ES2625179T3 - Control optogenético de comportamientos relacionados con la recompensa - Google Patents

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Abstract

Una opsina sensible a la luz para su uso en un método para alterar el comportamiento relacionado con la recompensa en un animal vivo, en donde dicha opsina sensible a la luz se expresa en neuronas colinérgicas del núcleo accumbens o del cuerpo estriado dorsal y en donde dicha opsina sensible a la luz es una bomba de iones que desplaza el potencial de membrana de la neurona lejos de su tensión umbral para disuadir o inhibir los potenciales de acción.

Description

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DESCRIPCION
Control optogenetico de comportamientos relacionados con la recompensa Campo de la invencion
Esta solicitud se refiere a composiciones que comprenden celulas animales que expresan protelnas opsinas sensibles a la luz en sus membranas plasmaticas y metodos para usar las mismas para hiperpolarizar selectivamente las interneuronas colinergicas que residen en microcircuitos del nucleo accumbens o estriado dorsal para afectar a uno o mas comportamientos asociados con el condicionamiento relacionado con la recompensa en el animal.
Antecedentes
El abuso de sustancias y la dependencia son problemas importantes a las que se enfrentan las sociedades de todo el mundo. Segun el Informe Mundial sobre las Drogas 2008, aproximadamente el 5 % de la poblacion mundial utiliza drogas illcitas y en el 0,6 % de la poblacion mundial, el consumo de drogas es un problema. En 2006, segun la Encuesta Nacional sobre Uso de Drogas y Salud de la Administracion de Servicios de Salud Mental y Abuso de Sustancias (SAMHSA), 23,6 millones de personas de 12 anos en adelante necesitaban tratamiento para un problema de abuso de drogas illcitas (9,6 por ciento de las personas tenlan 12 anos en adelante). De estas, solo 2,5 millones, 10,8 por ciento, que necesitaban tratamiento lo recibio en un centro especializado. El abuso de sustancias y la dependencia dan lugar a una enorme perdida de mano de obra productiva en todo el mundo e impone costos a los gobiernos y las sociedades en terminos de apoyo al tratamiento, pagos de seguros y gastos en programas de prevencion y desintoxicacion.
La optogenetica es la combinacion de metodos geneticos y opticos utilizados para controlar acontecimientos especlficos en celulas diana de tejido vivo, incluso dentro de mamlferos y otros animales que se mueven libremente, con la precision temporal (escala de tiempo de milisegundos) necesaria para mantener el ritmo de funcionamiento de sistemas biologicos intactos. El sello distintivo de la optogenetica es la introduccion de protelnas canal o bomba opsina que responden rapidamente a la luz en las membranas plasmaticas de celulas neuronales diana que permitan una manipulacion temporalmente precisa del potencial de membrana neuronal mientras se mantiene la resolution del tipo celular mediante el uso de mecanismos especlficos de focalizacion. Entre las opsinas microbianas que se pueden utilizar para investigar la funcion de los sistemas neuronales se encuentran las halorodopsinas (NpHRs), utilizadas para promover la hiperpolarizacion de la membrana cuando se iluminan. En tan solo unos pocos anos, el campo de la optogenetica ha fomentado la comprension cientlfica fundamental de como determinados tipos de celulas contribuyen a la funcion de los tejidos biologicos, como los circuitos neuronales in vivo. Por otra parte, desde el punto de vista cllnico, la investigation impulsada por la optogenetica ha llevado a comprender los mecanismos neurologicos subyacentes al comportamiento de los mamlferos.
A pesar de estos avances, los sustratos neurofisiologicos subyacentes a los comportamientos humanos complejos, como el abuso de sustancias y la dependencia (adiccion) siguen siendo poco conocidos, a pesar de la information emergente sobre el papel que determinadas areas del cerebro juegan en estos comportamientos. Por ejemplo, el nucleo accumbens (NAc) es un conjunto de neuronas que forma la parte principal del cuerpo estriado ventral. Se cree que el NAc desempena un papel importante en la recompensa, el placer, la risa, la adiccion, la agresion, el miedo y el efecto placebo. La acetilcolina es un neurotransmisor importante y ampliamente estudiado, que actua sobre varios receptores y celulas diana. Algunos enfoques farmacologicos in vivo han demostrado que la transmision colinergica en el NAc es necesaria para los comportamientos de aprendizaje por recompensa. Las interneuronas colinergicas dentro del NAc son particularmente intrigantes porque constituyen menos del 1 % de la poblacion neuronal local, sin embargo, se proyectan a lo largo de todo el NAc y proporcionan su unica entrada colinergica conocida. Los receptores colinergicos relevantes se expresan localmente, y los agonistas farmacologicos nicotlnicos y muscarlnicos pueden ejercer complejas influencias sobre las neuronas espinosas medianas (MSN, las cuales representan mas del 95 % de la poblacion neuronal local y constituyen la salida del NAc). Sin embargo, se desconoce el efecto neto (si lo hay) de las interneuronas colinergicas sobre cualquier aspecto de la fisiologla del NAc o sobre el comportamiento relacionado con la recompensa.
Lo que se necesita, por lo tanto, es una herramienta que permita investigar el papel causal desempenado por las interneuronas colinergicas dentro del NAc en los comportamientos relacionados con la recompensa como la dependencia de sustancias. Entender las vlas nerviosas que subyacen a la adiccion puede contribuir al descubrimiento y la detection de terapias farmacologicas para tratar a pacientes con tales trastornos, as! como abrir la posibilidad de utilizar estas herramientas para alterar estos comportamientos en el cerebro de las personas drogadictas.
La tecnica anterior incluye Hikida y col., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100, 2003, 6169-6173, que desvela que la inhibition de la acetilcolinesterasa suprimla la preferencia del lugar condicionado por la cocalna.
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Sumario de la invencion
La invencion a la que se refiere la presente memoria descriptiva se define en las reivindicaciones adjuntas a esta descri pcion.
En la presente memoria se proporcionan composiciones y metodos para alterar comportamientos relacionados con la recompensa en un individuo mediante el uso de protelnas opsina sensibles a la luz expresadas de forma estable capaces de alterar el estado de polarizacion de la membrana de las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado del individuo, en los que la alteracion del estado de polarizacion de la membrana de las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del nucleo estriado altera uno o mas comportamientos relacionados con la recompensa en el animal. En algunas realizaciones, el comportamiento relacionado con la recompensa es un comportamiento relacionado con la adiccion. En otras realizaciones, el comportamiento relacionado con la adiccion es la adiccion a la cocalna.
Por consiguiente, en algunos aspectos, se proporciona en la presente memoria un animal no humano que comprende una protelna opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de una interneurona colinergica en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del animal, en el que la protelna es sensible a la luz y es capaz de inducir la hiperpolarizacion de la membrana de las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, en el que la iluminacion de la opsina altera al menos un comportamiento relacionado con la recompensa del animal.
En otros aspectos, se proporciona en la presente memoria un corte de cerebro que comprende una seccion transversal del nucleo accumbens o el cuerpo estriado, en el que una protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de interneuronas colinergicas siendo la protelna sensible a la luz y capaz de inducir la hiperpolarizacion de la membrana de las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, en donde la iluminacion de la protelna altera la funcion cerebral relacionada con la recompensa.
En algunos aspectos, se proporciona en la presente memoria un metodo para alterar el comportamiento relacionado con la recompensa en un individuo que comprende: administrar un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de las interneuronas colinergicas en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del individuo y la protelna es sensible a la luz y es capaz de inducir la hiperpolarizacion de la membrana de las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, de modo que cuando se activa la protelna por la luz se altera al menos un comportamiento relacionado con la recompensa en el individuo. En algunas realizaciones, el polinucleotido se administra al nucleo accumbens o al cuerpo estriado del individuo.
En otros aspectos mas, se proporciona en la presente memoria un metodo para tratar la adiccion a drogas en un individuo que comprende: administrar un polinucleotido que codifica una protelna opsina sensible a la luz al individuo, en el que la protelna opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de las interneuronas colinergicas en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del individuo y la protelna es sensible a la luz y es capaz de hiperpolarizar las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, de modo que cuando se activa la protelna por la luz se altera el comportamiento relacionado con la recompensa en el individuo, en el que el individuo ya no desea mas tomar drogas. En algunas realizaciones, el polinucleotido se administra al nucleo accumbens o al cuerpo estriado del individuo.
Algunos aspectos de la presente descripcion se refieren al control o caracterizacion de comportamiento reforzado en animales vivos, como se describe en la presente memoria. Aunque la presente divulgacion no esta necesariamente limitada en estos contextos, se pueden apreciar diversos aspectos de la invencion mediante una discusion de ejemplos que utilizan estos y otros contextos.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a circuitos especialmente dirigidos que estan asociados con comportamiento hedonico y/o reforzado. Las realizaciones mas particulares se refieren al control espacio-temporal sobre circuitos neuronales para identificar una asociacion entre dianas de circuitos especlficos asociados y que corresponden a la memoria de recompensa, anhedonia, adiccion y/o comportamiento reforzado.
Las realizaciones particulares de la presente divulgacion se refieren a la inhibicion de celulas diana dentro de las estructuras implicadas en comportamientos naturales relacionados con la recompensa y/o para el aprendizaje por recompensa incluyendo, aunque no necesariamente limitandose, al nucleo accumbens (NAc) o el cuerpo estriado dorsal. En un ejemplo particular, la selection de neuronas colinergicas especlficas dentro del NAc es particularmente adecuada para alterar la liberation de acetilcolina por estas neuronas colinergicas. Se ha descubierto que tal inhibicion neural dirigida puede ser eficaz para reducir o eliminar efectos no deseados sobre el refuerzo de otros comportamientos, p.ej., respuestas apetitivas o aversivas. Algunos aspectos de la presente divulgacion se refieren a la estimulacion que es especlfica a los tipos temporales, espaciales y/o celulares. En ciertas realizaciones, esta inhibicion se realiza usando un sistema optogenetico que implica la expresion de opsinas sensibles a la luz en las celulas del circuito neuronal. En otras realizaciones, la inhibicion puede realizarse usando estlmulo electrico directo. Otras realizaciones mas permiten el uso de productos farmaceuticos temporalmente precisos.
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Breve descripcion de los dibujos
Diversos ejemplos de realizaciones se pueden comprender mas completamente teniendo en cuenta la siguiente
descripcion y los dibujos adjuntos, en los que:
La Fig. 1 representa la especificidad, la seleccion de la membrana y la funcionalidad de ChR2 y eNpHR3.0 en interneuronas ChAT del NAc. (A) VAA dependiente de Cre (que expresa eNpHR3.0-eYFP o ChR2(H134R)- eYFP) se inyecto en la porcion medial del NAc. (B) La imagen confocal de un corte inyectado demuestra la colocalizacion de la expresion de eYFP con el anticuerpo ChAT, cotenido con 4',6'- diamidino-2-fenilindol (DAPI). (C) 91,3 ± 1,3 % de las neuronas que expresaron YFP tambien se tineron para el anticuerpo ChAT (n = 418);
93,5 ± 2,8 % de las neuronas que se tineron para el anticuerpo ChAT tambien expresaron YFP (n = 413). Las barras de error indican el EEM. (D) La vista de gran aumento revela la localization en la membrana de eNphR3.0-eYFP (izquierda) y ChR2-eYFP (derecha), cotenidos con anticuerpo ChAT. (E) Cambios en el potencial de membrana inducidos por inyeccion de corriente en una neurona ChAT que expresa ChR2-eYFP. \/M = -48 mV. Etapas actuales: -60, -20, +20 pA. (F) Cambios en el potencial de membrana inducidos por 1 s de luz de 580 nm en una neurona ChAT que expresa eNpHR3.0-eYFP (hiperpolarizacion maxima: -103 mV). /M = -49 mV. (Recuadro) Hiperpolarizacion maxima promedio en la poblacion (media ± EEM: -83,8 ± 11,9 mV; n =4). (G) Potenciales de action consecutivos en una neurona ChAT que expresa ChR2-eYFP evocada por un tren de pulsos de 470 nm (5 ms de ancho de pulso, 10 Hz). (H) Probabilidad de exito promedio para generar potenciales de accion en las neuronas ChAT que expresan ChR2-eYFP en diferentes frecuencias de estimulacion (n = 4; media ± EEM; tren de impulsos de 470 nm, ancho de pulso de 5 ms).
La Fig. 2 representa la fotoactivacion optogenetica de interneuronas ChAT que aumenta la frecuencia de corrientes inhibidoras y suprime la descarga de MSN. (A) Las neuronas ChAT transducidas con ChR2-eYFP se activaron con luz azul (470 nm) en cortes de cerebro y MSN cercanas (celulas eYFP-) fueron sometidas a fijacion de tension en parches de membrana de la celula entera. (B) (Izquierda) Las corrientes sinapticas espontaneas se observaron en una MSN en un corte que expresaba ChR2-eYFP en neuronas ChAT. (Centro) Las corrientes sinapticas aumentaron en frecuencia en respuesta a los pulsos de luz de 470 nm (ancho de pulso de 5 ms, 10 Hz). (Derecha) Estas corrientes fueron bloqueadas por el antagonista del receptor de GABAa SR-95531 (5 mM) y, por lo tanto, se consideran IPSC. La 2,3-dihidroxi-6-nitro-7- sulfamoilbenzo[f]quinoxalin-2,3-diona (NBQX) (5 mM) y el acido (RS)-3-(2- carboxipiperazin-4-il)-propil-1-fosfonico (RS-CPP) (5 pM) estaban presentes en todos los experimentos. (C) Evolution temporal de las frecuencias IPSC para esta MSN, mostrando el efecto de los pulsos de luz (barras discontinuas de color azul) y SR-95531 (barra negra). (D) Aumento porcentual promedio en la frecuencia de IPSC durante los perlodos de iluminacion (normalizados a los perlodos de apagado) en funcion del tiempo en relation con los pulsos de luz (n = 6). La llnea azul discontinua indica el inicio de los pulsos de luz; las barras de error indican el EEM. (E) Los pulsos de luz aumentaron la frecuencia de IPSC en 525,8 ± 154,3 % (n = 6, P = 0,01, prueba t de dos colas pareada), mientras que las amplitudes medias de las IPSC espontaneas cambiaron 21,3 ± 28,9 % (P >0,05). (F) Un optrode (fibra optica unida a un electrodo de tungsteno) se coloco estereotaxicamente in vivo en un NAc que expresaba ChR2-eYFP en celulas ChAT. (G) (Arriba) Rastro de tension de una unidad aislada que es inhibida por la estimulacion de luz azul. (Centro) Grafico raster que muestra la respuesta de la misma unidad a cinco repeticiones de la estimulacion lumlnica, estando cada potencial de accion representado por un punto. (Inferior) Promedio y EEM de la tasa de activation en el tiempo para la misma unidad. (H) Fraction de sitios que fueron inhibidos frente a excitados por la estimulacion lumlnica. (I) Resumen poblacional de la evolucion temporal de respuesta a la estimulacion lumlnica para sitios que fueron inhibidos (izquierda; n = 13 de 16) o excitados (derecha; n = 3 de 16) por la luz. Las llneas continuas representan la tasa promedio de activacion en los sitios en funcion del tiempo; cada punto representa la tasa de activacion promedio de un sitio individual. Todas las tasas de activacion se normalizan a la tasa media antes de la estimulacion lumlnica. (F a I) Duration de la fotoestimulacion, 10 s; duration del pulso, 5 ms; longitud de onda, 470 nm; frecuencia, 10 Hz. Los momentos de estimulacion lumlnica estan representados por llneas discontinuas.
La Fig. 3 representa la fotoinhibicion optogenetica de interneuronas ChAT que intensifican la descarga de MSN in vivo. (A) (Superior) Rastro de tension de una unidad aislada (registrada del NAc in vivo) que se excito por fotoinhibicion optogenetica de las interneuronas ChAT con eNpHR3.0. (Centro) Grafico raster que muestra la respuesta de la misma unidad a cinco repeticiones de la estimulacion lumlnica, estando representado cada potencial de accion por un punto. (Inferior) Promedio y EEM de la tasa de activacion en el tiempo para la misma unidad. (B) El analisis de la ondlcula revela la potencia de descarga como una funcion de la frecuencia y el tiempo (media de cinco repeticiones) para la misma unidad que en (A). (C) Fraccion de sitios que fueron inhibidos frente a excitados por la estimulacion lumlnica. (D) Igual que (A), para una unidad que fue inhibida por la estimulacion lumlnica. (E) Resumen poblacional de la evolucion temporal de respuesta a la estimulacion lumlnica para sitios que fueron inhibidos (izquierda; n = 13 de 17) o excitados (derecha; n = 4 de 17) por luz. Las llneas continuas representan la tasa de activacion promedio en los sitios en funcion del tiempo; cada punto representa la tasa de activacion promedio de un sitio individual. Todas las velocidades de activacion se normalizan al valor medio antes de la estimulacion lumlnica. (A a E) Duracion de la fotoestimulacion, 15 s (iluminacion constante); longitud de onda, 560 nm. Los momentos de estimulacion lumlnica estan representados por barras.
La Fig. 4 representa interneuronas ChAT que pueden ser activadas por la cocalna en cortes y necesario para el condicionamiento de la cocalna in vivo. (A) La frecuencia de los potenciales de accion espontanea en una neurona ChAT aumento 10 minutos despues de la aplicacion de un bano de cocalna (5 pM). ACSF, llquido
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cefaiorraquldeo artificial. (B) Tasa de activacion a lo largo del tiempo para esta neurona ChAT. Barra gris horizontal, aplicacion de cocalna; llnea punteada vertical, 10 minutos despues de la aplicacion de cocalna, el punto de tiempo ilustrado en detalle en (A) y (C). (C) Datos poblacionales que ilustran el aumento inducido por cocalna en la activacion de las neuronas ChAT, comparando la tasa de activacion basal (promediada durante los
2.5 min antes de la aplicacion de cocalna) con la tasa despues de la infusion de cocalna (promediado entre 10 y
12.5 min despues del inicio de la aplicacion de cocalna); barras grises, celulas que reciben cocalna; barras blancas, celulas de control que reciben solo ACSF; P < 0,005, prueba t de dos colas pareada para el grupo tratado con cocalna antes frente a despues de la cocalna; P <0,05, prueba t de dos colas no pareada que compara la cocalna frente a las celulas de control despues de cocalna o vehlculo). (D) Ilustracion esquematica de un sistema de canula bilateral con fibras dobles insertadas para iluminar la porcion medial del NAc. (Recuadro izquierdo) Punto terminal del recorrido de la canula para todos los ratones utilizados en (H). (Recuadro derecho) Expresion de eYFP en el NAc de un raton ChAT::Cre+ al que se le ha inyectado con eNpHR3.0-eYFP dependiente de Cre. (E) Paradigma condicionante para la CPP inducida por cocalna (H). Los ratones fueron condicionados con cocalna ip (20 mg/kg), junto con la inhibicion de celulas ChAT con eNpHR3.0 (longitud de onda: 590 nm). (F) Datos del seguimiento de ratones ChAT::Cre+ y ChAT::Cre- representativos en el dla de ensayo despues del condicionamiento con cocalna (dla 3). El dla anterior (dla 2), los ratones hablan recibido cocalna y luz en una camara izquierda, mientras que en la otra hablan recibido solucion salina. El raton ChAT::Cre- (pero no el raton ChAT::Cre+) exhibla una preferencia por la camara condicionada. (G) (Izquierda) Veces de cambio en el tiempo en la camara condicionada durante el dla 3 frente al dla 1 de la CPP inducida por cocalna (condicionamiento con cocalna y luz). Comparacion de los miembros de la camada ChAT::Cre+ y ChAT::Cre-; en ambos casos inyectados con eNpHR3.0 dependiente de Cre (n = 10 ChAT::Cre+, n = 12 ChAT::Cre-; P < 0,01 para la prueba t de dos colas; tres cohortes). (Derecha) Veces de cambio en el tiempo en la camara condicionada durante el dla 3 frente al dla 1 para el condicionamiento con luz sola (sin cocalna; n = 9 ChAT::Cre+, n = 7 ChAT::Cre; P > 0,05 para la prueba t de dos colas; tres cohortes). Las barras de error indican EEM, n.s., no significativo. (H) Velocidad de inyeccion de virus (eNpHR3.0 dependiente de Cre) y ratones ChAT::Cre+ y ChAT::Cre- fotoestimulados en el campo abierto (n = 10 ChAT::Cre+, n = 10 ChAT::Cre-; P > 0,05 para la prueba t de dos colas; tres cohortes). (I) Igual que (H) para la longitud del recorrido en campo abierto (n = 10 ChAT::Cre+, n = 10 ChAT::Cre-; P > 0,05 para la prueba t de dos colas; tres cohortes). (J) Igual que (H) para el tiempo en el centro del campo abierto (n = 10 ChAT::Cre+, n = 10 ChAT::Cre; P > 0,05 para la prueba t de dos colas; tres cohortes). (A a J) *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,005.
