ES2683365T3

ES2683365T3 - Sistema de etiquetas de afinidad

Info

Publication number: ES2683365T3
Application number: ES13700036.0T
Authority: ES
Inventors: David O'connell; Sara Snogerup LINSE; Eva THULIN; Alejandro Merino
Original assignee: University College Dublin
Current assignee: University College Dublin
Priority date: 2012-01-06
Filing date: 2013-01-07
Publication date: 2018-09-26
Anticipated expiration: 2033-01-07
Also published as: US9676872B2; US20150005480A1; DK2800757T3; EP2612864A1; EP2800757A1; WO2013102684A1; EP2800757B1

Abstract

Un sistema de etiqueta de afinidad para inmovilizar una molécula, comprendiendo dicho sistema: (i) una matriz de afinidad que comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo anclado a un sustrato; y (ii) una molécula etiquetada con un segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo, en donde la molécula se inmoviliza en el sustrato mediante la interacción entre el primer y el segundo subdominios EF o fragmentos de los mismos, y en donde un fragmento de un primer o segundo subdominio EF conserva la capacidad del subdominio EF completo formar un par de unión de mano EF.

Description

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DESCRIPCION

Sistema de etiquetas de afinidad Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un sistema de etiquetas de afinidad para la inmovilizacion, deteccion y/o purificacion de moleculas. Particularmente, aunque no exclusivamente, la invencion se refiere al uso de subdominios de mano EF "EF-hand" de protemas de union a calcio, tales como los subdominios EF1 y EF2 de calbindina D9k, como etiquetas de afinidad y ligandos de afinidad cognados para la inmovilizacion, deteccion y/o purificacion de protemas y otras moleculas.

Antecedentes de la invencion

La capacidad de 'fijar' o 'inmovilizar' moleculas pequenas en una ubicacion deseada es importante para numerosas aplicaciones. Por ejemplo, en sistemas biologicos, la inmovilizacion de protemas en un sustrato solido se puede utilizar para aislar y/o detectar protemas espedficas dentro de una muestra biologica compleja. Ademas, la fijacion de una protema a un sustrato se utiliza a menudo para conseguir la separacion o purificacion de protemas a partir de una mezcla de moleculas biologicas, por ejemplo, un producto lisado celular.

Existen varios enfoques para la inmovilizacion, deteccion y purificacion de moleculas biologicas, incluyendo protemas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden explotarse para purificar sus respectivos antigenos mediante inmunoprecipitacion. Las protemas tambien se pueden purificar utilizando tecnicas de purificacion por afinidad alternativas, en las que tfpicamente se utiliza un "ligando de afinidad" capaz de unirse a la protema de interes para aislar la protema.

Para los fines de la purificacion por afinidad, la protema de interes a menudo se "etiqueta" con una molecula a la que se une espedficamente un ligando de afinidad. Se han desarrollado y utilizado diversos sistemas de etiquetado molecular para generar protemas de fusion que incorporan etiquetas que incluyen las siguientes: etiqueta myc; etiqueta peptido Flag; Etiqueta His; Etiqueta Strep; Eriqueta GST; Etiqueta MBP; Etiqueta SNAP; Etiqueta Halo; Etiqueta Tap; INPACT-CN. Los ligandos de afinidad cognados para cada una de estas etiquetas son conocidos y pueden utilizarse, por ejemplo, en el contexto de enfoques de cromatograffa de afinidad, para el aislamiento de protemas etiquetadas de interes.

A pesar de la disponibilidad de varios sistemas comerciales de etiquetado molecular, existen desventajas asociadas con muchas de las etiquetas existentes. En particular, el tamano de la etiqueta puede crear problemas durante la produccion de la protema de fusion recombinante, tal como la formacion de cuerpos de inclusion, dificultad en la solubilizacion, falta de estabilidad y/o plegamiento incorrecto de la protema de fusion y purificacion no espedfica de protemas bacterianas. Ademas, se ha informado de que las resinas que contienen metales que se unen a las Etiquetas His promueven la oxidacion no espedfica en las cadenas laterales de aminoacidos de la protema durante la purificacion. Esta oxidacion a menudo afecta a la funcionalidad de la protema.

Un reto adicional en el campo de las etiquetas moleculares o de afinidad utilizadas para purificar las protemas es equilibrar la fuerza y la especificidad de la union necesaria para lograr una purificacion eficaz con una interaccion de baja afinidad suficiente que pueda disociarse para eluir la protema purificada. Si la fuerza de union entre la etiqueta de la protema de fusion y su ligando de afinidad cognado es demasiado alta, puede ser necesario un protocolo de elucion intenso para liberar la protema, y esto puede perjudicar significativamente la funcion de la protema purificada.

Compendio de la invencion

Los autores de la presente invencion intentaron explotar interacciones dependientes de calcio entre fragmentos o regiones de protemas de origen natural con el fin de desarrollar un nuevo sistema de etiqueta de afinidad, que supera muchas de las desventajas asociadas con los sistemas existentes. Las etiquetas moleculares/de afinidad y los pares de union al ligando de afinidad de la presente invencion se basan en subdominios de mano eF encontrados en muchas protemas de union a calcio.

De acuerdo con un primer aspecto de la invencion, se proporciona un sistema de etiqueta de afinidad para inmovilizar una molecula, comprendiendo dicho sistema:

(i) una matriz de afinidad que comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo anclado a un sustrato; y

(ii) una molecula etiquetada con un segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo,

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en donde la molecula se inmoviliza en el sustrato mediante la interaccion entre el primer y el segundo subdominios de mano EF o fragmentos de los mismos.

El primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo se unira tipicamente al segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo en presencia de calcio.

Un fragmento de un primer o segundo subdominio de mano EF es un fragmento que conserva la capacidad del subdominio de mano Ef completo para formar un par de union de mano EF.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invencion, se proporciona una matriz de afinidad que comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo que es capaz de unirse a un segundo subdominio de mano EF en presencia de calcio, en donde dicho primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo esta anclado a un sustrato y en donde dicho primer subdominio de mano EF se selecciona entre:

(i) EF2 de calbindina D9K,

(ii) un subdominio de mano EF que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o

(iii) un subdominio de mano EF que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1,

en donde el fragmento del primer subdominio de mano EF conserva la capacidad del subdominio de mano EF completo para formar un par de union de mano EF. En un aspecto adicional de la invencion, se proporciona un metodo para purificar una molecula biologica etiquetada con un subdominio de mano EF o un fragmento del mismo de una muestra, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(i) proporcionar una matriz de afinidad de acuerdo con el segundo aspecto de la invencion;

(ii) poner una muestra que contiene la molecula biologica etiquetada en contacto con la matriz de afinidad de (i) en condiciones que permitan la union de los subdominios de mano EF;

(iii) separar cualquier material no unido de la molecula biologica etiquetada unida a la matriz de afinidad; y

(iv) efectuar la liberacion de la molecula biologica etiquetada de la matriz de afinidad.

En los metodos de la invencion, los subdominios de mano EF, o fragmentos de los mismos se uniran tipicamente en presencia de calcio. Un fragmento de la etiqueta de subdominio de mano EF es un fragmento que conserva la capacidad del subdominio EF completo para formar un par de union de mano EF con el ligando de afinidad de mano EF.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1 Mapa de plasmido para pJexpress-pelB-EF1.

Figura 2 Prueba de concepto experimental para el metodo de purificacion de protemas con nanopartmulas de EF2-SiO2 novedoso - expresion y purificacion de la protema de fusion EF1-scFv de pelBEFI. (PP) fraccion periplasmica de producto lisado de sobrenadante de E. coli (S) que expresa pelB-scFv-EF1 post-incubacion con sobrenadante de nanopartfculas de EF2-SiO2 (W1) post-lavado 1 con sobrenadante de tampon de lavado que contiene calcio (W2) post-lavado 2 con sobrenadante de tampon de lavado que contiene calcio (E1) post- lavado con sobrenadante de tampon de elucion de EDTA sin calcio (E2) post-lavado con sobrenadante de tampon de elucion de EDTA sin calcio (E3) post-lavado con tampon de elucion de EDTA sin calcio.

Figura 3 Prueba de concepto experimental para el metodo de purificacion de protemas con nanopartmulas de EF2-SiO2 - expresion y purificacion de protema de fusion EF1-Snap25 a partir de pEF1-N.

A Purificacion de protemas de fusion utilizando nanopartmulas de sflice EF2: (1) producto lisado nativo de EF1-Snap25 (2) primer lavado de calcio (3) segundo lavado de calcio (4) elucion de EF1-Snap25 en tampon de EDTA.

B Confirmacion de la expresion de la protema de fusion con la etiqueta 6xHis: (1) sin expresion de protema de fusion del vector vacm (2) producto lisado desnaturalizado de EF1-Snap25 (3) producto lisado nativo de EF1- Snap25 (4) flujo continuo de la elucion de la columna de Ni-NTA (5) de la protema de fusion EF1-Snap25 en imidazol 25o mM.

Figura 4 Mapa del plasmido para pJexpress404:92688 (EFTag-Nterminal-6His)

Figura 5 Mapa de plasmido para pJexpress401:92689 (EFTag-Cterminal-6His)

Figura 6 Mapa de plasmido para pJ602:92691 (EFTag-Nterminal-6His-maiTHfero)

Figura 7 Mapa de plasmido para pJ602:92690 (EF1-Cterminal-6His-mam^fero)

Descripcion detallada

Manos EF como etiquetas de afinidad/ligandos de afinidad

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La presente invencion proporciona un sistema de etiquetas de afinidad basado en el uso de subdominios de mano EF. El sistema de la invencion se basa en dos componentes: (i) una matriz de afinidad que comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo anclado a un sustrato; y (ii) una molecula marcada con un segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo.

