ES2683392T3 - Péptidos catiónicos cíclicos con actividad antimicrobiana - Google Patents

Abstract

Péptido que consiste en una secuencia A-B-C-D-C'-B'-A', en donde: la unidad A consiste en 2 aminoácidos, y la unidad A' consiste en 1 aminoácido, ambas unidades B y B' son Cys, cada unidad C consiste independientemente en aminoácidos, seleccionados tanto del grupo (a) de aminoácidos hidrofóbicos, como del grupo (b) de aminoácidos básicos o aminoácidos formadores de enlaces de hidrógeno; la unidad D es -Arg-Gly-, en donde: (i) dichos aminoácidos hidrofóbicos se seleccionan de: Ala, Phe, Ileu, Leu, Pro, Tyr, Trp y Val; (ii) dichos aminoácidos básicos se seleccionan de: Lys, His, Arg; (iii) dichos aminoácidos formadores de enlaces de hidrógeno se seleccionan de Asn, Gln, Ser, Thr; y en donde la subestructura C-D-C' como un todo contiene de 5 a 9 puntos de alternancia entre aminoácido del grupo (a) y aminoácido del grupo (b), o viceversa, en donde el péptido está en la forma cíclica pormedio de la formación de un puente disulfuro entre las dos unidades B, y en donde los aminoácidos hidrofóbicos son entre 30 y 50 % de la cantidad total de aminoácidos del péptido, dicho péptido es para el uso en el tratamiento de infecciones del cuerpo humano o animal causadas por bacterias, hongos y/o levaduras.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos cationicos dclicos con actividad antimicrobiana Campo de la invencion

La presente invencion proporciona una serie de peptidos cationicos dclicos, o que pueden volverse dclicos, con actividad antimicrobiana, caracterizados por citotoxicidad baja o no detectable contra celulas de organismos superiores, que son citostaticos o citotoxicos contra al menos una bacteria Gram negativa y/o Gram positiva y/o un hongo (que comprende levaduras) derivados de cepas de referencia o aislados clmicos.

Estado de la tecnica

El tratamiento de infecciones bacterianas con antibioticos representa uno de los pilares de la medicina humana. El desarrollo y empleo de antibioticos, a partir de la segunda mitad del siglo XX, ha revolucionado el enfoque al tratamiento y prevencion de enfermedades infecciosas e infecciones que se consideraban incurables en el pasado.

La necesidad de compuestos antimicrobianos nuevos y cada vez mas eficientes ha inducido a las compares farmaceuticas a concentrar sus esfuerzos hacia el desarrollo de nuevas moleculas, con el resultado de poner a disposicion, a partir del inicio de los anos sesenta del pasado siglo, mas de 200 compuestos antimicrobianos diferentes (Overbye y Barrett, Drug Discovery Today, 10: 45-52, 2005).

Sin embargo, a pesar de haberse invertido recursos y energfa para aumentar el conocimiento de los mecanismos de resistencia, y en la investigacion de moleculas cada vez mas eficientes, en este momento, el desarrollo de resistencia a los antibioticos es mas rapido que el descubrimiento de nuevas clases de moleculas.

La incapacidad de las industrias farmaceuticas de identificar nuevos compuestos antimicrobianos se hace evidente a partir de la reduccion drastica de la cantidad de moleculas nuevas comercializadas. De hecho, si bien de 1983 a 2001 la FDA (Administracion de Alimentos y Farmacos) aprobo 47 compuestos nuevos para el uso clmico, en el penodo de 1998-2005 solamente 9 compuestos recibieron licencia para su uso clmico (Overbye y Barrett, ver la referencia anterior).

La resistencia a antibioticos, definida como el surgimiento (y la propagacion) de factores de resistencia bacteriana a antibioticos, se activa por la presion selectiva ejercida sobre poblaciones microbianas por un uso excesivo y/o inadecuado de estos farmacos. Las infecciones por bacterias resistentes causan costos de salud estimados entre 10 y 15 mil millones de dolares al ano solamente en los Estados Unidos, con aumento de la morbilidad, la mortalidad y los costos asociados con la enfermedad (Prevention effectiveness: A guide to decision analysis and economic evaluation. 2da Edicion. Editores: Haddix AC, Teutsch SM, Corso PS., Nueva York: Oxford University Press 2003:345-57). Un artmulo, publicado recientemente en Clinical Infectious Diseases, destaca un costo de salud por paciente afectado por infecciones resistentes a antibioticos (ARI) evaluable entre 18 000 y 29 000 dolares asociado con un aumento promedio de la hospitalizacion entre 6 y 12 dfas. Ademas, las tasas de mortalidad para estos pacientes son aproximadamente 2-2,5 veces mayores en comparacion con pacientes no ARI (R.R. Roberts y otros, 2009 Clin Infect Dis; 49:1175-84).

En la actualidad este problema se ha convertido en una autentica prioridad de la salud publica a escala mundial, tambien debido a la aparicion de patogenos que son resistentes simultaneamente a varios antibioticos (resistencia a multiples farmacos, o resistencia heterogenea), lo que reduce de facto la posibilidad de un tratamiento eficiente (WHO Global Strategy for Containment of Antimicrobial Resistance. Ginebra, Organizacion Mundial de la Salud, 2001, WHO/CDS/CSR/DRS/2001.2). Cabe senalar que la resistencia heterogenea a antibioticos frecuentemente involucra a estructuras de salud. Estos microorganismos multirresistentes que se derivan de infecciones adquiridas en el hospital pueden transmitirse en una comunidad de varias maneras entre las que se encuentran: sistemas de ventilacion y aireacion, flujo de agua, tratamiento de tejidos y muestras de laboratorio, higiene inadecuada del personal y el ambiente, procedimientos quirurgicos y dispositivos invasivos (Eggimann, Clin Microbiol Infect 2001;7:91; Pittet, The Lancet 2000;356:1307; Hugonnet, Clin Microbiol Infect 2000;6:350; Pittet, Swiss-NOSO 2001;8:25).

Entre los principales problemas, debe mencionarse la resistencia a meticilina en S. aureus ("Celbenin"-resistant staphylococci. Br Med J, i:124-25, 1961), cuya prevalencia en Italia ha alcanzado una incidencia constante de alrededor de 40 %, y esta entre las mas altas en Europa (Antimicrobial resistance surveillance in Europe 2009. Annual Report of the European Antimicrobial resistance Surveillance Network (EARS-Net). Estocolmo, Centro Europeo de Prevencion y Control de Enfermedades (ECDC), 2010). La resistencia a la penicilina en S. pneumoniae alcanza una frecuencia superior al 20 % en algunos pafses de Europa y en los Estados Unidos, e incluso supera el 50 % en el Lejano Oriente. Recientemente, se ha observado una alta resistencia a macrolidos en este microorganismo, con valores que alcanzan el 30 %, con una tendencia creciente. En el genero Enterococcus la frecuencia de resistencia a vancomicina ha aumentado progresivamente en todo el mundo, principalmente en los ultimos anos (alrededor de 20 % en los Estados Unidos) (en Centers for Disease Control and Prevention. 2002. Morb Mortal Weekly Rep, Julio 5, 51(26):565-567). En Italia, en un estudio llevado a cabo en 2007, se encontro una frecuencia de resistencia a vancomicina de aproximadamente 2,5 % en E. faecalis y de aproximadamente 20 % en el menos frecuente E. faecium (European Antimicrobial Resistance Surveillance System, EARSS, 2007).

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En microorganismos Gram negativos, se observa una distribucion de resistencias muy heterogenea, con una tendencia creciente, relacionada principalmente con la resistencia a fluoroquinolonas, aminopenicilinas y aminoglucosidos en E. coli y K. pneumoniae/oxytoca, y resistencia a carbapenem en P. aeruginosa ("Antibiotic-resistance surveillance and use of systemic antibiotics in Emilia-Romagna" Dossier 173/2009, Agenzia sanitaria e sociale regionale dell'Emilia-Romagna). Recientemente, el aumento de la incidencia de bacterias Gram negativas de amplio espectro productoras de beta lactamasa ha despertado un notable interes por las consecuencias epidemiologicas/microbiologicas y por la importancia en la terapia (del Centro Europeo de Prevencion y Control de Enfermedades (ECDC) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMEA). ECDC/EMEA Joint Technical Report - The bacterial challenge: time to react. Estocolmo, 2009).

Ademas, en el campo de la veterinaria hay aspectos que suscitan una cierta preocupacion (Carattoli A y otros 2005; Busani C. y otros 2004). En un informe publicado por EFSA en 2007 (de "Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in the European Union in 2008", publicado el 26 de abril de 2010) se establece que algunas entre las bacterias zoonoticas mas comunes provenientes de animales y alimentos en la EU, han desarrollado resistencia antimicrobiana. En particular, entre las bacterias probadas, se observo con frecuencia resistencia a ampicilina, sulfonamida y tetraciclina y, en diferentes pafses, se informo resistencia a fluoroquinolonas, macrolidos o cefalosporinas de tercera generacion (antibioticos que tambien son importantes en el tratamiento de enfermedades infecciosas humanas) (Trends and Sources of Zoonoses and Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in the European Union in 2008", publicado el 26 de 2010). Tales preocupaciones se relacionan con la observacion de altos niveles de resistencia a fluoroquinolonas en cepas de Salmonella aisladas de aves de corral y en cepas de Campylobacter aisladas de aves de corral, reses y cerdos destinados al consumo, y con la importancia que algunos de estos antibioticos tienen en el tratamiento de enfermedades infecciosas humanas.

Los organismos vivos se defienden de la invasion de agentes extranos a traves de dos tipos de respuestas: una inmunidad denominada "innata o natural" y una "adquirida o espedfica". La inmunidad innata representa un mecanismo de defensa que existe antes de cualquier contacto con un antfgeno. Hace uso de diferentes factores mecanicos y qmmicos (integridad del epitelio, piel, saliva, secrecion gastrica), factores humorales (lisozima, complemento, interferon), celulas fagodticas (neutrofilos, macrofagos), celulas dendnticas, celulas asesinas naturales (NK) y flora bacteriana comensal.

Los peptidos antimicrobianos representan una via adicional para la respuesta innata a infecciones microbianas (Hartmann M., y otros 2010, Antimicrob. Agents Chemother. 54:3132-3142). Tienen doble importancia, dado que pueden proteger aproximadamente 80 % de las especies animales y casi todas las plantas, y tambien desempenan un papel fundamental en la inmunidad de animales superiores, proporcionando una especie de primera lmea de defensa que estimula y coopera activamente con las respuestas inmunitarias adaptativas (Tossi Ay Sandri L., Curr. Pharm. Design, 2002 8: 743-761). En animales superiores, representan las moleculas "efectoras" de la inmunidad innata (Boman HG., J Intern Med. 2003 254:197-215).

Los peptidos antimicrobianos muestran un amplio espectro de actividad: exterminan rapidamente las celulas bacterianas y son activos contra varias cepas resistentes a antibioticos de importancia clmica (Hancock y Chapple, Antimicrob Agents Chemother, 1999 43:1317-1323; Proc Natl Acad Sci USA. 2000 97:8856-886; Zasloff M., Nature, 2002 415:389-395).

Ademas, se ha demostrado que, para las bacterias, es mucho mas diffcil volverse resistentes a protemas con actividad antimicrobiana, dado que esto requerina un reordenamiento o modificacion de la composicion lipfdica de su membrana, un proceso poco economico y "costoso" para todas las especies microbianas (Zasloff M., Nature, 2002 415:389-395).

La mayona de los peptidos antimicrobianos actuan mediante la alteracion directa de la membrana de las celulas diana (Thevissen y otros, Mol Plant-Microbe Interact. 2000, 13:54-61). Las membranas bacterianas son ricas en fosfolfpidos anionicos, tales como fosfatidilserina y fosfatidilglicerol: esto determina una interaccion electrostatica del peptido cargado positivamente con la propia membrana, que es la base del efecto de perturbacion posterior de la bicapa.

En el caso de las bacterias Gram negativas, se ha observado que el peptido interactua primero con las moleculas de lipopolisacaridos anionicos de la membrana externa, y despues es capaz de hacerla permeable o de ser capturado en su interior. En el caso de las bacterias Gram positivas, en lugar de esto, probablemente el peptido es atrafdo por acidos teicoicos y teicuronicos y por otros grupos anionicos que se encuentran en el exterior en la capa de peptidoglicanos. La composicion diferente de las membranas, de hecho, es la base de la selectividad que algunos de estos peptidos tienen por las celulas bacterianas.

Las membranas de celulas eucariotas se caracterizan por un alto contenido de fosfolfpidos zwitterionicos, tales como fosfatidilcolina, esfingomielina y fosfatidiletanolamina. Ademas, son ricas en colesterol, que esta ausente en bacterias, el cual parece inhibir la accion de tales peptidos lo que confiere a las membranas una cierta resistencia (Zasloff M., Nature, 2002 415:389-395).

