ES2685332T3

ES2685332T3 - Medición de autoanticuerpos en condiciones de baja conductividad

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Publication number: ES2685332T3
Application number: ES12820994.7T
Authority: ES
Inventors: Alfred Weber; Andrea ENGELMAIER; Hans-Peter Schwarz
Original assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Current assignee: Baxalta GmbH; Baxalta Inc
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2018-10-08
Anticipated expiration: 2032-12-13
Also published as: JP6333731B2; DK2791675T3; US9075069B2; PT2791675T; PL2791675T3; EP2791675B1; KR20140104479A; AU2012321074B2; AR089233A1; JP2015500502A; WO2013090636A1; HUE038441T2; AU2012321074A1; US20130149700A1; HRP20181118T1; TW201339578A; EP2791675A1

Abstract

Un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra biológica, siendo dicho autoanticuerpo específico para un antígeno diana, comprendiendo el método las etapas de: (a) poner en contacto la muestra biológica en una condición de baja conductividad con el antígeno diana por el que el autoanticuerpo tiene afinidad de unión específica; y (b) detectar la unión de dicho antígeno diana a dicho autoanticuerpo en la muestra biológica, en el que dicho antígeno diana se inmoviliza en una fase sólida y la presencia de dicha unión es indicativa del autoanticuerpo en la muestra biológica, y en el que la condición de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM.

Description

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DESCRIPCION

Medición de autoanticuerpos en condiciones de baja conductividad Antecedentes de la invención

El papel de los autoanticuerpos en enfermedades es objeto de intensa investigación. Los autoanticuerpos forman un repertorio variado con capacidad para seleccionar como diana autoantígenos de anticuerpo, ácido nucleico o peptídicos. Estos autoanticuerpos pueden ser monovalentes o polirreactivos, y pueden presentar afinidades y avideces variables; las constantes de disociación pueden oscilar entre 10"5 y 10"8 M. Aunque los autoanticuerpos están ampliamente implicados en enfermedades autoinmunitarias, un subconjunto de autoanticuerpos también desempeña un papel no patológico en el mantenimiento de la homeostasia inmunológica y un sistema inmunitario que funciona apropiadamente. Hay cada vez más evidencias de que los autoanticuerpos son esenciales para la supervivencia y/o el desarrollo de linfocitos T y B en el sistema inmunitario periférico, la defensa contra infecciones microbianas, la supresión de la inflamación, la mediación de la eferocitosis, la inmunomodulación antiidiopática y la regulación de la producción de citocinas. Véanse Elkon et al. (2008) Nat Clin Pract Rheumatol 4(9): 491-498; Silverman et al. (2009) Discovery Medicine 8(42): 151-156; y Lacroix-Desmazes S. et al., (1998): J Immunol Methods 216, 117-137.

La detección de autoanticuerpos en pacientes que se sospecha que padecen o a los que se les ha diagnosticado una enfermedad autoinmunitaria tiene utilidad significativa en la investigación o en el contexto clínico. Los autoanticuerpos pueden servir como marcador o indicador de diagnóstico de la progresión de una enfermedad. Por ejemplo, niveles crecientes de anticuerpos anti-ADNbc en LES (lupus eritematoso sistémico) se correlacionan con un aumento de la actividad de una enfermedad y, en ocasiones, preceden a la recaída clínica en pacientes. En la bibliografía, se han relacionado numerosos autoanticuerpos con diversos trastornos. Véase, Watts et al. (2002) Medicine 30(10): 2-6. Algunos ejemplos incluyen anticuerpo anti-amiloide-p en la enfermedad de Alzheimer; anticuerpo anti-tiroglobulina en la tiroiditis; anticuerpo anti-tubulina en trastornos hepáticos autoinmunitarios, pérdida de audición autoinmunitaria y tiroidopatías autoinmunitarias; factores reumatoides en la artritis reumatoide; y anticuerpo (Ac) anti-ADNbc en el LES.

La medición de autoanticuerpos también es útil con fines terapéuticos, especialmente con la llegada de la terapia con inmunoglobulinas intravenosas (IGIV) para un número cada vez mayor de enfermedades autoinmunitarias. Los ejemplos incluyen, sin exclusión, púrpura trombocitopénica inmunitaria, enfermedad de Kawasaki, síndrome de Guillain-Barré, polimiositis/dermatomiositis, vasculitis y lupus eritematoso sistémico (LES). Véase, Yaniv et al., (septiembre de 2000) "Intravenous Inmunoglobuline (IVlG) in Autoimmune Diseases Expanding Indications and Increasing Specificity" Research Report de la American Autoimmune Related Diseases Association, Inc. La terapia con IGIV también ha resultado ser eficaz en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los estudios han demostrado el papel de los autoanticuerpos anti-Ap en facilitar el aclaramiento de agregados de Ap y la disminución de Ap sérico en el LCR (líquido cefalorraquídeo), que a su vez reducen el depósito del péptido Ap cerebral y el deterioro cognitivo. Véase, Szabo et al., (2008) Autoimmuity Reviews 7: 415-420.

Sin embargo, los resultados de un ensayo de autoanticuerpos son únicamente tan útiles como la calidad de los datos que produce. Los métodos de inmunodetección convencionales, tales como el ensayo de Farr, IFA (ensayos de inmunofluorescencia) con Crithidia y ELISA llegan a un compromiso entre la especificidad y la sensibilidad, y tienen sus respectivas limitaciones. Véase, Hughes et al. (2006) CLI 18(7):12-17. Los ensayos de Farr, por ejemplo, hacen precipitar complejos inmunitarios de ADNbc/Ac anti-ADNbc a concentraciones salinas altas en sulfato de amonio, lo cual hace que los complejos de baja avidez de ADNbc/anticuerpos anti-ADNbc se disocien y, por tanto, se limita la detección de autoanticuerpos con una avidez relativamente alta. Este resultado supone un revés, ya que los autoanticuerpos son sumamente heterogéneos con respecto a su avidez y los que tienen avidez de moderada a baja también pueden tener importancia clínica, tal como se observa en la enfermedad de Alzheimer (EA), en la que se unen autoanticuerpos IgG al epítopo en monómeros de beta-amiloide (Ap) y se agregan con avidez moderada. Véase, Szabo et al., (2010) Journal of Neuroinmunology 227: 167-174. Además, los ensayos de Farr emplean un radiomarcador y son tanto laboriosos como costosos. El IFA con Crithidia, aunque es capaz de detectar autoanticuerpos con una avidez de moderada a alta, requiere bastante tiempo y es bastante subjetivo debido a su dependencia de la puntuación del portaobjetos. Los ensayos ELISA generalmente son más sensibles y propensos a la automatización y, por tanto, suelen ser el ensayo de elección.

Los métodos de ELISA convencionales no carecen de inconvenientes. Generalmente son menos específicos que otros métodos tales como la inmunoprecipitación y la inmunoelectroforesis, y adolecen de multitud de problemas tal como se documenta en la bibliografía. Como un buen ejemplo de esto, los métodos de ELISA convencionales han proporcionado estimaciones extremadamente dispares sobre los títulos relativos de autoanticuerpos anti-Ap en pacientes con EA frente a controles normales de edad avanzada. Estudios iniciales de muestras de plasma intactas mediante métodos de ELISA convencionales atribuían títulos más bajos de anticuerpos endógenos contra monómeros de Ap a pacientes con EA que a controles sin demencia de edad correspondiente (Weksler et al., Exp Gerontol., 37:943-948 (2002)). Estudios posteriores notificaron títulos iguales o aumentados de anticuerpos anti- monómeros de Ap circulantes en pacientes con EA (Mruthinti et al., Neurobiol Aging, 25:1023-1032 (2004))

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basándose en ELISA realizados con inmunoglobulina plasmática eluida de columnas de proteína G a pH bajo (Akerstrom et al., J Biol Chem., 261:10240-10247 (1986)). Se planteó la hipótesis de que títulos más altos obtenidos mediante este método reflejan la presencia de un conjunto de anticuerpos anti-amiloide unidos que no se detectaron en ensayos de plasma completo y que pueden medirse cuando se liberan del antígeno mediante acidificación durante el transcurso de la purificación con proteínas G.

El plegamiento erróneo y la agregación del Ap es clave para la patogenia de la EA. El repertorio de inmunoglobulinas G (IgG) humanas contiene autoanticuerpos contra el péptido Ap que aumentan en ausencia de vacunación o inmunización pasiva, y tal actividad de los autoanticuerpos anti-Ap se ha detectado en la sangre de adultos normales de diferentes edades y pacientes con EA (Weksler et al., Exp Gerontol., 37:943-948 (2002); Hyman et al., Ann Neurol., 49:808-810.5 (2001); Mruthinti et al., Neurobiol Aging., 25:1023-1032 (2004); Nath et al., Neuromolecular Med., 3:29-39 (2003); Sohn et al., Frontiers in Bioscience., 14:3879-3883 (2009)). El interés en tales autoanticuerpos anti-amiloide-p se ha intensificado con el descubrimiento de que las IGIV humanas que contienen niveles elevados de los autoanticuerpos ejercen efecto terapéutico en pacientes con EA (Dodel et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry., 75:1472-1474 (2004); Hyman et al., Ann Neurol., 49:808-810.5 (2001); Mruthinti et al., Neurobiol Aging., 25:1023-1032 (2004)).

A pesar de los recientes avances en la investigación sobre el Alzheimer, los esfuerzos para medir con exactitud autoanticuerpos anti-amiloide-p han resultado mermados por muchos obstáculos. Uno de los obstáculos es la existencia de múltiples clases de anticuerpos humanos que reconocen neoepítopos lineales, así como conformacionales en formas agregadas de Ap. Los informes hasta la fecha han identificado anticuerpos humanos endógenos contra fibrillas de Ap (O'Nuallain et al., J Immunol., 176:7071-7078 (2006)), oligómeros de Ap (Moir et al., J Biol Chem., 280:17458-17463 (2005); Relkin et al., Alzheimer's and Dementia, 3:s196, X (2008); O'Nuallain et al., Biochemistry, 47:12254-12256 (2008)) y epítopos conformacionales en monómeros de Ap (Baumketner A et al., Prot Sci., 15:420-428 (2006)). Se han notificado otros tipos de anticuerpos que se unen al amiloide e incluso anticuerpos catalíticos contra Ap (Taguchi H et al., J Biol Chem., 284:4714-4722 (2008)).

La medición de autoanticuerpos polirreactivos de baja avidez supone un reto particular debido a la alta unión en segundo plano a pocillos de ELISA vacíos ya la interferencia en el ensayo de otras proteínas y componentes plasmáticos en las muestras de sangre. Véase, Szabo et al. (2010) Journal of Neuroinmunology 227:167-174. Estos problemas deben superarse, ya que una gran proporción de los autoanticuerpos IgG en las IGlV son polirreactivos y de baja avidez.

Se han realizado esfuerzos para mejorar la sensibilidad y la relación señal/ruido de ensayos de autoanticuerpos anti- Ap, incluyendo un ensayo de radioinmunoprecipitación desarrollado por el equipo de investigación de Brettschneider. Véase, Brettschneider et al. (2005) Biol. Psychiatry 57: 813-816. En otro estudio, se realizó un paso previo al ensayo de IGIV por columnas de poliestireno y/o agarosa con la esperanza de reducir los agentes de unión a autoanticuerpo no específicos. Los resultados estuvieron lejos de ser ideales ya que la reducción no fue específica para los autoanticuerpos que se unen a placas de blanco y la reducción redujo las concentraciones de por sí bajas de autoanticuerpos anti-Ap, lo que complicó la medición adicionalmente. La baja avidez de los autoanticuerpos polirreactivos hace que sea difícil detectarlos, y la intensidad de señal resultante se ve afectada adicionalmente por la interferencia de otras proteínas y componentes plasmáticos, lo que conduce a subestimaciones de la actividad anti-amiloide.

Una práctica habitual para compensar las bajas concentraciones de autoanticuerpos, que son habituales para autoanticuerpos anti-amiloide-p polirreactivos, de baja avidez, emplea muestras menos diluidas para el ensayo. Sin embargo, esta técnica aumenta tanto la intensidad de la señal como el ruido. Otro enfoque implica el tratamiento de complejos unidos de antígeno-autoanticuerpo con una sal caótropa (tiocianato de amonio). Véase, Szabo et al. (2010) Journal of neuroinmunology 227:167-174.

Por otro lado, métodos recientes dirigidos a mejorar la intensidad de señal de la detección de autoanticuerpos polirreactivos de baja avidez han dado como resultado sobreestimaciones de la actividad anti-amiloide. Por ejemplo, una técnica que parecía prometedora implica el aislamiento de IgG de plasma humano a través de cromatografía con proteínas G y elución con ácido; los ensayos dieron como resultado un aumento de 50 veces en títulos de anticuerpo anti-p aparentes (Li et al., BMC Neurosci., 8:22 (2007)). Sin embargo, los altos títulos se atribuyeron a la desnaturalización parcial y a la polivalencia inducida artificialmente de anticuerpos en la muestra, tal como demuestra un aumento de 100 veces en la unión a placas de blanco.

A efectos explicativos, los anticuerpos polirreactivos frente tanto a antígenos exógenos como a autoantígenos forman parte del repertorio de anticuerpos naturales de los seres humanos (Djoumerska et al., Scand J of Immunol., 61: 357-363 (2005)). La mayoría de los anticuerpos polirreactivos tienen regiones hipervariables de la línea germinal, pertenecen al isotipo IgG, presentan una afinidad y avidez más bajas por sus antígenos en comparación con los anticuerpos monovalentes madurados por afinidad, y tienen sitios de unión a antígeno más flexibles. Se cree que sirven como mecanismo de defensa frente a patógenos.

La medición exacta de autoanticuerpos es clave para avanzar en la investigación sobre la patogenia de la

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enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades autoinmunitarias. Asimismo, la evaluación clínica y el tratamiento de pacientes que se sospecha que padecen o a los que se les ha diagnosticado una enfermedad autoinmunitaria requieren ensayos mejorados para autoanticuerpos. Con el potencial descubierto de IGIV como tratamiento del Alzheimer viene una necesidad intensificada de superar algunos impedimentos para la medición de autoanticuerpos anti-amiloide y permitir el desarrollo de una norma para el uso terapéutico y estudios adicionales. Los ensayos fiables para autoanticuerpos polirreactivos de baja avidez han resultado ser mayoritariamente imprecisos. Así pues, se necesita desarrollar ensayos mejorados para autoanticuerpos anti-amiloide polirreactivos, de baja avidez tanto con sensibilidad como con especificidad. La presente invención proporciona ensayos de autoanticuerpos en condiciones de baja conductividad que aumentan la intensidad de la señal sin afectar negativamente a la selectividad de unión.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un sistema de tampón de baja conductividad y métodos para usarlo con el fin de conseguir la detección de autoanticuerpos con sensibilidad potenciada. Una sensibilidad aumentada permite la detección de autoanticuerpos incluso a concentraciones de tan sólo 0,2 |jg/ml, lo cual supone una menor limitación del umbral de detección y solventa diferentes problemas relacionados con someter a ensayo muestras más concentradas, es decir, muestras menos diluidas. Además, el sistema de tampón y los métodos de la invención aumentan significativamente la sensibilidad de los ensayos de inmunodetección sin una pérdida correspondiente de selectividad. Las condiciones de baja conductividad también proporcionan un entorno fluido de baja conductividad en el que se reduce drásticamente la unión a pocillos no recubiertos con antígeno.