Los subdominios de mano EF son regiones discretas de estructura tridimensional conservada que se encuentran en muchas protemas de union a calcio tales como calmodulina 1 (SEQ ID NO: 3), calmodulina 2 (SEQ ID NO: 4), calmodulina 3 (SEQ ID NO: 5) , similar a calmodulina 3 (SEQ ID NO: 6), similar a calmodulina 5 (SEQ ID NO: 7), similar a calmodulina 6 (SEQ ID NO: 8), calbindina 1 (SEQ ID NO: 9), calbindina 2 ( SEQ ID NO: 10), calbindina D9K (SEQ ID NO: 11), recoverina (SEQ ID NO: 12), frecuenina (SEQ ID NO: 13), troponina C (SEQ ID NO: 14), parvalbumina (SEQ ID NO : 15), calbindina D28k (SEQ ID NO: 16), secretagogina (SeQ ID nO: 17) y calretinina (SEQ ID NO: 18).

Las secuencias de aminoacidos subyacentes de las regiones proteicas definidas como "subdominios de mano EF" pueden variar considerablemente. Sin embargo, los subdominios de mano EF se caracterizan tipicamente por un motivo de protema de estructura secundaria "helice-bucle-helice" conservado. Se han resuelto las estructuras cristalinas de muchas protemas que contienen mano EF (Hakansson M. et al. An extended hydrophobic core induces EF-hand swapping. Protein Science (2001), 10: 927-933).

Un requisito de la presente invencion es que el primer subdominio de mano EF y el segundo subdominio de mano EF del sistema de etiqueta de afinidad formen un "par de union". Segun se utiliza en la presente memoria, el termino par de union significa dos moleculas o entidades que son capaces de interactuar o de asociarse para formar un complejo de union. Es preferible que la interaccion de union entre el par de union sea espedfica de manera que cada miembro del par de union solo sea capaz de unirse a su companero respectivo, o a un numero limitado de companeros de union. Los subdominios de mano EF para su uso junto con la presente invencion incluyen subdominios de mano EF seleccionados entre cualquier protema de union a calcio que sea capaz de formar un par de union con un segundo subdominio de mano EF. El primer y segundo subdominios de mano EF que componen el par de union del presente sistema de etiqueta de afinidad pueden derivar de diferentes protemas de union a calcio, pero preferiblemente derivan de la misma protema de union a calcio.

La protema de union a calcio se puede seleccionar a partir de cualquier fuente adecuada que incluya protemas de origen humano, bovino, murino o de rata. Los subdominios de mano EF tambien pueden derivar de protemas que tienen al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad con protemas de union a calcio de origen humano, bovino, murino o de rata. Las protemas de las que derivan los subdominios de mano EF pueden ser protemas purificadas, protemas expresadas de forma recombinante o protemas sintetizadas qmmicamente.

En ciertas realizaciones, los subdominios de mano EF primero y segundo no son identicos y derivan de la misma protema de union a calcio, en donde dicha protema de union a calcio contiene al menos dos subdominios de mano EF diferentes.

El primero y el segundo subdominios de mano EF se unen entre sf tfpicamente en presencia de calcio. Los subdominios de mano EF que forman pares de union adecuados para su uso en el sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion se pueden identificar tomando una protema de union a calcio que contiene al menos dos subdominios de mano EF, fragmentando dicha protema para producir al menos dos fragmentos, conteniendo cada fragmento al menos un subdominio de mano Ef, e intentando reconstituir la protema a partir de los fragmentos respectivos de una manera dependiente de calcio. Los fragmentos que permiten la reconstitucion de la protema en presencia de calcio o que permiten la asociacion no covalente de al menos dos fragmentos de la protema original en presencia de calcio, son fuentes adecuadas de subdominios de mano EF para su uso en el sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion.

Tfpicamente, la afinidad de la union entre el primer subdominio de mano EF y el segundo subdominio de mano EF del sistema de etiqueta de afinidad en presencia de calcio comprende una Kd menor de 1 pM, preferiblemente menor de 100 nM y mas preferiblemente menor de 10 nM. La afinidad de union entre el primer subdominio de mano EF y el segundo subdominio de mano EF puede estar en el intervalo nM, pM o fM.

En una realizacion preferida de la invencion, el primer y segundo subdominios de mano EF derivan de la protema de union a calcio calbindina D9k. La calbindina D9k (tambien conocida como protema de union a calcio S100) es una protema de union a calcio pequena (Mr 8500) que consta de dos subdominios de mano EF, EF1 y EF2. EF1 y EF2 interactuan con alta afinidad (Ka = 1.3 x 1010 M-1; Kd = 80 pM) y, por lo tanto, la calbindina D9k puede reconstituirse in vitro a partir de dos fragmentos de protema separados correspondientes a sus dominios EF1 y EF2.

En la presente invencion, el primer subdominio de mano EF del par de union forma al menos parte del "ligando de afinidad" unido al sustrato de la matriz de afinidad. El segundo subdominio de mano EF forma al menos parte de la etiqueta o etiqueta molecular o etiqueta de afinidad anclada a una molecula de interes.

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En ciertas realizaciones de la invencion, el primer subdominio de mano EF comprende la secuencia de aminoacidos siguiente:

STLDELFEELDKNGDGEVSFEEFQVLVKKISQ (SEQ ID NO: 1) o un fragmento de la misma como se describe en la presente memoria.

En realizaciones adicionales, el primer subdominio de mano EF comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "identidad de secuencia" se utiliza para describir la relacion de secuencia entre dos o mas secuencias de nucleotidos o aminoacidos. El porcentaje de "identidad de secuencia" entre dos secuencias se determina comparando dos secuencias optimamente alineadas sobre una ventana de comparacion (un numero definido de posiciones), en donde la porcion de la secuencia en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir huecos) en comparacion con la secuencia de referencia para lograr un alineamiento optimo. El porcentaje de identidad de secuencia se calcula determinando el numero de posiciones en las que aparecen la base nucleotidica o residuo de aminoacido identicos en ambas secuencias para obtener el numero de posiciones "emparejadas", dividiendo el numero de posiciones emparejadas por el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el resultado por 100. Para la comparacion de dos secuencias optimamente alineadas, la ventana de comparacion estara determinada por la longitud completa de las regiones alineadas. Los metodos y el soporte logico para determinar la identidad de secuencia estan disponibles en la tecnica e incluyen el soporte logico Blast y el analisis GAP. Las secuencias pueden alinearse utilizando cualquiera de los algoritmos disponibles dentro de las herramientas de alineamiento de secuencias, incluyendo algoritmos que utilizan parametros convencionales como el megablast, megablast discontinuo o algoritmos blastn para alinear secuencias de nucleotidos o los algoritmos PSI-BLAST, PHI-BLAST o blastp para alinear secuencias protema, disponibles a traves del software Blast.

En ciertas realizaciones de la invencion, el segundo subdominio de mano EF comprende la secuencia de aminoacidos siguiente:

KSPEELKGIFEKYAAKEGDPNQLSKEELKLLLGTEFPSLLKGM (SEQ ID NO: 2) o un fragmento del mismo como se describe en la presente memoria.

En realizaciones adicionales, el segundo subdominio de mano EF comprende una secuencia de aminoacidos con al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

En ciertas realizaciones de la invencion, el segundo subdominio de mano EF puede estar codificado por un polinucleotido representado por SEQ ID NO: 31 o SEQ ID NO: 32 o un polinucleotido con al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de secuencia. Los vectores de expresion que incorporan una secuencia de polinucleotido que codifica un segundo subdominio de mano EF son los descritos en otra parte de la presente memoria.

Los subdominios de mano EF para su uso junto con el sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion pueden representar formas nativas o de tipo salvaje tales como subdominios aislados de formas nativas o de tipo salvaje de protemas de union a calcio. Alternativamente, se pueden utilizar subdominios de mano EF modificados, siempre que se conserve suficiente afinidad de union entre el subdominio de mano EF de la matriz de afinidad (el primer subdominio de mano EF) y el subdominio de mano EF de la etiqueta de afinidad (el segundo subdominio de mano EF). Segun se utiliza en la presente memoria, la afinidad de union entre los subdominios de mano EF es suficiente, si la Kd es menor que 1 pM, preferiblemente menor que 100 nM y mas preferiblemente menor que 10 nM.

Las modificaciones de los subdominios de mano EF pueden incluir la delecion de residuos de aminoacidos, la insercion de residuos de aminoacidos, mutaciones puntuales y/o concatenaciones. Las mutaciones puntuales pueden incluir mutaciones con cambio de sentido en las que cualquier aminoacido dentro de un subdominio de mano EF se sustituye por cualquier otro aminoacido. En ciertas realizaciones, se pueden introducir sustituciones conservativas en las que una sustitucion conservativa implica la sustitucion de un aminoacido por otro aminoacido de la misma categona, es decir acido, alcalino, hidrofobo e hidrofilo. Se puede introducir una sustitucion conservativa para preservar la carga global del subdominio de mano EF.

Un experto en la tecnica reconocera que se pueden realizar modificaciones por varias razones. Estas pueden incluir modificaciones para mejorar o reducir la afinidad de union entre los subdominios de mano EF, modificaciones para mejorar la estabilidad del subdominio de mano EF o la molecula a la que esta unido, modificaciones para facilitar la union del primer subdominio de mano EF del ligando de afinidad al sustrato de la matriz de afinidad o para facilitar la union del segundo subdominio de mano EF de la etiqueta de afinidad a la molecula de interes.

Los subdominios de mano EF modificados pueden tener niveles variables de identidad de secuencia con la forma salvaje correspondiente del subdominio de mano EF. En ciertas realizaciones, un subdominio de mano EF modificado puede tener al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de identidad con la correspondiente forma

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salvaje del subdominio de mano EF.

En ciertas realizaciones, el sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion puede comprender una matriz de afinidad que comprende un fragmento de un primer dominio de mano EF anclado a un sustrato. En realizaciones alternativas o adicionales, el sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion puede comprender una molecula marcada con un fragmento de un segundo dominio de mano EF.

Segun se utiliza en la presente memoria, el termino fragmento debe tomarse para indicar una region de un subdominio de mano EF que tiene 1, 2, 3, 4, 5, etc. aminoacidos menos de longitud en comparacion con el subdominio de mano EF completo. Sin embargo, un requisito de la presente invencion es que cualquier fragmento de subdominio de mano EF utilizado como parte del sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion conserve la capacidad del subdominio de mano EF completo para formar un par de union de mano EF. Por lo tanto, un fragmento de un primer o segundo subdominio de mano EF puede ser cualquier fragmento que conserve la capacidad del subdominio EF completo para formar un par de union de mano EF. La afinidad de union de dichos fragmentos de subdominio de mano EF se puede potenciar o reducir en comparacion con los correspondientes subdominios EF completos.