La Fig. 5 representa la fotoactivacion optogenetica de interneuronas ChAT en cortes e in vivo. (A): Superposicion de 15 trazas de corriente para la misma MSN que en la Fig. 2B, con cada traza alineada con el pulso de luz. Algunas IPSC no estan asociadas temporalmente con los pulsos de luz, mientras que muchas estan asociadas temporalmente con latencia de ~8 ms despues del inicio del pulso de luz. (B): Ocurrencia de IPSC en funcion del tiempo en relacion con el pulso de luz para la misma neurona. Las barras en blanco corresponden al numero de IPSC registradas durante la estimulacion lumlnica; las barras grises corresponden al numero de IPSC registradas durante la llnea de base (antes de la estimulacion lumlnica) usando la misma alineacion temporal. Para esta neurona, es evidente una mejora asincronica en la frecuencia de IPSC, ademas del aumento slncrono mas prominente. (C): Una presentacion reescalada de la Fig. 2D, que muestra el aumento del porcentaje promediado para la poblacion en la frecuencia de IPSC en funcion del tiempo en relacion con los pulsos de luz durante la luz en relacion con el perlodo de apagado (n= 6). En la poblacion, es evidente un aumento asincronico en la frecuencia de IPSC, ademas del aumento slncrono mas prominente. Parametros de pulso para paneles A-C: 470 nm, duracion de pulso de 5 ms, 10 Hz. (D): Trazas de tension de los registros in vivo que muestran picos poblacionales (presumiblemente generados por celulas ChAT que expresan ChR2) que siguen la estimulacion con luz azul pulsada a 10Hz (superior) pero no a 100Hz (inferior: luz de 470 nm, duracion de estimulacion total de 10 seg).
La Fig. 6 representa la inhibicion de la neurona ChAT que altera la CPP inducida por cocalna sin afectar la CPP en ausencia de cocalna. (A): CPP inducida por cocalna, los mismos datos que la Fig. 4G (panel izquierdo), pero trazados como diferencia en lugar de veces del cambio. Izquierda: Diferencia en el tiempo en la camara condicionada con cocalna despues del condicionamiento frente a antes del condicionamiento. (n=10 ChAT::Cre+, n=12 ChAT::Cre-; p<0,01 para la prueba t de dos colas; 3 cohortes). Derecha: Diferencia en la preferencia por la camara condicionada con cocalna despues frente a antes del condicionamiento, donde la preferencia se define como la diferencia en el tiempo pasado en la camara condicionada frente a la camara incondicionada (n=10 ChAT::Cre+, n=12 ChAT::Cre-; p<0,01 para la prueba t de dos colas; 3 cohortes). (B): CPP sin cocalna, los mismos datos que la Fig. 4G (panel derecho) y la misma presentacion de datos que A. (Para ambos paneles, n=9 ChAT::Cre+, n=7 ChAT::Cre-; p>0,05 para la prueba t de dos colas; 3 cohortes).
La Fig. 7 representa como el antagonismo de los receptores nicotlnicos disminuye las IPSC evocadas por la interneurona ChAT registradas en las MSN. (A): Barridos de IPSC representativos de una MSN tlpica en la preparacion de un corte agudo en las condiciones sin luz, pulsos de luz (470 nm, 10 Hz, anchura de pulso de 5 ms) y pulsos de luz identicos con mecamilamina 10 pM. (B): Grafico de resumen de IPSC registradas como en A de una poblacion de MSNS antes de la presentacion de la luz, con la presentacion de la luz y con la luz y mecamilamina o vehlculo. La luz aumento de forma estable la frecuencia de IPSC de 3,4 +/- 1,3 Hz a 10,1 +/- 1,2 Hz (p < 0,05; n = 7, prueba t pareada) mientras que la mecamilamina redujo este aumento hasta 5,1 ± 1,8 Hz (p<0,05 en comparacion con la luz sola en las mismas celulas, prueba t pareada; p<0,05 en comparacion con el vehlculo control, n=5, prueba t no pareada).
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La Fig. 8 representa la modulacion de interneuronas ChAT en una gama de parametros de CPP inducida por cocalna. (A): Curva de dosis-respuesta para la CPP inducida por cocalna durante la inhibicion mediada por eNpHR3.0 de las interneuronas ChAT. La CPP inducida por cocalna disminuyo significativamente en ratones ChAT::Cre+ para la dosis recompensadora estandar de 20 mg/kg i.p. p < 0,01), pero no en otras concentraciones que se cree que son ansiogenicas o insuficientes (luz de 590 nm, iluminacion constante; vease Tabla 2, infra). (B): La estimulacion de las neuronas ChAT con ChR2 no determina la preferencia por el lugar por si misma. (Luz de 470 nm, ancho de pulso de 5 ms, 10 segundos de estimulacion de 10 Hz cada 30 segundos; n = 4, p > 0,05, prueba t de dos colas). (C): La estimulacion de las neuronas ChAT a 10 Hz con ChR2 no modula significativamente la preferencia por el lugar de la cocalna para la administracion i.p. de 10 mg/kg de cocalna. (Luz de 470 nm, ancho de pulso de 5 ms, estimulacion constante de 10 Hz durante el condicionamiento con cocalna, ChAT::Cre+ n = 6, ChAT::Cre- n = 6; p > 0,05, prueba t de dos colas). (D): La estimulacion de las neuronas ChAT a 10 Hz con ChR2 no modula significativamente la preferencia por el lugar de la cocalna para 20 mg/kg de cocalna i.p. (luz de 470 nm, ancho de pulso de 5 ms, estimulacion constante de 10 Hz durante el condicionamiento con cocalna, ChAT::Cre+ n = 4, ChAT::Cre- n = 3; p > 0,05, prueba t de dos colas).
La Fig. 9 representa como la inhibicion de las interneuronas ChAT con eNphR3.0 no afecta al condicionamiento del miedo contextual o asociado a una senal auditiva. (A): El porcentaje de tiempo pasado paralizados se cuantifico en un paradigma estandar de condicionamiento del miedo contextual. “Llnea de base” se refiere a los 30 segundos que preceden al primer emparejamiento de tono-choque. “Inmediato” se refiere a los 30 segundos inmediatamente despues del segundo (y final) emparejamiento tono-choque. “Contexto” se refiere a la paralisis en el mismo contexto el dla despues de la sesion de condicionamiento. Los ratones ChAT::Cre+ exhiblan paralisis inmediata y en el contexto aumentadas. (n = 9 ChAT::Cre+; n = 8 ChAT::Cre-; prueba t de dos colas; p < 0,05 que compara ChAT::Cre+ y ChAT::Cre- para la paralisis inmediata y frente al contexto. (B): Porcentaje de tiempo paralizado para el paradigma de condicionamiento del miedo asociado a una senal auditiva. “Pre-tono” se refiere a los 2,5 minutos en el nuevo contexto antes del inicio del tono; “Tono” se refiere a los 2,5 minutos durante el tono (n = 9 ChAT::Cre+; n = 8 ChAT::Cre-; prueba t de dos colas; p > 0,05 que compara ChAT::Cre+ y ChAT::Cre-).
La Fig. 10 representa un sistema para controlar el nucleo accumbens (NAc) o el cuerpo estriado dorsal, consistente con una realizacion de la presente divulgacion.
La Fig. 11 representa un diagrama de flujo para controlar la liberacion de acetilcolina, consistente con las realizaciones de la presente divulgacion.
Descripcion detallada
Esta divulgacion proporciona, entre otros, composiciones y metodos para alterar el comportamiento relacionado con la recompensa en un individuo mediante la alteracion selectiva del potencial electrico de membrana de las celulas interneuronales colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado dorsal. La invencion se basa en el descubrimiento de los inventores de que la hiperpolarizacion selectiva de las celulas interneuronales colinergicas del nucleo accumbens con protelnas bombas de iones opsina sensibles a la luz altera el comportamiento de busqueda de recompensa en un modelo animal de adiccion a las drogas.
Aunque la presente divulgacion es susceptible de diversas modificaciones y formas alternativas, se han mostrado sus detalles especlficos a modo de ejemplo en los dibujos y se describira en detalle. Debe entenderse, sin embargo, que la intencion no es limitar la presente divulgacion a las realizaciones particulares descritas. Por el contrario, la intencion es cubrir todas las modificaciones, equivalentes y alternativas que entren dentro del alcance de la presente divulgacion incluyendo aspectos definidos en las reivindicaciones.
Tecnicas generates
La practica de la presente invencion empleara, a menos que se indique lo contrario, tecnicas convencionales de biologla molecular, microbiologla, biologla celular, bioqulmica, qulmica de acidos nucleicos, inmunologla, fisiologla y la fisiopatologla de la adiccion a drogas y comportamientos relacionados con las recompensas que son bien conocidas por aquellos expertos en la materia. Tales tecnicas se explican detalladamente en la literatura, tales como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edicion (Sambrook et al., 1989) y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera edicion (Sambrook and Russel, 2001), (referidos conjuntamente como “Sambrook”); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987, incluidos los suplementos hasta 2001); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, Nueva York; Harlow and Lane (1999) Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (referidos conjuntamente como “Harlow and Lane”), Beaucage et al. eds., Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, 2000), Handbook of Experimental Immunology, 4a edicion (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987) y Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987). Otras referencias utiles incluyen Harrison's Principles of Internal Medicine (McGraw Hill; J. Isseleacher et al., eds.) y Addiction Research Methods, (Miller et al, eds., 2010; Wiley-Blackwell, Reino Unido).
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Definiciones
Tal como se usa en la presente memoria, el “comportamiento relacionado con la recompensa” es un proceso que refuerza algo del comportamiento que aumenta la tasa, la probabilidad o la intensidad de un comportamiento particular en forma de una respuesta a menudo placentera por la obtencion o aparicion de un estlmulo inmediatamente o poco despues de realizar el comportamiento. Los comportamientos relacionados con la recompensa pueden incluir, pero no estan limitados a, la obtencion de alimentos, comportamientos sexuales, comportamientos de juego y/o comportamiento adictivo relacionado con las drogas.
“Comportamiento adictivo relacionado con las drogas” es el comportamiento resultante del consumo compulsivo de sustancias y se caracteriza por una aparente dependencia de la sustancia. El slntoma de la conducta relacionada con la adiccion es (i) implicacion abrumadora con el uso de la droga, (ii) asegurar su suministro y (iii) una alta probabilidad de recalda despues de su retirada.
Como se hace referencia en la presente memoria, el termino “droga” o “narcotico” pretende incluir opiaceos, tales como opio y herolna, metanfetamina, cocalna (benzoilmetilecgonina), ketamina, MDMA (3,4- metilendioximetanfetamina, tambien conocida como “extasis”), dietilamida del acido lisergico (LSD), o cannabinoides. Ademas, se entiende que el narcotico incluye alcohol, nicotina, o cualquier otra sustancia controlada.
Un “individuo” es un mamlfero incluyendo un ser humano. Los mamlferos incluyen, pero no se limitan a, animales de granja, animales de deporte, mascotas, primates, ratones y ratas. Las personas tambien incluyen animales de companla incluyendo, pero sin limitarse a, perros y gatos. En algunos aspectos, un individuo es un animal no humano, tal como un mamlfero. En otro aspecto, un individuo es un ser humano.
Como se usa en la presente memoria, una “dosificacion eficaz” o “cantidad eficaz” de farmaco, compuesto o composicion farmaceutica es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Para el uso profilactico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados tales como eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar la aparicion de la enfermedad, incluyendo slntomas bioqulmicos, histologicos y/o de comportamiento de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patologicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para el uso terapeutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados cllnicos tales como la disminucion de uno o mas slntomas resultantes de la enfermedad, el aumento de la calidad de vida de los pacientes que sufren la enfermedad, la disminucion de la dosis de otros medicamentos requeridos para tratar la enfermedad, el refuerzo de otra medicacion tal como mediante la focalizacion, retrasando la progresion de la enfermedad y/o prolongando la supervivencia. Una dosificacion eficaz puede administrarse en una o mas administraciones. Para los fines de esta invencion, una dosificacion eficaz del farmaco, compuesto o composicion farmaceutica es una cantidad suficiente para realizar un tratamiento profilactico o terapeutico, ya sea directa o indirectamente. Como se entiende en el contexto cllnico, una dosificacion eficaz de un farmaco, compuesto o composicion farmaceutica puede o no conseguirse conjuntamente con otro farmaco, compuesto o composicion farmaceutica. Por lo tanto, una “dosificacion eficaz” puede considerarse en el contexto de la administracion de uno o mas agentes terapeuticos y se puede considerar que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o mas de otros agentes, se puede conseguir o se consigue un resultado deseable.
Tal como se utiliza en la presente memoria, “tratamiento” o “tratar” es un enfoque para obtener resultados beneficiosos o deseados incluyendo y preferiblemente resultados cllnicos. Para los propositos de esta invencion, los resultados cllnicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a, uno o mas de los siguientes: disminucion de los slntomas resultantes de la enfermedad, aumento de la calidad de vida de los pacientes que sufren la enfermedad, disminucion de la dosis de otros medicamentos necesarios para tratar la enfermedad, retraso de la progresion de la enfermedad y/o prolongation de la supervivencia de los individuos.
Como se usa en la presente memoria, la forma singular “uno”, “una” y “el”, “la” incluyen referencias plurales a menos que se indique lo contrario.
Se pretende que cada limitation numerica maxima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluya cualquier limitation numerica inferior, como si dichas limitaciones numericas inferiores estuvieran expresamente escritas aqul. Cada limitacion numerica minima dada a lo largo de esta memoria descriptiva incluira todas las limitaciones numericas mas altas, como si dichas limitaciones numericas mas altas estuvieran expresamente escritas en la presente memoria. Cada intervalo numerico dado a lo largo de esta memoria descriptiva incluira cada intervalo numerico mas estrecho que entra dentro de un intervalo numerico mas amplio, como si tales intervalos numericos mas estrechos estuvieran todos expresamente escritos en la presente memoria.
El nucleo accumbens
El nucleo accumbens (NAc), tambien conocido como accumbens nucleus o como el nucleus accumbens septi, es un conjunto de neuronas que forma la parte principal del cuerpo estriado ventral. Se cree que juega un papel importante en la recompensa, el placer, la risa, la adiccion, la agresion, el miedo y el efecto placebo. El principal tipo de celula neuronal que se encuentra en el nucleo accumbens es la neurona espinosa mediana (MSN). El neurotransmisor
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producido por estas neuronas es el acido gamma-aminobutirico (GABA), uno de los principales neurotransmisores inhibidores del sistema nervioso central. Las MSN tambien son las principales neuronas de proyeccion o eferentes del nucleo accumbens. Mientras que el 95 % de las neuronas en el nucleo accumbens son neuronas de proyeccion GABA-ergicas espinosas medias, tambien se encuentran otros tipos neuronales tales como las grandes interneuronas colinergicas no espinosas, que comprenden aproximadamente el 1 % de las celulas en esta region del cerebro.
La acetilcolina (ACh) fue el primer miembro descubierto de una clase de sustancias bioqulmicas que eventualmente se conocieron como neurotransmisores. En el sistema nervioso central, la ACh es importante para diversas funciones corporales, como el procesamiento sensorial y motor, el sueno, la nocicepcion, el estado de animo, la respuesta al estres, la atencion, la excitacion, la memoria, la motivation y la recompensa. Otro neurotransmisor, la dopamina (DA), se encuentra tambien en el NAc y su liberation es un acontecimiento crltico que media en los efectos gratificantes de las drogas estimulantes (Sofuoglu & Mooney, 2009, CNS Drugs, 20 (11): 939 - 952). Las interneuronas colinergicas liberan ACh en el nucleo accumbens. La actividad de las MSN puede ser modulada tanto mediante control colinergico como dopaminergico, que puede ser excitador o inhibitorio dependiendo de los subtipos receptores que son estimulados: los dopaminergicos D1 y los MAChR M1 son excitadores mientras que los dopaminergicos D2 y los MAChR M4 son inhibidores (Calabresi et al., Lancet Neurol., 2006, 5 (11):974-83). Las interneuronas colinergicas reciben information dopaminergica del area tegmental ventral (VTA) y la entrada glutamatergica principalmente procede de la corteza prefrontal, hipocampo y amlgdala (Sofuoglu & Mooney, 2009, CNS Drugs, 20(11):939-952). Sin estar ligado a la teorla, se cree que esta dA y la convergencia de glutamato en las interneuronas colinergicas pueden proporcionar un mecanismo para que la recompensa mediada por DA este asociada con el aprendizaje mediado por glutamato y la informacion contextual (Berlanga et al., Neuroscience. 2003; 120(4):1149-56). En consecuencia, se cree que las interneuronas colinergicas regulan la traduction de senales de recompensa en un comportamiento contextualmente apropiado.
Las drogas que son habitualmente objeto de abuso y las recompensas naturales comparten la action mutua de alterar las concentraciones extracelulares de neurotransmisores en el NAc (Di Chiara & Imperato, 1988, PNAS, 85(14):5274-8; Phaus, Curr Opin Neurobiol., 1999, 9(6):751-8). Ademas, se ha demostrado que las lesiones del NAc disminuyen los efectos gratificantes de diversos estimulantes y opiaceos (Kelsey et al., Behav Neurosci., 1989, 103(6):1327-34). No obstante, han sido los experimentos que abarcan la microinfusion directa de narcoticos en el NAc los que han proporcionado la prueba mas solida del papel que desempena en los estados de comportamiento gratificantes relacionados con la recompensa. Por ejemplo, en los modelos de adiccion de roedores se autoadministraran narcoticos facilmente, como la anfetamina (un agente liberador de dopamina), cocalna (un inhibidor de la recaptacion de dopamina) y nomifensina (un inhibidor de la recaptacion de dopamina) directamente en el NAc, demostrando as! que la dopamina juega un papel importante en el NAc para regular el comportamiento basado en la recompensa y la motivacion (Carlezon & Thomas, Neuropharmacology, 2009; 56 (Suppl 1):122-132).
Sin embargo, todavla no estan claros los papeles desempenados por las propias celulas del NAc en la mediation de estos complejos comportamientos de mamlferos en respuesta a la entrada de neurotransmisores como la dopamina, especialmente en lo que respecta a los comportamientos relacionados con la recompensa como el abuso de sustancias y la dependencia (adiccion). Tambien se desconocen los papeles especlficos desempenados por los neurotransmisores dopamina y acetilcolina en la generation de comportamientos relacionados con la recompensa a traves del NAc. Una recompensa es un proceso que refuerza el comportamiento, algo que, cuando se ofrece, hace que un comportamiento aumente en intensidad. La recompensa es un concepto operativo para describir el valor positivo que un individuo atribuye a un objeto, un acto conductual o un estado flsico interno. Las recompensas naturales incluyen aquellas que son necesarias para la supervivencia de especies, tales como comer, aparearse y luchar. El NAc se ha asociado con muchos de estos tipos de comportamientos relacionados con las recompensas, tan variados como la adiccion a las drogas, la adiccion al sexo y la adiccion al juego.
Proteinas opsina sensibles a la luz
En la presente memoria se proporcionan composiciones y metodos optogeneticos para hiperpolarizar selectivamente neuronas colinergicas en el nucleo accumbens y el cuerpo estriado de individuos para alterar al menos un comportamiento relacionado con la recompensa en el individuo. La optogenetica es la combination de metodos geneticos y opticos utilizados para controlar acontecimientos especlficos en celulas diana de tejido vivo, incluso dentro de mamlferos y otros animales que se mueven libremente, con la precision temporal (escala de tiempo de milisegundos) necesaria para mantener el ritmo de funcionamiento de sistemas biologicos intactos. La optogenetica requiere la introduction de proteinas canal o bomba opsina que responden rapidamente a la luz en las membranas plasmaticas de celulas neuronales diana que permitan una manipulation temporalmente precisa del potencial de membrana neuronal mientras se mantiene la resolution del tipo celular mediante el uso de mecanismos especlficos de focalizacion.
Las opsinas sensibles a la luz que pueden usarse en la presente invention incluyen opsinas que inducen hiperpolarizacion en las neuronas por la luz y opsinas que inducen la despolarizacion en neuronas por la luz. Ejemplos de opsinas se muestran en las Tablas 1 y 2 a continuation.
La Tabla 1 muestra las opsinas identificadas por la inhibicion de la actividad celular a traves del espectro visible:
Tipo de opsina
Origen biologico Sensibilidad a la longitud de onda Accion definida
NpHR
Natronomonas pharaonis 589 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
BR
Halobacterium helobium 570 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
AR
Acetabulaira acetabulum 518 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
GtR3
Guillardia theta 472 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
Mac
Leptosphaeria maculans 470-500 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
NpHr3.0
Natronomonas pharaonis 680 nm utilidad 589 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
NpHR3.1
Natronomonas pharaonis 680 nm utilidad 589 nm max Inhibicion (hiperpolarizacion)
La Tabla 2 muestra las opsinas identificadas por la excitacion y modulacion a traves del espectro visible:
Tipo de opsina
Origen biologico Sensibilidad a la longitud de onda Accion definida
VChR1
Volvox carteri 589 nm utilidad 535 nm max Excitacion (despolarizacion)
DChR
Dunaliella salina 500 nm max Excitacion (despolarizacion)
ChR2
Chlamydomonas reinhardtii 470 nm max 380-405 nm utilidad Excitacion (despolarizacion)
ChETA
Chlamydomonas reinhardtii 470 nm max 380-405 nm utilidad Excitacion (despolarizacion)
SFO
Chlamydomonas reinhardtii 470 nm max 530 nm max Excitacion (despolarizacion) Inactivation
SSFO
Chlamydomonas reinhardtii 445 nm max 590 nm; 390-400 nm Activation gradual (despolarizacion) Inactivacion
C1V1
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 542 nm max Excitacion (despolarizacion)
C1V1 E122
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 546 nm max Excitacion (despolarizacion)
C1V1 E162
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 542 nm max Excitacion (despolarizacion)
C1V1 E122/E162
Volvox carteri y Chlamydomonas reinhardtii 546 nm max Excitacion (despolarizacion)
5 Como se usa en la presente memoria, una opsina sensible a la luz (tal como NpHR, BR, AR, GtR3, Mac, ChR2, VChRI, DChR y ChETA) incluye protelnas naturales y variantes funcionales, fragmentos, protelnas de fusion que comprenden los fragmentos o la longitud total de la protelna. En algunas realizaciones, el peptido senal puede ser eliminado. Una variante puede tener una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la secuencia de la protelna natural. Una variante 10 funcional puede tener la misma o similar funcion de hiperpolarizacion o funcion de despolarizacion que la protelna de origen natural.
