ES2582216T3 - Combinación de biocatalizadores termoestables para la síntesis de nucleósidos - Google Patents

Abstract

Vector de expresión recombinante que comprende: la secuencia que codifica una purina nucleósido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1) con la secuencia que codifica una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3); cada una de las secuencias unida operativamente con una o más secuencias de control que dirigen la producción de dichas fosforilasas en un hospedador de expresión adecuado; originándose dichas secuencias de la clase Archaea Thermoprotei, caracterizado porque la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEQ ID NO. 8) y porque dicho hospedador de expresión adecuado es la cepa bacteriana BL21 de E. coli; y además porque dicho vector comprende un promotor T7 que permite la unión de ARN polimerasa T7, un operador lac que permite la inhibición de la expresión cuando el isopropiltiogalactopiranósido (IPTG) no está presente y tioredoxina con parche de histidinas.

Description

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DESCRIPCION

Combinacion de biocatalizadores termoestables para la smtesis de nucleosidos Campo de la invencion

La invencion pertenece al campo de la biotecnologfa.

Antecedentes de la invencion

Los (desoxi)nucleosidos son glicosilaminas que consisten en una base de tipo purina o pirimidina unida a una azucar de ribosa o desoxirribosa, esta ultima siendo pentosas dclicas. Algunos ejemplos incluyen: citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e inosina. Los analogos de nucleosidos han sido extensivamente usados como agentes antivirales y anticancerosos dada su capacidad para actuar como inhibidores de la transcriptasa inversa o como terminadores de cadena en las smtesis de ARN o ADN [1].

Se han conseguido smtesis qmmicas estereoselectivas de analogos de nucleosidos pero usando reactivos caros o contaminantes [2] y que implican procesos con multiples pasos que suponen un mayor consumo de tiempo. Los procedimientos biocataltticos ofrecen una excelente alternativa a la smtesis qmmica de nucleosidos ya que las reacciones biocatalizadas son regioselectivas y estereoselectivas y suponen una disminucion del contenido de subproductos de reaccion. De particular interes entre los procedimientos biocatalfticos se encuentra la reaccion de transglicosilacion enzimatica entre un nucleosido donador de azucar y una base aceptora mediante enzimas que catalizan las reacciones reversibles generales [3], tal como se representa en las figuras 1 y 2.

Las nucleosido fosforilasas son transferasas ampliamente distribuidas en celulas de mairnfero y bacterias y juegan un papel central en la ruta de salvataje del metabolismo nucleosfdico. Son bifuncionales. Por un lado, catalizan la escision reversible del enlace glicosfdico de los ribonucleosidos o desoxirribonucleosidos en presencia de fostato inorganico para generar la base y la ribosa-1-fosfato o desoxirribosa-1-fosfato. Estas reacciones que emplean las purina nucleosido fosforilasas y las pirimidina nucleosido fosforilasa se muestran en la figura 1. Por otro lado, estas enzimas pueden catalizar la transferencia de pentosas dependiente de fosfato entre bases puricas o pirimidmicas y nucleosidos, es decir, reacciones de transglicosilacion, para producir nucleosidos con diferentes bases. La figura 2 muestra un ejemplo de la smtesis en un solo paso sintetico utilizando nucleosido fosforilasas.

Cuando se combinan las purina nucleosido fosforilasas y las pirimidina nucleosido fosforilasas es posible transferir el azucar de un nucleosido pirimidmico donador a una base aceptora purica o pirimndinica, asf como de una nucleosido purico donador a una base aceptora purica o pirimndinica, dependiendo de los materiales de partida utilizados [4]. Como consecuencia, las nucleosido fosforilasas de diferentes fuentes, especialmente bacterianas, han sido explotadas como herramientas para la smtesis enzimatica de analogos de nucleosidos.

En la naturaleza estas enzimas han sido descritas en varias cepas microbianas, en particular en bacterias termofilas (es decir, bacterias que florecen a temperaturas entre 45°C y 80°C), que han sido usadas como fuentes de nucleosido fosforilasas en numerosos trabajos encaminados a la obtencion de nucleosidos modificados por transglicosilacion enzimatica. Sin embargo, a pesar de que en estos estudios los rendimientos de los productos diana eran suficientemente elevados, la cantidad o proporcion de las actividades enzimaticas necesarias para llevar a cabo la transglicosilacion no eran optimas [5]. Requenan una extension de los tiempos de reaccion (hasta varios dfas) o un incremento de las cantidades de biomasa bacteriana utilizadas para conseguir el grado de transformacion deseado.

Ademas, cuando se desarrolla un proceso de transglicosilacion se plantea otro problema: la diffcil solubilizacion de grandes cantidades de sustratos y productos, muchos de ellos poco solubles en medios acuosos a temperatura ambiente. Aunque este problema podna resolverse utilizando temperaturas mas altas, se necesitanan enzimas suficientemente estables en estas duras condiciones de reaccion.

Las arqueas son un grupo de microorganismos unicelulares que son uno de los tres dominios de la vida; los otros son bacteria y eucariotas. Se llamaron anteriormente arqueobacterias bajo el taxon de las bacterias, pero ahora se consideran por separado y distintas. El dominio de arquea se divide actualmente en dos filos principales, el Euryarchaeota y Crenarchaeota. El Euryarchaeota incluye una mezcla de metanogenos, halofilos extremos, termoacidofilos, y algunos hipertermofilos. Por el contrario, la Crenarchaeota incluye solo hipertermofilos. Los hipertermofilos son aquellos organismos que prosperan en ambientes extremadamente calientes, desde 60°C hacia arriba, de manera optima por encima de 80°C.

Cacciapuoti et al. [6-8] describen dos purina nucleosido fosforilasas (PNPasas) de arqueas hipertermofilas, en particular, da a conocer las enzimas 5'-desoxi-5'-metiltioadenosina fosforilasa II (SsMTAPII, EC 2.4.2.28) de Sulfolobus solfataricus, y purina nucleosido fosforilasa (PfPNP) de Pyrococcus furiosus. La enzima de Pyrococcus furiosus se denomino en primer lugar como MTAPII, pero se renombro a PNP, ya que no es capaz de escindir la

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metiltioadenosina. Sulfolobus solfataricus pertenece a Crenarchaeota, mientras que Pyrococcus furiosus pertenece a Euryarchaeota. El codigo EC anterior es la nomenclature convencional de enzimas proporcionada por la Union Internacional de Bioqmmica y Biolog^a Molecular que clasifica las enzimas por las reacciones que catalizan.