La presente invención proporciona métodos para detectar y para capturar autoanticuerpos en una muestra biológica. Estos métodos nuevos pueden detectar autoanticuerpos polirreactivos que tienen una avidez baja por un antígeno diana. En algunas realizaciones, los métodos pueden detectar autoanticuerpos que tienen una afinidad de unión específica para un antígeno diana seleccionado de un antígeno de amiloide-p, un antígeno de ADN, un antígeno de tubulina y un antígeno de tiroglobulina. El antígeno de amiloide-p puede estar en una forma seleccionada de un monómero, un dímero, un oligómero, oligómeros reticulados y una fibrilla. El antígeno de ADN puede estar en una forma seleccionada de ADN monocatenario y ADN bicatenario. En algunos métodos de la invención, puede someterse a ensayo una muestra biológica para determinar la presencia de una pluralidad de autoanticuerpos distintos usando simultáneamente cualquier ensayo múltiple conocido en la técnica como los potenciados mediante las enseñanzas de la presente divulgación. Por ejemplo, pueden usarse métodos de la invención para detectar simultáneamente autoanticuerpos con especificidades variables, de modo que se contempla la inmovilización de una pluralidad de antígenos distintos en una fase sólida en esas realizaciones.

El método comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra biológica en una condición de baja conductividad, que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, con el antígeno diana por el que el autoanticuerpo tiene afinidad de unión específica; y (b) detectar la unión de dicho antígeno diana a dicho autoanticuerpo en la muestra biológica. El antígeno diana se inmoviliza en una fase sólida y la presencia de unión es indicativa de la presencia del autoanticuerpo en la muestra biológica. En algunas realizaciones, el método comprende, antes de la etapa (b): lavar la fase sólida con un tampón de baja conductividad.

En algunas realizaciones, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, una fracción de los mismos, y un derivado procesado de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra biológica es una composición de IgG aislada de plasma, tal como una preparación de IgG intravenosa (IGIV), una preparación de IgG para la administración subcutánea, una preparación de IgG para la administración intramuscular, etc. En algunas realizaciones, la muestra biológica se deriva de un ser humano (por ejemplo, IGIV humana).

En algunas realizaciones, la etapa de detección (b) comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo contra el antígeno diana, en la que el anticuerpo específico de especie es específico para la misma especie a partir de la cual se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico al autoanticuerpo correspondiente presente; y (ii) detectar cualquier complejo que comprende el antígeno diana unido al autoanticuerpo correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie. En algunas realizaciones, la etapa de detección (ii) comprende poner en contacto el resto detectable con un reactivo indicador (por ejemplo, un resto detectable unido al anticuerpo específico de especie).

En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de especie se conjuga con un resto detectable. El resto detectable puede comprender, en algunas realizaciones, un marcador directo. El marcador directo podría comprender peroxidasa. En otras realizaciones, el resto detectable comprende un marcador indirecto. En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de especie se selecciona del isotipo IgG.

En algunas realizaciones, los autoanticuerpos que van a someterse a ensayo se seleccionan de un isotipo seleccionado de IgG, IgA e IgM. En realizaciones preferidas, los autoanticuerpos polirreactivos de baja avidez que van a detectarse son del isotipo IgG. En realizaciones más preferidas, los autoanticuerpos polirreactivos de baja avidez son del isotipo IgG humano.

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En algunas realizaciones, la muestra biológica se diluye al menos 1000 veces o al menos 5000 veces con un tampón de dilución de baja conductividad antes de la etapa (a). En determinadas realizaciones, los métodos descritos anteriormente comprenden además, antes de la etapa (a), bloquear la placa con un tampón de baja conductividad. La detección puede implicar confirmar la presencia de un autoanticuerpo de interés en algunos casos o cuantificar la concentración de autoanticuerpo(s) de interés en otros casos. Los expertos en la técnica apreciarán que los métodos descritos en el presente documento tienen la capacidad de detectar o capturar no solamente autoanticuerpos polirreactivos de baja avidez, sino también autoanticuerpos que son monovalentes.

En algunas realizaciones, la muestra biológica es un líquido seleccionado de sangre, suero, plasma, orina, saliva, líquido cefalorraquídeo y líquido sinovial. Preferiblemente, la muestra biológica se selecciona de sangre completa, suero, plasma, preparación de IgG intravenosa (IGIV), o alguna fracción o derivados procesados de los mismos. En algunas realizaciones, la muestra biológica es un producto intermedio del procedimiento de fabricación de IGIV.

Breve descripción de los dibujos

Se realizan descripciones más particulares de la invención haciendo referencia a determinadas realizaciones a modo de ejemplo de la misma que se ilustran en las la figuras adjuntas. Estas figuras forman parte de la memoria descriptiva. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta que las figuras adjuntas ilustran realizaciones a modo de ejemplo de la invención y, por tanto, no han de considerarse limitativas en su alcance.

La figura 1 muestra la medición de IgG anti-Ap(1-40) en muestras de plasma humano y la preparación de IGIV, respectivamente, utilizando el ensayo a modo de ejemplo descrito en el ejemplo 1. Las curvas de unión corresponden a mediciones obtenidas para la serie de dilución de cada tipo de muestra utilizando 16 mS/cm o condiciones de baja conductividad a lo largo de todo el ensayo. Los niveles de IgG anti-Ap(1-40) se expresan como DO corregida con respecto al blanco.

La figura 2 muestra la medición de IgG anti-Ap(1-42) en ocho lotes de un producto intermedio del procedimiento de fabricación de IGIV utilizando el ensayo a modo de ejemplo descrito en el ejemplo 2. Los niveles de IgG anti-Ap(1- 42) se expresan como DO corregida con respecto al blanco por mg de IgG.

La figura 3 muestra la medición de IgG anti-fibrilla de Ap en ocho lotes de un producto intermedio del procedimiento de fabricación de IGIV utilizando la realización a modo de ejemplo descrita en el ejemplo 4. Los niveles de IgG anti- Ap(1-42) se expresan como DO corregida con respecto al blanco por mg de IgG.

La figura 4 muestra la medición de IgG anti-ADN en muestras de plasma humano utilizando el ensayo a modo de ejemplo descrito en el ejemplo 5. Las curvas de unión corresponden a mediciones obtenidas para la serie de dilución utilizando 16 mS/cm o condiciones de baja conductividad a lo largo de todo el ensayo. Los niveles de IgG anti-ADN se expresan como DO corregida con respecto al blanco.

La figura 5 muestra la medición de IgG anti-tubulina en muestras de plasma humano utilizando el ensayo a modo de ejemplo descrito en el ejemplo 6. Las curvas de unión corresponden a mediciones obtenidas para la serie de dilución utilizando 16 mS/cm o condiciones de baja conductividad a lo largo de todo el ensayo. Los niveles de IgG anti- tubulina se expresan como DO corregida con respecto al blanco.

La figura 6 muestra la medición de IgG anti-tiroglobulina en muestras de plasma humano utilizando el ensayo a modo de ejemplo descrito en el ejemplo 7. Las curvas de unión corresponden a mediciones obtenidas para la serie de dilución utilizando 16 mS/cm o condiciones de baja conductividad a lo largo de todo el ensayo. Los niveles de IgG anti-tiroglobulina se expresan como DO corregida con respecto al blanco.

La figura 7 muestra la medición de IgG anti-ADN en un plasma de referencia humano utilizando el ensayo a modo de ejemplo descrito en el ejemplo 8. Las curvas de unión corresponden a mediciones obtenidas para la serie de dilución a concentraciones salinas variables de [NaCl]: 0 mM, 20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 120 mM y 150 mM, y demuestran una sensibilidad de ensayo creciente con concentraciones salinas decrecientes. Los niveles de IgG anti- ADN se expresan como DO corregida con respecto al blanco.

La figura 8 es un gráfico de las intensidades de señal relativas frente a la conductividad de los tampones de ensayo descritos en el ejemplo 8. La curva de regresión lineal entre la conductividad y el logaritmo de la intensidad de señal, con un coeficiente de correlación al cuadrado de R2 = 0,98, respalda la existencia de una relación proporcional inversa entre la conductividad y la intensidad de señal.

La figura 9 muestra curvas de competencia para la unión a IgG anti-ADN y anti-tubulina en condiciones de baja conductividad en un estudio comparativo proporcionado en el ejemplo 9. Los datos obtenidos confirman que la baja conductividad de los tampones de ensayo no afectó a la especificidad de los ensayos de unión.

Descripción detallada de la invención

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El descubrimiento de que condiciones de baja conductividad potencian la sensibilidad del ensayo y mejoran la selectividad puede aplicarse como complemento a las tecnologías actuales utilizadas en el entorno clínico o de laboratorio para detectar una diversidad de autoanticuerpos IgG humanos, polirreactivos, no madurados por afinidad diferentes. Se contempla que la presente invención también podría utilizarse para mejorar la detección de autoanticuerpos polirreactivos, no madurados por afinidad de otras especies de mamífero no humanas. También se contempla el uso de los métodos descritos en el presente documento para capturar autoanticuerpos polirreactivos, de baja avidez de interés a partir de una muestra dada o como complemento de metodologías de purificación de autoanticuerpos conocidas en la técnica.

La unión no específica de autoanticuerpos no madurados por afinidad, por ejemplo, polirreactivos o de otro tipo, a vidrio, metal o plástico u otros materiales utilizados en sustratos sólidos convencionales es una fuente de error muy conocida en inmunodetección. Por ejemplo, el plasma humano contiene cantidades relativamente grandes de anticuerpos polirreactivos, no madurados por afinidad específicos para agregados de amiloides, su antígeno diana. La presencia de tales autoanticuerpos polirreactivos, así como de anticuerpos que se unen de modo no específico a sustratos de ensayo, aumenta artefactualmente la concentración de autoanticuerpos polirreactivos de interés detectados. Ventajosamente, los métodos proporcionados en el presente documento aumentan la sensibilidad de ensayo para autoanticuerpos no madurados por afinidad y disminuyen la unión de tales autoanticuerpos al sustrato mediante el uso de las condiciones de ensayo de baja conductividad que se enseñan en el presente documento.

Normalmente, en los ensayos ELISA, la unión de antígenos y anticuerpos, y el subsiguiente lavado de los complejos formados de los mismos, se realizan a conductividad de moderada a alta, para reducir las interacciones antígeno- anticuerpo no específicas. Por ejemplo, las muestras biológicas habitualmente se diluyen en solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina tamponada con Tris (TBS) antes de realizar el ensayo ELISA. Ambos tampones PBS (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 2 mM) y TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM) tienen fuerzas iónicas moderadas, que se cree que son útiles para aumentar la rigurosidad de un ensayo ELISA. Muchos protocolos de ELISA también realizan la unión y el lavado del complejo antígeno-anticuerpo en tampón PBS o TBS.

Ventajosamente, en el presente documento se muestra que el uso de condiciones de disolución de baja conductividad que tienen una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM en ensayos de detección de autoanticuerpos aumenta sustancialmente la sensibilidad del ensayo sin comprometer la especificidad, por ejemplo, sin provocar un aumento de la unión no específica ("ruido de fondo"). Por ejemplo, tal como se muestra en la figura 7, los ensayos de detección de autoanticuerpo anti-ADN realizados en condiciones de disolución que contenían cloruro de sodio 60 mM son aproximadamente 100 veces más sensibles que ensayos realizados en condiciones de disolución que contenían cloruro de sodio 150 mM (tal como está presente en el tampón TBS). Incluso más sorprendentemente, los ensayos realizados en ausencia de sal (por ejemplo, cloruro de sodio 0 mM) son casi 10 000 veces más sensibles que ensayos realizados en condiciones de disolución que contenían cloruro de sodio 150 mM. Por tanto, en algunas realizaciones, se describe un ensayo de detección de autoanticuerpo en el que las condiciones de disolución se mantienen con una fuerza iónica baja (por ejemplo, donde los tampones de unión y/o lavado contienen niveles bajos de componentes iónicos tales como sales).

I. DEFINICIONES

Un autoanticuerpo, utilizado indistintamente en el presente documento con el término "anticuerpo endógeno," se refiere a un anticuerpo producido por un organismo y que se une a un antígeno endógeno para ese mismo organismo. Los métodos descritos en el presente documento detectan un "autoanticuerpo en una muestra biológica," que debe interpretarse como un autoanticuerpo producido por un organismo y que se une a un antígeno endógeno para ese mismo organismo, siendo dicho organismo una fuente de material biológico del que se deriva la muestra biológica. En cuanto a la estructura, un autoanticuerpo del isotipo IgM tiene cinco regiones Fc y diez regiones Fab; un autoanticuerpo del isotipo IgG tiene una región Fc y dos regiones Fab; y un autoanticuerpo del isotipo IgA tiene dos regiones Fc y cuatro regiones Fab. Como podrán apreciar los expertos en la técnica, los autoanticuerpos detectables mediante los métodos incluirán autoanticuerpos madurados por afinidad o autoanticuerpos no madurados por afinidad, así como autoanticuerpos polirreactivos o autoanticuerpos monorreactivos.

El término "antígeno propio", utilizado indistintamente con el término "antígeno endógeno" y "autoantígeno," es un constituyente del cuerpo de un individuo que desencadena la producción de anticuerpos en el mismo individuo.

Un anticuerpo "monorreactivo" se refiere a un anticuerpo en el que la región Fab reacciona con o se une a un único antígeno.

Un anticuerpo "polirreactivo" se refiere a un anticuerpo en el que la región Fab reacciona con o se une a múltiples antígenos.