Otro factor de selectividad importante es el valor del potencial de membrana: un potencial mas negativo en el interior de la celula, tfpico de celulas bacterianas (100-150 mV), facilita la interaccion del peptido con la capa lipfdica (Bechinger B. J Membr Biol. 1997 156:197-211).

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Se han propuesto dos mecanismos generales principales para explicar el efecto despues de la interaccion de los peptidos con la membrana citoplasmatica:

- un efecto "detergente", donde la estructura anfipatica de tales moleculas interactua con la bicapa lip^dica, lo que interrumpe su organizacion y determina el escape de los componentes citoplasmaticos;

- la formacion de canales, debido a la agregacion de monomeros del peptido en la bicapa lip^dica (Le Guerneve C y otros, Archives of Biochemistry and Biophysics 1998 360: 179-186) y se describe en el modelo de Shai-Matsuzaki-Huang (Zasloff M., Nature, 2002 415:389-395).

Desde 1985, se han identificado una serie de peptidos antimicrobianos, que alcanzaron la cantidad notable de aproximadamente 600 compuestos en 2010. Sin embargo, la mayoria de estos peptidos muestran una o mas desventajas que limitan su uso terapeutico potencial (Stein A. y Raoult D., Clin Infect Dis 2002 35:901-902).

Por ejemplo, el peptido antimicrobiano polimixina B requiere la ciclizacion para su estabilizacion y actividad biologica. Ademas, este peptido causa nefrotoxicidad, neurotoxicidad e hipertermia cuando se usa a concentraciones terapeuticamente eficientes (Ostronoff y otros, Int. J. Infect. Dis, 2006 10: 339-340).

Otro ejemplo se proporciona porTemporin L. Es un peptido antimicrobiano aislado de Rana temporaria, toxico para celulas eucariotas que comprenden las humanas (Rinaldi y otros, Biochem J. 368: 91-100, 2002). Los peptidos antimicrobianos mieloides bovinos (BmAP) han demostrado toxicidad contra celulas endoteliales cultivadas y, generalmente, contra casi todas las lmeas celulares de la lmea hematopoyetica (Risso y otros, Cell Immunol., 189: 107-115, 1998). De manera similar, tambien Bombinin H2, aislado del anuro Bombina orientalis, determina una hemolisis marcada (Csordas A. y Michl H.; Monatsh Chem 101: 182-189, 1970).

Los documentos WO 97/02287 A1 y US 2002/147301 A1 se refieren a compuestos basados en parevinas y taquiplesinas antimicrobianas, que tienen la secuencia de aminoacidos general siguiente:

imagen1

Los compuestos preferidos son peptidos bidclicos que se informan en el Ejemplo 1, es decir cis-parevina-1, trans- parevina-1, trans taquitegrina-1. Estos compuestos generalmente mantienen la actividad antimicrobiana de las protegrinas, pero difieren en la conformacion debido a la dislocacion de los residuos de cistema en las posiciones 6 y/o 15 de estas protegrinas.

Masuda y otros (1992) se refiere a peptidos que tienen actividad antiviral contra HIV tipo 1 in vitro, siendo T22 bidclico el compuesto candidato mas atractivo para la quimioterapia y profilaxis de las infecciones por HIV: T22

l I — I 1

NH2-R-R-W-C-Y-R-K-C-Y-K-G-Y-C-Y-R~K“C-R-CONH2

Kang y otros (2012) es una resena sobre peptidos antimicrobianos naturales, que analiza generalmente las propiedades de peptidos de origen natural.

Tamamura y otros (1998) describe derivados de polifemusin para el uso como antagonista de CXCR4 y bloqueo de la infeccion por HIV-1.

Por lo tanto, es necesario identificar aquellos peptidos antimicrobianos que tienen actividad biologica alta contra microorganismos, asociados con

una toxicidad debil o nula contra celulas eucariotas, amplio espectro de actividad y estabilidad estructural alta para diferentes aplicaciones clinicas.

Ademas, se ha observado que muchos peptidos con actividad antibacteriana demostrada in vitro, una vez que se prueban en otros medios de cultivo in vitro, o in vivo, pierden la actividad antibacteriana o la mayor parte de esta; tal fenomeno se ha atribuido a la accion de inactivacion de peptidos por altas concentraciones de sal, tales como las presentes en diferentes compartimentos del cuerpo humano o en algunos medios de cultivo. Por consiguiente, seria util ademas tener grupos o subgrupos de peptidos que, ademas de tener una actividad antimicrobiana basal util, tambien la mantengan en presencia de altas concentraciones de sal, a fin de obtener un efecto antibacteriano consistente in vivo en todos los compartimentos fisiologicos, que incluyen los que contienen altas cantidades de sales.

Resumen

En respuesta a los inconvenientes mostrados por los antibioticos actualmente en el mercado o disponibles para el tratamiento de infecciones resistentes a antibioticos, un objeto de la presente invencion es una serie de peptidos cationicos dclicos con actividad antimicrobiana y amplio espectro de actividad.

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Los peptidos de la invencion como se reivindica en la reivindicacion 13 pueden volverse dclicos por medio de la formacion de un puente disulfuro entre dos aminoacidos que contienen azufre, ubicados adecuadamente en proximidad con las regiones -NH2 terminal y -COOH terminal, adoptando una estructura de hoja plegada beta antiparalela en su forma dclica. Ademas, la porcion central del peptido se caracteriza por la presencia de un numero de aminoacidos cargados, en parte 25 o completamente alternantes con aminoacidos neutros. Mas espedficamente, los peptidos muestran una secuencia del tipo A-B-C-D-C'-B'-A', donde: las unidades A y A' representan las regiones - NH2 terminal y -COOH terminal respectivamente; las unidades B y B' consisten en aminoacidos que contienen azufre; las unidades C consisten en 5 aminoacidos seleccionados de: (a) aminoacidos hidrofobicos y (b) aminoacidos basicos o aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno; la unidad D consiste en glicina y un aminoacido basico. La subestructura C-D-C' se caracteriza por contener de 5 a 9 puntos de alternancia entre aminoacidos del grupo (a) y el grupo (b), o viceversa.

Los peptidos objeto de la presente invencion muestran actividad antibacteriana significativa como se reivindica en la reivindicacion 1. La estructura en horquilla y lazo del peptido, garantizada por el grupo D en la porcion central de la secuencia, se yuxtapone con los dos aminoacidos B que contienen azufre que, en un ambiente adecuado (en aire o condiciones oxidantes), forman un puente disulfuro.

La ciclizacion de la estructura contribuye a la estabilidad del peptido y la resistencia contra la accion de peptidasas bacterianas. La secuencia citada anteriormente comprende un porcentaje de aminoacidos hidrofobicos, a fin de no perturbar las membranas de las celulas eucariotas, lo que garantiza una toxicidad debil/nula para tales celulas. Ademas, la disposicion de aminoacidos hidrofobicos en regiones discretas, separados de aminoacidos cargados, es decir basicos y/o formadores de enlaces de hidrogeno, proporciona a los peptidos mayor eficacia, y posiblemente tambien mayor insensibilidad a las sales. Tales peptidos, eventualmente, muestran alta solubilidad en solventes acuosos.

La invencion tambien se refiere al uso de dichos peptidos en el tratamiento de infecciones relacionadas con diferentes zonas (por ejemplo, pulmonar, gastrointestinal, urinaria), infecciones cutaneas y enfermedades medicas/quirurgicas complicadas por superinfecciones bacterianas o fungicas.

Los peptidos objeto de la presente invencion se sintetizan con facilidad, son muy eficientes, estables proteoltticamente, esencialmente insensibles a las sales, no hemoltticos y no citotoxicos para celulas eucariotas.

El espectro antibacteriano de los peptidos antimicrobianos de la presente invencion incluye microorganismos Gram negativos y Gram positivos. Los microorganismos Gram negativos son, por ejemplo, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637: en particular, se observaron LD90 contra E. coli entre 0,83 pM (1,5 pg/ml) y 10,64 pM (19,63 pg/ml) y para P. aeruginosa entre 0,87 pM (1,59 pg/ml) y 7,68 |jM (16,29 pg/ml); las LD90 obtenidas contra Stenotrophomonas maltophilia vanan entre 1,88 pM (3,42 pg/ml) y 2,67 pM. De particular interes son tambien los resultados obtenidos contra bacterias Gram positivas, como se destaca por la actividad contra cepas de S. aureus resistentes a meticilina (MRSA ATCC 43300). Para los peptidos probados las LD90 vanan entre 0,85 pM (1,65 pg/ml) y 0,90 pM (1,72 pg/ml). Igualmente, interesantes son los resultados obtenidos contra cepas de S. aureus sensibles a meticilina (ATCC 25923), con LD90 comprendidas entre 1,42 pM (2,89 pg/ml) y 13,4 pM (28,77 pg/ml). Los peptidos de la presente invencion demostraron ser eficientes tambien contra especies de hongos y levaduras, como se destaca por la actividad contra Candida albicans ATCC 10231 y Malassezia pachydermatis ATCC 14522; los valores de LD90 obtenidos con diferentes peptidos para ambas especies probadas comprendfan entre un valor mmimo de 0,68 pM (1,24 pg/ml) y un valor maximo de 39 pM (aproximadamente 70 pg/ml).

Dichos peptidos pueden usarse eficazmente como agentes primarios o como adyuvantes en el tratamiento de enfermedades infecciosas relacionadas con diferentes zonas del cuerpo, tanto en seres humanos como en animales. Ademas, los peptidos objeto de la invencion tambien pueden emplearse en el tratamiento de infecciones de organismos vegetales.

Descripcion de las figuras

Figura-1: Representacion esquematica de la estructura de los peptidos. A: evidencia del enlace disulfuro; B: potencial electrostatico; C: (1)=zona cargada; (2)=zona hidrofobica.

Figura 2a: curva de permeabilizacion de la membrana de E. coli ML35p por los peptidos descritos en el ejemplo 1. El aumento de la densidad optica es proporcional a la concentracion de p-galactosidasa citoplasmatica liberada por las bacterias danadas en el medio de cultivo.

Figura 2b: curva de permeabilizacion de la membrana de E. coli ML35p por los peptidos descritos en el ejemplo 1. El aumento de la densidad optica es proporcional a la concentracion de un derivado cromogenico de la degradacion de CENTA por una beta-lactamasa liberada por las bacterias danadas en el medio de cultivo.

Figura 3: actividad hemolttica de peptidos hacia globulos rojos de carnero. La concentracion probada es 20 veces la LD90. El porcentaje de hemolisis se calculo por analisis de la densidad optica a 450 nm.

Descripcion detallada

El termino "peptido", dentro de la presente invencion, se define como una multiplicidad de residuos de aminoacidos unidos por enlaces peptfdicos. Tiene el mismo significado de polipeptido y protema y puede usarse indistintamente. Los

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aminoacidos que forman un polipeptido se identifican en la presente descripcion independientemente por su nombre completo, o por sus abreviaturas oficiales internacionales respectivas (codigo de 1 o 3 letras).

El termino "serie", en el presente documento, se define como todas las variantes posibles del peptido de la invencion, en donde uno o mas aminoacidos de la secuencia peptfdica se sustituyen por un aminoacido homologo de manera que las propiedades de los peptidos se mantienen, incluso si no es necesariamente al mismo nivel. Otra variante puede mostrar mayor o menor actividad y/o un espectro mas amplio (por ejemplo, actividad contra una variedad mas amplia de microbios), o sermas espedfica para un microorganismo particular. Preferentemente, las sustituciones conservadoras de aminoacidos se llevan a cabo en uno o mas residuos de aminoacidos.

El termino "hoja plegada beta" se refiere a la estructura tridimensional del peptido dclico como se ilustra por ejemplo en la Figura 1; en ella, puede observarse la organizacion del peptido en hoja plegada beta, donde cada cadena muestra una torsion hacia la derecha (giro) de aproximadamente 30°; tal geometna representa el compromiso entre la optimizacion de la energfa conformacional de las dos cadenas que forman la hoja, y el mantenimiento de la geometna de los enlaces de hidrogeno intracatenarios. En la secuencia citada anteriormente, las unidades A, B, C, D, C', B', A' se unen en el orden A- B-C-D-C'-B'-A' para formar una secuencia lineal; tal secuencia puede volverse dclica o ciclarse mediante el enlace directo entre las dos unidades B. En dicha estructura, las unidades nombradas con la misma letra no son necesariamente iguales, sino que pueden contener aminoacidos diferentes; en consecuencia, considerando el grupo central D, la invencion incluye tanto peptidos simetricos como asimetricos.