Matriz de afinidad de mano EF

El primer componente del sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion es una "matriz de afinidad". Segun se utiliza en la presente memoria, el termino matriz de afinidad se refiere a un sustrato al que esta unido un ligando de afinidad. El ligando de afinidad comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo de acuerdo con la descripcion anterior; esto se denomina en la presente memoria ligando de afinidad de mano EF. El ligando de afinidad de mano EF es capaz de unirse a la segunda "etiqueta" del subdominio de mano EF anclado a la molecula de interes y, por lo tanto, es capaz de inmovilizar la molecula en el sustrato de la matriz de afinidad. La union del ligando de afinidad de mano EF a la segunda etiqueta del subdominio de mano EF se produce tipicamente en presencia de calcio. La union de la molecula etiquetada con mano EF puede producirse a concentraciones de calcio superiores a 10 nM.

En una realizacion preferida, el primer subdominio de mano EF del ligando de afinidad comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoacidos con al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1.

Ademas de un primer subdominio de mano EF, el ligando de afinidad puede incluir residuos de aminoacidos adicionales. Por ejemplo, el ligando de afinidad puede incluir secuencias polipeptfdicas adicionales o fragmentos que flanquean el subdominio de mano EF en el contexto de la protema de tipo salvaje de la que deriva el subdominio de mano EF. El ligando de afinidad tambien puede incluir subdominios de mano EF adicionales, por ejemplo, uno o mas, dos o mas, tres o mas etcetera, subdominios de mano EF. Se pueden incluir residuos de aminoacidos y/o subdominios adicionales en el ligando de afinidad por varias razones, por ejemplo para aumentar la afinidad del ligando de afinidad por la segunda etiqueta del subdominio de mano EF unida a la molecula de interes.

El sustrato de la matriz de afinidad puede consistir en cualquier material adecuado, pero preferiblemente es solido. En ciertas realizaciones, el sustrato puede incluir, pero no esta limitado a, polisacaridos entrecruzados tales como celulosa, dextrano (sefadex), agarosa, sefarosa, papel, vidrio, plastico, metal, minerales, ceramica, celulosa, materiales semiconductores, sflice, diversas membranas (porosas o no porosas) o resinas polimericas ngidas tales como poliestireno, poliestireno/latex y otros polfmeros organicos e inorganicos, tanto naturales como sinteticos. Tambien se pueden utilizar sustancias que forman geles, tales como protemas (por ejemplo, gelatinas), lipopolisacaridos, silicatos, agarosa y poliacrilamidas. Tambien son adecuados polfmeros tales como dextranos, polialquilenglicoles o tensioactivos, tales como fosfolfpidos o sales de alquilamonio de cadena larga (12-24 atomos de carbono).

El sustrato puede adoptar cualquiera de una serie de formas. Estas incluyen, pero sin limitacion, esferas solidas o porosas u otras partfculas, superficies solidas tales como sustratos de matriz, columnas, capilares y similares. En una realizacion preferida de la invencion, el sustrato comprende nanopartfculas, tales como nanopartfculas de sflice. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "nanopartfcula" se debe adoptar para significar una partfcula microscopica con al menos una dimension inferior a 100 nm. En ciertas realizaciones, el sustrato no es un chip sensor del tipo utilizado junto con el aparato Biacore 3000.

Ademas, el sustrato se puede anclar a un soporte adicional de modo que la matriz de afinidad adopte una forma adecuada para la aplicacion requerida. Por ejemplo, el sustrato puede empaquetarse en una columna, un capilar, un microcapilar o un tubo de electroforesis para formar una matriz de afinidad a traves de la cual puede pasar una muestra. Alternativamente, el sustrato se puede utilizar para revestir las paredes de un recipiente o los pocillos de una placa de multiples pocillos a la que se agrega una muestra que contiene la molecula etiquetada de interes.

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El ligando de afinidad de mano EF puede anclarse al sustrato mediante cualquier medio adecuado. En una realizacion, el ligando se une covalentemente al sustrato. Si el ligando de afinidad de mano EF se une covalentemente al sustrato de la matriz de afinidad, el sustrato puede ser polifuncional o susceptible de ser polifuncionalizado. Los grupos funcionales que pueden estar presentes en el sustrato y se utilizan para la conexion incluyen, pero no se limitan a, acidos carboxflicos, aldehfdos, grupos amino, grupos ciano, grupos etilenicos, grupos hidroxilo, grupos mercapto y grupos haloacetilo (es decir grupos yodoacetilo).

El ligando de afinidad de mano EF se puede unir al sustrato directamente. En una realizacion, el ligando se une al sustrato mediante acoplamiento aleatorio de amina mediado por cualquier aminoacido a lo largo de la longitud del subdominio de mano EF, siempre que esto no interfiera en la union del ligando de afinidad de mano EF a la segunda etiqueta de subdominio de mano Ef En una realizacion adicional, el ligando de afinidad de mano EF incorpora un residuo de cistema en el extremo N o el extremo C y el primer ligando de afinidad de mano EF se une al sustrato mediante acoplamiento de tiol.

El ligando de afinidad de mano EF tambien se puede unir al sustrato indirectamente, por ejemplo por medio de un reactivo de entrecruzamiento o conector. Los expertos en la tecnica conoceran reactivos de entrecruzamiento adecuados, e incluyen, pero sin limitacion, carbodiimidas, maleimidas, succinomidas y disulfuros reactivos. Los conectores adecuados tambien son conocidos e incluyen, pero sin limitacion, cadenas alqmlicas tales como conectores carbonados de cadena lineal o ramificada, conectores carbonados heterodclicos, conectores carbohidratados y conectores polipeptfdicos.

Moleculas etiquetadas con mano EF

El segundo componente del sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion es una molecula etiquetada con un segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo. Segun se utiliza en la presente memoria, una "etiqueta" es una molecula anclada a la molecula de interes. En la presente invencion, la etiqueta comprende un subdominio de mano EF o un fragmento del mismo de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente; por lo tanto, la etiqueta se denominara en la presente memoria "etiqueta mano EF". Una molecula "etiquetada con EF" o molecula "etiquetada" es cualquier molecula a la que se ancla una etiqueta mano EF de la invencion para formar una molecula quimerica.

Ademas de un subdominio de mano EF, la etiqueta de afinidad puede incluir residuos de aminoacidos adicionales. Por ejemplo, la etiqueta de afinidad puede incluir secuencias polipeptfdicas o fragmentos adicionales que flanquean el subdominio de mano EF en el contexto de la protema de tipo salvaje de la que deriva el subdominio de mano EF. La etiqueta de afinidad tambien puede incluir subdominios de mano EF adicionales, por ejemplo, uno o mas, dos o mas, tres o mas etcetera, subdominios de mano EF. Se pueden incluir residuos y/o subdominios de aminoacidos adicionales en la etiqueta de afinidad por varias razones, por ejemplo, para aumentar la afinidad de la etiqueta de afinidad por el ligando de afinidad mano EF de la matriz de afinidad.

La molecula a la que se ancla la etiqueta mano EF puede ser cualquier molecula organica o biologica de interes incluyendo, pero sin limitase a, una protema, un polipeptido, un acido nucleico, un lfpido, un polisacarido, un carbohidrato y una lectina. En una realizacion preferida, la etiqueta mano EF se ancla a una secuencia de polipeptido o protema que no es parte del subdominio de mano EF, para formar una protema de fusion.

La etiqueta mano EF se puede anclar a la molecula de interes por cualquier medio adecuado, y se puede anclar directa o indirectamente. Cuando la molecula es una protema o polipeptido, la etiqueta mano eF se puede anclar covalentemente a la secuencia polipeptfdica en el extremo N de la secuencia polipeptfdica o en el extremo C de la secuencia polipeptfdica. Alternativamente, la etiqueta mano EF se puede anclar al grupo funcional de la cadena lateral de un residuo de aminoacido de la secuencia polipeptfdica en una posicion entre el extremo N y el extremo C de la secuencia polipeptfdica.

Cuando el anclaje de la etiqueta mano EF a la molecula es indirecto, el anclaje puede estar mediado por un conector. Un conector preferido es capaz de formar enlaces covalentes tanto para la etiqueta mano EF como para la molecula que se va a etiquetar. Los conectores adecuados son conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, pero no estan limitados a, conectores carbonados de cadena lineal o ramificada, conectores carbonados heterodclicos, conectores carbohidratados y conectores polipeptfdicos. En algunas realizaciones, se puede utilizar un conector bifuncional que incluye un grupo funcional reactivo con una funcionalidad preexistente en la etiqueta mano EF, y otro grupo reactivo con una funcionalidad preexistente en la molecula que se vaya a etiquetar.

Cuando la etiqueta mano EF se ancla a un polipeptido o protema para formar una protema de fusion, se prefiere que el conector sea un conector polipeptfdico. Ademas, el conector se puede unir a grupos funcionales de cadena lateral de aminoacidos constitutivos de la etiqueta y/o el polipeptido o a los grupos alfa amino y carboxilo de los aminoacidos terminales de la etiqueta mano EF y el polipeptido que se vaya a etiquetar.

En ciertas realizaciones, se pueden utilizar conectores escindibles para anclar la molecula de interes a la etiqueta

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mano EF. Esto permite que la etiqueta mano EF se separe de la molecula de interes, por ejemplo, mediante la adicion de un agente capaz de escindir el conector. Los expertos en la tecnica conocen una serie de conectores escindibles diferentes. Dichos conectores pueden escindirse, por ejemplo, mediante irradiacion de un enlace fotolabil o hidrolisis catalizada por acido. Tambien existen conectores polipeptfdicos que incorporan un sitio de reconocimiento de proteasas y que pueden escindirse mediante la adicion de una enzima de proteasa adecuada.