Un "autoanticuerpo polirreactivo", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un autoanticuerpo en el

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que la región Fab reacciona con o se une a múltiples antígenos. En algunas realizaciones, el autoanticuerpo polirreactivo es reactivo con uno o más autoantígenos. En otras realizaciones, el autoanticuerpo polirreactivo es reactivo con un autoantígeno y un antígeno exógeno.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "autoanticuerpo no madurado por afinidad" se refiere a un autoanticuerpo expresado por un linfocito B que no ha experimentado maduración por afinidad. La maduración por afinidad es un proceso mediante el cual se seleccionan linfocitos B, que expresan anticuerpos con afinidad más alta por antígeno(s) presentado(s) en los centros germinales, para su activación. El proceso implica iteraciones de hipermutación somática seguidas de selección basada en afinidad, que operan para generar una población de linfocitos B que expresa anticuerpos con afinidades más altas por sus antígenos diana.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la fuerza de una interacción entre un único determinante antigénico en un antígeno y su sitio de unión correspondiente en un anticuerpo. Es la suma de las fuerzas de atracción y repulsión que operan entre el determinante antigénico y el sitio de unión correspondiente del anticuerpo. La afinidad se describe como una constante de disociación (por ejemplo, Kd o Kd) que caracteriza la interacción antígeno-anticuerpo. Cuanto más alta es la afinidad de un anticuerpo por un antígeno, menor es la Kd.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "avidez" es una característica que describe la fuerza total de unión entre un anticuerpo y su antígeno diana, teniendo en cuenta sus interacciones entre sí en múltiples sitios. En algunos casos, la fuerza total de unión entre un anticuerpo y su antígeno diana es mayor que la suma de las afinidades de unión individuales. A efectos ilustrativos, para un anticuerpo que tiene múltiples sitios de unión con antígeno que interaccionan simultáneamente con un único antígeno, puede romperse fácilmente cada interacción de unión individual por sí misma. Sin embargo, cuando un anticuerpo y su antígeno diana se unen en múltiples sitios, el efecto global es sinérgico ya que la unión de un anticuerpo de este tipo a su antígeno diana estaría reforzada por la presencia de otras interacciones de unión cuando hay separación transitoria de un único sitio de unión en el anticuerpo de su determinante antigénico correspondiente en el antígeno diana.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "antígeno de amiloide-p" está en una forma seleccionada de monómero, dímero, oligómero, un agregado de oligómeros reticulados y una fibrilla. El antígeno de amiloide-p puede comprender una proteína amiloide-p de longitud completa o una parte de la misma, comprendiendo dicha parte un determinante antigénico elegido para capturar o detectar los autoanticuerpos de interés. El oligómero de Ap puede variar en composición y corresponder a una secuencia N-terminal, secuencia C-terminal o cualquier parte de la proteína Ap. En algunas realizaciones, el antígeno de amiloide-p comprende un epítopo dentro de los seis residuos N-terminales expuestos de las formas nativa y fibrilar de Ap. Véase, Solomon et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93: 452-455. En otras realizaciones, el antígeno de amiloide-p es una forma de un péptido amiloide p-40 (aminoácidos 1-40) seleccionado de un monómero, dímero, oligómero, agregado de oligómeros reticulados y una fibrilla. En otras realizaciones, el antígeno de amiloide-p es una forma de un péptido amiloide p-42 (aminoácidos 142) seleccionado de un monómero, dímero, oligómero, agregado de oligómeros reticulados y una fibrilla.

La transformación de proteínas y péptidos solubles en fibrillas de amiloide insolubles es el reflejo de una serie de alteraciones conformacionales que implican la formación de productos intermedios amiloidogénicos; la autoasociación y estabilización de estos componentes a través de interacciones entre láminas p que conducen a protofilamentos/protofibrillas; y, finalmente, la interacción de los componentes para formar la fibrilla madura. Véase, Serpell (2000) Biochim Biophys Acta 1502:15-30; Dobson (2004) Methods 34:4-14; Makin et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:315-320. Por tanto, se contempla que el antígeno de amiloide-p seleccionado pueda adoptar cualquiera de los estados de transición mencionados anteriormente, por ejemplo, productos intermedios amiloidogénicos, protofilamentos o protofibrillas. En algunas realizaciones, el antígeno de amiloide-p comprende epítopo(s) lineal(es) específico(s) de secuencia expuesto(s) en la fibrilla, así como el producto intermedio amiloidogénico desplegado y la proteína precursora nativa. En otras realizaciones, el antígeno de amiloide-p comprende neoepítopos presentes en la fibrilla y productos intermedios de ensamblaje (por ejemplo, regiones antigénicas ocultas en la molécula nativa que se ven expuestas como resultado del desplegamiento de la proteína). Todavía en otras realizaciones, el antígeno de amiloide-p comprende epítopo(s) conformacional(es) genérico(s) común/comunes a todas las fibrillas, independientemente de la estructura primaria. Véase, Hrncic et al. (2000) Am J. Pathol 157:1239-1246; O'Nuallain et al. (2002) Proc natl Acad Sci USA 99:1485-1490. Otro antígeno de amiloide-p a modo de ejemplo comprende epítopo(s) conformacional(es) común/comunes al péptido amiloide p-40, cadenas ligeras (LC), amiloide A sérico (SAA), transtiretina (TTR) y polipéptido amiloide de los islotes (IAPP) que no está(n) presente(s) en los estados no fibrilares nativos de estos péptidos amiloidogénicos.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "antígeno de tubulina" está en una forma seleccionada de monómero, dímero, oligómero y agregado. El antígeno de tubulina puede comprender una proteína tubulina de longitud completa o una parte de la misma, comprendiendo dicha parte un determinante antigénico elegido para capturar o detectar los autoanticuerpos de interés. El antígeno de tubulina puede comprender uno o más polipéptidos de tubulina del subtipo a, subtipo p, subtipo y, subtipo 8 o subtipo £. El antígeno de tubulina puede variar en composición y corresponder a una secuencia N-terminal, secuencia C-terminal o cualquier parte de la proteína tubulina. En los métodos proporcionados en el presente documento puede utilizarse cualquiera de estas u otras proteínas tubulinas. En realizaciones preferidas, el antígeno de tubulina se deriva de la misma especie que los

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autoanticuerpos que están sometiéndose a ensayo.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "antígeno de tiroglobulina" puede comprender una proteína tiroglobulina de longitud completa o una parte de la misma, comprendiendo dicha parte un determinante antigénico elegido para capturar o detectar los autoanticuerpos de interés. El antígeno de tiroglobulina puede variar en composición y corresponder a una secuencia N-terminal, secuencia C-terminal o cualquier parte de la proteína tiroglobulina. En los métodos proporcionados en el presente documento puede utilizarse cualquiera de estas u otras proteínas tiroglobulinas. En realizaciones preferidas, el antígeno de tiroglobulina se deriva de la misma especie que los autoanticuerpos que están sometiéndose a ensayo.

Tal como se utiliza en el presente documento, un "antígeno de ADN" está en una forma seleccionada de ADN monocatenario y ADN bicatenario. El antígeno de ADN puede variar en composición y ser de cualquier longitud. En algunas realizaciones, el antígeno de ADN se deriva de la misma especie que los autoanticuerpos que están sometiéndose a ensayo.

En el contexto de la presente invención, un "antígeno diana" es un antígeno seleccionado para detectar los autoanticuerpos de interés. El antígeno diana puede estar en una forma seleccionada de monómero, dímero, oligómero, polímero y un agregado. En realizaciones preferidas, el antígeno diana se deriva de la misma especie que los autoanticuerpos que están sometiéndose a ensayo. En realizaciones seleccionadas, el antígeno diana y los autoanticuerpos que están sometiéndose a ensayo son ambos humanos.

El término "baja conductividad", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una conductividad que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM. Pueden seleccionarse tampones o condiciones de baja conductividad útiles para los métodos descritos en el presente documento de formulaciones hipotónicas, isotónicas o hipertónicas.

El término "hipotónica" describe una formulación con una tonicidad sustancialmente por debajo de la de la sangre. La tonicidad puede medirse utilizando un osmómetro del tipo de presión de vapor o punto de congelación, por ejemplo.

Los tampones o la condición de baja conductividad de la invención seleccionados de formulaciones hipotónicas generalmente tendrán una osmolalidad que oscila entre aproximadamente 1 mOsm y menos de aproximadamente 250 mOsm. En algunas realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad de la invención se caracterizan por osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de aproximadamente 10 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 20 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 30 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 40 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 50 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 60 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 70 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 80 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 90 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 100 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 110 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 120 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 130 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 140 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 150 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 160 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 170 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 180 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 190 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 200 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 210 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 220 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 230 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm, de aproximadamente 240 mOsm a menos de aproximadamente 250 mOsm.

En algunas realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad seleccionados de formulaciones hipotónicas tienen osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de aproximadamente 1-100 mOsm, aproximadamente 1-75 mOsm, aproximadamente 1-50 mOsm y aproximadamente 1-25 mOsm. En otras realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad tienen osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de aproximadamente 25-250 mOsm, aproximadamente 50-225 mOsm, aproximadamente 75-200 mOsm, aproximadamente 100-175 mOsm, aproximadamente 125-150 mOsm.

El término "isotónica" describe una formulación con una tonicidad aproximada a la de la sangre. En algunas realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad seleccionados de formulaciones isotónicas tienen osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de aproximadamente 250 mOsm a 350 mOsm. En algunas realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad seleccionados de formulaciones isotónicas tienen osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de aproximadamente 250 mOsm a aproximadamente 325 mOsm, de aproximadamente 250 mOsm a aproximadamente 300 mOsm, de aproximadamente 250 mOsm a aproximadamente 275 mOsm. En otras realizaciones, los tampones

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o la condición de baja conductividad seleccionados de formulaciones isotónicas tienen osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de aproximadamente 275 mOsm a aproximadamente 350 mOsm, de aproximadamente 300 mOsm a aproximadamente 350 mOsm, de aproximadamente 325 mOsm a aproximadamente 350 mOsm. Todavía en otras realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad seleccionados de formulaciones isotónicas tienen osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de aproximadamente 275 mOsm a aproximadamente 325 mOsm.

El término "hipertónica" describe una formulación con una tonicidad sustancialmente por encima de la de la sangre. En algunas realizaciones, los tampones o la condición de baja conductividad de la invención se caracterizan por unas osmolalidades seleccionadas respectiva e independientemente de un intervalo de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 2000 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1950 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1900 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1850 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1800 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1750 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1700 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1650 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1600 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1550 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1500 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1450 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1400 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1350 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1300 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1250 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1200 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1150 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1100 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1050 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 1000 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 950 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 900 mOsm, de mayor

de 350 mOsm a aproximadamente 850 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 800 mOsm, de mayor

de 350 mOsm a aproximadamente 750 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 700 mOsm, de mayor

de 350 mOsm a aproximadamente 650 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 625 mOsm, de mayor

de 350 mOsm a aproximadamente 600 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 550 mOsm, de mayor

de 350 mOsm a aproximadamente 500 mOsm, de mayor de 350 mOsm a aproximadamente 450 mOsm, de mayor

de 350 mOsm a aproximadamente 400 mOsm.

Los términos "individuo", "sujeto" y "paciente", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a un mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, animales murinos, simios, humanos, animales de granja que son mamíferos, animales que se utilizan en deportes que son mamíferos y mascotas que son mamíferos. En realizaciones preferidas, el individuo es un ser humano.

El término "muestra", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a una muestra biológica obtenida con el fin de su evaluación in vitro. En los métodos de la presente invención, la muestra se deriva de un líquido biológico extraído de uno o más individuos de la misma especie. En realizaciones preferidas, el líquido biológico es de origen humano. Los líquidos biológicos a modo de ejemplo incluyen sangre, suero, plasma, líquido cefalorraquídeo, líquido sinovial, orina o saliva. En realizaciones preferidas, el líquido biológico se selecciona de sangre completa, suero, plasma y una fracción o derivado procesado de los mismos (por ejemplo, una disolución de IgG aislada de sangre, plasma, mezcla de sangres o mezcla de plasmas, tal como IGIV).

Los términos "dosis" y "dosificación" se utilizan indistintamente en el presente documento. Una dosis se refiere a la cantidad de un principio activo facilitada a un individuo en cada administración. La dosis variará dependiendo de varios factores, que incluyen la frecuencia de administración; el tamaño y la tolerancia del individuo; la gravedad de la afección; el riesgo de efectos secundarios; y la vía de administración. Un experto en la técnica reconocerá que la dosis puede modificarse dependiendo de los factores anteriores o basándose en la evolución terapéutica. El término "forma de dosificación" se refiere al formato particular del producto farmacéutico, y depende de la vía de administración. Por ejemplo, una forma de dosificación puede ser un líquido, por ejemplo, una solución salina para inyección.

Una cantidad o dosis "terapéuticamente eficaz", o cantidad o dosis "suficiente/eficaz", es una dosis que produce los efectos para los cuales se administra. La dosis exacta dependerá del fin del tratamiento y podrá determinarse por un experto en la técnica utilizando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Pickar, Dosage Calculations (1999); y Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20.a Edición, 2003, Gennaro, Ed., Lippincott, Williams & Wilkins).

Los términos "terapia," "tratamiento" y "alivio" se refieren a cualquier reducción en la gravedad de los síntomas o la cantidad de agregación de amiloides, o mejora en la función cognitiva. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "tratar" y "prevenir" no se pretende que sean términos absolutos. Tratamiento puede referirse a cualquier retraso en la aparición, el alivio de los síntomas, la mejora en la supervivencia de los pacientes, el aumento del tiempo o la tasa de supervivencia, etc. El efecto del tratamiento puede compararse con un individuo o conjunto de individuos que no están recibiendo el tratamiento.

Una muestra o valor de "control" se refiere a una muestra que sirve como referencia, habitualmente una referencia

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conocida, para su comparación con una muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de prueba puede ser una muestra de referencia de concentración de IgG conocida. Un control también puede representar un valor promedio adquirido a partir de una población de individuos similares, por ejemplo, pacientes con enfermedad de Alzheimer, pacientes con enfermedad de Parkinson, pacientes con enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, etc., con antecedentes médicos similares o de la misma edad, peso, etc. También puede obtenerse un valor de control del mismo individuo, por ejemplo, de una muestra obtenida con anterioridad, antes de los síntomas, o antes o en diferentes puntos temporales terapéuticos. En algunos casos, los controles pueden incluir comparaciones dentro de un individuo o entre individuos, por ejemplo, la comparación de títulos de anticuerpos anti-amiloide con el título de uno o más anticuerpos conocidos.

Un experto en la técnica comprenderá qué controles son valiosos en una situación dada y será capaz de analizar los datos basándose en comparaciones con valores de control. Los controles también son valiosos para determinar la importancia de los datos. Por ejemplo, si los valores para un parámetro dado varían ampliamente en los controles, la variación en muestras de prueba no se considerará significativa.

