ES2683380T3 - Inhibidores del receptor H4 para tratar el tinnitus - Google Patents

Inhibidores del receptor H4 para tratar el tinnitus Download PDF

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Abstract

Un inhibidor del receptor de la histamina tipo 4 (H4R) para uso en el tratamiento del tinnitus, en el que dicho inhibidor de H4R se selecciona entre: - 1-[(5-cloro-1H-indol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina, - 4-((3R)-3-5 aminopirrolidin-1-il)-6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-ilamina, - cis-4-(piperazin-1-il)-5,6,7a,8,9,10,11,11a-octahidrobenzofuro[2,3-h] quinazolin-2-amina, - 7-(furan-2-il)-4-(piperazin-1-il)quinazolin-2-amina, - 1-(7-(2-amino-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidin-4-il)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-2-ciclopentiletanona, - 1-[(5-cloro-1H-bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina maleato, - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina, - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina tartrato, - (R)-4-(3-amino-pirrolidin-1-il)-6-isopropil-pirimidin-2-ilamina, - 2-isobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-isobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclohexilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-(4-fluorobencil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-tert-butil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-isopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-(ciclopropilmetil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina, - 2-ciclopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-tert-butil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-isopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina, - 6-(3-aminoazetidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina, - 2-isobutil-6-(3-metil-3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 6-((3R)-3-aminopirrolidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina, - 2-ciclobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclopentil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclopentil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-(2,2-dimetilpropil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-(2,2-dimetilpropil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, 2-(2-ciclopentiletil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclohexilmetil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclopropilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclohexil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina, - 2-ciclohexil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, y - 2-(4-fluorobencil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina.

Description

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DESCRIPCION
Inhibidores del receptor H4 para tratar el tinnitus Campo de invencion
La invencion se refiere a antagonistas del receptor de la histamina tipo 4 (H4R) para uso en el tratamiento del tinnitus.
Antecedentes de la invencion
El ofdo interno es la parte mas interna del ofdo vertebrado donde dos organos sensoriales estan alojados en el hueso temporal:
• La coclea, dedicada a la funcion auditiva, que convierte los patrones de presion sonora de la oreja externa en impulsos electroqmmicos que se transmiten al cerebro a traves del nervio auditivo. La coclea constituye la region ventral del ofdo interno y contiene el organo de Corti que comprende las celulas ciliadas mecanosensoriales y las celulas de soporte.
• El sistema vestibular, dedicado al equilibrio, la aceleracion y la gravedad. Este organo tiene una funcion totalmente diferente de la coclea, dicha funcion consiste en la deteccion de aceleraciones lineales y angulares de la cabeza para transmitir al cerebro informacion sobre movimientos para lograr la funcion de equilibrio en colaboracion con informacion visual y propioceptiva. Tambien esta constituido por celulas ciliadas mecanosensoriales que convierten acciones mecanicas en potenciales electricos y celulas de soporte.
Aunque estos dos organos tienen celulas ciliadas sensoriales responsables del potencial receptor y los potenciales de accion subsiguientes, su distinta morfologfa, conexiones sinapticas y funcion global implican diferencias en los mecanismos moleculares y celulares subyacentes a su accion.
El sistema vestibular y la coclea exhiben diferencias dependientes del organo. De hecho, el numero de canales ionicos y receptores activados por neurotransmisores se expresan de manera diferente en esos organos sensoriales. Esto es particularmente cierto para los canales de iones involucrados en la excitabilidad de las celulas nerviosas. Como tal, la heterogeneidad endogena es, por ejemplo, responsable de diferencias muy fuertes en los patrones de descarga del potencial de accion entre la coclea y el vestfbulo (Zun-Li MO and Robin Davis, 1997. J Neurophysiol. 77(3):1294-305; Eatock et al., 2008 J. Exp Biol. 211(Pt 11): 1764-74). Por lo tanto, la alteracion/modulacion de la expresion o funcion de los canales o receptores de iones, ya sea farmacologica o geneticamente, puede tener consecuencias significativamente diferentes en las funciones auditivas y de equilibrio. De forma similar, cuando los receptores o canales ionicos expresados en un organo tienen mecanismos desconocidos, sus probables efectores o socios moleculares en el otro organo del ofdo interno son diffciles de predecir, y por consiguiente el resultado de su modulacion/mutacion es impredecible en sf mismo.
En un ejemplo mas espedfico, Kv7. La familia de canales de potasio asociada con la excitabilidad de las neuronas se expresa en ambos tejido neuronas, su modulacion o mutacion tiene consecuencias funcionales muy distintas en las dos modalidades sensoriales: una sordera progresiva y grave (Kharkovets T. et al., 2006 EMBO J. 25(3):642- 652) pero la funcion de equilibrio normal (Spitzmaul G et al., 2013 J Biol Chem. 288(13):9334-44).
En resumen, tales diferencias estructurales, funcionales y patologicas entre la coclea y el vestfbulo conducen a la busqueda del tratamiento terapeutico coclear como altamente espedfico para este peculiar organo sensorial.
En la tecnica, varias divulgaciones han ensenado el uso de antagonistas del receptor de la histamina tipo 4 (H4R), para el tratamiento de trastornos vestibulares (Solicitud de Patente Internacional WO2010/072829; Kiss et al., Expert Opin Ther Pat. 2012 Mar;22(3):205-21; Desmadryl et al., Br J Pharmacol. 2012 Oct;167(4):905-16).
El tinnitus es una sensacion fantasma de audicion en ausencia de sonidos externos. Se refiere al tinnitus objetivo, que es causado por el sonido generado en algun lugar del cuerpo y el tinnitus subjetivo, que es la percepcion de sonidos sin sentido sin que este presente ningun sonido ffsico. El tinnitus afecta aproximadamente al 10% de la poblacion. Aproximadamente 50 millones de adultos estadounidenses informaron tener cualquier tinnitus, y 16 millones de adultos estadounidenses informaron haber tenido tinnitus frecuente en el ultimo ano. La prevalencia de tinnitus frecuente aumenta con la edad, alcanzando un maximo de 14.3% entre los 60 y 69 anos. El tinnitus puede afectar significativamente la calidad de vida ya que causa irritabilidad, agitacion, estres, insomnio, ansiedad y depresion. De hecho, para uno de cada 100 adultos, el tinnitus afecta su capacidad para llevar una vida cotidiana normal.
El tinnitus subjetivo es la percepcion del sonido sin ningun estfmulo auditivo. Muchas personas experimentan tinnitus transitorios que duran segundos o minutos despues de la exposicion a ruidos fuertes. Los sonidos asociados con el tinnitus subjetivo se han descrito como zumbidos, silbidos, agua corriendo, zumbidos, grillos, cigarras, silbidos,
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vientos. La mayona de los pacientes experimentan un ruido de tono alto por lo general superior a 3,000Hz. Aunque no existe consenso sobre un patomecanismo unico y comun para el tinnitus, actualmente hay evidencia acumulada de una teona del sistema auditivo periferico principal del tinnitus subjetivo. Las emisiones otoacusticas espontaneas, el aumento de la actividad espontanea en el area coclear, tal como el disparo aberrante del nervio auditivo y la disfuncion discordante de las celulas ciliadas externas danadas y las celulas ciliadas internas intactas se han postulado como causa putativa del tinnitus.