La mayona de las enzimas caracterizadas a partir de hipertermofilas son optimamente activas a temperaturas cercanas a la temperatura optima de crecimiento del organismo huesped. Cuando se clonan y expresan en huespedes mesofilos, como Escherichia coli, las enzimas hipertermofilas generalmente retienen sus propiedades termicas. A veces, las enzimas son optimamente activas a temperaturas muy por encima de la temperatura optima de crecimiento del organismo huesped [9]. Otras veces se han descrito enzimas que son optimamente activas de 10°C a 20°C por debajo de la temperatura optima de crecimiento del organismo [10-11]. Sin embargo, la 5'- metiltioadenosina fosforilasa de Sulfolobus solfataricus (una enzima hexamerica que contiene seis puentes disulfuro entre subunidades), cuando se expresa en un huesped mesofilo, forma puentes disulfuro incorrectos y es menos estable y menos termofilo que la enzima nativa [12].

Thermoprotei son una clase hipertermofila de Crenarchaeota. A partir de los genomas secuenciados y disponibles para la clase de arqueas Thermoprotei, solo se hallaron tres secuencias para purina nucleosido fosforilasa (EC 2.4.2.1) y tres secuencias para la uridina fosforilasa (EC 2.4.2.3). Estas seis proternas se han introducido, respectivamente, en UniProtKB/TrEMBL con los numeros de acceso: A1RW90 (A1RW90_THEPD), para la protema hipotetica de Thermofilum pendens (cepa Hrk 5); Q97Y30 (Q97Y30_SULSO), para la protema hipotetica de Sulfolobus solfataricus; A3DME1 (A3DME1_STAMF), para la protema hipotetica de Staphylothermus marinus (cepa ATCC 43588/DSM 3639/F1); Q9YA34 (Q9YA34_AERpE), para la protema hipotetica de Aeropyrum pernix; A2BJ06 (A2BJ06_HYPBU) para la protema hipotetica de Hyperthermus butylicus (cepa DSM 5456/JCM 9403); y D9PZN7 (D9PZN7_ACIS3) para la protema hipotetica de Acidilobus saccharovorans (cepa DSM 16705/VKM B-2471/345-15). Todas estas secuencias estaban en el estado de anotacion de no revisadas, lo que significa que su presencia en las arqueas solo ha sido verificada por ordenador.

A pesar de que muchos genes se pueden expresar con exito en Escherichia coli a altos rendimientos, varias proternas de hipertermofilas se expresan poco o nada, en parte debido al uso de codones raros. De hecho, y segun nuestro conocimiento, nadie ha conseguido con exito la expresion de alguno de los genes mencionados anteriormente.

En vista de los prejuicios anteriores, y en vista de las dificultades tecnicas, los inventores inesperadamente fueron capaces de preparar vectores recombinantes viables y, de manera destacada, de obtener fosforilasas recombinantes que eran optimamente activas a temperaturas superiores a 60°C. Los catalizadores termoestables y qmmicamente estables de la presente invencion son una purina nucleosido fosforilasa (PNPasa, EC 2.4.2.1), y una uridina fosforilasa (UPasa, EC 2.4.2.3), procedentes de la clase de arqueas Thermoprotei, en el que la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID. NO 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEQ ID. NO 8).

En particular, se ha encontrado sorprendentemente que las nucleosido fosforilasas recombinantes derivadas de Thermoprotei hipertermofilas tienen propiedades de estructura-funcion unicas, tales como una termoestabilidad mejorada, alta eficiencia catalttica y actividades enzimaticas optimas a temperaturas cercanas o superiores a 100°C. Estas enzimas recombinantes se pueden usar ventajosamente para las reacciones de transglicosilacion, en forma de lisado de celulas y en forma de extractos en bruto o purificados, para la produccion industrial de analogos de nucleosidos naturales y modificados. En particular, son versatiles, ya que pueden catalizar transglicosilaciones en medios acuosos, en disolventes organicos, a temperaturas entre 6o°C y 120°C, o en una combinacion de estos parametros, lo que permite la preparacion de muchos y diversos tipos de nucleosidos a rendimientos de produccion y tiempos de reaccion aceptables, y empleando cantidades economicas de las enzimas. Es importante destacar que los biocatalizadores descritos en la presente invencion se pueden utilizar para reacciones de byconversion que requieren la presencia de disolventes organicos, temperaturas por encima de 60°C, o ambos, con el fin de solubilizar los sustratos o los productos de reaccion. Estas fosforilasas son ideales en reacciones con sustratos insolubles en agua. Otra ventaja de estas fosforilasas reside en su tolerancia a los disolventes organicos, y en que se pueden reutilizar para varios ciclos de reaccion.

Mas ventajosamente, la invencion ofrece una combinacion de nucleosido fosforilasas de Thermoprotei que es util para la smtesis “one-pot” de nucleosidos. Las enzimas se pueden utilizar para producir nucleosidos naturales o analogos en una sola etapa (one-pot) o con procedimientos de smtesis de dos etapas. En la smtesis de una sola etapa, se utilizan una pirimidina nucleosido fosforilasa y una purina nucleosido fosforilasa en el mismo lote con el fin de cambiar la base ligada al azucar por otra de eleccion. En el de dos etapas, se utiliza una pirimidina nucleosido fosforilasa para la liberacion del azucar de un nucleosido de pirimidina y, a continuacion, se afsla el azucar 1-fosfato y mas tarde, en otro recipiente, se liga una base de purina al azucar usando una purina nucleosido fosforilasa.

