ES2689244B2 - PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE NUCLEOSIDOS EN UN SOLO PASO EN PRESENCIA DE UNA ENZIMA NUCLEOSIDO 2¿-DESOXIRRIBOSILTRANSFERASA TERMOESTABLE TIPO II PROCEDENTE DE CHROOCOCCIDIOPSIS THERMALIS PCC 7203 (CtNDT) - Google Patents

Description

DESCRIPCION

PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE NUCLEOSIDOS EN UN SOLO PASO EN

PRESENCIA DE UNA ENZIMA NUCLEOSIDO 2-DESOXIRRIBOSILTRANSFERASA

TERMOESTABLE TIPO II PROCEDENTE DE CHROOCOCCIDIOPSIS THERMALIS PCC

7203 (CNDT)

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invention se encuadra dentro del campo de la biotecnologla. Mas concretamente, se refiere a la obtencion de nucleosidos naturales y no naturales con actividad terapeutica mediante metodos biotecnologicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Los acidos nucleicos son moleculas de vital importancia para los seres vivos ya que estan implicados en diferentes tipos de procesos bioqulmicos, como almacenamiento y transferencia de information genetica. Por ello, numerosos compuestos derivados de acido nucleicos (NADs) han sido utilizados en diferentes areas de investigation con diversos fines.

En este sentido diversos NADs son utilizados habitualmente en el tratamiento de diferentes tipos de cancer, enfermedades linfoproliferativas, infecciones virales (como hepatitis o VIH) y algunas enfermedades inflamatorias, como por ejemplo la enfermedad de Crohn, as! como materiales de partida para la slntesis de oligonucleotidos antisentido.

La slntesis de NADs se ha llevado a cabo tradicionalmente mediante metodos qulmicos que implican numerosos de pasos de proteccion-desproteccion de grupos funcionales y conllevan la presencia de mezclas de esteroisomeros, dificultando el proceso de purification de los productos y disminuyendo el rendimiento global de la reaction.

Ademas, el uso necesario de re-agentes y disolventes organicos contaminantes, hace que estos procesos sean poco sostenibles lo cual desde un punto de vista industrial dificulta el escalado de los mismos. Debido a ello, este tipo de compuestos presentan precios elevados, impidiendo su uso cllnico en muchos casos y limitando su aplicacion en industrias como la farmaceutica o la alimentaria. En las ultimas decadas se ha convertido una practica habitual en la industria la sustitucion parcial o total de estos metodos qulmicos por metodos enzimaticos (Boryski J. Curr Org Chem 2008, 12:309-325; Fresco-Taboada A, de la Mata I, Arroyo M, Fernandez-Lucas J. Appl Microbiol Biotechnol 2013, 97:3773-3785; FernandezLucas, J. Appl Microbiol Biotechnol 2015, 99, 4615-4627; Rozzell, J. D. Bioorg Med Chem 1999, 7: 2253-2261).

La slntesis enzimatica de NADs mediante celulas enteras o enzimas supone una interesante alternativa a los tradicionales metodos qulmicos que ofrece muchas ventajas, como la reaccion en un solo recipiente (one-pot), bajo condiciones suaves de pH y temperatura, con una total estereo, regio y enantioselectividad y bajo unas condiciones respetuosas con el medio ambiente. Dichas reacciones se pueden llevar a cabo mediante una unica enzima con el objetivo de llevar a cabo una reaccion espedfica en un solo paso (“one-pot, one step”), o bien mediante dos o mas enzimas que actuen secuencialmente o en paralelo (“one-pot, x steps”) para conseguir los productos deseados.