Debido a la falta de bases fisiopatologicas, la razon detras de los tratamientos farmacologicos para el tinnitus es tratar las comorbilidades que acompanan al tinnitus, como la depresion y la ansiedad. Otros tratamientos usan farmacos que son eficaces en los trastornos que se cree que comparten algunos puntos en comun con el tinnitus, como los anticonvulsivos usados en la epilepsia y el antagonista del calcio gabapentina usado en el dolor neuropatico. Aunque una gran variedad de compuestos se usa fuera de indicacion para tratar pacientes con tinnitus, todavfa no hay en el mercado medicamentos aprobados por the US Food and Drug Administration (FDA) o the European Medicines Agency (EMA). La lista de compuestos usados incluye anticonvulsivos, ansiolfticos, antidepresivos, antagonistas de NMDA, antagonistas colinergicos, antihistammicos, vasodilatadores, antipsicoticos y antagonistas del calcio. Por ejemplo, los documentos WO2010113109 y WO2012/042314 describieron el uso de ciclobenzaprina para tratar el tinnitus.
Sin embargo, la mayona de los farmacos no han demostrado una eficacia suficiente en ensayos clmicos controlados aleatorios para ser aprobados y comercializados espedficamente para el tinnitus.
La presente invencion tiene como objetivo proporcionar composiciones para uso en el tratamiento del tinnitus. Resumen
La invencion proporciona inhibidores del receptor de la histamina tipo 4 (H4R) como se define en las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento del tinnitus.
En otra realizacion, dicho inhibidor es 1-[(5-cloro-1H-indol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina o 4-((3R)-3-aminopirrolidin-
1- il)-6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-ilamina o cis-4-(piperazin-1-il)-5,6,7a,8,9,l0,11,11a- octahidrobenzofuro[2,3- h]quinazolin-2-amina o 7-(furan-2-il)-4-(piperazin-1-il)quinazolin-2-amina o 1-(7-(2-amino-6- (4-metilpiperazin-1-il)pirimidin-4-il)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-2-ciclopentiletanona o 1-[(5-cloro-1H-bencimidazol-
2- il)carbonil]-4-metilpiperazina maleato o PF-3893787 o pF-3893787-18 o JNJ39758979.
Otro objeto de la invencion es una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de H4R como se define en las reivindicaciones 1-5 para uso en el tratamiento de tinnitus.
Definiciones
El termino "receptor de la histamina H4" tiene su significado general en la tecnica. El termino puede incluir receptores de la histamina H4 de origen natural y variantes y formas modificadas de los mismos. El receptor de la histamina H4 puede ser de cualquier fuente, pero por lo general es un receptor de la histamina H4 de mairnfero (por ejemplo, humano y no humano), particularmente un receptor de la histamina H4 humano. Las secuencias para el receptor de la histamina H4 se han publicado con las referencias NM_021624 (Homo sapiens), NM_153087 (Mus musculus) y NM_131909 (Rattus norvegicus).
El termino "antagonista del receptor" se usa indistintamente para indicar un antagonista "verdadero" y un agonista inverso de un receptor. Un antagonista del receptor "verdadero" es un compuesto que se une al receptor y bloquea la activacion biologica del receptor, y por lo tanto la accion del agonista del receptor, por ejemplo, compitiendo con el agonista por dicho receptor. Un agonista inverso es un compuesto que se une al mismo receptor que el agonista, pero ejerce el efecto opuesto. Los agonistas inversos tienen la capacidad de disminuir el nivel constitutivo de activacion del receptor en ausencia de un agonista.
El termino "antagonista del receptor de la histamina H4" incluye cualquier entidad qdmica que, tras la administracion a un paciente, da como resultado la inhibicion o regulacion negativa de una actividad biologica asociada con la activacion del receptor de la histamina H4 en el paciente, incluyendo cualquiera de los efectos biologicos aguas abajo que de otro modo resultanan de la union al receptor de la histamina H4 de su ligando natural. Tales antagonistas del receptor de la histamina H4 incluyen cualquier agente que pueda bloquear la activacion del receptor de la histamina H4 o cualquiera de los efectos biologicos aguas abajo de la activacion del receptor de la histamina H4. Por ejemplo, tales antagonistas del receptor de la histamina H4 pueden actuar ocupando el sitio de union del ligando o una porcion del mismo del receptor de la histamina H4, lo que hace que el receptor sea inaccesible a su ligando natural, de modo que se evita o reduce su actividad biologica normal. En el contexto de la presente invencion, los antagonistas del receptor de la histamina H4 son selectivos para el receptor de la histamina H4 en comparacion con los otros receptores de la histamina, tales como el receptor de la histamina H1, el receptor de la histamina H2 y el receptor de la histamina H3. Por "selectivo" se entiende que la afinidad del antagonista por el receptor de la histamina H4 humano es al menos 10 veces, preferiblemente 25 veces, mas preferiblemente 100
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veces, todavfa preferiblemente 500 veces mayor que la afinidad para el otro receptor de la histamina humana (H1, H2 y H3).
La afinidad de un antagonista para el receptor de la histamina H4 se puede cuantificar midiendo la actividad del receptor de la histamina H4 o el efecto biologico resultante del antagonismo del receptor en presencia de un intervalo de concentraciones de dicho antagonista con el fin de establecer una curva dosis-respuesta. A partir de esa curva de respuesta a la dosis, se puede deducir un valor de IC50 que represente la concentracion de antagonista necesaria para inhibir el 50% de una actividad biologica inducida por un agonista en una concentracion definida. El valor de 1C50 se puede determinar facilmente por un experto en la tecnica ajustando los diagramas de dosis- respuesta con una ecuacion dosis-respuesta como describen De Lean et al., (1979). Los valores de IC50 se pueden convertir en constante de afinidad (Ki) usando los supuestos de Cheng and Prusoff (1973).
De acuerdo con lo anterior, un antagonista del receptor de la histamina H4 selectivo es un compuesto para el cual al menos una de las proporciones (i) Ki H3: Ki H4, y (ii) IC50 H3: IC50 H4, esta por encima de 10: 1, preferiblemente 25: 1, mas preferiblemente 100: 1, aun preferiblemente 1000: 1.
La actividad antagonista de los compuestos hacia los receptores de la histamina H4 se puede determinar usando diversos metodos, tales como los descritos en Thurmond RL et al., (2004) o Venable JD. et al., (2005).
El termino "molecula organica pequena" se refiere a una molecula de un tamano comparable a las moleculas organicas generalmente usadas en productos farmaceuticos. El termino excluye macromoleculas biologicas (por ejemplo, protemas, acidos nucleicos). Las moleculas organicas pequenas preferidas vanan en tamano hasta 5000 Da, mas preferiblemente hasta 2000 Da, y mas preferiblemente hasta 1000 Da.
Como se usa en este documento, el termino "sujeto" indica un mairnfero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferiblemente, un sujeto segun la invencion es un ser humano.
El termino "tratar" se refiere a prevenir (esto es, evitar que suceda), reducir o aliviar al menos un efecto o smtoma negativo de una enfermedad, trastorno o afeccion asociada con una deficiencia o ausencia de un organo, tejido o funcion celular. De acuerdo con lo anterior, el objetivo de la invencion es proporcionar un final del tinnitus, una disminucion del volumen del tinnitus o una mejora del estado del sujeto protegiendo o restaurando la funcionalidad o parte de la funcionalidad de la coclea.
Descripcion detallada
La presente invencion se refiere a antagonistas del receptor H4 para tratar o usar en el tratamiento del tinnitus.
El tinnitus que se va a tratar puede ser provocado por un trauma acustico, presbiacusia, fluctuacion en el suministro de sangre a la coclea que conduce a isquemia, tratamientos de anoxia con medicamentos ototoxicos, sordera subita u otra aparicion inductora de excitotoxicos cocleares.