Protemas de fusion de mano EF

En la presente memoria se proporcionan, pero no forman parte de la invencion, protemas de fusion de mano EF. Dichas protemas de fusion comprenden un subdominio de mano EF o fragmento del mismo de acuerdo con las realizaciones descritas anteriormente, conjugado con una secuencia de polipeptido que no es parte del subdominio de mano EF o fragmento del mismo.

En una realizacion preferida, el subdominio de mano EF comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de la misma, o una secuencia de aminoacidos con al menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad con la misma. En una realizacion preferida adicional, el subdominio de mano EF comprende EF1 de calbindina D9k.

La porcion polipeptfdica de la protema de fusion que no es parte del subdominio de mano EF puede ser cualquier secuencia de polipeptido o protema adecuada. En una realizacion, el polipeptido al que esta unida la etiqueta del subdominio de mano EF puede ser un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) de una inmunoglobulina que comprende cualquier dominio Vh y Vl de interes.

Las protemas de fusion de mano EF utilizadas en la presente invencion se pueden producir utilizando tecnicas de smtesis qmmica o utilizando tecnicas de expresion recombinantes. Los mecanismos convencionales de smtesis qmmica de peptidos son conocidos en la tecnica e incluyen mecanismos de smtesis en fase solida.

La expresion recombinante implica tfpicamente la produccion de protemas mediante el uso de un casete de expresion o vector de expresion adecuado. Los vectores de expresion de la presente invencion estan disenados para expresar un polipeptido o protema etiquetados con un subdominio de mano EF o fragmento del mismo.

En ciertas realizaciones, el vector de expresion comprende una secuencia de polinucleotido que codifica una etiqueta mano EF de acuerdo con la presente invencion y un sitio de clonacion que tiene uno o mas sitios de restriccion (es decir un sitio de clonacion multiple) para la insercion de una secuencia de polinucleotido adicional que codifica el polipeptido o protema que se vaya a etiquetar con el subdominio de mano EF o fragmento del mismo. El sitio de clonacion debena situarse de manera que cuando la secuencia polinucleotfdica que codifica el polipeptido o protema se inserte en el vector, este en fase con la secuencia polinucleotfdica que codifica la etiqueta mano EF, de forma que cuando el polinucleotido del vector se transcriba y traduzca, se produzca una protema de fusion. Dentro del vector de expresion, el polinucleotido que codifica la etiqueta mano EF puede situarse aguas arriba del sitio de clonacion multiple de modo que la etiqueta se coloca en el extremo 5' o 3' del polipeptido.

Los vectores de expresion para la produccion de protemas de fusion de mano EF pueden ser plasmidos o cosmidos bacterianos o pueden ser vectores de levadura tales como cromosomas artificiales de levadura (YAC), que se replican como cromosomas lineales pequenos. Los vectores de expresion adecuados tambien se pueden obtener de bacteriofagos, incluyendo todos los fagos de ADN y ARN, o virus tales como baculovirus, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados, virus Herpes, virus Vaccinia y virus de ADN totalmente monocatenario, bicatenario y parcialmente bicatenario, virus de ARN con cadena de sentido todo positivo y negativo y retrovirus de replicacion defectuosa.

Para la expresion recombinante de la protema de fusion, el polinucleotido que codifica la protema de fusion se debe unir operablemente a al menos una secuencia reguladora dentro del vector de expresion, en donde la secuencia reguladora es capaz de dirigir o efectuar la expresion de la protema de fusion. El termino secuencia reguladora se debe tomar en un contexto amplio y se pretende que se refiera a cualquier secuencia de nucleotidos capaz de efectuar la expresion de polinucleotidos a los que esta conectada operablemente, incluyendo, pero sin limitarse a, promotores, potenciadores y otros elementos activadores de la transcripcion de origen natural o sinteticos. La secuencia reguladora puede estar localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia de polinucleotido. El termino "conectado operablemente" se refiere a una conexion funcional entre la secuencia reguladora y la secuencia de polinucleotido de manera que la secuencia reguladora impulsa la transcripcion del polinucleotido. Los elementos conectados operablemente pueden ser contiguos o no contiguos. Preferiblemente, la secuencia reguladora es un promotor seleccionado del grupo que incluye, pero no se limita a, promotores constitutivos, promotores inducibles y/o promotores espedficos de tejido.

Las protemas de fusion etiquetadas con mano EF utilizadas en la presente invencion se pueden expresar en una celula anfitriona. Se pretende que el termino "celula anfitriona" incluya cualquier celula o lmea celular en la que se

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pueda introducir un vector de expresion recombinante para la produccion de una protema de fusion etiquetada con EF como se describio anteriormente con en fin de efectuar la expresion. Las celulas anfitrionas adecuadas incluyen, pero no estan limitadas a celulas bacterianas (p.ej. E. coli), celulas de levadura, celulas fungicas, celulas vegetales, celulas de invertebrados y celulas de vertebrados, incluyendo celulas de mairnferos. Las celulas anfitrionas no debenan derivarse de embriones humanos.

La eleccion del vector de expresion y la de secuencia reguladora o promotora asociada puede depender de la celula anfitriona que se vaya a utilizar. Por ejemplo, los vectores de expresion que incorporan el promotor temprano inmediato de CMV son adecuados para su uso en celulas anfitrionas de mai^ero.

El vector de expresion puede se transfectar o transformar en una celula anfitriona adecuada utilizando cualquiera de los mecanismos convencionales conocidos por los expertos en la tecnica. Los ejemplos de mecanismos de transfeccion incluyen, pero sin limitacion, precipitacion con fosfato de calcio, transfeccion mediada por DEAE- dextrano, lipofeccion, electroporacion y microinyeccion. El vector se puede mantener como un vector no integrado, por ejemplo, un plasmido, o alternativamente, se puede integrar en el genoma de la celula anfitriona.

El vector de expresion puede comprender opcionalmente un gen marcador seleccionable. Segun se utiliza en la presente memoria, el termino "gen marcador seleccionable" incluye cualquier gen que confiera un fenotipo a una celula en la que se expresa para facilitar la identificacion y/o seleccion de celulas, que se transfectan o transforman con una construccion de expresion de la invencion. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados incluyen genes de resistencia contra ampicilina (Ampr), tetraciclina (Tcr), kanamicina (Kanr), fosfinotricina, cloranfenicol (CAT), neomicina y geneticina G418. Otros genes marcadores adecuados proporcionan un rasgo metabolico, por ejemplo manA. Tambien pueden utilizarse genes marcadores visuales e incluyen, por ejemplo, beta-glucuronidasa (GuS), luciferasa y protema fluorescente verde (GFP).

El vector de expresion de la invencion puede incluir adicionalmente un origen de replicacion que se requiere para el mantenimiento y/o la replicacion en un tipo celular o celula anfitriona espedficos. Un ejemplo es aquel en el que se requiere que una construccion de expresion se mantenga en una celula bacteriana como un elemento genetico extracromosomico o episomal (p.ej., una molecula de plasmido o cosmido) en una celula. Los ongenes preferidos de replicacion incluyen, pero no se limitan a, pUC-ori, f1-ori, pBR322 ori (pMB1) y colEI ori.

En la Figura 1 se muestra un vector de expresion (pJexpress411:59935 - pelBEF1a_optEc1) de la presente invencion y la secuencia de polinucleotido se muestra en SEQ ID NO: 19. El vector de expresion comprende un casete de expresion adecuado para la expresion de una protema de fusion que incorpora el subdominio EF1 de mano EF de calbindina D9k. El vector de expresion incorpora una secuencia lfder pelB y un sitio de clonacion multiple, que incluye los sitios Ncol y Notl para la insercion de un polipeptido de interes aguas abajo de un promotor T7. La insercion de un polipeptido permite que el polipeptido se transcriba en marco con el subdominio EF1 de mano EF de la calbindina D9k (codificada por la secuencia de polinucleotido representada por los nucleotidos 1621-1746 de SEC ID NO: 19 es decir SEQ ID NO: 31 dentro del inserto del vector en los nucleotidos 1496-1758 de SEQ ID NO:19 es decir SEQ ID NO: 30). El vector de expresion tambien incluye multiples sitios de restriccion, un gen de resistencia a kanamicina y un origen de replicacion pUC_ori. Los detalles completos de las caractensticas y sitios de enzimas de restriccion presentes en el vector mostrado en la Figura 1 se proporcionan en la Tabla 1 a continuacion.

Tabla 1

Vector: Mapa de caractensticas Mapa de restriccion

Nombre: Secuencia Posiciones de corte

pJexpress411: 59935 (SEQ ID NO: 19): Inserto que incluye la secuencia que codifica el subdominio EF1 de mano EF de calbindina D9k: 59935 - Inicio: 1496 Fin: 1758 (SEQ ID NO: 30) AclI AACGTT 3115

AlwNI: CAGNNNCT G 321,1537

ApaI: GGGCCC 974,3664

ApaLI: GTGCAC 416,3433

: AscI GGCGCGCC 3024

: Secuencia EF1 - Inicio: 1621 Fin: 1746 (SEQ ID NO: 31) AseI ATTAAT LO CO 00 CM CO OO CM CO ■sr

: AsiSI GCGATCGC 2636

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion



: Nombre Secuencia Posiciones de corte

: pUC_ori - Inicio: 2 Fin:805 AvaI CYCGRG 967, 1753, 1864



: BelI TGATCA 3467

: Terminador rpn txn - Inicio: 977 Fin: (Complementaria) 1090 GCGNNNNN GGC



: BqlI 978, 1564



: BsmBI CGTCTC 1810(C)

: Terminador bla txn - Inicio: 1097 Fin: 1397 BspHI TCATGA 2, 2158

: (Complementaria) BsrBI CCGCTC 801, 2156, 1453(C)



: BsrDI GCAATG 3866, 3500(C)

: Terminador rrnB1 B2 T1 txn - Inicio: 1858 BssHII GCGCGC 32, 3024, 3864

: Fin:2032 BstEII GGTNACC 3634

: pTF3- Inicio: 1281 Fin:1306 BstXI CCANNNNN NTGG 3255, 3384, 3507

: pTR - Inicio: 1941 Fin: 1957 (Complementaria) BtsI GCAGTG 2584, 4186, 2497(C), 3818 (C)