Se contempla que los métodos de la presente invención pueden aplicarse a ensayos de detección de una única medición, así como a ensayos múltiples. El término "ensayo múltiple", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un ensayo, tal como los descritos en la patente estadounidense 5 763 158 o la patente estadounidense n.° 5 981 180, capaz de realizar diferentes mediciones simultáneamente. "Diferentes mediciones" se entiende que significa la detección de una pluralidad de analitos distintos o la detección de un único analito mediante una pluralidad de subconjuntos de perlas distintas, o una combinación de ambas. En este contexto, "simultáneamente" se entiende que significa que se detectan los múltiples analitos o se detecta el único analito mediante conjuntos de perlas diferentes, o se realiza una combinación de mediciones en el mismo ensayo. Normalmente, un ensayo múltiple se realizará en un único recipiente que contiene varios conjuntos de partículas (por ejemplo, un subconjunto de partículas mezcladas), de modo que un único ensayo múltiple proporcionará múltiples lecturas de información.

Antes de describir la presente invención más detalladamente, debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que estas pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en el presente documento es a efectos de describir realizaciones particulares únicamente, y no se pretende que sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención está limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el primer decimal del límite inferior, a menos que el contexto indique claramente lo contrario, entre el límite superior e inferior de ese intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en ese intervalo indicado, está englobado dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también están englobados dentro de la invención, sujetos a cualquier límite excluido específicamente en el intervalo indicado. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, los intervalos que excluyen uno o ambos de estos límites incluidos también están incluidos en la invención.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado con el que los entiende normalmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque también puede utilizarse cualquier método y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o puesta a prueba de la presente invención, ahora se describen métodos y materiales ilustrativos y representativos.

Se hace constar que, tal como se utilizan en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen los referentes en plural a menos que contexto indique claramente lo contrario. Se hace constar además que las reivindicaciones pueden estar redactadas para excluir cualquier elemento opcional. Como tal, se pretende que esta afirmación sirva como base antecedente para el uso de terminología tan exclusiva como "solamente", "únicamente" y similares en relación con la mención de elementos de las reivindicaciones, o el uso de una limitación "negativa".

Tal como será evidente para los expertos en la técnica al leer esta divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene características y componentes diferenciados que pueden separarse fácilmente de o combinarse con las características de cualquiera de las otras diversas realizaciones sin apartarse del alcance de la presente invención. Cualquier método citado puede llevarse a cabo en el orden de acontecimientos citado o en cualquier otro orden que sea posible desde un punto de vista lógico.

II. DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención es adecuada para su uso en el ensayo de anticuerpos no madurados por afinidad, por ejemplo, polirreactivos o de otro tipo, en una variedad de muestras biológicas. Las muestras biológicas contempladas por la presente invención incluyen cualquier líquido seleccionado de sangre, suero, plasma, orina, saliva, líquido sinovial y líquido cefalorraquídeo. Preferiblemente, la muestra biológica se selecciona de sangre completa, suero, plasma, una composición de IgG aislada de sangre o plasma (por ejemplo, IgG intravenosa), o una

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fracción o derivado procesado de los mismos.

La muestra biológica puede obtenerse mediante una variedad de medios. En algunas realizaciones, la muestra biológica se recoge o se realiza una biopsia y la muestra biológica recogida se somete a prueba in vitro. En determinadas realizaciones, las inmunoglobulinas presentes en la muestra se enriquecen antes de la detección. En otras realizaciones, las inmunoglobulinas no se enriquecen adicionalmente antes de la detección. La muestra puede separarse adicionalmente, por ejemplo, en plasma y materia celular, para aislar la fracción que contiene anticuerpos, aunque esta etapa no es necesaria. La muestra también puede exponerse a métodos de filtración y/o cromatografía por tamaño. En algunas realizaciones, la muestra se expone a cromatografía tiófila para retirar las proteínas no inmunoglobulínicas de la muestra.

En algunas realizaciones de la invención, la muestra biológica se diluye hasta al menos una dilución de 1/20, hasta al menos una dilución de 1/1000 o hasta al menos una dilución de 1/500 000.

Tal como se mencionó anteriormente, el método de la invención incluye (a) poner en contacto la muestra biológica en una condición de baja conductividad que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM con el antígeno diana por el que el autoanticuerpo no madurado por afinidad tiene afinidad de unión específica; y (b) detectar la unión de dicho antígeno diana a dicho autoanticuerpo en la muestra biológica. El antígeno diana se ha inmovilizado en una fase sólida antes de la etapa de puesta en contacto (a). En algunas realizaciones, el autoanticuerpo no madurado por afinidad detectado es polirreactivo. La detección de unión es, por tanto, indicativa del autoanticuerpo no madurado por afinidad en la muestra biológica.

En algunas realizaciones, la etapa de detección (b) comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de antígeno diana contra el antígeno diana, en la que el anticuerpo específico de especie es específico para la especie de la que se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico de especie al autoanticuerpo específico de antígeno diana correspondiente presente; y (ii) detectar cualquier complejo que comprende el antígeno diana unido al autoanticuerpo específico de antígeno diana correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie. En algunas realizaciones, el autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de antígeno diana detectado es polirreactivo. La especie se selecciona de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, especie de primates, tal como humanos y chimpancés; animales murinos, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; etc. En realizaciones preferidas, la especie es humana.

En algunas realizaciones, la etapa de detección (b) comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de amiloide-p contra el antígeno de amiloide-p, en la que el anticuerpo específico de especie es específico para la especie de la que se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico de especie al autoanticuerpo específico de amiloide-p correspondiente presente; y (ii) detectar cualquier complejo que comprende el antígeno de amiloide-p unido al autoanticuerpo específico de amiloide-p correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie. En algunas realizaciones, el autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de amiloide-p detectado es polirreactivo. La especie se selecciona de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, especie de primates, tal como humanos y chimpancés; animales murinos, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; etc. En realizaciones preferidas, la especie es humana.

En otras realizaciones, la etapa de detección (b) comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de ADN contra el antígeno de ADN, en la que el anticuerpo específico de especie es específico para la especie de la que se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico de especie al autoanticuerpo específico de ADN correspondiente presente; y (ii) detectar cualquier complejo que comprende el antígeno de ADN unido al autoanticuerpo específico de aDn correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie. En algunas realizaciones, el autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de ADN detectado es polirreactivo. La especie se selecciona de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, especie de primates, tal como humanos y chimpancés; animales murinos, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; etc. En realizaciones preferidas, la especie es humana.

Todavía en algunas realizaciones, la etapa de detección (b) comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de tubulina contra el antígeno de tubulina, en la que el anticuerpo específico de especie es específico para la especie de la que se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico de especie al autoanticuerpo específico de tubulina correspondiente presente; y (ii) detectar cualquier complejo que comprende el antígeno de tubulina unido al autoanticuerpo específico de tubulina correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie. En algunas realizaciones, el autoanticuerpo detectado es polirreactivo. La especie se selecciona de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, especie de primates, tal como humanos y chimpancés; animales murinos, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; etc. En realizaciones preferidas, la especie es humana.

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Todavía en realizaciones adicionales, la etapa de detección (b) comprende: (i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo no madurado por afinidad específico de tiroglobulina contra el antígeno de tiroglobulina, en la que el anticuerpo específico de especie es específico para la especie de la que se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico de especie al autoanticuerpo específico de tiroglobulina correspondiente presente; y (ii) detectar cualquier complejo que comprende el antígeno de tiroglobulina unido al autoanticuerpo específico de tiroglobulina correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie. En algunas realizaciones, el autoanticuerpo detectado es polirreactivo. La especie se selecciona de cualquier especie de mamífero, por ejemplo, especie de primates, tal como humanos y chimpancés; animales murinos, tales como ratas y ratones; caninos; felinos; bovinos; ovinos; equinos; etc. En realizaciones preferidas, la especie es humana.

En algunas realizaciones, se proporciona un método para detectar un autoanticuerpo no madurado por afinidad presente en una muestra de sangre o fracción de la misma que tiene afinidad por un antígeno diana, comprendiendo el método las etapas de (a) diluir la muestra hasta una concentración final de inmunoglobulina de no más de 100 |jg/ml, (b) poner en contacto la muestra de sangre o suero diluida con el antígeno diana en una primera condición de disolución de baja conductividad para formar un complejo que comprende el autoanticuerpo y el antígeno diana, y (c) detectar el complejo, en el que la primera condición de disolución de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM.

En algunas realizaciones, el método comprende además una etapa de (d) lavar el complejo formado en la etapa (b) con un primer tampón de lavado que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM.

En algunas realizaciones, la etapa de detectar el complejo comprende las subetapas de (i) poner en contacto el complejo que comprende el autoanticuerpo y el antígeno diana con un anticuerpo anti-inmunoglobulina humana en una segunda condición de disolución de baja conductividad que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM para formar un complejo ternario, (ii) lavar el complejo ternario formado en la subetapa (i) con un segundo tampón de lavado que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, y (iii) detectar la presencia del anticuerpo anti-inmunoglobulina humana. En algunas realizaciones, detectar la presencia del anticuerpo anti-inmunoglobulina humana comprende determinar la concentración relativa del anticuerpo anti-inmunoglobulina humana.

En las realizaciones descritas anteriormente, en las que el anticuerpo específico de especie se conjuga con un resto detectable, la etapa de detección (ii) comprende poner en contacto el resto detectable con un reactivo indicador.

En otras realizaciones, el método comprende además, antes de la etapa (b): lavar la fase sólida con un tampón de baja conductividad que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM.

Los expertos en la técnica apreciarán que un tampón de baja conductividad que tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM de la misma o diferente composición puede utilizarse para uno o más de los siguientes fines en cualquier combinación: lavar la placa después de inmovilizar los antígenos diana; diluir la muestra biológica; bloquear la placa; lavar el(los) complejo(s) formado(s); poner en contacto el complejo con una inmunoglobulina secundaria; lavar el(los) complejo(s) ternario(s) formado(s).

En algunas realizaciones, la condición de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 60 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 40 mM o menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 20 mM.

En algunas realizaciones, el tampón de lavado de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 60 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 40 mM o menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 20 mM.

En algunas realizaciones, el tampón de dilución de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 60 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 40 mM o menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 20 mM.

El(los) tampón(es) de baja conductividad utilizado(s) en los métodos y sistemas de la presente invención pueden adquirirse de cualquier proveedor comercial, tal como VWR, Fisher Scientific o Sigma Aldrich, o generarse por los expertos habituales en la técnica. En algunas realizaciones, la disolución de baja conductividad está tamponada a pH fisiológico. En otras realizaciones, los tampones de baja conductividad adecuados contienen una o más sales fisiológicas seleccionadas de KCl, NaCl, CaCl2, KH2PO4, K2HPO4, NaH2PO4, NaHCO3-Na2CO3, Na2HPO4, NaHCO3y mezclas de las mismas. En otras realizaciones, los tampones de baja conductividad contienen una o más sales no

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fisiológicas conocidas en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden seleccionarse tampones de baja conductividad útiles en los métodos y sistemas descritos en el presente documento de TAPS, CAPS, TES, MOPS, CHES, MES, bicina, BIS-TRIS propano, TRIS base, BIS-TRIS, HEPES, otros tampones de amina orgánicos, o diferentes combinaciones de los mismos.

Los tampones de baja conductividad a modo de ejemplo útiles en la presente invención comprenden concentraciones variables de HEPES en algunas realizaciones, concentraciones variables de HEPES y Tween 20 en otras realizaciones, concentraciones variables de HEPES, Tween 20 y CaCl2 todavía en otras realizaciones, o concentraciones variables de HEPES y Tween 20, NaCl y CaCl2 aún en otras realizaciones. En algunas realizaciones, los tampones de baja conductividad tienen una formulación seleccionada de cualquiera de las siguientes: HEPES 20 mM; HEPES 20 mM con NaCl 20 mM; HEPES 20 mM con NaCl 40 mM; HEPES 20 mM con NaCl 60 mM; HEPES 20 mM con NaCl 80 mM; HEPES 20 mM y CaCh 2 mM, Tween 20 al 0,1 %; HEPES 20 mM y Tween 20 al 0,1 %.

Otros tampones de baja conductividad a modo de ejemplo incluyen un tampón de NaCl 80 mM, KCl 1,8 mM, KH2PO4 1,33 mM y K2HPO4 5,33 mM, pH 7,4 ± 0,1; un tampón de NaCl 60 mM, KCl 1,35 mM, KH2PO4 1 mM y K2HPO4 3,99 mM, pH 7,4 ±0,1; un tampón de NaCl 70 mM, NaHCOa20 mM, KH2PO4 4 mM y K2HPO42,6 mM, pH 7,4 ±0,1; y un tampón de NaCl 65 mM, KH2PO4 1 mM y K2HPO4 4 mM, pH 7,4 ±0,1. Todavía en otras realizaciones, los tampones de baja conductividad están sustancialmente exentos de sales no fisiológicas.

La disolución tampón de lavado de baja conductividad puede seleccionarse de cualquiera de los tampones descritos anteriormente. Además, los expertos en la técnica guiados por la presente divulgación estarían preparados para elegir o generar un tampón de baja conductividad útil con el fin de retirar los anticuerpos no unidos y lavar los anticuerpos unidos débilmente a sitios no específicos. Los tampones de lavado a modo de ejemplo pueden incluir una pequeña cantidad de detergente diluida en la solución salina tamponada con Tris o agua destilada. En otras realizaciones, los tampones de lavado no incluyen un detergente.

Los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención puede adaptarse a muchos métodos de detección en fase sólida convencionales. Estos incluyen, sin limitación, ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), ensayo de inmunosorción fluorescente (FIA), ensayo de inmunosorción quimioluminiscente (CLIA) e inmunotransferencia. Para consular una revisión de los diferentes inmunoensayos que pueden utilizarse véase, The Immunoassay Handbook, David Wild, ed., Stockton Press, Nueva York, 1994.

Pueden utilizarse varios métodos de detección conocidos en la técnica conjuntamente con la presente invención, tal como podrán apreciar los expertos. En algunas realizaciones, el antígeno diana se inmoviliza en una superficie o soporte sólido tal como una perla, placa, portaobjetos o placa de microtitulación. Se añade una alícuota de muestra al soporte sólido y se deja incubar con el antígeno diana en fase líquida. Se añade una inmunoglobulina (denominada también en el presente documento anticuerpo secundario) seleccionada para reconocer una región constante de los autoanticuerpos que están sometiéndose a ensayo. En realizaciones preferidas, el anticuerpo secundario se caracteriza por un isotipo IgG. Alternativamente, el anticuerpo secundario se caracteriza por una alta afinidad con alguna región constante del autoanticuerpo que está sometiéndose a ensayo. Tras separar el soporte sólido de la fase líquida, se examina la fase de soporte para detectar una señal detectable. La presencia de la señal en el soporte sólido indica que se han unido autoanticuerpos frente al antígeno diana en el soporte a su diana.