Se cree que el tinnitus surge de la hiperactividad neuronal. Sin querer estar sujetos a una teona, los inventores sugieren que el control farmacologico eficiente y selectivo de la excitabilidad de las neuronas auditivas primarias es una solucion para atenuar el tinnitus. De hecho, como se encuentra que el receptor de la histamina tipo 4 (H4R) se expresa en la neurona ganglionar espiral, los antagonistas selectivos de H4R pueden modular eficazmente la actividad electrica de las neuronas primarias cocleares de mamfferos. El antagonista del receptor H4 como se define en las reivindicaciones 1-5 es un antagonista selectivo del receptor H4.
Segun una realizacion de la invencion, un antagonista selectivo del receptor H4 como se define en las
reivindicaciones 1-5 se refiere a una molecula que tiene una afinidad por el receptor H4 al menos 10 veces, preferiblemente 25 veces, preferiblemente 50 veces, mas preferiblemente 100 veces, y aun mas preferiblemente 500 veces mayor que su afinidad por cualquiera de los receptores H1, H2 o H3.
Segun otra realizacion de la invencion, un antagonista selectivo del receptor H4 como se define en las
reivindicaciones 1-5 es una molecula para la cual una de las proporciones Ki h3: Ki H4 y (ii) IC50 H3: IC50 H4 esta por encima de 10: 1, preferiblemente 25: 1, preferiblemente 50: 1, mas preferiblemente 100: 1 e incluso mas preferiblemente entre 500: 1 a 1000: 1.
La afinidad por el receptor H4 y otros receptores (HI, H2 y H3) se puede caracterizar por cualquier tecnica convencional conocida en la tecnica. Por ejemplo, se puede determinar mediante ensayos de union. Dichos ensayos usan pellas celulares de celulas tales como sK-N-MC o HEK293 T, celulas transfectadas con receptor H4, H3, H2 o H1 humano, de rata o de raton (Lovenberg et al., 1999, Liu et al., 2001a,b, Thurmond et al., 2004). Las celulas se pueden homogeneizar en Tris 50 mM, pH 7.5 que contiene EDTA 5 mM, y los sobrenadantes de un centrifugado de 800 g se recogen y se vuelven a centrifugar a 30 000 g durante 30 minutos. Las pellas se homogeneizaron luego en
Tris 50 mM, pH 7.5 que contema EDTA 5 mM. Para estudios de union competitiva H4, las celulas humanas, de raton
o de rata se incuban usando diferentes concentraciones de [3H] histamina (espedficas para cada especie, por
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ejemplo 10, 40 y 50 nM respectivamente), en presencia o ausencia de la molecula que se probara, durante 45 minutes a 25 °C. La union no espedfica se define usando histamina no marcada 100 |iM o usando 10-6 M de antagonista de receptor H4 espedfico o selectivo tal como JNJ-7777120 o JNJ-10191584. Se determino con este metodo que los valores de Kd para el receptor H4 humano, de raton y de rata eran 5, 42 y 178 nM, respectivamente, y se determino que los valores de Bmax eran 1.12, 1.7 y 0.68 pmol/mg de protema, respectivamente. De forma similar, el ligando usado para los ensayos de union al receptor H3 es, por ejemplo, [3H] N-a-metil histamina, y la union no espedfica se define usando histamina no marcada 100 |iM. Se determino con este metodo que el valor de Kd para el receptor H3 humano era de 1 nM y el valor de Bmax de 2.13 pmol/mg de protema. El ligando usado para la union del receptor H1 fue [3H] pirilamina y la actividad no espedfica se define usando difenhidramina 10 |iM no marcada. Se determino con este metodo que el valor de Kd para el receptor H1 humano era de 1 nM y el valor de Bmax de 2.68 pmol/mg de protema. En estos ensayos, las celulas se incuban por lo general con diferentes concentraciones, tales como 10'11 a 10'4 M de molecula que se va a analizar.
La persona experta en el arte que desee verificar o determinar la actividad antagonista de la molecula que se va a analizar puede usar cualquier metodo conocido en la tecnica y, por ejemplo, un ensayo de cAMP basado en celulas. Dicho ensayo usa lmeas celulares SK-n-MC transfectadas con el receptor H4, H3, H2 o H1 y una construccion de gen indicador tal como b-galactosidasa bajo el control de elementos dclicos que responden a AMP. Las celulas se ponen en placas durante la noche antes del ensayo. La histamina se usa como la molecula agonista. Para la determinacion de la actividad antagonista, las moleculas que se van a ensayar se anaden 10 minutos antes de la adicion del agonista. La forskolina (concentracion final 5 |iM) se anade 10 minutos despues de la adicion de histamina. Luego las celulas se mantienen a 37 °C, durante 6 horas y luego despues del lavado, se lisan con 25 |il de 0.1x solucion reguladora de ensayo (fosfato de sodio 10 mM, pH 8, MgSO4 0.2 mM y MnCh 0.01 mM) y se incuban a temperatura ambiente durante 10 min. Luego las celulas se incuban durante 10 minutos con 100 |il de 1x solucion reguladora de ensayo que contiene Triton X-100 al 0.5% (v/v) y mercaptoetanol 40 mM. El color puede desarrollarse usando 25 |il de solucion de sustrato de 1 mg/ml tal como clorofenol rojo b-D-galactopiranosido, y cuantificarse midiendo la absorbancia a 570 nm. Los datos obtenidos para cada curva de concentracion-respuesta se pueden ajustar a una curva sigmoidal para obtener la respuesta maxima, el coeficiente de Hill y EC50.
Los antagonistas de la histamina H4 y los antagonistas selectivos de la histamina H4 que se contemplan en la invencion se definen en las reivindicaciones 1-5. En una realizacion de la invencion, el antagonista de la histamina H4 o antagonista de H4 selectivo se selecciona entre los compuestos de 2-aminopirimidina tales como los descritos en el documento WO2008/100565; los derivados de 4-amino-pirimidina tales como los descritos en el documento WO2009/080721; los compuestos de pirimidina tales como los descritos en el documento WO2007/072163.
En otra realizacion, el antagonista de la histamina H4 o los antagonistas de la histamina H4 selectivos se seleccionan entre los descritos en la Solicitud de Patente Internacional WO2008/100565: (R)-4-(3-Amino-pirrolidin-1- il)-6-isopropilpirimidin-2-ilamina; y las sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.
En otra realizacion, el antagonista de la histamina H4 o los antagonistas de la histamina H4 selectivos se seleccionan entre los descritos en la Solicitud de Patente Internacional WO2009/080721: 2-isobutil-6-((3R)-3- (metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-ciclohexilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2- (4-fluorobencil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-lsobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4- amina; 2-ciclopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-tert-butil-6-(3-(metilamino)azetidin-1- il)pirimidin-4-amina; 2-isopropil-6-(3 - (metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-(ciclopropilmetil)-6-(3- (metilamino)azetidin- 1 -il)pirimidin-4-amina; 6-(3 -(metilamino)azetidin- 1 -il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina; 2- ciclopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-tert-butil-6-((3R)-3 -(metilamino)pirrolidin-1 - il)pirimidin-4-amina; 2-isopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; 6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-
1- il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina; 6-(3-aminoazetidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina; 2-isobutil-6-(3-metil-3- (metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 6-((3R)-3 -aminopirrolidin-1 -il)-2-isobutilpirimidin-4-amina; 2-ciclobutil-6- (3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-ciclobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2- ciclopentil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-ciclopentil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin- 4-amina; 2-(2,2-dimetilpropil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-(2,2-dimetilpropil)-6-((3R)-3- (metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-(2-ciclopentiletil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina;
2- ciclohexilmetil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina; 2-ciclopropilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-
il)pirimidin-4-amina; 2-ciclohexil-6-(3-(metilamino) azetidin-1 -il)pirimidin-4-amina; 2-ciclohexil-6-((3R)-3-
(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina; y 2-(4-fluorobencil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, o una sal de los mismos.