: EagI CGGCCG 1589


: EcoRV GATATC 1314, 3903

: Terminador T7 - Inicio: 1764 Fin:1810 HincII GTYRAC 1332, 3959



: HpaI GTTAAC 3959


: KasI GGCGCC 1091, 4092

: Promotor T7 - Inicio: 1424 Fin:1440 MluI ACGCGT 1819, 3453



: NarI GGCGCC 1092, 4093


: NcoI CCATGG 1568

: Kanamicina - Inicio: 2217 Fin: 3011 NdeI CATATG 1508



: NotI GCGGCCGC 1589


: NruI TCGCGA 2073, 2293


: NsiI ATGCAT 1388, 2486, 2752

: lacI - Inicio: 3106 Fin: 4176 PciI ACATGT 730, 1326


: PspOMI GGGCCC 970, 3660


: PspXI VCTCGAGB 1753


: PvuI CGATCG 2636


: PvuII CAGCTG 4053,4146


: SapI GCTCTTC 1625(C)


: SapI- Rev GAAGAGC 1625


: SfiI 1564

Vector: Mapa de caractensticas Mapa de restriccion

Nombre: Secuencia Posiciones de corte



: GGCCNNNN NGGCG


: SmaI CCCGGG 1866


: SspI AATATT 1083, 1244, 2193, 2560


: XbaI TCTAGA 1470


: XhoI CTCGAG 1753


: XmaI CCCGGG 1864

Otros vectores de expresion de acuerdo con la presente invencion se muestran en las Figuras 4-7: pJexpress404:92688-EFTag-Nterminal-6His (Figura 4, secuencia de polinucleotido en SEQ ID NO: 20);

pJexpress401:92689-EFTag-Cterminal-6His (Figura 5, secuencia de polinucleotido en SEQ ID NO: 21);

5 pJ602:92691-EFTag-Nterminal-6His-mairnfero (Figura 6, secuencia de polinucleotido en la SEQ ID NO: 22); y

pJ602:92690-EF1-Cterminal-6His-maiTHfero (Figura 7, secuencia de polinucleotido en la SEQ ID NO: 23). Estos vectores de expresion tambien comprenden un casete de expresion adecuado para la expresion de una protema de fusion que incorpora el subdominio EF1 de mano EF de la calbindina D9k. Los detalles completos de las caractensticas y sitios de enzimas de restriccion presentes en los vectores mostrados en las Figuras 4-7 se 10 proporcionan en la Tabla 2 a continuacion.

Tabla 2

Vector: Mapa de caractensticas Mapa de restriccion


: Nombre Secuencia Posiciones de corte

pJexpress 404:: Inserto que incluye la secuencia que codifica el Acc65I GGTACC 401

92688 (SEQ ID NO: 20): subdominio EF1 de mano EF de calbindina D9k: 92688 - Inicio: 153 Fin: 489 (SEQ ID NO: 24) AclI AACGTT 2974, 3371, 3744

AfeI: AGCGCT 103, 3195


: AlwNI CAGNNNCTG 1588


: ApaI GGGCCC 936, 2431

: Secuencia EF1 - Inicio: 241 Fin: 366 (SEQ ID ApaLI GTGCAC 1486, 2654, 3812

: NO: 32) AscI GGCGCGCC 3063


: AseI ATTAAT 1951, 3317

: pUC_ori - Inicio: 1102 Fin: 1905 AvaI CYCGRG 385, 935, 4274

: (Complementaria) BamHI GGATCC 376


: BclI TGATCA 2620

: Terminador rpn txn - Inicio: 817 Fin:930 BglI GCCNNNNNG GC 495, 931, 3265


: BglII AGATCT 389


: BlpI GCTNAGC 475

: terminador rrnB1 B2 T1 txn - Inicio: 4111 Fin: BspEI TCCGGA 3231

: 4285 (Complementaria) BspHI TCATGA 44, 1900, 3980


: BsrBI CCGCTC 9(C), 70 (C), 1105 (C), 3986

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion



: Nombre Secuencia Posiciones de corte




: (C)

: pTF3 - Inicio: 601 Fin: 626 (Complementaria) BsrDI GCAATG 2593, 2227(C)


: BssHII GCGCGC 1870, 2223, 3063


: BstBI TTCGAA 269

: pTR - Inicio: 4186 Fin:4202 BstEII GGTNACC 2452

: rpo_bla_txn_term - Inicio: 506 Fin:930 BstXI CCANNNNNN TGG 2588, 2711, 2840


: BtsI GCAGTG 2275, 3545, 1907 (C), 3565 (C)

: Promotor T5 - Inicio: 41 Fin:88 EcoRI GAATTC 343


: EcoRV GATATC 592, 2188

: Terminadortxn - Inicio: 506 Fin:930 HincII GTYRAC 574, 2132


: HindIII AAGCTT 417


: HpaI GTTAAC 2132

: ori bacteriano de alta numero de copias - Inicio: KasI GGCGCC 811, 1995

: 1103 Fin: 1906 (Complementaria) KpnI GGTACC 405


: MluI ACGCGT 2634


: NarI GGCGCC 812, 1996

: Ampicilina - Inicio: 3081 Fin: 3929 NcoI CCATGG 405

: (Complementaria) NdeI CATATG 170


: NheI GCTAGC 208

: AmpR - Inicio: 3087 Fin: 3929 (Complementaria) NruI TCGCGA 4069


: PciI ACATGT 576, 1172


: PsiI TTATAA 83, 772

: lacl - Inicio: 1916 Fin: 2986 (Complementaria) PspOMI GGGCCC 932, 2427


: PstI CTGCAG 397


: PvuI CGATCG 3515


: PvuII CAGCTG 398, 1945, 2038


: SacI GAGCTC 386


: ScaI-HF AGTACT 3625


: SmaI CCCGGG 4276


: SspI AATATT 662, 823, 3949


: XbaI TCTAGA 129


: XhoI CTCGAG 385


: XmaI CCCGGG 4274


: XmnI GAANNNNTTC 3744

pJexpress: 401: Inserto que incluye la secuencia que codifica Acc65I GGTACC 1686

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion


: Nombre Secuencia Posiciones de corte

92689 (SEQ ID: subdominio EF1 de mano EF de calbindina D9k: AclI AACGTT 3166

NO: 21): 92689 - Inicio: 1567 Fin: 1888 (SEQ ID NO: 25) AfeI AGCGCT 1517


: AlwNI CAGNNNCTG 321


: ApaI GGGCCC 974, 3715


: ApaLI GTGCAC 416, 3484

: Secuencia EF1 - Inicio: 1757 Fin: 1882 (SEQ ID AscI GGCGCGCC 3075

: NO: 32) AseI ATTAAT 2886, 4189

: pUC_ori - Inicio: 2 Fin:805 AsiSI GCGATCGC 2687


: AvaI CYCGRG 967, 1670, 1915

: Terminador rpn txn - Inicio: 977 Fin: 1090 BamHI GGATCC 1661

: (Complementaria) BclI TGATCA 3518

: terminador bla txn - BglI GCCNNNNNG GC 978, 1894


: BglII AGATCT 1674

: Inicio: 1097 Fin: 1397 (Complementaria) BspHI TCATGA 2, 1458, 2209




: 801, 2207, 1423


: BsrBI CCGCTC (C), 1484 (C)

: Terminador rrnB1 B2 T1 txn - Inicio: 1909 Fin: BsrDI GCAATG 3917, 3551 (C)

: 2083 BssHII GCGCGC 32, 3075, 3915


: BstBI TTCGAA 1785

: pTF3- Inicio: 1281 Fin:1306 BstEII GGTNACC 3685

: pTR - Inicio: 1992 Fin: 2008 (Complementaria) BstXI CCANNNNNN TGG 3306, 3435, 3558




: 2635, 4237, 2548


: BtsI GCAGTG (C), 3869 (C)

: Promotor T5 - Inicio: 1455 Fin:1502 EcoRI GAATTC 1859


: EcoRV GATATC 1314, 3954


: HincII GTYRAC 1332, 4010

: ori bacteriano de alto numero de copias - Inicio: 1 HpaI GTTAAC 4010

: Fin:804 KasI GGCGCC 1091, 4143

: Kanamicina - Inicio: 2265 Fin: 3062 KpnI GGTACC 1690


: MluI ACGCGT 3504


: NarI GGCGCC 1092, 4144

: lacl -Inicio: 3157 Fin: 4227 NcoI CCATGG 1690


: NdeI CATATG 1584


: NheI GCTAGC 1622


: NruI TCGCGA 2124, 2344

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion

Nombre: Secuencia Posiciones de corte


: NsiI ATGCAT 1388, 2537, 2803


: PciI ACATGT 730, 1326


: PsiI TTATAA 1134, 1497


: PspOMI GGGCCC 970, 3711


: PstI CTGCAG 1682


: PvuI CGATCG 2687


: PvuII CAGCTG 1683, 4104, 4197


: SacI GAGCTC 1671


: SmaI CCCGGG 1917


: SspI AATATT CM CM CD CM CO oo O CM V- CM


: XbaI TCTAGA 1543


: XhoI CTCGAG 1670


: XmaI CCCGGG 1915

pJ602: 92691 (SEQ ID NO: 22): Inserto que incluye la secuencia que codifica el Subdominio EF1 de mano EF de calbindina D9k: 92691 - Inicio: 2108 Fin: 2444 (SEQ ID NO: 26) AatII GACGTC 1599, 1652, 1735, 1921, 3182

Acc65I: GGTACC 2356

AccI: GTMKAC 3771, 3778

AclI: AACGTT 4113, 4486

Secuencia EF1 - Inicio: 2196 Fin: 2321 (SEC ID NO: 32): AfeI AGCGCT 3937

AlwNI: CAGNNNCTG 321

: ApaI GGGCCC 974

pUC_ori - Inicio: 2 Fin: 805: ApaLI GTGCAC 416, 3481, 4554

Terminador rpn txn - Inicio: 977 Fin: 1090 (Complementaria): AseI ATTAAT 1481, 2086, 2678, 3078, 4059