Taran S A et al., "Enzymatic transglycosylation of natural and modified nucleosides by immobilized thermostable nucleoside phosphorylases from Geobacillus stearothermophilus", Russian Journal of Bioorganic Chemistry, vol. 35, No. 6, 6 Noviembre 2009, paginas 739-745, da a conocer la transglicosilacion enzimatica de nucleosidos naturales y

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modificados por nucleosido fosforilasas inmovilizadas termoestables de Geobacillus stearothermophilus: purina nucleosido fosforilasa II (E. C. 2.4.2.1) y pirimidina nucleosido fosforilasa (E. C. 2.4.2.2).

Trelles J A et al., "Screening of Catalytically active microorganisms for the synthesis of 6-modified purine nucleosides", Biotechnology Letters, Kluwer Academic Publishers, DO LNKD-DOI: 10.1007/S10529-005-5628-7, vol. 27, no. 11, 1 junio 2005, paginas 759-763 da a conocer un procedimiento de cribado para encontrar actividad de transglicosilacion en microorganismos para la smtesis de nucleosidos de purina modificados en 6.

Kawarabayashi Yutaka et al. "Complete genome sequence of an aerobic hyperthermophilic crenarchaeon, Aeropyrum pernix K1", DNA Research, Universal Academy Press, JP LNKD-DOI:10.1093/DNARES/6.2.83., vol 6, no. 2, 1 enero 1999, paginas 83-101, da a conocer una uridine fosforilasa de Aeropyrum pernix.

Hamamoto Tomoki et al. "Cloning of purine nucleoside phosphorylase II gene from Bacillus stearothermophilus TH 62 and characterization of its gene product", Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol. 61, no. 2, 1997, paginas 276-280, da a conocer el proceso de clonacion y secuenciacion de Pu-NPasa II de la cepa TH 6-2 de Bacillus stearothermophilus. La Pu-NPasa se purifico y caracterizo.

Hamamoto Tomoki et al. "Cloning and expression of purine nucleoside phosphorylase I gene from Bacillus stearothermophilus TH 6-2", Bioscience Biotechnology and Biochemistry, vol. 61, no. 2, 1997, paginas 272-275, da a conocer el proceso de clonacion, secuenciacion y expression del gen de Pu-NPasa I de la cepa TH 6-2 de Bacillus stearothermophilus. El gen clonado se overexpreso en E. coli mediante la utilizacion del promotor trc para producir una enzima activa en grandes cantidades.

Cacciapuoti Giovanna et al. "Purine nucleoside phosphorylases from hyperthermophilic Archaea require a CXC motif for stability and folding", The Febs Journal Oct 2009 LNKDS-PUBMED: 19740110, vol. 276, no. 20, Octubre 2009, paginas 5799-5805, da a conocer el studio de como el motive CXC mejora la estabilidad y el plegado en protemas hipertermofilas con enlaces disulfuro, en particular en la 5'-desoxi-5'-metiladenosina fosforilasa II hipertermofila de Sulfolobus solfataricus (SsMTAPII).

Cacciapuoti Giovanna et al. "A novel hyperthermostable 5'-deoxy-5'-methylthioadenosine phosphorylase from the archaeon Sulfolobus solfataricus", Febs Journal, vol. 272, no. 8, Abril 2005, paginas 1886-1899, da a conocer la 5'- desoxi-5'-metiltioladenosin fosforilasa hipertermoestable de la arquea Sulfolobus solfataricus, que se clono y expreso en E. coli.

Cacciapuoti Giovanna et al. "Biochemical and structural characterization of mammalian-like purine nucleoside phosphorylase from the Archaeon Pyrococcus furiosus", Febs Journal, vol. 274, no. 10, Mayo 2007, paginas 24822495, da a conocer la caracterizacion de la primera purina nucleosido fosforilasa de tipo mairnfero de la arquea hipertermofila Pyrococcus furiosus (PfPNP). El gen PF0853 que codifica PfPNP se clono y expreso en E. coli y la protema recombinante se purifico hasta homogeneidad.

She Quinxin et al. "The complete genome of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus P2", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol. 98, no. 14, 3 Julio 2001, paginas 7835-7840, da a conocer la secuencia de la protema DeoD de Sulfolobus solfataricus, cuya secuencia de codificacion (nucleotidos 1372685-1371861 del genoma de Sulfolobus solfataricus) corresponde a la SEQ ID NO: 7 de la presente invencion.

Descripcion resumida de la invencion

La presente invencion se refiere a un vector de expresion recombinante tal como se define en las reivindicaciones.

Ademas, la presente invencion se refiere a un procedimiento de transglicosilacion tal como se define en las reivindicaciones.

Descripcion de las figuras

La figura 1 muestra un ejemplo de dos reacciones enzimaticas catalizadas por nucleosido fosforilasas. La primera reaccion, en la parte superior, es una fosforolisis que tiene lugar a traves de un mecanismo de tipo Sn1 , mediante un intermedio de tipo oxonio para dar a-ribosa-1-fosfato. La segunda reaccion ocurre a traves de un mecanismo Sn2 donde el fosfato es sustituido por una base proporcionando el p-nucleosido [13]. En el esquema, la uridina nucleosido fosforilasa cataliza la escision fosforolttica del enlace glicosfdico C-N de uridina que da lugar a ribosa-1- fosfato y uracilo. La purina nucleosido fosforilasa (adenosina nucleosido fosforilasa) cataliza la escision del enlace glicosfdico, en presencia de ortofosfato inorganico (Pi) como segundo sustrato, para generar la base purica y la ribosa(desoxirribosa)-1-fosfato. Para los sustratos naturales las reacciones son irreversibles.

Figura 2. Esquema de la smtesis en una sola etapa sintetica (“one-pot”) usando enzimas nucleosido fosforilasas.