Intensification del transporte celular por motivos de aminoacidos
15 La presente divulgacion proporciona la modificacion de protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en una celula mediante la adicion de uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero. Las protelnas opsina sensibles a la luz que tienen componentes derivados de organismos evolutivamente mas simples pueden no ser expresadas o toleradas por celulas de mamlfero o pueden presentar una localization subcelular alterada cuando se expresan a niveles altos en 20 celulas de mamlfero. Por consiguiente, en algunas realizaciones, las protelnas opsina sensibles a la luz expresadas en una celula pueden fusionarse con uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos seleccionados del grupo que
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consiste en un peptido senal, una senal de exportacion del retlcuio endoplasmico (RE), una senal de trafico de membrana y/o una senal de exportacion del aparato de Golgi N-terminal. Los uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte de protelna opsina sensible a la luz a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero pueden fusionarse con el extremo N terminal, el extremo C terminal o con los extremos N y C terminales de la protelna opsina sensible a la luz. Opcionalmente, la protelna opsina sensible a la luz y el uno o mas motivos de secuencia de aminoacidos pueden estar separados por un enlazador. En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz puede modificarse mediante la adicion de una senal de trafico (ts) que intensifica el transporte de la protelna a la membrana plasmatica de la celula. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede derivarse de la secuencia de aminoacidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En otras realizaciones, la senal de trafico puede comprender la secuencia de aminoacidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
Otros motivos de protelna adicionales que pueden intensificar el transporte de protelna opsina sensible a la luz a la membrana plasmatica de una celula se describen en la Solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 12/041.628.
En algunas realizaciones, la secuencia del peptido senal en la protelna puede suprimirse o sustituirse con una secuencia de peptido senal de una protelna diferente.
Bombas de cloruro sensibles a la luz
En algunos aspectos de los metodos proporcionados en la presente memoria, uno o mas miembros de la familia halorodopsina de bombas de cloruro sensibles a la luz se expresan en las membranas plasmaticas de las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado.
En algunos aspectos, dichas una o mas protelnas bomba de cloruro sensibles a la luz, expresadas en las membranas plasmaticas de las celulas nerviosas de las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado, pueden derivarse de Natronomonas pharaonis. En algunas realizaciones, las protelnas bomba de cloruro sensibles a la luz pueden ser sensibles a la luz ambar as! como a la luz roja y pueden mediar una corriente hiperpolarizante en la interneurona cuando las protelnas bomba de cloruro sensibles a la luz se iluminan con luz ambar o roja. La longitud de onda de la luz que puede activar las bombas de cloruro sensibles a la luz puede estar entre aproximadamente 580 y 630 nm. En algunas realizaciones, la luz puede tener una longitud de onda de aproximadamente 590 nm o la luz puede tener una longitud de onda superior a aproximadamente 630 nm (p.ej. menos de aproximadamente 740 nm). En otra realizacion, la luz tiene una longitud de onda de aproximadamente 630 nm. En algunas realizaciones, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz puede hiperpolarizar una membrana neural durante al menos aproximadamente 90 minutos cuando se expone a un pulso continuo de luz. En algunas realizaciones, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia a la mostrada en la SEQ ID NO:1. Ademas, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de la luz y/o aumentar o disminuir la capacidad de la protelna sensible a la luz para regular el estado de polarizacion de la membrana plasmatica de la celula. En algunas realizaciones, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz contiene una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras. En algunas realizaciones, la protelna sensible a la luz contiene una o mas sustituciones de aminoacidos que no conservadoras. La protelna sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de hiperpolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz.
Ademas, en otros aspectos, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y una senal de exportacion del retlculo endoplasmico (RE). Esta senal de exportacion del RE puede fusionarse con el extremo C terminal de la secuencia de aminoacidos basica o puede fusionarse con el extremo N terminal de la secuencia de aminoacidos basica. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE esta unida a la secuencia de aminoacidos basica por un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una protelna fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una protelna fluorescente amarilla, una protelna fluorescente roja, una protelna fluorescente verde o una protelna fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE puede comprender la secuencia de aminoacidos FXYENE, donde X puede ser cualquier aminoacido. En otra realizacion, la senal de exportacion del RE puede comprender la secuencia de aminoacidos VXXSL, donde X puede ser cualquier aminoacido. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE puede comprender la secuencia de aminoacidos FCYENEV.
En otros aspectos, las protelnas bomba de cloruro sensible a la luz proporcionadas en la presente memoria pueden comprender una protelna sensible a la luz expresada en la membrana celular, en la que la protelna comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 % 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y una senal de trafico (p.ej., que puede
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intensificar el transporte de la protelna bomba de cloruro sensible a la luz a la membrana plasmatica). La senal de trafico puede fusionarse con el extremo C terminal de la secuencia de aminoacidos basica o puede fusionarse con el extremo N terminal de la secuencia de aminoacidos basica. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede estar unida a la secuencia de aminoacidos basica mediante un enlazador que puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400, o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una protelna fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una protelna fluorescente amarilla, una protelna fluorescente roja, una protelna fluorescente verde o una protelna fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de trafico puede derivarse de la secuencia de aminoacidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En otras realizaciones, la senal de trafico puede comprender la secuencia de aminoacidos KSRITSEGEYIPLDQIDINV.
En algunos aspectos, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y al menos uno (dos, tres, o mas) motivos de la secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero seleccionadas del grupo que consiste en una senal de exportacion del RE, un peptido senal y una senal de trafico de membrana. En algunas realizaciones, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz comprende un peptido senal N- terminal, una senal de exportacion del RE C-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE C-terminal y la senal de trafico C-terminal pueden unirse mediante un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una protelna fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una protelna fluorescente amarilla, una protelna fluorescente roja, una protelna fluorescente verde o una protelna fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE puede estar localizada mas proxima al C-terminal que la senal de trafico. En otras realizaciones, la senal de trafico esta localizada mas proxima al C-terminal que la senal de exportacion del RE. En algunas realizaciones, el peptido senal comprende la secuencia de aminoacidos MTETLPPVTESAVALQAE. En otra realizacion, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz comprende una secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la SEQ ID NO:2.
Ademas, en otros aspectos, las protelnas bomba de cloruro sensibles a la luz pueden comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, en la que el peptido senal N-terminal de la SEQ ID NO:1 se elimina o se sustituye. En algunas realizaciones, pueden usarse otros peptidos senal (tales como peptidos senal de otras opsinas). La protelna sensible a la luz puede comprender ademas una senal de transporte del Re y/o una senal de trafico de membrana descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, la protelna bomba de cloruro sensible a la luz comprende una secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la SEQ ID NO:3.
En la presente memoria tambien se proporcionan polinucleotidos que codifican cualquiera de las protelnas bomba de ion cloruro sensible a la luz descritas en la presente memoria, tales como una protelna sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 % 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En otra realizacion, los polinucleotidos comprenden una secuencia que codifica una secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la SEQ ID NO:2 y la SEQ ID NO:3. Los polinucleotidos pueden estar en un vector de expresion (tal como, pero sin limitarse a, un vector viral descrito en la presente memoria). Los polinucleotidos pueden usarse para la expresion de las protelnas bomba de ion cloruro sensibles a la luz en las neuronas colinergicas del NAc o del cuerpo estriado.
En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz es una protelna opsina NpHR que comprende una secuencia de aminoacidos al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1. En algunas realizaciones, la protelna opsina NpHR comprende ademas una senal de exportacion del retlculo endoplasmico (RE) y/o una senal de trafico de membrana. Por ejemplo, la protelna opsina NpHR comprende una secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 y una senal de exportacion del retlculo endoplasmico (RE). En algunas realizaciones, la secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 esta unida a la senal de exportacion del RE a traves de un enlazador. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE comprende la secuencia de aminoacidos FXYENE, donde X puede ser cualquier aminoacido. En otra realizacion, la senal de exportacion del RE comprende la secuencia de aminoacidos VXXSL, donde X puede ser cualquier aminoacido. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE comprende la secuencia de aminoacidos FCYENEV. En algunas realizaciones, la protelna opsina NpHR comprende una secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En otras realizaciones, la protelna opsina NpHR comprende, desde el extremo N terminal hasta el extremo C terminal, la secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, la senal de exportacion del RE y la senal de trafico de membrana. En otras realizaciones, la protelna opsina NpHR comprende, desde el extremo N terminal hasta el extremo C terminal, la secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1, la senal de trafico de membrana y la senal de exportacion del RE. En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana se deriva de la secuencia de
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aminoacidos del canal de potasio rectificador interno humano Kir2.1. En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana comprende la secuencia de aminoacidos K S R I T S E G E Y I P L D Q I D I N V. En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana esta unida a la secuencia de aminoacidos al menos 95 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:1 por un enlazador. En algunas realizaciones, la senal de trafico de membrana esta unida a la senal de exportation del RE a traves de un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una protelna fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una protelna fluorescente amarilla, una protelna fluorescente roja, una protelna fluorescente verde o una protelna fluorescente cian. En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz comprende ademas un peptido senal N-terminal. En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:2. En algunas realizaciones, la protelna opsina sensible a la luz comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO:3.
Se puede encontrar information adicional relacionada con protelnas bomba de cloruro sensible a la luz en las Publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos numeros 2009/0093403 y 2010/0145418, as! como en la Solicitud de Patente Internacional N.°: PCT/US2011/028893.
Bombas de protones sensibles a la luz
En algunos aspectos de las composiciones y metodos proporcionados en la presente memoria, una o mas bombas de protones sensibles a la luz se expresan en las membranas plasmaticas de las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado.
En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede ser sensible a la luz azul y puede derivarse de Guillardia theta, en la que la protelna bomba de protones puede ser capaz de mediar una corriente hiperpolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz azul. La luz puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 450 y aproximadamente 495 nm o puede tener una longitud de onda de aproximadamente 490 nm. En otra realization, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4. La protelna bomba de protones sensible a la luz puede comprender adicionalmente sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de la luz y/o aumentar o disminuir la capacidad de la protelna de la bomba de protones sensible a la luz para regular el estado de polarization de la membrana plasmatica de la celula. Ademas, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o una o mas sustituciones de aminoacidos no conservadoras. La protelna bomba de protones sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de hiperpolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz.
En otros aspectos de los metodos divulgados en la presente memoria, la protelna bomba de protones sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 % 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4 y al menos uno (como uno, dos, tres o mas) motivos de secuencia de aminoacidos que intensifican el transporte a las membranas plasmaticas de las celulas de mamlfero seleccionados del grupo que consiste en un peptido senal, una senal de exportacion del RE y una senal de trafico de membrana. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal y una senal de exportacion de C-terminal ER. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N - terminal y una senal de trafico C - terminal. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende un peptido senal N-terminal, una senal de exportacion del RE C-terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la protelna bomba de protones sensible a la luz comprende una senal de exportacion del RE C- terminal y una senal de trafico C-terminal. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE C-terminal y la senal de trafico C-terminal estan unidas por un enlazador. El enlazador puede comprender cualquiera de aproximadamente 5, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 400 o 500 aminoacidos de longitud. El enlazador puede comprender ademas una protelna fluorescente, por ejemplo, pero sin limitarse a, una protelna fluorescente amarilla, una protelna fluorescente roja, una protelna fluorescente verde o una protelna fluorescente cian. En algunas realizaciones, la senal de exportacion del RE esta situada mas proxima al C-terminal que la senal de trafico. En algunas realizaciones, la senal de trafico esta situada mas proxima al C-terminal que la senal de exportacion del RE.
En la presente memoria tambien se proporcionan polinucleotidos aislados que codifican cualquiera de las protelnas bomba de protones sensibles a la luz descritas en la presente memoria, tales como una protelna bomba de protones sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos de nucleo al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4. Tambien se proporcionan en la presente memoria vectores de expresion (tales como un vector viral descrito en la presente memoria) que comprenden un polinucleotido que codifica las protelnas descritas en la presente memoria,
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tal como una protelna bomba de protones sensible a la luz que comprende una secuencia de aminoacidos basica al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 % , 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:4. Los polinucleotidos pueden usarse para la expresion de la protelna opsina sensible a la luz en celulas neurales (p.ej. las interneuronas colinergicas del NAc o del cuerpo estriado).
Se puede encontrar informacion adicional relacionada con protelnas bomba de protones sensibles a la luz en la Solicitud de Patente Internacional N.° PCT/US2011/028893.
Protelnas canal sensibles a la luz
En algunos aspectos de los metodos proporcionados en la presente memoria, uno o mas miembros de la familia canalrodopsina de canales ionicos sensibles a la luz se expresan en las membranas plasmaticas de las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado.
En algunos aspectos, la protelna canal cationico sensible a la luz puede derivarse de Chlamydomonas reinhardtii, en el que la protelna canal cationico puede ser capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. En otra realizacion, la protelna canal cationico sensible a la luz puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:5. La luz utilizada para activar la protelna canal cationico sensible a la luz derivada de Chlamydomonas reinhardtii puede tener una longitud de onda entre aproximadamente 460 y aproximadamente 495 nm o puede tener una longitud de onda de aproximadamente 470 nm. Adicionalmente, la luz puede tener una intensidad de al menos aproximadamente 100 Hz. En algunas realizaciones, la activacion del canal cationico sensible a la luz derivado de Chlamydomonas reinhardtii con luz que tiene una intensidad de 100 Hz puede causar la deplecion sinaptica inducida por la despolarizacion de las neuronas que expresan el canal cationico sensible a la luz. La protelna canal cationico sensible a la luz puede comprender adicionalmente sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en una secuencia de aminoacidos nativa para aumentar o disminuir la sensibilidad a la luz, aumentar o disminuir la sensibilidad a determinadas longitudes de onda de la luz y/o aumentar o disminuir la capacidad de la protelna canal cationico sensible a la luz para regular el estado de polarizacion de la membrana plasmatica de la celula. Adicionalmente, la protelna canal cationico sensible a la luz puede contener una o mas sustituciones de aminoacidos conservadoras y/o una o mas sustituciones de aminoacidos no conservadoras. La protelna canal cationico sensible a la luz que comprende sustituciones, deleciones y/o inserciones introducidas en la secuencia de aminoacidos nativa retiene adecuadamente la capacidad de despolarizar la membrana plasmatica de una celula neuronal en respuesta a la luz.
En otras realizaciones, la protelna canal cationico sensible a la luz puede ser una protelna opsina de funcion de paso (SFO) o una protelna opsina de funcion de paso estabilizada (SSFO) que puede tener sustituciones de aminoacidos especlficas en posiciones clave a lo largo del sitio de union a la retina de la protelna. En algunas realizaciones, la protelna SFO puede tener una mutacion en el residuo de aminoacido C128 de la SEQ ID NO:5. En otras realizaciones, la protelna SFO tiene una mutacion C128A en la SEQ ID NO:5. En otras realizaciones, la protelna SFO tiene una mutacion C128S en la SEQ ID NO:5. En otra realizacion, la protelna SFO tiene una mutacion C128T en la SEQ ID NO:5. En algunas realizaciones, la protelna SFO puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en la SEQ ID NO:6 o la SEQ ID NO:7.
En otras realizaciones, la protelna canal cationico sensible a la luz puede ser una protelna quimerica C1V1 derivada de la protelna VChR1 de Volvox carteri y la protelna ChR1 de Chlamydomonas reinhardti, en la que la protelna comprende la secuencia de aminoacidos de VChR1 que tiene al menos la primera y segunda helices transmembrana sustituidas por la primera y segunda helices transmembrana de ChR1, es sensible a la luz y es capaz de mediar una corriente despolarizante en la celula cuando la celula se ilumina con luz. Adicionalmente, en algunas realizaciones, la invencion puede incluir polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos sustituidas o mutadas, en las que el polipeptido mutante retiene la naturaleza caracterlstica sensible a la luz del polipeptido quimerico precursor C1V1, pero tambien puede poseer propiedades alteradas en algunos aspectos especlficos. Por ejemplo, las protelnas quimericas C1V1 sensibles a la luz mutantes descritas en la presente memoria pueden presentar un nivel aumentado de expresion tanto dentro de una celula animal como en la membrana plasmatica de celulas animales; una respuesta alterada cuando se exponen a diferentes longitudes de onda de luz, particularmente luz roja y/o una combinacion de rasgos en los que el polipeptido quimerico C1V1 posee las propiedades de baja desensibilizacion, desactivacion rapida, activacion con poca luz violeta para una activacion cruzada minima con otros canales cationicos sensibles a la luz y/o fuerte expresion en celulas animales. En algunas realizaciones, la protelna C1V1 puede comprender una secuencia de aminoacidos al menos aproximadamente 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identica a la secuencia mostrada en las SEQ ID NO:8, 9, 10 u 11.
Se puede encontrar informacion adicional relacionada con protelnas canal cationico sensibles a la luz en la Publication de solicitud de patente de los Estados Unidos N.° 2007/0054319 y en la Publicaciones de Solicitud de Patente Internacional numeros WO 2009/131837 y WO 2007/024391. Se puede encontrar informacion adicional relacionada con protelnas SFO o SSFO en la Publicacion de solicitud de patente internacional N.° WO 2010/056970
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y en la Solicitud de patente provisional de los Estados Unidos numeros 61/410.704 y 61/511.905. Se puede encontrar informacion adicional relacionada con canales cationicos quimericos C1V1, as! como variantes mutantes de los mismos en Solicitud de patente provisional de los Estados Unidos numeros 61/410.736, 61/410.744 y 61/511.912.
Polinucleotidos
La divulgacion tambien proporciona polinucleotidos que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz descrita en la presente memoria. En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende un casete de expresion. En algunas realizaciones, el polinucleotido es un vector que comprende el acido nucleico anteriormente descrito. En algunas realizaciones, el acido nucleico que codifica una protelna opsina sensible a la luz de la divulgacion esta unido operativamente a un promotor. Los promotores son bien conocidos en la tecnica. Se puede usar cualquier promotor que funcione en una interneurona colinergica para la expresion de las protelnas sensibles a la luz y/o cualquier variante de las mismas de la presente divulgacion. Las regiones de control de la iniciacion o promotores, que son utiles para dirigir la expresion de las protelnas opsina sensibles a la luz o sus variantes en una celula animal especlfica son numerosos y familiares para los expertos en la materia. Puede usarse practicamente cualquier promotor capaz de dirigir estos acidos nucleicos. En algunas realizaciones, el promotor usado para dirigir la expresion de la protelna sensible a la luz puede ser el promotor de la colinacetiltransferasa (ChAT), que es capaz de dirigir la expresion solida de transgenes en la interneurona colinergica (Vease, por ejemplo, Gong et al., J. Neurosci., 27, 9817-9823 (2007)).
En la presente memoria tambien se proporcionan vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica una protelna opsina sensible a la luz o cualquier variante de la misma descrita en la presente memoria. Los vectores que se pueden administrar de acuerdo con la presente invencion tambien incluyen vectores que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un ARN (p. ej, un ARNm) que cuando se transcribe a partir de los polinucleotidos del vector tendra como resultado la acumulacion de protelnas sensibles a la luz en las membranas plasmaticas de las celulas animales diana. Los vectores que pueden usarse incluyen, sin limitacion, vectores lentivirales, VHS, adenovirales y virales adeno-asociados (VAA). Los lentivirus incluyen, pero no se limitan a VIH-1, VIH-2, VIS, VIF y VAIE. Los lentivirus pueden ser pseudotipados con las protelnas de la envoltura de otros virus, incluyendo pero sin limitarse a los virus VSV, rabia, Mo-MLV, baculovirus y Ebola. Tales vectores pueden prepararse usando metodos convencionales en la tecnica.
En algunas realizaciones, el vector es un vector VAA recombinante. Los vectores VAA son virus de ADN de tamano relativamente pequeno que pueden integrarse, de una manera estable y especlfica del sitio, en el genoma de las celulas que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de celulas sin inducir ningun efecto sobre el crecimiento, la morfologla o la diferenciacion celular y no parecen estar implicados en patologlas humanas. El genoma del VAA ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. Abarca aproximadamente 47.00 bases y contiene una region de repeticion terminal invertida (ITR) de aproximadamente 145 bases en cada extremo, que sirve como origen de replicacion para el virus. El resto del genoma se divide en dos regiones esenciales que llevan las funciones de encapsidacion: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen rep implicado en la replicacion viral y la expresion de los genes virales y la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que codifica las protelnas de la capside del virus.