En otra realizacion, el antagonista de la histamina H4 o los antagonistas de la histamina H4 selectivos se seleccionan entre los descritos en la Solicitud de Patente Internacional WO2007/072163: N4-(ciclopropilmetil)-6- [(3R)-3-(metilamino) pirrolidin-1 -il]pirimidina-2,4-diamina y N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1- il]pirimidina-2,4-diamina tartrato. En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 es 1- [(5-cloro-1H-bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina (tambien denominado JNJ 10191584 o VUF 6002) descrito por Herman D. et al. (2005). Este antagonista selectivo se une con alta afinidad al receptor de la histamina H4
humano (Ki = 26 nM). Esta afinidad es 540 veces mas selectiva con respecto al receptor H3 (Ki = 14.1 |iM) (Zhang M. et al. 2007).
En una realizacion particular, el antagonista selectivo del receptor de la histamina H4 es 1-[(5-cloro-1H-indol-2- il)carbonil]-4-metilpiperazina (tambien denominado JNJ 7777120) descrito por Robin L. et al. (2004).
5 En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 es JNJ 39758979 y comprende la formula:
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En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 selectivo es 1-[(5-cloro-1H- bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina maleato (tambien denominado JNJ 10191584).
10 En una realizacion particular, el antagonista selectivo del receptor de la histamina H4 es 4-((3R)-3-aminopirrolidin-1- il)-6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-ilamina (tambien denominado A-943931) descrita por Cowart MD. Et al., (2008).
En una realizacion particular, el antagonista selectivo del receptor de la histamina H4 es cis-4-(piperazin-1-il)- 5,6,7a,8,9,10,11,11a-octahidrobenzofuro[2,3-h]quinazolin-2-amina (tambien denominado A-987306) descrita por Liu 15 H et al., (2008).
En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 es 7-(furan-2-il)-4-(piperazin-1- il)quinazolin-2-amina (tambien denominado VUF11489):
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En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 es PF-3893787:
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En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 es PF-3893787-18
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En una realizacion particular, el antagonista del receptor de la histamina H4 es 1-(7-(2-amino-6-(4-metilpiperazin-1- il)pirimidin-4-il)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-2-ciclopentiletanona (tambien denominada INCB38579).
Otro objeto de la invencion se refiere a un antagonista selectivo del receptor de la histamina H4 para uso en el tratamiento del tinnitus, en el que dicho antagonista del receptor de la histamina H4 se debe administrar a un sujeto que lo necesite.
El compuesto de la invencion se puede administrar antes, durante o despues de que se haya inducido el tinnitus.
Los antagonistas del receptor de la histamina H4 selectivos se pueden administrar en forma de una composicion farmaceutica, como se define a continuacion.
Preferiblemente, dichos antagonistas se administran en una cantidad terapeuticamente eficaz.
Por "cantidad terapeuticamente eficaz" se entiende una cantidad suficiente del antagonista selectivo del receptor de la histamina H4 para tratar el tinnitus a una proporcion beneficio/riesgo razonable aplicable a cualquier tratamiento medico.
Se entendera que el uso diario total de los compuestos y las composiciones de la presente invencion lo decidira el medico tratante dentro del alcance del buen criterio medico. El nivel de dosis terapeuticamente eficaz espedfico para cualquier paciente particular dependera de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se esta tratando y la gravedad del trastorno; actividad del compuesto espedfico empleado; la composicion espedfica empleada, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del paciente; el tiempo de administracion, la via de administracion y la tasa de excrecion del compuesto espedfico empleado; la duracion del tratamiento; farmacos usados en combinacion o coincidentes con el polipeptido espedfico empleado; y como factores bien conocidos en las artes medicas. Por ejemplo, esta dentro de la experiencia de la tecnica comenzar las dosis del compuesto a niveles inferiores a los requeridos para lograr el efecto terapeutico deseado y aumentar gradualmente la dosificacion hasta que se logre el efecto deseado. Sin embargo, la dosificacion diaria de los productos puede variar en un amplio intervalo desde 0.01 a 1,000 mg por adulto por dfa. Preferiblemente, las composiciones contienen 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100, 250 y 500 mg del ingrediente activo para el ajuste sintomatico de la dosificacion al paciente que se va a tratar. Un medicamento por lo general contiene desde 0.01 mg a 500 mg del ingrediente activo, preferiblemente desde 1 mg a 100 mg del ingrediente activo. Normalmente se suministra una cantidad eficaz del farmaco a un nivel de dosificacion de 0.0002 mg/kg a 20 mg/kg de peso corporal por dfa, especialmente de 0.001 mg/kg a 7 mg/kg de peso corporal por dfa.
Los antagonistas del receptor de la histamina H4 selectivos se pueden combinar con excipientes farmaceuticamente aceptables, y opcionalmente matrices de liberacion sostenida, tales como polfmeros biodegradables, para formar composiciones terapeuticas.
En las composiciones farmaceuticas de la presente invencion, el principio activo, solo o en combinacion con otro principio activo, se puede administrar en una forma de administracion unitaria, como una mezcla con soportes farmaceuticos convencionales, a animales y seres humanos. Las formas de administracion unitarias apropiadas comprenden formas de via oral tales como comprimidos, capsulas de gel, polvos, granulos y suspensiones o soluciones orales, formas de administracion sublingual y bucal, aerosoles, implantes, subcutaneos, transdermicos, topicos, intraperitoneales, intramusculares, intravenosos, subdermicos, transdermicos, formas de administracion intratecal e intranasal y formas de administracion rectal.
Preferiblemente, las composiciones farmaceuticas contienen vehfculos que son farmaceuticamente aceptables para una formulacion capaz de inyectarse. Estos pueden ser en particular soluciones isotonicas, esteriles, salinas (fosfato monosodico o disodico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio o mezclas de tales sales), o composiciones secas, especialmente liofilizadas que, dependiendo de cada caso, de agua esterilizada o solucion salina fisiologica, permiten la constitucion de soluciones inyectables.
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Las formas farmaceuticas apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas esteriles; formulaciones que incluyen aceite de sesamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso; y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. En todos los casos, la forma debe ser esteril y debe ser fluida en la medida en que exista facilidad de inyeccion. Debe ser estable en las condiciones de fabricacion y almacenamiento y debe preservarse contra la accion contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Las soluciones que comprenden los compuestos de la invencion como base libre o sales farmacologicamente aceptables se pueden preparar en agua adecuadamente mezclada con un surfactante, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones tambien se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles lfquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para prevenir el crecimiento de microorganismos.
Los antagonistas del receptor de la histamina H4 selectivos de la invencion se pueden formular en una composicion en forma neutra o de sal. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales de adicion de acido (formadas con los grupos amino libres de la protema) y que se forman con acidos inorganicos tales como, por ejemplo, acidos clorhndrico o fosforico, o acidos organicos tales como acetico, oxalico, tartarico o mandelico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres tambien se pueden derivar de bases inorganicas tales como, por ejemplo, hidroxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o ferricos, y bases organicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procama.
El portador tambien puede ser un solvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol lfquido), mezclas apropiadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de la dispersion y mediante el uso de surfactantes. La prevencion de la accion de microorganismos puede ser provocada por diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido sorbico y timerosal. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares o cloruro de sodio. La absorcion prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse mediante el uso en las composiciones de agentes que retrasan la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables esteriles se preparan incorporando los polipeptidos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con uno o varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion por filtracion. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehnculo esteril que contiene el medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de soluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son tecnicas de liofilizacion y secado al vacfo que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente deseado adicional de una solucion previamente esterilizada filtrada del mismo.