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La figura 3 muestra el mapa genetico del vector de expresion inicial pET102/D-TOPO® antes del clonaje. Longitud del vector 6315 nucleotidos. Promotor T7: bases 209-225; region para los cebadores del promotor T7: bases 209228; operador lac (lacO): bases 228-252; region de union al ribosoma (RBS): bases 282-288; marco abierto de lectura (ORF) de la tioredoxina con parche de histidinas (HP): bases 298-627; region para los cebadores directos TrxFus: bases 607-624; region de reconocimiento de la enteroquinasa (EK): bases 643-657; region 1 de reconocimiento de TOPO®: bases 670-674; secuencia ("overhang"): bases 675-678; region 2 de reconocimiento de TOPO®: bases 679-683; epftopo V5: bases 700-741; region de polihistidina (6xHis): bases 751-768; region para los cebadores inversos de T7: bases 822-841; region de terminacion de la transcripcion de T7: bases 783-911; promotor bla: bases 1407-1505; ORF del gen de resistencia a la ampicilina (bla): bases 1506-2366 origen de pBR322: bases 2511-3184; ORF de ROP: bases 3552-3743 (hebra complementaria); ORF de lad: bases 5055-6146 (hebra complementaria).

La figura 4 muestra una “matriz Doehlert”, en la que cinco temperaturas se combinaron con tres valores de pH lo que resulta en siete combinaciones de temperatura y pH.

Figura 5. Grafico de contorno que muestra el efecto interactivo del pH y la temperatura sobre la actividad de UPasa. Los datos fueron analizados estadfsticamente con la metodologfa de superficie de respuesta (RSM), utilizando el programa "Minitab". La enzima parece muy termofila y su actividad se ve incrementada significativamente hasta la temperatura mas alta ensayada (100°C) y se mostro actividad a un pH distinto optimo cercano a la neutralidad (6,57,5), preferiblemente 7,0.

Figura 6. Grafico de contorno que muestra el efecto interactivo del pH y la temperatura sobre la actividad de PNPasa. Los datos fueron analizados estadfsticamente con la metodologfa de superficie de respuesta (RSM), utilizando el programa "Minitab". La enzima parece muy termofila y su actividad se ve incrementada significativamente hasta la temperatura mas alta ensayada (100°C) y se mostro actividad a un pH distinto optimo cercano a la neutralidad (6,5-7,0).

La figura 7 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO. 7) de la region codificante para la purina nucleosido fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus, tambien conocido como gen deoD. Numero de acceso en GenBank AE006766.

La figura 8 muestra la secuencia de ADN (SEQ ID NO. 8) de la region codificante para la pirimidina nucleosido fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix, tambien conocido como gen udp. Numero de acceso en GenBank NC000854.

Descripcion de la invencion

La presente invencion se refiere a un vector de expresion recombinante tal como se define en las reivindicaciones, siendo el resto de las realizaciones relacionadas con el mismo no parte de la invencion, pero que representan la tecnica de base util para entender la invencion.

Aeropyrum pernix y Sulfolobus solfataricus son arqueas hipertermofilas capaces de crecer a altas temperaturas, por encima de los 90°C. Las arqueas son organismos que pertenecen a un tercer grupo de organismos bien diferenciado de los eucariotas y de los procariotas. Se consideran descendientes de organismos primitivos y son organismos especiales que no han evolucionado ni se han adaptado a las condiciones de temperatura ordinarias.

Las enzimas UPasa y PNPasa en sus condiciones naturales intracelulares no permiten la smtesis de nucleosidos o analogos de nucleosidos con un alto rendimiento, tal como se desea a nivel industrial. Para superar esta importante limitacion, los inventores han usado la tecnologfa del ADN recombinante para disenar un vector de expresion que comprende los genes udp y deoD y los elementos apropiados para sobreexpresar las nucleosido fosforilasas en las celulas hospedadoras adecuadas, tal como bacterias. El vector de expresion disenado tambien facilita la solubilizacion y la purificacion de las diferentes fosforilasas.

Los vectores de la presente invencion comprenden la secuencia nucleotidica codificante de diferentes nucleosido fosforilasas y las secuencias de nucleotidos que permiten a dicho vector ser seleccionable y que se replique autonomamente dentro de la celula hospedadora.

La construccion del vector de expresion recombinante se lleva a cabo usando tecnologfas convencionales de ADN recombinante, es decir, procedimientos para unir segmentos de ADN juntos en un sistema libre de celulas.

El termino “vector” se refiere a una molecula de ADN originada a partir de un virus, un plasmido o una celula de un organismo superior en el que otro fragmento de ADN con un tamano apropiado puede ser integrado (clonado) sin que el vector pierda la capacidad de replicarse autonomamente. Ejemplos de vectores son plasmidos, cosmidos, y cromosomas artificiales de levaduras. Los vectores generalmente son moleculas recombinantes con secuencias de

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ADN de ongenes diversos. El termino “vector de expresion” se refiere a un vector que ademas comprende las secuencias regulatorias y controladoras necesarias para permitir la transcripcion y la traduccion del gen o los genes clonados. Los vectores de ADN lineales o circularizados son utiles para la presente invencion.

Para que el vector en la presente invencion sea seleccionable y replicable autonomamente en celulas hospedadoras, el vector seleccionado tiene que ser compatible con las celulas hospedadoras seleccionadas. La secuencia de nucleotidos que permite al vector ser seleccionable y capaz de replicarse autonomamente en Escherichia coli, es el gen que codifica el promotor T7, que permite a la ARN polimerasa T7 de la cepa seleccionada de Escherichia coli unirse al promotor. El termino "seleccionable" significa que el vector permanece estable en las bacterias descendientes. La seleccion se consigue mediante condiciones del medio estrictas de acuerdo con la introduccion en el vector de un gen marcador de seleccion apropiado, cuya expresion permite identificar las celulas que han sido transformadas con el vector. El gen marcador de seleccion es a menudo un gen de resistencia a un antibiotico. Algunos genes marcadores de seleccion preferidos en esta invencion son kanamicina, tetraciclina, carbenicilina, y mas preferiblemente, ampicilina.

La presente invencion se refiere ademas a la celulas hospedadora de E. coli tal como se define en las reivindicaciones.