Por lo tanto, la presente invencion se refiere a un peptido que consiste en una secuencia A-B-C-D-C'-B'-A', en donde: la unidad A consiste en 2 aminoacidos, y la unidad A' consiste en 1 aminoacido, ambas unidades B y B' son Cys, cada unidad C consiste independientemente en 5 aminoacidos, seleccionados tanto del grupo (a) de aminoacidos hidrofobicos, como del grupo (b) de aminoacidos basicos o aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno; la unidad D es -Arg-Gly-

en donde:

(i) dichos aminoacidos hidrofobicos se seleccionan de: Ala, Phe, Ileu, Leu, Pro, Tyr, Trp y Val;

(ii) dichos aminoacidos basicos se seleccionan de: Lys, His, Arg;

(iii) dichos aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno se seleccionan de Asn, Gln, Ser, Thr;

y en donde la subestructura C-D-C' como un todo contiene de 5 a 9 puntos de alternancia entre aminoacido del grupo (a) y aminoacido del grupo (b), o viceversa,

en donde el peptido esta en la forma dclica por medio de la formacion de un puente disulfuro entre las dos unidades B, y en donde los aminoacidos hidrofobicos son entre 30 y 50 % de la cantidad total de aminoacidos del peptido, dicho peptido es para el uso en el tratamiento de infecciones causadas por bacterias, hongos y/o levaduras.

Las unidades A representan las regiones terminales del peptido: la unidad A se refiere a la region -NH2 terminal, mientras que la unidad A' se refiere a la region -COOH terminal. La unidad A consiste en 2 aminoacidos, y la unidad A' consiste en 1 aminoacido; el tipo de estos aminoacidos no es determinante, sin embargo, pueden seleccionarse preferentemente de histidina, lisina, glicina, triptofano, alanina, valina.

Las unidades B se encuentran representadas por un aminoacido que contiene azufre, en particular cistema. Las unidades 8 estan involucradas en la formacion del puente disulfuro responsable de la ciclizacion del peptido. La ciclizacion puede lograrse en el momento de la smtesis del peptido, o puede producirse posteriormente en presencia de una cantidad adecuada de oxfgeno ambiental. La invencion incluye la smtesis, formulacion y uso terapeutico del peptido tanto en forma lineal como en forma dclica.

La unidad D se encuentra representada por glicina y un aminoacido basico, preferentemente con la secuencia: aminoacido basico^glicina, en direccion A^A'; en ella, el aminoacido basico es preferentemente arginina. La glicina presente en D, apoyada adecuadamente por arginina, permite la estructura en horquilla y lazo del peptido y, en asociacion con las unidades C unidas a ella, una distancia adecuada entre las unidades B que forman el puente disulfuro.

Las unidades C, independientemente, consisten en 5 aminoacidos seleccionados:

a) tanto del grupo de aminoacidos hidrofobicos,

b) como del grupo de aminoacidos basicos o formadores de enlaces de hidrogeno.

Los aminoacidos hidrofobicos del grupo (a) se seleccionan de: alanina, fenilalanina, isoleucina, leucina, prolina, tirosina, triptofano y valina. Con referencia a la cantidad total de todos los aminoacidos del peptido, estos representan preferentemente entre 30 y 50 %, con mayor preferencia entre 35 y 45 %, por ejemplo, entre 39 y 43 %.

Los aminoacidos basicos del grupo (b) se seleccionan de: lisina, histidina, arginina.

Los aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno del grupo (b) se seleccionan de asparagina, glutamina, serina, treonina.

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En la presente invencion, es esencial que cada unidad C contenga tanto aminoacidos del grupo (a) como aminoacidos del grupo (b); como miembros del grupo (b), es posible usar libremente aminoacidos basicos, aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno, o ambos. En una variante preferida, las unidades C contienen, principalmente o totalmente, aminoacidos basicos como miembros del grupo (b).

Una caractenstica fundamental de las unidades C es el alto grado de alternancia entre aminoacidos cargados positivamente del grupo (b), y aminoacidos electricamente neutros del grupo (a). En particular, la secuencia C-D-C' contiene de 5 a 9 puntos de alternancia entre: (a) aminoacido hidrofobico y (b) aminoacido basico o formador de puente de hidrogeno, o viceversa. La cantidad de "puntos de alternancia" es igual a la cantidad de enlaces peptfdicos que, en la secuencia C-D-C', separan un aminoacido del grupo (a) de un aminoacido del grupo (b) unido directamente a este: por ejemplo la secuencia Ala-His-Ala-Thr-Phe contiene 4 puntos de alternancia, correspondientes a los 4 enlaces peptfdicos que se encuentran en la secuencia; por otra parte, una secuencia Lys-Ala-Phe-Lys-Phe contiene solamente 3 puntos de alternancia: porque Ala y Phe pertenecen a la misma clase (a), y por tanto el enlace Ala-Phe no se considera un "punto de alternancia". Para los propositos de la presente invencion, los "puntos de alternancia" tambien incluyen el enlace entre el aminoacido basico presente en D y el aminoacido de la unidad C unido a este, en caso de que dicho aminoacido sea un aminoacido hidrofobico; viceversa, los enlaces que involucran a la glicina y a aminoacidos que contienen azufre, no se consideran "puntos de alternancia", independientemente del aminoacido unido a ellos.

Por consiguiente, en las unidades C los aminoacidos del tipo (a) y (b) tfpicamente se alternan entre ellos; sin embargo, esto no excluye la posibilidad de contiguidades limitadas entre aminoacidos del mismo grupo ((a) o (b)), siempre y cuando dicha cantidad de puntos de alternancia en la secuencia C-D-C se satisfaga.

La alternancia de carga lograda en la subestructura C-D-C es ventajosa para la actividad antibacteriana general del peptido.

Un subgrupo preferido de peptidos pertenecientes a la familia descrita anteriormente es aquel que contiene un total de 17 aminoacidos, en donde las unidades A y A' consisten independientemente en 1 o 2 aminoacidos, ambas unidades B y B' son Cys, al menos una de las unidades CyC' incluye Lys, todos los aminoacidos en las posiciones 6, 8, 13 (numeradas de A a A') pertenecen a dicho grupo (i) de aminoacidos hidrofobicos, y los aminoacidos en las posiciones 9 y 10 son Arg y Gly.

Un subgrupo mas preferido se caracteriza por contener, ademas de las caractensticas enumeradas anteriormente, un aminoacido hidrofobico especialmente en la posicion 11 (siempre con numeracion de A a A'). Tal caractenstica ha demostrado ser particularmente util para aumentar la insensibilidad a las sales del peptido, es decir el mantenimiento de su accion antibacteriana incluso en presencia de altas concentraciones de sal. Esta propiedad es de particular importancia, dado que la actividad membranolftica de los peptidos antimicrobianos se basa generalmente en la interaccion electrostatica con membranas de bacterias u hongos cargadas negativamente; normalmente, la presencia de iones libres (por ejemplo Na+, Cl-, usualmente presentes en el medio de ensayo o en fluidos fisiologicos/patologicos) enmascara la carga negativa presente en la membrana bacteriana, lo que reduce la eficiencia de union del peptido y por tanto la eficacia del tratamiento. Los presentes peptidos no se ven influenciados por este fenomeno no deseado, manteniendo una eficacia significativa (especialmente contra bacterias Gram negativas) en presencia de concentraciones ionicas ambientales altas.

Todos los aminoacidos presentes en el presente peptido pueden estar presentes independientemente en forma D o L; preferentemente, se encuentran principalmente (es decir por encima de 50 %) o totalmente en la forma L.

Otro aspecto preferido de la invencion se refiere a peptidos constituidos de al menos 80 %, por ejemplo 90 %, o con mayor preferencia 91-100 %, por ejemplo 100 %, de L-aminoacidos.

Otro aspecto preferido de la invencion se refiere a peptidos constituidos de al menos 80 %, por ejemplo 90 %, o con mayor preferencia 91-100 %, por ejemplo 100 %, de D-aminoacidos.

Todos los aminoacidos pueden usarse en su estado natural o en forma de sus derivados sinteticos.

Un grupo preferido de peptidos es aquel donde:

- la unidad A (NH2- terminal) contiene 2 aminoacidos, y la unidad A' (COOH- terminal) contiene 1 aminoacido,

- ambas unidades B y B' se encuentran representadas por cistema.

Los peptidos preferidos espedficos de acuerdo con la presente invencion son el peptido identificado como AMP2041 (sec. con num. de ident.:1), el peptido identificado como AMP72 (sec. con num. de ident.:2), y el peptido identificado como AMP126 (sec. con num. de ident.:3). Otros peptidos utiles para los propositos de la invencion son aquellos quetienen las secuencias sec. con num. de ident.: 4-54 como se describe en la presente descripcion.

Igualmente preferidos son los homologos cercanos de cada una de dichas sec. con num. de ident.: 4-54, caracterizados porque estan modificados por solo un aminoacido en cualquier posicion entre la num. 1 y 17, donde dicha modificacion no involucra a los aminoacidos en las posiciones 3, 9, 10, 16; la modificacion consiste en sustituir dicho aminoacido con otro aminoacido seleccionado de los 20 aminoacidos naturales; preferentemente, el aminoacido se sustituye con otro

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aminoacido perteneciente a la misma categona, (a) o (b) como se definio anteriormente: por ejemplo, Ala se sustituye con Leu; o Ser se sustituye con Lys o Thr, etc.

La presente invencion incluye un proceso para la smtesis de dichos peptidos que tienen la estructura A-B-C-D-C'-B'-A' definida anteriormente.

Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la invencion son generalmente peptidos sinteticos sintetizados in vitro con el uso de metodos qmmicos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, se preparan con el uso de procedimientos de smtesis en fase solida, fase lfquida, condensacion peptidica, o cualquier combinacion de las tecnicas antes mencionadas. Los aminoacidos que componen los peptidos de la invencion pueden ser naturales o sinteticos. Los aminoacidos usados para la smtesis de peptidos pueden ser aminoacidos en donde el a-amino-terminal esta protegido por el grupo inestable en acidos N-a-t-butiloxicarbonilo (Boc) de acuerdo con el trabajo de Merrifield (J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2154, 1963) o por el grupo inestable en bases 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) como se describe en Carpino y Han (J. Org. Chem., 37: 3403-3409, 1972). Los aminoacidos protegidos por Boc o Fmoc pueden obtenerse de diferentes fuentes comerciales, tales como, por ejemplo, Fluka, Sigma-Aldrich Bachem, Advanced Chemtech, Cambridge Biochemical Research.

En general, los metodos de smtesis qmmica en fase solida, de acuerdo con M. Bodansky, Principles of peptide synthesis, (Springer-Verlag, Berlin, 1984) o JM Stewart y JD Young, Solid Phase Peptide Synthesis (Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois 1984), consisten en la adicion secuencial de uno o mas aminoacidos a la cadena peptfdica en crecimiento. Generalmente, el grupo amino o carboxilo del primer aminoacido esta protegido por un grupo protector optimo. El primer aminoacido protegido se adhiere a un soporte solido inerte, por ejemplo, una resina. Despues el grupo protector se elimina del residuo unido a la resina y los siguientes aminoacidos (adecuadamente protegidos) se anaden secuencialmente. Despues de alcanzar el numero de aminoacidos, todos los grupos protectores restantes (y cualquier soporte solido) se eliminan secuencialmente o simultaneamente, para proporcionar el peptido final.

Es posible anadir mas de un aminoacido a la vez a la cadena en crecimiento, por ejemplo, mediante el acoplamiento (en condiciones experimentales adecuadas que evitan la formacion de racematos debido a la presencia de centros quirales) de un tripeptido protegido con un dipeptido adecuadamente protegido para formar, despues de su desproteccion, un pentapeptido como se describe, por ejemplo, por Merrifield en G. Barany y RB Merrifield, Peptides: analysis, synthesis, biology, E. y J. Gross Meienhofer eds., vol. 2 (Academic Press, Nueva York, 1980, pags. 3-254).

Dichos peptidos pueden sintetizarse por firmas que proporcionan el servicio de smtesis de peptidos por encargo, por ejemplo, pero sin limitarse a, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Estados Unidos), SelleckChem (Houston, TX, Estados Unidos), Invitrogen (Grand Island, NY, Estados Unidos), Abgent (Oxfordshire, OX144RY, Reino Unido).

El grado de pureza del compuesto peptfdico puede determinarse mediante varios metodos, entre los que se encuentra la identificacion de picos de HPLC. Preferentemente, se prefiere un peptido que produce un pico individual de altura y ancho iguales al menos a 75 % del material aplicado en una columna de HPLC. Se prefiere aun mas un peptido que produce un pico individual que es al menos 87 %, al menos 90 %, al menos 99 % o incluso 99,5 % del material aplicado en una columna de HPLC.

Para garantizar que el peptido obtenido con el uso de una de las tecnicas de smtesis antes mencionadas es el peptido deseado para los usos o formulaciones descritas en lo adelante en la presente invencion, el analisis de la composicion del peptido se lleva a cabo con la ayuda de diferentes metodos analfticos conocidos en la tecnica. El analisis de la composicion puede llevarse a cabo, por ejemplo, con el uso de espectrometna de masas de alta resolucion para determinar el peso molecular del peptido. Alternativamente, el contenido de aminoacidos de un peptido puede confirmarse mediante la hidrolisis del peptido en solucion acida para identificar y cuantificar los componentes de la mezcla con el uso de HPLC, o un analizador de aminoacidos. Igualmente, utiles son los metodos de cromatograffa en capa fina, que tambien pueden usarse para identificar uno o mas grupos o residuos constituyentes de un peptido deseado.

