuronas piramidales de la capa V de la corteza prefrontal de un sujeto en los que la despolarizacion de dichas neuronas induce la psicosis del animal. En algunas realizaciones, se induce esquizofrenia. Optogenetica se refiere a la combinacion de metodos geneticos y opticos empleados para controlar eventos especlficos en celulas diana de tejido vivo, incluso dentro de mamlferos que se mueven libremente y otros animales, con la precision temporal (milisegundo-escala de tiempo) necesaria para seguir el ritmo del funcionamiento de sistemas biologicos intactos. La optogenetica requiere la introduccion de un canal sensible a la luz rapido o el bombeo de protelnas en las membranas plasmaticas de las celulas neuronales diana que permitan la manipulacion temporalmente precisa del potencial de la membrana neuronal al mismo tiempo que se mantiene la resolucion del tipo de celula a traves del uso de mecanismos de direccionamiento especlficos.
Las opsinas sensibles a la luz que pueden utilizarse en la presente invencion incluyen opsinas que inducen la despolarizacion de la membrana celular de las neuronas con la luz. En la Tabla 1 a continuation, se muestran Ejemplos de dichas opsinas.
La Tabla 1 muestra las opsinas identificadas por excitation y modulation a traves del espectro visible:
Tipo de Opsina
Origen biologico Longitud de onda Sensibilidad Accion definida
VChRl
Volvox carteri 589 nm utilidad 535 nm max. Excitacion (Despolarizacion)
DChR
Dunaliella salina 500 nm max. Excitacion (despolarizacion)
ChR2
Chlamydomonas reinhardtii 470 nm max. 380-405nm utilidad Excitacion (despolarizacion)
ChETA
Chlamydomonas reinhardtii 470 nm max. 380-405nm utilidad excitacion (despolarizacion)
SFO
Chlamydomonas reinhardtii 470 nm max. 530 nm max. Excitacion (despolarizacion) Inactivation
SSFO
Chlamydomonas reinhardtii 445 nm max. 590 nm; 390-400 nm Activation de tipo escalonado(despolarizacion) Inactivacion
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C1V1
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 542 nm max. Excitation (despolarizacion)
C1V1 E122
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 546 nm max. Excitacion (despolarizacion)
C1V1 E162
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 542 nm max. Excitacion (despolarizacion)
C1V1 E122/E162
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 546 nm max. Excitacion (despolarizacion)
Tal como se utiliza en el presente documento, una opsina sensible a la luz (como ChR2, VChRI, DChR y ChETA) incluye protelnas naturales y variantes funcionales, fragmentos, protelnas de fusion que comprenden los fragmentos o la protelna de longitud completa. En algunas realizaciones, el peptido senal puede eliminarse. Una variante puede tener una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia de la protelna natural. Una variante funcional puede tener la misma funcion de despolarizacion o una similar a la de la protelna natural.
Motivos de aminoacidos de transporte intracelular potenciados
La presente divulgacion proporciona la modification de protelnas opsina sensibles a la luz, expresadas en una celula mediante la adicion de uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos que potencian el transporte a las membranas plasmaticas de celulas de mamlfero. Las protelnas opsina sensibles a la luz que tienen componentes derivados de organismos evolutivamente mas simples pueden no ser expresadas o toleradas por celulas de mamlfero o pueden presentar un emplazamiento sub-celular alterado cuando se expresan a altos niveles en celulas de mamlfero. En consecuencia, en algunas realizaciones, las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en una celula pueden fusionarse con uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos seleccionados del grupo que consiste en un peptido senal, una senal de exportation de retlculo endoplasmico (ER), una senal de trafico de membrana y/o una senal de exportacion de golgi N-terminal. El uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos que potencian el transporte de protelna opsina sensible a la luz a las membranas plasmaticas de celulas de mamlfero se pueden fusionar con los extremos N-terminal, C-terminal o tanto el extremo N-terminal como al extremo C-terminal de la protelna opsina sensible a la luz. Opcionalmente, la protelna opsina sensible a la luz y el uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos se pueden separar mediante un engarce. En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz puede modificarse mediante la adicion de una senal de trafico (ts) que potencia el transporte de la protelna a la membrana plasmatica de la celula. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede derivarse de la secuencia de aminoacidos del canal de potasio rectificador hacia adentro humano Kir 2.1 En otras realizaciones, la senal de trafico puede comprender la secuencia de aminoacidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
Otros motivos de protelna adicionales que pueden potenciar el transporte de protelna opsina sensible a la luz a la membrana plasmatica de una celula se describen en la solicitud de patente estadounidense N° 12 / 041.628. En algunas realizaciones, la secuencia de peptido senal en la protelna se puede suprimir o sustituir con una secuencia de peptido senal de una protelna diferente.
Protelnas del canal sensibles a la luz
En algunos aspectos, la protelna opsina sensible a la luz es una protelna canal sensible a la luz. En algunos aspectos de los metodos proporcionados en el presente documento, se expresan en las membranas plasmaticas del subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal uno o mas miembros de la familia Canalrodopsina de canales ionicos sensibles a la luz.
En algunos aspectos, la protelna del canal de cationes sensible a la luz puede derivarse de Chlamydomonas reinhardtii, en los que la protelna del canal cationico puede ser capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando se ilumina la celula con luz. En otra realization, la protelna del canal cationico sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en SEQ ID NO: 1. La luz utilizada para activar la protelna del canal cationico sensible a la luz derivada de Chlamydomonas reinhardtii puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 460 y aproximadamente 495 nm o puede tener una longitud de onda de aproximadamente 470 nm. Asimismo, la luz puede tener una intensidad de al menos aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activation del canal cationico sensible a la luz derivado de Chlamydomonas reinhardtii con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede causar el empobrecimiento sinaptico inducido por despolarizacion de
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las neuronas que expresan el canal cationico sensible a la luz. La protelna del canal cationico sensible a la luz puede comprender adicionalmente sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a longitudes de onda de luz en particular y/o aumentar o disminuir la capacidad de la protelna del canal de cationes sensible a la luz para regular el estado de polarizacion de la membrana plasmatica de la celula. Asimismo, la protelna del canal de cationes sensible a la luz puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o una o mas sustituciones de aminoacidos no conservadoras. La protelna del canal cationico sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene convenientemente la capacidad de despolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal como respuesta a la luz.
En otras realizaciones, la protelna del canal cationico sensible a la luz puede ser una protelna opsina con funcion escalonada (SFO) o una protelna opsina estabilizada con funcion escalonada (SSFO) que puede tener sustituciones de aminoacidos especlficas en posiciones clave en todo el bolsillo de union retinal de la protelna. En algunas realizaciones, la protelna SFO puede tener una mutacion en el resto aminoacido C128 de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la protelna SFO tiene una mutacion C128A en la SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la protelna SFO tiene una mutacion C128S en SEQ ID NO: 1. En otra realizacion, la protelna SFO tiene una mutacion C128T en SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, la protelna SSFO puede tener una mutacion en los restos aminoacido C128 y D156 de SEQ ID NO: 1. En otras realizaciones, la protelna SSFO tiene una mutacion C128S y una mutacion D156A en la SEC ID N: 1. En algunas realizaciones, la protelna SFO puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96% , 97 %, 98%, 99 % o 100 % identica a la secuencia presentada en SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO:3.
En otras realizaciones, la protelna del canal cationico sensible a la luz puede ser una protelna quimerica C1V1 derivada de la protelna VChR1 de Volvox carteri y la protelna ChR1 de Chlamydomonas reinhardtii, en la que la protelna comprende la secuencia de aminoacidos de VChR1 que tiene al menos la primera y la segunda helice transmembrana reemplazadas por la primera y la segunda helice transmembrana de ChR1; es sensible a la luz; y es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando se ilumina la celula con luz. Por otra parte, en algunas realizaciones, se describen en el presente documento polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos sustituidas o mutadas, en las que el polipeptido mutante retiene la naturaleza sensible a la luz caracterlstica del polipeptido quimerico C1V1 precursor, pero tambien puede poseer propiedades alteradas en algunos aspectos especlficos. Por ejemplo, las protelnas quimericas C1V1 sensibles a la luz mutantes descritas en el presente documento pueden presentar un mayor nivel de expresion tanto dentro de una celula animal como en la membrana plasmatica de la celula animal; una alteracion de la capacidad de respuesta cuando se expone a diferentes longitudes de onda de luz, particularmente luz roja; y/o una combinacion de rasgos en virtud de los cuales el polipeptido C1V1 quimerico posee las propiedades de baja desensibilizacion, desactivacion rapida, activacion con escasa iluminacion violeta para una minima activacion cruzada con otros canales cationicos sensibles a la luz y/o fuerte expresion en celulas animales. En algunas realizaciones, la proteina C1V1 puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100% identica a la secuencia que se presenta en las SEQ ID NO: 4, 5, 6 o 7.
En la publicacion de solicitud de patente estadounidense N° 2007/0054319 y en las publicaciones de solicitud de patente internacional No. WO 2009/131837 y WO 2007/024391 se pueden encontrar otras divulgaciones relacionadas con proteinas del canal cationico sensibles a la luz. Otras divulgaciones relacionadas con las proteinas SFO o SSFO se pueden encontrar en la publicacion de solicitud de patente internacional N° WO 2010/056970 y en las solicitudes de patente provisional estadounidense N° 61/410.704 y 61/511.905. Otras divulgaciones relacionadas con los canales de cationes quimericos C1V1 asi como variantes mutantes de los mismos se pueden encontrar en las solicitudes de patente provisional estadounidenses N° 61/410,736, 61/410,744 y 61/511,912.
Polinucleotidos que codifican proteinas opsina sensibles a la luz
La divulgacion proporciona tambien polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una proteina opsina sensible a la luz descrita en el presente documento. En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende un casete de expresion. En algunas realizaciones, el polinucleotido es un vector que comprende el acido nucleico descrito. En algunas realizaciones, el acido nucleico que codifica una proteina opsina sensible a la luz de la divulgacion esta unido operativamente a un promotor. Los promotores son muy conocidos en la tecnica. Puede utilizarse cualquier promotor que funcione en una interneurona colinergica para la expresion de las proteinas sensibles a la luz y/o cualquier variante de las mismas de la presente divulgacion. Las regiones o los promotores de control de iniciacion que son utiles para conducir la expresion de las proteinas opsina sensibles a la luz, o variantes de las mismas, en una celula animal especifica, son numerosas y conocidas entre las personas especializadas en la tecnica. Practicamente puede usarse cualquier promotor capaz de conducir estos acidos nucleicos. En algunas realizaciones, el promotor utilizado para conducir la expresion de la proteina sensible a la luz puede ser el promotor 1 del antigeno del timo (Thy1), que es capaz de conducir una robusta expresion de transgenes en neuronas piramidales de la corteza prefrontal (Vease, p.ej., Arenkiel et.al., Neuron 54, 205 (19 de abril de 2007)).
Asimismo, se proporcionan en el presente documento vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que
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codifica una protelna opsina sensible a la luz o cualquier variante de la misma descrita en el presente documento. Los vectores que pueden administrarse de acuerdo con la presente divulgacion tambien incluyen vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN (p.ej. ANRm) que, cuando se transcribe desde los polinucleotidos del vector tendra como resultado la acumulacion de protelnas sensibles a la luz en las membranas plasmaticas de las celulas animales diana. Los vectores que se pueden usar incluyen, sin limitacion, vectores lentivirales, HSV, adenovirales y adenoasociados (AAV). Los lentivirus incluyen, pero sin limitarse a ellos VIH-l, VIH-2, SIV, FTV y EIAV. Los lentivirus pueden pseudo-tipificarse con las protelnas de la envoltura de otros virus, entre los que se incluyen, pero sin limitarse a ellos, VSV, rabia, Mo-MLV, baculovirus y Ebola. Dichos vectores pueden prepararse aplicando los metodos convencionales en la tecnica.