El termino “celula hospedadora” se refiere a una celula transformada con un vector de expresion recombinante que comprende la secuencias nucleotfdicas de PNPasa y UPasa. Otro aspecto del vector de ADN recombinante permite que la celula hospedadora produzca nucleosido fosforilasas, y cuando las condiciones del medio son adecuadas, dichas nucleosido fosforilasas catalizan la obtencion de nucleosidos. Los genes de PNPasa y UPasa de Sulfolobus solfataricus y Aeropyrum pernix, respectivamente, son introducidos en el vector de expresion de ADN. Las figuras 7 y 8 muestran las secuencias nucleotfdicas y de aminoacidos relevantes para la invencion, en particular la secuencia de acidos nucleicos de Sulfolobus solfataricus deoD (SEQ ID No. 7) y la secuencia de acidos nucleicos de Aeropyrum pernix udp (SEQ ID No. 8), respectivamente.

El experto en la materia elegira de amanera adecuada el sistema de expresion constituido por el vector inicial y una cepa de la celula hospedadora para maximizar la produccion de nucleosidos.

La Escherichia coli pertenece a la cepa bacteriana BL21. Los vectores de expresion adecuados para Escherichia coli B21 son, por ejemplo, vectores pET, trcHis y pUB (todos ellos de la casa comercial Invitrogen) y vectores pGEX y GST (de la casa comercial Amersham). Tambien son utiles en esta invencion la cepa bacteriana Escherichia coli DH5 alfa, en combinacion con los vectores pUC y Escherichia coli F' en combinacion con los vectores PSL, vectores PEZZ o vectores M13 (todos ellos de Amersham).

En una realizacion, un lisado se obtiene lisando la celula hospedadora tal como se define en las reivindicaciones.

La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento de transglicosilacion tal como se define en las reivindicaciones, siendo el resto de las realizaciones relacionadas con el mismo no parte de la invencion, pero que representan la tecnica de base util para entender la invencion.

El termino "nucleosido donador de azucar" se refiere a una glicosilamina que consiste en una nucleobase (a menudo denominado simplemente como base) unida a un azucar de ribosa o desoxirribosa mediante un enlace beta- glicosfdico. Ejemplos de " nucleosido donador de azucar" incluyen, sin limitarse a, citidina, uridina, adenosina, guanosina, timidina e inosina, asf como los nucleosidos naturales o modificados que contienen D-ribosa o 2'- desoxirribosa; nucleosidos que contienen el grupo ribosa modificado en las posiciones 2', 3' y/o 5'; y nucleosidos en los que el azucar es beta-D-arabinosa, alfa-L-xilosa, 3'-desoxirribosa, 3',5'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, 5'- desoxirribosa, 2',5'-didesoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, 3'-amino-3'-desoxirribosa, o 2'-fluoro-2'-desoxirribosa.

El termino "base aceptora" se refiere a una nucleobase, base de nucleotidos, base nitrogenada, o simplemente base. En la naturaleza, las bases son parte de ADN o ARN. Las nucleobases primarias son citosina, guanina, adenina (ADN y ARN), timina (ADN) y uracilo (ARN), abreviados como C, G, A, T, y U, respectivamente. El termino "base aceptora" en la presente invencion pretende comprender tambien nucleobases modificadas y analogas. En el ADN, la base modificada mas comun es 5-metilcitidina (m5C). En el ARN, hay muchas bases modificadas, incluyendo pseudouridina (^), dihidrouridina (D), inosina (I), ribotimidina (rT) y 7-metilguanosina (m7G). Hipoxantina y xantina son dos de las muchas bases creadas a traves de la presencia de un mutageno. Otros ejemplos de bases aceptoras incluyen bases de pirimidina y purina naturales o sustituidas; bases de purina sustituidas en una o mas de las posiciones 1, 2, 6; bases de pirimidina sustituidas en una o mas de las posiciones 3, 5; y purina, 2-azapurina, 8- azapurina, 1-deazapurina (imidazopiridina), 3-deazapurina, 7-deazapurina, 2,6-diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5- trifluorometiluracilo, trans-zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina, 6-mercaptopurina.

Este procedimiento de transglicosilacion es util para la preparacion de nucleosidos, analogos de nucleosidos, y particularmente principios farmaceuticos activos (API); que comprenden, contienen o consisten en grupos de nucleosidos, o analogos de los mismos. Entendiendo un API como cualquier sustancia o mezcla de sustancias

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destinadas a utilizarse en la fabricacion de un producto farmacologico (medicinal) y que, cuando se utiliza en la produccion de un farmaco, se convierte en un principio activo del producto farmacologico. Dichas sustancias pretenden proporciona actividad farmacologica u otro efecto en el diagnostico, cura, mitigacion, tratamiento o prevencion de una enfermedad o afectan en la estructura y funcion del cuerpo. (Eudralex, Part II del volumen 4 EU Guidelines to Good Manufacturing Practice).

La combinacion de uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3) y purina nucleosido fosforilasa (PNP; E.C. 2.4.2.1) transfiere de manera eficiente un grupo azucar desde un nucleosido donador a una base aceptora.

Cuando los nucleosidos de pirimidina se preparan partiendo de otros nucleosidos de pirimidina y bases pirimidmicas como materiales de partida, entonces la utilizacion de la UPasa sola es suficiente, pero la utilizacion de ambas enzimas, PNPasa y UPasa es preferente porque la PNPasa tambien puede contribuir a la etapa de fosforolisis. En cambio, cuando se preparan nucleosidos de purina partiendo de otros nucleosidos de purina y bases purmicas como materiales de partida, entonces la utilizacion de tanto PNPasa como UPasa tambien es preferida. Por otro lado, la utilizacion de ambas enzimas PNPasa y UPasa es mucho mas satisfactoria cuando la reaccion es de un nucleosido de pirimidina a un nucleosido de purina, por ejemplo, de una uridina a una 2,6 diaminopurina ribosido, cuando se compara con la utilizacion de cada tipo de enzima por separado.

El procedimiento de tranglicosilacion utiliza una combinacion de UPasa y PNPasa. Los lisados celulares crudos o las soluciones clarificadas de enzimas crudas se pueden mezclar en diferentes proporciones para obtener un biocatalizador optimizado para una reaccion de transglicosilacion particular.