Los vectores VAA pueden prepararse usando metodos estandar en la tecnica. Los virus adeno-asociados de cualquier serotipo son adecuados (vease, p.ej., Blacklow, pags. 165-174 de “Parvoviruses and Human Disease” J. R. Pattison, ed. (1988); Rose, Comprehensive Virology 3:1, 1974; P. Tattersall “The Evolution of Parvovirus Taxonomy” en Parvoviruses (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p5-14, Hudder Arnold, Londres, Reino Unido (2006) y DE Bowles, JE Rabinowitz, RJ Samulski “The Genus Dependovirus” (JR Kerr, SF Cotmore. ME Bloom, RM Linden, CR Parrish, Eds.) p15-23, Hudder Arnold, Londres, Reino Unido (2006). Se pueden encontrar metodos para purificar vectores en, por ejemplo, las patentes US-6.566.118, US-6.989.264 y US-6.995.006 y en el documento WO/1999/011764 Titulado “Methods for Generating High Titer Helper-free Preparation of Recombinant AAV Vectors”. La preparation de vectores hlbridos se describe, por ejemplo, en la Solicitud PCT N.1° PCT/US2005/027091. El uso de vectores derivados de los VAA para la transferencia de genes in vitro e in vivo ha sido descrito (Vease, por ejemplo, Publication de solicitud de patente internacional N°: 91/18088 y WO 93/09239; Patentes US-4.797.368, uS-6.596.535 y US-5.139.941 y la Patente Europea N.°: 048 8528. Estas publicaciones describen diversas construcciones derivadas de VAA en las que los genes rep y/o cap se eliminan y se sustituyen por un gen de interes y el uso de estas construcciones para transferir el gen de interes in vitro (en celulas cultivadas) o in vivo (directamente en un organismo). Los VAA recombinantes defectuosos para la replicacion de acuerdo con la invencion pueden prepararse co-transfectando un plasmido que contiene la secuencia de acido nucleico de interes flanqueada por dos regiones de repeticion terminal invertida (ITR) del VAA y un plasmido que lleva los genes de encapsidacion del VAA (genes rep y cap), en una llnea celular que esta infectada con un virus colaborador (por ejemplo un adenovirus). Los recombinantes del VAA que se producen se purifican despues mediante tecnicas estandar.
En algunas realizaciones, el vector(es) para su uso en los metodos de la invencion se encapsidan en una partlcula de virus (por ejemplo, partlcula de virus VAA, incluyendo, pero sin limitarse a VAA1, VAA2, VAA3, VAA4, VAA5,
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VAA6, VAA7, VAA8, VAA9, VAA10, VAA11, VAA12, VAA 13, VAA 14, VAA 15 y VAA16). De acuerdo con ello, la invencion incluye una particula de virus recombinante (recombinante porque contiene un polinucleotido recombinante) que comprende cualquiera de los vectores descritos en la presente memoria. Los metodos para producir tales particulas son conocidos en la tecnica y se describen en la Patente US-6.596.535, cuya divulgacion se incorpora aqui como referencia en su totalidad.
Administration de proteinas opsina sensibles a la luz
En algunos aspectos, los polinucleotidos que codifican las proteinas opsina sensibles a la luz divulgadas en la presente memoria (por ejemplo, un vector VAA) se pueden administrar directamente a las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado usando una aguja, cateter o dispositivo relacionado, usando tecnicas neuroquirurgicas conocidas en la tecnica, tal como por inyeccion estereotactica (Ver, p.ej., Stein et al., J. Virol, 73: 3424-3429, 1999; Davidson et al., PNAS, 97:3428-3432, 2000; Davidson et al., Nat. Genet. 3:219-223, 1993; y Alisky y Davidson, Hum. Gene Ther. 11:2315-2329, 2000.
En otros aspectos, cualquiera de las proteinas opsina sensibles a la luz pueden expresarse en las interneuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado de un animal transgenico. Por ejemplo, se puede emplear una linea transgenica de raton usando Cre-recombinasa bajo control del promotor de la colinacetiltransferasa (ChAT). Un vector de virus adeno-asociado (VAA) inducible por Cre que lleva el gen de opsina sensible a la luz puede por lo tanto ser inyectado estereotaxicamente en el NAc.
Tambien se pueden usar otros metodos para administrar proteinas sensibles a la luz a interneuronas colinergicas, tales como, pero sin limitarse a, transfeccion con lipidos o polimeros ionicos, electroporacion, transfeccion optica, impelencia o via pistola genica.
Fuentes de luz
Cualquier dispositivo que sea capaz de aplicar luz que tenga una longitud de onda para activar las proteinas sensibles a la luz expresadas en una neurona puede utilizarse para despolarizar y/o hiperpolarizar la neurona. Por ejemplo, se puede usar un dispositivo de suministro de luz para activar canales ionicos y/o bombas ionicas para afectar a la tension de la membrana de una o mas neuronas. Un dispositivo de suministro de luz puede configurarse para proporcionar estimulo optico a una region diana del cerebro. El dispositivo de suministro de luz puede comprender una base, una guia de canula que esta unida a la base y uno o mas conductos opticos unidos a la base a traves de la guia de canula. La base puede comprender uno o mas puertos de suministro de luz que estan posicionados para suministrar luz desde los conductos opticos a regiones de tejido diana, tales como el nucleo accumbens o el cuerpo estriado. Los conductos opticos pueden ser fibras opticas, donde el extremo proximal de la fibra esta unido a una fuente de luz optica y el extremo distal esta en comunicacion con los puertos de suministro de luz. La fuente de luz optica puede ser capaz de proporcionar luz continua y/o luz pulsada, y puede ser programable para proporcionar luz en secuencias de impulsos predeterminadas. El dispositivo de suministro de luz puede tener cualquier numero de conductos opticos como puede ser deseable, p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, etc. Los conductos opticos pueden llevar cada uno luz de la misma longitud de onda o de longitudes de onda diferentes. La luz suministrada puede tener una longitud de onda entre 450 nm y 600 nm, tal como luz amarilla o verde o azul. El dispositivo de suministro de luz puede tener cualquier numero de puertos de suministro de luz como puede ser deseable, p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, etc. En algunas variaciones, puede haber el mismo numero de puertos de suministro de luz que los conductos opticos mientras que en otras variaciones, puede haber un numero diferente de conductos opticos y puertos de suministro de luz. Por ejemplo, puede haber un unico conducto optico que transporta luz a dos o mas puertos de suministro de luz. En otra alternativa o adicionalmente, un unico conducto optico puede conectarse a un unico puerto de suministro de luz. La guia de canula puede estar configurada para ayudar a asegurar y alinear los conductos opticos con los puertos de suministro de luz. En algunas realizaciones, el dispositivo de suministro de luz esta configurado para suministrar luz al nucleo accumbens o al cuerpo estriado para alterar al menos un comportamiento relacionado con la recompensa en un individuo. Los dispositivos de suministro de luz pueden comprender tambien uno o mas electrodos de medicion que pueden estar configurados para medir la actividad neural. Por ejemplo, los electrodos de medicion pueden registrar cambios en el potencial de membrana (p.ej, potenciales de accion) y/o flujo de corriente a traves de una membrana de una o mas neuronas cuando las neuronas responden a un estimulo. En algunas variaciones, los electrodos de medicion pueden medir la respuesta electrica de una o mas neuronas a la estimulacion optica. Los electrodos de medicion pueden ser electrodos extracelulares o intracelulares.
En otros aspectos, el dispositivo de suministro de luz puede ser una fuente de luz implantable que no requiere sujecion fisica a una fuente de alimentacion externa. La fuente de luz implantable puede comprender un cuerpo interior, teniendo el cuerpo interior al menos un medio para generar luz que esta configurada para una fuente de energia. En algunas realizaciones, la fuente de energia puede ser una bateria interna para alimentar los medios generadores de luz. En otra realizacion, la fuente de luz implantable puede comprender una antena externa para recibir energia electromagnetica transmitida inalambricamente desde una fuente externa para alimentar los medios generadores de luz. La energia electromagnetica transmitida inalambricamente puede ser una onda de radio, una microonda o cualquier otra fuente de energia electromagnetica que pueda ser transmitida desde una fuente externa
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para alimentar los medios generadores de luz de la fuente de luz implantable. En una realizacion, el medio generador de luz es controlado por un circuito integrado producido usando un semiconductor u otros procesos conocidos en la tecnica.
En algunos aspectos, los medios de luz pueden ser un diodo emisor de luz (LED). En algunas realizaciones, el LED puede generar luz azul y/o verde. En otras realizaciones, el LED puede generar luz ambar, amarilla y/o azul. En algunas realizaciones, varios micro LED estan incrustados en el cuerpo interior de la fuente de luz implantable. En otras realizaciones, el medio generador de luz es un diodo laser de estado solido o cualquier otro medio capaz de generar luz. Los medios generadores de luz pueden generar luz que tiene una intensidad suficiente para activar las protelnas sensibles a la luz expresadas en la membrana plasmatica de los nervios en proximidad a la fuente de luz. En algunas realizaciones, la intensidad de la luz que llega a las interneuronas colinergicas del NAc o del cuerpo estriado producida por los medios generadores de luz tiene una intensidad de cualquiera de aproximadamente 0,05 mW/mm2, 0,1 mW/mm2, 0,2 mW/mm2, 0,3 mW/mm2, 0,4 mW/mm2, 0,5 mW/mm2, aproximadamente 0,6 mW/mm2, aproximadamente 0,7 mW/mm2, aproximadamente 0,8 mW/mm2, aproximadamente 0,9 mW/mm2, aproximadamente 1,0 mW/mm2, aproximadamente 1,1 mW/mm2, aproximadamente 1,2 mW/mm2, aproximadamente 1,3 mW/mm2, aproximadamente 1,4 mW/mm2, aproximadamente 1,5 mW/mm2, aproximadamente 1,6 mW/mm2, aproximadamente 1,7 mW/mm2, aproximadamente 1,8 mW/mm2, aproximadamente 1,9 mW/mm2, aproximadamente 2,0 mW/mm2, aproximadamente 2,1 mW/mm2, aproximadamente 2,2 mW/mm2, aproximadamente 2,3 mW/mm2, aproximadamente 2,4 mW/mm2, aproximadamente 2,5 mW/mm2, aproximadamente 3 mW/mm2, aproximadamente 3,5 mW/mm2, aproximadamente 4 mW/mm2, aproximadamente 4,5 mW/mm2, aproximadamente 5 mW/mm2, aproximadamente 5,5 mW/mm2, aproximadamente 6 mW/mm2, aproximadamente 7 mW/mm2, aproximadamente 8 mW/mm2, aproximadamente 9 mW/mm2, o aproximadamente 10 mW/mm2, inclusive, incluyendo valores entre estos numeros.
En algunos aspectos, los medios generadores de luz pueden ser activados externamente por un controlador externo. El controlador externo puede comprender un generador de energla que puede montarse en una bobina transmisora. En algunas realizaciones del controlador externo, se puede conectar una baterla al generador de energla, para proporcionar energla al mismo. Se puede conectar un interruptor al generador de energla, lo que permite a un individuo activar o desactivar manualmente el generador de energla. En algunas realizaciones, tras la activacion del interruptor, el generador de energla puede proporcionar energla a los medios generadores de luz en la fuente de luz mediante el acoplamiento electromagnetico entre la bobina de transmision en el controlador externo y la antena externa de la fuente de luz implantable. La bobina de transmision puede establecer un acoplamiento
electromagnetico con la antena externa de la fuente de luz implantable cuando esta en proximidad de la misma, para suministrar energla a los medios generadores de luz y para transmitir una o mas senales de control a la fuente de luz implantable. En algunas realizaciones, el acoplamiento electromagnetico entre la bobina de transmision del controlador externo y la antena externa de la fuente de luz implantable puede ser un acoplamiento de inductancia magnetica de radiofrecuencia. Cuando se utiliza acoplamiento de inductancia magnetica de radiofrecuencia, la frecuencia de funcionamiento de la onda de radio puede estar entre aproximadamente 1 y 20 MHz, inclusive, incluyendo cualquier valor entre estos numeros (por ejemplo, aproximadamente 1 MHz, aproximadamente 2 MHz, aproximadamente 3 MHz, aproximadamente 4 MHz, aproximadamente 5 MHz, aproximadamente 6 MHz,
aproximadamente 7 MHz, aproximadamente 8 MHz, aproximadamente 9 MHz, aproximadamente 10 MHz, aproximadamente 11 MHz, aproximadamente 12 MHz, aproximadamente 13 MHz, aproximadamente 14 MHz,
aproximadamente 15 MHz, aproximadamente 16 MHz, aproximadamente 17 MHz, aproximadamente 18 MHz,
aproximadamente 19 MHz, o aproximadamente 20 MHz). Sin embargo, se pueden utilizar otras tecnicas de acoplamiento, tales como un receptor optico, infrarrojo o un sistema de telemedida biomedica (Vease, por ejemplo, Kiourti, “Biomedical Telemetry: Communication between Implanted Devices and the External World, Opticon1826, (8):Spring, 2010).
Ejemplos de dispositivos de estimulacion de luz, incluyendo fuentes de luz, se pueden encontrar en las Solicitudes de patente internacional numeros PCT/US08/50628 y PCT/US09/49936 y en Llewellyn et al., 2010, Nat. Med., 16(10):161-165.
Opsinas sensibles a la luz expresadas en interneuronas colinergicas
En la presente memoria se proporcionan animales no humanos que comprenden una protelna opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de una interneurona colinergica en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del animal, en la que la protelna es sensible a la luz y es capaz de alterar el estado de polarizacion de la membrana de las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, en la que la iluminacion de la opsina altera al menos un comportamiento relacionado con la recompensa del animal. En algunas realizaciones, la protelna sensible a la luz se selecciona del grupo que consiste en NpHR, BR, AR y GtR3 descritos en la presente memoria. Por ejemplo, cualquiera de las protelnas NpHR descritas en la presente memoria puede expresarse en la membrana celular de las neuronas diana. En algunas realizaciones, el comportamiento relacionado con la recompensa es un comportamiento adictivo relacionado con una droga. La droga puede ser cualquier droga adictiva, como por ejemplo, opioides (por ejemplo, opio y herolna), metanfetamina, cocalna, ketamina, MDMA (3,4-metilendioximetanfetamina), dietilamida del acido lisergico, cannabinoides, alcohol, nicotina, o cualquier otra sustancia controlada. En una realizacion, la droga es cocalna. En otra realizacion, el comportamiento relacionado con la recompensa es la adiccion a la cocalna.
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Tambien se proporcionan en la presente memoria cortes de tejido cerebral que comprenden el nucleo accumbens o el cuerpo estriado, en los que una proteina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de interneuronas colinergicas del nucleo accumbens, en los que la proteina es sensible a la luz y es capaz de alterar el estado de polarizacion de la membrana de las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, en los que la iluminacion de la proteina altera al menos un comportamiento relacionado con la recompensa. En algunas realizaciones, los cortes de tejido cerebral son cortes de tejido cultivados extraidos de los animales no humanos descritos en la presente memoria. En algunas realizaciones, la proteina sensible a la luz es capaz de hiperpolarizar las membranas de interneuronas colinergicas del nucleo accumbens y se selecciona del grupo que consiste en NpHR, BR, AR y GtR3 descritos en la presente memoria. Por ejemplo, cualquiera de las proteinas NpHR descritas en la presente memoria puede expresarse en la membrana celular de las neuronas diana. En otras realizaciones, la proteina sensible a la luz es capaz de despolarizar la membrana de interneuronas colinergicas del nucleo accumbens y se selecciona del grupo que consiste en ChR2, SFO, SSFO y los C1V1 descritos en la presente memoria.
Metodos de la invention
En algunos aspectos, se proporcionan en la presente memoria metodos para alterar el comportamiento relacionado con la recompensa en un individuo que comprende: administrar un polinucleotido que codifica una proteina opsina sensible a la luz al individuo, en el que la proteina opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de interneuronas colinergicas en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del individuo y la proteina es sensible a la luz y es capaz de inducir hiperpolarizacion de la membrana de las interneuronas cuando las interneuronas son iluminadas con la luz, de modo que la activacion de la proteina por la luz altera al menos un comportamiento relacionado con la recompensa en el individuo. En algunas realizaciones, el polinucleotido se administra al nucleo accumbens o al cuerpo estriado del individuo. En algunas realizaciones, la proteina sensible a la luz se selecciona del grupo que consiste en NpHR, BR, AR y GtR3 descritos en la presente memoria. Por ejemplo, cualquiera de las proteinas NpHR descritas en la presente memoria puede expresarse en la membrana celular de las neuronas diana. En algunas realizaciones, el comportamiento relacionado con la recompensa es un comportamiento adictivo relacionado con una droga. La droga puede ser cualquier droga adictiva tal como, pero sin limitarse a, opioides (por ejemplo, opio y heroina), metanfetamina, cocaina, ketamina, MDMA (3,4-metilendioximetanfetamina), dietilamida del acido lisergico, cannabinoides, alcohol, nicotina o cualquier otra sustancia controlada. En una realizacion, la droga es cocaina. En otra realizacion, el comportamiento relacionado con la recompensa es la adiccion a la cocaina. En algunas realizaciones, el individuo es un animal no humano. En algunas realizaciones, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el polinucleotido comprende ademas un promotor (por ejemplo, un promotor ChAT) unido operativamente a la proteina opsina sensible a la luz. En algunas realizaciones, el polinucleotido es un vector.
Los metodos para medir la alteracion del comportamiento relacionado con la recompensa son muchos y bien conocidos en la tecnica (Ver, p.ej., Addiction Research Methods, (Miller et al., eds., 2010, Wiley-Blackwell, Reino Unido)). Por ejemplo, la adiccion a la cocaina y la alteracion del comportamiento adictivo relacionado con las drogas se pueden evaluar mediante el uso de la preferencia por el lugar condicionada (CPP, tambien conocido como lugar ambiental). La CPP es una tecnica comunmente utilizada en estudios con animales para evaluar las preferencias por estimulos ambientales que se han asociado con una recompensa positiva o negativa. La tecnica se utiliza a menudo para determinar el potencial adictivo de las drogas. El procedimiento implica varios ensayos en los que al animal se le presenta el estimulo positivo (p.ej., alimentos, neurotransmisores o los efectos de una droga de abuso) emparejado con la colocacion en un ambiente distinto que contenga varias senales (p.ej., tactiles, visuales y/o olfativas). Cuando mas tarde se prueba en el estado normal, los enfoques y la cantidad de tiempo que se pasa en los compartimentos previamente asociados con el estimulo positivo sirven como un indicador de preferencia y una medida del aprendizaje por recompensa.
En otros aspectos, se proporciona en la presente memoria un metodo para tratar la adiccion a drogas en un individuo que comprende: administrar un polinucleotido que codifica una proteina opsina sensible a la luz al individuo, en el que la proteina opsina sensible a la luz se expresa en la membrana celular de las interneuronas colinergicas en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del individuo y la proteina es sensible a la luz y es capaz de hiperpolarizar las interneuronas cuando las interneuronas se iluminan con la luz, de modo que al activar la proteina por la luz se altera el comportamiento relacionado con la recompensa en el individuo, en el que individuo ya no desea tomar drogas. En algunas realizaciones, el polinucleotido se administra en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del individuo. En algunas realizaciones, la proteina sensible a la luz se selecciona del grupo que consiste en NpHR, BR, AR y GtR3 descritos en la presente memoria. Por ejemplo, cualquiera de las proteinas NpHR descritas en la presente memoria puede expresarse en la membrana celular de las neuronas diana. En algunas realizaciones, el comportamiento relacionado con la recompensa es un comportamiento adictivo relacionado con una droga. La droga puede ser cualquier droga adictiva, como por ejemplo, opioides (por ejemplo, opio y heroina), metanfetamina, cocaina, ketamina, MDMA (3,4-metilendioximetanfetamina), dietilamida del acido lisergico, cannabinoides, alcohol, nicotina o cualquier otra sustancia controlada. En una realizacion, la droga es cocaina. En otra realizacion, el comportamiento relacionado con la recompensa es la adiccion a la cocaina. En algunas realizaciones, el individuo es un animal no humano. En otra realizacion, el individuo es un ser humano. En algunas realizaciones, el individuo ya no experimenta la experiencia de reforzar positivamente el uso de la droga. En algunas
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realizaciones, el polinucleotido comprende ademas un promotor (p.ej., un promotor ChAT) unido operativamente a la protelna opsina sensible a la luz. En algunas realizaciones, el polinucleotido es un vector.
Ejemplos de realizaciones
Se cree que la presente divulgacion es util para el control o caracterizacion del comportamiento reforzado en animales vivos. Las aplicaciones especlficas de la presente invencion facilitan la evaluacion de la adiccion y otros comportamientos reforzados en animales vivos. Dado que muchos aspectos de los ejemplos de realizaciones divulgados en la presente memoria se refieren y significativamente vienen a sumarse a los desarrollos previos en este campo, la siguiente discusion resume tales desarrollos previos para proporcionar una comprension solida de las bases y las ensenanzas subyacentes a partir de los cuales se pueden extraer detalles de la aplicacion y modificaciones. Es en este contexto en el que se proporciona la siguiente discusion. Aunque la presente invencion no esta necesariamente limitada a tales aplicaciones, se pueden apreciar diversos aspectos de la invencion a traves de una discusion de varios ejemplos usando este contexto.
La FIG. 10 representa un sistema para controlar el nucleo accumbens (NAc) o el cuerpo estriado dorsal, de acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion. Una fuente de estlmulo 102 esta unida 104 a una ubicacion diana 106. Esta ubicacion diana puede situarse en o cerca del NAc o del cuerpo estriado dorsal, por ejemplo, la ubicacion representada se alinea generalmente con el NAc, pero no esta necesariamente limitada.