El sistema productor de la señal está constituido por uno o más componentes, al menos uno de los cuales es un marcador, que genera una señal detectable que se relaciona con la cantidad de marcador unido. El marcador es una molécula que produce o que puede inducirse que produzca una señal. Los marcadores detectables adecuados para tal uso incluyen cualquier composición detectable mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos, eléctricos, ópticos o químicos. Los ejemplos de marcadores incluyen agentes fluorescentes, enzimas, agentes quimioluminiscentes, agentes fotosensibilizadores o partículas suspendibles. La señal se detecta y puede medirse detectando la actividad enzimática, luminiscencia o absorción de luz.

Los marcadores útiles en la presente invención incluyen perlas magnéticas (por ejemplo, DYNABEADS), colorantes fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rojo Texas, rodamina, proteína fluorescente verde y similares), radiomarcadores (por ejemplo, 3H, 1251, 35S, 14C o 32P), enzimas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina y otros utilizados normalmente en un ELISA), y marcadores colorimétricos tales como perlas de oro coloidal o vidrio o plástico coloreado (por ejemplo, poliestireno, polipropileno, látex). Puede encontrarse un resumen general de la tecnología aplicable en Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988).

Aunque también pueden utilizarse radiomarcadores, y detectarse y medirse niveles de radioactividad utilizando un contador de centelleo, esto no se prefiere debido a problemas de seguridad y medioambientales. Los sistemas productores utilizados más normalmente emplean mecanismos cromógenos mediados por enzimas o fluorescentes mediados por fluoróforos. Con indicadores cromógenos, se hace reaccionar entonces cualquier marcador enzimático unido con un sustrato para obtener un producto coloreado que puede analizarse con un microscopio. Los ejemplos de marcadores enzimáticos adicionales que pueden utilizarse incluyen, sin limitación, p-D-galactosidasa, glucosas- fosfato deshidrogenasa ("G6PDH") y glucosa oxidasa.

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Con sistemas indicadores fluorescentes, los fluoróforos se conjugan con una sonda o el anticuerpo secundario y no requieren un sustrato para activar la enzima como en los sistemas de detección cromógenos. Además, los sistemas indicadores fluorescentes son particularmente útiles en ensayos múltiples. Los ejemplos de marcadores fluorescentes que pueden utilizarse incluyen, sin limitación, fluoresceína, isotiocianato, compuestos de rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. Los agentes quimioluminiscentes incluyen, por ejemplo, isoluminol.

La cantidad o la intensidad de color, fluorescencia, luminiscencia o radioactividad presente en la reacción (dependiendo del sistema productor de la señal utilizado) debe correlacionarse con la concentración de autoanticuerpos en una muestra. La cuantificación de la densidad óptica puede realizarse utilizando métodos espectrofotométricos. La cuantificación de la señal del radiomarcador puede realizarse utilizando recuento de centelleo. Cuando se utilizan marcadores enzimáticos, la actividad enzimática depende de diversas variables, que incluyen la concentración de sustrato y enzima, el tampón, el pH, la temperatura y posiblemente la luz. En la técnica se describen sistemas de enzima-sustrato que pueden emplearse y pueden incluir, sin limitación, DAB-HRP; DAB mejorado con metal-HRP; BCIP-AP; NBT-AP y glucosa oxidasa; NbT-BCIP de una etapa y AP, etc.

Las enzimas pueden unirse covalentemente a anticuerpos reactivos con antígeno diana para su uso en los métodos de la invención utilizando métodos conocidos por los expertos habituales en la técnica. Por ejemplo, pueden conjugarse fosfatasa alcalina y peroxidasa de rábano picante con anticuerpos utilizando glutaraldehído. La peroxidasa de rábano picante también puede conjugarse utilizando el método del peryodato. Se dispone de numerosos kits comerciales para anticuerpos que se conjugan con enzimas. En múltiples fuentes comerciables disponen de anticuerpos anti-inmunoglobulina humana y anti-inmunoglobulina de ratón específicos conjugados con enzimas.

Alternativamente, puede efectuarse una detección indirecta de los autoanticuerpos utilizando el método del complejo de avidina-biotina, método de la biotina-estreptavidina marcada o el método de la fosfatasa-anti-fosfatasa como con los que estarán familiarizados los expertos habituales en la técnica.

Los anticuerpos marcados con enzima producen fuentes de señal diferentes, dependiendo del sustrato. La generación de señal implica la adición del sustrato a la mezcla de reacción. Los sustratos de peroxidasa habituales incluyen 3,3'-diaminobencidina (DAB), ABTS™2,2'-azinobis(etilbenzotiazolina-6-sulfonato)), OPD (O- fenilenodiamina) y TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbencidina). El fosfato de p-nitrofenilo es un sustrato de fosfatasa alcalina utilizado normalmente. Cuando se emplea un marcador enzimático de fosfatasa alcalina, el sustrato se selecciona como una combinación de cloruro de nitroazul de tetrazolio (NBT) y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BCIP). Cuando se emplea un marcador enzimático de glucosa oxidasa, el sustrato se selecciona para que sea cloruro de nitroazul de tetrazolio. Cuando se utiliza un marcador enzimático de p-galactosidasa, el sustrato se selecciona para que sea 5-bromo-4-cloro-3-indoil-p-D-galactopiranósido (BCIG o X-Gal). Durante un periodo de incubación, la enzima convierte gradualmente una proporción del sustrato en su producto final. Al final del periodo de incubación, puede añadirse un reactivo de detención que detiene la actividad enzimática. La intensidad de la señal se determina midiendo la densidad óptica, habitualmente mediante un espectrofotómetro.

También pueden medirse anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina mediante fluorometría. Por tanto, en los métodos de inmunodetección de la presente invención, puede utilizarse el sustrato fosfato de 4-metilumbeliferilo (4- UMP). La fosfatasa alcalina desfosforila al 4-UMP para formar 4-metilumbeliferona (4-MU), el fluoróforo. La luz incidente es a 365 nm y la emitida a 448 nm.

A lo largo de los ensayos, pueden requerirse etapas de incubación y/o lavado después de cada combinación de reactivos. Las etapas de incubación pueden variar de aproximadamente 5 segundos hasta varias horas, por ejemplo, de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. Sin embargo, el tiempo de incubación dependerá del formato del ensayo, el anticuerpo, el volumen de la disolución, las concentraciones y similares. Habitualmente, los ensayos se llevarán a cabo a temperatura ambiente, aunque pueden realizarse en un intervalo de temperaturas, tal como de 10 °C a 40 °C.

En algunas realizaciones, se procesa al menos un control junto con la muestra, y se comparan con respecto a la cantidad de anticuerpo y/o el nivel de unión. En otras realizaciones, el resultado del ensayo puede compararse con un nivel de control establecido previamente para el sistema de interés. Por ejemplo, un control positivo puede incluir la misma muestra biológica obtenida de un individuo o grupo de individuos que se sabe que padecen una enfermedad relacionada con amiloide. Otro ejemplo de un control positivo adecuado es un anticuerpo monoclonal anti-amiloide conocido con fines comparativos. Un control negativo a modo de ejemplo puede incluir la misma muestra biológica obtenida de un individuo o grupo de individuos que corren un riesgo bajo de desarrollar la enfermedad relacionada con amiloide. Otro ejemplo de un control negativo adecuado es un anticuerpo conocido específico para un antígeno no amiloide.

Utilizando tales métodos y correlacionando un nivel relativamente alto de anticuerpos anti-amiloide con una probabilidad aumentada de que el sujeto padezca o corra un riesgo alto de desarrollar un trastorno autoinmunitario

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relacionado con amiloide, un experto puede diagnosticar una enfermedad autoinmunitaria relacionada con amiloide en el sujeto.

Los métodos anteriores pueden aplicarse para seleccionar un grupo de pacientes para una terapia de una enfermedad relacionada con amiloide. Por ejemplo, puede determinarse el nivel de anticuerpos anti-amiloide en una pluralidad de individuos. Tal como se explicó anteriormente, pueden seleccionarse para tratamiento aquellos individuos que se determina que tienen unos niveles relativamente altos de anticuerpos anti-amiloide. En algunas realizaciones, el nivel de anticuerpos anti-amiloide se detecta periódicamente durante un ciclo de tratamiento. En algunas realizaciones, el tratamiento comprende la administración de IGIV.

Enfermedad de Alzheimer y otros trastornos relacionados con amiloide

Las proteínas amiloides y los agregados de proteínas anómalos desempeñan un papel en varias enfermedades y afecciones diferentes. Los métodos de la invención permiten la detección de determinados autoanticuerpos polirreactivos, no madurados por afinidad contra diversas formas de antígenos o agregados polipeptídicos de amiloide. Se contempla que la detección de determinados autoanticuerpos anti-amiloide, no madurados por afinidad ayudará a un experto en la técnica a realizar un diagnóstico o determinar el ciclo de terapia para cualquier enfermedad en la que la una proteína amiloide sirve como marcador de la enfermedad. Como tal, los métodos de la invención comprenden la detección de autoanticuerpos anti-amiloide seguida por la realización de un diagnóstico en algunas realizaciones. Los métodos de la invención pueden comprender la detección de autoanticuerpos anti- amiloide seguida por la realización de un diagnóstico y que comprenden además una etapa de determinación del ciclo de terapia para mitigar la enfermedad de Alzheimer u otros trastornos autoinmunitarios relacionados con amiloide. Se contempla además que algunas realizaciones de la invención descritas en el presente documento pueden comprender la detección de autoanticuerpos de interés seguida por la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de IGIV a un paciente que lo necesita.

Los trastornos relacionados con amiloide no incluyen únicamente la enfermedad de Alzheimer (EA), sino también diabetes mellitus de tipo 2, enfermedad de Parkinson, encefalopatía espongiforme transmisible, enfermedad de Huntington, carcinoma medular tiroideo, arritmias cardíacas, aterosclerosis, artritis reumatoide, amiloide aórtico medial, prolactinomas, polineuropatía amiloidótica familiar, amiloidosis sistémica no neuropática hereditaria, amiloidosis relacionada con diálisis, amiloidosis de tipo finlandés, distrofia reticular de la córnea, angiopatía amiloide cerebral, angiopatía amiloide cerebral (de tipo islándico) y amiloidosis sistémica de AL. En algunas realizaciones, la enfermedad o afección correlacionada con el antígeno diana es la enfermedad de Alzheimer.

Por consiguiente, la invención puede utilizarse para detectar y/o capturar autoanticuerpos contra formas específicas de antígenos de amiloide y agregados de amiloide que se encuentran en trastornos relacionados con amiloide. Además, los métodos divulgados en el presente documento pueden aplicarse para detectar anticuerpos contra agregados de proteínas anómalos formados a partir de beta amiloide (Ap), polipéptido amiloide de los islotes (IAPP; amilina), a-sinucleína (SNCA), proteína priónica principal (PrP), huntingtina (HD), calcitonina (CCP), factor natriurético auricular (ANF), apolipoproteína AI (Apo-A1), proteína amiloide A sérica (SAA), amiloide medin (fragmento de la proteína factor eGf 8 del glóbulo de la grasa de leche; MFG-E8), prolactina (PRL), transtiretina (ATTR), lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidasa C), beta 2-microglobulina (p2M), gelsolina (AGEL), proteína ig-h3 inducida por el factor de crecimiento transformante beta (beta ig-h3; queratoepitelina), cistatina C (CST3), cadena ligera de inmunoglobulina (AL), proteínas que tienen repeticiones de poliQ, proteína Tau (Tau) y otras proteínas amiloides.

En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden aplicarse para detectar autoanticuerpos contra cualquier proteína amiloidógena de la técnica, tales como las enumeradas en la siguiente tabla:

Nomenclatura de amiloide: proteínas fibrilares amiloides y sus precursores en humanos*

Proteína amiloide: Precursor de la proteína

AL: Cadena ligera de inmunoglobulina

AH: Cadena pesada de inmunoglobulina

ATTR: Transtiretina

AP2M: p2-microglobulina

AA: (Apo)AA sérico

AapoAl: Apolipoproteína AI

AApo AII: Apolipoproteína AII

Agel: Gelsolina

Alys: Lisozima

Afib: Cadena a de fibrinógeno

Acys: Cistatina C

Abri: ABriPP

Adan: ADanPP

AprP: Proteína priónica

ACal: (Pro)calcitonina

AIAPP: Polipéptido amiloide de los islotes

AANF: Factor natriurético auricular

APro: Prolactina

Alns: Insulina

Amed: Lactadherina

AKer: Queratoepitelina

A(Pin): Desconocido

ALac: Lactoferrina

*Modificada a partir de Westermark, et al., 2002

Independientemente de sus secuencias de aminoácidos variadas, las fuentes de origen o las funciones biológicas, todos los tipos de fibrillas comparten características de tinción y ultraestructurales prácticamente idénticas, por ejemplo, cuando se tiñen con el colorante sulfonato de diazobenzadina rojo Congo y se examinan mediante un 5 microscopio de polarización, las fibrillas muestran una birrefringencia verde característica (véase, Westermark et al. (2002) Amiloid J Protein Folding Disord 9:197-200) y su interacción con tioflavina T (ThT) da como resultado un desplazamiento al rojo de 120 nm en el espectro de excitación de este compuesto benzotiazólico (véase, LeVine et al. (1995) Int J Exp Clin Invest 2:1-6). La demostración de que todas las fibrillas, independientemente de la composición de la proteína, comparten epítopos conformacionales genéricos ha proporcionado evidencias de la 10 presencia de coincidencias estructurales entre estas moléculas. Se contempla que los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para detectar autoanticuerpos que reconocen específicamente determinantes antigénicos expresados en fibrillas de amiloide o productos intermedios de ensamblaje oligomérico solubles mediante la selección del(de los) antígeno(s) diana apropiado(s).

15 En determinadas realizaciones de los métodos proporcionados en el presente documento, la detección de la presencia o el nivel de una proteína amiloide particular es útil para diagnosticar una enfermedad o afección particular, o para seleccionar un candidato para el tratamiento de una enfermedad o afección particular. En la tabla 1 se encuentran ejemplos no limitativos de correlaciones de amiloide-enfermedad que se conocen en la técnica. En determinadas realizaciones, la detección de la presencia o el nivel de un anticuerpo no madurado por afinidad 20 específico para la proteína amiloide enumerada en la tabla 1 será diagnóstico de la enfermedad enumerada correspondiente.