En el procedimiento de transglicosilacion de la presente invencion, la UPasa de Aeropyrum pernix y la PNPasa de Sulfolobus solfataricus son proporcionadas por una celula hospedadora tal como se define en las reivindicaciones.

En una realizacion, en el procedimiento de transglicosilacion de la presente invencion, la combinacion de UPasa y PNPasa se utiliza en forma de lisado.

En una realizacion, el procedimiento de transglicosilacion comprende las etapas de: (I) cultivo de la celula hospedadora en un medio de cultivo adecuado; (II) sobreexpresion de UPasa, PNPasa, o de ambas enzimas; (III) opcionalmente preparacion de un lisado celular; (IV) adicion de un nucleosido donador de azucar, una base aceptora, e iones fosfato, y (V) recuperacion de los nucleosidos a partir de la mezcla de reaccion.

En una realizacion particular, el transformante de Escherichia coli que comprende el vector se puede hacer crecer en un medio de cultivo que comprende triptona, extracto de levadura, cloruro de sodio y un antibiotico seleccionado del grupo que consiste en kanamicina, tetraciclina, carbenicilina, y ampicilina, preferiblemente, a 37°C, hasta alcanzar una densidad optica, medida a una longitud de onda de aproximadamente 600 nm, de entre 0,5-0,8. A continuacion, se puede anadir al cultivo isopropil-beta-D-tiogalactopiranosido (IPTG) para alcanzar una concentracion final de 100 mg/l y se pueden realizar inducciones a 37°C durante 6-12 horas. Las celulas pueden ser recuperadas mediante centrifugacion a 4°C y los residuos celulares se pueden lisar usando tres ciclos de congelacion-descongelacion. Las celulas hospedadoras recombinantes se pueden alterar mediante tecnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia. El lisado celular resultante puede ser usado directamente como biocatalizador o centrifugarse para eliminar el debris celular y obtener soluciones enzimaticas crudas clarificadas. El termino “biocatalizador”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier entidad biologica capaz de catalizar la conversion de un sustrato en un producto, en este caso la biotransformacion de nucleosidos.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre nucleosidos naturales o modificados que contienen D-ribosa y 2'-desoxirribosa; nucleosidos que contienen el grupo ribosa modificado en las posiciones 2', 3' y/o 5'; y nucleosidos en los cuales el azucar es beta-D-arabinosa, alfa-L-xilosa, 3'-desoxirribosa, 3',5'-didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, 5'- desoxirribosa, 2',5'-didesoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, 3'-amino-3'-desoxirribosa, 2'-fluoro-2'-desoxirribosa.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, la base aceptora se selecciona entre las bases puricas y pirimidmicas naturales o sustituidas; bases puricas sustituidas en las posiciones 1, 2, 6, o una combinacion de las mismas, del anillo punco; bases pirimidmicas sustituidas en las posiciones 3, 5, o una combinacion de las mismas, del anillo pirimidmico; por ejemplo, purina, 2-azapurina, 8-azapurina, 1-deazapurina (imidazopiridina), 3-deazapurina, 7-deazapurina, 2,6-diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, trans- zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina, 6-mercaptopurina.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el analogo de nucleosido resultante es un principio farmaceutico activo (API) tal como se conoce en la tecnica.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, dicho procedimiento se lleva a cabo entre 60 y 100°C.

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En una realizacion, el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion se lleva a cabo en medios acuosos o en un sistema de codisolventes polares aproticos.

En una realizacion, el sistema de codisolventes polares aproticos se selecciona entre dimetilsulfoxido, tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, dimetilformamida, o cualquier combinacion de los mismos.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es la 2,6-diaminopurina.

En una realizacion, se proporciona una smtesis enzimatica de nucleosidos “one-pot” utilizando uridina o 2'- desoxiuridina como dadores de grupos de azucar, ya que la enzima UPasa recombinante de la presente invencion es la mas espedfica para estos sustratos. Sin embargo, esta enzima se puede utilizar con cualquier donador de grupos azucar porque no discrimina entre uridina, 2'-desoxiuridina, y otros nucleosidos de pirimidina, como desafortunadamente ocurre en muchos organismos inferiores, tales como B. stearothermophilus [14].

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 5-fluorouracilo.

En una realizacion, en el procedimiento de transglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 5-trifluorometiluracilo.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es trans-zeatina.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 2-cloro-6-metilaminopurina.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 6-dimetilaminopurina.

En una realizacion, en el procedimiento de tranglicosilacion de la presente invencion, el nucleosido donador de azucar se selecciona entre uridina y 2'-desoxiuridina, y la base aceptora es 6-mercaptopurina.

El termino “nucleosido fosforilasa termoestable”, se refiere a enzimas que son estables al calor, resistentes al calor y que retienen suficiente actividad nucleosido fosforilasa como para llevar a cabo otras reacciones sin desnaturalizarse irreversiblemente (inactivarse) cuando se someten a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para realizar las reacciones de transglicosilacion.

Los ejemplos siguientes tienen el proposito de ilustrar la presente invencion sin constituir una limitacion del campo de aplicacion de la misma.

Ejemplos

Como se ha indicado anteriormente, las reacciones de transglicosilacion segun la presente invencion se llevaron a cabo utilizando las enzimas UPasa y PNPasa obtenidas a partir de celulas productoras de estas enzimas. Tales celulas son preferiblemente celulas de Escherichia coli modificada geneticamente capaces de expresar cantidades considerables de UPasa o PNPasa. Como se obtienen dichas celulas, las enzimas y sus caractensticas, asf como la produccion de algunos analogos de nucleosidos se muestran en los ejemplos que se acompanan expuestos a continuacion.