De acuerdo con las realizaciones de la presente divulgacion, la fuente de estlmulo 102 puede incluir una fuente de luz optica. La fuente de luz optica esta opticamente unida a la ubicacion diana 106 (p.ej., utilizando fibra optica). La ubicacion diana 106 esta configurada para incluir celulas que responden al estlmulo optico. Estas celulas pueden incluir celulas que expresan opsinas sensibles a la luz incluyendo, pero sin limitarse a, bombas de iones (por ejemplo, NpHR y variantes de NpHR) y/o canales ionicos (por ejemplo ChR2/ChR1 y variantes de ChR2/ChR1).
De acuerdo con varias otras realizaciones de la presente divulgacion, la fuente de estlmulo 102 puede incluir un dispositivo de administracion de farmaco/farmacologico. El dispositivo de administracion esta unido a la ubicacion diana (por ejemplo, utilizando un lumen de administracion).
Ciertas realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la seleccion como diana de las neuronas colinergicas de las estructuras implicadas en los comportamientos naturales relacionados con la recompensa y/o en el aprendizaje por recompensa (por ejemplo, el NAc o cuerpo estriado dorsal) usando una fuente de estlmulo. La fuente de estlmulo 102 proporciona un estlmulo que controla la liberacion de acetilcolina dentro de la estructura. En ciertas realizaciones, este control se realiza de una manera espacio-temporal localizada que puede ser particularmente util para alterar las propiedades adictivas del abuso de sustancias sin afectar notablemente al refuerzo de otros comportamientos, por ejemplo, respuestas apetitivas o aversivas. El estlmulo puede proporcionarse a partir de una serie de fuentes de estlmulo diferentes. Ejemplos no limitantes incluyen activar opsinas sensibles a la luz expresadas en neuronas colinergicas, aplicar un impulso electrico a traves de uno o mas electrodos situados cerca de las neuronas colinergicas, liberar un farmaco en una ubicacion proxima a las neuronas colinergicas, aplicar un campo magnetico a una ubicacion proxima a las neuronas colinergicas y/o alternativas quirurgicas basadas en este conocimiento.
La FIG. 11 representa un diagrama de flujo para controlar la liberacion de acetilcolina, de acuerdo con las realizaciones de la presente divulgacion. Un acontecimiento basado en la recompensa 202 proporciona una base para evaluar o controlar comportamientos relacionados con la recompensa y/o para el aprendizaje por recompensa. Aunque no se limite a ello, el acontecimiento basado en la recompensa 202 puede ser la introduction de una sustancia adictiva a un paciente. Las instrucciones de control 204 determinan como una fuente de estlmulo 206 aplica un estlmulo 208 como una funcion de una diana que puede ser definida por uno o mas de los atributos temporales, ubicacion espacial y/o tipo de celula. El estlmulo 208 da lugar a cambios en la liberacion de acetilcolina 210. El efecto del estlmulo puede entonces ser monitorizado 212. La monitorizacion se puede utilizar para ajustar las instrucciones de control, ajustando as! el estlmulo para el resultado deseado. Varias realizaciones discutidas en la presente memoria proporcionan ejemplos adicionales que pueden usarse en conexion con (o ademas de) un proceso de este tipo.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la evaluacion de las propiedades adictivas de una sustancia. El control y/o la monitorizacion de la actividad de las neuronas colinergicas en estructuras neurales especialmente seleccionadas (o derivadas de estas) pueden usarse para predecir la naturaleza adictiva de la sustancia. Por ejemplo, las neuronas colinergicas de un nucleo accumbens pueden ser expuestas a la sustancia en estudio. La actividad de las neuronas colinergicas del nucleo accumbens se monitoriza despues de la exposition a la sustancia. Esta monitorizacion puede incluir, pero no se limita a, la actividad electrica (p.ej., potenciales de accion/activacion) y/o la liberacion de acetilcolina.
De acuerdo con otras realizaciones de la presente divulgacion, se pueden evaluar los efectos de un tratamiento para una sustancia adictiva. Por ejemplo, se puede utilizar un tratamiento potencial en relation con la exposicion de las neuronas colinergicas de un nucleo accumbens a la sustancia. La actividad de las neuronas colinergicas del nucleo
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accumbens se puede monitorizar en relacion con el tratamiento para evaluar su eficacia.
De acuerdo con las realizaciones de la presente divulgacion, los efectos de un tratamiento para la dependencia de sustancias se evaluan induciendo artificialmente una dependencia de las sustancias en un animal mediante la excitacion de neuronas colinergicas de un nucleo accumbens de un animal mientras se ensena una respuesta condicionada al animal. Los efectos del tratamiento se evaluan mediante la aplicacion del tratamiento y la monitorizacion de la respuesta condicionada del paciente.
Aspectos de la presente divulgacion se refieren a realizaciones de un sistema que incluye un conjunto de neuronas colinergicas, un dispositivo de administracion de farmacos para proporcionar farmacos al conjunto de neuronas colinergicas y un dispositivo de monitorizacion para evaluar la actividad del conjunto de neuronas colinergicas en respuesta a los farmacos que se proporcionan al conjunto de neuronas colinergicas. De acuerdo con ciertas realizaciones, el conjunto de neuronas colinergicas incluye opsinas sensibles a la luz y el sistema incluye ademas un sistema optico de administracion para excitar las neuronas colinergicas activando las opsinas sensibles a la luz.
De acuerdo con diversas realizaciones de la presente divulgacion, el control sobre el circuito neuronal puede incluir inhibicion o excitacion, lo que puede incluir cada uno una activacion coordinada y/o una susceptibilidad modificada a entradas de circuitos externos. Por ejemplo, la inhibicion se puede lograr usando una opsina sensible a la luz, tal como una bomba de iones (por ejemplo, NpHR y variantes de NpHR). Tales bombas de iones alteran el potencial de membrana de la neurona a valores alejados de su tension umbral para disuadir o inhibir los potenciales de accion. En otro caso, la excitacion se puede llevar a cabo usando una opsina sensible a la luz, tal como un canal ionico (por ejemplo, ChR2 y variantes de ChR2). Tales canales ionicos pueden hacer que el potencial de membrana varle y/o traspase la tension umbral, estimulando o promoviendo as! los potenciales de accion. De acuerdo con varias realizaciones, se puede usar una opsina sensible a la luz para variar (temporalmente) el potencial de reposo de una neurona para aumentar o disminuir su susceptibilidad a entradas de circuitos externos. Estas diversas opciones tambien se pueden utilizar en combinacion.
Varias realizaciones de la presente divulgacion se refieren a un sistema o metodo optogenetico que correlaciona el control temporal sobre un circuito neuronal con medidas medibles. Por ejemplo, una funcion de memoria particular podrla estar asociada con un trastorno neurologico. El sistema optogenetico se dirige a un circuito neuronal dentro de un paciente para su control selectivo. El sistema optogenetico consiste en monitorizar al paciente para obtener mediciones (p.ej., slntomas) asociados con el trastorno neurologico. De esta manera, el sistema optogenetico puede proporcionar information detallada sobre el circuito neuronal, su funcion y/o el trastorno neurologico.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a una solution o soluciones combinadas en las que el control sobre estructuras neuronales asociadas con comportamientos relacionados con la recompensa y/o aprendizaje por recompensa se usa en combinacion con la alteration de la adquisicion de memoria y los recuerdos asociados con el comportamiento relacionado con la recompensa. Por ejemplo, la adiccion a la cocalna puede ser estudiada y/o tratada mediante la inhibicion de estructuras neuronales asociadas con comportamientos relacionados con la recompensa y/o el aprendizaje por recompensa cuando las estructuras neurales se exponen a la cocalna. Ademas, la adquisicion de memoria asociada con el uso de cocalna puede ser alterada en el momento en que la cocalna se introduce al paciente. El recuerdo asociado con el consumo de cocalna tambien puede ser alterado, por ejemplo, en respuesta a un acontecimiento desencadenante asociado con el uso de cocalna. Aunque la cocalna se presenta como ejemplo, la aplicacion de tal solucion o soluciones no esta tan limitada. Las realizaciones y los resultados experimentales relacionados con la alteracion de la memoria se discuten con mas detalle a continuation.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la alteracion de la adquisicion de memoria, el recuerdo y/o asociaciones entre la memoria y respuestas emocionales, tales como recuerdos basados en la adiccion o basados en el miedo. En una realization particular, se refiera a un circuito neuronal especlfico a traves de la expresion de opsinas sensibles a la luz en el mismo. La funcion del circuito neuronal es alterada por la activacion de las opsinas expresadas, las cuales pueden inhibir la funcion del circuito neuronal (p.ej, utilizando NpHR o variantes de NpHR). En otras realizaciones, el circuito neuronal especlfico se selecciona implantando un electrodo(s) cerca del circuito neuronal especlfico. La funcion del circuito neuronal se altera mediante la aplicacion de una senal electrica al electrodo(s). En otras realizaciones, el circuito neuronal especlfico se selecciona implantando un dispositivo que suministre un farmaco de accion rapida cerca del circuito neuronal especlfico. La funcion del circuito neuronal se altera mediante la activacion del dispositivo para liberar el farmaco de accion rapida, lo que inhibe la funcion del circuito neuronal especlfico.
En ciertas aplicaciones, esta alteracion se puede implementar durante la creation de memoria. En otras aplicaciones, esta alteracion se puede implementar antes o durante la recuperation de la memoria. Esto puede ser particularmente util para los trastornos psiquiatricos o neurologicos relacionados con la recuperacion de la memoria, como el trastorno de estres postraumatico (TEPT). De acuerdo con ciertas realizaciones, la alteracion puede ser desencadenada en respuesta a un acontecimiento desencadenante de la memoria u otro estlmulo externo que se presenta y/o controla para la alteracion. Por ejemplo, la alteracion puede proporcionarse en respuesta a la introduction de un desencadenante de la memoria a un animal/paciente condicionado para responder al desencadenante. En otro caso, un paciente puede desencadenar activamente la alteracion. Por ejemplo, un paciente
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puede desencadenar la alteracion cuando experimenta una memoria asociada con TEPT. Otras realizaciones de la presente divulgacion se refieren a fomentar la adquisicion de memoria, el recuerdo y/o asociaciones entre la memoria y las respuestas emocionales. Por ejemplo, se puede usar una opsina expresada para aumentar la susceptibilidad de un circuito neuronal a estlmulos intrlnsecos (por ejemplo, usando opsinas de funcion de paso estabilizadas (SSFO) descritas en la presente memoria). El estlmulo puede ser proporcionado para fortalecer la adquisicion, formacion o recuperacion de una memoria. Esto puede usarse para determinar el papel del circuito o para tratar trastornos asociados con el deterioro de la memoria. Se ha descubierto que la alteracion (temporal) del circuito del hipocampo dorsal CA1 es eficaz para prevenir la adquisicion de la memoria del miedo contextual. En consonancia con ello, una teorla de redes neuronales prevaleciente sugiere que el proceso de consolidacion de la memoria comienza con modificaciones a corto plazo en las conexiones entre el hipocampo y la corteza, que permiten al hipocampo activar los sitios corticales relevantes que contribuyen a la memoria completa, en lugar de almacenar la propia memoria. Aunque estos rastros corticales son co-activados repetidamente, los cambios graduales de larga duracion en las conexiones entre ellos ocurren hasta que finalmente estas conexiones son bastante fuertes apoyar la memoria sin la implicacion del hipocampo. Sorprendentemente, se ha descubierto que esa alteracion del circuito del hipocampo dorsal CA1 es eficaz para bloquear el recuerdo de la memoria de miedo, incluso despues de que se cree que la reorganizacion cortical ha ocurrido.
La siguiente discusion, que incluye una discusion de varias realizaciones experimentales, presenta una serie de ejemplos de estas y otras realizaciones. Sin embargo, estos ejemplos no pretenden ser limitativos. Una realizacion de este tipo se refiere a la produccion de un vector lentiviral. Este vector lentiviral lleva el gen que codifica la eNpHR3.1 activable por luz que esta fusionada en el marco a la protelna fluorescente amarilla intensificada (eNpHR3.1-EYFP) bajo el control del promotor de la protelna quinasa A dependiente de calcio/calmodulina (CaMKIla), selectivo para las neuronas glutamatergicas excitatorias. eNpHR3.1 es una version truncada de eNpHR3.0 con una delecion del peptido senal intrlnseco N-terminal y es similar a eNpHR3.0 tanto en la fotocorriente como en la hiperpolarizacion que induce en las neuronas. La administracion estereotactica de CaMKIIa::eNpHR3.1 dio lugar a la expresion especlfica de CA1, abarcando todo su segmento dorsal. Dentro del area transfectada, el 94 % de las celulas CaMKIla expresaron eNpHR3.1 y el promotor proporciono especificidad completa, concretamente, todas las celulas eNpHR3.1-EYFP tambien fueron CaMKIIa positivas (Fig. 1B). Los registros con Optrode en ratones anestesiados confirmaron que la iluminacion con luz verde continua (561 nm) de las neuronas excitatorias CA1 inhiblan fuertemente la descarga (disminucion del 73 %) de una manera temporalmente precisa y reversible, sin afectar la amplitud de la descarga. Para demostrar que la inhibition optogenetica tambien puede bloquear la actividad neuronal inducida por FC de una manera especlfica de la region, se suministro luz verde continua bilateral a traves de dos fibras opticas insertadas a traves de una doble canula dirigida al dorsal CA1 durante el entrenamiento y tenidas para el marcador de activation sinaptica cFos. Los ratones que expresan eNpHR3.1 demostraron una expresion de cFos reducida especlficamente en CA1, pero no en otras dos regiones del cerebro implicadas en FC, la amlgdala basolateral (BLA) y la corteza cingulada anterior (ACC).
Se demostro que la inhibicion optogenetica modula la funcion cognitiva administrando luz verde continua bilateral a ratones que se mueven libremente durante el entrenamiento en una camara FC personalizada. Durante el entrenamiento, los ratones se introdujeron en el contexto A, y luego se les presento dos veces con un tono seguido de un choque en la planta de la pata, con suministro continuo de luz bilateral. La memoria del miedo fue evaluada al dla siguiente sin luz. La inhibicion optogenetica del dorsal CA1 durante el entrenamiento evito la adquisicion del miedo contextual. Se demostro que el efecto de la inhibicion optogenetica era reversible mediante el re- entrenamiento de los ratones en el mismo contexto sin exposition a la luz y se volvio a probar al dla siguiente. Los ratones que expresan eNpHR3.1 exhibieron memoria contextual intacta cuando no se suministraba luz durante el entrenamiento. Tambien se demostro que la inhibicion optogenetica del dorsal CA1 interfiere con la recuperacion de la memoria. Los mismos ratones fueron reexaminados, esta vez con suministro de luz durante el recuerdo y se encontro que la memoria que estaba presente el dla anterior no estaba disponible para su recuperacion en presencia de iluminacion.
Se demostro que la adquisicion del miedo y los mecanismos de expresion del miedo probablemente no se velan afectados en las pruebas de los mismos ratones en un contexto diferente para su memoria del tono. Los ratones que expresan eNpHr3.1 demostraron la adquisicion de memoria intacta de temor asociada a una senal auditiva despues de la inhibicion de la luz durante el entrenamiento, as! como recuerdo intacto de miedo a la senal con la iluminacion durante la prueba. Utilizando la correlation entre la exploration espacial y la adquisicion del miedo contextual, el tiempo de exploracion de la camara de condicionamiento se midio durante el entrenamiento bajo estimulacion lumlnica. No se encontro diferencia significativa entre los ratones que expresan eNpHR3.1 y sus controles. Se cree que la inhibicion optogenetica CA1 no tiene un efecto ansiolltico ya que los ratones se ensayaron para su exploracion en campo abierto con administracion ligera. No se encontraron diferencias significativas en la longitud de la trayectoria, velocidad o el porcentaje de tiempo pasado en el centro del campo (que sirve como signo de ansiedad) entre los ratones que expresan eNpHR3.1 y los ratones control.
Para analizar si la inhibicion optogenetica puede tener como resultado diferentes fenotipos de comportamiento cuando eNpHR se expresa en diferentes estructuras cerebrales, los ratones fueron inyectados bilateralmente con un virus adeno-asociado (VAA5) que lleva CaMKIIa::eNpHR3.0-EYFP en la BLA. La adquisicion del miedo mismo, es decir, la asociacion entre un estlmulo aversivo a cualquier estlmulo neutro, as! como la expresion del miedo reciente
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y remoto dependen de la amlgdaia y la activacion optogenetica de la BLA fue suficiente para inducir el miedo a parti r de un estlmulo neutral. Se demostro que la inhibition optogenetica de la BLA interfiere tanto con la adquisicion de FC contextual como con una senal auditiva.
Por consiguiente, las realizaciones de la presente divulgation se refieren a la introduction de eNpHR de tercera generation en una forma especlfica del tipo celular y de la region y al uso de la inhibicion optogenetica de CA1 para la interferencia con la adquisicion y recuperation de la memoria reciente.
Las realizaciones de la presente divulgacion tambien se refieren al uso de tales aspectos para refinar la comprension actual del papel del hipocampo en la recuperacion de la memoria remota. De acuerdo con una realization experimental de la presente divulgacion, un grupo de ratones fueron entrenados y luego analizados cuatro semanas mas tarde. Se demostro que el bloqueo del CAI durante la recuperacion parece bloquear (completamente) la memoria remota de miedo. Esta interferencia con la recuperacion tambien demostro ser reversible, ya que cuando los ratones se sometieron a la prueba al dla siguiente sin iluminacion pareclan expresar miedo de forma similar a los controles. Los ratones que expresan eNpHr3.1 demostraron recuperacion de la memoria de miedo a la senal auditiva remota intacta con la iluminacion durante la prueba con senal, lo que sugiere que su mecanismo de expresion del miedo permanece intacto. Sorprendentemente, esto sugiere la participation del hipocampo en la memoria remota del miedo.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren tambien a la capacidad de la inhibicion de CA1 (optogenetica o de otro tipo) para afectar reversiblemente al recuerdo remoto del miedo evitando la recuperacion de las memorias a largo plazo en tiempo real, despues de la recuperacion repetida y la reconsolidacion. Los resultados experimentales se obtuvieron entrenando a otro grupo de ratones y luego sometiendoles a la prueba cinco semanas despues para verificar la persistencia de un rastro de memoria (sin luz tanto en el entrenamiento y en las pruebas). En ambos grupos se encontraron resultados similares. Al dla siguiente, los mismos ratones se sometieron a la prueba con iluminacion y el grupo eNpHR3.1 parecla no recuperar la memoria aversiva. Se demostro que este efecto era reversible, ya que al dla siguiente, cuando se probo sin suministro de luz, los ratones que expresan eNpHR3.1 demostraron memoria contextual intacta. Ademas, despues de que los ratones ya hablan recordado el contexto aversivo y expresaron miedo, la respuesta al miedo ceso rapidamente tan pronto como se suministro nuevamente la luz, desde la mitad del ensayo de prueba y hacia adelante.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren por lo tanto a la interferencia reversible de la memoria remota del miedo en tiempo real, incluso despues de que la memoria ya haya sido recuperada. Esto puede ser particularmente util para tratamientos terapeuticos, p.ej, en los cuales se puede detener una memoria perturbadora en el momento en el que aparece, por ejemplo, en pacientes con TEPT, sin afectar permanentemente otras memorias que se almacenan en la misma estructura cerebral.
La aparente implication directa del hipocampo en el acceso a las memorias remotas sugiere un hallazgo sorprendente de que el hipocampo intacto sigue siendo el activador por defecto del rastro de la memoria. Se realizaron ensayos experimentales para determinar los efectos de la naturaleza temporal y/o la resolution de la inhibicion. El experimento de memoria remota se repitio con una iluminacion precisa solamente durante la duration de la prueba (como antes) o exposition prolongada a la luz, en la que se administro luz durante 30 minutos antes de la prueba y despues continuamente a lo largo de la prueba. La inhibicion optogenetica precisa inhibio significativamente la recuperacion de la memoria remota, mientras que la inhibicion prolongada no tuvo ningun efecto significativo en la recuperacion de la memoria remota. Cuando los ratones del grupo de la inhibicion prolongada se volvieron a probar al dla siguiente con una administration de luz precisa (durante la prueba solamente), mostraron inhibicion del recuerdo del miedo. No se cree que la falta de efecto de la administracion prolongada de luz sea atribuible a una disminucion de la inhibicion por eNpHR3.1 con el tiempo o una reduction en la salud celular debido a exposicion prolongada a la luz, como registros de parches de celulas enteras en celulas eNpHR3.1 positivo en cortes preparados a partir de los mismos ratones que mostraban que la capacidad de eNpHR para suprimir la descarga segula siendo la misma a lo largo de un perlodo de 30 minutos y era reversible. Estos datos sugieren que mientras que el hipocampo intacto es el activador por defecto del rastro de memoria remota, el rastro de memoria no se almacena en el hipocampo, como cuando se da suficiente tiempo para compensar su inactivation, el rastro de memoria puede ser recuperado por otras estructuras cerebrales.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la inhibicion de la memoria remota a traves de la inhibicion de la corteza cingulada anterior (ACC). Los experimentos se realizaron dirigiendose a la ACC con un virus CaMKIIa::eNpHR3.0-EYFP y analizando el efecto de la inhibicion optogenetica el dla uno y un mes despues del entrenamiento la inhibicion optogenetica de la ACC no tenia efecto aparente sobre la memoria reciente, pero deterioro significativamente la memoria remota. En conjunto, estos hallazgos sugieren que incluso despues de la reorganization cortical la forma mas eficiente de activar el rastro de la memoria sigue involucrando el hipocampo.