Las nucleosido desoxirribosiltransferasas (NDTs) (EC 2.4.2.6) catalizan la reaccion de transglicosilacion entre bases puricas y/o pirimidlnicas (Fresco-Taboada A, de la Mata I, Arroyo M, Fernandez-Lucas J. Appl Microbiol Biotechnol 2013, 97:3773-3785) utilizando un 2’-desoxirribonucleosido que actua como donador y una base nitrogenada como aceptor. La reaccion transcurre a traves de un intermedio covalente enzima-sustrato generado por el ataque nucleofilo de un residuo de acido glutamico (Glu) catalltico sobre el carbono anomerico del 2'-desoxirribonucleosido. Posteriormente este complejo es atacado por una segunda base generando un 2'-desoxirribonucleosido de igual configuration a la inicial (anomero P). La reaccion llevada a cabo es la siguiente:

donde B1 y B2 son purina o pirimidina.

En funcion de la especificidad en el reconocimiento de sustrato existen dos tipos de NDTs, las nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasas tipo I (PDT), especlficas para bases puricas, y las nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasas tipo II (NDT), que catalizan la reaccion de transglicosilacion entre purinas y/o pirimidinas. Ambos tipos de NDTs, NDT y PDT, aceptan distintas bases naturales y no naturales, pero son altamente especlficas sobre 2'-desoxirribosa. Teniendo en cuenta que las NDTs operan de manera regio (glicosilacion a traves del N1 de pirimidinas y N9 de purinas) y estereoselectivas (se forma unicamente el anomero P) ofrecen un gran potencial como biocatalizador para la smtesis industrial de NADs.

A pesar de que este proceso de slntesis de nucleosidos serla en principio una alternativa eficiente a los tradicionales metodos de slntesis qulmica, existe un problema a la hora de su implementation como biocatalizadores en procesos industriales, ya que no todos los tipos de bases puricas o pirimidlnicas usadas como sustrato para generar los analogos de nucleosidos son solubles en medios acuosos.

Esto limita la concentration de sustrato con la que se puede trabajar y dificulta en muchos casos el escalado del proceso. Para solventar este tipo de problemas se utilizan diversos tipos de alternativas como por ejemplo la adiccion de co-solventes organicos al medio de reaction, el aumento o disminucion del pH de del medio o el aumento de factores como la temperatura o la presion. El problema de este tipo de estrategias es que no es facil encontrar enzimas que sean estables bajo estas condiciones, por ello la busqueda de enzimas procedentes de microorganismos que crezcan en condiciones extremas de pH, temperatura, salinidad o presion constituye es un area de interes.

Los organismos termofilos son un tipo de organismos cuyas temperaturas optimas de crecimiento se encuentran por encima de 45 °C. En su mayorla son microorganismos pertenecientes a los dominios Bacteria y Archaea, y, segun su temperatura optima de crecimiento, se pueden dividir en termofilos moderados (45-65 °C), termofilos extremos (65-80°C) e hipertermofilos (>80 °C).

El empleo de enzimas provenientes de termofilos, termozimas, en biocatalisis resulta de especial interes ya que a su termorresistencia natural, que permite el trabajo a altas temperaturas, se asocian frecuentemente una serie de ventajas adicionales como, por ejemplo:

i) Reduction de la viscosidad del medio, aumento de la solubilidad y del coeficiente de difusion de sustratos y/o productos;

ii) Purification eficiente de termozimas cuando se expresan en un sistema mesofilo como E. coli o Saccharomyces cerevisiae mediante tecnicas de desnaturalizacion diferencial;

iii) Menor riesgo de contamination del biorreactor por especies mesofilas ambientales por encima de los 60 °C;

iv) Mayor resistencia del biocatalizador a agentes desnaturalizantes y solventes organicos;

v) Mayor rendimiento debido a que se minimizan los subproductos de reaccion, lo que permite una recuperacion del producto mas facil.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invention se refiere a un procedimiento de obtencion de nucleosidos que comprende una reaccion enzimatica de transglicosilacion en un solo paso, entre un nucleosido donador y una base nitrogenada aceptora en presencia de una enzima nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasa tipo II termoestable procedente de Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203 (CtNDT) caracterizada por la secuencia SEQ ID NO: 1.

Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203 es una cepa de C. thermalis

La enzima nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasa se puede obtener recombinante mediante la expresion del gen ndt de Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203, caracterizado por la SEQ ID NO: 2, en una bacteria accesible como, por ejemplo, Escherichia coli. La enzima recombinante se puede obtener partiendo de secuencias cuya expresion da lugar a polipeptidos que conservan la actividad nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasa.

Gracias al empleo de la CtNDT en la reaccion enzimatica de transglicosilacion en un solo paso se obtienen distintos nucleosidos naturales y no naturales y, dentro de estos ultimos, arabinosil-nucleosidos como el arabinosido de adenina (ara-A), citosina (ara-C), hipoxantina (ara-H) y guanina (ara-G), 2',3'-didesoxiribosil nucleosidos como la didanosina (ddIno), asl como diferentes 2'-fluoro-2'- desoxiribonucleosidos como la 2 '-fluoro-2'-desoxiadenosina (2'F-dAdo) y el 2'-fluoro-2'-desoxiguanosine (2'F-dGuo). Estos nucleosidos naturales tienen interes terapeutico.

En otro aspecto de la invencion, la reaccion enzimatica de transglicosilacion en un solo paso se lleva a cabo en presencia de disolventes organicos en una concentration del 20 %-40 % en volumen. Se ha demostrado que tanto la actividad de la enzima como su estabilidad no se ven afectadas por la presencia de disolventes organicos en diferentes concentraciones comprendidas dentro del rango de 20 %-40 % en volumen.

Los disolventes organicos empleados para dicha reaccion pueden ser polares aproticos, alcoholes y polioles. En una realization preferida el disolvente organico es acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, etanol, isopropanol, metanol, glicerol, etilenglicol o propilenglicol.

En otro aspecto de la invention, las reacciones de transglicosilacion se realizan a distintas temperaturas (20-90 °C) y diferentes valores de pH (3-11), preferentemente a una temperatura entre 40 °C y 90 °C y a un pH entre 3 y 7, ya que se observa un valor de actividad retenida superior al 70 %.

En otro aspecto de la invencion, la base nitrogenada aceptora es adenina, guanina, hipoxantina o citosina.

En otro aspecto de la invencion, el nucleosido donador es 2',3'-didesoxiribosilnude6sido, 2'-fluoro-2'-desoxiribosilnucleosido, arabinosiladenina, arabinosilcitosina, arabinosilhipoxantina, 2’-desoxicitidina, 2’-desoxiuridina, 2’-desoxiadenosina, 2’-desoxiguanosina, 2’-desoxiinosina o 2’-desoxitimidina.

TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

A continuation, se aporta una traduction del texto libre en ingles que aparece en la lista de secuencias.

SEQ ID NO: 1. Protelna con actividad nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasa tipo II de la cepa PCC 7203 de Chroococcidiopsis thermalis.

SEQ ID NO: 2. Gen con actividad nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasa tipo II de la cepa PCC 7203 de Chroococcidiopsis thermalis.

SEQ ID NO: 3. Cebador Promotor T7

SEQ ID NO: 4. Cebador Terminador T7

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Efecto de la temperatura en la actividad de CtNDT.

Figura 2. Efecto del pH en la actividad de CtNDT.

Figura 3. Efecto de la temperatura en la estabilidad de CtNDT mediante estudios de desnaturalizacion termica de la enzima a diversos valores de pH en diversos tampones (Citrato sodico pH 5-6 y Fosfato potasico, 6-7) a 60 °C.