Ejemplo 1

Construccion de la deoD de Escherichia coli

La secuencia de la Purina Nucleosido Fosforilasa (PNPasa) de Sulfolobus solfataricus fue encontrada en la base de datos GenBank, con el numero de acceso AE006766. El gen fue amplificado por PCR utilizando 2 unidades de la enzima Platinum Pfx (Invitrogen), 1 mM de Mg2SO4 y 1x tampon de amplificacion de enzima, 200 |iM de dNTPs y 0,3 |iM de cada cebador (“primer”) con los oligonucleotidos 5'-caccgtgccatttttagaaaatggttcc-3' (Sulfolobus solfataricus deoD directo; SEQ ID NO. 1) y 5'- aatcagttttaagaatcttaaggtaat-3' (Sulfolobus solfataricus deoD inverso; SEQ ID NO. 2) de Sulfolobus solfataricus P2 [15]. La reaccion de PCR fue llevada a cabo con un primer paso de desnaturalizacion a 94°C durante 30 min, seguido de 36 ciclos de temperatura de un paso de desnaturalizacion a 94°C durante 1 min y un paso de hibridacion/extension a 60°C durante 1,5 min y a 68°C durante 10 min. Despues de los 36 ciclos, la muestra se sometio a 68°C durante 10 minutos y finalmente a 4°C. El producto PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN fue purificada del gel (S.N.A.P™ UV-Free Gel Purification

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Kit, Invitrogen). El fragmento amplificado fue clonado en la region polienlazadora del vector pUC18 que lleva el gen de resistencia a la ampicilina [17]. La region clonada fue secuenciada completamente y se hallo que era completamente identica a las secuencias de la base de datos.

Ejemplo 2

Construccion de la udp de Escherichia coli

La secuencia de la Pirimidina Nucleosido Fosforilasa (UPasa) de Aeropyrum pernix fue encontrada en la base de datos GenBank, con el numero de acceso NC_000854.2. El gen fue amplificado por PCR utilizando 2 unidades de la enzima Platinum Pfx (Invitrogen), 1 mM de Mg2SO4 y 1x tampon de amplificacion de enzima, 200 |iM de dNTPs y 0,3 |iM de cada cebador (“primer”) con los oligonucleotidos 5'- caccgtggcccgctacgttctcctc-3' (Aeropyrum pernix udp directo; SEQ ID NO. 3) y 5'-gaattcctatgtgcgtctgcacgccagg-3' (Aeropyrum pernix inverso; SEQ ID NO. 4) de Aeropyrum pernix K1 [16]. La reaccion de PCR fue llevada a cabo con un primer paso de desnaturalizacion a 94°C durante 30 min, seguido de 36 ciclos de temperatura de un paso de desnaturalizacion a 94°C durante 1 min y un paso de hibridacion/extension a 60°C durante 1,5 min y 68°C durante 10 min. Despues de los 36 ciclos, la muestra se sometio a 68°C durante 10 minutos y por ultimo, a 4°C. El producto PCR fue analizado por electroforesis en gel de agarosa y la banda de ADN fue purificada del gel (S.NAP™ UV-Free Gel Purification Kit, Invitrogen). El fragmento amplificado se clono en la region polienlazadora del vector pUC18 que lleva el gen de resistencia a la ampicilina [17]. La region clonada fue secuenciada completamente y se hallo que era completamente identica a las secuencias de la base de datos.

Ejemplo 3

Clonacion en el vector pET102/D-TOPO® y transformacion de las celulas

Los fragmentos de ADN que contienen las secuencias de los genes deoD de Sulfolobus sulfactaricus y los genes udp de Aeropyrum pernix fueron clonados en el vector pET102/D-TOPO® (pET102 Directional TOPO® Expression Kit, Invitrogen) que comprende el origen de replicacion del plasmido pBR322, un gen de resistencia a ampicilina, un promotor T7 que permite la union de la ARN polimerasa T7, un operador Jac que permite la inhibicion de la expresion cuando el isopropiltiogalactopiranosido (IPTG) no esta presente, un sitio de union al ribosoma para la traduccion de ARN, un parche de His-tioredoxina para incrementar la solubilidad de las protemas de fusion y una etiqueta de polihistidina (6xHis) para la deteccion y purificacion de las protemas de fusion (figura 3). El vector fue introducido por choque termico en Escherichia coli BL21 (pET102 Directional TOPO® Expression Kit, Invitrogen), una cepa comercial para la expresion regulada de genes heterologos. Comprende el gen que codifica la ARN polimerasa T7 que hace que la cepa sea compatible con la utilizacion de vectores pET que comprenden el promotor T7 para la sobreexpresion de protemas recombinantes con IPTG.

Los vectores recombinantes resultantes fueron analizados por restriccion de ADN con 10 unidades de la enzima HindIII. El clon positivo fue secuenciado utilizando los cebadores de secuenciacion TrxFus directo 5' 'TTCCTCGACGCTAACCTG, 3' (SEQ ID No. 5) y T7 inverso 5' TAGTTATTGCTCAGGGGTGG 3' (SEQ ID No. 6).

Ejemplo 4

Fermentacion de las cepas recombinantes

Las cepas recombinantes a las que se refiere la presente invencion fueron cultivadas, por separado, en discontinuo, a pH 7, en medio solido de a base de tripticasa de soja suplementado con ampicilina. Se paso una colonia del cultivo en un caldo de nutrientes n° 2 (Oxoid) que contema polvo Lab-lemco 10 g/l, peptona 10 g/l y NaCl 5 g/l, suplementado con 200 mg/l ampicilina. Se incubo a 37°C, en condiciones de agitacion vigorosa (200 rpm). Las cepas de Escherichia coli que albergaban el plasmido de expresion se desarrollaron hasta una densidad optica de 0,6 a 600 nm, entonces se anadio IPTG (hasta 100 mg/l) y se dejo el cultivo en las mismas condiciones de incubacion otras 8 horas. Cuando se ha completado la fermentacion, el medio de cultivo fue centrifugado y el sedimento celular se lavo con solucion tampon fosfato 30 mM-pH 7. La biomasa obtenida fue conservada a -20°C hasta el momento de su uso.

Ejemplo 5

Purificacion parcial de UPasa y PNPasa (preparacion de lisado celular)

Para una purificacion parcial de la protema, la pasta celular, separada mediante centrifugacion o mediante microfiltracion de un cultivo de la cepa recombinante que expresa la enzima UPasa o PNPasa, se altero mediante la adicion de 160 mg de lisozima y una hora de incubacion a 0°C, seguido de tres ciclos de congelacion- descongelacion ultrarrapidos (-80 °C/37°C) y un paso final para reducir la viscosidad consistente en la adicion de 1.000 unidades de desoxirribonucleasa I.