Otro aspecto preferido, pero no limitante, de los peptidos de la invencion se refiere al angulo polar comprendido entre 90° y 180°, preferentemente entre 91° y 179°, con mayor preferencia entre 104° y 115°. El termino "angulo polar" en el presente documento significa la medida del angulo formado entre los lados polar y no polar de un peptido formados en una estructura anfipatica.

Otro aspecto preferido, pero no limitante, de los peptidos de la invencion se refiere al mdice de Boman comprendido entre -1 y +4. Preferentemente entre -0,5 y +3 y aun con mayor preferencia entre +1 y +2,5, por ejemplo entre +1,1 y +2,0. El termino "mdice de Boman" en la presente invencion significa la suma de las energfas para la transferencia de agua a ciclohexano de las cadenas laterales de los aminoacidos individuales que componen los peptidos, dividida por la cantidad total de residuos, de acuerdo con lo descrito por Radzeka y Wolfenden (1988) en "Comparing the polarities of amino acids: side-chain distribution coefficients between vapour phase, cyclohexane, 1-octanol and neutral aqueous solution." (Biochemistry 27:1664-1670). Los valores calculados son negativos pero el signo (+ o -) es el opuesto.

Otro aspecto preferido, pero no limitante, de la invencion se refiere al porcentaje de solubilidad en agua de los peptidos de la invencion, comprendido entre 40 % y 90 %, preferentemente entre 91 % y 97 %, aun con mayor preferencia entre

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Colectivamente o individualmente, los peptidos de la invencion se proporcionan con actividad biologica hacia la biota (organismos celulares pertenecientes a los dominios Archea, Bacteria o Eukaryota).

Un aspecto preferido de los peptidos de la invencion se refiere a la falta de actividad biologica hacia la biota perteneciente al dominio Eukaryota, preferentemente la biota perteneciente al subreino Eumetazoa, aun con mayor preferencia la biota perteneciente al phylum Chordata.

Colectivamente o individualmente, los peptidos de la invencion se proporcionan con actividad antimicrobiana para una amplia variedad de patogenos tales como, por ejemplo, bacterias, hongos, levaduras, parasitos, protozoos y virus. Un "agente patogeno" se define generalmente como cualquier organismo (unicelular o pluricelular, o que tiene organizacion subcelular) que causa una enfermedad en un organismo.

Colectivamente o individualmente, los peptidos antimicrobianos de la invencion se sintetizan con facilidad, son muy eficientes, estables proteoltticamente, esencialmente insensibles a las sales, no hemoltticos y no citotoxicos.

La masa de los peptidos de la invencion puede determinarse a traves de procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, espectrometna de masas. Esencialmente, esta tecnica incluye la ionizacion de un compuesto y la posterior separacion de los iones producidos en base a su propia relacion masa/carga. Los espectrometros de masa tienen diferentes metodos para determinar la relacion masa/carga del ion, por ejemplo, el tiempo de vuelo. Esencialmente, los iones provenientes de la fuente se aceleran por un potencial (V) a la misma energfa cinetica, despues se dejan volar a lo largo de un tubo hacia un detector. Si un espectrometro tiene un tubo de vuelo de una longitud L, el tiempo de vuelo para un ion dado se proporciona por: t = (L2*m/2*z*e*V). A partir de la relacion m/z, una funcion del tiempo de permanencia en el tubo de vuelo, puede calcularse la masa de un ion dado. El tubo de vuelo, no obstante, tiene baja resolucion (baja capacidad de discriminar dos iones con m/z similar), para superar esto, la mayona de los analizadores se proporcionan con un "Reflectron" es decir un espejo capaz de reflejar los iones y despues hacer que el ion recorra dos veces la trayectoria. De esta manera, es posible discriminar entre 2 iones que tienen tiempos de vuelos muy similares en el tubo de vuelo. El uso del "Reflectron" reduce el intervalo de masa molecular que puede analizarse, que esta comprendido entre 200 y 5 000-10 000 Da.

La estructura secundaria de peptidos en solucion puede analizarse mediante una tecnica conocida en la tecnica, denominada dicrofsmo circular. Forma parte de las espectroscopfas quiropticas, es decir aquellas tecnicas espectroscopicas que, con el uso de luz polarizada, ponen de manifiesto la actividad optica de las moleculas de prueba. Los resultados obtenidos mediante esta tecnica proporcionan informacion sobre los porcentajes de estructuras secundarias presentes en polipeptidos. Aunque no es posible establecer la posicion en la secuencia, esta tecnica puede usarse para un primer tamizaje para la eleccion del sistema de solventes para el analisis de NMR y como una comprobacion de los resultados obtenidos del calculo computacional.

La actividad antimicrobiana de un peptido puede determinarse con el uso de un metodo conocido en la tecnica, por ejemplo, el metodo de dilucion en caldo de cultivo. Esencialmente, este metodo involucra el cultivo de un microorganismo en un medio lfquido hasta que alcanza la fase logantmica. El peptido de prueba se diluye de manera seriada con medio de cultivo para la bacteria de prueba en los pocillos de una placa de multiples pocillos. Una concentracion optima del microorganismo se anade a los pocillos que contienen el peptido diluido de manera seriada. La placa se incuba en un termostato a una temperatura de 37 °C durante un tiempo suficiente para que el microorganismo crezca. El crecimiento del microorganismo, evaluado en comparacion con un control negativo (microorganismo cultivado en ausencia del peptido), se determina mediante la deteccion de la absorbancia de la solucion que contiene la bacteria, por ejemplo, a 605 nm.

Otro metodo conocido en la tecnica para determinar la actividad antimicrobiana de un peptido de la invencion es la prueba de difusion en agar. Esencialmente, la prueba se lleva a cabo en agar en placas de 14 cm o 9 cm. Para realizar la inoculacion de bacterias en agar, 4-5 colonias cultivadas en medio de aislamiento primario se suspenden en 4-5 ml de Caldo Tnptico Soya (caldo de cultivo de enriquecimiento), se incuba durante 2-6 horas hasta que el cultivo lfquido ha alcanzado una opacidad correspondiente a un valor de 0,5 en la escala nefelometrica de McFarland (es decir 1,5 x 106 bacterias). La bacteria cuya sensibilidad se ensayara se siembra en la superficie del agar. Posteriormente, en la superficie perfectamente seca del agar, se depositan discos impregnados con peptido con el uso de pinzas esteriles y, despues de hacer que los discos se adhieran a la superficie, la placa se incuba en un termostato a una temperatura de 37 °C durante 24 horas. El diametro de las zonas de inhibicion permite definir cual bacteria es resistente, tiene resistencia intermedia o es sensible al peptido.

Un metodo adicional para determinar si un peptido tiene actividad antimicrobiana consiste en comprobar la existencia de un dano a la membrana bacteriana. Este metodo consiste esencialmente en poner en contacto, en un medio lfquido, el microorganismo con un peptido. Se anade al medio lfquido, una molecula capaz de atravesar la membrana intacta del microorganismo. Una vez que se introduce, dentro del microorganismo, se digiere para formar un producto que ya no es capaz de atravesar la membrana. El medio en el cual el microorganismo se dispersa, se analiza en cuanto a la presencia

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de dicho producto. La presencia de tal producto en el medio en el que se incuba el microorganismo es un mdice del dano a la membrana causado por el peptido y es un mdice de la actividad antimicrobiana del peptido. Un ejemplo de una molecula adecuada es calcema AM. La calcema AM se convierte en calcema libre dentro del microorganismo. Normalmente, la calcema libre no es capaz de atravesar la membrana celular del microorganismo y estar presente en el medio de cultivo. Portanto, la deteccion de calcema libre en el medio es un mdice del dano a la membrana celular del microorganismo, y portanto de la actividad antimicrobiana del peptido.

Otro metodo util para identificar un dano a la membrana bacteriana explota la capacidad de la p-galactosidasa de convertir el sustrato cromogenico artificial orto-nitrofenil-p-D-galactopiranosido (ONPG) en glucosa y o-nitrofenol. Este metodo descrito por primera vez por Jeffrey Miller en 1972 y publicado en "Experiments in Molecular Genetics" se modifico posteriormente por Zhang y Bremer en 1995 (The Journal of Biological Chemistry, 1995, 270, 11181-11189). Esencialmente, este metodo consiste en mezclar en un medio lfquido adecuado una almuota de celulas bacterianas y un agente permeabilizante, por ejemplo, detergentes tales como Triton-X100 o Tween20, o los peptidos de la invencion, que destruyen las membranas bacterianas dejando la enzima p-galactosidasa intacta. Despues de un penodo de incubacion adecuado, se anade una solucion de ONPG al medio de cultivo. La p-galactosidasa liberada por las bacterias danadas metaboliza el ONPG, para liberar nitrofenol libre. El nitrofenol, que proporciona al medio un color amarillo, se cuantifica por analisis espectrometrico a 405 nm.

En la presente invencion, tambien se determino la citotoxicidad de los peptidos, por ejemplo, mediante la determinacion de la hemolisis de globulos rojos y calificacion de los peptidos antimicrobianos en base a su concentracion hemolttica minima. En el presente documento, la MHC10 se define como la concentracion de peptido que determina un 10 % de hemolisis, la MHC50 es la concentracion de peptido que determina un 50 % de hemolisis y la MHC90 es la concentracion de peptido que determina un 90 % de hemolisis. Se seleccionaron los peptidos que a la concentracion de 100 pg/ml caen en la clase definida como MHC10.

En la presente invencion, tambien se determino la citotoxicidad de los peptidos contra una lmea celular de linfocitos T, por ejemplo, celulas Jurkat. Las celulas se cultivaron en presencia y en ausencia de peptidos y el dano a la membrana se evaluo mediante la tincion de viabilidad con azul Tripan.

Un aspecto preferido de la invencion se refiere al uso de un peptido que tiene la estructura A-B-C-D-C'-B'-A' definida anteriormente, para fabricar un medicamento util para el tratamiento de un sujeto afectado por una infeccion causada por bacterias, hongos y/o levaduras; la invencion comprende ademas el mismo peptido para el uso en el tratamiento de un sujeto afectado por una infeccion causada por bacterias, hongos y/o levaduras. En una primera variante, el tratamiento se dirige particularmente contra el grupo de bacterias Gram negativas; en una segunda variante, el tratamiento se dirige contra el grupo de bacterias Gram positivas; en una tercera variante, el tratamiento se dirige contra el grupo de hongos y levaduras; en una cuarta variante, el tratamiento se dirige contra microorganismos pertenecientes a mas de uno de dichos grupos. El termino "tratamiento" se refiere a los efectos de los peptidos de la invencion capaces de proporcionar beneficios a pacientes afectados por una enfermedad infecciosa, por ejemplo, una mejona de las afecciones del paciente o un retraso en la progresion de la enfermedad. En el presente documento, el termino "infeccion", o su sinonimo "enfermedad infecciosa" significa la invasion, colonizacion y/o multiplicacion de un microorganismo dentro de o en otro organismo huesped. El termino "infeccion microbiana" significa una enfermedad infecciosa causada por un agente patogeno, como se definio anteriormente, por ejemplo, una bacteria, un parasito, un protozoo, un virus o un hongo, que comprende levaduras. En el presente documento, el termino "sujeto" define cualquier organismo pluricelular, entre los que se encuentra un ser humano, animal, planta o insecto que puede infectarse por un microorganismo. Preferentemente, el sujeto es cualquier organismo animal, por ejemplo, un ser humano o un animal, que puede infectarse por un microorganismo contra el cual un peptido antimicrobiano o una variante de este es activo.

Una bacteria patogena, como se definio anteriormente, puede originarse de una de las especies bacterianas seleccionadas en el grupo que incluye: Staphylococcus spp., por ejemplo, Staphylococcus aureus (por ejemplo, Staphylococcus aureus ATCC 25923), Enterococcus spp., por ejemplo, Enterococcus faecalis ATCC 29212; Pseudomonas spp., por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Mycobacterium spp., por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacterspp.; Salmonella spp. (por ejemplo Salmonella enteritidis ATCC 13076); Streptococcus spp., por ejemplo Streptococcus grupo Ao B, Streptoccocus pneumoniae, Helicobacter spp., por ejemplo Helicobacter pylori;. Neisseria spp., por ejemplo Neisseria gonorreae, Neisseria meningitidis;. Borrelia burgdorferi, Shigella spp., por ejemplo, Shigella flexneri; Escherichia coli (ATCC 25922);. Haemophilus spp., por ejemplo, Haemophilus influenzae; Francisella tularensis, Bacillus spp., por ejemplo, Bacillus anthracis; Clostridium spp., Clostridium botulinum, Yersinia spp., por ejemplo, Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; por ejemplo, Burkholderia cepacia ATCC 17759, B. mallei y B. pseudomallei; Stenotrophomonas spp., por ejemplo, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637.