Figura 4. Actividad de la CtNDT en presencia de un 20 % de disolventes polares aproticos (acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfoxido), alcoholes (etanol, isopropanol, metanol) y polioles (glicerol, etilenglicol y propilenglicol)

DESCRIPCION DE MODOS DE REALIZACION

Habiendo descrito la presente invention, se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1. Construction del microorganismo recombinante E. coli CtNDT

Partiendo del genoma de la cianobacteria cocoide extremofila Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203 alojada en la base de datos de secuencias geneticas del NIH (National Institutes of Health de Estados Unidos, GenBank), se ha llevado a cabo la busqueda bioinformatica en el mismo de secuencias de ADN que pudieran codificar posibles 2’-desoxirribosiltransferasas putativas empleando los algoritmos BlastN y BlastP respectivamente (Altschul, S.F., Gish, W., Miller, W., Myers, E.W. & Lipman, D.J. J. Mol. Biol. 1990, 215:403-410) a traves del servidor del National Center for Biotechnology Information (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

Como resultado de ello, se encontro la secuencia genica con numero de acceso GenBank: AFY86715.1, que se nombro como ndtCt (SEQ ID N°2). Mediante el alineamiento multiple de la secuencia de aminoacidos correspondiente a la traduction de gen ndtCt, con secuencias de otras NDTs, se observo que dicho gen podia codificar una 2'-desoxiribosiltransferasa (CtNDT). Para llevar a cabo dicho alineamiento se empleo el programa Clustal Q (Goujon M, McWilliam H, Li W, Valentin F, Squizzato S, Paern J, Lopez R. Nucleic acids research 2010, 38 Suppl: W695-9) alojado en el servidor EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ ).

Una vez efectuado el analisis bioinformatico del gen de interes, se encargo a la casa comercial GenScript (http://www.genscript.com/) la slntesis del mismo, asl como su inclusion como fragmento NdeI-EcoRI dentro del vector de expresion pET28b(+) (Novagen) dando como resultado el plasmido recombinante pET28bCtNDT. Dicho vector porta un marcador de resistencia a Kanamicina, un promotor de expresion lac inducible por IPTG para su selection en este genero y una secuencia de ADN que codificarla para la presencia de 6 histidinas en el extremo N-terminal de la protelna, dando como resultado la protelna de fusion His-CtNDT. A continuacion, se llevo a cabo la transformacion mediante choque termico de celulas competentes de E. coli BL21(D3) obtenidas previamente segun el procedimiento del RbCl (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA) y se obtuvieron clones recombinantes que expresaban de forma constitutiva el gen ndtCt (nombrados E. coli CtNDT). Los transformantes se seleccionaron en medio Luria-Bertani solido al que se le habla adicionado kanamicina (50 p,g/ml). Mediante este procedimiento se obtuvieron varios clones que se analizaron mediante electroforesis de los plasmidos purificados, mediante el procedimiento High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche), en geles de agarosa al 1 % y posterior secuenciacion utilizando los oligonucleotidos T7 promotor (SEQ IDNO: 3) y T7 reverse 5’- (SEQ ID NO: 4).

Ejemplo 2. Production y purification de la CtNDT

Para la produccion de la CtNDT utilizando el clon recombinante conseguido previamente, se cultivo una colonia aislada del organismo recombinante en medio Luria-Bertani, LB (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, USA)), a 37 °C y 250 rpm, en presencia de una concentration de kanamicina de 50 p,g/ml hasta obtener una densidad optica de 0,6-0,8. En ese momento se adiciono IPTG hasta una concentracion final 0,5 mM dejando el cultivo creciendo durante 3 horas en las condiciones anteriormente descritas. Transcurrido este tiempo, se centrifugo a 3500 x g durante 30 minutos a 4 °C, y se procedio a la disruption celular del sedimento obtenido, mediante sonicacion en tampon fosfato sodico 10 mM pH=7. Una vez finalizado el proceso, las celulas lisadas se centrifugaron a 9500 x g 30 min a 4 °C y se separo el sobrenadante de los desechos celulares. Dicho sobrenadante contiene la protelna de fusion His-CtNDT, lo que permitio una sencilla purificacion mediante cromatografla de afinidad. Para ello se procedio a aplicar el sobrenadante previamente obtenido en una columna Ni-NTA de 5-ml HisTrap FF (GE Healthcare) previamente equilibrada en el tampon 1 (20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 100 mM NaCl y 10 mM imidazol), y posteriormente se eluyo en el tampon 2 (20 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, 100 mM NaCl y 500 mM imidazol).