Se cree que el hipocampo proporciona una entrada de senales continua a la corteza. En consecuencia, se realizo un experimento para determinar si la alteration del recuerdo remoto es un subproducto de la caida repentina en la entrada de senales desde el hipocampo a la corteza, incluso si esta entrada de senales no esta relacionada con la tarea de recuerdo. Otra fuente de entrada de senales cortical principal, los bulbos olfatorios (OB), fue seleccionada
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para la introduccion de un virus CaMKIIa::eNpHR3.0-EYFP y el efecto de la inhibicion optogenetica fue analizado durante el recuerdo reciente y remoto del miedo. La inhibicion optogenetica del OB no tuvo ningun efecto significativo en la recuperacion de la memoria en ninguno de los dos momentos, lo que sugiere que una calda repentina de la entrada excitatoria por otro lado no relacionada con la corteza no es suficiente para interferir con el recuerdo. Cuando se recuperan las memorias remotas, estas quedan disponibles para la reconsolidacion, lo que las hace susceptibles a la interrupcion, pero esto tambien puede fortalecer la traza. Los aspectos de la presente divulgacion se refieren a la terapia para pacientes con TEPT, en el que una memoria perturbadora recurrente puede ser detenida tan pronto aparece al bloquear de forma reversible una memoria remota de miedo en tiempo real, antes y despues de la reconsolidacion o en tiempo real despues de que ya se ha recuperado.
De acuerdo con otra realizacion de la presente divulgacion, las memorias relacionadas con drogas de abuso pueden inhibirse para reducir el comportamiento de busqueda de la droga. Otras realizaciones se refieren a la capacidad de afectar instantaneamente a la cognicion por modulacion optogenetica de diferentes areas cerebrales con el fin de estudiar el papel de poblaciones neuronales especlficas en procesos de memoria y permitir una diseccion temporal, genetica y espacial mas detallada de los circuitos neuronales subyacentes.
Los aspectos especlficos de la presente invencion se refieren a la conmutacion de la memoria usando genes de opsina microbiana adaptados para las neurociencias, que permitan la transduccion de trenes de pulsos de luz en cambios de potencial de membrana de milisegundo en los tipos de celulas especlficas dentro del cerebro de mamlfero intacto (p.ej., canalrodopsina (ChR2), canalrodopsina de Volvox (VChRI) y halorodopsina (NpHR)). ChR2 es una rodopsina derivada del alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii. El termino “rodopsina”, tal como se usa en la presente memoria, es una protelna que comprende al menos dos bloques estructurales, una protelna opsina y un cofactor unido covalentemente, usualmente retinal (retinaldehldo). La rodopsina ChR2 se deriva de la opsina canalopsina-2 (Chop2), originalmente denominada clamopsina-4 (Cop4) en el genoma de Chlamydomonas. Las propiedades temporales de una canalrodopsina despolarizante, ChR2, incluyen una cinetica rapida de activacion y desactivacion, lo que proporciona la generacion de trenes de potencial de accion temporalmente precisos.
Para las aplicaciones que buscan una activacion a una escala de tiempo larga, se ha descubierto que la cinetica de desbloqueo normalmente rapida de las canalrodopsinas puede ser ralentizada. Por ejemplo, ciertas aplicaciones de canalrodopsinas aplican luz de 1 mW/mm2 practicamente durante todo el tiempo en el que se desea la despolarizacion, lo que puede ser menos de lo deseable. Gran parte de la discusion de la presente memoria se refiere a ChR2. A menos que se indique lo contrario, la invencion incluye una serie de variantes similares. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, Chop2, ChR2-310, Chop2-310 y la canalrodopsina de Volvox VChRI. Para mas detalles sobre la VChR1 se puede hacer referencia a “Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri”. Nat Neurosci. June 2008, 11 (6):631-3. Publicada en Internet el 23 de abril de 2008, que se incorpora completamente en la presente memoria como referencia. En otras aplicaciones, se pueden hacer modificaciones similares a otras moleculas de opsina. Por ejemplo, se pueden hacer modificaciones/mutaciones a variantes de ChR2 o VChR1. Ademas, las variantes modificadas pueden usarse en combinacion con bombas de iones activadas por luz.
Las realizaciones de la presente invencion incluyen variantes de aminoacidos relativamente menores de las secuencias naturales. En un caso, las variantes son mas de aproximadamente el 75 % homologas a la secuencia de protelnas de las secuencias naturales. En otras variantes, la homologla es mayor que aproximadamente el 80 %. Sin embargo, otras variantes tienen homologla mayor que aproximadamente 85 %, mayor que 90 % o incluso de hasta aproximadamente el 93 % a aproximadamente el 95 % o aproximadamente el 98 %. La homologla en este contexto significa semejanza o identidad de secuencia, prefiriendose la identidad. Esta homologla se puede determinar usando tecnicas estandar conocidas en el campo del analisis de secuencias. Las composiciones de las realizaciones de la presente invencion incluyen las secuencias de protelna y acido nucleico proporcionadas en la presente memoria, incluyendo variantes que son mas del 50 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 55 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 60 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 65 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 70 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 75 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 80 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 85 % homologas a la secuencia proporcionada, mas de aproximadamente 90 % homologas a la secuencia proporcionada, o mas de aproximadamente 95 % homologas a la secuencia proporcionada.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la estimulacion de una celula diana se utiliza generalmente para describir la modification de las propiedades de la celula. Por ejemplo, el estlmulo de una celula diana puede tener como resultado un cambio en las propiedades de la membrana celular que puede conducir a la despolarizacion o polarization de la celula diana. En un caso particular, la celula diana es una neurona y el estlmulo afecta a la transmision de impulsos facilitando o inhibiendo la generacion de impulsos (potenciales de accion) por la neurona.
Para mas detalles sobre las opsinas sensibles a la luz, puede hacerse referencia a la publication PCT N.° WO 2010/056970, titulada “Optically-Based Stimulation of Target Cells and Modifications Thereto”, concedida a Deisseroth et al.
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Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la aplicacion de cambios bioestables en la excitabilidad de las poblaciones diana. Esto incluye, pero no esta necesariamente limitado a, el doble mutante ChR2-C128S/D156A. Se ha encontrado que este mutante doble ChR2-C128S/D156A es bien tolerado en neuronas del hipocampo cultivadas y conserva las propiedades esenciales de SFO de activacion rapida gradual con pulsos breves aislados de luz azul y desactivacion con luz verde o amarilla. En particular, el espectro de activacion de ChR2-C128S/D156A alcanza un maximo a los 445 nm. Se encontro un segundo pico de desactivacion a 390-400 nm, con una desactivacion mas rapida pero menos completa en comparacion con el pico de desactivacion de 590 nm. Se encontro que las fotocorrientes maximas en celulas que expresaban ChR2-C128S/D156A eran robustas y comparables a las de celulas ChR2-D156A (231,08 ± 31,19 EEM; n = 9 celulas y 320,96 ± 78,26 EEM; n = 7 celulas, respectivamente).
Las neuronas individuales transfectadas y sometidas a pinzamiento de tension en parches de membrana se activaron despues con impulsos de 100 ms de luz de 470 nm y para garantizar que a lo largo de los largulsimos registros la calda de corriente no fuera atribuible a la degradacion celular, cada celula se desactivo con pulsos de luz prolongados de 590 nm a intervalos distintos para determinar la magnitud de la corriente SFO restante en cada punto de tiempo. Sorprendentemente, las neuronas que expresan ChR2-C128S/D156A dieron lugar a fotocorrientes sostenidas que eran mas estables que las de celulas que expresan un solo mutante solo. El ajuste de una curva de decaimiento mono-exponencial a la relacion de desactivacion/activacion a lo largo del tiempo revelo una constante de tiempo de decaimiento espontaneo de 29,3 min para ChR2-C128S/D156A, lo que indica que las mutaciones C128 y D156 actuan sinergicamente para retrasar la desintegracion del estado abierto de ChR2.
En consonancia con la mejora requerida para la aplicacion prevista a comportamientos complejos de mamlferos, partes significativas de la corriente de la SFO mutante doble estaban todavla presentes hasta 20 minutos despues del pulso de fotoactivacion unico. Basandose en estas cineticas de decaimiento sorprendentemente lentas, el gen mutante doble se denomina gen SSFO (de opsina de funcion gradual estabilizada). La SSFO tambien se utiliza como forma abreviada de la protelna activa. Ambos residuos probablemente estan implicados en el cierre (o como compuerta) del canal ChR2 y ambas mutaciones probablemente estabilizaran la configuracion de estado abierto del canal. Sin estar limitado por la teorla, los aspectos de la presente divulgacion se refieren al descubrimiento de que la SSFO puede estar completamente bloqueada en la progresion del fotociclo y, por tanto, puede representar la estabilidad maxima posible con la ingenierla del fotociclo. Por ejemplo, a diferencia de ChR2-C128X y ChR2-D156A, el fotociclo de la SSFO no parece tener acceso a subproductos desprotonados inactivos adicionales que probablemente se separan del fotociclo en etapas posteriores del fotociclo no alcanzadas en este mutante, lo que a su vez hace que la SSFO sea aun mas fiable para su uso repetido in vivo que las mutaciones parentales unicas.
Las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la sensibilidad de la SSFO a la luz. Por ejemplo, las canalrodopsinas con constantes de decaimiento lento actuan eficazmente como integradores de fotones. Esto puede ser particularmente util para estrategias mas sensibles y menos invasivas a la de la modulacion de circuito optogenetico, todavla con accion facilmente titulable sobre la poblacion neuronal diana mediante la modulacion de la longitud del impulso de luz. Se ha descubierto que, incluso a intensidades de luz extraordinariamente bajas (tan bajas como 8 pW/mm2), se podrlan obtener cientos de picoamp de fotocorrientes de celulas enteras a partir de neuronas que expresan SSFO, lo que aumento con una cinetica monoexponencial en respuesta a luz de 470 nm durante todo el tiempo de iluminacion. Otros aspectos se relacionan con el uso de constantes de tiempo de activacion que estan linealmente correlacionadas con la potencia luminosa de activacion en una escala log-log, que es indicativa de una relacion potencia-ley y sugiere que la SSFO es un integrador puro, con la exposicion a los fotones total a lo largo del tiempo como unico determinante de la fotocorriente. Por ejemplo, se cree que el numero de fotones por area de membrana requeridos para que las fotocorrientes alcancen una activacion submaxima dada (tiempo hasta T) es constante independientemente de la potencia luminosa de activacion.
Ejemplos de realizaciones de la presente divulgacion se refieren al uso de una quimera hlbrida ChR1/VChR1 que no contiene ninguna secuencia de ChR2 en absoluto, se deriva de dos genes de opsinas que no se expresan bien individualmente y denominado en la presente memoria como C1V1. Las realizaciones de la presente divulgacion tambien se refieren a mejoras en la orientacion a la membrana de VChR1 mediante la adicion de una senal de trafico de membrana derivada del canal Kir2.1. Las imagenes confocales de las neuronas cultivadas que expresan VChR1-EYFP revelaron una gran proporcion de protelna intracelular en comparacion con ChR2; por lo tanto, para aumentar la orientacion a la membrana de VChR1, hemos anadido una senal de trafico de membrana derivada del canal Kir2.1. La orientacion a la membrana de este VChR1-ts-EYFP estaba ligeramente mejorada en comparacion con VChR1-EYFP; sin embargo, las fotocorrientes medias registradas de neuronas del hipocampo cultivadas que expresan VChR1-ts-EYFP fueron solo ligeramente mayores que las de VChR1-EYFP. Por consiguiente, las realizaciones de la presente divulgacion se refieren a VChR1 modificado por intercambio de helices con las helices correspondientes de otros ChR. Por ejemplo, se ha descubierto una mejora robusta en dos quimeras en las que las helices 1 y 2 se reemplazaron con los segmentos homologos de ChR1. Se descubrio que independientemente de que los sitios de corte empalme estuviesen en el bucle intracelular entre las helices 2 y 3 (en el residuo ChR1 A1a145) o dentro de la helice 3 (en el residuo ChR1 Trp163), las quimeras resultantes fueron expresadas de forma robusta y mostraron fotocorrientes con una intensificacion y propiedades espectrales similares. Este resultado fue inesperado ya que ChR1 solo esta debilmente expresada y mal integrada en las membranas de la mayoria de las celulas hospedadoras de mamifero. La quimera hlbrida ChR1/VChR1 resultante se denomina en la presente
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memoria C1V1.
Algunos aspectos de la presente divulgacion se refieren a la expresion de C1V1 en neuronas del hipocampo cultivadas. Los ensayos experimentales han mostrado una serie de resultados sorprendentes y utiles, los cuales se discuten con mas detalle a continuacion. C1V1-EYFP exhibe una fluorescencia media sorprendentemente mejorada en comparacion con VChR1-EYFP. Las fotocorrientes de celulas enteras en las neuronas que expresan C1V1 eran mucho mas grandes que las de VChR1-EYFP y VChR1-ts-EYFP y la selectividad ionica fue similar a la de ChR2 y VChR1. La adicion de la senal de trafico Kir2.1 entre C1V1 y YFP potencio las fotocorrientes en un 41 % adicional (las fotocorrientes medias de C1V1-ts-EYFP eran extremadamente grandes, casi diez veces mayores que las de tipo silvestre (VChR1). Los niveles medios de fluorescencia se ajustaron estrechamente a las fotocorrientes medidas (fluorescencia media 9,3 ± 1, 19,6 ± 3,4, 19,8 ± 2,8 y 36,3 ± 3,8 para VChR1-EYFP, VChR1-ts-EYFP, C1V1-EYFP y C1V1-ts-EYFP, respectivamente), lo que sugiere que el aumento en los tamanos de la fotocorriente se debio principalmente a la mejor expresion de estos canales en las neuronas de mamlferos. La fluorescencia somatica total (medida como densidad de plxeles integrada) se correlaciono linealmente con el tamano de fotocorriente en celulas individuales registradas/visualizadas a traves de las diferentes construcciones (VChR1, VChR1-ts-EYFP, C1V1, C1V1-ts-EYFP). Esto sugiere (sin estar limitado por la teorla) que el aumento de la fotocorriente de C1V1 es el resultado de los cambios de expresion funcional en las neuronas.
Varias realizaciones de la presente divulgacion se refieren a opsinas con constantes de decaimiento rapido. Esta propiedad puede ser particularmente util para proporcionar un control preciso sobre la descarga, por ejemplo, con el fin de interferir mlnimamente con las conductancias intrlnsecas, desencadenar descargas individuales por pulso de luz y/o minimizar los potenciales de meseta durante los trenes de pulso de luz. Los resultados experimentales sugieren que las fotocorrientes evocadas por luz registradas en C1V1-ts-EYFP sufrieron decaimiento con una constante de tiempo similar a la de VChR1. Por lo tanto, los aspectos de la presente divulgacion se refieren a modificaciones en la region cromofora para mejorar la cinetica del fotociclo, reducir la inactivacion y/o la posible absorcion adicional de desplazamiento al rojo.
Una realizacion se refiere a una mutacion E162T de ChETA correspondiente, cuyos experimentos sugieren que proporciona un fotociclo acelerado (por ejemplo, casi 3 veces) (puede hacerse referencia a Gunaydin, et al., Ultrafast optogenetic control, Nat Neurosci, 2010 y que se incorpora completamente en la presente memoria por referencia). Sorprendentemente, se demostro que esta mutacion cambia el espectro de accion hipocromico a 530 nm, mientras que las mutaciones analogas en ChR2 u otras rodopsinas microbianas han provocado un desplazamiento al rojo.
Otra realizacion se refiere a una mutacion del glutamato-122 a la treonina (C1V1-E122T). Las pruebas experimentales mostraron que C1V1-E122T es inactivado solo un 26 % en comparacion con el 46 % de inactivacion de ChR2; ademas, el espectro se desplazo mas al rojo hasta 546 nm.
Otra realizacion de la presente divulgacion se refiere a un doble mutante de C1V1 que incluye tanto las mutaciones E122T como E162T. Las pruebas experimentales han demostrado que la inactivacion de la corriente era incluso menor que en el mutante E122T y el fotociclo era mas rapido en comparacion con E162T. Esto sugiere que multiples propiedades utiles de las mutaciones individuales se conservaron juntas en el doble mutante.
Las realizaciones de la presente divulgacion incluyen la expresion de diversas opsinas sensibles a la luz en neuronas. Pruebas experimentales de genes de opsina C1V1 en las neuronas se llevaron a cabo mediante la generacion de vectores lentivirales que codifican C1V1-ts-EYFP y varias combinaciones de mutaciones puntuales descritas en la presente memoria. Las opsinas se expresaron a continuacion en neuronas del hipocampo cultivadas y se registraron fotocorrientes de celulas enteras en condiciones de estimulacion identicas (pulsos de 2 ms, luz de 542 nm, 5,5 mW/mm2). Las fotocorrientes en celulas que expresan C1V1, C1V1-E162T y C1V1-E122T/E162T eran todas robustas y con tendencia mayor que las fotocorrientes de ChR2-H134R. Los experimentos tambien incluyeron una comparacion de la fluorescencia YFP somatica integrada y las fotocorrientes de las celulas que expresan C1V1- E122T/E162T y de celulas que expresan ChR2H134R. Sorprendentemente, las celulas C1V1-E122T/E162T mostraron fotocorrientes mas fuertes que las celulas ChR2H134R a niveles de fluorescencia equivalentes. Esto sugiere que C1V1 podrla poseer una mayor conductancia unitaria en comparacion con ChR2-H134R. Los resultados de los ensayos sugieren que la cinetica de C1V1-E122T fue mas lenta que la de C1V1-E122T/E162T y que las celulas que expresan C1V1-E122T respondieron mas fuertemente a la luz roja (630 nm) que las celulas que expresan el doble mutante. Esto puede ser particularmente util para generar la activacion optogenetica en respuesta a la luz roja.
En consonancia con diversas realizaciones de la presente divulgacion, las neuronas inhibidoras y/o excitadoras que residen dentro del mismo microcircuito son las seleccionadas para la introduction de varias opsinas. Las pruebas experimentales se realizaron con C1V1-E122T/E162T y ChR2-H134R expresados separadamente bajo el promotor CaMKIla en neuronas del hipocampo cultivadas. Las celulas que expresan C1V1-E122T/E162T activadas en respuesta a pulsos de luz verde de 2 ms (560 nm) pero no a pulsos de luz violeta (405 nm). Por el contrario, las celulas que expresan ChR2-H134R activadas en respuesta a pulsos de luz de 405 nm de 2 ms, pero no a pulsos de luz de 561 nm de 2 ms.
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Varias realizaciones de la presente divulgacion se refieren a la activacion independiente de dos poblaciones neuronales dentro de los cortes de cerebro vivo. Las pruebas experimentales fueron realizadas con CaMKIIa-C1V1- E122T/E162Tts-eYFP y EFla-DIO-ChR2-H134R-EYFP en mPFC de ratones PV::Cre. En las celulas que no expresan PYR, los pulsos de luz de 405 nm desencadenaron corrientes postsinapticas inhibitorias (IPSC) intensas y rapidas debido a la activacion directa de las celulas PV, mientras que los pulsos de luz de 561 nm desencadenaron solamente las esperadas IPSC polisinapticas de latencia larga como consecuencia del efecto sobre las celulas piramidales que expresan C1V1 por las neuronas inhibidoras locales.
Varias realizaciones descritas anteriormente o mostradas en las figuras pueden aplicarse conjuntamente y/o de otras maneras. Uno o mas de los elementos representados en los dibujos/figuras tambien se pueden aplicar de una manera mas separada o integrada, o eliminarse y/o resultar inoperables en ciertos casos, como es util de acuerdo con aplicaciones particulares. A la vista de la descripcion en la presente memoria, los expertos en la memoria reconoceran que se pueden hacer muchos cambios en ella sin apartarse del alcance de la presente invencion.
Ejemplos
Las neuronas que emplean el neurotransmisor acetilcolina estan muy extendidas pero son relativamente raras, con cuerpos celulares y proyecciones escasamente distribuidas en gran parte del cerebro de los mamlferos. Se sabe que la modulacion farmacologica de los diversos receptores de acetilcolina afecta a numerosos procesos cerebrales, pero a menudo con efectos secundarios debido a las limitaciones en la especificidad del farmaco para el tipo de receptor y la poblacion de celulas diana, de tal manera que la funcion causal final de las neuronas colinergicas en la funcion y comportamiento del circuito no estan del todo claros. En un caso paradigmatico, las interneuronas colinergicas gigantes del nucleo accumbens (NAc) son un grupo estructuralmente distintivo y escasamente distribuido de neuronas cuya funcion se ha mantenido elusiva debido a la incapacidad experimental para activar o desactivar con precision estas celulas en el tejido vivo o en los animales que muestran comportamiento. Aqul integramos varias tecnologlas de control optico, en el contexto del comportamiento de mamlferos que se mueven libremente, electrofisiologla in vivo y fisiologla de cortes, para investigar causalmente la funcion de estas neuronas por excitacion directa o inhibicion con alta precision celular y temporal. Notablemente, a pesar de representar una pequena (<1 %) fraccion de la poblacion neuronal local, encontramos que las neuronas colinergicas en el NAc tienen un papel dominante de control, ejerciendo una potente modulacion bidireccional de la actividad en el circuito circundante. Ademas, se encontro que estas neuronas eran activadas directamente por la cocalna y que silenciar esta actividad inducida por drogas durante la exposicion a la cocalna en mamlferos de comportamiento libre alteraba la recompensa de la cocalna. Es importante destacar que la manipulacion de las interneuronas colinergicas no era aversiva por si misma, lo que sugiere que estas celulas unicas juegan un papel en la aplicacion especlficamente de comportamientos hedonicos relevantes para las drogas de abuso a traves de su potente influencia en los circuitos del NAc.