Despues de la formulacion, las soluciones se administraran de una manera compatible con la formulacion de dosificacion y en una cantidad tal que sea terapeuticamente eficaz. Las formulaciones se administran facilmente en una variedad de formas de dosificacion, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero tambien se pueden emplear capsulas de liberacion de farmaco.
Para la administracion parenteral en una solucion acuosa, por ejemplo, la solucion se debe estandarizar adecuadamente si es necesario y el diluyente lfquido primero se vuelve isotonico con suficiente solucion salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente apropiadas para la administracion intravenosa, intramuscular, subcutanea e intraperitoneal. En relacion con esto, los expertos en el arte conoceran medios acuosos esteriles que se pueden emplear a la luz de la presente divulgacion. Por ejemplo, una dosis se podna disolver en 1 ml de solucion isotonica de NaCl y anadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusion propuesto. Alguna variacion en la dosificacion necesariamente ocurrira dependiendo de la condicion del sujeto que se esta tratando. La persona responsable de la administracion determinara, en cualquier caso, la dosis apropiada para el sujeto individual.
Los antagonistas del receptor de la histamina H4 selectivos de la invencion se pueden formular dentro de una mezcla terapeutica para que comprenda de 0.0001 a 1.0 miligramos, o de 0.001 a 0.1 miligramos, o de 0.1 a 1.0 o incluso de 10 miligramos por dosis mas o menos. Tambien se pueden administrar dosis multiples.
Ademas de los compuestos de la invencion formulados para administracion parenteral, tales como inyeccion intravenosa o intramuscular, otras formas farmaceuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, comprimidos u otros solidos para administracion oral; formulaciones liposomales; capsulas de liberacion en el tiempo; y cualquier otra forma actualmente utilizada.
En un aspecto particular, los antagonistas del receptor de la histamina H4 selectivos se administran directamente en el ofdo interno. Esta ruta de administracion puede ser preferida para introducir un efecto directo y a largo plazo en el
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vestfbulo. Dicha administracion se puede realizar mediante diversas tecnicas de administracion, que incluyen el uso de dispositivos o portadores de farmacos para transportar y/o administrar los antagonistas del receptor H4 a las membranas de la ventana redonda u ovalada, donde se difunde en el ofdo interno o se infunde activamente. Los ejemplos incluyen otowicks, cateteres para ventana redonda, diversos tipos de geles, espumas, fibrinas u otros portadores de farmacos, que se colocan en el nicho de ventana redonda o en la ventana oval, y se cargan con el compuesto de la invencion para liberacion sostenida. Tambien incluye dispositivos que se insertan en el conducto coclear o en cualquier otra parte de la coclea. El compuesto de la invencion tambien se puede administrar al ofdo interno mediante inyeccion transtimpanica o intratimpanica.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 representa la localizacion de H4R en la coclea. El panel (A) muestra la expresion del ARNm de H4R en la coclea P9. El panel (B) muestra la localizacion de la protema H4R en las neuronas ganglionares en espiral (SGN) de las ratas P10 y P27.
La figura 2 representa la modulacion del antagonista H4R de la excitabilidad de las neuronas ganglionares en espiral in vitro. El panel (A) muestra un ejemplo de SGN cultivadas para 3 DIV. Por lo general, los cultivos conteman neuronas (10-20 |im de diametro) que eran monopolares, bipolares o pseudomonopolares. En la mayona de los cultivos, estas neuronas todavfa estaban cubiertas de mielina. En el panel (A2), las trazas distintivas de las neuronas transitorias y sostenidas resaltan el patron de disparo A.P (rapido y de adaptacion lenta) en estas neuronas. El panel (B1) muestra un ejemplo de potenciales de accion inducidos por etapas en una condicion de control (negro) y en presencia de JNJ10191584 100 |iM en una neurona transitoria (gris). El panel (B2) muestra un rasgo distintivo del primer potencial de accion en una neurona transitoria en una condicion de control (negro), en presencia de JNJ7777120 100 |iM (gris). Ni la frecuencia ni la amplitud de los picos se vieron afectados por los antagonistas de H4R como se resume en las graficas de barras (panel C2). El panel (C1) muestra un ejemplo de potenciales de accion inducidos por etapas en el control y en presencia de JNJ10191584 100 nM de en una neurona sostenida. El panel (C2) resume el porcentaje de inhibicion obtenido en neuronas sostenidas tratadas con los antagonistas de H4R a 100 nM o 100 |iM. El panel (C3) muestra un ejemplo de potenciales de accion inducidos por etapas en el control y en presencia de JNJ7777120 100 |iM en una neurona sostenida.
La figura 3 representa la modulacion del antagonista de H4R de la activacion de A.P. espontanea inducida por accion sinaptica en una preparacion coclear semiintacta. El panel (A) muestra un ejemplo de una preparacion de coclea semiintacta cultivada a nivel de los SGN. Las estrellas destacan la presencia de mielina alrededor de los cuerpos celulares y las flechas negras muestran fibras SGN intactas que se dirigen hacia las celulas ciliadas sensoriales del organo de Corti. El panel (B) muestra un registro distintivo de un SGN con potenciales de accion espontaneos (inducido por accion sinaptica) en condiciones de control y en presencia de JNJ10191584 (100 |iM).
Ejemplos
Ejemplo 1: expresion de ARNm de H4R en coclea de rata postnatal (P) 9-11.
Expresion de ARNm H4R-RT-PCR
Se diseccionaron cocleas de ratas Wistar postnatales (P) 9-12 del hueso temporal y se congelaron instantaneamente en nitrogeno lfquido inmediatamente despues de la diseccion de ratas adultas. En un unico experimento, se usaron al menos 4-6 cocleas y 1 bazo (se uso un control tisular (positivo) para analizar la expresion de ARNm de H4R) para extraer el ARN total usando un protocolo estandar con TRIzol (RiboPure, Ambion) y cloroformo. La smtesis de ADNc de la primera cadena (transcripcion inversa, RT) se realizo con 0.5-1 |ig de ARN total tratado con ADNasa y cebadores Oligo (dT) (Kit de transcripcion inversa Quantitect, Qiagen). La reaccion se realizo a 42 °C, durante 30 min. seguido por 95 °C por 3 min. La PCR se realizo con 1-2 |il de reacciones de RT. La amplificacion fue de 30 ciclos para bazo y ganglios cocleares con 30 s a 95 °C, 30 segundos a la temperatura de hibridacion espedfica del cebador (58-60 °C) y 1 minuto a 72 °C. Se realizo una extension final a 72 °C, durante 7 min. Para H4R, la RT se realizo preferentemente usando cebador espedfico de secuencia y los productos de PCR (1 |il) se resolvieron en geles de agarosa al 2% que conteman bromuro de etidio (10%). Los resultados se obtuvieron en 3 experimentos diferentes (independientes) y los productos de PCR se secuenciaron sistematicamente para certificar la naturaleza del producto amplificado a partir de la secuencia de H4R. Para evitar contaminaciones genomicas de ADNc, se realizo una transcripcion inversa sin la enzima transcriptasa inversa. Ademas, los conjuntos de cebadores se disenaron a traves de lfmites intron-exon determinados a partir de secuencia de rata H4R (SEQ ID NO: 1) y secuencia de rata GAPDH (SEQ ID NO: 6) usando el software NcBI/Primer-Blast libre (Figura 1) y PCR anidada se realizaron usando los primeros productos de PCR. Los cebadores GAPDH (SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8) se usaron como control positivo y para H4R; los cebadores (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 5) se analizaron sistematicamente para determinar la calidad en el tejido del bazo.