Posteriormente con las fracciones mas puras se llevo a cabo una cromatografla de exclusion molecular mediante la aplicacion de la muestra en una columna Hi-Load 16/60 Superdex 200 prep grade column (GE Healthcare) previamente equilibrada con el tampon 3 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0). Para los procesos de purificacion se utilizo un FPLC modelo Akta Prime (GE Healthcare). Las fracciones se analizaron mediante electroforesis de protelnas en condiciones desnaturalizantes en geles de poliacrilamida en presencia de SDS al 0,1 % (SDS-PAGE).

Ejemplo 3. Efecto del pH, temperatura y disolventes sobre la actividad y estabilidad de la CtNDT.

Para ello se procedio a determinar la actividad de la enzima a diferentes valores de pH (4,5­ 11) y temperatura (20-90 °C), observandose que la enzima mostro valores de actividad retenida superiores al 70 % en un amplio intervalo de temperatura (40-90 °C) (Figura 1) y de pH (4-7) (Figura 2). Particularmente interesante, es el hecho de que la enzima presente valores de actividad mayor del 95 % en el intervalo 60-90 °C, lo cual permitirla llevar a cabo los procesos a altas temperaturas, con las consiguientes ventajas que ello supondrla. Ateniendonos a los resultados, las condiciones optimas de uso del biocatalizador serlan en el intervalo de temperatura (60-90 °C) y pH (4-6). Como condiciones estandar para la cuantificacion de la actividad enzimatica se eligieron pH 6 y 60 °C. En esas condiciones el biocatalizador mostro una actividad de 37 unidad internacional de actividad (UI). Ademas, se ha evaluado el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima mediante estudios de desnaturalizacion termica de la enzima a diversos valores de pH en diversos tampones (Citrato sodico pH 5-6 y Fosfato potasico, 6-7) a 60 °C (Figura 3).

Adicionalmente se ha evaluado el efecto de la adicion de disolventes organicos en la actividad de la enzima (Figura 4). En este sentido se ha evaluado la actividad de la enzima en presencia de un 20 % de disolventes organicos, como por ejemplo disolventes polares aproticos (acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfoxido), alcoholes (etanol, isopropanol, metanol) y polioles (glicerol, etilenglicol y propilenglicol). Como se puede observar en la Figura 4 se obtuvieron valores de actividad retenida superiores al 60 % por ciento en todos los casos. Esta tolerancia de la enzima a la utilizacion de disolventes organicos, unida a la gran termoestabilidad mostrada por la misma permite ser optimistas de cara a la posible implementation de proceso a nivel industrial.

Ejemplo 4. Determination y caracterizacion de la actividad desoxiribosiltransferasa en CtNDT

Para la determinacion de actividad de la protelna, se llevo a cabo el ensayo de actividad estandar que consistio en la smtesis de 2’-desoxiadenosina a partir de 2’-desoxiinosina y adenina. Para ello diversas concentraciones de enzima se anadieron a una solution de 2’-desoxiinosina (dIno) 10 mM y Adenina (Ade) 10 mM tampon fosfato 50 mM, pH=6,0. La reaction se mantuvo en agitation a 60 °C y 350 r.p.m. en un intervalo comprendido entre 0 y 30 minutos horas, con el objetivo de determinar el intervalo de tiempo en el que la enzima muestra una respuesta lineal. La reaccion se detuvo anadiendo un volumen de metanol previamente enfriado a 4°C, y posteriormente se calento a 95 °C con el objetivo de desnaturalizar la enzima. Posteriormente tras la centrifugacion, los productos obtenidos fueron determinados determinan mediante Cromatografla Llquida de Alta Resolution (HPLC) segun la metodologla descrita (Fernandez-Lucas J. et al. (2007) Enzyme Microb. Technol. 40, 1147-1155). En estas condiciones de reaccion, una unidad internacional de actividad (UI) se define como la cantidad de biocatalizador que produce 1 pmol de 2'-desoxiadenosina por minuto.