En algunas realizaciones, el vector es un vector de AAV recombinante. Los vectores AAV son virus de ADN de tamano relativamente pequenos que pueden integrarse de una manera estable y especlfica del sitio en el genoma de las celulas que infectan. Pueden infectar un amplio espectro de celulas sin inducir ningun efecto sobre el crecimiento celular, la morfologla o la diferenciacion, y no parecen estar relacionadas con patologlas humanas. El genoma de AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Abarca aproximadamente 4700 bases y contiene una region de repeticion terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como un origen de replicacion para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que llevan a cabo las funciones de encapsidacion: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep relacionado con la replicacion viral y la expresion de los genes virales; y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las protelnas de la capside del virus.
Los vectores de AAV pueden prepararse aplicando metodos convencionales en la tecnica. Son adecuados los virus adeno-asociados de cualquier serotipo (vease, p.ej., Blacklow, pags. 165-174 de "Parvovirus and Human Disease" J.R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3: 1, 1974; P. Tattersall "The Evolution of Parvovirus Taxonomy " en Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) pag. 5-14, Hudder Arnold, Londres, RU (2006) y DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski "The Genus Dependovirus" (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, Rm Linden, CR Parrish, Eds.) pag. 5-23, Hudder Arnold, Londres, RU (2006). Los metodos de purificacion de vectores pueden encontrarse, por ejemplo, en las patentes estadounidenses No. 6.566.118, 6.989.264 y 6.995, 006 y WO / 1999/011764 titulada "Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombination AAV Vectors”. La preparacion de vectores hlbridos se describe por ejemplo en la solicitud PCT N° PCT / US2005 / 027091. Se ha descrito el uso de vectores derivados de los AAV para transferir genes in vitro e in vivo (vease, por ejemplo, las publicaciones de solicitud de patente internacional N°: 91/18088 y WO 93/09239; Patentes estadounidenses N°: 4.797.368, 6.596.535 y 5.139.941 y la patente europea N°: 0488528. Dichas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de AAV en las que los genes rep y/o cap se eliminan y reemplazan por un gen de interes, as! como el uso de estas construcciones para transferir el gen de interes in vitro (en celulas cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los AAV recombinantes defectivos de replicacion de acuerdo con la divulgacion pueden prepararse co-transfectando un plasmido que contiene la secuencia de acidos nucleicos de interes flanqueada por dos regiones de repeticion terminal invertida (ITR) de AAV, y un plasmido que transporta los genes de encapsidacion de AAV (genes rep y cap), hacia una llnea celular que esta infectada con un virus ayudador humano (por ejemplo, un adenovirus). Los recombinantes de AAV que se producen se purifican despues a traves de tecnicas convencionales.
En algunas realizaciones, el/los vector(es) para su uso en los metodos descritos en el presente documento se encapsidan en una partlcula de virus (p.ej., partlculas de virus AAV entre las que se incluyen, pero sin limitarse a ellas, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV13, AAV14, AAV15 y AAV16). Por consiguiente, la divulgacion incluye una partlcula de virus recombinante (recombinante porque contiene un polinucleotido recombinante) que comprende cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. Los metodos para producir dichas partlculas son conocidos en la tecnica y se describen en la patente estadounidense N° 6.596.535.
Entrega de protelnas opsina sensibles a la luz
En algunos aspectos, los polinucleotidos que codifican las protelnas opsina sensibles a la luz divulgadas en el presente documento (por ejemplo, un vector AAV) pueden entregarse directamente a las neuronas piramidales de la corteza prefrontal de un animal mediante el empleo de una aguja, un cateter o un dispositivo relacionado, aplicando tecnicas neuroquirurgicas conocidas en la tecnica, como, por ejemplo, por inyeccion estereotactica (vease, p.ej., Stein et al., J. Virol, 73: 34243429, 1999; Davidson et al., PNAS, 97: 3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3: 219 - 223, 1993; y Alisky & Davidson, Hum. Gene Ther. 11: 2315-2329, 2000)o fluoroscopia.
En algunos aspectos, las protelnas opsina sensibles a la luz pueden expresarse en las neuronas piramidales de la corteza prefrontal de un animal transgenico. Por ejemplo, se puede emplear una llnea de raton transgenico usando Cre-recombinasa bajo el control del promotor 1 del antlgeno de celulas del timo (Thy1). Puede inyectarse entonces un vector de virus adeno-asociado (AAV) inducible por Cre que transporta el gen de opsina sensible a la luz estereotacticamente en la corteza prefrontal.
En otros aspectos, cualquiera de las protelnas opsina sensibles a la luz puede expresarse en las neuronas
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piramidales de la corteza prefrontal de un animal transgenico. Por ejemplo, se puede emplear una ilnea de raton transgenico usando ChR2 bajo el control del promotor 1 del antlgeno de celulas del timo (Thy1). Los ratones transgenicos se pueden generar aplicando tecnicas de inyeccion pronuclear convencionales (vease, p. ej., Arenkiel et al., Neuron 54, 205 (19 de abril de 2007)).
Tambien pueden emplearse otros metodos para entregar las protelnas sensibles a la luz a neuronas piramidales, como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, transfeccion con pollmeros o llpidos ionicos, electroporacion, transfeccion optica, empalefaccion o mediante pistola genica.
En algunos aspectos, la divulgacion proporciona animales no humanos generados a traves de cualquiera de los metodos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, los animales no humanos comprenden una protelna opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V de la corteza prefrontal del animal, en la que la opsina induce la despolarizacion de la membrana con la luz, y en la que la iluminacion de la opsina con la luz induce la psicosis del animal. En algunos aspectos, la divulgacion proporciona un corte de tejido de corteza prefrontal que comprende un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V de la corteza prefrontal de un animal no humano, en el que se expresa una opsina sensible a la luz en la membrana celular del subconjunto de neuronas piramidales de la capa V, y la activacion de la opsina con la luz induce despolarizacion de la membrana.
Fuentes de luz
Puede utilizarse cualquier dispositivo que sea capaz de aplicar luz que tenga una longitud de onda para activar las protelnas sensibles a la luz expresadas en una neurona para despolarizar la neurona. Por ejemplo, se puede utilizar un dispositivo de suministro de luz para activar una protelna opsina sensible a la luz que afecte el voltaje de la membrana de una o mas neuronas. Puede configurarse un dispositivo de suministro de luz para que proporcione un estlmulo optico a una region diana del cerebro. El dispositivo de suministro de luz puede comprender una base, una gula de canula, que se fija en la base, y uno o mas conductos opticos fijados en la base a traves de la gula de la canula. La base puede comprender uno o mas puertos de suministro de luz que estan situados para suministrar luz desde los conductos opticos a las regiones de tejido diana, como, por ejemplo, las neuronas piramidales en la corteza prefrontal. Los conductos opticos pueden ser fibras opticas, en las que el extremo proximal de la fibra esta fijado a una fuente de luz optica y el extremo distal esta en comunicacion con los puertos de suministro de luz. La fuente de luz optica puede ser capaz de proporcionar luz continua y/o pulsada y puede programarse para proporcionar luz en secuencias de impulsos predeterminadas. El dispositivo de suministro de luz puede tener cualquier cantidad de conductos opticos que pueda ser deseable, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, etc. Los conductos opticos pueden transportar cada uno luz de la misma o diferente longitud de onda. La luz suministrada puede tener una longitud de onda entre 450 nm y 600 nm, como por ejemplo luz amarilla o verde o azul. El dispositivo de suministro de luz puede tener cualquier cantidad de puertos de suministro de luz como sea deseable, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, etc. En algunas variaciones, puede haber el mismo numero de puertos de suministro de luz que de conductos opticos, mientras que en otras variaciones, puede haber un numero diferente de conductos opticos y puertos de suministro de luz. Por ejemplo, puede haber un unico conducto optico que transmita luz a dos o mas puertos de suministro de luz. Alternativa o adicionalmente, puede conectarse un unico conducto optico a un unico puerto de suministro de luz. Puede configurarse la gula de la canula para ayudar a asegurar y alinear los conductos opticos con los puertos de suministro de luz. En algunas realizaciones, el dispositivo de suministro de luz esta configurado para suministrar luz al subconjunto de neuronas piramidales de la capa V de la corteza prefrontal para inducir la despolarizacion de las protelnas opsina expresadas en la membrana celular del subconjunto de neuronas piramidales de la capa V. Los dispositivos de suministro de luz pueden comprender tambien uno o mas electrodos de medicion que pueden configurarse para medir la actividad neuronal. Por ejemplo, los electrodos de medicion pueden registrar cambios en el potencial de membrana (por ejemplo, potenciales de accion) y/o flujo de corriente a traves de una membrana de una o mas neuronas a medida que las neuronas responden a un estlmulo. En algunas variaciones, los electrodos de medicion pueden medir la respuesta electrica de una o mas neuronas a la estimulacion optica. Los electrodos de medicion pueden ser electrodos extracelulares o intracelulares.
En otros aspectos, el dispositivo de suministro de luz puede ser una fuente de luz implantable que no requiera anclarse flsicamente a una fuente de alimentacion externa. La fuente de luz implantable puede comprender un cuerpo interno, teniendo el cuerpo interior al menos un medio para generar luz que esta configurado para una fuente de alimentacion. En algunas realizaciones, la fuente de alimentacion puede ser una baterla interna para alimentar los medios de generacion de luz. En otra realizacion, la fuente de luz implantable puede comprender una antena externa para recibir energla electromagnetica por transmision inalambrica desde una fuente externa para alimentar los medios de generacion de luz. La energla electromagnetica transmitida de forma inalambrica puede ser una onda de radio, una microonda o cualquier otra fuente de energla electromagnetica que pueda transmitirse desde una fuente externa para alimentar los medios de generacion de luz de la fuente de luz implantable. En una realizacion, los medios de generacion de luz se controlan mediante un circuito integrado producido utilizando semiconductores u otros procedimientos conocidos en la tecnica.
En algunos aspectos, los medios de luz pueden ser un diodo emisor de luz (LED). En algunas realizaciones, el LED
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puede generar luz azul y/o verde. En otras realizaciones, el LED puede generar luz ambar, amarilla y/o azul. En algunas realizaciones, se embeben varios micro LED en el cuerpo interior de la fuente de luz implantable. En otras realizaciones, el medio generador de luz es un diodo laser de estado solido o cualquier otro medio capaz de generar luz. Los medios generadores de luz pueden generar luz que tiene una intensidad suficiente para activar las protelnas sensibles a la luz expresadas en la membrana plasmatica de los nervios proximos a la fuente de luz (como un manguito de luz). En algunas realizaciones, la intensidad de la luz que alcanza las interneuronas colinergicas del NAc o cuerpo estriado producida por los medios de generacion de luz tiene una intensidad de cualquiera entre aproximadamente 0,05 mW/mm2, 0,1 mW/mm2 , 0,2 mW/mm2, 0,3 mW/mm2, 0,4 mW/mm2, 0,5 mW/mm2, aproximadamente 0,6 mW/mm2, aproximadamente 0,7 mW/mm2, Aproximadamente 0,8 mW/mm2, aproximadamente 0,9 mW/mm2, aproximadamente 1,0 mW/mm2, aproximadamente 1,1 mW/mm2, aproximadamente 1,2 mW/mm2, aproximadamente 1,3 mW/mm2, aproximadamente 1,4 mW/mm2, aproximadamente 1,5 mW/mm2, aproximadamente 1,6 mW/mm2, aproximadamente 1,7 mW/mm2, aproximadamente 1,8 mW/mm2, aproximadamente 1,9 mW/mm2, aproximadamente 2,0 mW/mm2, aproximadamente 2,1 mW/mm2 mW/mm2, aproximadamente 2,2 mW/mm2, aproximadamente 2,3 mW/mm2, aproximadamente 2,4 mW/mm2, aproximadamente 2,5 mW/mm2, aproximadamente 3 mW/mm2, aproximadamente 3,5 mW/mm2, aproximadamente 4 mW/mm2, aproximadamente 4,5 mW/mm2, aproximadamente 5 mW/mm2 , aproximadamente 5,5 mW/mm2, aproximadamente 6 mW/mm2, aproximadamente 7 mW/mm2, aproximadamente 8 mW/mm2, aproximadamente 9 mW/mm2 o aproximadamente 10 mW/mm2, inclusive, incluyendo los valores de entre estos numeros.