La actividad biologica de los peptidos de la invencion contra microorganismos se determino, por ejemplo, a traves de ensayo de microdilucion en caldo de cultivo y recuento de las colonias en una placa. En la presente invencion, se determino la capacidad de los peptidos de reducir o prevenir el crecimiento de las bacterias involucradas en enfermedades infecciosas fundamentalmente de importancia clmica. Por ejemplo, la actividad sobre bacterias Gram negativas se comprobo con referencia a bacteria tales como Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia. En particular, Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram negativa problematica

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en virtud de su invasividad y resistencia heterogenea a quimioterapicos antibacterianos. Este microorganismo es responsable de infecciones severas y es la causa de la morbilidad severa en sujetos inmunodeprimidos debido a infecciones virales tales como HIV, quimioterapia contra el cancer o terapias inmunosupresoras. Ademas, esta bacteria es frecuentemente el agente etiologico de enfermedades infecciosas severas del tracto respiratorio inferior, el tracto urinario, lesiones cutaneas (heridas, ulceras) en poblacion juvenil internada, que incluye sujetos afectados de fibrosis qmstica, y pacientes hospitalizados. En los ultimos anos, la incidencia de infecciones por Pseudomonas, en la fibrosis qmstica, ha aumentado drasticamente.

Escherichia coli es un microorganismo Gram negativo perteneciente a la familia de Enterobacteriaceae, a la que pertenecen bacterias tales como Shigella, Salmonella, Klebsiella o Proteus. Escherichia coli es un agente patogeno importante que causa frecuentemente enfermedades infecciosas del tracto urinario, bacteremias, neumoma adquirida en el hospital y la comunidad y varias enfermedades infecciosas de la cavidad abdominal. La resistencia emergente a quimioterapicos antibacterianos observada en los ultimos anos en Escherichia coli se esta volviendo un serio problema de salud. De particular interes es la resistencia relacionada con la produccion de beta-lactamasas de amplio espectro que ha hecho a esta bacteria resistente a cefalosporinas y fluoroquinolonas, en particular al ciprofloxacino.

Stenotrophomonas maltophilia es un bacilo Gram negativo aerobio de amplia distribucion en diferentes habitats naturales, animales o seres humanos. Actualmente, se considera responsable de enfermedades infecciosas adquiridas en el hospital tales como bacteremias, meningitis, infecciones oculares, neumoma, infecciones del tracto urinario, infecciones de tejidos blandos y de la piel. Las enfermedades infecciosas causadas por este microorganismo se consideran generalmente un factor de riesgo en todas las enfermedades en las que se observa una reduccion de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, en neoplasias, enfermedades respiratorias cronicas, tales como fibrosis qmstica o enfermedades pulmonares obstructivas cronicas, y se considera el agente responsable de las endocarditis infecciosas. Estas endocarditis generalmente adquiridas en el hospital se relacionan con la contaminacion de cateteres y frecuentemente son fatales debido a la resistencia intrrnseca de esta bacteria a los antibioticos comunes.

La actividad sobre bacterias Gram positivas se comprobo con referencia a bacteria tales como Staphylococcus aureus y su variante resistente a meticilina.

Un patogeno fungico puede originarse de uno de los hongos (que comprenden levaduras) pertenecientes al grupo que incluye los generos Candidaspp. (por ejemplo C. albicans), Epidermophyton spp. Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp. (por ejemplo T. rubrum y T. interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (por ejemplo, Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidia spp., Cladophialophoraspp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Arthrographisspp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichumspp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp. (por ejemplo, Malassezia furfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phoma spp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucor spp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharomycesspp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladiumspp., Ustilago spp., Verticillium spp., Wangiella spp.

La actividad biologica de los peptidos de la invencion contra un hongo o una levadura se determino, por ejemplo, por ensayo de microdilucion en caldo de cultivo y recuento de las colonias en una placa. Por ejemplo, se determino la capacidad de un peptido aislado o de uno perteneciente a una biblioteca de peptidos de inhibir el crecimiento y/o exterminar los hongos (que comprenden levaduras) pertenecientes a los generos Candida spp. o Malassezia spp., por ejemplo, Candida albicans o Malassezia furfur.

Malassezia, conocido anteriormente como Pityrosporum, es un genero de hongos que viven en la piel de varios animales, que incluyen seres humanos, y ocasionalmente causan infecciones oportunistas. Recientemente, gracias al uso de tecnicas de biologfa molecular, se observo que este hongo es el agente patogeno de una serie de dermatitis en seres humanos, que incluyen caspa y dermatitis seborreica (Sugita T, Tajima M, Takashima M, y otros, 2004, "A new yeast, Malassezia yamatoensis, isolated from a patient with seborrhoeic dermatitis, and its distribution in patients and healthy subjects", Microbiol. Immunol. 48 (8): 579-83). Ademas, se descubrio que las erupciones cutaneas observadas en pitiriasis versicolor se deben a la infeccion por este hongo (Guillot J, Hadina S, Gueho E, 2008, "The genus Malassezia: old facts and new concepts". Parassitologia 50 (1-2): 77-9). Los miembros del genero Malassezia spp., en particular Malassezia pachidermtatis, son de particular importancia en el campo de la medicina veterinaria. Se desarrolla como un saprofito sobre la piel y en el canal del ofdo externo de perros y gatos, ademas de otros mairnferos. Se adapta estrictamente al huesped, tanto que no se encuentra libre en la naturaleza. Es un hongo oportunista que expresa su potencia patogenica solamente en presencia de factores promotores: exceso de humedad, aumento de la secrecion de cerumen o sebo, pliegues cutaneos. Constituye uno de los agentes mas frecuentes de la otitis externa en el perro. La terapia topica parece ser la mas indicada en el manejo de las infecciones oticas por Malassezia spp., donde existe la necesidad de productos multivalentes que tengan simultaneamente actividad fungicida/bactericida.

En una variante preferida, pero no limitante, el tratamiento se dirige contra un microorganismo seleccionado en el grupo de Pseudomonas spp., Escherichia spp., Stenotrophomonas spp., Burkholderia spp., Candidaspp., o Malassezia spp.

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Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la presente invencion tambien pueden ser utiles en el tratamiento de infecciones asociadas generalmente con la piel entre las que se encuentran, sin limitacion, ulceras y lesiones, heridas de la piel, cortes o quemaduras.

Un aspecto preferido adicional de la invencion informa que los peptidos, colectivamente o individualmente, son utiles en el tratamiento de infecciones cutaneas bacterianas o piodermitis.

Otro aspecto incluye el uso colectivo o individual de los peptidos de la invencion en el tratamiento de enfermedades (clmicas o quirurgicas) complicadas por superinfecciones bacterianas entre las que se encuentran, sin limitacion, infecciones asociadas con las mucosas, infecciones asociadas con el tracto gastrointestinal, el tracto urogenital, infecciones del tracto urinario (por ejemplo, pielonefritis, cistitis, uretritis) o infecciones respiratorias, por ejemplo, fibrosis qmstica.

Los mairnferos, las aves y, en general, otros animales pueden tratarse con los peptidos descritos en la presente invencion. Los marnfferos y las aves comprenden, pero no se limitan a, seres humanos, perros, gatos y aves mascotas y ganado de produccion, tales como caballos, reses, ovejas, cabras, cerdos, gallinas y pavos y aves de corral.

Un segundo aspecto preferido incluye el uso de los peptidos de la invencion en el tratamiento de enfermedades infecciosas: infecciones por Klebsiella, Salmonella, Yersinia, Proteus y Colibacilli de animales de comparua y ganado de produccion.

Otro aspecto preferido se refiere al tratamiento del muermo en equidos y melioidosis en carmvoros e infecciones por Pseudomonas aeruginosa en animales de comparua y ganado de produccion. Un aspecto adicional se refiere al tratamiento de infecciones por Bordetella spp., en animales de comparua y ganado de produccion; infecciones por Moraxella spp.; infecciones por Francisella spp., infecciones por Brucella spp., infecciones por Campylobacter spp., infecciones por Pasteurella spp.; infecciones por Actinobacillus spp. (actinobacilosis); infecciones por Haemophilus spp.; infecciones por Streptococcus spp. (entre las que se encuentran mastitis en vacas, moquillo); infecciones por Staphylococcus spp. (entre las que se encuentran mastitis, piodermitis, endometritis); infecciones por Bacillus spp., entre las que se encuentra el antrax; infecciones por Clostridium spp., entre las que se encuentran tetanos, botulismo y antrax sintomatico; infecciones por Listeria spp. (listeriosis); infecciones por Erysipelothrix spp., entre las que se encuentra el erisipeloide; infecciones por Leptospira spp., Serpulina (enteritis necrotica superficial), Treponema spp. (sffilis del conejo), Borrelia spp. en animales de comparua y ganado de produccion.

Eventualmente, las plantas tambien pueden tratarse con los peptidos de la invencion.

La presente invencion tambien se refiere a un peptido que consiste en una secuencia A-B-C-D-C'-B'-A', en donde: la unidad A consiste en 2 aminoacidos, y la unidad A' consiste en 1 aminoacido, ambas unidades B y B' son Cys; cada unidad C consiste independientemente en 5 aminoacidos, seleccionadostanto del grupo (a) de aminoacidos hidrofobicos, como del grupo (b) de aminoacidos basicos o aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno; la unidad D es -Arg-Gly-

en donde:

(i) dichos aminoacidos hidrofobicos se seleccionan de: Ala, Phe, Ileu, Leu, Pro, Tyr, Trp y Val;

(ii) dichos aminoacidos basicos se seleccionan de: Lys, His, Arg;

(iii) dichos aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno se seleccionan de Asn, Gln, Ser, Thr; y en donde la subestructura C-D-C' como un todo contiene de 5 a 9 puntos de alternancia entre

aminoacido del grupo (a) y aminoacido del grupo (b), o viceversa, en donde el peptido esta en la forma dclica por medio de la formacion de un puente disulfuro entre las dos unidades B, y en donde los aminoacidos hidrofobicos son entre 30 y 50 % de la cantidad total de los aminoacidos del peptido, dicho peptido se selecciona de la sec. con num. de ident.: 1-54, y los homologos de cada una de dichas sec. con num. de ident.: 1-54, caracterizados porque dichos homologos estan modificados por solo un aminoacido en cualquier posicion entre la num. 1 y 17, donde dicha modificacion no involucra a los aminoacidos en las posiciones 3, 9, 10, 16, y la modificacion consiste en sustituir un aminoacido con otro aminoacido perteneciente al mismo grupo (a) o (b).

Preferentemente, dicho peptido se selecciona de la sec. con num. de ident.: 1, sec. con num. de ident. 2, sec. con num. de ident. 3.

Diferentes formulaciones farmaceuticas que contienen, colectivamente o individualmente, los peptidos de la invencion pueden prepararse mediante procedimientos descritos en la tecnica y con excipientes conocidos y disponibles con facilidad. Tales formulaciones son parte de la presente invencion.

En el presente documento, el termino "excipiente" significa un compuesto o una mezcla de este optimo para el uso en una formulacion destinada al tratamiento de una enfermedad infecciosa espedfica o afecciones asociadas con ella. Por ejemplo, un excipiente para el uso en una formulacion farmaceutica, generalmente, no debe causar una respuesta adversa en un sujeto. El excipiente, como se describio anteriormente, no debe inhibir significativamente la actividad biologica

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relevante del compuesto activo. Por ejemplo, un excipiente no inhibe significativamente la actividad antimicrobiana de un peptido antimicrobiano de la presente invencion o una variante de este. Un excipiente puede proporcionar simplemente una actividad tamponante para mantener el compuesto activo a un pH adecuado para ejercer su actividad biologica, por ejemplo, tampon salino de fosfato. Alternativamente o ademas, el excipiente puede comprender un compuesto, por ejemplo un inhibidor de proteasas, que aumenta la actividad o la vida media del peptido. En otro ejemplo, el excipiente puede incluir o ser en sf mismo una molecula antimicrobiana adicional y/o una molecula antiinflamatoria.

Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la invencion tambien pueden formularse como soluciones para la administracion oral o como soluciones adecuadas para la administracion parenteral, tal como, por ejemplo, por via intramuscular, subcutanea, intraperitoneal o intravenosa.

Las formulaciones farmaceuticas de los peptidos de la invencion pueden estar ademas en forma de una solucion acuosa, una forma seca o una dispersion, o alternativamente en forma de una emulsion, una suspension, una crema, un balsamo o un unguento.

Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la presente invencion pueden incluirse en suspensiones, soluciones o emulsiones oleosas en vehmulos o en agua y pueden contener agentes de suspension, estabilizantes utiles y/o agentes promotores de la dispersion.

Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la presente invencion pueden formularse en forma de un polvo, obtenido por aislamiento aseptico de un solido esteril o por liofilizacion de una solucion a reconstituir en forma de una solucion con la ayuda de un vehmulo adecuado antes del uso, por ejemplo, agua para preparaciones inyectables.

Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la presente invencion tambien pueden administrarse por medio del tracto respiratorio. Para la administracion por inhalacion o insuflacion, la composicion puede estar en forma de un polvo seco, por ejemplo, una mezcla de polvo del agente terapeutico y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidon.