AvaI: CYCGRG 967, 2340, 3028, 3214, 3224

pTF3- Inicio: 1281 Fin: 1306: AvrII CCTAGG 3007

: BamHI GGATCC 2331

rpo_bla_txn_term - Inicio: 977 Fin: 1401 (Complementaria): BclI TGATCA 3058

BglI: GCCNNNNNG 978, 1564, 1686, 1757, 3441, 4007



: GC

: txn_terminador - Inicio: 977 Fin: 1401 BglII AGATCT 2344

: (Complementaria)

: BlpI GCTNAGC 2430


: BspEI TCCGGA 3973

: Promotor de CMV - Inicio: 1454 Fin: 2054 BspHI TCATGA 2, 4722

: BsrBI CCGCTC 801, 1422(C),

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion


: Nombre Secuencia Posiciones de corte




: 319 0 (C), 4728 (C)

: ori SV40 - Inicio: 2682 Fin: 3025 BssHII GCGCGC 32, 3172


: BstBI TTCGAA 2224

: Resistencia a zeocina - Inicio: 3136 Fin:3510 BtsI GCAGTG 4287, 2062(C), 37 15 (C), 4307 (C)


: EaqI CGGCCG 3467

: Senal de poliadenilacion de SV40 - Inicio: 3638 EcoRI GAATTC 2298

: Fin: 3768 EcoRV GATATC 1314


: FseI GGCCGGCC 3412

: ori bacteriano de alto numero de copias - Inicio: 1 Fin: 804 HincII GTYRAC 1332, 1458, 3072, 3146, 3779


: HindIII AAGCTT 2372

: ZeoR - Inicio: 3139 Fin: 3501 KasI GGCGCC 1091


: KpnI GGTACC 2360

: Ampicilina - Inicio: 3823 Fin: 4671 MscI TGGCCA 3139

: (Complementaria) NarI GGCGCC 1092

: AmpR - Inicio: 3829 Fin: 4671 (Complementaria) NcoI CCATGG 1834, 2360, 2914, 3134


: NdeI CATATG 1708, 2125


: NqoMIV GCCGGC 3408, 3469, 3583


: NheI GCTAGC 2163


: NruI TCGCGA 4811


: NsiI ATGCAT 2757, 2829


: PciI ACATGT 730, 1326


: PmlI CACGTG 3067, 3513


: PsiI TTATAA 1134, 2609, 3659


: PspOMI GGGCCC 970


: PstI CTGCAG 2352


: PvuI CGATCG 4257


: PvuII CAGCTG 2353


: SacI GAGCTC 2042, 2341


: SalI GTCGAC 3777


: SalI-HF GTCGAC 3777


: ScaI-HF AGTACT 4367


: SexAI ACCESO 2774, 3299


: SmaI CCCGGG 3030, 3226


: SnaBI TACGTA 1814

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion


: Nombre Secuencia Posiciones de corte


: SpeI ACTAGT 1473


: SphI GCATGC 2755, 2827


: SspI AATATT 1083, 1244, 4691


: StuI AGGCCT 3006


: XhoI CTCGAG 2340


: XmaI CCCGGG 3028, 3224


: XmnI GAANNNNTTC 2679, 4486




: 1597, 1650,


: ZraI GACGTC 1733, 1919, 3180

pJ602:92690: Inserto que incluye la secuencia que codifica 1599, 1652,

: EF1 de calbindina D9k AatII GACGTC 1735, 1921, 3167

(SEQ ID NO: 23): Subdominio mano EF: 92690 - Inicio: 2108 Fin: Acc65I GGTACC 2227

: 2429 (SEQ ID NO: 27) AccI GTMKAC 3756, 3763


: AclI AACGTT 4098, 4471


: AfeI AGCGCT 3922

: Secuencia EF1 - Inicio: 2298 Fin: 2423 (SEQ ID AlwNI CAGNNNCTG 321

: NO: 32) ApaI GGGCCC 974


: ApaLI GTGCAC 416, 3466, 4539

: pUC_ori - Inicio: 2 Fin: 805 AseI ATTAAT 1481, 2086, 2663, 3063, 4044

: Terminador rpn txn - Inicio: 977 Fin: 1090 967, 2211, 3013,

: (Complementaria) AvaI CYCGRG 3199, 3209

: pTF3- Inicio: 1281 Fin: 1306 AvrII CCTAGG 2992


: BamHI GGATCC 2202

: rpo_bla_txn_term - Inicio: 977 Fin: 1401 BelI TGATCA 3043

: (Complementaria) BglI GCCNNNNNG GC 978, 1564, 1686, 1757, 3426, 3992

: Terminador txn - Inicio: 977 Fin: 1401 BglII AGATCT 2215

: (Complementaria) BspEI TCCGGA 3958


: BSpHI TCATGA 2, 4707

: Promotor CMV - Inicio: 1454 Fin: 2054 BsrBI CCGCTC 801, 1422(C), 3175 (C), 4713 (C)


: BssHII GCGCGC 32, 3157

: ori SV40 - Inicio: 2667 Fin: 3010 BstBI TTCGAA 2326




: 4272, 2062(C), 3700 (C), 4292


: BtsI GCAGTG (C)

: Resistencia a zeocina - Inicio: 3121 Fin: 3495 EagI CGGCCG 3452


: EcoRI GAATTC 2400

Vector: Mapa de caracteristicas Mapa de restriccion


: Nombre Secuencia Posiciones de corte


: EcoRV GATATC 1314

: Senal de poliadenilacion de SV40 - Inicio: 3623 FseI GGCCGGCC 3397

: Fin: 3753 HincII GTYRAC 1332, 1458, 3057, 3131, 3764

: ori bacteriano de alto numero de copias - Inicio: 1 KasI GGCGCC 1091

: Fin: 804 KpnI GGTACC 2231


: MscI TGGCCA 3124

: ZeoR - Inicio: 3124 Fin: 3486 NarI GGCGCC 1092

: Ampicilina - Inicio: 3808 Fin: 4656 1834, 2231,

: (Complementaria) NcoI CCATGG 2899, 3119


: NdeI CATATG 1708, 2125


: NqoMIV GCCGGC 3393, 3454, 3568

: AmpR - Inicio: 3814 Fin: 4656 (Complementaria) NheI GCTAGC 2163


: NruI TCGCGA 4796


: NsiI ATGCAT 2742, 2814


: PciI ACATGT 730, 1326


: PmlI CACGTG 3052, 3498


: PsiI TTATAA 1134, 2594, 3644


: PspOMI GGGCCC 970


: PstI CTGCAG 2223


: PvuI CGATCG 4242


: PvuII CAGCTG 2224


: SacI GAGCTC 2042, 2212


: SaII GTCGAC 3762


: SaII-HF GTCGAC 3762


: ScaI-HF AGTACT 4352


: SexAI ACCESO 2759, 3284


: SmaI CCCGGG 3015, 3211


: SnaBI TACGTA 1814


: SpeI ACTAGT 1473


: SphI GCATGC 2740, 2812


: SspI AATATT 1083, 1244, 4676


: StuI AGGCCT 2991


: XhoI CTCGAG 2211


: XmaI CCCGGG 3013, 3209


: XmnI GAANNNNTTC 2664, 4471




: 1597, 1650,


: ZraI GACGTC 1733, 1919, 3165

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Una vez expresadas, las protemas de fusion se pueden purificar de acuerdo con procedimientos convencionales. En una realizacion preferida, las protemas se purifican utilizando la matriz de afinidad de la presente invencion de acuerdo con los metodos descritos a continuacion.

Metodos

El sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion se puede utilizar para una variedad de aplicaciones en las que se requiere fijar o inmovilizar una molecula en un sustrato.

En una realizacion, el sistema de etiqueta de afinidad se puede utilizar para detectar la presencia de una molecula en una muestra que contiene una mezcla de moleculas, por ejemplo para detectar una molecula o protema biologica espedfica en una muestra biologica que contiene muchos tipos diferentes de moleculas biologicas. La molecula o protema de interes se une a una etiqueta mano EF del tipo descrito anteriormente, y la muestra que contiene la molecula o protema etiquetada con EF se pone en contacto a continuacion con una matriz de afinidad de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente que comprende el ligando de afinidad de mano EF cognado. Cualquier molecula no unida se elimina mediante lavado dejando solo unidas moleculas etiquetadas con mano EF inmovilizadas en el sustrato de la matriz de afinidad. La deteccion de moleculas unidas se puede llevar a cabo utilizando cualquier medio adecuado conocido por los expertos en la tecnica, incluyendo la deteccion de protemas unidas utilizando anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos capaces de reconocer la protema de interes.

En otra realizacion, el sistema de etiqueta de afinidad de la invencion puede utilizarse para generar una "matriz" de protemas, tal como una matriz de protemas para uso en la deteccion de la union de un ligando o compuesto inhibidor a protemas de interes. En estas circunstancias, el sustrato de la matriz de afinidad puede adoptar la forma de una matriz de "chip" o en fase solida a la que se anclan multiples ligandos de afinidad de mano EF. En el contexto de la presente invencion, el termino "multiple" significa que se pueden inmovilizar en el sustrato al menos dos, al menos tres, al menos cuatro, etc. y hasta al menos 1000, 5000, 10.000 etc. protemas de fusion etiquetadas con mano EF del tipo descrito anteriormente mediante la union a los ligandos de afinidad de mano EF anclados a la misma, para producir una matriz de protemas. En una realizacion, las protemas etiquetadas con mano EF son diferentes de manera que en el "chip" o "matriz" se muestran multiples protemas en cualquier momento. Los ligandos o compuestos inhibidores para someterlos a ensayo se pueden aplicar a la matriz de protemas en condiciones adecuadas de manera que se capturan ligandos o compuestos inhibidores con afinidad de union para cualquiera de las protemas mostradas. Cualquier material no unido puede eliminarse por lavado y cualquier ligando unido o compuesto inhibidor puede detectarse mediante mecanismos conocidos por los expertos en la tecnica.