En algunos aspectos, los medios de generacion de luz pueden activarse externamente mediante un controlador externo. El controlador externo puede comprender un generador de potencia que se puede montar en una bobina de transmision. En algunas realizaciones del controlador externo, puede conectarse una baterla al generador de potencia para proporcionarle energla. Se puede conectar un interruptor al generador de potencia, lo que permite que una persona active o desactive manualmente el generador de potencia. En algunas realizaciones, tras la activacion del interruptor, el generador de potencia puede proporcionar potencia a los medios de generacion de luz en la fuente de luz a traves del acoplamiento electromagnetico entre la bobina de transmision en el controlador externo y la antena externa de la fuente de luz implantable. La bobina de transmision puede establecer un acoplamiento electromagnetico con la antena externa de la fuente de luz implantable cuando esta proxima a ella, para suministrar potencia a los medios de generacion de luz y para transmitir una o mas senales de control a la fuente de luz implantable. En algunas realizaciones, el acoplamiento electromagnetico entre la bobina de transmision del controlador externo y la antena externa de la fuente de luz implantable puede ser un acoplamiento de inductancia magnetica de radiofrecuencia. Cuando se usa acoplamiento de inductancia magnetica de radiofrecuencia, la frecuencia operativa de la onda de radio puede oscilar entre 1 y 20 MHz, inclusive, incluyendo los valores entre estos numeros (por ejemplo, aproximadamente 1 MHz, aproximadamente 2 MHz, aproximadamente 3 MHz) , aproximadamente 4 MHz, aproximadamente 5 MHz, aproximadamente 6 MHz, aproximadamente 7 MHz, aproximadamente 8 MHz, aproximadamente 9 MHz, aproximadamente 10 MHz, aproximadamente 11 MHz, aproximadamente 12 MHz, aproximadamente 13 MHz, aproximadamente 14 MHz, aproximadamente 15 MHz, aproximadamente 16 MHz, aproximadamente 17 MHz, aproximadamente 18 MHz, aproximadamente 19 MHz, o aproximadamente 20 MHz). Sin embargo, es posible utilizar otras tecnicas de acoplamiento, como un receptor optico, infrarrojo o un sistema de telemetrla biomedica (vease, por ejemplo, Kiourti, "Biomedical Telemetry: Communication between Implanted Devices and the External World, Opticon 1826, (8): Spring, 2010).
Se pueden encontrar ejemplos de dispositivos de estimulacion de luz, que incluyen fuentes de luz, en las solicitudes de patente internacional No: PCT/US08 / 50628 y PCT/US09/49936 y en Llewellyn et al., 2010, Nat. Med., 16 (10): 161 - 165.
Metodos para inducir psicosis y cribar compuestos que afectan estados psicoticos
La invencion proporciona metodos para inducir psicosis en un animal no humano que comprenden: administrar un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz al animal no humano, en el que la protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de un subconjunto neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal del animal no humano, y la protelna es sensible a la luz y es capaz de inducir la despolarizacion de la membrana de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V cuando se ilumina con la luz el subconjunto de neuronas piramidales de la capa V, en virtud de lo cual la activacion de la protelna con la luz induce la psicosis en el animal no humano. En algunas realizaciones, se induce esquizofrenia. En algunas realizaciones, se induce una perturbacion de la exploracion social.
La invencion proporciona tambien metodos para inducir la despolarizacion de la membrana de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en un corte de tejido de la corteza prefrontal que comprende: activar una protelna opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular del subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en el corte de tejido de la corteza prefrontal, en el que la protelna opsina sensible a la luz es capaz de inducir la despolarizacion de la membrana de las neuronas con luz.
En algunos aspectos, es posible utilizar los animales no humanos y los cortes de tejido de corteza prefrontal descritos en el presente documento para identificar, cribar o examinar la eficacia de un compuesto que es util para tratar la psicosis (por ejemplo, esquizofrenia). Por ejemplo, la divulgacion proporciona metodos de cribado de un
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compuesto que puede ser util para tratar la psicosis, que comprenden medir el estado psicotico de un animal no humano antes y despues de administrar el compuesto a la corteza prefrontal del animal, en los que se induce el estado psicotico por activacion con luz de una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de neuronas piramidales de la capa V de un sujeto animal, y la activacion de la opsina induce la despolarizacion de la membrana; en los que una mejora en una o mas de las mediciones del estado psicotico tras la administracion del compuesto indica que el compuesto puede ser util para tratar psicosis. En algunas realizaciones, la medicion del estado psicotico es una medicion de la conducta (como la exploracion social). En algunas realizaciones, la medicion del estado psicotico es una medicion celular (como la medicion electrofisiologica de los patrones de despolarizacion que presenta un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V). En otra realizacion, el metodo comprende ademas una etapa de administracion de un agonista D2 (como quinpirol) al animal antes de la administracion del compuesto. En algunas realizaciones, el compuesto puede ser un antagonista de D2 como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, sulpirida y haloperidol. En algunas realizaciones, el compuesto puede ser un antagonista del canal de Ca2+ de tipo L, como, por ejemplo, pero sin limitarse a ella, nifedipina.
La divulgacion proporciona tambien metodos de cribado de un compuesto que puede ser util para tratar la psicosis, que comprenden: medir un estado psicotico de un corte de tejido de corteza prefrontal antes y despues de incubar el corte de tejido con el compuesto, en los que el corte de tejido de corteza prefrontal comprende neuronas piramidales de la capa V de un sujeto y se expresa una opsina sensible a la luz en la membrana celular de las neuronas piramidales de la capa V del sujeto, en el que se induce el estado psicotico por la despolarizacion de membrana de las neuronas inducida por la activacion de la opsina sensible a la luz; en el que una mejora en una o mas de las lecturas del estado psicotico despues de la incubacion con el compuesto indica que el compuesto puede ser util para tratar la psicosis. En algunas realizaciones, la medicion del estado psicotico es una medicion celular. En otra realizacion, comprende ademas una etapa de administracion de un agonista D2 (como quinpirol) con el corte de tejido de la corteza prefrontal antes de la incubacion con el compuesto. En algunas realizaciones, el compuesto puede ser un antagonista de D2 como, por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, sulpirida y haloperidol. En algunas realizaciones, el compuesto puede ser un antagonista del canal de Ca2+ de tipo L como, por ejemplo, pero sin limitarse a ella, nifedipina.
Realizaciones ilustrativas
Se cree que la presente divulgacion es util para identificar poblaciones de celulas neuronales relacionadas con diversos trastornos psiquiatricos. Las aplicaciones especlficas de la presente invencion facilitan la evaluacion de modelos de enfermedad relacionados con poblaciones de celulas neuronales relacionadas con diversos trastornos psiquiatricos. Dado que muchos aspectos de las realizaciones ilustrativas divulgadas en el presente documento se relacionan y se basan significativamente en desarrollos previos en este campo, la siguiente explicacion compendia dichos desarrollos previos a fin de proporcionar una solida comprension de los fundamentos y las directrices que subyacen en ellas, a partir de las cuales se pueden extraer detalles y modificaciones de implementacion incluyendo los que se incluyen en los ejemplos. En este contexto, se proporciona la siguiente explicacion. Si bien la presente invencion no esta limitada necesariamente a dichas aplicaciones, se podran apreciar varios aspectos de la invencion a lo largo de la explicacion de los distintos ejemplos, dentro de este contexto.
Las realizaciones y aplicaciones especlficas explicadas en el presente documento (incluyendo los Ejemplos) pueden implementarse en conexion con uno o mas de los aspectos, realizaciones e implementaciones descritos, as! como con los que se muestran en las figuras y se describen a continuation. Se puede hacer referencia a los siguientes Ejemplos. Para mas detalles sobre las moleculas y opsinas sensibles a la luz, incluyendo metodologla, dispositivos y sustancias, puede hacerse referencia tambien a la siguiente publication de antecedentes: publication de patente estadounidense N° 2010/0190229, titulada "System for Optical Stimulation of Target Cells" para Zhang et al.; La publicacion de patente estadounidense N° 2010/0145418, tambien titulada "System for Optical Stimulation of Target Cells” para Zhang et al.; y la publicacion de patente estadounidense No. 2007/0261127, titulada " System for Optical Stimulation of Target Cells" para Boyden et al. De acuerdo con estas publicaciones, es posible utilizar numerosas opsinas en celulas de mamlfero in vivo e in vitro para proporcionar estimulacion optica y control de celulas diana. Por ejemplo, cuando se introduce ChR2 en una celula, la activacion de la luz de ChR2 canalrodopsina tiene como resultado la excitation y el disparo de la celula. En los casos en los que se introduce NpHR en una celula, la activacion con luz de la opsina de NpHR tiene como resultado la inhibicion de la celula. Estos y otros aspectos de las divulgaciones de las solicitudes de patente a las que se ha hecho referencia pueden ser utiles para implementar diversos aspectos de la presente divulgacion.
En algunos aspectos, se proporcionan en el presente documento metodos de identification de poblaciones neuronales relacionadas con trastornos psiquiatricos que comprenden: proporcionar estimulacion optica a una poblacion de neuronas diana que expresa una opsina sensible a la luz, medir un primer patron electrico de la poblacion de neuronas diana como respuesta a la estimulacion optica , introducir un farmaco, conocido por inducir psicosis a la poblacion de neuronas diana, proporcionar estimulacion optica a la poblacion de neuronas diana, medir un patron electrico posterior de la poblacion de neuronas diana como respuesta a la estimulacion optica, y comparar el primer patron electrico con el patron electrico posterior. En otra realizacion mas, identificar un subconjunto de neuronas asociadas con psicosis. En algunas realizaciones, el subconjunto de neuronas es un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V. En algunas realizaciones, la poblacion de celulas neuronales diana esta en un
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paciente. En algunas realizaciones, el farmaco puede ser un agonista de D2 como, por ejemplo, pero sin limitarse a el, quinpirol. En algunas realizaciones, el farmaco puede ser un inhibidor del receptor NMDa como, por ejemplo, pero sin limitarse a ella, fenciclidina.
Volviendo a la FIG. 5, se representa un modelo para identificar celulas de interes con arreglo a una realizacion de la presente divulgacion. Se especifica un area de interes dentro del cerebro (500). El area de interes puede seleccionarse sobre la base de las caracterlsticas previamente identificadas de una enfermedad de interes o las funciones conocidas del area, por ejemplo. Se modifican con opsina uno o mas tipos de celulas dentro del area de interes (510). Cada uno de los diferentes tipos de celulas puede modificarse con una opsina diferente que responde a una longitud de onda de luz diferente. En ciertas realizaciones alternativas, se modifican los diferentes tipos de celulas con la misma opsina, pero en diferentes muestras o pacientes. Se estimulan los diferentes tipos de celulas en el area de interes (520) con luz visible en un intervalo que se determina sobre la base de la opsina utilizada para modificar el tipo de celula particular que se esta estimulando. Se observa la respuesta de cada tipo de celula (580). Se introduce un farmaco conocido por inducir un estado en particular en un paciente cuando se lo observa a nivel macro (en lugar de a nivel celular) en el area de interes (530). Se observa la respuesta de cada tipo de celula en presencia del farmaco (590). Se comparan las respuestas de cada tipo de celula en presencia del farmaco conocido por inducir el estado en particular (540) con la respuesta del mismo tipo de celula a la estimulacion cuando las celulas estan en un estado "normal" o "natural" (es decir, sin que este presente el farmaco). Sobre la base de dicha comparacion, se puede determinar si participan o no uno o mas de los tipos de celulas en la creacion del estado desencadenado por el farmaco (550). Si una o mas de las respuestas en presencia del farmaco difieren de las respuestas del valor inicial, puede seguir investigandose el tipo de celula con la respuesta que ha cambiado para determinar si el tipo de celula participa o no en causar la induction del estado en particular.
En diversas realizaciones alternativas y complementarias, se puede estudiar un area de interes in vivo (560), in vitro (570) o ambos. En realizaciones que estudian un area de interes in vitro, se pueden utilizar cortes del area de interes que mantienen intactos los circuitos neuronales. Se utilizan varios conjuntos de cortes, con un tipo de celula diferente dentro del area de interes que se modifica en cada conjunto. Alternativamente, se puede estudiar una sola celula de cada tipo de celula en el area de interes. El metodo alternativo in vitro permite observar la respuesta de la celula en aislamiento, as! como su efecto sobre las celulas circundantes. El uso de varios conjuntos de cortes o celulas individuales permite utilizar un solo tipo de opsina para modificar todos los tipos de celulas diferentes sin provocar que todas las celulas se disparen a la vez.