Colectivamente, o individualmente, los peptidos de la presente invencion pueden administrarse en una solucion acuosa en forma de aerosol o por via de inhalacion.

En toda la descripcion y las reivindicaciones de esta invencion espedfica, las palabras "comprender" y "contener" y las variaciones de las palabras, por ejemplo "comprende" y "contiene", significan "que comprende, pero sin limitarse a", y no pretenden excluir otras fracciones, aditivos, componentes o etapas completas.

En toda la descripcion y las reivindicaciones de esta invencion espedfica, el singular incluye el plural, a menos que el contexto requiera otra cosa. Ademas, en las partes donde se usa el artmulo indefinido, debe entenderse espedficamente como pluralidad y singularidad, a menos que el contexto requiera otra cosa.

Con "individualmente" o "individual" se entiende que la invencion comprende el peptido antimicrobiano o grupos de peptidos antimicrobianos mencionados, y que, aunque puede ser que los peptidos individuales o grupos de peptidos no se enumeren por separado en este documento, las reivindicaciones que se enumeran mas abajo pueden definir tales peptidos o grupos de peptidos de una manera divisible y por separado unos de otros.

Con "colectivamente" o "colectivo" se entiende que la invencion incluye cualquier cantidad o combinacion de peptidos antimicrobianos o grupos de peptidos antimicrobianos mencionados, y que, con la comprension de que tales cantidades o combinaciones de peptidos o grupos de peptidos no pueden mencionarse espedficamente en el presente documento, las reivindicaciones que se enumeran mas abajo pueden definir tales combinaciones o subcombinaciones por separado y de una manera divisible de cualquier otra combinacion de peptidos o grupos de peptidos.

La presente invencion se describira en mas detalle en los siguientes ejemplos no limitantes.

Parte experimental

Ejemplo 1: Smtesis de peptidos

Metodo

La smtesis de los peptidos se realizo por la compama SelleckChem, a traves de su socio en los Estados Unidos. La smtesis se llevo a cabo mediante tecnicas conocidas en la tecnica y espedficamente mediante smtesis en fase solida.

Resultados

Se sintetizaron 100 peptidos, que tienen una longitud de 17 aminoacidos y un grado de pureza comprendido entre 78 y 90 %. Los peptidos se entregaron en una placa de 96 pocillos que contiene 2-5 mg de peptido liofilizado + 4 frascos criogenicos que contienen los 4 peptidos restantes. El informe tecnico adjunto a los peptidos no destaco problemas durante la smtesis. En la Figura 1 se representa esquematicamente la estructura de los peptidos.

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Ejemplo 2: Ensayo de permeabilizacion de la membrana con el uso de la cepa bacteriana E. coli ML-35pYC Metodos:

La cepa ML-35pYC de E. coli se uso para el ensayo de la cinetica de permeabilizacion de la membrana realizado con los peptidos de la invencion. Esta cepa bacteriana expresa resistencia a ampicilina, expresion constitutiva de beta- galactosidasa citoplasmatica, y se encuentra modificada geneticamente con un plasmido para la smtesis de una beta- lactamasa periplasmatica. Se anadieron sesenta microlitros (60 pl) de suspension bacteriana de la cepa ML-35pYC de E. coli a 60 pl de una solucion a 15 mM de ONPG o 1,5 mM de CENTA en tampon fosfato. Posteriormente, se anadieron 120 pl de los peptidos de prueba para obtener una concentracion final de 12,5 pg/ml. La cinetica de la reaccion se evaluo mediante el registro del valor de absorbancia a 600 nm y 405 nm, para ONPG y CENTA respectivamente, cada 10 min hasta un maximo de 240 min.

Resultados

En las Figuras 2A y 2B se informan las curvas de permeabilizacion con relacion a los 3 peptidos probados. Cuando los valores de absorbancia obtenidos con el ensayo con el uso de CENTA u ONPG se representan en un grafico en funcion del tiempo, es posible destacar dos comportamientos distintos.

Mediante el "ajuste" de los puntos experimentales con la curva logfstica de 4 parametros, fue posible determinar el punto de inflexion, es decir el punto donde la curva cambia de direccion, con relacion a los 3 peptidos de prueba. No se observo punto de inflexion durante el ensayo con CENTA (punto de inflexion mayor que 500 min). El ensayo con ONPG pone de manifiesto una meseta de absorbancia despues de 40 min, y un punto de inflexion a 7,86 y 16,08 min, respectivamente para los peptidos P72 y P2041, mientras que el peptido 126 muestra una tendencia lineal en toda la duracion del experimento.

Tabla 1: Punto de inflexion obtenido mediante el ajuste de los puntos experimentales con la curva logfstica de 4 parametros.

Peptido

Punto de inflexion

CENTA

ONPG

72

>500 min 7,86 min

126

>500 min >500 min

2041

>500 min 16,08 min

Ejemplo 3 Determinacion del espectro de actividad y la eficacia de peptidos antimicrobianos en bacterias Gram negativas

Este ejemplo demuestra el espectro de actividad y la eficacia de los peptidos probados contra Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637. Se determinaron las LD90 para cada peptido y para cada cepa probada.

Metodos:

a) Preparacion del inoculo bacteriano

Por cada cepa bacteriana, se extrajeron 3-5 colonias morfologicamente similares de cultivos frescos, se inocularon en medio lfquido de caldo de infusion cerebro corazon y se incubaron a la temperatura de 37 °C con agitacion a 225 r.p.m. durante 3-4 h. Posteriormente, la suspension bacteriana se centrifugo a 1 000 g durante 20 min y el sedimento asf obtenido se resuspendio en tampon fosfato 10 mM. La turbidez se midio en un espectrofotometro con absorbancia a 600 nm, equivalente en el intervalo de 0,08-0,13 a una concentracion de aproximadamente 108 UFC/ml. La suspension bacteriana se diluyo 1:100 en tampon fosfato 10 mM, y dentro de 30 min se inocularon 50 microlitros de la suspension bacteriana (106 UFC/ml) en cada pocillo de la placa de microtitulacion, para obtener una concentracion bacteriana final de aproximadamente 5 x 105 UFC/ml.

b) Microdilucion seriada

Varios peptidos se probaron en cuanto a su capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano en cultivo lfquido. Se anadieron cincuenta microlitros de peptido a una concentracion comprendida entre aproximadamente 0,2 mM y 50 mM en placas de 96 pocillos de fondo en U que contienen medio de cultivo lfquido y una de las siguientes bacterias: Escherichia coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853, Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637. Despues de 2 horas de incubacion a 37

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°C, las bacterias se transfirieron a un medio solido. Como control de crecimiento, los cultivos bacterianos se cultivaron en ausencia de peptidos.

c) Transferencia a agar

La suspension bacteriana se puso en contacto durante dos horas con diferentes concentraciones del peptido a la temperatura de 37 °C. Despues de la incubacion, se extrajeron 20 jl de los pocillos de cada dilucion y se sembraron en medio solido, agar McConkey. El inoculo se distribuyo uniformemente en el medio con agar por medio de un asa esteril desechable. Despues de la incubacion durante 24 h a la temperatura de 37 °C, se realizo el recuento de las colonias bacterianas (UFC).

Resultados

En la tabla 2, se expresan los valores de LDgo para los diferentes peptidos. Los peptidos 72, 126 y 2041 resultaron ser activos contra E. coli con un valor de LDgo de 1,69 pg/ml (0,86 jM), 1,86 pg/ml (0,91 jM), 1,57 pg/ml (0,83 jM), respectivamente. Con relacion a P. aeruginosa, el peptido 126 resulta ser el mas eficiente con un valor de LDg0 igual a 0,20 jM (0,4 jg/ml), seguido del peptido 72 con un valor de LDg0 igual a 0,87 jM (1,61 pg/ml). Con relacion a Stenotrophomonas maltophilia, el peptido 72 resulta ser el mas eficiente con un valor de LDg0 de 1,88 jM (3,42 pg/ml) seguido del peptido 2041 con una LDg0 de 2,67 pM.

Tabla 2A Actividad antimicrobiana. Valores de LDg0 obtenidos mediante la prueba de microdilucion en caldo de cultivo y posterior siembra en placa con agar.

Bacterias Gram Negativas:

E. Coli P. aeruginosa S. maltophilia

ATCC 25022 ATCC 27853 ATCC 13637

P72

0,86 jM 0,87 jM 1,88 jM

P126

0^1 jM 0,20 jM 6,65 jM

P2041

0,83 jM 2,14 jM 2,67 jM

Pruebas adicionales, realizadas a los peptidos de acuerdo con la invencion, proporcionaron los siguientes resultados de actividad antibacteriana (MBC jg/ml).

Tabla 2b Actividad antimicrobiana. Valores de MBC (jg/ml), obtenidos mediante la prueba de la Tabla 2a. Actividad antimicrobiana. Valores de MBC (jg/ml) obtenidos mediante la prueba de microdilucion en caldo de cultivo y posterior siembra en placa con agar.

Bacterias Gram Negativas:

E,coli ATCC 25922* P, aeruginosa ATCC 27853

Sec, con num, de ident.: 1

3,05 2,08

Sec, con num, de ident.: 2

g,68 2,84

Sec, con num, de ident.: 3

12,5 4,53

Sec, con num, de ident.: 4

17,37 1,14

Sec, con num, de ident.: 5

1,08 1,0g

Sec, con num, de ident.:22

11,72 1,08

Sec, con num, de ident.: 8

g,26 1,81

Sec, con num, de ident.: 7

7,81 3,4

Sec, con num, de ident.: 6

1,81 0,4

Sec, con num, de ident.: 0

7,56 2,57

Sec, con num, de ident.: 10

24,6 12,08

Las secuencias de referencia, que contienen menos de 5 puntos de alternancia entre los aminoacidos del grupo (a) y (b) en el segmento comprendido entre las dos cistemas (C),

P14: AKCRPLHTRGKQSAVCV

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P127: FFCGNKRWRGNYQGSCK P195: ANCWTRKIRGWGVSCG

probadas en las mismas condiciones, resultaron inactivas.

Ejemplo 4: Determinacion del espectro de actividad y la eficacia de peptidos antimicrobianos en bacterias Gram positivas

Este ejemplo demuestra el espectro de actividad y la eficacia de algunos peptidos antimicrobianos contra cepas de S. aureus tanto sensibles a meticilina como resistentes a meticilina (MRSA). Se determino la LD90 para cada peptido y para cada cepa.

Metodos:

a) Preparacion del inoculo bacteriano

Por cada cepa bacteriana, se extrajeron 3-5 colonias morfologicamente similares de cultivos frescos, se inocularon en medio lfquido de caldo de infusion cerebro corazon y se incubaron a la temperatura de 37 °C con agitacion a 225 r.p.m. durante 3-4 h. Posteriormente, la suspension bacteriana se centrifugo a 1 000 g durante 20 min y el sedimento asf obtenido se resuspendio en tampon fosfato 10 mM. La turbidez se midio en un espectrofotometro con absorbancia a 600 nm, equivalente en el intervalo de 0,08-0,13 a una concentracion de aproximadamente 108 UFC/ml. La suspension bacteriana se diluyo 1:100 en tampon fosfato 10 mM, y dentro de 30 min, se inocularon 50 microlitros de la suspension bacteriana (106 UFC/ml) en cada pocillo de la placa de microtitulacion, para obtener una concentracion bacteriana final de aproximadamente 5x105 UFC/ml.

b) Microdilucion seriada

Varios peptidos sinteticos se probaron en cuanto a su capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano. Se anadieron cincuenta microlitros de peptido a una concentracion comprendida entre aproximadamente 0,2 mM y aproximadamente 50 mM a placas de 96 pocillos de fondo en U que contienen tampon fosfato y una de las siguientes bacterias: S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 43300 resistente a meticilina. Despues de 2 horas de incubacion a 37 °C, las bacterias se transfirieron a un medio solido. Como control, los cultivos bacterianos se cultivaron en ausencia de peptido.

c) Transferencia a agar

La suspension bacteriana se puso en contacto durante dos horas con diferentes concentraciones del peptido a la temperatura de 37 °C. Despues de la incubacion, se extrajeron 20 pl de los pocillos de cada dilucion y se sembraron en medio solido, agar Columbia complementado con 5 % de globulos rojos bovinos para bacterias Gram positivas. El inoculo se distribuyo uniformemente en el medio con agar por medio de un asa esteril desechable. Despues de la incubacion durante 24 horas a la temperatura de 37 °C, se realizo el recuento de las colonias bacterianas (UFC).

Resultados

En la Tabla 3, se expresan los valores de LD90 para los diferentes peptidos. Los peptidos 2041 y 72 resultan ser los mas eficientes contra S. aureus ATCC 25923 con un valor de LD90 de 1,42 pM (2,89 pg/ml) y 3,39 pM (6,16 pg/ml), respectivamente. Le sigue el peptido 126, con una LD90 de 4,68 pM (9,54 pg/ml). Particularmente interesantes son los valores de LD90 obtenidos en el caso de S. aureus ATCC 43300 resistente a meticilina. Con relacion al peptido 72 se obtuvo una LD90 igual a 0,90 pM (1,65 pg/ml), mientras que con el peptido 2041 se obtuvo un valor de 0,85 pM (1,72 pg/ml). El peptido 126 tiene una LD90 igual a aproximadamente 71 pM (100 pg/ml).