Ejemplo 5. Sintesis de diferentes nucleosidos mediante el empleo de CtNDT

A continuation, se explica el procedimiento para la sintesis de diferentes nucleosidos mediante el empleo como biocatalizador de la CtNDT En los diferentes ejemplos que se presentan, los productos de reaccion se pueden cuantificar mediante HPLC utilizando las siguientes condiciones: columna ACE 5 C18-PFP (250 x 4,6 mm); fase movil: (1) gradiente lineal durante 10 minutos de acetato de trimetilamonio 0.1 M hasta alcanzar 90/10 (v/v) acetato de trimetilamonio 0,1 M /acetonitrilo, (2) 10 minutos con 90/10 (v/v) acetato de trimetilamonio 0,1 M /acetonitrilo. El flujo se fija a 1 ml/min (180 bares de presion) y el detector UV se ajusta a 260 nm. En estas condiciones, los tiempos de retention de las bases y nucleosidos detectados se presentan en la Tabla I.

Tras determinar las condiciones optimas de actividad de CtNDT, se procedio a realizar estudios de especificidad de sustrato, utilizando diferentes 2'-desoxinucleosidos y bases, con el fin de determinar cuales son los sustratos que mejor reconoce la enzima. Para ello la enzima se incubo en condiciones optimas de actividad y estabilidad descritas en el apartado anterior utilizando diferentes 2’-desoxinucleosidos (dAdo, dCyd, dGuo, dIno, dThd y dUrd) 10 mM y bases (Ade, Cyt, Hyp, Gua, Ura y Thy), Las condiciones de reaccion fueron:

- 36 unidades de enzima en 40 pl a 60 °C, 5-10 min, 300 rpm. [Sustratos] = 1 mM, tampon MES 50 mM, pH 6.5, para Ade, Cyt, Hyp, Ura y Thy, y

- 0,6 pg de enzima en 40 pl a 60 °C, 5-10 min, 300 rpm. [Sustratos] = 1 mM, tampon borato sodico 50 mM, pH 8.5, para Gua.

Como se puede observar en la Tabla II, CtNDT reconoce de manera similar como donador 2’-desoxiadenosina (dAdo), 2'-desoxiinosina (dIno) y 2'-desoxiguanosina (dGuo), no sucediendo lo mismo con los nucleosidos pirimidlnicos, a exception de 2'-desoxicitidina. Esto concuerda con los resultados que se obtienen al utilizar diversas bases como aceptor, ya que como se puede observar la enzima reconoce como mejores sustratos Adenina (Ade) e Hipoxantina (Hyp), mostrando una actividad menor sobre Citosina (Cit) y nula sobre Uracilo (Ura) y Timina (Thy).

Tabla I. Tiempos de retencion de bases, 2’-desoxinucleosidos y nucleosidos

obtenidos.

5.1. Sintesis de arabinosil nucleosidos mediante el uso de la CfNDT.

Para la sintesis de arabinosil nucleosidos se procedio de la siguiente manera:

- 225 unidades de enzima en 30 de una solucion que contenla arabinosil nucleosido (ara-A, ara-C, ara-H o ara-G) 1 mM, [Base] = 1 mM, en tampon MES 50 mM a pH 6.5, para Ade, Hyp y Cyt.

- 225 unidades de enzima en 30 ^L de una solucion que contenla arabinosil nucleosido (ara-A, ara-C, ara-H o ara-G), [Base] = 1 mM, en tampon borato sodico 50 mM a pH 8,5, para Gua.

La reaccion se mantiene en agitacion a 60 °C y 300 r.p.m. durante un periodo de 24 horas. Los rendimientos de las correspondientes se muestran en la tabla III. Particularmente interesante es la obtencion de ara-A (Vidarabina), usado para el tratamiento del virus herpes y varicela-zoster viruses, ademas de ser un potencial precursor de drogas antitumorales como la fludarabina o la clofarabina. Por otro lado el ara-G, usado para tratar la leucemia linfoblastica aguda de celulas T (LAA-T) y el linfoma linfoblastico de celulas T (LLB-T).