La acetilcolina es un neurotransmisor importante y ampliamente estudiado, que actua sobre una enorme diversidad de receptores y celulas diana (1-8). Los estudios farmacologicos y geneticos pioneros han elucidado las influencias complejas ya menudo opuestas de los subtipos individuales de los receptores muscarlnicos y nicotlnicos de acetilcolina en numerosos procesos biologicos (9-15), pero ningun estudio ha resuelto aun la cuestion fundamentalmente distinta del papel causal de las propias neuronas colinergicas en un tejido del SNC, a pesar de la importancia hipotetica de estas neuronas en el aprendizaje, memoria, atencion y recompensa (16-22). Abordar tal cuestion requerirla un paradigma novedoso para el control selectivo y temporalmente preciso (activacion e inhibicion) de las neuronas colinergicas dentro de los tejidos de mamlferos vivos, ya que las investigaciones anteriores han tenido como resultado hallazgos contradictorios probablemente debido a las dificultades planteadas por la especificidad y resolucion temporal. Por ejemplo, elegantes enfoques farmacologicos in vivo (23-26) han descrito que la transmision colinergica en el NAc (una estructura implicada en los comportamientos relacionados con recompensas naturales y las respuestas a las drogas como la cocalna (27-33)) es necesaria para el aprendizaje por recompensa, mientras que los nuevos estudios de ablacion molecular de interneuronas colinergicas dentro del NAc han descrito una intensificacion del aprendizaje por recompensa asociada a las mismas (34]. Estas interneuronas colinergicas dentro del NAc son particularmente intrigantes ya que constituyen menos del 1 % de la poblacion neuronal local (35), pero proyectan a traves del NAc y proporcionan su unica entrada colinergica conocida (36, 37). Los receptores colinergicos relevantes se expresan localmente y los agonistas farmacologicos nicotlnicos y muscarlnicos pueden ejercer influencias complejas en las neuronas espinosas medianas (MSN, que representan mas del 95 % de la poblacion neuronal local y constituyen la salida del NAc) (38-41), aunque se desconoce el efecto neto (si lo hay) de las rarlsimas interneuronas colinergicas sobre cualquier aspecto de la fisiologla o comportamiento del NAc, al igual que con otras regiones cerebrales.
Ejemplo 1: Expresion de protefnas opsina sensibles a la luz en interneuronas colinergicas del nucleo accumbens
Hemos emprendido un enfoque optogenetico (42-44) para resolver esta cuestion impulsando o bloqueando selectivamente la activacion del potencial de accion en estas celulas, tanto con una alta resolucion temporal como con una alta especificidad de tipo celular. Para expresar los genes de opsina microbiana especlficamente en interneuronas colinergicas, se empleo una llnea transgenica de raton que expresa la Cre recombinasa bajo el
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promotor de la colinacetiltransferasa (ChAT) (45). Se inyecto estereotaxicamente en el NAc (Fig. 1A) un vector de virus adeno-asociado inducible (AAV) por Cre que lleva el gen de la opsina fusionado en el marco con la secuencia que codifica la protelna fluorescente amarilla mejorada (eYFP) (46, 47); el gen de la opsina codificaba la canalrodopsina-2 (ChR2) del canal cationico regulado por luz azul (48, 49) o la halorodopsina de la bomba de cloruro de tercera generation regulada por luz amarilla (eNpHR3.0) (50).
Materiales y metodos
Sujetos
Los ratones BAC colinacetiltransferasa (ChAT)::Cre transgenicos se obtuvieron de GENSAT (nombre de stock: Tg(Chat-cre) 24Gsat/Mmcd) (Gong et al., J. Neurosci 27, 9817-9823 (2007)) y se aparearon con ratones C57BL6 de Charles River. Los ratones experimentales eran heterocigoticos para Cre (+/-) o bien companeros de camada control (-/-). Los ratones se alojaron en grupo en una colonia mantenida en un ciclo de luz/oscuridad invertido de 12 horas y se les dio alimento y agua ad libitum. Los protocolos experimentales fueron aprobados por la IACUC de la Universidad de Stanford para cumplir con las directrices de la gula de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
Production de virus
Como se ha descrito anteriormente (Tsai et al., Science 324, 1080-1084 (2009); Sohal et al., Nature 459, 698-702 (2009), los vectores AAV recombinantes inducibles por Cre se basaron en un casete de ADN que llevaba dos pares de sitios lox incompatibles (loxP y lox2722) con la opsina (ya sea ChR2(H134R) o eNpHR3.0) insertada entre los sitios lox en la orientation inversa. Este casete de opsina inversa doblemente flanqueado se clono en una version del vector pAAV2-MCS que llevaba el promotor EF-1a y el elemento regulador post-transcripcional del virus de la hepatitis Woodchuck (WpRE) para aumentar la expresion. Los mapas completos de la construction de AAV con ChR2 inducible por Cre, as! como el transgen eNpHR3.0, estan disponibles en
www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.html. Los vectores AAV recombinantes fueron serotipados con protelnas de la cubierta de AAV5 y empaquetados por el nucleo del vector viral en la Universidad de Carolina del Norte. La concentration viral final fue de 3 x 1012 partlculas/ml para el virus ChR2 y 1,5 x 1012 partlculas/ml para el virus eNpHR3.0.
Inyeccion estereotactica de virus, implantation de la canula/cable de conexion y suministro de luz
Los ratones se anestesiaron con ketamina/xilazina (60 gl/raton de una mezcla de 80 mg/ml de ketamina y 12 mg/ml de xilazina) y a continuation se situaron en un aparato de cabeza estereotactica. Las ciruglas se realizaron en ratones de 4 a 6 semanas de edad para los experimentos de fisiologla y en ratones de 8 a 12 semanas de edad para los experimentos de comportamiento. Se aplico una pomada oftalmica para evitar que los ojos se secaran. Se realizo una incision en el cuero cabelludo de la llnea media seguido de una craneotomla y luego se inyecto el virus con una jeringa de 10 gl y una aguja metalica de calibre 34. El volumen de inyeccion y el caudal (1gl a 0,15 gl/min) se controlaron mediante una bomba de inyeccion. Cada NAc recibio dos inyecciones (inyeccion 1: AP 1,15 mm, ML 0,8 mm, DV -4,8 mm, inyeccion 2: AP 1,15 mm, ML 0,8 mm, DV -4,2 mm). La inyeccion de virus y la position de la fibra se eligieron de manera que practicamente toda la cubierta fue estimulada. Dado el pequeno tamano de la cubierta en los ratones, no es posible limitar la propagation del virus y la luz completamente a la cubierta medial y se incluyo la parte medial del nucleo (medial a la comisura anterior). Despues de la inyeccion, la aguja se dejo en su lugar durante 5 minutos adicionales y despues se retiro muy lentamente. Para los experimentos de comportamiento se inyectaron ratones bilateralmente y luego se colocaron canulas bilaterales con una distancia de centro a centro de 1,5 mm por encima de los sitios de inyeccion (AP 1,15 mm, DV 3,8 mm). Para manipular la actividad neuronal durante el comportamiento, la luz se suministro bilateralmente a traves de dos fibras opticas de 300 gm de diametro (0,37 N.A.) que se insertaron a traves de las canulas para permitir que la fibra se proyectara 200-300 gm mas alla del extremo de las canulas.
Inmunohistogufmica
Para determinar la especificidad de la expresion de la opsina en las neuronas ChAT, los ratones fueron anestesiados con beuthanasia y perfundidos transcardialmente, primero con PBS y despues con paraformaldehldo (PFA) 4 % disuelto en solution salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4). Los cerebros se retiraron y se fijaron despues en PFA 4 % durante la noche a 4 °C y luego se equilibraron en sacarosa 30 % en PBS. Se prepararon cortes coronales de 40 gm de espesor sobre un microtomo de congelation (Leica) y se almacenaron en crioprotector (glicerol 25 % y etilenglicol 30 5 en PBS) a 4 °C. Los cortes de flotation libre se lavaron en PBS y despues se incubaron durante 30 min en Triton X-100 (Tx100) 0,3 % y suero de burro normal 3 % (NDS). Los cortes se incubaron a 4 °C durante la noche con el anticuerpo primario en NDS 3 % (anti-ChAT de cabra 1:200, Millipore). Los cortes se lavaron entonces con PBS y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con anticuerpos secundarios (anti-cabra de burro conjugado con Cy3 o Cy5, Jackson Laboratories). Los cortes se lavaron a continuacion, se incubaron con DAPI (1:50.000) durante 20 min, se lavaron de nuevo y se montaron en portaobjetos con PVA-DABCO. Las imagenes de fluorescencia confocal se adquirieron en un microscopio laser de barrido
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utilizando objetivos secos 5X o 10X o un objetivo de inmersion en aceite 40X Resultados
Hemos validado la especificidad y funcionalidad de esta estrategia de insercion dirigida in vivo y encontramos que la expresion de eYFP era altamente especlfica para las neuronas que expresaban ChAT; ademas, la gran mayorla de las neuronas que expresaban ChAT tambien expresaban eYFP (Fig. 1B,C). La especificidad observada fue particularmente impresionante para una poblacion neuronal tan escasa, ya que habla una probabilidad muy baja antes de la prueba de que cualquier celula dada fuera una interneurona ChAT y por lo tanto, incluso una focalizacion rara disminuirla drasticamente la especificidad de una insercion dirigida efectiva. Ambas opsinas se expresaron en las membranas superficiales de las neuronas ChAT (Fig. 1D), y las neuronas diana respondieron a la inyeccion de corriente de una manera correspondiente a las respuestas previamente establecidas de interneuronas colinergicas en el cuerpo estriado dorsal (Fig. 1 E) (51). En concordancia con la fisiologla del cuerpo estriado dorsal, tanto el potencial de reposo como la resistencia de entrada fueron mayores para las neuronas ChAT (neuronas YFP +) que para las MSN (identificados como neuronas YFP-), Tabla S1, p <10-4 para VM y p = 0,004 para R-input, prueba t de dos colas). Finalmente, ambas opsinas fueron potencialmente funcionales en celulas ChAT, ya que eNpHR3.0 impulso hiperpolarizaciones masivas (Fig. 1 F; Media ± EEM: -83,8 ± 11,9 mV, n = 4) y ChR2 impulso de manera fiable hasta uno niveles de 20-30 Hz (Fig. 1G, H).
Tabla 3: La tension de membrana (VM) y la resistencia de entrada (RINPUT) en cortes cerebrales de neuronas ChAT que expresan ChR2-eYFP y de MSN que no expresan un fluoroforo. Ambos VM y RINPUT son mas altos para las neuronas ChAT que para las MSN. (p = 0,00003 para VM; p = 0,002 para RINPUT; prueba t de dos colas; media ___________________________________________± EEM.)___________________________________________
ChAT (ChR2-eYFP) (n = 19)
MSN (n = 13)
Vm (mV)
Rinput (MQ) Vm (mV) Rinput (MQ)
-49,47 ± 1,07
382,02 ± 47,30 -65,43 ± 2,88 223,64 ± 31,92
Ejemplo 2: Efectos de la despolarizacion de las interneuronas colinacetiltransferasa (ChAT) positivo
Se cree que las interneuronas ChAT son tonicamente activas in vivo (3-10 Hz (52, 53)), pero ha seguido siendo un misterio como (o incluso si) este tipo de actividad lenta en las escasas celulas ChAT podrla estar implicada causalmente en la afectacion de la actividad o comportamiento del circuito local. Hemos aprovechado el control optogenetico para abordar esta cuestion con una combinacion de electrofisiologla de cortes, electrofisiologla in vivo y comportamiento de libre movilidad.
Materiales y metodos
Fisiolooia del corte cerebral agudo
Se prepararon cortes cerebrales coronales de ratones adultos con virus previamente inyectados (> 2 semanas antes del corte), utilizando tecnicas estandar siguiendo estrictamente un protocolo aprobado por el Comite para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Stanford. Se cortaron cortes coronales de 250 pm de espesor con un vibratomo usando una cuchilla de zafiro en una solucion de corte a base de N-metil-D-glucamina (NMDG) helada que contenla NMDG 135 mM, KCl 1 mM, KH2PO4 1,2 mM, bicarbonato de colina 20 mM, glucosa 10 mM, MgCl2 1,5 mM y CaCl2 0,5 mM. Los cortes se mantuvieron despues en llquido cefalorraquldeo artificial (ACSF) que contenla NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 1,3 mM, NaH2PO4 1 mM, NaHCO3 26,2 mM y glucosa 11 mM. Los cortes se mantuvieron en ACSF a 37 °C durante 30 minutos y despues a temperatura ambiente. El ACSF se burbujeo constantemente con 95 % de O2/5 % de CO2 y se calento a 34 °C para todos los experimentos. Las neuronas se visualizaron en un microscopio vertical (Leica DM-LFSA) equipado con optica DIC y un conjunto de filtros para la visualizacion de eYFP utilizando un objetivo de inmersion en agua x 40 y una camara de dispositivo de carga acoplada (CCD). Los registros de celulas enteras se hicieron en neuronas utilizando la solucion de electrodo que contenla gluconato de potasio 120 mM, HEPES 20 mM, EGTA 10 mM, MgCl2 1 mM, Na-ATP 2 mM y Na-GTP 0,2 mM (pH 7,3, 290 mOsm/l); en los experimentos de registro de IPSC, se utilizo KCl para reemplazar el gluconato de potasio. Las resistencias de la pipeta fueron 3-5 MQ y los registros se hicieron sin compensacion de la resistencia en serie. Los potenciales de membrana han sido corregidos para el error resultante de los potenciales de union del llquido. El potencial de retencion (VM) para los experimentos de fijacion de tension fue de -70 mV. Se anadieron los siguientes agentes como se indica: SR-95531 5 pM; 2,3- dihidroxi-6-nitro-7-sulfamoil-benzo(F)quinoxalina (NBQX) 5 pM; (R,S)- CPP; mecamilamina (10 pM); clorhidrato de cocalna 5 pM. La concentracion de cocalna de 5 pM fue cuidadosamente seleccionada por varios criterios. En primer lugar, era coherente con las opciones de los trabajos realizados previamente en cortes (Thompson et al., Neuropharmacology 49, 185-194 (2005)). En segundo lugar, concentraciones significativamente mas altas darlan lugar a efectos anestesicos locales (Thompson et al., Neuropharmacology 49, 185-194 (2005)). Finalmente, segun los estudios de farmacocinetica de la cocalna en ratones, una inyeccion i.p. de 10 mg/kg producira 4,7 pM de cocalna en el cerebro despues de 15 minutos y 20 mg/kg producira 9,4 pM, comparable a los niveles utilizados en los experimentos de comportamiento (Shah et al., Toxicology and Applied Pharmacology 53, 279-284 (1980)). Las fotocorrientes se evocaron utilizando un conmutador optico con una lampara de xenon de 300 W y filtros de paso de banda de 470 ± 20 nm o de 580 ± 20 nm; la potencia
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lumlnica en la muestra fue de 11,52 mW mm-2 (470 Nm) o 10,64 mW mm-2 (580 nm). Las corrientes se filtraron a 2 kHz, se digitalizaron a 50 kHz y se registraron usando en disco utilizando el software pClamp10 (Axon Instruments). Los datos se expresan como media ± error estandar de la media y la significacion estadlstica se determino usando la prueba t pareada o no pareada, segun sea apropiado. Para las mediciones de las IPSC en MSN (Fig. 2B-E y Fig. 5A-B), 10 repeticiones sin luz precedieron a 10 repeticiones con luz. Cada repeticion fue de 5 segundos de duracion y estaban separadas por un perlodo de descanso de 5 segundos. Para probar la respuesta a la cocalna de las celulas ChAT en los cortes (Fig. 4A-C), se obtuvieron los registros de celulas enteras de la porcion ventral de la cubierta medial, donde las elevaciones de descarga fueron variables como se resume en la Fig. 4, pero en contraste con la disminucion tlpica de la descarga en condiciones de control; el trabajo exploratorio sugerla que las celulas ChAT en el nucleo y en otras partes de la cubierta eran menos sensibles a la cocalna.
Registros in vitro con optrode
La estimulacion optica simultanea y el registro electrico extracelular se realizaron como se ha descrito anteriormente (Gradinaru et al., J. Neurosci 27, 14231 - 1442 (2007)). El optrode consiste en un electrodo de tungsteno (1 MQ, 0,127 mm, aislamiento de parileno) pegado a una fibra optica (300 |jm de diametro del nucleo, 0,37 N.A.), con la punta del electrodo proyectandose mas alla de la fibra en 300-500 jm. El electrodo se bajo a traves del NAc en incrementos de aproximadamente 100 jm y se registraron las respuestas opticas en cada incremento. La fibra optica se acoplo a un laser de 473 nm o 560 nm. La densidad de potencia fue ~ 140 mW/mm2 en la punta de la fibra para ambas longitudes de onda, lo que corresponde a una densidad en la punta del electrodo de ~ 7-17 mW/mm2 para la luz de 470 nm y ~10-22 mW/mm2 para la luz de 560 nm. Las senales se amplificaron y se filtraron con un filtro pasa banda (valor de corte superior 300 Hz, valor de corte inferior 10 kHz) antes de digitalizar y registrar en el disco. En cada sitio, se presentaron y se guardaron 5 repeticiones de estimulacion. Cada perlodo de estimulacion duro 10-15 segundos con un perlodo de recuperacion de 80-90 segundos entre el tiempo de inicio de cada repeticion y se grabaron 50 segundos de datos en el disco para cada repeticion.
Resultados
Primero monitorizaron las corrientes postsinapticas en las MSN (celulas que no expresan ChR2-eYFP) en cortes de NAc agudos durante la fotoestimulacion optogenetica de celulas ChAT que expresan ChR2-eYFP (Fig. 2A), dirigido como en la Fig. 1. La estimulacion de las neuronas ChAT en este contexto aumento fuertemente la frecuencia de corrientes postsinapticas inhibitorias (IPSC) mediadas por el receptor de acido Y-aminobutlrico del tipo A (GABAa) registradas en las MSN (Fig. 2, B y C). Las corrientes inhibidoras evocadas se sincronizaron generalmente con el pulso luminoso, con una latencia modal de 6 ms (Fig. 2D), acopladas con un aumento menor de las IPSC asincronicas (Fig. 5A-C). En todas las celulas registradas, la frecuencia media de IPSC observada en las MSN aumento en 525,8 ± 154,3 % durante la estimulacion lumlnica de las neuronas ChAT (n = 7, media ± EEM, P = 0,01, prueba t pareada), mientras que la amplitud media de las IPSC no se vio afectada (P > 0,05, prueba t pareada; n = 7, Fig. 2E). Este efecto fue atenuado por el antagonista nicotlnico mecamilamina (Fig. 7, n = 5, P < 0,05, prueba t pareada).
A continuation se planteo la cuestion de si estos cambios dramaticos en la frecuencia de la corriente inhibitoria se traducirlan en cambios en la descarga en MSN in vivo y como se producirla. Se registro la actividad neuronal extracelularmente con un optrode en el NAc durante la activation optogenetica de las interneuronas ChAT in vivo (Fig. 2F). En sitios donde no se aislaron unidades individuales, se observo una activacion de la poblacion neuronal que correspondla a la estimulacion lumlnica a 10 Hz pero no a 100 Hz (Fig. 5D), lo que probablemente represente la descarga en la poblacion de las escasas pero sincronicamente activadas celulas ChAT en el vecindario del electrodo. En contraste con estas descargas poblacionales, las unidades aisladas en el NAc mostraron una respuesta marcadamente diferente a la fotoestimulacion optogenetica. En consonancia con el aumento observado en la frecuencia de IPSC en las MSN de los cortes, se observo in vivo una considerable inhibition de la activacion de fondo durante la estimulacion de las celulas ChAT in vivo (celula representativa, Fig. 2G). En toda la poblacion, los sitios modulados de manera mas significativa mostraban una supresion de la activacion de fondo, aunque algunos respondieron con un aumento de la activacion (Fig. 2, H e I), en consonancia con la inhibicion de la corriente conocida entre las MSN y la correspondiente liberation de la inhibicion, durante el impulso a la neurona ChAT, que habla sido previamente ejercida por la poblacion de MSN mas amplia.
Ejemplo 3: Efectos de la hiperpolarizacion de las interneuronas colinacetiltransferasa (ChAT) positivo
A continuacion, se exploraron las consecuencias de inhibir especlficamente las interneuronas ChAT, empleando la expresion de eNpHR3.0 dependiente de Cre in vivo.
Materiales y metodos
Los ratones, los registros de optrode y las cortes de cerebro igual que antes.