Tabla 3: Actividad antimicrobiana. Valores de LD90 obtenidos mediante la prueba de microdilucion en caldo de cultivo y posterior siembra en placa con agar.

Bacteria Gram Positiva:

S. aureus ATCC 25923 MRSA ATCC 43300

P72

3,39 pM 0,90 pm

P126

4,68 pM >70 pM

P2041

1,42 pM 0,85 pM

Ejemplo 5 Metodologfa para el ensayo de actividad antimicrobiana de peptidos contra cepas de hongos (levaduras) Metodos:

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El inoculo se establecio mediante el cultivo de Candida albicans ATCC 10231 y Malassezia pachydermatis ATCC 14522 en medio de caldo Czapek-Dox (DIFCO) durante 48-72 h. En el dfa del ensayo, el cultivo fungico se centrifugo a 1 700 x g durante 15 min, el sedimento se resuspendio en tampon fosfato y se sometio a agitacion mediante el uso de un agitador de vortice electrico para dispersar los agregados de celulas fungicas. La suspension se diluyo hasta alcanzar una densidad optica igual a una opacidad de 0,5 en la escala turbidimetrica de McFarland, que contiene aproximadamente 1-5 x 106 celulas/ml (Branda J.A., Krantz A. Effectc of yeast on automated cell counting. Am J Clin Pathol., 2006:126, 248-254).

a) Microdilucion seriada

Los peptidos se probaron en cuanto a su capacidad de inhibir el crecimiento fungico. Se anadieron cincuenta microlitros de peptido a una concentracion comprendida entre aproximadamente 0,2 mM y aproximadamente 50 mM en placas de 96 pocillos de fondo en U que contienen tampon fosfato y uno de los siguientes hongos: Candida albicans ATCc 10231 y Malassezia pachydermatis ATCC 14522. Despues de 2 h de incubacion a 37 °C, los hongos se transfirieron al medio solido agar Sabouraud. Como control, los cultivos fungicos se cultivaron en ausencia de peptido.

b) Transferencia a agar

La suspension fungica se puso en contacto durante dos horas con diferentes concentraciones del peptido a latemperatura de 37 °C. Despues de la incubacion, se extrajeron 20 pl de los pocillos de cada dilucion y se sembraron en el medio solido agar Sabouraud. El inoculo se distribuyo uniformemente en el medio con agar por medio de un asa esteril desechable. Despues de la incubacion durante 24 h a la temperatura de 37 °C, se realizo el recuento de las colonias fungicas (UFC).

Resultados

En la tabla 4, se expresan los valores de LD90 para los diferentes peptidos. El peptido 72 resulto ser el mas eficiente contra ambas especies fungicas probadas. En particular, contra Candida albicans se obtuvo un valor de 1,03 pM (1,87 pg/ml), mientras que contra Malassezia spp. se obtuvo 0,68 pM (1,24 pg/ml). Para el peptido 126 las LD90 variaron entre un mmimo de 0,75 pM y un maximo de aproximadamente 2 pM para ambas especies fungicas probadas.

Tabla 4: Actividad antimicrobiana. Valores de LD90 obtenidos mediante la prueba de microdilucion en caldo de cultivo y posterior siembra en placa con agar.

Hongos (levaduras)

Candida albicans Malassezia pachydermatis

P72

1,03 pM 0,68 pM

P126

1,98 pM 0,75 pM

P2041

1,42 pM 0,85 pM

Ejemplo 6: Citotoxicidad de los peptidos antimicrobianos

Este ejemplo evalua la citotoxicidad de peptidos antibacterianos mediante la observacion y cuantificacion de la hemolisis de globulos rojos (RBC) de carnero o la presencia de celulas intensamente coloreadas con la tincion de viabilidad azul Tripan, en presencia y en ausencia de peptido.

Metodos:

(a) Prueba de hemolisis

Los eritrocitos de carnero, extrafdos inmediatamente antes de iniciar la prueba, se lavaron en tampon isotonico hasta que el sobrenadante se volvio transparente. Los eritrocitos lavados se incubaron con diferentes concentraciones de peptido durante una hora a temperatura ambiente. Despues de este penodo, los eritrocitos se sedimentaron por centrifugacion. El sobrenadante se recolecto y se analizo a 450 nm para la cuantificacion de la hemolisis. El control positivo consistfa en globulos rojos lisados con la adicion de 0,1 % de Triton. Esta muestra sirvio para la determinacion de la densidad optica maxima. El porcentaje de hemolisis se calculo a partir de la relacion entre la densidad optica de la muestra y la del control positivo a 450 nm.

El valor de MHC10 se calculo como la concentracion minima de peptido que induce 10 % de lisis celular.

(b) Citotoxicidad de peptidos contra celulas Jurkat

La citotoxicidad de los peptidos contra linfocitos T, por ejemplo, celulas Jurkat, se determino mediante la siembra de las celulas a una densidad de aproximadamente 5*105 celulas/ml en presencia y en ausencia de peptidos e incubacion

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durante toda la noche a 37 °C en termostato bajo CO2. Como control negativo de citotoxicidad, se uso un medio carente del peptido de prueba, mientras que, como control positivo de citotoxicidad, se uso un medio que contiene 0,2 % de Triton X-100, para lisar completamente las celulas. La viabilidad celular se determino posteriormente mediante la adicion de 20 |jl de azul Tripan en cada pocillo, y mediante la incubacion de las celulas durante 5 min adicionales a 37 °C. El valor de MCC10 se calculo como la concentracion minima de peptido necesaria para inducir 10 % de citotoxicidad.

Resultados

Los datos que se informan en la Figura 3 muestran la actividad hemolttica de los peptidos probados. Todos los peptidos que tienen menos de 10 % de actividad hemolttica a una concentracion de 40 jM se consideraron no hemolfticos. Los datos de hemolisis de estos peptidos resultaron ser mejores que los de taquiplesina-1, que indujo 15 % de hemolisis de globulos rojos a 40 jM.

Los datos que se presentan en la tabla 5 muestran la citotoxicidad de los peptidos en celulas Jurkat. Todos los peptidos destacaron una citotoxicidad menor que 7 % a 40 jM, y esto confirma su falta de toxicidad contra celulas eucariotas. Los datos obtenidos son evidentemente favorables en comparacion con los obtenidos con taquiplesina-1, que causo la muerte del 10 % de las celulas a una concentracion de 20 jM.

Tabla 5

Concentracion (jg/ml)

100 jg/ml 12,5 jg/ml

P72

6,02 <3%

P126

5,04 <2%

P2041

6,95 <3%

Ejemplo 7: Evaluacion de la actividad antimicrobiana en presencia de diferentes concentraciones de sal

Este ejemplo comprueba la capacidad de los peptidos de ejercer una actividad antimicrobiana en presencia de concentraciones escaladas de NaCl.

Metodos:

a) Microdilucion seriada

Varios peptidos se probaron en cuanto a su capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano en cultivo lfquido. Se anadieron cincuenta microlitros de peptido a una concentracion entre aproximadamente 0,2 mM y 50 mM en placas de 96 pocillos de fondo en U que contienen tampon fosfato 10 mM complementado con NaCl a 125 o 250 mM y una de las siguientes bacterias: Escherichia coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC 27853. Despues de 2 horas de incubacion a 37 °C, las bacterias se transfirieron a un medio solido. Como control de crecimiento, los cultivos bacterianos se cultivaron en ausencia de peptidos.

b) Transferencia a agar

La suspension bacteriana se puso en contacto durante dos horas con diferentes concentraciones del peptido a la temperatura de 37 °C. Despues de la incubacion, se extrajeron 20 jl de los pocillos de cada dilucion y se sembraron en el medio solido agar McConkey para bacterias Gram negativas y agar Columbia complementado con 5 % de globulos rojos bovinos para bacterias Gram positivas. El inoculo se distribuyo uniformemente en el medio con agar por medio de un asa esteril desechable. Despues de la incubacion durante 24 h a la temperatura de 37 °C, se realizo el recuento de las unidades formadoras de colonias (UFC).

Resultados

En la tabla 6A, se informa la actividad antimicrobiana contra E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 en presencia de NaCl 10 mM. La actividad se calculo como el porcentaje de inhibicion del crecimiento de UFC: para cada peptido se evaluo la cantidad de inhibicion a la concentracion de 100 y 12,5 pg/ml.

A NaCl 10 mM, los resultados concuerdan con los ya obtenidos anteriormente con la prueba descrita en el ejemplo 3.

Tabla 6A Actividad antimicrobiana (porcentaje en comparacion con el control) contra E. coli, Pseudomonas aeruginosa en presencia de NaCl 10 mM.

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10 mM

E. Coli P. aeruginosa

^Peptido

100 pg/ml* 12,5 pg/ml 100 pg/ml 12,5 pg/ml

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2041

100 100 100 100

*concentracion probada del peptido

Tabla 6B. Actividad antimicrobiana contra E. coli, P. aeruginosa en presencia de NaCI 125 mM.

125 mM

E. Coli P. aeruginosa

^Peptido

100 12.5 100 12.5

72

99.42 70.59 100 100

126

100 98.64 99.9 97.1

2041

100 99.95 100 100

En la tabla 6B, se informan los datos de actividad con NaCl 125 mM. A esta concentracion de sal, el peptido 2041 y el peptido 126 demuestran mantener completamente su actividad antimicrobiana para las dos bacterias Gram negativas. El peptido 72 resulta ser igualmente eficiente a ambas concentraciones para P. aeruginosa ATCC 27853.

Tabla 6C. Actividad antimicrobiana contra E. coli, P. aeruginosa en presencia de NaCl 250 mM.

250 mM

E, Coli P, aeruginosa

^Peptido

100 12,5 100 12,5

72

44,64 25,8 80,5 64,28

126

90,6 86,7 98,1 85,2

2041

99,51 67,72 99,83 98,39

En la Tabla 6C, se informan los datos de actividad con NaCl 250 mM. Aunque en estas condiciones extremas (concentracion que se alcanza solamente en ciertas zonas patologicas tales como por ejemplo fluido pulmonar con fibrosis qmstica) los diferentes peptidos probados aun retienen una actividad antibacteriana buena/discreta; particularmente interesante es el peptido 2041 que mantiene una actividad excelente contra P. aeruginosa ATCC 27853 a ambas concentraciones probadas. Tambien es de interes la actividad antibacteriana mayor que 85 % del peptido 126 a la concentracion de 12,5 pg/ml.

En experimentos adicionales, se probo la resistencia a la sal de los peptidos P944 y P1188, que contienen un aminoacido no lipofilo en la posicion 11. Ambos, si bien tienen una actividad antibacteriana basal muy buena, mostraron una reduccion muy fuerte de la misma en presencia de concentraciones crecientes de sal. Los porcentajes de inhibicion del crecimiento en dependencia de la concentracion de sal presente son los siguientes.

E. Coli

(i) NaCl 10 mM

P944 100 pg/ml: 99.5 P944 12,5 pg/ml:95 %

P1188 100 pg/ml: 100.