Tabla III. Rendimientos de la produccion de arabinosil nucleosidos

5.2. Sintesis de 2,-fluoro-2,-desoxiribosilnucle6sidos mediante el uso de la CtNDT.

Para la sintesis de 2-fluoro-2-desoxiribosilnucle6sidos se procedi6 de la siguiente manera:

- 225 unidades de enzima en 30 ^L de una solucion que conterna 2-fluoro-2-desoxiribosilnucleosido (2,F-dIno) 1 mM, [Base] = 1 mM, en tamp6n MES 50 mM a pH 6.5, para Ade, Hyp y Cyt.

- 225 unidades de enzima en 30 ^L de una solucion que contenia 2-fluoro-2-desoxiribosilnucleosido (2,F-dIno) 1 mM, [Base] = 1 mM, en tamp6n borato s6dico 50 mM a pH 8,5, para Gua.

La reacci6n se mantiene en agitaci6n a 60°C y 300 r.p.m. durante un periodo de 24 horas. Los rendimientos de las correspondientes se muestran en la tabla IV. En este caso destacamos la obtenci6n de 2'-fluoro-2'-desoxiguanosina (2'F-dGuo), usado como antiviral para el tratamiento de virus influenza.

Tabla IV. Rendimientos de la produccion de 2'-fluoro-2'-desoxiribosilnucleosidos

5.3. Sintesis de 2,,3'-didesoxiribosil nucleosidos mediante el uso de la CtNDT.

Para la sintesis de 2,,3-didesoxiribosil nucleosidos (Figura 3) se procedio de la siguiente manera:

- 225 unidades de enzima en 30 ^L de una solucion que contenia 2,,3-didesoxiribosil nucleosido (ddAdo, ddIno), [Base] = 1 mM en tampon MES 50 mM a pH 6.5, para Ade, Hyp y Cyt.

- 225 unidades de enzima en 30 de una solucion que contema 2,,3-didesoxiribosil nucleosido (ddAdo, ddIno), [Base] = 1 mM en tampon borato sodico 50 mM a pH 8,5, para Gua.

La reaccion se mantiene en agitacion a 60 °C y 300 r.p.m. durante un periodo de 24 horas. Los rendimientos de las correspondientes se muestran en la tabla V. En este caso destacamos la obtencion de la didanosina (ddIno) un conocido antiviral para el tratamiento de la infeccion por VIH-1.

Tabla V. Rendimientos de la produccion de 2',3'-didesoxiribosil nucleosidos

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de obtencion de nucleosidos que comprende una reaccion enzimatica de transglicosilacion en un solo paso, entre un nucleosido donador y una base nitrogenada aceptora en presencia de la enzima nucleosido 2'-desoxirribosiltransferasa tipo II procedente de Chroococcidiopsis thermalis PCC 7203 que comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.

2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que se lleva a cabo en presencia de disolventes organicos en una concentration del 20 % - 40 % en volumen.

3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado por que el disolvente organico se encuentra seleccionado entre acetona, acetato de etilo, acetonitrilo, cloroformo, dimetilformamida, dimetilsulfoxido, etanol, isopropanol, metanol, glicerol, etilenglicol o propilenglicol.

4. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado por que la base nitrogenada aceptora se encuentra seleccionada entre adenina, guanina, hipoxantina o citosina.

5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado por que el nucleosido donador se encuentra seleccionado entre 2',3'-didesoxiribosilnudeosido, 2'-fluoro-2'-desoxiribosilnucleosido, arabinosiladenina, arabinosilcitosina, arabinosilhipoxantina, 2’-desoxicitidina, 2’-desoxiuridina, 2’-desoxiadenosina, 2’-desoxiguanosina, 2’-desoxiinosina o 2’-desoxitimidina.

6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado por que se lleva a cabo a una temperatura entre 40 °C y 90 °C y a un pH entre 3 y 7.