En realizaciones que estudian un area de interes in vivo, es posible utilizar varios sujetos modificando un tipo de celula diferente en cada sujeto. Alternativamente, se pueden utilizar diferentes opsinas excitatorias, sensibles a diferentes longitudes de onda de luz para modificar los diferentes tipos de celulas en el area de interes.
En ciertas realizaciones mas especlficas, el area de interes es la capa V de la corteza prefrontal. Se modifican las neuronas piramidales de la capa V. Se cree que la corteza prefrontal esta relacionada con estados psicoticos como la esquizofrenia. Se introduce un farmaco como quinpirol o PCP en las neuronas piramidales de la capa V. Al comparar la respuesta de las celulas antes de introducir el farmaco con la respuesta despues de introducir el farmaco, se ha observado experimentalmente que un subconjunto de las neuronas piramidales de la capa V tiene una respuesta diferente. Este subconjunto de neuronas piramidales de la capa V puede utilizarse para estudiar la eficacia de diversos tratamientos para la esquizofrenia u otras psicosis.
Volviendo a la FIG. 6, se divulga un metodo para determinar un tipo de celula de interes. Se selecciona un tipo de celula diana (600). La selection de la celula diana puede realizarse basandose en resultados experimentales previos. Se estimulan las celulas diana y se observa la respuesta a la estimulacion (610). En ciertas realizaciones mas especlficas, la estimulacion de las celulas diana se consigue activando una molecula sensible a la luz introducida en las celulas diana. Se induce psicosis (620). Esto se puede conseguir introduciendo un farmaco conocido por inducir psicosis en un sujeto. Se vuelve a estimular las celulas diana y se observa la respuesta (630). Se compara la respuesta de las celulas diana antes de inducir la psicosis y despues de inducir la psicosis (640). La comparacion puede utilizarse para determinar si las celulas diana participan o no en causar la psicosis en el sujeto basandose en si las celulas reaccionan de forma diferente o no en presencia del farmaco conocido por inducir la psicosis.
En ciertas realizaciones de la presente divulgacion, tanto un agonista D2, como quinpirol, como un farmaco psicotomimetico, como fenciclidina ("PCP"), producen conductas similares a la esquizofrenia en seres humanos y animales. Si bien estos y otros farmacos actuan a traves de diferentes receptores de neuronas, ambos farmacos inducen un fenotipo de despolarizacion dependiente de actividad en un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal ("PFC"). La despolarizacion dependiente de actividad en estas neuronas interrumpe el flujo de information a traves de las neuronas y tiene una relation causal con conductas sociales de tipo slntomas negativos.
Diversos aspectos de la presente divulgacion se refieren a las caracterlsticas de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal. Las caracterlsticas del subconjunto incluyen la despolarizacion dependiente de actividad que provoca biestabilidad e interrumpe el flujo de informacion a traves de estas
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neuronas. La biestabilidad disruptiva depende de un subtipo de canal Ca2+ (el canal de tipo L). Anteriormente, se ha relacionado dicho canal con la esquizofrenia. Asimismo, al mismo tiempo que la despolarizacion de las neuronas subconjunto crean un fenotipo no social, el bloqueo de los canales de tipo L corrige la disfuncion social inducida por psicotomimeticos.
Ciertos aspectos de la presente divulgacion se refieren a la identificacion de posibles fundamentos celulares de la conducta psicotica y la cognicion deteriorada tal como se observa en la esquizofrenia y otras afecciones relacionadas. Las herramientas optogeneticas sirven para activar las celulas sin introducir una fuente electrica externa. Esto permite observar una respuesta a la activacion de una poblacion de celulas diana que ha sido infectada con una opsina, por ejemplo, sin que se activen otras celulas en el area tambien y alteren los resultados. En ciertas realizaciones, la respuesta de una celula se observa en el estado "natural" de las celulas, es decir, sin la presencia de un estlmulo adicional conocido por causar cambios de conducta a un macro nivel. A continuacion, se compara dicha respuesta con la respuesta de la celula de interes despues de haber introducido un estlmulo.
Ciertos aspectos de la presente divulgacion se refieren a la busqueda de neuronas especlficas relacionadas con la disfuncion prefrontal en la esquizofrenia u otras psicosis. Se puede seleccionar un area del cerebro o tipo de celula neuronal en particular para un posterior examen, como puedan ser las neuronas piramidales de la capa V dentro de la PFC. Las neuronas piramidales de la capa V son de interes por lo que respecta a la esquizofrenia y otras formas de psicosis, ya que los receptores D2 en la PFC estan concentrados las neuronas piramidales de la capa V y los receptores D2 son conocidos por desempenar un papel en la esquizofrenia. Asimismo, las neuronas piramidales de la capa V son neuronas de respuesta de la neocorteza y son responsables de senales incluyendo la descarga del corolario.
Varios aspectos de la presente divulgacion sirven para verificar la conexion que existe entre los trastornos psiquiatricos y neuronas concretas. Se modifican las neuronas de interes para expresar canalrodopsina-2 (ChR2) in vivo. Se estimula ChR2 en las neuronas modificadas. Se cuantifica el deterioro cognitivo y otros slntomas negativos como resultado de la estimulacion. En los modelos en los que se emplean ratones transgenicos Thy1::Chrl18, la expresion de ChR2 esta localizada en las neuronas piramidales de la capa V en la PFC. Una estimulacion optica moderada (por ejemplo, 470 nm, 0,4 mW, 5 ms a 10 Hz) es suficiente para alterar la exploracion social de los ratones sin afectar la locomocion normal. Aumentar la frecuencia de estimulacion (por ejemplo, 470 nm, 0,4 mW, 2,5 ms a 40 Hz) anula practicamente por completo la conducta social y provoca diversas conductas de tipo catatonico. La evaluacion de estos resultados lleva a concluir que las celulas que expresan ChR2 contribuyen a conductas de tipo psicotico. En ciertas realizaciones, un hallazgo como este sirve como base para investigar nivel de circuito las celulas que expresan la opsina.
Ciertos aspectos de la presente divulgacion se refieren a la combinacion de la activacion de opsina con manipulaciones farmacologicas de celulas diana de interes. El agonista de D2 quinpirol provoca conductas de tipo esquizofrenia en animales. Quinpirol se puede administrar in vivo, o se puede aplicar en cortes del area de interes. Cuando se utilizan cortes, se estudia la actividad de red suscitada con luz. Tal como se explica en los Ejemplos, incluyendo la FIG. 2A, la aplicacion de quinpirol cambia las respuestas de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V. El cambio en la respuesta de la celula incluye algunos destellos de luz que dejan de suscitar potenciales de accion, nuevos potenciales de accion no relacionados con destellos de luz y potenciales de niveles estables. Los perlodos de potenciales de accion de alta frecuencia van seguidos una despolarizacion prolongada que dura decenas o cientos de milisegundos mas que la estimulacion directa. En ciertos casos, esta despolarizacion prolongada provoca un aumento de los potenciales de accion. En otros casos, la despolarizacion produce una despolarizacion de tipo nivel estable por encima del potencial de accion umbral.
La induccion de una respuesta anormal utilizando un farmaco conocido por inducir psicosis permite examinar la eficacia de farmacos antipsicoticos, as! como confirmar los mecanismos de los antipsicoticos conocidos. Por ejemplo, la aplicacion del farmaco antipsicotico haloperidol invierte el efecto del quinpirol en las celulas diana. De forma similar, el antagonista de D2 especlfico sulpirida tambien invierte los efectos de quinpirol en las celulas diana cuando se utiliza en las dosis correctas. Vease los ejemplos para una mayor explication sobre el efecto de quinpirol, haloperidol y sulpirida en los receptores D2, la tasa de potencial de accion y otras caracterlsticas de la celula diana.
Tal como se ha explicado brevemente, se observo que un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V presentaba despolarizacion dependiente de actividad cuando estaba presente quinpirol. Es posible identificar el subconjunto de celulas con esta reaction por un combamiento prominente y un rebote despues de la despolarizacion como respuesta a un pulso de corriente hiperpolarizante cuando no esta presente quinpirol. Las neuronas piramidales de la capa V sin el combamiento prominente ni rebote no presentan despolarizacion dependiente de actividad en presencia de quinpirol. Las dos subpoblaciones de neuronas piramidales no difieren en su resistencia al estlmulo o en las constantes de tiempo de la membrana. Sin embargo, las celulas que presentan la despolarizacion dependiente de la actividad tienden a estar ligeramente mas despolarizadas en reposo.
En ciertas realizaciones mas especlficas, todas las neuronas de ratones transgenicos Thy1: ChR2 en los que el quinpirol provoca la despolarizacion dependiente de actividad expresan ChR2 intensamente, mientras que, en
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cambio, la mayorla de las neuronas que expresan ChR2 intensamente presentan despolarizacion dependiente de actividad. Por lo tanto, la subpoblacion de neuronas piramidales de la capa V que presenta la despolarizacion dependiente de actividad fue sustancialmente similar a la poblacion activada por ChR2 que tuvo como resultado anormalidades sociales y otras anormalidades conductuales en ratones transgenicos Thy1::ChR2. En ratones transgenicos, la despolarizacion dependiente de actividad puede ser provocada por inyeccion de corriente solamente y no requirio estimulacion optogenetica.
Las celulas que presentan la despolarizacion dependiente de actividad son morfologicamente diferenciadas. El subconjunto de neuronas piramidales de la capa V posee una unica dendrita apical grande que no se bifurca hasta que alcanza las capas superficiales 2/3. Las celulas tambien tienen muchas proyecciones dentro de la capa V. Por el contrario, las celulas sin la despolarizacion dependiente de actividad tienen morfologlas mas heterogeneas, incluyendo dendritas apicales que se ramifican en las capas 4 o 5. Vease los ejemplos para una explication mas profunda de las diferencias entre los subconjuntos de neuronas piramidales de la capa 5.
En ciertas realizaciones de la presente divulgation, se estudian los patrones electrofisiologicos al nivel de una sola celula. La despolarizacion dependiente de actividad parece provocar un abanico de comportamientos celulares destacados, que incluyen una marcada despolarizacion que bloquea aun mas el potencial de action, biestabilidad prolongada, un incremento del potencial de accion provocado por la inyeccion de corriente y una postdespolarizacion que dura mas que el perlodo de estimulaciones directas y puede provocar potenciales de accion adicionales. La biestabilidad se asocia normalmente con la actividad rltmica en la banda beta/gamma. En ciertas realizaciones, los picos de biestabilidad en los espectros de potencia oscilan entre 20 y 40 Hz.
En ciertas realizaciones, el efecto neto de quinpirol sobre la excitabilidad neuronal (p.ej., aumento de los potenciales de accion frente al bloqueo de despolarizacion y fenomenos asociados) dependio de la dosis y la duration de la aplicacion de quinpirol, as! como de la intensidad del estlmulo. En particular, puede producirse un aumento de los potenciales de accion durante la aplicacion temprana de quinpirol o como respuesta a un estlmulo de despolarizacion debil, que se transforma en una despolarizacion prolongada o biestabilidad tras una aplicacion mas prolongada de quinpirol o como respuesta a un estlmulo de despolarizacion mas intenso. La despolarizacion dependiente de actividad puede estar presente en condiciones de control (antes de aplicar quinpirol). Se observo que este fenomeno puede ser provocado en algunas circunstancias por niveles inusualmente elevados de activation del receptor D2 en un corte.