Las matrices de protemas descritas anteriormente se pueden modificar para mostrar diferentes conjuntos de protemas dependiendo de la aplicacion requerida. Por ejemplo, se puede separar un primer conjunto de protemas etiquetadas con mano EF ancladas a la matriz de afinidad mediante la adicion de un agente de liberacion adecuado. Los agentes de liberacion adecuados incluyen cualquier agente capaz de interrumpir la interaccion entre la etiqueta mano EF de las protemas y el ligando de afinidad de mano EF de la matriz de afinidad. Una vez que las protemas etiquetadas con EF se separan de la matriz, la matriz se puede volver a cargar con un conjunto diferente de protemas etiquetadas con mano EF. De esta forma, las matrices de afinidad de la invencion en forma de chips o matrices recubiertas con ligandos de afinidad de mano EF pueden reciclarse para producir diferentes matrices de protemas para su uso posterior.

En una realizacion preferida, el sistema de etiqueta de afinidad de la presente invencion se puede utilizar para purificar moleculas, tales como moleculas biologicas, etiquetadas con un subdominio de mano EF o un fragmento del mismo a partir de una muestra. En una realizacion particularmente preferida, el sistema de etiqueta de afinidad se utiliza para purificar protemas o polipeptidos a partir de una muestra. En un primer paso, la molecula o protema de interes se marca con una etiqueta mano EF como se describio anteriormente. En una segunda etapa, se pone en contacto una muestra que contiene una molecula de interes etiquetada con EF-mano con una matriz de afinidad que comprende un subdominio de mano EF o fragmento del mismo anclado a un sustrato. El subdominio de mano eF o fragmento del mismo de la matriz de afinidad, es decir el ligando de afinidad de mano EF debe ser capaz de unirse a la etiqueta mano EF anclada a la molecula de interes.

La muestra que contiene la molecula etiquetada con mano EF de interes se pone en contacto con la matriz de afinidad en condiciones que permiten la union de la etiqueta mano EF y el ligando de afinidad de mano EF. La molecula etiquetada con mano EF que se debe purificar generalmente se pone en contacto con la matriz de afinidad en una solucion o tampon que incluye iones de calcio (u otro ion u otro equivalente que pueda sustituir al calcio) para facilitar la union de la molecula etiquetada a la matriz. La union de la molecula etiquetada con mano EF puede producirse a concentraciones de calcio superiores a 10 nM. En presencia de calcio, la Kd para la union de los subdominios de mano EF o fragmentos de los mismos tipicamente sera menor que 1 pM, preferiblemente menor que 100 nM y mas preferiblemente menor que 10 nM.

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Cualquier material no unido en la muestra se puede eliminar, por ejemplo, mediante el lavado de la matriz de afinidad. En una etapa final, la molecula de interes puede liberarse de la matriz de afinidad utilizando cualquier agente liberador adecuado. Generalmente, utilizando los metodos de la invencion, se obtiene una composicion sustancialmente pura con una homogeneidad de al menos 80%, 85%, 90%, 95%, 98% o 99%.

El agente de liberacion puede ser cualquier agente capaz de separar la molecula de interes de la matriz de afinidad. En una realizacion, el agente de liberacion es un agente capaz de interrumpir la interaccion entre la etiqueta mano EF y el ligando de afinidad de mano EF de la matriz. Los agentes adecuados para este fin incluyen agentes capaces de secuestrar o quelar calcio. Los quelantes de calcio son bien conocidos por los expertos en la tecnica e incluyen, entre otros, EDTA, EGTA, desferal, bifosfonato, acido 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano-N,N,N'N'-tetraacetico (BAPTA), BAPTA/AM, EGTA/AM, 5N-BAPTA, 5,5'Br2-BAPTA, fura-2, Quin-2 y similares.

En una realizacion adicional alternativa o en algunos casos, el agente de liberacion es un agente capaz de escindir la molecula de interes de la etiqueta mano EF de manera que la molecula de interes se separe de la matriz de afinidad. Como se describio anteriormente, la etiqueta mano EF se puede anclar a la molecula de interes a traves de un conector escindible. Cuando la molecula de interes es un polipeptido o protema anclados a la etiqueta mano EF a traves de un conector polipeptfdico, el conector polipeptfdico se puede disenar de manera que contenga un sitio de reconocimiento de proteasa. Se puede utilizar cualquier proteasa capaz de reconocer el sitio de escision del conector de polipeptido para liberar la protema de interes de la etiqueta mano EF y separar de ese modo la protema de interes de la matriz de afinidad.

Para los metodos de purificacion por afinidad descritos en la presente memoria, la matriz de afinidad puede adoptar cualquier forma adecuada. Por ejemplo, la matriz de afinidad puede ocupar el interior de una columna de purificacion de afinidad a la que se aplica una muestra. Cualquier material no unido puede separarse de las protemas etiquetadas con EF unidas mediante lavado de la columna.

En una realizacion preferida, la matriz de afinidad comprende un sustrato de nanopartmulas, en particular nanopartmulas de sflice, con ligandos de afinidad de mano EF anclados. La muestra que contiene las protemas etiquetadas con mano EF se mezcla con las nanopartmulas en condiciones que permiten la union entre los subdominios de mano EF. Las moleculas etiquetadas con mano EF unidas a las nanopartmulas se pueden recoger mediante centrifugacion en condiciones adecuadas para la sedimentacion espedfica de las nanopartmulas. Se pueden emplear diversas etapas de lavado para mejorar la pureza de la preparacion de protema, como entenderan facilmente los expertos en la tecnica.

En una aplicacion adicional, el sistema de etiqueta de afinidad de la invencion se puede utilizar para lograr el suministro dirigido de moleculas de interes. En una realizacion, el sistema de etiqueta de afinidad se puede utilizar para dirigir la administracion de farmacos a sitios concretos dentro del organismo de un paciente que se vaya a tratar. Bajo estas circunstancias, el sustrato de la matriz de afinidad puede comprender un agente de direccionamiento, por ejemplo un anticuerpo, o un fragmento de union a antfgeno del mismo, capaz de reconocer un antfgeno presente dentro de un tejido concreto o sobre una celula concreta dentro del organismo. La matriz de afinidad estana asf localizada en un sitio concreto dentro del organismo. La etiqueta mano EF podna anclarse a cualquier molecula o farmaco destinados a ser administrados a un paciente. La molecula o farmaco etiquetados con mano EF, una vez administrados al paciente, se localizanan asf en el sitio de la matriz de afinidad a traves de la interaccion con el ligando de afinidad de mano EF cognado. Este enfoque se puede utilizar en particular para dirigir farmacos relativamente no espedficos o toxicos a su sitio de accion y de ese modo reducir la dosis global necesaria para la administracion a un paciente.

La invencion se comprendera mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

1. Produccion de una protema de fusion de mano EF - scFv-EF1

El gen de cadena pesada variable, la secuencia del conector de glicina serina y la secuencia del gen de la cadena ligera variable se escindieron del clon anti-scFv de ubiquitina (biblioteca Tomlinson I, recurso MRC Gene) utilizando los sitios de restriccion Nco I/Not I. El fragmento escindido se purifico en gel y se ligo al vector de clonacion pJexpress411:59935 - pelBEFIa optEcl (pJexpress-pelB-EF1, Figura 1) que habfa sido digerido con los sitios de restriccion Nco I/Not I y purificado en gel. La mezcla de ligacion se utilizo para transformar qmmicamente celulas BL21 competentes de E. coli. Se preparo un cultivo durante la noche de E. coli BL21 transformadas con pJExpress pelB-anti-ubiquitin scFv-EF1 recogiendo una sola colonia de las bacterias transformadas en 2 mL de 2 x tY/100 |jg/ml de ampicilina/glucosa al 2% (p/v). El cultivo de una noche se utilizo para inocular 2 litros de 2 * TY/100 jg/ml de ampicilina/glucosa al 0,1% (p/v) que se cultivo en una incubadora con movimiento oscilante a 37°C hasta que se obtuvo una DO600nm de aprox.

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Se anadio IPTG 1.0. (Sigma) a una concentracion final de 1 mM para inducir la expresion de la protema de fusion scFv-EF1 y el cultivo de expresion se transfirio a una incubadora con movimiento oscilante a 30°C ajustada a 250 rpm. Despues de una incubacion de 4 h, las bacterias se sedimentaron por centrifugacion a 4000 g durante 20 min. A continuacion se anadieron 50 mL de tampon de extraccion periplasmatico enfriado con hielo (Tris-HCl 30 mM, pH 8,0, sacarosa al 20% (p/v), EDTA 1 mM) a los sedimentos bacterianos para la resuspension. Las bacterias se centrifugaron de nuevo a 4000 g durante 20 min y se retuvo el sobrenadante. A continuacion se anadieron 50 mL tampon de choque osmotico enfriado con hielo (MgSO4 5 mM) a los granulos bacterianos. La preparacion fue nuevamente centrifugada a 4000 g durante 20 min y se retuvo el sobrenadante. Los sobrenadantes de la extraccion periplasmica y la extraccion de choque osmotico se combinaron y centrifugaron a 17.500 g durante 20 minutos para retirar los restos celulares.

2. Produccion de una matriz de afinidad de mano EF

Se sedimento 1 mg de nanopartmulas (5 mg/ml) de SO2-COOH 70 nm en una microcentnfuga a 10.000 RPM durante 5 minutos. Se mezclaron primero volumenes iguales de NHS 0,1 M y EDC 0,4 M, y se utilizaron 100 pl de la mezcla para volver a suspender las nanopartmulas. La EDC/NHS se elimino de las nanopartmulas despues de una breve centrifugacion (5 min) a 10.000 RPM en una microcentnfuga. Se utilizaron 100 microlitros de una solucion de PDEA, preparada disolviendo 4,5 mg de PDEA en 205 pl de tampon de borato 0,1 M a pH 8,5, para resuspender las partmulas para introducir un grupo disulfuro reactivo en grupos carboxilo de las nanopartmulas carboxiladas. Las nanopartmulas se sedimentaron una vez mas y se retiro el sobrenadante. A continuacion, se utilizo EF2-GGC a 0,1 mg/ml en 100 pl de tampon de formiato sodico 10 mM a pH 4,3 para resuspender las partmulas y se dejo incubar durante 10 minutos. La Cys C-terminal de EF2-GGC se utilizo para crear un enlace covalente entre el EF2-GGC inmovilizado en la superficie de las nanopartmulas. La desactivacion del exceso de disulfuros reactivos en la superficie de las nanopartmulas se realizo resuspendiendo las partmulas sedimentadas en 200 pl de L-cistema 50 mM con NaCl 1 M en tampon de formiato 100 mM a pH 4,3. Las nanopartmulas de EF2-SO resultantes se reconstituyeron en Tris HCl 10 mM, CaCl21 mM, KCl 150 mM.