Enfermedad: Proteína amiloide N.° de registro de GenBank N.° de registro de UniProt

Enfermedad de Alzheimer: Beta amiloide (Ap) NP 000475 P05067

Diabetes mellitus de tipo 2: Polipéptido amiloide de los islotes (IAPP; amilina) NP_000406 P10997

Enfermedad de Parkinson: Alfa-sinucleína (SNCA) NP 000336 P37840

Encefalopatía espongiforme transmisible (por ejemplo, enfermedad de Creutzfeldt- Jakob): Proteína priónica principal (prp) NP_000302 P04156

Enfermedad de Huntington: Huntingtina (HD) NP 002102 P42858

Carcinoma medular tiroideo: Calcitonina (CCP) NP 001029124 P01258

Arritmias cardíacas, amiloidosis auricular aislada: Factor natriurético auricular (ANF) NP_006163 P01160

Aterosclerosis: Apolipoproteína AI (Apo-A1) NP 000030 P02647

Artritis reumatoide: Proteína amiloide A sérica (SAA) NP 954630 P02735

Amiloide aórtico medial: Amiloide medin (fragmento de la proteína factor EGF 8 del glóbulo de la grasa de leche; MFG-E8) NP_005919 Q08431

Prolactinomas: Prolactina (PRL) NP 000939 P01236

Polineuropatía amiloidótica familiar: Transtiretina (ATTR) NP_000362 P02766

Amiloidosis sistémica no neuropática hereditaria: Lisozima C (1,4-beta-N-acetilmuramidasa C) NP_000230 P61626

Amiloidosis relacionada con diálisis: Beta 2-microglobulina (p2m), NP_004039 P61769

Amiloidosis de tipo finlandés: Gelsolina (AGEL) NP 000168 P06396

Distrofia reticular de la córnea: Proteína ig-h3 inducida por el factor de crecimiento transformante beta (beta ig-h3; NP_000349 Q15582

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: queratoepitelina)

Angiopatía amiloide cerebral: Beta amiloide (Ap; Abeta) NP_000475 P05067

Angiopatía amiloide cerebral (de tipo islándico): Cistatina C (CST3) NP_000090 P01034

Amiloidosis sistémica de AL: Cadena ligera de inmunoglobulina (AL)

La detección de autoanticuerpos específicos, tales como anticuerpos anti-oligómeros de Ap en el caso de la EA y el Parkinson, puede utilizarse en la evaluación del diagnóstico o de factores de riesgo. Los métodos de diagnóstico de la invención pueden aplicarse a individuos que se considera que corren el riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con amiloide, por ejemplo, basándose en su edad, antecedentes familiares, síntomas cognitivos, etc., tal como puede determinar un experto en medicina.

Los factores de riesgo y síntomas de trastornos relacionados con amiloide se reconocerán del mejor modo por un médico experto. El riesgo de desarrollar estos trastornos aumenta con la edad y se correlaciona con los antecedentes familiares. En muchos casos, un diagnóstico absolutamente definitivo se considera inviable. Los síntomas observables de la EA incluyen la pérdida de memoria disruptiva, diferencias en la capacidad para resolver problemas, confusión en cuanto al tiempo o el lugar, problemas para realizar tareas rutinarias, retraimiento social y cambios en el estado de ánimo. Estos se correlacionan con manifestaciones físicas de la enfermedad tales como una formación de placas de amiloide aumentada y disminución global en el volumen cerebral.

Terapias para la enfermedad de Alzheimer, y otras enfermedades y trastornos relacionados con amiloide

Los métodos descritos en el presente documento comprenden además determinar un pronóstico para la progresión de la enfermedad o una etapa de asignar un ciclo de tratamiento o administrar un tratamiento al sujeto. Generalmente, el ciclo de tratamiento se prescribirá cuando el nivel de anticuerpos anti-amiloide en la muestra biológica esté por encima de un umbral de control (por ejemplo, un umbral que indica una probabilidad alta o progresión de la enfermedad), o se parezca mucho más a un control positivo (por ejemplo, un nivel de control de un grupo o individuo que ha experimentado progresión de la enfermedad) que a un control negativo (por ejemplo, un nivel de control de un grupo o individuo que no ha experimentado progresión de la enfermedad).

Los tratamientos para enfermedades y afecciones relacionadas con amiloide, tales como EA, se centran normalmente en síntomas cognitivos y afectivos de la enfermedad. El tratamiento temprano y los regímenes de prevención incluyen la actividad física y social, juegos para ejercitar la memoria, y puzles y la resolución de problemas. Las terapias farmacéuticas para individuos sintomáticos incluyen inhibidores de colinesterasa (para hacer frente a la acetilcolina reducida), antagonistas parciales del glutamato (por ejemplo, memantina), y fármacos psiquiátricos (por ejemplo, antipsicóticos, somníferos, ansiolíticos y bloqueantes p). Los inhibidores de colinesterasa incluyen Aricept® (clorhidrato de donepezilo), Exelon® (rivastigmina), Razadyne® (galantamina) y Cognex® (tacrina).

También se ha observado que preparaciones de mezclas de inmunoglobulinas (por ejemplo, IGIV) pueden ser eficaces para mejorar los síntomas de la EA. Por ejemplo, la preparación de IGIV (inmunoglobulina intravenosa) es muy conocida en la técnica. Se encuentran métodos para aislar IgG de una mezcla de plasmas, por ejemplo, en las publicaciones de solicitud de patente estadounidenses n.os 2010/0330071 y 2011/0293638. Resumiendo, la IGIV se forma mezclando sangre o plasma donado por más de un individuo (por ejemplo, más de 1000 individuos), separando la fracción de plasma y enriqueciéndola en inmunoglobulina IgG utilizando una combinación de cromatografía, ultrafiltración y diafiltración. La IGIV se administra normalmente por infusión intravenosa. Se divulgan métodos para tratar la EA, el Parkinson y otros trastornos de agregación de proteínas utilizando IGIV en las publicaciones estadounidenses n.os 2009/0148463 y 2009/0221017.

La detección de autoanticuerpos específicos, tales como aquellos contra oligómeros de Ap en el caso de la EA y el Parkinson, puede utilizarse en la evaluación del diagnóstico o de factores de riesgo. Los métodos diagnósticos de la invención pueden aplicarse a individuos que se considera que corren el riesgo de desarrollar un trastorno relacionado con amiloide, por ejemplo, basándose en su edad, antecedentes familiares, síntomas cognitivos, etc., tal como puede determinar un experto en medicina.

Alternativamente, los métodos de detección se utilizan para monitorizar o generar un pronóstico para la progresión de la enfermedad asociada, proviniendo el control de un individuo o grupo de individuos que experimentaron

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progresión de la enfermedad, de tal modo que un nivel similar o aumentado del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad alta o de progresión de la enfermedad. En algunas realizaciones, el control proviene de un individuo o grupo de individuos que no experimentaron progresión de la enfermedad, de tal modo que un nivel similar del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad baja de progresión de la enfermedad. Aún en otra realización, el control proviene del mismo paciente tomado en un momento previo, de tal modo que un nivel aumentado del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad alta o de progresión de la enfermedad. En determinadas realizaciones, la muestra previa puede haberse tomado aproximadamente 1 mes antes, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 meses antes, o 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años antes. Un experto entenderá cómo seleccionar al menos un control apropiado e interpretar los resultados en consecuencia.

Terapias para el lupus eritematoso sistémico, y otras enfermedades y trastornos relacionados con el ADN

Los métodos descritos en el presente documento comprenden además determinar un pronóstico para la progresión de la enfermedad o una etapa de asignar un ciclo de tratamiento o administrar un tratamiento al sujeto. Generalmente, el ciclo de tratamiento se prescribirá cuando el nivel de anticuerpos anti-ADN en la muestra biológica esté por encima de un umbral de control (por ejemplo, un umbral que indica una probabilidad alta o progresión de la enfermedad), o se parezca mucho más a un control positivo (por ejemplo, un nivel de control de un grupo o individuo que ha experimentado progresión de la enfermedad) que a un control negativo (por ejemplo, un nivel de control de un grupo o individuo que no ha experimentado progresión de la enfermedad).

En la técnica se conocen terapias para enfermedades y afecciones relacionadas con el ADN, tales como el lupus eritematoso sistémico. Las terapias farmacéuticas para individuos sintomáticos incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroides (AINE) tales como ibuprofeno y naproxeno, antipalúdicos tales como hidroxicloroquina (Plaquenil™), corticoesteroides tales como prednisona (Deltasone™), hidrocortisona, metilprednisolona (Medrol™) y dexametasona (Decadron™, Hexadrol™), inmunosupresores tales como ciclofosfamida (Cytoxan™) y micofenolato de mofetilo (CellCept™), inhibidores específicos de BLyS tales como Belimumab (Benlysta®), metotrexato (Folex, Mexate, Rheumatrex), un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad, que pueden utilizarse para ayudar a controlar la enfermedad. Otros tratamientos pueden incluir terapias hormonales tales como deshidroepiandrosterona (DHEA) e inmunoglobulina intravenosa, que también es útil para controlar el lupus, particularmente en casos en los que otros tratamientos no han conseguido hacer frente a los síntomas.

La detección de autoanticuerpos específicos, tales como anti-ADNbc en el caso del lupus eritematoso sistémico, puede utilizarse en la evaluación del diagnóstico o de factores de riesgo. Los métodos diagnósticos pueden aplicarse a individuos que se considera que corren el riesgo de desarrollar lupus eritematoso sistémico, por ejemplo, basándose en la genética, la presencia de un autoanticuerpo, tal como autoanticuerpos anti-Sm, anti-RNP, anti-Ro (SSA) y anti-La (SSB), por encima de un umbral de control, la exposición a agentes infecciosos tales como virus, tales como el virus de Epstein-Barr, y la luz del sol, estrés, hormonas, cigarrillos, humo o determinados fármacos, síntomas, etc., tal como puede determinar un experto en medicina.

Los factores de riesgo y síntomas de trastornos autoinmunitarios relacionados con ADN se reconocerán del mejor modo por un médico experto. En muchos casos, un diagnóstico absolutamente definitivo se considera inviable. Los síntomas del lupus eritematoso sistémico pueden ser de leves a graves y pueden incluir uno o más de los siguientes, sin exclusión: articulaciones doloridas o inflamadas (artritis), fiebre sin foco, fatiga extrema, exantema eritematoso en la nariz y las mejillas, cara, orejas, brazos, hombros, pecho, manos, fotosensibilidad, dolor torácico, caída del cabello, anemia, úlceras bucales, dedos pálidos o morados del frío y estrés, cefaleas, mareos, depresión, confusión o convulsiones.

Alternativamente, los métodos de detección se utilizan para monitorizar o generar un pronóstico para la progresión de la enfermedad asociada, proviniendo el control de un individuo o grupo de individuos que experimentaron progresión de la enfermedad, de tal modo que un nivel similar o aumentado del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad alta o de progresión de la enfermedad. El control puede provenir de un individuo o grupo de individuos que no experimentaron progresión de la enfermedad, de tal modo que un nivel similar del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad baja de progresión de la enfermedad. El control puede provenir del mismo paciente tomado en un momento previo, de tal modo que un nivel aumentado del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad alta o de progresión de la enfermedad. La muestra previa puede haberse tomado aproximadamente 1 mes antes, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 meses antes, o 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años antes. Un experto entenderá cómo seleccionar al menos un control apropiado e interpretar los resultados en consecuencia.

Terapias para la tiroiditis, y otras enfermedades y trastornos relacionados con la tiroglobulina o tubulina

Los métodos descritos en el presente documento comprenden además determinar un pronóstico para la progresión de la enfermedad o una etapa de asignar un ciclo de tratamiento o administrar un tratamiento al sujeto.

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Generalmente, el ciclo de tratamiento se prescribirá cuando el nivel de autoanticuerpos anti-tiroglobulina o anti- tubulina en la muestra biológica esté por encima de un umbral de control (por ejemplo, un umbral que indica una probabilidad alta o progresión de la enfermedad), o se parezca mucho más a un control positivo (por ejemplo, un nivel de control de un grupo o individuo que ha experimentado progresión de la enfermedad) que a un control negativo (por ejemplo, un nivel de control de un grupo o individuo que no ha experimentado progresión de la enfermedad).

En la técnica se conocen terapias de enfermedades y afecciones relacionadas con la tiroglobulina, tales como tiroiditis, por ejemplo, la enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, hipotiroidismo, cáncer de tiroides, tirotoxicosis. Las terapias farmacéuticas para individuos sintomáticos incluyen la reposición hormonal, tal como el tratamiento con levotiroxina (Levothroid™, Levoxil™, Synthroid ™), dieta especial y complementación, que pueden utilizarse para ayudar a controlar la enfermedad. Otros tratamientos incluyen inmunoglobulina intravenosa, que tiene un efecto demostrado en el tratamiento de hipotiroidismo preclínico en pacientes con tiroiditis de Hashimoto.

La detección de autoanticuerpos específicos, tales como anti-tiroglobulina en el caso de la tiroiditis de Hashimoto, puede utilizarse en la evaluación del diagnóstico o de factores de riesgo. Los métodos diagnósticos de la invención pueden aplicarse a individuos que se considera que corren el riesgo de desarrollar tiroiditis de Hashimoto, por ejemplo, basándose en la genética, la presencia de un autoanticuerpo tal como autoanticuerpos anti-peroxidasa tiroidea por encima de un umbral de control, niveles de TSH, síntomas, etc., tal como puede determinar un experto en medicina.

Los factores de riesgo y síntomas de trastornos autoinmunitarios relacionados con tiroglobulina se reconocerán del mejor modo por un médico experto. En muchos casos, un diagnóstico absolutamente definitivo se considera inviable. Los síntomas de la tiroiditis de Hashimoto pueden ser de leves a graves, y pueden incluir uno o más de los siguientes, sin exclusión: los síntomas de la tiroiditis de Hashimoto, la forma más común de hipotiroidismo autoinmunitario, pueden incluir glándula tiroides inflamada, fatiga crónica, mayor sensibilidad al frío, estreñimiento, depresión, cara hinchada, voz ronca, nivel elevado de colesterol en sangre, dolores musculares, dolor a la palpación, y rigidez, debilidad muscular, menorragia, sequedad del cabello y la piel, falta de concentración, hinchazón de los pies o las piernas y ganancia de peso.