Ciertos aspectos de la presente divulgacion se refieren a la fijacion de voltaje de celula completa. Esto permite identificar corrientes de canales ionicos que llevan a efecto la despolarizacion dependiente de actividad. En el subconjunto de neuronas piramidales de la capa V identificado (explicado anteriormente), las corrientes de Ca2+ dependientes del voltaje contribuyen a la despolarizacion dependiente de actividad. Un influjo de Ca2+ a traves de los canales de tipo L durante un potencial de accion activa las corrientes de K+ dependientes de Ca2+ que desempenan un papel principal en la repolarizacion del potencial de accion. La fuerte activacion de D2 potencia tambien el influjo de Ca2+ a traves de canales de tipo L. Por otra parte, es de esperar que la fuerte activacion de D2 potencie la AHP de potencial de accion y suprima selectivamente el potencial de accion a intervalos cortos entre disparos. Es de esperar que el bloqueo de d2 suprima el reclutamiento de corrientes de K+ dependientes de Ca2+, con el resultado de una repolarizacion del potencial de accion comprometida, potenciales de accion mas amplios, una mayor inactivation del canal de Na+, un umbral de potencial de accion mas alto y menores potenciales de accion a intervalos cortos entre disparos.
En ciertas realizaciones de la presente divulgacion, se comparan los efectos de quinpirol en una poblacion de celulas diana con los efectos de otro psicotomimetico, como fenciclidina (PCP). PCP produce un slndrome muy semejante a la esquizofrenia en seres humanos y lleva utilizandose mucho tiempo para establecer modelos de esquizofrenia en animales. Los efectos psicotomimeticos de PCP se han atribuido durante mucho tiempo al bloqueo del receptor NMDA. Sorprendentemente, se ha observado que a una dosis similar a la que bloquea los receptores NMDA prefrontales, PCP produjo una despolarizacion dependiente de actividad y una postdespolarizacion que duro mas que el perlodo de estimulacion directa que eran practicamente identicas a las provocadas por quinpirol. A diferencia del quinpirol, los efectos no estan bloqueados por sulpirida, pero si estan bloqueados por nifedipina. Esto indica que, si bien PCP no activa receptores d2, si que produce una despolarizacion dependiente de actividad a traves de los canales de Ca2+ de tipo L. PCP produce un abanico de efectos similar a traves de la despolarizacion dependiente de actividad al de quinpirol, incluyendo una postdespolarizacion que dura mas que el perlodo de estimulacion directa, una marcada despolarizacion que bloqueo el potencial de accion, biestabilidad y disparo persistente que dura mas que el perlodo de estimulacion directa. La despolarizacion dependiente de actividad se limita a la subpoblacion de neuronas piramidales de la capa V que presentaron un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote como respuesta a la inyeccion de corriente hiperpolarizante. Cabe destacar que, en algunos casos se observo que PCP provocaba amplios potenciales de accion que fueron bloqueados por nifedipina y que pueden representar potenciales de accion de Ca2+ dendrltico. Durante las respuestas a una sucesion de pulsos de luz en cortes corticales de Thy1::ChR2, PCP (al igual que quinpirol) suprimio los potenciales de accion a intervalos cortos entre disparos, lo cual indica que los efectos de PCP sobre las corrientes de Ca2+ del tipo L (como los del quinpirol) potencian el reclutamiento de corrientes de K+ dependientes de Ca2+ durante los potenciales de accion.
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Quinpirol, psicotomimetico estructural v funcionalmente diferenciado, y PCP convergen hacia un estado neuronal aberrante dependiente del canal de Ca2+ causalmente importante comun. Por consiguiente, PCP, aunque no se haya relacionado anteriormente a este tipo de ruta, parece ejercer parte de su accion psicotomimetica a traves del reclutamiento de canales de Ca2+ de tipo L. En presencia de PCP, el antagonista del canal de calcio de tipo L nifedipina mejora los deficits sociales inducidos por PCP en ratones. La nifedipina tambien reduce la incidencia de conductas de tipo catatonico provocadas por pCp solamente. Las dosis apropiadas de nifedipina reducen niveles excesivos de activacion del canal de calcio, evitando as! potenciales de accion prolongados o biestabilidad, y restablecen la respuesta prefrontal normal y otros comportamientos mediados por la corteza prefrontal.
Al aplicar las respuestas observadas del subconjunto de neuronas piramidales de la capa V a los slntomas observados en pacientes con esquizofrenia y/u otras formas de enfermedad mental, la despolarizacion dependiente de actividad representa un fenomeno celular unico que podrla dar cuenta del comportamiento perseverante y tangencial en redes prefrontales. Por consiguiente, ademas de para inducir despolarizacion dependiente de actividad, se pueden utilizar las neuronas como modelo de enfermedad para estudiar nuevos posibles tratamientos para enfermedades como la esquizofrenia.
Se cree que la presente divulgacion es util para focalizar poblaciones de celulas neuronales especlficas relacionadas con diversos trastornos psiquiatricos y, mas especlficamente, a psicosis y/o slntomas de psicosis. Las aplicaciones especlficas de la presente invencion facilitan la evaluacion, el tratamiento y la caracterizacion de la psicosis y/o los slntomas de la psicosis al focalizarse en poblaciones de celulas neuronales especlficas relacionadas con ellos. Dado que muchos aspectos de las realizaciones ilustrativas divulgadas en el presente documento se refieren y estan construidas sobre desarrollos anteriores en este campo, la explicacion que se expone a continuacion compendia dichos desarrollos previos para proporcionar una solida comprension de los fundamentos y directrices que subyacen en ellos de los que se pueden extraer detalles y modificaciones de su implementacion incluyendo los incluidos en los Ejemplos. Si bien la presente invencion no esta necesariamente limitada a dichas aplicaciones, se pueden apreciar diversos aspectos de la invencion a traves de una explicacion de diversos ejemplos en los que se aplica dicho contexto.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a focalizacion de celulas que son un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V. La focalizacion de estas celulas puede ser particularmente util para generar, estudiar, tratar o caracterizar de otro modo estados psicoticos.
Volviendo a la FIG. 7, se representa un modelo para el control y la caracterizacion de trastornos neuronales con arreglo a una realizacion de la presente divulgacion. Se elige un tipo de celula identificado por su participacion en un trastorno neuronal de interes. Dependiendo de las caracterlsticas y la funcion conocida del tipo de celula, se selecciona un opsina (700) para infectar el tipo de celula identificado. Por ejemplo, en ciertas realizaciones mas especlficas, se elige una opsina excitatoria, como ChR2, para infectar el tipo de celula identificada. Se selecciona ChR2 cuando se desea la excitacion del tipo de celula identificado. El tipo de celula identificado puede modificarse para que presente una conducta aberrante utilizando una segunda opsina o introduciendo un farmaco conocido por inducir la conducta aberrante de la enfermedad cuyo modelo se esta estableciendo. La conducta puede presentarse a nivel macro y puede incluir los signos externos de la enfermedad cuyo modelo se esta estableciendo. En otras realizaciones la conducta de la que se hace un seguimiento es a nivel celular y puede incluir la respuesta de la celula a un estlmulo.
En diversas realizaciones, tal como se representa en la FIG. 7, el tipo de celula identificado puede localizarse y estimularse (705), in vivo (730) o in vitro (725). Es posible estimular el tipo de celula identificado como una sola celula (750) o como parte de un corte de un animal (745), por ejemplo. Para el establecimiento de modelos in vivo (730), el tipo de celula identificado puede estar en un animal transgenico (735) o un ser humano (740), por ejemplo.
Una vez entregada la opsina seleccionada al tipo de celula de interes, se estimula el tipo de celula identificado (705) y se observa la respuesta (720). La respuesta del tipo de celula identificado puede observarse cuando la celula se encuentra en su estado “normal” o cuando se ha inducido una patologla, o en ambos casos. Tras las observaciones iniciales, se selecciona el farmaco de interes. Puede seleccionarse el farmaco basandose en el tipo de celula identificado, la enfermedad cuyo modelo se esta estableciendo, observaciones previas de otros farmacos, una combinacion de estos factores, u otros factores que sirven de gula para determinar posibles farmacos para tratar una enfermedad concreta. Se introduce una dosis inicial del farmaco en la celula identificada (710) y se observa la respuesta de la celula al estlmulo en presencia del farmaco (715). A continuacion, se compara la respuesta con la respuesta de la celula cuando no esta presente el farmaco (755).
En otras realizaciones, se compara la respuesta de la celula en presencia del farmaco de interes con la respuesta de la celula en presencia de un farmaco conocido por inducir una conducta aberrante. Es posible tambien introducir el farmaco de interes en el tipo de celula identificado ademas del farmaco conocido por inducir una conducta aberrante.
En ciertas realizaciones, se modifica la dosis del farmaco de interes y se vuelve a estimular el tipo de celula identificado sobre la base de la evaluacion. La respuesta a la dosis modificada puede compararse entonces con la respuesta en ausencia del farmaco de interes, as! como con la respuesta a la dosificacion previa del farmaco de
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interes. Es posible tambien comparar las respuestas con otros farmacos o tratamientos para la enfermedad cuyo modelo se esta estableciendo. Esto permite determinar la dosis y el farmaco optimos para una enfermedad concreta. Dado que la respuesta observada puede ser una respuesta de conducta o una respuesta celular, se puede determinar una dosis y/o farmaco eficaz a partir de un conjunto de posibles farmacos.
En ciertas realizaciones mas especlficas, un tipo de celula identificado es un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V. Se introduce un farmaco como PCP o quinpirol en el tipo de celula identificado para inducir una conducta aberrante en correspondencia con una patologla cuyo modelo se va a establecer. El tipo de celula identificada se estimula entonces utilizando luz visible que activa la opsina introducida en la celula y se observa la respuesta a la estimulacion. A continuacion se introduce un segundo farmaco, el farmaco de interes, en el tipo de celula identificado. Se observa la respuesta al estlmulo en presencia del farmaco de interes y se compara con la respuesta de la celula en la patologla. Esta comparacion puede servir para determinar la eficacia del farmaco de interes. Puede servir asimismo para determinar si se deberla introducir o no una modification en la dosis u otros aspectos de la administration del farmaco.
Volviendo a la FIG. 8, se representa un metodo para determinar la eficacia de un tratamiento propuesto con arreglo a una realization de la presente divulgation. Se puede producir una conducta aberrante a nivel celular cuando se investiga un tratamiento in vitro. Cuando se investiga un tratamiento in vitro, la conducta aberrante puede ser a nivel celular y/o a nivel macro, incluyendo la conducta observable del paciente. Puede inducirse la conducta aberrante (800) mediante la administracion de un farmaco conocido por causar la conducta aberrante que se va a tratar. Se administra un tratamiento propuesto (810), ya sea al paciente (in vivo) o a una celula (o celulas) (in vitro). Se observa la respuesta de la celula o del paciente al estlmulo en presencia del tratamiento (820). A continuacion, las observaciones sirven para evaluar la eficacia del tratamiento (830).
En diversas realizaciones con arreglo a la FIG. 8, el tratamiento puede ser un farmaco, un estlmulo electrico o un tratamiento conductual, por ejemplo. La respuesta puede ser a un estlmulo de luz, por ejemplo. El estlmulo de la luz puede excitar o inhibir las celulas sobre la base de una molecula sensible a la luz seleccionada introducida en una poblacion celular de interes.
Las distintas realizaciones descritas y presentadas en las figuras pueden implementarse en combination y/o de otras maneras. Uno o mas de los artlculos representados en los dibujos/figuras tambien pueden implementarse por separado o de manera integrada en mayor medida, o eliminarse y/o hacerse no operativos en ciertos casos, segun sea util de acuerdo con las aplicaciones en particular. Por ejemplo, las realizaciones que implican el establecimiento de modelos de la enfermedad, tal como se ha explicado, pueden implementarse empleando diversas opsinas y estlmulos. Asimismo, pueden establecerse modelos in vivo o in vitro. A la vista de la description del presente documento, las personas especializadas en la tecnica reconoceran que es posible introducir muchos cambios en ella.
Ejemplos
A continuacion, se demuestra que el agonista de D2 quinpirol y el psicotomimetico fenciclidina, que producen conductas de tipo esquizofrenia en seres humanos y animales, pero que actuan a traves de diferentes receptores, convergen en un nuevo fenotipo de despolarizacion dependiente de actividad en un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la PFC. Se demuestra que esta despolarizacion dependiente de actividad provoca biestabilidad e interrumpe el flujo de information a traves de estas neuronas y que dicha inestabilidad disruptiva depende de un subtipo de canal de Ca 2+ (el canal de tipo L) que ha sido relacionado con la esquizofrenia. Por ultimo, se demuestra que el endofenotipo celular de estas neuronas tiene una relation causal con las conductas sociales del tipo de slntomas negativos; la despolarizacion selectiva de estas neuronas optogeneticamente crea un fenotipo no social, mientras que el bloqueo de los canales de tipo L corrige la disfuncion social inducida por psicotomimeticos. En conjunto, estos datos definen un nuevo mecanismo celular de disfuncion prefrontal reclutado por mecanismos pertinentes para la esquizofrenia y trastornos relacionados.