3. Purificacion de protemas de scFv-EF1 utilizando el sistema de etiqueta de afinidad mano EF

Los sobrenadantes agrupados de la extraccion periplasmica y la extraccion de choque osmotico se sometio a cambio de tampon en Tris-HCl 10 mM, CaCl2 1 mM, KCl 150 mM a pH 7,4 utilizando un cartucho centriprep YM-10 con centrifugacion a 3.000 xg. A continuacion se incubo 1 mL de la preparacion sometida a intercambio con 0,1 mg/ml de nanopartmulas de EF2-SO en un agitador rotativo, girando durante al menos 1 hora a temperatura ambiente. La mezcla se centrifugo a 10.000 RPM en una microcentnfuga durante 10 minutos. El sobrenadante se retiro y se guardo. La mezcla de nanopartmulas se lavo luego dos veces en 150 pl de tampon de lavado de calcio (Tris-HCl 10 mM, CaCh 1 mM, KCl 150 mM, pH 7,4). Las nanopartmulas se eluyeron a continuacion dos o tres veces en 150 pl de tampon de elucion con EDTA (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0). Las fracciones resultantes (sobrenadantes, lavados y productos eluidos) se analizaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 10% y se visualizaron mediante tincion con Coomassie y decoloracion (Figura 2).

4. Produccion de protema de fusion EF1-Snap25 a partirde pEF1-N

La secuencia codificante para la protema asociada a sinaptosomas humanos, 25 kDa (SNAP25) (numero de acceso: NM_130811) se amplifico a partir de una construccion de vector utilizando cebadores de clonacion de PCR espedficos de gen: -

Snap25-BamHI: TGG GGA TCC ATG GCC GAA GAC (SEC ID NO: 28)

Snap25-NcoI: ATC CCA TGG TTA ACC ACT TCC CAG (SEQ ID NO: 29)

El producto de PCR se digirio con enzimas de restriccion BamHI y Ncol que cortan dentro de los sitios de restriccion incorporados a las secuencias de cebador de clonacion. El producto de PCR digerido se purifico y se ligo a la secuencia de clonacion multiple del vector de expresion terminal pEFTag-N (pEF1-N, Figura 4) que se habfa digerido con las mismas enzimas de restriccion y se purifico en gel. Brevemente, se anadio 1 pl de ADN ligasa T4 a una razon 2:1 de inserto genico con respecto a vector en una reaccion de 20 pl durante 10 minutos. Se utilizaron 5 pl de esta reaccion de ligacion para transformar celulas de E. coli BL21 Rosetta competentes y se recogio una colonia transformada unica y se inoculo s 5 mL de Overnight Express Autoinduction Media (Novagen) y se cultivo durante 8 horas a 37°C, de los cuales se utilizaron 2 mL. para inocular 100 mL de medio de cultivo. Despues de 16 horas de crecimiento, las celulas se sedimentaron y las protemas se purificaron en condiciones desnaturalizantes o nativas. Brevemente, la preparacion desnaturalizante implico la lisis de granulos bacterianos con tampon de lisis que contema Urea 8 M con purificacion posterior en esferas de agarosa de Ni-NTA en un gradiente de pH de pH 8 a pH 4,5. La purificacion nativa se realizo mediante la suspension de sedimentos bacterianos en un tampon Tris con NaCl 300 mM y la sonicacion de celulas con una micropunta sonicadora a 60W.

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REIVINDICACIONES

1. Un sistema de etiqueta de afinidad para inmovilizar una molecula, comprendiendo dicho sistema:

(i) una matriz de afinidad que comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo anclado a un sustrato; y

(ii) una molecula etiquetada con un segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo,

en donde la molecula se inmoviliza en el sustrato mediante la interaccion entre el primer y el segundo subdominios EF o fragmentos de los mismos, y en donde un fragmento de un primer o segundo subdominio EF conserva la capacidad del subdominio EF completo formar un par de union de mano EF.
2. El sistema de la reivindicacion 1, en donde el primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo es capaz de unirse al segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo en presencia de calcio y/o en donde la afinidad de union entre el primer subdominio de mano EF y el segundo subdominio de mano EF es Kd = 10 nM o menos.
3. El sistema de la reivindicacion 1 o 2, donde el primer subdominio de mano EF se selecciona del grupo que consiste en los dominios de mano EF encontrados en cualquier protema de union a calcio que comprende dos o mas manos EF, y en donde el subdominio de mano EF es capaz de formar un par de union con un segundo subdominio de mano EF, en presencia de calcio, opcionalmente en donde el primer subdominio de mano EF se selecciona entre:

(i) una protema de origen humano, bovino, murino o de rata;

(ii) el grupo de subdominios proteicos que comprende la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3-18;

(iii) el grupo de dominios de protema que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 85% de identidad de secuencia con uno cualquiera de SEQ ID NO: 3-18;

(iv) EF2 de calbindina D9k;

(v) un subdominio de mano EF que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1;

(vi) un subdominio de mano EF que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos un 85% de identidad de secuencia con SEQ iD NO: 1.
4. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el sustrato de la matriz de afinidad se selecciona del grupo que consiste en polisacarido entrecruzado, ceramica, metal, vidrio, plastico, celulosa, sflice,

y/o en donde el primer subdominio de mano EF se ancla al sustrato mediante acoplamiento aleatorio de amina o en donde el primer subdominio de mano EF se modifica para facilitar el anclaje al sustrato y/o en donde el primer subdominio de mano EF se ancla al sustrato a traves de un conector.
5. El sistema de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la molecula etiquetada con un segundo subdominio de mano EF o fragmento del mismo es una protema de fusion que comprende un segundo subdominio de mano EF y una secuencia polipeptfdica que no es parte del subdominio de mano Ef. opcionalmente en donde el segundo subdominio de mano EF esta unido a la secuencia polipeptfdica en el extremo N-terminal de la secuencia polipeptfdica o en el extremo C terminal de la secuencia polipeptfdica o a un residuo de aminoacido de la secuencia polipeptfdica en una posicion entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de la secuencia polipeptfdica o en donde el segundo subdominio de mano EF esta unido a la secuencia polipeptfdica a traves de un conector.
6. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, donde el segundo subdominio de mano EF se selecciona del grupo que consiste en los subdominios de mano EF encontrados en cualquier protema de union a calcio que comprende dos o mas manos EF, y en donde el subdominio de mano EF es capaz de formar un par de union con un primer subdominio de mano EF en presencia de calcio, opcionalmente en donde el segundo subdominio de mano EF esta:

(i) derivado de la misma protema de union a calcio que el primer subdominio de mano EF; o

(ii) es de una protema de origen humano, bovino, murino o de rata; o

(iii) se selecciona del grupo de dominios proteicos que comprende la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 3-17; o

(iv) se selecciona del grupo de dominios de protema que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos 85% de identidad de secuencia con uno cualquiera de SEQ ID NO: 3-17; o

(v) es EF1 de calbindina D9K; o

(vi) es un subdominio de mano EF que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2; o

(vii) es un subdominio de mano EF que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

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7. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la primera y la segunda manos EF se disocian mediante la adicion de un agente quelante de calcio, opcionalmente en donde el agente quelante de calcio se selecciona del grupo que consiste en EDTA, EGTA, BAPTA, citrato y fosfato .
8. El uso del sistema de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para detectar la presencia de una molecula biologica en una muestra o para detectar la union de un ligando o inhibidor a una molecula biologica en una muestra o para purificar moleculas biologicas etiquetadas con un subdominio de mano EF .
9. Una matriz de afinidad que comprende un primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo que es capaz de unirse a un segundo subdominio de mano Ef en presencia de calcio, en donde dicho primer dominio de mano EF o fragmento del mismo se ancla a un sustrato y donde dicho primer subdominio de mano EF se selecciona entre:

(i) EF2 de calbindina D9K,

(ii) un subdominio de mano EF que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1 o

(iii) un subdominio de mano EF que comprende una secuencia de aminoacidos con al menos 85% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1,

en donde el fragmento del primer subdominio de mano EF conserva la capacidad del subdominio de mano EF completo para formar un par de union de mano EF.
10. La matriz de la reivindicacion 9, en donde el sustrato de la matriz de afinidad se selecciona del grupo que consiste en polisacarido entercruzado, ceramica, metal, vidrio, plastico, celulosa, sflice y/o

en donde el primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo se ancla al sustrato mediante acoplamiento aleatorio de amina o en donde el primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo se modifica para facilitar el anclaje al sustrato,

y/o en donde el primer subdominio de mano EF o fragmento del mismo se ancla al sustrato a traves de un conector.
11. Un metodo para purificar una molecula biologica etiquetada con un subdominio de mano EF o un fragmento del mismo a partir de una muestra, comprendiendo dicho metodo las etapas de:

(i) proporcionar la matriz de afinidad de la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10;

(ii) poner una muestra que contiene la molecula biologica etiquetada en contacto con la matriz de afinidad de (i) en condiciones que permitan la union de los subdominios de mano EF (es decir en presencia de calcio);

(iii) separar cualquier material no unido de la molecula biologica etiquetada unida a la matriz de afinidad; y

(iv) efectuar la liberacion de la molecula biologica etiquetada de la matriz de afinidad.
12. El metodo de la reivindicacion 11 en donde la liberacion de la molecula biologica etiquetada se efectua mediante la adicion de un agente que quela el calcio o mediante la escision de la etiqueta del subdominio de mano EF

y/o en donde la matriz de afinidad comprende un dominio de mano EF anclado a un sustrato que consiste esencialmente en, o que consiste en, nanopartfculas de sflice y/o en donde la molecula biologica es una protema o polipeptido.