Alternativamente, los métodos de detección se utilizan para monitorizar o generar un pronóstico para la progresión de la enfermedad asociada, proviniendo el control de un individuo o grupo de individuos que experimentaron progresión de la enfermedad, de tal modo que un nivel similar o aumentado del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad alta o de progresión de la enfermedad. El control puede provenir de un individuo o grupo de individuos que no experimentaron progresión de la enfermedad, de tal modo que un nivel similar del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad baja de progresión de la enfermedad. El control puede provenir del mismo paciente tomado en un momento previo, de tal modo que un nivel aumentado del complejo remanente en relación con el control es indicativo de una probabilidad alta o de progresión de la enfermedad. En determinadas realizaciones, la muestra previa puede haberse tomado aproximadamente 1 mes antes, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 meses antes, o 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más años antes. Un experto entenderá cómo seleccionar al menos un control apropiado e interpretar los resultados en consecuencia.

Composiciones farmacéuticas y dosificaciones

Se contempla que los métodos descritos en el presente documento pueden utilizarse para normalizar o cuantificar la cantidad de un autoanticuerpo no madurado por afinidad de interés en una muestra biológica, seleccionada de los tipos descritos en el presente documento, que entonces puede administrarse a un sujeto que lo necesita por su efecto terapéutico. El autoanticuerpo de interés puede ser polirreactivo. Alternativamente, los métodos descritos en el presente documento se utilizan para capturar autoanticuerpos no madurados por afinidad de interés a partir de una muestra biológica para que de este modo se reconstituyan en una formulación para su administración a un sujeto que lo necesita. Una composición farmacéutica que comprende inmunoglobulina, por ejemplo, una preparación de inmunoglobulina enriquecida que comprende anticuerpos humanos heterogéneos puede administrarse mediante varios métodos conocidos en la técnica. La vía y/o el modo de administración varían dependiendo de los resultados deseados, pero normalmente será intravenoso, intramuscular, intraperitoneal o subcutáneo. La composición farmacéutica puede incluir un vehículo adecuado aceptable para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, medular o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión).

La fluidez apropiada de la composición puede mantenerse, por ejemplo, utilizando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de una dispersión y utilizando tensioactivos. En algunos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción a largo plazo de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

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Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse según métodos muy conocidos y puestos en práctica de manera rutinaria en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Co., 20.a ed., 2000; y Sustained and Controlled Release Drug Delivery Sistems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Las composiciones farmacéuticas se fabrican preferiblemente en condiciones de BPF. Normalmente, se emplea una dosis terapéuticamente eficaz o dosis eficaz de la preparación de inmunoglobulina en las composiciones farmacéuticas de la invención. La composición farmacéutica puede formularse en forma de formas de dosificación mediante métodos convencionales conocidos por los expertos en la técnica. Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, varias dosis divididas a lo largo del tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Puede ser ventajoso formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitarias para facilitar su administración y la uniformidad de la dosificación. Forma de dosificación unitaria, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a unidades diferenciadas desde un punto de vista físico adecuadas para dosificaciones unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.

Los niveles de dosificación reales pueden variarse para obtener así una cantidad del principio activo que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente particular sin que sea tóxica para el paciente. Un médico puede comenzar con dosis de la composición farmacéutica en niveles inferiores a los requeridos para conseguir el efecto terapéutico deseado y aumentar la dosificación gradualmente hasta conseguir el efecto deseado. En general, las dosis eficaces varían dependiendo de muchos factores diferentes, que incluyen la enfermedad o afección específica que va a tratarse, su gravedad, el estado fisiológico del paciente, otros medicamentos administrados, y de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. Un régimen de tratamiento a modo de ejemplo implica la administración una vez cada dos semanas, o una vez al mes, o una vez de cada 3 a 6 meses.

La composición puede administrarse en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosificaciones individuales pueden ser semanales, mensuales o anuales. Los intervalos también pueden ser irregulares según se indique midiendo la evolución terapéutica en el paciente. La dosificación y la frecuencia pueden variar dependiendo de la semivida de los anticuerpos en el paciente.

En el caso de una preparación de inmunoglobulina, se utiliza normalmente inmunoglobulina intravenosa (IGIV). La formulación de IGIV se diseña para la administración mediante inyección. Debido a que la preparación de IgG de esta invención ha conseguido una concentración de inmunoglobulina excepcionalmente alta (por ejemplo, el 10% p/v en algunas realizaciones, el 15 % p/v en otras realizaciones, el 20 % p/v todavía en otras realizaciones, y hasta el 25 % p/v todavía en realizaciones adicionales), que reduce significativamente el volumen para una dosis terapéuticamente eficaz, la composición de la presente invención es particularmente ventajosa para la administración subcutánea y/o intramuscular a un paciente, así como la administración intravenosa.

El término "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de una preparación de inmunoglobulina, particularmente IgG, que da como resultado una mejora o remedio de una afección médica que está tratándose en el sujeto (por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, lupus eritematoso sistémico, tiroiditis, trastornos hepáticos autoinmunitarios, pérdida de audición autoinmunitaria y tiroidopatías autoinmunitarias, etc.). Un médico puede determinar una cantidad eficaz que va a administrarse al sujeto teniendo en cuenta diferencias individuales en edad, peso, gravedad de la enfermedad, vía de administración (por ejemplo, intravenosa frente a subcutánea) y respuesta a la terapia. Una preparación de inmunoglobulina puede administrarse a un sujeto en de aproximadamente 300 a aproximadamente 600 mg/kilogramos cada 3 a 4 semanas en función de la respuesta clínica. Para la administración intravenosa, una tasa de infusión inicial a modo de ejemplo sería de 0,5 ml/kg/h (0,8 mg/kg/min) durante 30 minutos mientras que la tasa de infusión de mantenimiento a modo de ejemplo sería aumentar la tasa cada 30 minutos si se tolera hasta 5 ml/kg/h (8 mg/kg/min).

Para la administración subcutánea, una dosis a modo de ejemplo es de 1,37 veces la dosis intravenosa previa dividida entre el número de semanas entre dosis intravenosas, mientras que una dosis de mantenimiento a modo de ejemplo se basa en la respuesta clínica y el nivel valle de IgG diana. Para la administración subcutánea a individuos con un peso corporal de 40 kg y mayor, una tasa de infusión inicial a modo de ejemplo es de 30 ml/sitio a 20 ml/h/sitio, mientras que una tasa de infusión de mantenimiento a modo de ejemplo es de 30 ml/sitio a 2030 ml/h/sitio. Para la administración subcutánea a individuos con un peso corporal de menos de 40 kg, una tasa de infusión inicial a modo de ejemplo es de 20 ml/sitio a 15 ml/h/sitio, mientras que una tasa de infusión de mantenimiento a modo de ejemplo es de 20 ml/sitio a 15-20 ml/h/sitio. Las dosis de la preparación de inmunoglobulina pueden ser mayores o menores. Los facultativos familiarizados con las enfermedades tratadas mediante preparaciones de IgG pueden determinar la dosis apropiada para un paciente según criterios conocidos en la técnica.

Un médico puede determinar el tiempo requerido para finalizar un ciclo de tratamiento y puede oscilar entre únicamente un día y más de un mes. En determinadas realizaciones, un ciclo de tratamiento puede ser desde 1 hasta 6 meses.

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Kits

La presente divulgación describe además kits para la detección y/o el aislamiento de autoanticuerpos no madurados por afinidad, incluyendo autoanticuerpos polirreactivos. Los kits pueden utilizarse para diagnosticar cualquier trastorno autoinmunitario, e identificar un individuo susceptible de un método de terapia particular, tal como con IGIV.

Los kits incluirán normalmente instrucciones para su uso en formato escrito o electrónico, y reactivos, disoluciones y tampones convencionales para el ensayo deseado. El kit puede incluir opcionalmente controles o equipo de laboratorio consumible convencional, tal como placas de ELISA, herramientas de cromatografía, envases y recipientes de reacción. El kit también puede incluir dispositivos para la recogida de una muestra biológica, por ejemplo, jeringas y dispositivos de fraccionamiento de sangre.

Los kits pueden incluir materiales descritos en el presente documento para la detección de anticuerpos polirreactivos no madurados por afinidad específicos para cualquier antígeno diana endógeno, incluyendo sin exclusión, ADN, tubulina, tiroglobulina y amiloide. El kit puede incluir reactivos de cromatografía tiófila, y tampones de elución y lavado apropiados para separar las IgG de otras proteínas en la muestra.

El kit también puede incluir materiales para separar autoanticuerpos no madurados por afinidad de interés de anticuerpos no específicos. Tales materiales pueden incluir un soporte sólido conjugado con la forma deseada de antígeno diana, por ejemplo, monomérica, oligomérica (globular), polimérica o de agregado. El soporte sólido puede ser una perla, una fase estacionaria de cromatografía (por ejemplo, agarosa, sílice, etc.), una placa de ELISA, etc. Los materiales también pueden incluir en algunas realizaciones al menos un tampón de lavado caótropo, para separar y eliminar anticuerpos de baja afinidad del soporte conjugado a amiloide tras la detección para su reconstitución en una formulación para uso terapéutico o procesamiento adicional.

Ejemplos

A continuación, se proporcionan ejemplos para ilustrar la presente invención.

Ejemplo 1: Medición de IgG anti-amiloide(1-40) (A¡340) en plasma y en una preparación de IgG intravenosa (IGIV)

Se disolvió el péptido Ap40 humano sintético (Calbiochem) a una concentración de 1 mg/ml en ácido trifluoroacético y se diluyó hasta 10 pg/ml con tampón de NaHCO3-Na2CO3 0,1 M, pH 9,5. Esta disolución se incubó con los pocillos de una placa Maxisorp F96 de NUNc a 4 °C durante la noche (100 pl/pocillo). Entonces, la placa se lavó con tampón de lavado que tenía una concentración de NaCl con una conductividad de 16 mS/cm o de baja conductividad. En ambos casos, el tampón de lavado fue HEPES 20 mM, CaCh 2 mM, Tween 20 al 0,1 % que contenía NaCl 0 (WBs)

0 150 mM (WBi). Las muestras, una preparación de plasma de referencia humano n.° 1R92 y una preparación intravenosa de IGIV (Gammagard Liquid, n.° LE12G036), se diluyeron utilizando el respectivo tampón de lavado tras la adición de seroalbúmina humana (hSA) a 10 mg/ml. Estos tampones de dilución se utilizaron también para bloquear la placa, lo cual se consiguió mediante incubación a temperatura ambiente (TA) durante 2 h. Entonces, la placa se lavó y después se incubó con la serie de dilución de las muestras (100 pl/pocillo) durante 2 h. Tras una etapa de lavado, se incubó un conjugado de anticuerpo de conejo anti-IgG humana-peroxidasa (Dako P-214), diluido en el respectivo tampón de dilución (1/1000) con la placa (100 pl/pocillo) a TA durante 1 h. La incubación se terminó con una etapa de lavado y se midió la peroxidasa unida con el sustrato de tetrametilbencidina SureBlue listo para su utilización (KPL; 100 pl/pocillo), incubado a TA hasta que se desarrolló el color apropiado. Entonces, se detuvo la reacción con 100 pl/pocillo de ácido sulfúrico 1,5 M. En el plazo de 60 min, la placa se midió entonces en un lector de ELISA a 450 nm con una medición de referencia a 620 nm. Las densidades ópticas (DO) medidas para la serie de dilución se corrigieron entonces por sustracción de un blanco de reactivos, idéntico para todas las diluciones, y por sustracción de un blanco específico para la muestra y la dilución. Este blanco específico se obtuvo incubando la serie de dilución con pocillos de blanco, en los que no se había aplicado péptido Ap40 como recubrimiento. La figura

1 muestra las curvas de unión obtenidas para plasma humano y la preparación de IGIV utilizando las condiciones de conductividad de 16 mS/cm o de baja conductividad a lo largo de todo el ensayo.

Las condiciones de baja conductividad utilizadas durante el ensayo potenciaron claramente la unión de IgG anti-Ap natural, presente en plasma humano y una preparación de IGIV, al péptido Ap40 unido a la placa. Por tanto, las señales obtenidas fueron al menos 100 veces más altas cuando se utilizó el tampón HEPES 20 mM de baja conductividad a lo largo de todo el ensayo para el lavado, la dilución y la detección. Además, utilizando un tampón de baja conductividad disminuyó significativamente (>50 %) la razón entre las señales medidas en pocillos recubiertos con Ap y en pocillos de blanco. La unión a pocillos de blanco se redujo en más de un 60 % en el sistema de baja conductividad.

Ejemplo 2: Medición de IgG anti-A@42 en productos intermedios de IGIV

Se investigaron ocho lotes de un producto intermedio de procedimiento para el procedimiento de fabricación de IGIV con una pureza superior al 85 % para determinar sus niveles de IgG anti-Ap42 utilizando los métodos descritos en el

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ejemplo 1. A diferencia de los tampones descritos, los tampones utilizados no contenían CaCl2. La figura 2 muestra los niveles de IgG anti-Ap42 medidos, expresados como DO corregida con respecto al blanco por mg de IgG.

En todos los casos, las condiciones de baja conductividad dieron como resultado señales claramente aumentadas. La señal de ensayo obtenida en condiciones de baja conductividad fue en promedio 50 veces superior a la obtenida en condiciones de 16 mS/cm. Los aumentos individuales oscilaron entre 24 y 102 veces. Simultáneamente, la razón entre las señales en pocillos recubiertos con Ap y de blanco disminuyó más de un 50 % en promedio y se encontraron razones medias de 0,13 y 0,04 paras las condiciones de 16 mS/cm o de baja conductividad.

Ejemplo 3: Medición de IgG anti-oligómero de Ap40 (CAPS) en productos intermedios de IGIV

Se recubrieron placas con anticuerpos anti-oligómeros de Ap40 (CAPS, especie de proteína p-amiloide reticulada), obtenidos tal como se describe (O'Nuallain B. et al., (2010): J Clin Immunol mayo; 30 Supl. 1:S37-42). Entonces el ensayo se realizó tal como se describe en el ejemplo 1 utilizando tampones sin CaCl2. Se investigaron ocho lotes de un producto intermedio de procedimiento para el procedimiento de fabricación de IGIV con una pureza superior al 85 % para determinar sus niveles de IgG anti-CAPS. La tabla 2 muestra los resultados proporcionando las concentraciones de IgG (en pg/ml) y las señales correspondientes obtenidas en los pocillos recubiertos con CAPS (DO) y los pocillos de blanco (Blanco). Además, se proporcionan la razón (Razón) y la diferencia (A) entre las correspondientes señales y la señal normalizada respecto a la concentración de proteína, expresada como DO/mg:

Tabla 2: Medición de IgG anti-CAPS

Condiciones de 16 mS/cm

Muestra: IgG (pg/ml) DO Blanco Razón ADO DO/mg

O o o d: 654 1,107 0,075 0,07 1,033 1,58

n.° 002: 421 1,086 0,095 0,09 0,991 2,36

n.° 003: 595 1,418 0,189 0,13 1,229 2,07

n.° 004: 493 1,324 0,112 0,08 1,212 2,46

n.° 005: 456 1,133 0,100 0,09 1,034 2,27

n.° 006: 487 0,917 0,160 0,17 0,757 1,55

n.° 007: 398 1,061 0,174 0,16 0,887 2,23

n.° 008: 515 0,802 0,133 0,17 0,669 1,30

Condiciones de baja conductividad

Muestra: IgG (pg/ml) DO Blanco Razón ADO DO/mg

O o o d: 6,54 0,489 0,009 0,02 0,480 73

n.° 002: 4,21 0,424 0,014 0,03 0,410 98

n.° 003: 5,95 0,601 0,005 0,01 0,596 100

n.° 004: 4,93 0,437 0,009 0,02 0,428 87

n.° 005: 4,56 0,529 0,004 0,01 0,525 115

n.° 006: 4,87 0,596 0,012 0,02 0,584 120

n.° 007: 3,98 0,579 0,021 0,04 0,558 140

n.° 008: 5,15 0,471 0,011 0,02 0,460 89

La cantidad de complejos de antígeno-anticuerpo formados aumentó tal como muestran las intensidades de señal aumentadas obtenidas en el sistema de ensayo de baja conductividad. Esto se observó para todas las muestras investigadas. La intensidad de señal aumentó en promedio 54 veces con valores individuales de entre 35 y 77 veces.