Tanto para las muestras de coclea como de control de tejido (bazo), el tamano de las bandas observadas en geles correspondio a los tamanos predichos de los productos amplificados: 477 pb para H4R y 502 pb para GAPDH (no
mostrado) usados como control positivo para la reaccion de PCR (Figura 1A). Como era de esperar, no se observaron bandas en nuestros controles negativos (RT-) que confirmaran la pureza de nuestras muestras de ARN. Ya que la expresion de H4R era baja con un unico experimento de PCR, una segunda amplificacion del primer producto de PCR usando cebadores anidados (referenciados como H4R-F2 y H4R-R2 en la figura 1) fue 5 sistematicamente necesaria para aumentar las posibilidades de revelar la expresion de H4R. En este caso, la expresion de ARNm de H4R ha sido probada y encontrada en 3 experimentos independientes. La secuenciacion directa realizada en todos los productos de PCR confirmo la naturaleza del producto amplificado como ARNm de H4R.
Localizacion H4R-Inmunofluorescencia
10 Para confirmar adicionalmente la presencia de H4R en neuronas ganglionares en espiral a todas las edades, verificamos la localizacion del receptor a nivel de protema usando un anticuerpo (policlonal) anti-H4R. Estas pruebas se han llevado a cabo usando coclea "madura" postnatal (P) 10, (P) 27 y coclea de rata adulta (esto es, en este documento la coclea madura es en el sentido del inicio de la coclea auditiva. Ratas Wistar postnatales (P) 10-27 y adultas (12 semanas) se anestesiaron profundamente con pentobarbital (0.4%), luego se perfundieron 15 transcardialmente con heparina PBS (0.01 M) seguido de una solucion de fijacion (4% de paraformaldel'ndo, 1% de acido pfcrico, con 5% de sacarosa). Los huesos temporales se fijaron despues en la misma solucion antes de disecar la coclea en PBS. Los endorgios vestibulares se incrustaron en agarosa al 4% y se cortaron secciones de 40 |im de grosor con un vibrato (HM650V, Microm). Las secciones de flotacion libre se permeabilizaron primero con Triton X-100 al 4%, se evito la union no espedfica mediante una etapa de preincubacion en una solucion de bloqueo 20 de gelatina de pescado al 0.5%, Triton X-100 al 0.5% y BSA al 1%. Luego las muestras se incubaron con anticuerpos primarios: anti-H4R policlonal de rata (0.5 pg/ml; regalo del Laboratorio P. Chazot) diluido en la solucion de bloqueo. Para los experimentos de control, se omitio el anticuerpo primario investigado, mientras que los siguientes procedimientos no se modificaron. La marcacion espedfica se revelo con Alexa anticuerpos secundarios 594-fluorescentes (1: 700) en la solucion de bloqueo combinada con tincion de neurofilamentos con faloidina 25 conjugada con Alexa 488 (Fisher Scientific). Las muestras se observaron con un microscopio confocal de barrido laser (LSM 5 LIVE DUO, Zeiss). El procesamiento final de la imagen se realizo con el software Adobe Photoshop (San Jose, CA). Las reacciones de control se observaron y procesaron con los parametros usados para las secciones tenidas. Todos los experimentos de inmunofluorescencia se han realizado al menos 3 veces (3 experimentos independientes).
30 H4R se ha localizado en SGN (marcado doblemente con antineurofilamento) en todos los giros de la coclea (apical, medio y basal) con un gradiente creciente de expresion durante el desarrollo: las neuronas cocleares de rata P10 expresaron H4R en baja densidad (correlacionando con nuestros datos de RT-PCR a esta edad) (Figura 1B), mientras que la coclea P27 mostro una mayor expresion de H4R en estas neuronas (Figura 1C). H4R se expresaron tambien en SGN de coclea adulta (datos no mostrados). Curiosamente, la comarcacion con el anticuerpo 35 antineurofilamento revelo que H4R se localizo en la gran mayona de los SGN, aunque una pequena poblacion no expresaba el receptor. A nivel celular, se encontro que H4R se localizaba preferentemente en las regiones membranosa y submembranosa.
Ejemplo 2: los antagonistas de H4R son moduladores de la excitabilidad del ganglio espiral.
Cultivo de celulas
40 La cabeza de ratas Wistar de 5-8 dfas (CERJ, Le Genest, Berthevin, Francia) se hemisecciono de forma aseptica y la coclea se diseco del hueso temporal. En medio L15 (Leibovitz) medio (Gibco), el hueso coclear se elimino suavemente con unos forceps finos para aislar el tejido neurosensorial. El ganglio espiral se separo del organo de Corti justo antes de la habenula perforata y (colagenasa 0.75 mg.mL'1, dispasa 1 mg.mL'1 y ADNasa 0.75 mg.mL'1) se disocio enzimaticamente durante 15 min a 25 °C. Despues de lavar a fondo con una solucion de Tyrode (Sigma), 45 se utilizo una pipeta de transferencia para disociar suavemente las neuronas ganglionares en medio de cultivo (medio DMEM/F-12 1: 1, 2% de nutriente N2, Glc 28 mM, Gln 1.5 mM, HEPES 15 mM, AraC 2 |iM, 10 ng mL1 de BDNF y 1% de penicilina/estreptomicina). Las neuronas ganglionares en espiral se sembraron en placas de cultivo recubiertas previamente con 10 mg.pL'1 de laminina (Sigma). Estos cultivos de baja densidad se mantuvieron a 37 °C en 5% de CO2 durante 3 a 5 dfas antes de los experimentos de patch-clamp de celulas enteras.
50 Preparacion de coclea semiintacta
Para esta preparacion, se usaron ratas Wistar de 10-14 dfas posnatales (P). Las primeras etapas del protocolo fueron similares al cultivo celular hasta que la coclea fue liberada del hueso coclear. Los giros cocleares (apical y medio) se disecaron y aislaron en medio L-15 esteril filtrado (Leibovitz). Los explantes se sembraron boca abajo (neuronas ganglionares en espiral en la parte superior) en cubreobjetos de vidrio recubiertos con laminina (10 |ig/ml) 55 y Matrigel (BD biosciences) reducido en 10 |il de factor de crecimiento. Estas preparaciones se incubaron primero durante 30 min a 37 °C en una atmosfera de 95%/5% de O2/CO2 y luego se cultivaron durante 2 a 5 dfas in vitro en
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(50%) F12/(50%) DMEM (Invitrogen) suplementado con (2%) de nutrientes N2 (Fisher Scientific). El medio se renovo una vez, 3 dfas despues de colocar los explantes.
Electrofisiolog^a In vitro.
La eficacia del antagonista de H4R se ha probado usando dos tecnicas patch-clamp: registros de fijacion de corriente de celulas enteras con neuronas de ganglios en espiral disociadas (SGN) y registros de parches sueltos para SGN en preparaciones de cocleas semiintactas. Para estos experimentos, se utilizaron ratas Wistar postnatales (P) de 10-14 dfas en DIV2-5.
Todos los experimentos se realizaron usando un amplificador Axopatch 200B. Las huellas se filtraron a paso bajo a 10-20 kHz y se digitalizaron a 100 kHz con una placa Digidata 1440A. Los datos se almacenaron con el software PClamp10.2 (Axon Instruments; Molecular Devices Corp., USA) y se analizaron fuera de lmea usando los softwares Clampfit 10.2 (Molecular Devices) y Origin 8 (Origin-Lab).