Ejemplo 1: conductas de tipo psicotico inducidas en ratones por estimulacion optica de las neuronas piramidales de la capa V infralfmbica que expresan ChR2.
Se opto por realizar la presente investigation en neuronas piramidales de la capa V dentro de la PFC por dos razones. En primer lugar, los receptores D2 en la PFC estan concentrados en las neuronas piramidales de la capa V (3, 4) y los receptores D2 desempenan un crucial papel en la esquizofrenia y otras formas de psicosis (5) ya que todos los antipsicoticos conocidos bloquean el receptor D2, mientras que los farmacos que aumentan los niveles de dopamina (p. ej., L-Dopa, estimulantes) y los agonistas del receptor de dopamina pueden causar psicosis en individuos normales o exacerbar los slntomas en pacientes con esquizofrenia. De hecho, la union a receptores D2 corticales puede explicar especlficamente la eficacia superior de ciertos antipsicoticos, particularmente para los slntomas cognitivos y negativos de la esquizofrenia (6). En segundo lugar, las neuronas piramidales de la capa V son neuronas de respuesta claves de la neocorteza, responsables de las senales que incluyen la descarga del corolario que, cuando es deficiente, podrla contribuir a fallos de autocontrol que producen slntomas psicoticos como alucinaciones auditivas (7).
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Para verificar que estas neuronas contribuyen a la conducta psicotica en ratones, se estimulo canalrodopsina-2 (ChR2) en las neuronas piramidales de la capa V dentro de la PFC (FIG. 1A-B) utilizando ratones transgenicos Thy1::ChR18 perfectamente establecidos, en los que la expresion neocortical de ChR2 esta localizada principalmente en las neuronas piramidales de la capa V (8). Para cuantificar el deterioro cognitivo y los slntomas negativos caracterlsticos de la esquizofrenia, se midio la exploracion social en estos ratones y, para evaluar los slntomas de tipo positivo, se midio la conducta desorganizada o catatonica, incluyendo los movimientos estereotipados y la rigidez.
Materiales y metodos
Se consiguio la estimulacion optica de neuronas piramidales de la capa V infrallmbica que expresan ChR2-EYFP en ratones transgenicos Thy1::ChR2 mediante la colocacion de fibra optica unilateral por encima de la corteza prefrontal infrallmbica (FlG. 1A-B). La estimulacion optica de banda gamma de baja frecuencia y alta frecuencia de neuronas de capa V se consiguio con luz azul de 473 nm (10 Hz, duracion de pulso 5 ms) y luz azul de 473 nm (40 Hz, duracion de pulso 5 ms), respectivamente. Para cuantificar el deterioro cognitivo y los slntomas negativos caracterlsticos de la esquizofrenia, se midio la exploracion social en estos ratones y, para la evaluacion de los slntomas de tipo positivo, se midieron las conductas desorganizadas o catatonicas, incluyendo los movimientos estereotipados y la rigidez.
Resultados
Se observo que una estimulacion optica relativamente moderada (470 nm, 0,4 mW, 5 ms a 10 Hz) fue suficiente para perturbar notablemente la exploracion social sin afectar la locomocion normal (FIG. 1C-E). Especlficamente, la estimulacion optica de baja frecuencia disminuyo la exploracion social de crla joven en 6 de los 6 animales Thy1::ChR2-EYFP examinados (p = 0,03; se intercalan perlodos de luz encendida/luz apagada) (FIG. 1C-D). Los datos de campo abierto demostraron que no hubo diferencia en la velocidad total (izquierda) o longitud del rastro (derecha) de animales Thy1::ChR2 tras la estimulacion optica de baja frecuencia, lo cual indica que la locomocion normal no se vio afectada con una estimulacion moderada (FIG. I-E). El aumento de la frecuencia de estimulacion (470 nm, 0,4 mW, 2,5 ms a 40 Hz) elimino practicamente por completo la conducta social y provoco una serie de conductas de tipo catatonico (FIG. F-H). Especlficamente, el aumento de la frecuencia de estimulacion optica de neuronas piramidales de la capa V elimino practicamente por completo la exploracion social de crla joven en 6 de los 6 animales examinados (p <0,01; intercalando perlodos de luz encendida/luz apagada) (FIG. F-G). Por otra parte, la estimulacion optica de alta frecuencia de 40 Hz aumento significativamente el tiempo empleado en una postura rlgida de tipo catatonico en 3 de los 6 ratones examinados (izquierda; p <0,05) y se observo una tendencia a pasar mas tiempo enganchados en movimientos de la cabeza de un lado a otro repetitivos en 2 de los 6 ratones examinados (a la derecha, p = 0,13) (FIG. 1H). Estos resultados validan aun mas la idea de que la actividad aberrante en neuronas piramidales de la capa V en la PFC puede contribuir a las conductas de tipo esquizofrenico (9) y servir como base para la investigacion a nivel de circuito. Asimismo, estos resultados demuestran que la estimulacion optica de neuronas piramidales de la capa V que expresan ChR2 en una llnea de ratones Thy1::ChR2- EYFP da cabida al empleo de estos ratones como modelo animal para la esquizofrenia.
Ejemplo 2: un agonista de D2 provoca una despolarizacion dependiente de actividad mediada por canales de Ca2+ de tipo L en un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V que es reversible mediante el tratamiento con antagonistas de D2
La estimulacion optica de neuronas piramidales de la capa que expresa ChR2 induce una conducta de tipo esquizofrenico en ratones transgenicos Thy1:ChR2-EYFP. Por lo tanto, se procedio a explorar los procesos a traves de los cuales las manipulaciones farmacologicas pertinentes para la esquizofrenia podrlan afectar a estas neuronas piramidales de la capa V en la PFC. Tal como se ha explicado, los receptores D2 desempenan un papel clave en la esquizofrenia y el agonista de D2 quinpirol provoca conductas de tipo esquizofrenia en los animales (10, 11). Para explorar los procesos a traves de los cuales las manipulaciones farmacologicas pertinentes para la esquizofrenia podrlan afectar a estas neuronas piramidales de la capa V en la PFC, se emplearon cortes prefrontales de ratones Thy1::ChR2 para estudiar la actividad de red suscitada con luz en presencia o ausencia de quinpirol seguido de tratamiento con antagonistas de D2 (FIG. 2 y 3).
Materiales y metodos
Se utilizaron cortes prefrontales de ratones Thy1::ChR2 para estudiar la actividad de red suscitada con luz. Se sometieron a estimulacion con luz cortes de cerebro aislados de ratones transgenicos Thy1::ChR2 in vitro y se llevo un seguimiento de las neuronas piramidales de la capa V mediante registros electrofisiologicos para respuestas celulares una sucesion de destellos de luz (470 nm, 1 ms) en ausencia de un agonista de D2 (control) o presencia de un agonista de D2 (20 pM quinpirol). A continuacion, se lavo el corte de cerebro para eliminar el quinpirol y se trato con 0,2-2 pM de haloperidol o 5 pM de sulpirida, ambos conocidos antagonistas de D2. Se cuantifico la tasa de potencial de accion de las neuronas piramidales de la capa V y la cantidad de informacion transmitida por la tasa de potencial de accion, as! como el numero de potenciales de accion en funcion del intervalo de disparo.
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A continuacion, se trataron las neuronas piramidales de la capa V con pulsos de corriente hiperpolarizantes y/o despolarizantes en presencia de 20 pM de quinpirol solamente o en combinacion con un antagonista de D2, haloperidol (2 pM) o sulpirida (5 pM), o con un antagonista del canal de Ca2+ de tipo L, nifedipina (10 pM). Los registros electrofisiologicos sirvieron para llevar un seguimiento de las respuestas celulares de las neuronas piramidales de la capa V a la estimulacion con luz in vitro cuando se encontraban en las condiciones o los tratamientos farmacologicos.
Resultados
Tal como se ilustra en la FIG. 2A, la aplicacion de quinpirol (20 pM, rastro morado, panel inferior) produjo un marcado cambio en las respuestas de una fraccion sustancial de neuronas piramidales de la capa V, de modo que algunos destellos de luz que antes suscitaban potenciales de accion dejaron de hacerlo (flechas), al mismo tiempo que aparecieron nuevos potenciales de accion, no relacionados con los destellos de luz ("+") y potenciales de nivel estable ("p"). En un subconjunto de celulas piramidales de la capa V, se observo que los perlodos de los potenciales de accion de alta frecuencia fueron seguidos por una despolarizacion prolongada, que duro decenas o cientos de milisegundos mas que la estimulacion directa (FIG. 2B, panel central, rastro morado, observado en 16/26'de neuronas piramidales de la capa V). Esta despolarizacion dependiente de actividad podrla provocar otros potenciales de accion o producir una despolarizacion de tipo nivel estable por encima del umbral de potencial de accion (FIG. 2B). El lavado de quinpirol y la aplicacion simultanea del farmaco antipsicotico haloperidol invirtieron rapidamente este efecto (FIG. 2b, panel inferior, rastro verde, reversion con 0,2-10 pM de haloperidol en 9/9 celulas), al igual que la aplicacion simultanea de quinpirol y el antagonista de D2 especlfico sulpirida (reversion con 5 pM de sulpirida, observado en 2/2 celulas).
Cabe destacar que se observo una curva con forma de U invertida para los efectos de la activacion del receptor D2 sobre la cantidad de informacion que transmitio la tasa de potencial de accion de estas neuronas sobre la tasa de destellos de luz; la cantidad de informacion fue maxima en condiciones de control, intermedia cuando los receptores D2 fueron activados por quinpirol (20 pM) y minima cuando los receptores D2 fueron bloqueados con haloperidol (0,2-2 pM) o sulpirida (5 pM) (FIG. 2C; < 0,05, control frente a quinpirol, p <0,01, control frente a haloperidol/sulpirida, ANOVA de 2 vlas). Se identifico un mecanismo para esta relacion, ya que tambien habla una curva en forma de U para los efectos de la activacion del receptor D2 en los potenciales de accion como respuesta a la estimulacion ChR2: las neuronas presentaron el mayor potencial de accion en condiciones de control y el mlnimo cuando los receptores D2 fueron bloqueados con haloperidol ( 0,2-2 pM) o sulpirida (5 pM) (FIG. 2D; p <0,01, control frente a quinpirol; p <0,001, control frente a haloperidol/sulpirida; ANOVA de 2 vlas). Las tasas de potencial de accion mas bajas cuando los receptores D2 fueron activados por quinpirol o bloqueados con haloperidol o sulpirida se relacionaron especlficamente con la perdida de potenciales de accion a intervalos cortos de disparo (FIG. 2E; n = 4 celulas por grupo) y, de hecho, los efectos de los agonistas y antagonistas de D2 reflejaron aparentemente los efectos sobre los potenciales de accion repetitivos (FIG. 2F). La activacion de D2 con quinpirol (rastro morado) mejoro la posthiperpolarizacion de potencial de accion (AHP, flechas en la FIG. 2F), lo que concuerda con hacer que los impulsos posteriores por debajo del umbral provocaran un segundo potencial de accion en condiciones de control. En cambio, el bloqueo de D2 con sulpirida amplio los potenciales de accion, lo que concuerda con la prevencion de los potenciales de accion a intervalos cortos entre disparos a traves de un mecanismo como la inactivacion del canal de Na+.