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Resultados
En contraste con lo que se observo con la excitacion de la neurona ChAT, la activacion de las neuronas del NAc se incremento generalmente mediante la inhibicion optogenetica de las celulas ChAT; una celula representativa se muestra en la Fig. 3A). El analisis espectral de potencia revelo un sorprendente pico de frecuencia en el patron de activacion a ~ 4 Hz en estos registros in vivo (Fig. 3B). Los datos de resumen se presentan en la Fig. 3C; en toda la poblacion de sitios significativamente modulados, la mayorla de las neuronas fueron excitadas por la inhibicion optogenetica de las neuronas ChAT (n = 17). Hemos sido capaces de obtener una sola unidad de registro de una presunta rara interneurona ChAT, que fue completamente bloqueada por eNpHR3.0 (Fig. 3D) y que mostraba la prolongada duracion del potencial de accion caracterlstica de las interneuronas ChAT (37) (2,0 ms para esta celula, mientras que la duracion de las descargas para las MSN en nuestros registros oscilaban entre 1,1-1,7 ms). Los datos resumidos (Fig. 3E) muestran la dinamica de excitacion e inhibicion para todos los sitios registrados, ilustrando el patron dominante de excitacion (actividad aumentada en 130,5 +/- 17,5 % en los sitios que fueron excitados por la luz). En conjunto, los resultados de la excitacion e inhibicion optogenetica in vivo de las neuronas ChAT son concordantes con nuestros hallazgos de la fisiologla de los cortes, lo que apunta a un papel sorprendentemente potente para estas celulas raras en el control de la actividad del circuito local en el NAc.
Ejemplo 4: Efectos de la manipulacion de la interneurona colinergica sobre el comportamiento de recompensa en ratones que se mueven libremente
Se decidio analizar si este potente mecanismo de control del NAc era relevante para el comportamiento de recompensa dependiente del nucleo accumbens en ratones que se movlan libremente. Primero se probo el efecto de la administration aguda de cocalna sobre la actividad de estas neuronas ChAT identificadas en cortes de NAc agudos. A continuation, se uso eNpHR3.0 para determinar los papeles causales en esta actividad inducida por cocalna o en la actividad basal de las celulas ChAT en el comportamiento relacionado con la recompensa de la preferencia por el lugar condicionada inducida por la cocalna (CpP), en la que los animales aprenden a asociar un ambiente con cocalna.
Materiales y metodos
Preferencia por el lugar condicionada
Todos los experimentos de comportamiento se realizaron 4-6 semanas despues de las inyecciones de virus durante el ciclo (activo) de oscuridad de los animales. El protocolo de preferencia por el lugar condicionada (CPP) fue similar a los de trabajos previos de preferencia por el lugar imparcial y equilibrada (Bardo et al., Neurosci Biobehav Rev 19, 39-51 (1995)). El aparato de CPP constaba de una camara rectangular con un compartimento lateral que media 23 cm x 26 cm con paredes negras y una rejilla en el suelo, un compartimiento central que media 23 cm x 11 cm con paredes de plexiglas transparentes y un piso de plexiglas y otro compartimento lateral que media 23 cm x 26 cm con paredes blancas y un piso de metal perforado. La position del raton durante cada dia de prueba se monitorizo usando un sistema de seguimiento de video. Se seleccionaron pisos para que los ratones no mostraran un sesgo basal promedio para una camara en particular, y se excluyo cualquier raton con una fuerte preferencia inicial por una camara (presencia de mas de cinco minutos de diferencia en las camaras laterales el dia 1). La prueba de CPP consistio en lo siguiente. El dia 1, se coloco a cada raton en la camara central y se dejo que explorara libremente todo el aparato durante 20 minutos (pre-prueba). El dia 2 consistio en el condicionamiento. Por la manana, cada raton fue confinado en una de las camaras laterales durante 20 minutos y por la tarde se confino en la otra camara lateral durante el mismo perlodo de tiempo. Para los experimentos de CPP inducida por cocalna, los sujetos recibieron inyecciones i.p. de cocalna (20 mg/kg, a menos que se especifique lo contrario) antes de su colocation en una camara, mientras que los otros sujetos recibieron inyecciones de solution salina de un volumen equivalente antes de su colocacion en la otra camara. (Esta concentration de cocaina permitio un condicionamiento fuerte con un unico dia de entrenamiento en animales de control, facilitando la intervention optogenetica). Los ratones recibieron luz amarilla o azul durante los 20 minutos en los que exploraron el compartimiento que estaba asociado con la inyeccion de cocaina, mientras que estaban conectados a una fibra “ficticia” que no estaba emitiendo luz al explorar la otra camara. La intensidad de la luz azul (470 nm) se eligio para generar una densidad de potencia de 140-200 mW/mm2 en la punta de la fibra, que debe corresponder a una densidad de potencia de ~ 4-7mW/mm2 en el centro del NAc. La intensidad de la luz amarilla (590 nm) se eligio de manera que hubo una densidad de potencia de 70-140 mW/mm2 en la punta de la fibra, lo que deberla corresponder a una densidad de potencia de ~ 3,5 a 7 mW/mm2 en el centro del NAc. El dia 3, exactamente igual que en el dia 1, los ratones se colocaron en la camara central y se les permitio explorar libremente todo el aparato durante 20 minutos (post-prueba). Los experimentos de CPP que no implicaban el uso cocalna se realizaron de manera identica, excepto que se omitieron las inyecciones de cocalna o solucion salina.
Campo abierto
La prueba de campo abierto se realizo en un campo de plastico abierto (50 cm de largo x 50 cm de ancho x 40 cm de profundidad). Los ratones se colocaron individualmente en el centro de la camara y se les permitio explorar libremente durante 3 min. La actividad tanto en el centro como en la periferia del campo se midio usando un sistema
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automatizado de seguimiento por video (Viewer II, BiObserve). El tiempo en el centro se refiere al tiempo que el raton paso en el area central de 35 x 35 cm del campo abierto.
Condicionamiento del miedo
El aparato de condicionamiento del miedo consistla en una jaula de condicionamiento cuadrada (18x18x30 cm) con un suelo de rejilla cableado a un generador de choque y un codificador, rodeado por una camara acustica. La parte superior de la camara se modifico para permitir el suministro de luz durante el entrenamiento mediante la introduccion de una abertura para la fibra. Todos los ratones recibieron luz amarilla continua durante el entrenamiento pero no durante la prueba al dla siguiente (590 nm, misma densidad de potencia que para los experimentos de CPP). Para inducir el condicionamiento del miedo, los ratones fueron colocados en la jaula durante 120 segundos; se emitio un tono puro (2,9 KHz) durante 20 segundos, seguido inmediatamente de un choque en la planta del pie de 2 segundos (0,5 mA). Este procedimiento se repitio y 30 segundos despues de la descarga del segundo choque, los ratones fueron devueltos a su jaula de origen. Se cuantifico la paralisis (inmovilidad completa) durante los 30 segundos antes del primer tono en el dla de condicionamiento para evaluar la paralisis inicial, as! como los 30 segundos inmediatamente despues del choque final en el dla de condicionamiento para evaluar la paralisis inmediata. El condicionamiento del miedo contextual y asociado a la senal auditiva fue evaluado el dla despues del condicionamiento. Para probar el condicionamiento del miedo contextual, los ratones fueron colocados en la jaula de condicionamiento original y se midio la paralisis durante 5 min. Para probar el condicionamiento del miedo asociado a una senala auditiva, los ratones se colocaron en un contexto diferente: una jaula de forma piramidal con un suelo de plexiglas. Como control de la influencia del nuevo ambiente, se midio la paralisis durante 2,5 minutos en esta nueva jaula y luego se emitio el tono de 2,9 KHz durante 2,5 minutos, durante los cuales se determino la paralisis condicionada.
Resultados
En las celulas ChAT del Nac ventro-mediales, se observo que la cocalna aumentaba notablemente la activacion espontanea (neurona ChAT representativa mostrada en Fig. 4, A y B). Los datos de resumen revelaron que la cocalna aumentaba las tasas de activacion de 0,60 ± 0,41 Hz a 1,74 ± 0,56 Hz a los 10 min en neuronas ChAT (n = 7; P <0,005, prueba t pareada, mientras que en el grupo de control de las celulas que reciblan unicamente el vehlculo, las tasas de activacion disminuyeron de 0,69 ± 0,24 Hz a 0,09 ± 0,09 Hz durante el mismo perlodo de tiempo (n = 6; P < 0,05 comparando los dos grupos, prueba t de dos colas) (Fig. 4C).
A continuacion se uso eNpHR3.0 para determinar los papeles causales de esta actividad inducida por cocalna o actividad basal de las celulas ChAT en el comportamiento relacionado con la recompensa de la preferencia por el lugar condicionada (CPP), en el cual los animales aprenden a asociar un ambiente con cocalna. Despues de inyectar el virus e implantar las canulas bilateralmente (Fig. 4D) para silenciar las neuronas ChAT durante la exposicion a la cocalna (Fig. 4E), observamos que los ratones que expresaban eNpHR3.0 en las celulas ChAT mostraban significativamente menos preferencia por el lugar condicionada (CPP) inducida por cocalna que sus companeros de camada control (Cre recombinase negativo) que hablan recibido el mismo virus, sometidos a la misma cirugla y protocolo de suministro de luz [20 mg/kg por via intraperitoneal (ip), Fig.4, F y G; n = 10 ChAT::Cre+, n = 12 ChAT: :Cre- (panel izquierdo); P <0,01 para la prueba t de dos colas; tres cohortes; ver tambien Fig. 6A. No se observo ningun efecto en el comportamiento por la inhibicion de las celulas ChAT en ausencia de cocalna y la inhibicion de la neurona ChAT por si misma no era aversiva, ya que el condicionamiento con eNpHR3.0 solo no afecta a la preferencia por el lugar (Fig. 4G, panel derecho; n = 9 ChAT::Cre+, n = 7 ChAT::Cre-; P > 0,05 para la prueba t de dos colas; tres cohortes; Fig. 6B; ver tambien Fig. 8A para la curva de dosis-respuesta de cocalna). La activacion de las celulas con ChR2 a 10 Hz no fue suficiente para determinar la preferencia por el lugar por si misma o aumentar la preferencia por el lugar asociada a la cocalna (10 y 20 mg/kg ip, Fig. 8B a D; Tabla 4), demostrando en su lugar nuestros datos de inhibicion de celulas ChAT la necesidad de estas celulas. Finalmente, en los experimentos de control, encontramos que la inhibicion de la neurona ChAT por si sola no tenia ningun efecto sobre la movilidad o la ansiedad en el campo abierto (Fig. 4, H y J) y el condicionamiento de miedo contextual y asociado a una senal auditiva no se vieron afectados por la inhibicion de las celulas ChAT (Fig. 9).
Tabla 4: Tiempo total pasado en el lado asociado a la cocalna el dla de prueba del paradigma de preferencia por el
lugar inducida por cocalna (para diversas concentraciones de cocalna) cuando la inhibicion de las neuronas ChAT (con eNphR3.0) estaba asociada con la exposicion a cocalna.
mg/kg 0 10 20 40
ChAT::Cre+
N 11 10 4
Lado condicionado (min) 10,3 10,7 10,5
ChAT::Cre-
N 12 12 3
Lado condicionado (min) 8,5 14,2 9,2
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Discusion
En conjunto, estos resultados del control optogenetico especlfico y agudo de la poblacion definida de neuronas ChAT apuntan a un papel potente para estas neuronas raras y dispersamente distribuidas en el control de la actividad del circuito local y la aplicacion del comportamiento relacionado con la recompensa en mamlferos que se mueven libremente. El hecho de que el silenciamiento agudo de las interneuronas ChAT altere el aprendizaje relacionado con drogas sin afectar a la preferencia por el lugar en ausencia de droga sugiere la tentadora posibilidad de que se pudiera utilizar el control sobre este microcircuito para alterar selectivamente las propiedades adictivas de drogas de abuso sin afectar a las respuestas apetitivas o aversivas en general, una posibilidad que tendrla un enorme beneficio cllnico. Curiosamente, los resultados del comportamiento no apoyan las conclusiones derivadas de la ablacion cronica de las interneuronas colinergicas (34), sino que concuerdan mas con las interpretaciones que surgen de una modulacion farmacologica mas rapida pero menos dirigida a las celulas en el NAc (23-26). La ablacion de las interneuronas colinergicas podrla conducir a efectos indirectos, como un aumento compensatorio de la dopamina en el NAc, lo que a su vez podrla aumentar la recompensa de la cocalna. De hecho, una diferencia fundamental entre las manipulaciones agudas y cronicas podrla explicar las contradicciones aparentes cllnicamente relevantes en nuestra comprension del equilibrio acetilcolina/dopamina en el cerebro, como el hallazgo de que un aumento agudo de nicotina (que presumiblemente actua sobre los receptores colinergicos) causa el correspondiente aumento agudo de dopamina (54, 55), mientras que los cambios cronicos en los niveles de dopamina o acetilcolina pueden causar cambios opuestos en los niveles del otro neuromodulador (56), por ejemplo, como se observa en el agotamiento de dopamina de la enfermedad de Parkinson (57).
La velocidad y la especificidad de este enfoque pueden permitir aclarar el papel causal de las neuronas acetilcolinergicas, tanto en circuitos neuronales sanos como enfermos, en otras regiones del sistema nervioso. Por ejemplo, al igual que las neuronas dopaminergicas que se proyectan al cuerpo estriado (58, 59), las interneuronas ChAT del cuerpo estriado dorsal se piensa que transportan informacion sobre recompensas y estlmulos que predicen recompensas (60). Dichos estlmulos generan una breve pausa en la actividad de las neuronas estriatales tonicamente activas en primates, a menudo precedida y seguida por una rafaga excitatoria de actividad (16, 17). La homologla estructural entre el cuerpo estriado dorsal y ventral sugiere que principios similares a los descritos aqul para el NAc podrlan extenderse a la actividad de las celulas ChAT en el cuerpo estriado dorsal, lo que de hecho parece ser el caso (English et al., manuscrito adjunto). Estos resultados, junto con nuestros hallazgos de que la actividad de estas celulas en el NAc impulsa una potente inhibicion temporal y controla el comportamiento de aprendizaje por recompensa, sugieren que las neuronas ChAT sirven como un potente nodo de control adecuado para la regulation neuromodulatoria versatil de la actividad del circuito y el comportamiento en el cerebro de los mamlferos.
Los ejemplos, que estan destinados a ser puramente ilustrativos de la invention y por lo tanto no deben ser considerados como limitativos de la invencion de ninguna manera, tambien describen y detallan aspectos y realizaciones de la invencion discutidos anteriormente. Los ejemplos anteriores y la description detallada se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitation.
Aunque la invencion anterior se ha descrito con algun detalle a modo de ilustracion y ejemplo con fines de claridad de entendimiento, sera facilmente evidente para los expertos en la materia a la luz de las ensenanzas de esta invencion que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
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SECUENCIAS
La secuencia de aminoacidos de NpHR sin el peptido senal:
VTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPVVSIASYTGLASGLTIS VLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTGLAA ALTTSSHLMRWFWYAISCACFI.WLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVLP VGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADD (SEQ ID NO:l)
La secuencia de aminoacidos de eYFP-NpHR3.0:
MTETLPPVTESAVALQAEVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILV PVVSIASYTGLASGLTISVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATK LFTAITFDIAMCVTGLAAALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMW LGYPIVWALGVEGIAVLPVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKS RITSEGEYIPLDQIDINWSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVP WPTLVTTFGYGLQCFARYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDF KEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQ SALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKFCYENEV (SEQ ID NO:2)
La secuencia de aminoacidos de eYFP-NpHR3.1:
MVTQRELFEFVLNDPLLASSLYINIALAGLSILLFVFMTRGLDDPRAKLIAVSTILVPWSIASYTGLASGLTI SVLEMPAGHFAEGSSVMLGGEEVDGVVTMWGRYLTWALSTPMILLALGLLAGSNATKLFTAITFDIAMCVTGLA AALTTSSHLMRWFWYAISCACFLVVLYILLVEWAQDAKAAGTADMFNTLKLLTVVMWLGYPIVWALGVEGIAVL PVGVTSWGYSFLDIVAKYIFAFLLLNYLTSNESVVSGSILDVPSASGTPADDAAAKSRITSEGEYIPLDQIDIN VVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFGYGLQCFAR YPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNS HNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLL EFVTAAGITLGMDELYKFCYENEV (SEQ ID NO:3)
La secuencia de aminoacidos de GtR3:
ASSFGKALLEFVFIVFACITLLLGINAAKSKAASRVLFPATFVTGIASIAYFSMASGGGWVIAPDCRQLFVARY
L
DWLITTPLLLIDLGLVAGVSRWDIMALCLSDVLMIATGAFGSLTVGNVKWVWWFFGMCWFLHIIFALGKSWAEA
AKAKGGDSASVYSKIAGITVITWFCYPWWVFAEGFGNFSVTFEVLIYGVLDVISKAVFGLILMSGAATGYESI
5 (SEQ ID NO:4)
La secuencia de aminoacidos de ChR2:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQT WKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTCPVILIHLSNLTGLSNDYSRR TMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVS WGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGIiLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEV ETLVEDEAEAGAVP (SEQ ID NO:5)
10
La secuencia de aminoacidos de SFO:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVWNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQT WKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFF.FKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRR TMGLLVSDIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVS WGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEV ETLVEDEAEAGAVP (SEQ ID NO:6)
15 La secuencia de aminoacidos de SSFO:
MDYGGALSAVGRELLFVTNPVWNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQTASNVLQWLAAGFSILLLMFYAYQT WKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYLATGHRVQWLRYAEWLLTSPVILIHLSNLTGLSNDYSRR TMGLLVSAIGTIVWGATSAMATGYVKVIFFCLGLCYGANTFFHAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVS WGMFPILFILGPEGFGVLSVYGSTVGHTIIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIGGTEIEV ETLVEDEAEAGAVP (SEQ ID NO:7)
La secuencia de aminoacidos de C1V1:
20
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQ CFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWEEIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEP AVIYSSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILF FLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGH SILDLIAKNiyiWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO:8)
La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E122T):
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQCF
CLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEPAVIY
SSNGNKTVWLRYAEWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILFFLISLS
YGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGHSILDLIAK
NMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO:9)
5 La secuencia de aminoacidos de C1V1 (E162T):
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQ C FC LAWLKS NGT NAEKLAANILQWIT FALSALCLMFYGYQTWKST CGWEEIYVATIEMIKF11EYFHE FDE P AVIYS SNGNKTVWLRYATWLLTC PVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTMGLLVS DVGCIVWGAT SAMCTGWTKILF FLISLSYGMYTYFHAAKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGH
SILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NOllO)
La secuencia de aminoacidos de (E122T/E162T):
10
MSRRPWLLALALAVALAAGSAGASTGSDATVPVATQDGPDYVFHRAHERMLFQTSYTLENNGSVICIPNNGQ CFCLAWLKSNGTNAEKLAANILQWITFALSALCLMFYGYQTWKSTCGWETIYVATIEMIKFIIEYFHEFDEP AVIYSSNGNKTVWLRYATWLLTCPVLLIHLSNLTGLKDDYSKRTHGLLVSDVGCIVWGATSAMCTGWTKILF FLISLSYGMYTYFH7\AKVYIEAFHTVPKGICRELVRVMAWTFFVAWGMFPVLFLLGTEGFGHISPYGSAIGH SILDLIAKNMWGVLGNYLRVKIHEHILLYGDIRKKQKITIAGQEMEVETLVAEEED (SEQ ID NO: 11)

Claims (6)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Una opsina sensible a la luz para su uso en un metodo para alterar el comportamiento relacionado con la recompensa en un animal vivo, en donde dicha opsina sensible a la luz se expresa en neuronas colinergicas del nucleo accumbens o del cuerpo estriado dorsal y en donde dicha opsina sensible a la luz es una bomba de iones que desplaza el potencial de membrana de la neurona lejos de su tension umbral para disuadir o inhibir los potenciales de accion.
  2. 2. Una opsina sensible a la luz para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, que es una halorodopsina de Natronomonas pharaonis (NpHR) o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la misma.
  3. 3. Una opsina sensible a la luz para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el comportamiento relacionado con la recompensa es la adiccion a la cocalna.
  4. 4. Un metodo para evaluar los efectos de un tratamiento para la dependencia de sustancias, comprendiendo el metodo:
    a) inducir artificialmente la dependencia de una sustancia en un animal no humano mediante la excitacion de neuronas colinergicas de un nucleo accumbens del animal a la vez que se ensena una respuesta condicionada al animal, en donde el animal no humano contiene una protelna opsina sensible a la luz expresada en la membrana celular de una interneurona colinergica en el nucleo accumbens o el cuerpo estriado del animal y en donde dicha opsina sensible a la luz es un canal ionico que puede provocar el desplazamiento del potencial de membrana hasta y/o mas alla de la tension umbral, excitando o estimulando as! un potencial de accion, en donde la iluminacion de la protelna induce un comportamiento relacionado con la recompensa del animal y
    b) evaluar los efectos del tratamiento mediante la aplicacion del tratamiento y evaluar la aplicacion del tratamiento mediante el control de la respuesta condicionada del animal no humano.
  5. 5. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que el canal ionico se selecciona de canalrodopsina de Chlamydomonas ChR2 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la misma, canalrodopsina de Volvox VChR1 o una variante de la misma que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con la misma o una canalrodopsina quimerica C1V1 o una variante de la misma que tiene al menos una identidad de secuencia del 90 % con la misma.
  6. 6. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 4, en el que la dependencia de una sustancia es la adiccion a la cocalna.
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