La solucion de registro contema (en mM): NaCl 135, HEPES 10, glucosa 10, MgCh 1, KCl 5 y CaCl2 2.5, (pH 7.35). Para registros de patch-clamp de celulas enteras, las pipetas de vidrio de registro (4-6 MQ) se recubrieron con cera para reducir la capacitancia de la pipeta y se llenaron con (en mM): KCl 135, HEPES 10, glucosa 10, NaCl 5, EGTA 5, Mg-ATP3, GTPNa1, pH 7.35. Para estas soluciones, se pudo medir un potencial de union de lfquido de 3-7 mV, pero los voltajes de la membrana no se corrigieron. La osmolaridad de todas las soluciones se ajusto a 300 mOsm/L. Las soluciones de control y prueba se aplicaron usando un sistema de perfusion capilar multiple (velocidad de flujo ~ 500 |il/min). Despues de cada aplicacion del farmaco probado, las celulas se lavaron con solucion reguladora de control.
Los registros se realizaron a temperatura ambiente (TA, 22-25 °C). En las neuronas disociadas, se aplicaba una corriente cuadrada de 150-200 pA DC (1 s de duracion) cada 6 s con el fin de obtener trenes de potenciales de accion. Las pruebas farmacologicas se realizaron solo cuando los registros presentaron los siguientes criterios: resistencia en serie (<10 MQ en promedio) no mas de 3 veces la resistencia de la pipeta, potencial estable de membrana en reposo (R.M.P) negativo a -40 mV, potenciales de accion rebasantes (magnitud > 60 mV para el primer potencial de accion), disparo estable durante hasta un minuto en condiciones de control.
Los electrodos para los registros SGN de parche suelto teman una resistencia de punta de 1.0-1.5 MQ y se llenaban con la solucion de registro. En estas preparaciones de cocleas semiintactas, las descargas espontaneas de potencial de accion se registraron directamente. Para cada prueba, el compuesto se aplico durante al menos 2 minutos. Para verificar la reversibilidad de la respuesta, las neuronas se lavaron con medio de control despues de cada prueba de los farmacos. Los resultados in vitro se expresaron como lo media ± S.E.M.
Para evaluar la eficacia de los antagonistas de H4R (JNJ7777120 y JNJ10191584) para modular la hiperexcitabilidad de los SGN, medimos el porcentaje de inhibicion del disparo del potencial de accion (A.P) de los dos compuestos. Se han probado dos concentraciones: 100 |iM y 100 nM.
Por lo general, en los SGN disociados, (Figura 2A1), pequenos pasos de corriente despolarizante (0,1 nA-0,4 nA) provocaron dos tipos de descarga del potencial de accion: transitorios (no mas de 1-2 picos-neuronas que se adaptan rapidamente) y disparos sostenidos (numero de picos que aumentan linealmente por encima del umbral: neuronas que se adaptan lentamente) (Figura 2A2). Los picos transitorios SGN representaron la mayona de las neuronas en nuestros cultivos celulares (80% contra 20% de neuronas pico sostenidas). El porcentaje de ambos tipos de neuronas y sus propiedades de membrana (capacitancia, resistencia de entrada, R.M.P., umbral de pico) son comparables con estudios previos (vease el resumen en la tabla-figura 2). Las pruebas de la accion inhibidora de JNJ10191584 y JNJ777120 se realizaron tanto en SGN sostenidas como transitorias (Figura 2B, 2C).
Para picos transitorios SGN, ni JNJ10191584 ni JNJ7777120 tuvieron un efecto sobre el unico pico en todas las concentraciones ensayadas. La frecuencia de los picos (1-3 picos) y la amplitud del primer pico no fueron afectados por los dos antagonistas espedficos (85.6 ± 4.1mV (n = 4) contra 83.7 ± 5.2 mV respectivamente para el control y JNJ10191584 100 |iM y 77±5.6mV (n = 7) contra 73.3± 6.1 mV respectivamente para el control y JNJ7777120 100 |iM (Figura 2B1-B2).
Por el contrario, JNJ7777120 y JNJ10191584 redujeron el numero medio de potenciales de accion provocados por etapas de una manera dependiente de la dosis (Figura 2C). En la concentracion de 100 nM, la frecuencia de disparos de A.P. se inhibio ligeramente en 25.2 ± 2.0% (n = 3) y 21.6 ± 1.7% (n = 2) respectivamente para JNJ10191584 y JNJ7777120 (Figura 2C1-C2). El potencial de membrana en reposo de los SGN no se vio afectado por los antagonistas de H4R (en promedio -0.13 ± 0.4 mV de diferencia con JNJ10191584 y 0.55 ± 0.2 mV (n = 2) en promedio en presencia de JNJ7777120 contra control). Del mismo modo, el umbral del potencial de accion no vario significativamente en presencia de antagonistas de H4R (datos no mostrados). A una concentracion de 100 |iM, tanto JNJ10191584 como JNJ7777120 tuvieron un efecto inhibidor mayor en la frecuencia de AP JNJ10191584 y JNJ7777120 (100 |iM) inhibieron la frecuencia en respectivamente 46.2 ± 12% (n = 3) y en 69.05 ± 8% (n = 3)
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(Figura 2C2-C3). Despues de un penodo de lavado, la frecuencia del potencial de accion aumento hasta un 70% de la frecuencia medida en las condiciones de control. Ademas, en presencia de una alta concentracion del antagonista de H4R JNJ10191584, el potencial de membrana en reposo no se vio afectado (aumento de 1.5 ± 1 mV frente al control). No obstante, aunque el numero de A.P disminuyo en presencia de cualquiera de los antagonistas de H4R, el primer pico no se vio afectado; esto es coherente con una accion moduladora de los compuestos sobre la excitabilidad de SGN en lugar de un efecto de bloqueo puro.
Usando las preparaciones cocleares semiintactas (ex vivo), probamos la eficacia de JNJ10191584 para disminuir la descarga del potencial de accion espontaneo (impulsado sinapticamente) registrado desde los SGN con una configuracion de parche suelto. En nuestras condiciones, pocas SGN han mostrado actividad espontanea (9 de 41 SGN registradas). Los registros de la membrana citoplasmica de los SGN en presencia de una capa de mielina grande envolviendo no solo sus neuritas sino tambien los cuerpos de las celulas (Figura 3A) limitaron el numero de registros exitosos. La frecuencia de A.P espontanea vario de 0.1 a un maximo de 3 Hz (en promedio 1.08 ± 0.3 Hz, n = 9). En dos experimentos, la descarga del potencial de accion espontanea de baja frecuencia se anulo por completo dentro de los dos minutos posteriores al comienzo de una aplicacion de bano de 100 |iM de JNJ10191584 (Figura 3B).
Para comprobar si los antagonistas de H4R son capaces de modular la excitabilidad de SGN en un estado "patologico" (similar a los SGN hiperexcitables en modelos de tinnitus), se esta probando la eficacia de estos compuestos en SGN con una mayor descarga de A.P. Tal hiperexcitabilidad de los SGN se puede inducir, por ejemplo, mediante salicilato de sodio 3-5 mM, que se sabe que potencia fuertemente el A.P inducido sinapticamente en roedores. El resultado positivo de este experimento refuerza la eficacia moduladora de los antagonistas de H4R en picos sostenidos SGN o cualquier tipo de SGN que tendnan una mayor actividad de descarga de A.P.
Ejemplo 3: Eficacia de los antagonistas de H4R para disminuir el modelo de comportamiento del tinnitus
El objetivo de estas pruebas in vivo es medir la eficacia de los antagonistas de H4R para disminuir los smtomas de tinnitus (transitorios y permanentes) inducidos por salicilato de sodio o por la exposicion al ruido de alto nivel. La evaluacion de la eficacia se lleva a cabo en ratas adultas usando la prueba de tinnitus desarrollada por Turner et al., 2006: the Gap-Prepulse Inhibition of Acoustic Startle (GPIAS) behavioral model. Este modelo usa un hueco en un fondo acustico constante como un preestimulo que reduce la amplitud del reflejo acustico de sobresalto. Las ratas que perciben el tinnitus en una frecuencia espedfica han disminuido la deteccion del hueco incrustado en bandas similares a la frecuencia del tinnitus. La reduccion de la eficiencia de la puerta del hueco produce un sobresalto acustico mas grande (GPIAS reducido).