Los autores de la invention caracterizaron mejor la despolarizacion dependiente de la actividad. En primer lugar, buscaron determinar si estarla presente en una subpoblacion especlfica de neuronas piramidales de la capa V definidas segun cualquiera de las propiedades electrofisiologicas identificadoras en particular, una matriz de expresion genica o morfologla. Se observo que practicamente todas las celulas piramidales de la capa V con un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote ("*" en la FIG. 3A, panel superior) como respuesta a un pulso de corriente hiperpolarizante presentaron despolarizacion dependiente de actividad tras la aplicacion de 20 pM de quinpirol (16/17 celulas), en cambio 0/9 neuronas piramidales de la capa V sin estas propiedades presentaron la despolarizacion dependiente de actividad tras la aplicacion de quinpirol. Estas dos subpoblaciones de neuronas piramidales no difirieron en su resistencia al estlmulo ni en las constantes de tiempo de membrana, aunque las celulas que presentaron la despolarizacion dependiente de la actividad estaban ligeramente mas despolarizadas en reposo. Cabe destacar que todas las neuronas de los ratones transgenicos Thy1::ChR2 en los que quinpirol provoco la despolarizacion dependiente de actividad expresaron ChR2 intensamente (14/14 celulas); en cambio, la mayorla de las neuronas que expresaron intensamente ChR2 presentaron despolarizacion dependiente de actividad (14/18 celulas). Por tanto, la subpoblacion de neuronas piramidales de la capa V que presento despolarizacion dependiente de actividad fue sustancialmente similar a la poblacion activada por ChR2 que tuvo como resultado anormalidades sociales y otras anormalidades de conducta en ratones transgenicos Thy1::ChR2 (FIG. 1). Cabe destacar que la despolarizacion dependiente de la actividad pudo ser provocada por inyeccion de corriente solamente ("1" en la FIG. 3A, panel central, rastro morado) y no requirio estimulacion optogenetica ni que se manifestara el tipo de actividad de red que se presenta en la FIG. 2, tal como se describe a continuacion. Se identificaron asimismo las caracterlsticas morfologicas relacionadas con la presencia de la despolarizacion dependiente de la actividad que puede estar relacionada con las subredes morfologicas en la capa V de PFC medial descritas (12): las celulas con despolarizacion dependiente de actividad poselan invariablemente una unica dendrita apical grande sin bifurcation hasta alcanzar las capas superficiales 2/3, en combinacion con muchos procesos que se proyectaron dentro de la
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capa V (FIG. 3B; panel izquierdo; n = 5), mientras que, en cambio, las celulas sin despolarizacion dependiente de actividad tuvieron morfologias mas heterogeneas, que incluyeron frecuentemente dendritas apicales que se ramificaban en capas 4 y 0 5 (panel derecho)
Para comprender las consecuencias celulares de este efecto, se exploraron los patrones electrofisiologicos asociados identificados a nivel de celula individual. La despolarizacion dependiente de actividad provoco aparentemente un abanico de comportamientos celulares destacados que incluyeron una marcada despolarizacion que bloqueo un mayor potencial de accion ("2" en la FIG. 3A), biestabilidad prolongada ("3" en la FIG. 3A), un aumento del potencial de accion provocado por la inyeccion de corriente ("4" en la FIG. 3C) y una postdespolarizacion que duro mas que el periodo de estimulacion directa y pudo provocar potenciales de accion adicionales ("5" en la FIG. 3C). Se cuantifico la postdespolarizacion observada mas habitualmente tal como se muestra en la FIG. 3D y en la FIG. 3E se compendian un abanico mas amplio de efectos provocados por quinpirol como fraccion de las neuronas piramidales de la capa V con un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote que presento una postdespolarizacion (ADP) despues de la inyeccion de corriente despolarizante, bloqueo de despolarizacion de potencial de accion (bloque de depol), biestabilidad o disparo persistente que duro mas que el periodo de inyeccion de corriente despolarizante. Cabe destacar que la biestabilidad se asocio normalmente con la actividad ritmica en la banda beta/gamma (FIG. 3F; 4/6 celulas con biestabilidad tenian picos en sus espectros de potencia entre 20 y 40 Hz).
A continuacion, se trato de confirmar que la despolarizacion dependiente de actividad estaba mediada por receptores D2. De hecho, se observo que podia bloquearse utilizando el antipsicotico haloperidol (0,2 - 10 pM; FIG. 3A, panel inferior, rastro verde; 9/9 celulas), o el antagonista de D2 mas especifico sulpirida (5 pM; FIG. 3C, panel inferior, rastro verde, 2/2 celulas). La despolarizacion dependiente de actividad tambien pudo ser provocada con dosis mas bajas de quinpirol; en 8/10 celulas con un combamiento prominente, durante, y postdespolarizacion rebote despues de un pulso de corriente hiperpolarizante, 5 pM (-) Quinpirol o 10 pM de quinpirol provoco despolarizacion dependiente de la actividad y los fenomenos relacionados (p. ej., una postdespolarizacion y/o biestabilidad prolongadas). Tambien encontramos que el efecto neto de quinpirol en la excitabilidad neuronal (p. ej., un aumento del potencial de accion frente al bloqueo despolarizacion y fenomenos asociados) dependio de la dosis y la duracion de la aplicacion de quinpirol, asi como de la potencia del estimulo. En particular, a menudo se observo un aumento de los potenciales de accion durante la aplicacion temprana de quinpirol o como respuesta a un estimulo despolarizante debil, que se transformo en una despolarizacion o biestabilidad prolongada despues de una aplicacion mas prolongada de quinpirol o como respuesta a un estimulo de despolarizacion mas fuerte. En casos aislados, la despolarizacion dependiente de la actividad estaba presente en condiciones de control (antes de aplicar quinpirol), lo que indica que este fenomeno podria ser provocado en algunas circunstancias por niveles inusualmente elevados de activacion del receptor D2 en el corte; de hecho, en tales casos (n = 3), dosis moderadas de haloperidol (0.2 - 2 pM) pudieron convertir la biestabilidad en una postdespolarizacion mas moderada o bloquear la despolarizacion dependiente de la actividad completamente.
A continuacion, se trato de identificar las posibles corrientes de los canales ionicos que median la despolarizacion dependiente de actividad en fijacion de voltaje de celulas completas. Despues de una serie de etapas de 1 ms a 0 mV para simular potenciales de accion, el quinpirol (20 pM) provoco una corriente de despolarizacion de activacion lenta a -30 mV, y aumento una corriente de cola de inactivacion rapida a -60 mV; ambos efectos fueron bloqueados por sulpirida (5 pM). Estas observaciones indican que las corrientes de Ca2+ dependientes de voltaje contribuyen a la
desp°larizaci°n dependiente de actividad y, de hecho, la aplicacion de antagonistas del ca+nal de Ca2+ dependientes de voltaje bloquearon la despolarizacion dependiente de actividad en 5/5 celulas (5 mM Ni o 100 pM nifedipina, n =
2; nifedipina 10 pM, n = 3, Fig. 3G, panel inferior, rastro gris). Este papel para los canales de Ca2+ del tipo L en la
despolarizacion dependiente de actividad puede informar la curva en forma de U sobre los efectos de la activacion
del receptor D2 en el potencial de accion (FIG. 2C-F), cuando el influjo de Ca2+ a traves de los canales de tipo L
durante un potencial de accion activa las corrientes K+ dependientes de Ca2+ que desempenan un papel principal en
la repolarizacion de potencial de accion (13). Seria de esperar que la intensa activacion de D2 mejore el influjo de
Ca2+ a traves de los canales de tipo L (13), aumentara el AHP de potencial de accion y suprimiera selectivamente los
potenciales de accion a intervalos entre disparos cortos; en cambio seria de esperar que el bloqueo de D2
suprimiera el reclutamiento de corrientes de K+ dependientes de Ca2+, lo que resulta en una repolarizacion de
potencial de accion comprometida, potenciales de accion mas amplios, una mayor inactivacion del canal de Na+, un
umbral de canal de accion mas alto y, en ultima instancia, menores potenciales de accion a intervalos cortos entre
disparos.
Ejemplo 3: la fenciclidina (PCP) tambien provoca una despolarizacion dependiente de actividad a traves de canales de Ca2+ del tipo L que es reversible por tratamiento
Una vez estudiados los efectos del quinpirol en las neuronas que median la respuesta prefrontal y que se ha identificado un mecanismo que interrumpe su capacidad para transmitir information, se compararon a continuacion los efectos de quinpirol con los de otro psicotomimetico, fenciclidina (PCP). PCP produce un sindrome que se parece mucho a la esquizofrenia en seres humanos (14) y lleva utilizandose mucho tiempo para establecer un modelo de esquizofrenia en animales.
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Materiales y metodos
Se sometieron a estimulacion de corriente directa cortes de cerebro aislados de ratones transgenicos Thy1::ChR2 y se llevo el seguimiento de una neurona piramidal de la capa V con registros electrofisiologicos de respuestas celulares a pulsos de corriente despolarizantes en ausencia o presencia de 5 pM de PCP. A continuacion, se trato el corte del cerebro con 5 pM de sulpirida o 10 pM de nifedipina y el registro electrofisiologico sirvio para llevar un seguimiento de la respuesta celular al tratamiento. Para cuantificar el deterioro cognitivo y los slntomas negativos caracterlsticos de la esquizofrenia, se midio la exploracion social en ratones tratados con 4-15 mg/kg de nifedipina solamente o en combinacion con 5 mg / kg de PCP.
La fraccion de las neuronas piramidales de la capa V con un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote presento postdespolarizacion (ADP) despues de la inyeccion de corriente despolarizante, bloqueo de despolarizacion de potenciales de accion (bloqueo despol.), biestabilidad o disparo persistente que duro mas que el perlodo de inyeccion de corriente despolarizante, tras la aplicacion de 5 pM de PCP (FIG. 4B). Arriba: nifedipina deteriora la exploracion social de una manera dependiente de la dosis (n = 8 ratones en cada grupo). Abajo: PCP deteriora la exploracion social, pero nifedipina mejora dicho deficit en ratones tratados con PCP de una manera dependiente de la dosis (n = 8 ratones en cada grupo) (FIG 4C). Respuestas de las neuronas piramidales de la capa V a pulsos de corriente despolarizantes y hiperpolarizantes en un raton de tipo silvestre, y en el raton en el que se ha introducido geneticamente TS2neo disenado como un gen de ganancia de funcion CACNA1C (FIG. 4D) (20). * = p <0,05, ** = p <0,01. El efecto estuvo presente en 4/4 celulas mutantes y 0/5 celulas de tipo silvestre con un gran combamiento y despolarizacion rebote como respuesta a la inyeccion de corriente hiperpolarizante (p <0,01 segun la prueba exacta de Fisher).
Resultados
Los efectos psicotomimeticos de PCP se han atribuido durante mucho tiempo al bloqueo del receptor NMDA; sorprendentemente, los autores de la invencion han observado que a una dosis similar a la que bloquea los receptores NMDA prefrontal (5 pM) (15), PCP produjo una despolarizacion dependiente de actividad y una postdespolarizacion que duro mas que el perlodo de estimulacion directa virtualmente identicas a las provocadas con quinpirol (FIG. 4A, observada en 6/12 neuronas piramidales de la capa V). Estos efectos no fueron bloqueados por el antagonista de D2 sulpirida (5 pM, n = 2 celulas), pero fueron bloqueados por el antagonista del canal de Ca2+ de tipo L nifedipina (10 pM, n = 2 celulas), lo cual indica que mientras PCP no activa receptores de D2, como quinpirol, produce una despolarizacion dependiente de actividad a traves de los canales de Ca2+ de tipo L. De manera llamativa, PCP produjo un abanico similar de efectos a traves de la despolarizacion dependiente de actividad que quinpirol, incluyendo una postdespolarizacion que duro mas que el perlodo de estimulacion directa, una marcada despolarizacion que bloqueo el potencial activo, biestabilidad y disparo persistente que duro mas que el perlodo de estimulacion directa (FIG. 4B). La despolarizacion dependiente de actividad se limito una vez mas a la subpoblacion de neuronas piramidales de la capa V que presentaron un combamiento prominente y postdespolarizacion de rebote como respuesta a la inyeccion de corriente hiperpolarizante (se observo despolarizacion dependiente de actividad en 6/9 de estas neuronas y en 0/3 neuronas piramidales de la capa V sin estas propiedades). Cabe mencionar que, en algunos casos, se observo que PCP provoco amplios potenciales de accion que fueron bloqueados con nifedipina y pueden representar potenciales de accion de Ca2+ dendrlticos (FIG. 4A). Por ultimo, durante las respuestas a una sucesion de pulsos de luz en Thy1:: cortes corticales de ChR2, PCP (al igual que quinpirol) suprimio los potenciales de accion a intervalos cortos entre disparos, lo cual indica que los efectos de PCP sobre las corrientes de Ca 2+ de tipo L (al igual que los de quinpirol) potencian el reclutamiento de corrientes de K+ dependientes de Ca2+ durante los potenciales de accion.