P1188 12,5 pg/ml:95,3 %

(ii) NaCl 125 mM P944 100 pg/ml: 38,6 %

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Lys*Asn*Cys*Ile*Lys*Tyr*His*Tyr*Arg*Gly*Ile*Asn*Tyr*Arg*Ser*C

ys*Gly*

Sec. con num. de ident.:17 Lys*Lys*Cys*Gly*Ala*Phe*Thr*Tyr*Arg*Gly*Val*His*Tyr*Arg*Lys*Cys*Val* Sec. con num. de ident.: 18

Ala*Val*Cys*GIy*Lys*Phe*His*Trp*Arg*Gly*Val*Lys*Tyr*Arg*Ile*C

ys*Lys*

Sec. con num. de ident.: 19

Ala*Lys*Cys*Lys*Ser*Phe*Tyr*Tyr*Arg*Gly*Lys*Trp*Phe*Gly*Lys*

Cys*Tyr*

Sec. con num. de ident.:20

Lys*Trp*Cys*Arg*Val*Phe*His*Tyr*Arg*Gly*Asn*Lys*Trp*Lys*Leu

*Cys*Tyr*

Sec. con num. de ident.:21

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Sec. con num. de ident.:22

Arg*Asn*Cys*Leu*Lys*Trp*Thr*Trp*Arg*Gly*Ile*Thr*Tyr*Leu*Lys*

Cys*Lys*

Sec. con num. de ident.:23

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Sec. con num. de ident.:24

Lys*Lys*Cys*Ala*Leu*Trp*Lys*Phe*Arg*Gly*His*Lys*Trp'f'Val*a*rg

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Sec. con num. de ident.:25

Leu*Leu*Cys*Leu*Lys*Trp*Lys*Tyr*Arg*Gly*His*Thr*'iyr*Arg*Gly

*Cys*Leu*

Sec. con num. de ident.:26

Leu*Lys*Cys*Ile*Gly*Trp*Thr*Tyr*Arg*Gly*His*Lys*Trp*Arg*Ser*

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Sec. con num. de ident.:37

Leu*Lys*Cys*Lys*Val*Tyr*Arg*Phe*Arg*Gly*Ite*Arg*Tyr*Gly*Lys*

Cys*Leu*

Sec. con num. de ident.:38

Ala*Phe*Cys*Ala*Lys*Tyr*Arg*Phe*Arg*Gly*Lys*Arg*Tyr*Val*Gly*

Cys*Ala*

Sec. con num. de ident.:39

Lys*Asn*Cys*Phe*Lys*Trp*Thr*Tyr*Arg*Gly*His*Tyr*Trp*Lys*Ser*

Cys*Ala*

Sec. con num. de ident.:40

Lys*Leu*Cys*Lys*Leu*Tyr*Thr*Tyr*Arg*Gly*Lys*Tyr*Trp*Gly*Lys*

Cys*Lys*

Sec. con num. de ident.:41

Ala*Lys*Cys*Ala*Arg*Tyr*Asn*Tyr*Arg*Gly*Lys*Lys*Trp*Leu’tLys*

Cys*Arg*

Sec. con num. de ident.:42

Phe*Gly*Cys*Arg*Lys*Phe*Tyr*Trp*Arg*Gly*Val*Lys*Trp*Lys*Val*

Cys*Ala*

Sec. con num. de ident.:43

Gly*Ile*Cys*Lys*Thr*Trp*Asn*Tyr*Arg*Gly*Lys*Lys*Tyr*Lys*Ile*C

ys*Leu*

Sec. con num. de ident.:44

Arg*Asn*Cys*Ala*Phe*Trp*Lys*Trp*Arg*Gl\r*Lys*Ser*Tyr*Ala*Leu*

Cys*Lys*

Sec. con num. de ident.:45

Lys*Ile*Cys*Ala*Lys*Tyr*Asn*Trp*Arg*Gly*Lys*Thr*Tyr*Lys*Ile*C

ys*Leu*

Sec. con num. de ident.:46

Ala*Ile*Cys*Ala*Arg*Trp*Lys*Trp*Arg*Gly*Ile*Ser*Tyr*Lys*Arg*Cy

s*Arg*

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Sec. con num. de ident.:47

Ile*Phe*Cys*Trp*Gly*Tyr*Lys*Phe*Arg*Gly*Val*His*Tyr*Lys*Ala*C

vs*Arg*

Sec. con num. de ident.:48

Lys*Thr*Cys*Ala*Lys*Trp*Ser*Tyr*Arg*Gly*Val*a*snTyr*Gly*Arg*

Cys*Arg*

Sec. con num. de ident.:49

Ala*Lys*Cys*Ser*Val*Tyr*Thr*Trp*Arg*Gly*Asn*Lys*Trp*Arg*Thr*

Cys*Lys*

Sec. con num. de ident.:50

lle*Arg*Cys*Ala*Val*Trp*Lys*Tyr*Arg*Gly*Asn*Lys*Tyr*Lys*Thr*C

ys*AIa*

Sec. con num. de ident.:51

Lys*Leu*Cys*Lys*Thr*Trp*Gln*Trp*Arg*Gly*His*Thr*Trp*Arg*Thr

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Sec. con num. de ident.:52

Lys*Ile*Cys*Gly*Lys*Tyr*His*Phe*Arg*Gly*Val*Gln*Tyr*Lys*Ala*C

ys*Lys*

Sec. con num. de ident.:53

Lys*Lys*Cys*Lys*Ala*Tyr*Thr*Phe*Arg*Gly*Val*Tyr*Trp*Lys*Ala*

Cys*Leu*

Sec. con num. de ident.:54

Leu*Lys*Cys*Arg*Thr*Trp*Asn*Trp*Arg*G2y*Lys*Lys*TYr*Ala*Leu

*Cys*Lys*

Listado de secuencias que son parte de la descripcion Sec. con num. de ident.1:

HIS*LYS*CYS*ALA*LYS*ILE*LYS*TRP*ARG*GLY*VAL*HIS*VAL*LYS*TYR

*CYS*ALA

Sec. con num. de ident.2:

LYS*GLY*CYS*ALA*LEU*VAL*LYS*VAL*ARG*GLY*LEU*THR*LEU*LYS*V

AL*CYS*LYS

imagen6

Sec. con num. de ident.10:

Sec. con num. de ident.11:

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Sec. con num. de ident.:27

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Sec. con num. de ident.:35

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CM

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Sec. con num. de ident.:52

Lys*Ne*Cys*Gly*Lys*Tyr*His*Phe*Arg*Gly*Val*Gln*Tyr*Lys*Ala*Cys*Lys*

5 Sec. con num. de ident.:53

Lys*Lys*Cys*Lys*Ala*Tyr*Thr*Phe*Arg*Gly*Val*Tyr*Trp*Lys*Ala*Cys*Leu*

Sec. con num. de ident.:54

1°

Leu*Lys*Cys*Arg*Thr*Trp*Asn*Trp*Arg*Gly*Lys*Lys*Tyr*Ala*Leu*Cys*Ly

s*

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Claims (15)

1. 5

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   Reivindicaciones

   1. Peptido que consiste en una secuencia A-B-C-D-C'-B'-A', en donde: la unidad A consiste en 2 aminoacidos, y la unidad A' consiste en 1 aminoacido, ambas unidades B y B' son Cys, cada unidad C consiste independientemente en 5 aminoacidos, seleccionados tanto del grupo (a) de aminoacidos hidrofobicos, como del grupo (b) de aminoacidos basicos o aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno; la unidad D es -Arg-Gly-,

   en donde:

   (i) dichos aminoacidos hidrofobicos se seleccionan de: Ala, Phe, Ileu, Leu, Pro, Tyr, Trp y Val;

   (ii) dichos aminoacidos basicos se seleccionan de: Lys, His, Arg;

   (iii) dichos aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno se seleccionan de Asn, Gln, Ser, Thr;

   y en donde la subestructura C-D-C' como un todo contiene de 5 a 9 puntos de alternancia entre aminoacido del grupo (a) y aminoacido del grupo (b), o viceversa,

   en donde el peptido esta en la forma dclica por medio de la formacion de un puente disulfuro entre las dos unidades B, y

   en donde los aminoacidos hidrofobicos son entre 30 y 50 % de la cantidad total de aminoacidos del peptido, dicho peptido es para el uso en el tratamiento de infecciones del cuerpo humano o animal causadas por bacterias, hongos y/o levaduras.
2. 2. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde los aminoacidos hidrofobicos son entre 35 y 45 % de la cantidad total de los aminoacidos del peptido.
3. 3. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde al menos una de las unidades C y C' comprende Lys.
4. 4. Peptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde ambas unidades C y C' comprenden Lys.
5. 5. Peptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el aminoacido adyacente a Gly de la unidad D es un aminoacido hidrofobico.
6. 6. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el aminoacido adyacente a Gly de la unidad D es un aminoacido aromatico hidrofobico.
7. 7. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde al menos una de las unidades C y C' comprende Lys, y todos los aminoacidos en las posiciones 6, 8, 13 (numeradas de A a A') pertenecen a dicho grupo (i) de aminoacidos hidrofobicos.
8. 8. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el aminoacido en la posicion 11 tambien pertenece a dicho grupo (i) de aminoacidos hidrofobicos.
9. 9. Peptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde las unidades A y A' comprenden, independientemente entre sf, uno o mas aminoacidos seleccionados de His, Lys, Gly, Tyr, Ala, Val.
10. 10. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, seleccionado de las sec. con num. de ident.: 1-54 y homologos de cada una de dichas sec. con num. de ident.: 1-54, caracterizados porque dichos homologos estan modificados por solo un aminoacido en cualquier posicion entre la num. 1 y 17, donde dicha modificacion no involucra a los aminoacidos en las posiciones 3, 9, 10, 16, y la modificacion consiste en sustituir un aminoacido con otro aminoacido perteneciente al mismo grupo (a) o (b).
11. 11. Peptido para el uso de acuerdo con la reivindicacion 10, seleccionado de la sec. con num. de ident.: 1, sec. con num. de ident. 2, sec. con num. de ident. 3.
12. 12. Peptido para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el tratamiento de infecciones de uno o mas de Staphylococcus spp., por ejemplo, Staphylococcus aureus (por ejemplo, Staphylococcus aureus ATCC 25923), Enterococcus spp., por ejemplo, Enterococcus faecalis; Pseudomonas spp., por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; Mycobacterium spp., por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis; Enterobacter spp.; Campylobacter spp.;. Salmonella spp.; Streptococcus spp., por ejemplo Streptococcus grupo A o B, Streptoccocus pneumoniae, Helicobacter spp., por ejemplo Helicobacter pylori;. Neisseria spp., por ejemplo Neisseria gonorrea, Neisseria meningitidis;. Borrelia burgdorferi, Shigella spp., por ejemplo, Shigella flexneri; Escherichia coli (ATCC 25922);. Haemophilus spp. por ejemplo, Haemophilus influenzae; Francisella tularensis, Bacillus spp., por ejemplo, Bacillus anthracis; Clostridia spp., Clostridium botulinum, Yersinia spp., por ejemplo, Yersinia pestis; Treponema spp.; Burkholderia spp.; por ejemplo, Burkholderia cepacia, B. mallei y B pseudomallei; Stenotrophomonas spp., por ejemplo, Stenotrophomonas maltophilia; Candida spp. (por ejemplo C. albicans), Epidermophyton spp., Exophiala spp., Microsporum spp., Trichophyton spp. (por ejemplo T. rubrum y T.

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    interdigitale), Tinea spp., Aspergillus spp., Blastomyces spp., Blastoschizomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp. (por ejemplo Cryptococcus neoformans), Histoplasma spp., Paracoccidiomyces spp., Sporotrix spp., Absidz spp., Cladophialophora spp., Fonsecaea spp., Phialophora spp., Lacazia spp., Ari rographis spp., Acremonium spp., Actinomadura spp., Apophysomyces spp., Emmonsia spp., Basidiobolus spp., Beauveria spp., Chrysosporium spp., Conidiobolus spp., Cunninghamella spp., Fusarium spp., Geotrichum spp., Graphium spp., Leptosphaeria spp., Malassezia spp., (por ejemplo Malassezia furfur), Mucor spp., Neotestudina spp., Nocardia spp., Nocardiopsis spp., Paecilomyces spp., Phomaspp., Piedraia spp., Pneumocystis spp., Pseudallescheria spp., Pyrenochaeta spp., Rhizomucorspp., Rhizopus spp., Rhodotorula spp., Saccharorra ces spp., Scedosporium spp., Scopulariopsis spp., Sporobolomyces spp., Syncephalastrum spp., Trichoderma spp., Trichosporon spp., Ulocladium spp., Ustilago spp., Verticillium spp., Wangiella spp..
13. 13. Peptido que consiste en una secuencia A-B-C-D-C'-B'-A', en donde: la unidad A consiste en 2 aminoacidos, y la unidad A' consiste en 1 aminoacido, ambas unidades B y B' son Cys; cada unidad C consiste independientemente en 5 aminoacidos, seleccionados tanto del grupo (a) de aminoacidos hidrofobicos, como del grupo (b) de aminoacidos basicos o aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno; la unidad D es -Arg-Gly-,

    en donde:

    (i) dichos aminoacidos hidrofobicos se seleccionan de: Ala, Phe, Ileu, Leu, Pro, Tyr, Trp y Val;

    (ii) dichos aminoacidos basicos se seleccionan de: Lys, His, Arg;

    (iii) dichos aminoacidos formadores de enlaces de hidrogeno se seleccionan de Asn, Gln, Ser, Thr;

    y en donde la subestructura C-D-C' como un todo contiene de 5 a 9 puntos de alternancia entre aminoacido del grupo (a) y aminoacido del grupo (b), o viceversa,

    en donde el peptido esta en la forma dclica por medio de la formacion de un puente disulfuro entre las dos unidades B, y

    en donde los aminoacidos hidrofobicos son entre 30 y 50 % de la cantidad total de aminoacidos del peptido, dicho peptido se selecciona de las sec. con num. de ident.: 1-54, y los homologos de cada una de dichas sec. con num. de ident.: 1-54, caracterizados porque dichos homologos estan modificados por solo un aminoacido en cualquier posicion entre la num. 1 y 17, donde dicha modificacion no involucra a los aminoacidos en las posiciones 3, 9, 10, 16, y la modificacion consiste en sustituir un aminoacido con otro aminoacido perteneciente al mismo grupo (a) o (b).
14. 14. Peptido de acuerdo con la reivindicacion 13, seleccionado de la sec. con num. de ident.: 1, sec. con num. de ident. 2, sec. con num. de ident. 3.
15. 15. Composicion farmaceutica para el uso en seres humanos o animales, que comprende uno o mas peptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.