El nivel de GPIAS se mide en condiciones iniciales en una cohorte de 6 a 8 ratas adultas.
El tinnitus es inducido por una administracion i.p. del salicilato sodico (250 mg/kg) y GPIAS se mide en T1h despues de la induccion para medir la reduccion en GPIAS (que confirma la presencia de tinnitus). Las ratas se tratan con antagonistas H4R (administracion i.p. individual) o con el veldculo el mismo dfa y se mide GPIAS en diferentes momentos segun el perfil PK de los compuestos.
Alternativamente, el tinnitus es inducido por una exposicion unilateral a un ruido de banda estrecha de 12 kHz presentado a 120-126 dB SPL (la oreja contralateral esta protegida con un tapon auditivo) durante 2 h. Se utilizan dos tipos de ruido para esta forma de induccion del tinnitus: ruido de 120 dB para inducir un tinnitus transitorio (que dura hasta 2 dfas) y 126 dB para inducir un tinnitus permanente (que dura >10 dfas). Para estos experimentos de "exposicion al ruido", todas las ratas se anestesiaron con gas isoflurano y se colocaron en una almohadilla termica de control de temperatura. Se usa una exposicion de 120-126 dB para inducir tinnitus y se mide GPIAS 24 h despues de la exposicion para evaluar la reduccion en GPIAS (que confirma la presencia de tinnitus transitorio inducido por ruido); y hasta 10 dfas para confirmar la presencia de un tinnitus permanente (inducido por el ruido). Los animales con tinnitus transitorio se tratan con antagonistas de H4R (administracion i.p. individual) T24h despues de la induccion de tinnitus y los cambios en GPIAS se miden en diferentes puntos de tiempo segun el perfil de PK de los antagonistas de H4R. De forma similar, los animales con tinnitus permanente (>10 dfas) se tratan con antagonistas de H4R (administracion individual i.p.) el dfa 11 despues de la induccion del tinnitus y se miden los cambios en GPIAS en diferentes momentos.
El aumento en los valores de GPIAS en ratas tratadas con antagonistas de H4R (JNJ7777120 y JNJ10191584) en comparacion con la condicion de pretratamiento (salicilato solo) o el tratamiento simulado (vetuculo solo) mostrara una mejora del tinnitus en estos modelos.
Material
Farmacos/productos qmmicos: La 1-[(5-Chloro-1H-bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metil piperazina (JNJ 10191584) y la 1-[(5-cloro-1H-indol-2-il)carbonil]-4-metil piperazina maleato (JNJ 7777120) se adquirieron de Axon Medchem BV (Groningen, The Netherlands). Las soluciones madre se prepararon a 60 mM en dimetilsulfoxido al 100% segun lo

Claims (6)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un inhibidor del receptor de la histamina tipo 4 (H4R) para uso en el tratamiento del tinnitus, en el que dicho inhibidor de H4R se selecciona entre:
    - 1-[(5-cloro-1H-indol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina,
    - 4-((3R)-3-aminopirrolidin-1-il)-6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-ilamina,
    - cis-4-(piperazin-1-il)-5,6,7a,8,9,10,11,11a-octahidrobenzofuro[2,3-h] quinazolin-2-amina,
    - 7-(furan-2-il)-4-(piperazin-1-il)quinazolin-2-amina,
    - 1-(7-(2-amino-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidin-4-il)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-2-ciclopentiletanona,
    - 1-[(5-cloro-1H-bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina maleato,
    - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina,
    - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina tartrato,
    - (R)-4-(3-amino-pirrolidin-1-il)-6-isopropil-pirimidin-2-ilamina,
    - 2-isobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-isobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(4-fluorobencil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-tert-butil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-isopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(ciclopropilmetil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-tert-butil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-isopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina,
    - 6-(3-aminoazetidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina,
    - 2-isobutil-6-(3-metil-3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 6-((3R)-3-aminopirrolidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina,
    - 2-ciclobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopentil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopentil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(2,2-dimetilpropil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(2,2-dimetilpropil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
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    - 2-(2-ciclopentiletil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexilmetil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopropilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, y
    - 2-(4-fluorobencil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina.
  2. 2. El inhibidor para su uso segun la reivindicacion 1, en el que dicho inhibidor es:
    - 1-[(5-cloro-1H-indol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina,
    - 4-((3R)-3-aminopirrolidin-1-il)-6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-ilamina,
    - cis-4-(piperazin-1-il)-5,6,7a,8,9,10,11,11a-octahidrobenzofuro[2,3-h] quinazolin-2-amina,
    - 7-(furan-2-il)-4-(piperazin-1-il)quinazolin-2-amina,
    - 1-(7-(2-amino-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidin-4-il)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-2-ciclopentiletanona,
    - 1-[(5-cloro-1H-bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina maleato,
    - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina,
    - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina tartrato,
    - (R)-4-(3-amino-pirrolidin-1-il)-6-isopropil-pirimidin-2-ilamina, o
    - 2-isobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina.
  3. 3. El inhibidor para uso segun la reivindicacionl, en el que dicho inhibidor es:
    - 2-isobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-isobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(4-fluorobencil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-tert-butil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-isopropil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(ciclopropilmetil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-tert-butil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-isopropil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)-2-(fenoximetil)pirimidin-4-amina,
    - 6-(3-aminoazetidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina,
    - 2-isobutil-6-(3-metil-3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    5
    10
    15
    20
    25
    - 6-((3R)-3-aminopirrolidin-1-il)-2-isobutilpirimidin-4-amina,
    - 2-ciclobutil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclobutil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopentil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopentil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(2,2-dimetilpropil)-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(2,2-dimetilpropil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-(2-ciclopentiletil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexilmetil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclopropilmetil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexil-6-(3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina,
    - 2-ciclohexil-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina, o
    - 2-(4-fluorobencil)-6-((3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il)pirimidin-4-amina.
  4. 4. El inhibidor para uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho inhibidor es 2-isobutil-6- (3-(metilamino)azetidin-1-il)pirimidin-4-amina.
  5. 5. El inhibidor para uso segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicho inhibidor se selecciona entre:
    - 1-[(5-cloro-1H-indol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina,
    - 4-((3R)-3-aminopirrolidin-1-il)-6,7-dihidro-5H-benzo[6,7]ciclohepta[1,2-d]pirimidin-2-ilamina,
    - cis-4-(piperazin-1-il)-5,6,7a,8,9,10,11,11a-octahidrobenzofuro[2,3-h] quinazolin-2-amina,
    - 7-(furan-2-il)-4-(piperazin-1-il)quinazolin-2-amina,
    - 1-(7-(2-amino-6-(4-metilpiperazin-1-il)pirimidin-4-il)-3,4-dihidroisoquinolin-2(1H)-il)-2-ciclopentiletanona,
    - 1-[(5-cloro-1H-bencimidazol-2-il)carbonil]-4-metilpiperazina maleato,
    - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina,
    - N4-(ciclopropilmetil)-6-[(3R)-3-(metilamino)pirrolidin-1-il]pirimidina-2,4-diamina tartrato, y
    - (R)-4-(3-amino-pirrolidin-1-il)-6-isopropil-pirimidin-2-ilamina.
  6. 6. Una composicion farmaceutica que comprende un inhibidor de H4R segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en el tratamiento de tinnitus.
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