Si los psicotomimeticos estructural y funcionalmente diferenciados quinpirol y PCP convergen realmente ante un estado neuronal aberrante dependiente del canal de Ca2+ causalmente importante comun, es posible predecir que PCP (no relacionada previamente con este tipo de ruta) podrla ejercer parte de su accion psicotomimetica al reclutar canales de Ca2+ de tipo L. Para probar esta nueva hipotesis, se midieron los efectos de PCP (5 mg / kg) y del antagonista del canal de calcio de tipo L nifedipina (4, 15 mg / kg) en la conducta social en ratones. De acuerdo con la hipotetica curva de efectos en forma de U, se observo que la nifedipina solamente deterioro la sociabilidad de una manera dependiente de la dosis (FIG. 4C, parte superior; p <0,05, n = 8 ratones por grupo), en cambio, en marcado contraste, la nifedipina mejoro los deficits sociales inducidos por PCP con una dependencia de dosis similar (FIG. 4C, parte inferior; p <0,05; n = 8 ratones por grupo). Por otra parte, nifedipina (15 mg / kg, no se muestra) tambien redujo la incidencia de conductas de tipo catatonico, p.ej., recorridos en clrculo y rigidez, provocadas por PCP solamente (16). Estos datos se ajustan a la hipotesis indicada; nifedipina en solitario reducira la activacion del canal del Ca2+ a niveles que alteran la repolarizacion de potenciales de accion y potenciales de accion repetitivos (en virtud de lo cual se deterioran las conductas mediadas prefrontales), pero en combinacion con PCP, las dosis adecuadas de nifedipina reduciran los niveles excesivos de activacion del canal de calcio (evitando potenciales de accion prolongados y biestabilidad) restaurando as! la respuesta prefrontal normal y rescatando conductas mediadas por la corteza prefrontal.
Explicacion
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Se ha identificado y caracterizado en el presente documento una nueva despolarizacion dependiente de actividad mediada por la activacion del receptor D2; este fenomeno esta presente en un subconjunto definido de neuronas piramidales de la capa V en la PFC que, cuando se activan, generan un conducta de tipo psicotomimetico en ratones. Tambien se ha determinado que dicha despolarizacion dependiente de la actividad genera biestabilidad, potencial de accion aberrante y otros comportamientos celulares que interrumpen el flujo de informacion a traves de dichas neuronas y, por lo tanto, retiene la validez aparente como un mecanismo que podrla contribuir a la disfuncion prefrontal en la esquizofrenia y formas relacionadas de enfermedad mental. Los autores de la invencion han observado que, sorprendentemente, una clase fundamentalmente diferenciada de psicotomimeticos (fenciclidina) tambien provoca una despolarizacion dependiente de actividad similar que fue independiente de la activacion del receptor D2. Por ultimo, se determino que dicha despolarizacion dependiente de actividad compartida depende de los canales de Ca 2+ de tipo L y que el bloqueo de los canales de Ca2+ de tipo L mejora los efectos psicotomimeticos de PCP en la conducta de los ratones.
Estas neuronas de la capa V estan preparadas perfectamente para afectar a los dominios cognitivos alterados en la esquizofrenia. Tal como se muestra segun los efectos de quinpirol, dichas neuronas expresan receptores D2, y los receptores D2 prefrontales estan relacionados con la memoria activa y tareas de cambio de situacion (9, 17); por otra parte, en la PFC, los receptores D2 estan localizados principalmente en las neuronas piramidales de la capa V (4), que envlan respuestas desde la PFC a otras regiones cerebrales. Por lo tanto, a traves de los efectos presentados en la FIG. 1A-D, los canales de Ca2+ del tipo L en estas neuronas de la capa V podrlan alterar profundamente la informacion que fluye fuera de la PFC a regiones del cerebro como el cuerpo estriado (18). Se observa que este hipotetico papel para los receptores D2 en la estimulacion de la respuesta prefrontal podrla complementar la estabilizacion de la actividad del perlodo de retraso con los receptores D1 (19-23) y la estimulacion del estlmulo prefrontal (24) por liberacion fasica de dopamina (25), que preferentemente activarla los receptores D1 (26). Tambien cabrla especular que el abanico de efectos mediados por la despolarizacion dependiente de actividad notificada en el presente documento pudiera ayudar a explicar observaciones cllnicas aparentemente paradojicas. Los pacientes con esquizofrenia u otras formas de enfermedad mental que son agudamente psicoticos a menudo presentan un pensamiento y un discurso muy tangencial y cambian rapidamente de un tema a otro con escasa conexion, si es que la tienen. Sin embargo, estos mismos pacientes, casi al mismo tiempo, tambien pueden ser notablemente perseverantes y ser incapaces de apartar su pensamiento o discurso de una sola idea o palabra. La despolarizacion dependiente de actividad representa un fenomeno de una sola celula que podrla dar cuenta de la conducta tanto perseverante como tangencial en redes prefrontales. Si la activacion de D2 afecta a un subconjunto de neuronas prefrontales que median senales de respuesta que desencadenan respuestas motoras o descargas de corolarios (7, 9, 18, 27) a traves de la despolarizacion dependiente de actividad que potencia el potencial de accion de estas neuronas, los potenciales de accion aberrantes o prolongados resultantes (FIG. 2A,B; FIG. 3C,E) pueden dar lugar a senales de respuesta promiscuas o inapropiadas que se corresponden con la conducta tangencial en procesos mediados por redes corticales. Los niveles extremadamente altos de activacion de D2 pueden a su vez producir biestabilidad (FIG. 3A) o bloqueo de despolarizacion del potencial de accion (FIG. 3A,E), evitando la senalizacion de respuesta y correspondiendose a la conducta de red perseverante o catatonica. Este fenotipo celular puede informar tambien sobre los efectos secundarios de la terapia, ya que el bloqueo del receptor D2 con dosis altas de antipsicoticos suprimira la transmision de informacion prefrontal en esta poblacion clave de neuronas de respuesta (FIG. 2C, D, F, FIG. 3A, C), contribuyendo posiblemente al retraso psicomotor y al Parkinsonismo, tal como se observo cllnicamente. El hecho de que la activacion excesiva y el bloqueo de los receptores D2 puedan producir fenotipos similares (menor potencial de accion) recuerda a otros fenomenos psiquiatricos, p.ej., la curva en forma de U de los efectos de la activacion del receptor Dl (19) y un deterioro neurologico similar causado por sobre-expresion y sub-expresion de MeCP2 (28).
Se ha asociado los canales de Ca 2+ de tipo L con la esquizofrenia en estudios de asociacion de todo el genoma
(29) , aunque hasta ahora no ha habido ninguna hipotesis en cuanto a su papel. De hecho, con escasas excepciones
(30) , ha sido muy diflcil relacionar los canales ionicos en neuronas especlficas con los slntomas de enfermedad psiquiatrica. Asimismo, segun estudios geneticos, se han relacionado los canales de Ca2+ de tipo L con el trastorno bipolar (31), que incluye deficits cognitivos y de tangencialidad similares a los observados en la esquizofrenia (32), y recientemente los autores de la invencion han descubierto que una llnea de raton disenada para generar una alta actividad del canal de Ca2+ de tipo L (33, 34) prolongando las corrientes de tipo L (35) provoca una disfuncion celular similar en las neuronas de la capa V (FIG. 4D). Los autores de la invencion observaron asimismo que el antagonismo del canal de Ca2+ de tipo L deterioro la conducta social, al tiempo que la misma dosis rescata los deficits inducidos por PCP en esta conducta (FIG. 4C). Ocasionalmente, se ha demostrado que dosis moderadas de nifedipina y otros antagonistas del canal de calcio de tipo L pueden ser prometedoras para el tratamiento de la esquizofrenia (36-38), pero no hay estudios concluyentes. Los hallazgos notificados en el presente documento pueden dar informacion sobre el diseno cuidadoso y la seleccion de dosis de dichos estudios proporcionando un endofenotipo celular pertinente que relaciona un fenomeno especlfico accionado por un canal de iones en una subpoblacion especlfica de neuronas prefrontales con la sintomatologla que corresponde a la esquizofrenia y otras enfermedades mentales.
Aunque la invencion expuesta ha sido descrita con cierto detalle de un modo ilustrativo y con ejemplos para mayor claridad para su comprension, no se debera interpretar que dichas descripciones y ejemplos limitan el alcance de la invencion.
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REFERENCIAS
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SECUENCIAS
La secuencia de aminoacidos de ChR2
MDYGGALSAVGRELLFVTNPWVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQT WKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRR TMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVS WGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEV ETLVEDEAEAGAVP (SEQ ID NO:l)
La secuencia de aminoacidos de SFO:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQT WKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRR TMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVS WGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEV ETLVEDEAEAGAVP (SEQ ID NO:2)
La secuencia de aminoacidos de SSFO:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQT WKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRR TMGLLVSAIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVS WGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEV 5 ETLVEDEAEAGAVP (SEQ ID NO:3)
La secuencia de aminoacidos de C1V1:
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQC FCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAV IYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLI SLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILD LIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO: 4)
10
La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E122T):
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCF CLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIY SSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLS YGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAK NMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO: 5)
15 La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E162T):
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQC FCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSAIiCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAV IYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLI SLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILD LIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO:6)
La secuencia de aminoacidos de CI VI (E122T / E162T):
20
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQC FCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAV IYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLI SLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILD LIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO: 7)

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de induccion de psicosis en un mamlfero no humano, que comprende una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal, en donde la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO:1, comprendiendo dicho metodo la activacion con luz de la opsina sensible a la luz, en el que la activacion con luz de la opsina induce despolarizacion de la membrana celular, en virtud de lo cual se induce un estado psicotico en el mamlfero.
  2. 2. Un metodo de cribado de un compuesto que puede ser util para tratar psicosis, comprendiendo el metodo:
    medir un estado psicotico de un mamlfero no humano antes y despues de administrar el compuesto en la corteza prefrontal del mamlfero,
    en el que el mamlfero no humano comprende una opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal, en donde la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO:1, y en el que el estado psicotico es inducido por activacion con luz de la opsina sensible a la luz, en donde la activacion con luz de la opsina induce despolarizacion de la membrana;
    en el que una mejora de una o mas de las mediciones de estado psicotico tras la administracion del compuesto indica que el compuesto puede ser util para tratar psicosis.
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, que comprende ademas una etapa de administracion de un agonista de D2 al mamlfero antes de administrar el compuesto.
  4. 4. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la opsina sensible a la luz comprende una secuencia de aminoacidos identica en al menos un 95 % a la protelna de canal de cationes sensible a la luz de la SEQ ID NO: 1 derivada de Chlamydomonas reinhardtii (ChR2).
  5. 5. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2.
  6. 6. El metodo de las reivindicaciones 4 o 5, en el que la expresion de la opsina sensible a la luz se controla mediante un promotor Thy1.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la medicion del estado psicotico es una medicion de la conducta.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 7, en el que la medicion de la conducta es exploracion social.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 2, en el que la medicion del estado psicotico es una medicion celular.
  10. 10. Un metodo de cribado de un compuesto que puede ser util para tratar psicosis, que comprende: medir una respuesta celular en un corte de tejido de corteza prefrontal, obtenido de un mamlfero no humano que comprende una opsina sensible a la luz en la membrana celular de un subconjunto de neuronas piramidales de la capa V en la corteza prefrontal antes y despues de incubar el corte de tejido con el compuesto, en el que la opsina sensible a la luz es Chlamydomonas reinhardtii ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoacidos con la SEQ ID NO: 1, en donde la respuesta celular es inducida por la despolarizacion de la membrana de las neuronas inducida por la activacion de la opsina sensible a la luz; en donde una mejora en las lecturas de respuesta celular tras la incubacion con el compuesto indica que el compuesto puede ser util para tratar psicosis.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 10, en el que la respuesta celular es despolarizacion dependiente de actividad.
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