Ejemplo 4: Medición de IgG anti-fibrilla de Ap en productos intermedios de IGIV

Se recubrieron placas con anticuerpos anti-fibrillas de Ap obtenidos tal como se describe (O'Nuallain B. et al., (2008). Biochemistry 47, 12254-12256). Entonces el ensayo se realizó tal como se describe en el ejemplo 1 utilizando tampones sin CaCl2. Se investigaron ocho lotes de un producto intermedio de procedimiento para el procedimiento de fabricación de IGIV con una pureza superior al 85 % para determinar sus niveles de IgG anti-CAPS. La figura 3 muestra los niveles de IgG anti-fibrilla de Ap medidos, expresados como DO corregida con respecto al blanco por mg de IgG.

En todos los casos, las condiciones de baja conductividad dieron como resultado señales claramente aumentadas. La señal de ensayo obtenida en condiciones de baja conductividad fue en promedio 64 veces superior a la obtenida en condiciones de 16 mS/cm. Los aumentos individuales oscilaron entre 41 y 116 veces.

Ejemplo 5: Medición de IgG anti-ADN en plasma humano

Los anticuerpos anti-ADN son autoanticuerpos humanos bien descritos. El ejemplo 5 muestra las curvas de unión obtenidas en un ensayo en fase sólida para IgG anti-ADN en plasma humano obtenidas en condiciones de ensayo

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de baja conductividad y 16 mS/cm. Se incubó ADN monocatenario (timo de ternera, Sigma D8899) a 5 pg/ml con los pocilios de una placa Maxisorp F96 de NUNC a 4 °C durante la noche (100 pl/pocillo). Entonces, el ensayo de unión en fase sólida se realizó tal como se describe en el ejemplo 1 utilizando tampones sin CaCl2. Se utilizó la preparación de plasma de referencia n.° 1R01B00 de Technoclone (Viena). La serie de dilución comenzó con una dilución mínima de 1/20 correspondiente a una concentración de IgG de 250 pg/ml. El diseño del ensayo, es decir, el método utilizado para obtener el blanco específico para la muestra y la dilución se realizó como se describe en el ejemplo 1. La figura 4 muestra las curvas de unión obtenidas utilizando una forma de presentación como log/lin debido a las grandes diferencias en las intensidades de señal observadas para los dos sistemas de tampón.

Las curvas de concentración-respuesta son una clara evidencia de que el tampón de baja conductividad aumentó la intensidad de señal al menos en un factor de 100. Además, la unión a los pocillos de blanco que representaba el 67% de la señal obtenida en condiciones de 16 mS/cm, disminuyó un 90% utilizando las condiciones de baja conductividad.

Ejemplo 6: Medición de IgG anti-tubulina en plasma humano

La tubulina forma parte de los microtúbulos, estructuras filamentosas cilindricas presentes en casi todas las células eucariotas y forma parte del sistema citoesquelético. Los autoanticuerpos anti-tubulina son un componente normal de algunos sueros humanos, aunque la mayoría de la IgG anti-tubulina parece estar presente en forma de complejos inmunitarios (Bernier-Valentin et al., (1988): Clin. exp. Immunol. 71, 261-268). El ejemplo 6 muestra las curvas de unión obtenidas en un ensayo en fase sólida para IgG anti-tubulina en plasma humano obtenida en condiciones de baja conductividad y 16 mS/cm. La tubulina (porcina, Sigma T6954) se incubó a 5 pg/ml con los pocillos de una placa Maxisorp F96 de NUNC a4°C durante la noche (100 pl/pocillo). Entonces, el ensayo de unión en fase sólida se realizó tal como se describe en el ejemplo 1 utilizando tampones sin CaCl2. Se utilizó la preparación de plasma de referencia n.° 1R01B00 de Technoclone (Viena). La serie de dilución comenzó con una dilución mínima de 1/20 correspondiente a una concentración de IgG de 250 pg/ml. El diseño del ensayo, es decir, el método utilizado para obtener el blanco específico para la muestra y la dilución se realizó tal como se describe en el ejemplo 1. La figura 5 muestra las curvas de unión obtenidas utilizando una forma de presentación como log/lin debido a las grandes diferencias en las intensidades de señal observadas para los dos sistemas de tampón.

Las curvas de concentración-respuesta son una clara evidencia de que el tampón de baja conductividad aumentó la intensidad de señal al menos en un factor de 100. Además, la unión a los pocillos de blanco que representaba el 50% de la señal obtenida en condiciones de 16 mS/cm, disminuyó un 90% utilizando las condiciones de baja conductividad.

Ejemplo 7: Medición de IgG anti-tiroglobulina en plasma humano

El ejemplo 7 muestra las curvas de unión obtenidas en un ensayo en fase sólida para IgG anti-tiroglobulina en plasma humano obtenida en condiciones de baja conductividad y 16 mS/cm. La tiroglobulina (porcina, Sigma T1126) se incubó a 5 pg/ml con los pocillos de una placa Maxisorp F96 de NUNC a 4 °C durante la noche (100 pl/pocillo). Entonces, el ensayo de unión en fase sólida se realizó tal como se describe en el ejemplo 1 utilizando tampones sin CaCl2. Se utilizó la preparación de plasma de referencia n.° 1R01B00 de Technoclone (Viena). La serie de dilución comenzó con una dilución mínima de 1/20 correspondiente a una concentración de IgG de 250 pg/ml. El diseño del ensayo, es decir, el método utilizado para obtener el blanco específico para la muestra y la dilución se realizó tal como se describe en el ejemplo 1. La figura 6 muestra las curvas de unión obtenidas utilizando una forma de presentación como log/lin debido a las grandes diferencias en las intensidades de señal observadas para los dos sistemas de tampón. Las curvas de concentración-respuesta son una clara evidencia de que el tampón de baja conductividad aumentó la intensidad de señal al menos en un factor de 100.

Ejemplo 8: Influencia de la conductividad sobre la sensibilidad de la detección de autoanticuerpo IgG anti-ADN de plasma humano

Se utilizaron también las condiciones y la preparación del ADN descritas en el ejemplo 5 para investigar la influencia de la conductividad de los tampones de ensayo utilizados sobre la sensibilidad del ensayo. Por tanto, se preparó un tampón HEPES 20 mM que contenía ocho concentraciones diferentes de NaCl que oscilaban entre 0 y 150 mM, y se utilizó como tampón de lavado y tras la adición de hSA a 10 mg/ml para diluir la muestra de plasma humano de referencia. La figura 7 muestra las ocho curvas de unión obtenidas.

A partir de los resultados, fue evidente una relación entre la conductividad de los tampones de ensayo y la sensibilidad del ensayo de unión de anti-ADN en fase sólida. Por tanto, la concentración de IgG requerida para obtener, por ejemplo, una señal corregida con respecto al blanco de 0,2 difirió en un factor de 1000 cuando se comparó la señal obtenida con el tampón de NaCl 150 mM con la del tampón que no contenía NaCl. La relación proporcional inversa entre la conductividad y la intensidad de señal se ajustaba a una función matemática como la que se muestra en la figura 8, en la que las intensidades de señal relativas se representan frente a la conductividad de los tampones de ensayo utilizados. La curva de regresión lineal entre la conductividad y el logaritmo de la intensidad de señal tenía un coeficiente correlación al cuadrado de R2 = 0,98, lo que respalda fuertemente la

5

10

15

20

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30

35

40

conclusión de que este aumento en la intensidad de señal se basa en una relación funcional.

Ejemplo 9: Estudio de competencia que muestra la especificidad de la unión de IgG anti-ADN y anti-tubulina en condiciones de baja conductividad

La competencia con antígeno soluble es un enfoque común para demostrar la especificidad de las pruebas de unión utilizando antígeno unido a placa. Este enfoque se utilizó, por tanto, para confirmar que las condiciones de baja conductividad no favorecían la unión no específica, lo cual se planteó como hipótesis como una posible explicación para las intensidades de señal aumentadas observadas en estas condiciones. Esto se muestra en el ejemplo 9, en el que la unión de IgG anti-ADN y anti-tubulina a sus antígenos unidos a placa se llevó a cabo con antígenos solubles. Con este fin, la muestra de plasma se incubó durante 1 h con concentraciones decrecientes del respectivo antígeno. Entonces, estas muestras se analizaron tal como se describe en el ejemplo 5 y el ejemplo 6, respectivamente. La figura 9 muestra las curvas de competencia obtenidas con una competencia dependiente de la concentración clara provocadas por el antígeno en disolución en ambos casos. Se obtuvieron niveles de competencia del 50 % con la unión al antígeno unido a placa en concentraciones de 9,9 y 18 pg/ml para el ADN y la tubulina, respectivamente. Estos datos confirman que la baja conductividad de los tampones de ensayo no afectó a la especificidad de los ensayos de unión.

Ejemplo 10: Rendimiento de un sistema ELISA convencional utilizando anticuerpos derivados de inmunización en condiciones de ensayo de baja conductividad

Hay autoanticuerpos presentes en el plasma sin inmunización o vacunación previa con su antígeno diana contra el que se dirigen. Este definitivamente no es el caso para casi todos los anticuerpos utilizados para ELISA, que se generan normalmente mediante inmunización activa con el antígeno diana. Este proceso es el principal responsable de las diferencias entre autoanticuerpos y sus homólogos que se generan mediante inmunización activa. El ejemplo 10 investiga si el uso de tampones de baja conductividad para un ensayo ELISA de anticuerpos generados mediante inmunización activa aumentó la sensibilidad en esos casos. Por tanto, se utilizó un ELISA validado, bien establecido, para la a-i-antitripsina basado en el uso de IgG policlonal de conejo (Weber A. et al., (2011): Vox Sanguinis abril; 100(3):285-97) intercambiando el tampón de 16 mS/cm con un sistema de tampón de baja conductividad. Este ensayo se realizó sin ningún cambio obvio. Sin embargo, al contrario de los resultados de ensayos de unión de diversos autoanticuerpos, no se observó aumento en la intensidad de señal para los anticuerpos generados mediante inmunización activa.

Basándose en la presente divulgación, los expertos en la técnica apreciarán que la presente invención puede emplearse para detectar autoanticuerpos que abarcan una variedad de afinidades, avideces y reactividades (polirreactivos frente a monovalentes) diferentes y para diferentes tipos de antígenos diana, incluyendo péptidos y ácidos nucleicos. Se contempla que los métodos proporcionados en el presente documento también pueden detectar autoanticuerpos que tienen una alta avidez por antígenos diana cuyas regiones Fab son específicas, aunque no necesariamente con sensibilidad potenciada en ensayos ELISA convencionales.

Claims

10

15

2.

20 3.

4.

25 5.

6.

30

7. 35

8.

40

45

9.

50 10.

11.

55

12.

60

REIVINDICACIONES

Un método para detectar un autoanticuerpo en una muestra biológica, siendo dicho autoanticuerpo específico para un antígeno diana, comprendiendo el método las etapas de:

(a) poner en contacto la muestra biológica en una condición de baja conductividad con el antígeno diana por el que el autoanticuerpo tiene afinidad de unión específica; y

(b) detectar la unión de dicho antígeno diana a dicho autoanticuerpo en la muestra biológica,

en el que dicho antígeno diana se inmoviliza en una fase sólida y la presencia de dicha unión es indicativa del autoanticuerpo en la muestra biológica, y

en el que la condición de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM.

El método de la reivindicación 1, en el que el autoanticuerpo es un autoanticuerpo no madurado por afinidad.

El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, una fracción de los mismos y un derivado procesado de los mismos.

El método de la reivindicación 1 o 2, en el que la muestra biológica es una preparación de IgG intravenosa.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la muestra biológica se deriva de un ser humano.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la condición de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 60 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 40 mM o menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 20 mM.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la fase sólida comprende una microplaca.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicha etapa de detección (b) comprende:

(i) poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo específico de especie que se une al autoanticuerpo contra el antígeno diana, en el que el anticuerpo específico de especie es específico para la especie de la que se obtuvo la muestra biológica en condiciones suficientes para la unión específica del anticuerpo específico de especie al autoanticuerpo correspondiente presente; y

(ii) detectar cualquier complejo que comprenda el antígeno diana unido al autoanticuerpo correspondiente, que está unido al anticuerpo específico de especie.

El método de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo específico de especie se conjuga con un resto detectable.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el autoanticuerpo se selecciona de un anticuerpo IgG, anticuerpo IgA y anticuerpo IgM.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la muestra biológica se diluye al menos 1000 veces o al menos 5000 veces con un tampón de dilución de baja conductividad antes de la etapa (a).

El método de la reivindicación 11, en el que el tampón de dilución de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 150 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 120 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 60 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 40 mM o menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 20 mM.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que comprende además, antes de la etapa (b): lavar la fase sólida con un tampón de lavado de baja conductividad.

14.: El método de la reivindicación 13, en el que el tampón de lavado de baja conductividad tiene una conductividad menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 150 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 120 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 90 mM, menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 60 mM,

5: menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 40 mM o menor que la conductividad de una disolución de cloruro de sodio 20 mM.

15.: El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el autoanticuerpo es un autoanticuerpo específico de amiloide p.

10 16.: El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el autoanticuerpo se selecciona de un autoanticuerpo específico de ADN, un autoanticuerpo específico de tubulina y un autoanticuerpo específico de tiroglobulina.