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Ejemplo 6

Determinacion de la actividad enzimatica de la enzima UPasa

Se anadieron 100 microlitros del lisado celular centrifugado, que comprende una suspension de celulas que expresan UPasa, diluido 1:100 (volumen/volumen) con tampon fosfato de potasio a pH 7, se anadieron a 800 microlitros de una solucion de uridina 75 mM en tampon fosfato 100 mM a pH 7,0, se preincubaron a 30°C. Despues de 5 minutos, la reaccion de fosforolisis se detuvo mediante la adicion de 1 ml de HCl 2N. Se analizo una aftcuota de la mezcla de reaccion mediante cromatograffa ffquida de alta resolucion (HPLC) equipada con una columna Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel) de 250 x 4,6 mm. La elucion se llevo a cabo usando una solucion de 4% metanol-agua. La actividad enzimatica del lisado celular se expreso en unidades por ml (pmoles of uracilo x min-1 x ml-1) y se calculo en relacion a soluciones patron de uracilo eluidas en las mismas condiciones. Se recuperaron aproximadamente 590 unidades por ml de lisado celular centrifugado.

Ejemplo 7

Determinacion de la actividad enzimatica de la enzima PNPasa

Se anadieron 100 microlitros del lisado celular centrifugado, que comprende una suspension de celulas que expresan PNPasa, diluido 1:100 (volumen/volumen) con tampon fosfato de potasio a pH 7, se anadieron a 800 microlitros de una solucion de inosina 60 mM en tampon fosfato 100 mM a pH 7,0, se preincubaron a 30°C. Exactamente 10 minutos despues, la reaccion de fosforolisis se detuvo mediante la adicion de 1 ml de HCl 2N. Se analizo una aftcuota de la mezcla de reaccion mediante cromatograffa ftquida de alta resolucion (HPLC) equipada con una columna Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel) de 250 x 4,6 mm. La elucion se llevo a cabo usando una solucion de 4% metanol-agua. La actividad enzimatica del lisado celular se expreso en unidades por ml (pmoles of hipoxantina x min-1 x ml-1) y se calculo en relacion a soluciones patron de hipoxantina eluidas en las mismas condiciones. Se recuperaron aproximadamente 310 unidades por ml de lisado celular centrifugado.

Ejemplo 8

Determinacion de la actividad catalftica de transglicosilacion

Para la determinacion de la actividad catalftica de transglicosilacion se preparo la mezcla de lisados celulares que conteman UPasa y PNPasa mezclando los lisados para tener una proporcion de actividad enzimatica UPasa:PNPasa de aproximadamente 1:1, determinada en los ejemplos 6 y 7. La reaccion de transglicosilacion se llevo a cabo a escala analftica en las siguientes condiciones: se anadieron 250 |il de lisados celulares (equivalentes a 14 unidades de las actividades enzimatica de cada una de UPasa y PNPasa) a 10 ml de una solucion que tema la siguiente composicion: 4 mM de 1-p-D-ribofuranosiluracilo (nucleosido de uridina), 4 mM de base adenina, tampon fosfato de potasio 30 mM pH 7, controlada termostaticamente a 60°C. Despues de 1,5 horas a 60°C, la reaccion se detuvo diluyendo la mezcla 1:5 y enfriando en un bano de hielo. El porcentaje de byconversion de la base adenina a 9-p-D-ribofuranosiladenina (nucleosido de adenosina) se determino analizando una aftcuota de la mezcla de reaccion mediante cromatograffa ffquida de alta resolucion (HPLC), usando una columna Kromasil 100-5C18 (Akzo Nobel) de un tamano de 250 x 4,6 mm y elucion con una solucion 4% de metanol-agua. La actividad catalftica de tranglicosilacion se expreso en unidades ■ ml-1 (|imoles de Ara-A formados en 1,5 horas ■ ml-1 de una mezcla de lisados celulares) o en unidades ■ g_1 de resina humeda (pmoles de D-ribofuranosiladenina formados en 1,5 horas ■ ml-1 de lisados celulares) y se calculo en relacion a una solucion patron de D-ribofuranosiladenina eluida mediante HPLC en las mismas condiciones. Bajo estas condiciones, se formo aproximadamente un 55% de nucleosido de adenosina (aproximadamente 9 unidades por ml de lisado celular).

Ejemplo 9

Efecto de la temperatura y el pH sobre las actividades de las nucleosido fosforilasas

La influencia del pH y la temperatura sobre la accion de las nucleosido fosforilasas fue investigada mediante “disenos de procedimientos de experimentos”. Se combinaron diferentes temperaturas con diferentes valores de pH para encontrar las condiciones que resulten en la maximizacion de las actividades enzimaticas. Se definio un dominio experimental entre 80°C-100°C y pH 5,5-8,5. Como se muestra en la figura 4, se combinaron cinco temperaturas con tres valores de pH de acuerdo con la “Matriz Doehlert”, dando lugar a 7 combinaciones de temperatura y pH. Los sustratos fueron incubados en las soluciones de reaccion seleccionadas y temperatura sin enzima y a continuacion se anadio la enzima y se incubo en las condiciones seleccionadas. Las muestras se procesaron como se ha descrito anteriormente para la determinacion de la actividad enzimatica de las enzimas PNPasa o UPasa. Los valores de actividad se expresaron como un porcentaje de los valores maximos encontrados (100%). En las figuras 5 y 6, respectivamente, se muestran los resultados.

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Ejemplo 10

Termoestabilidad

La termoestabilidad de las enzimas fue estudiada a 80°C. Se prepararon alfcuotas de la enzima entre 100 y 200 microlitros de una suspension de celulas (lisado celular) que expresaban UPasa o/y PNPasa, diluidas 1:100 o 1:1000 (volumen/volumen) usando tampon fosfato, pH 7,0-7,2. Los biocatalizadores se incubaron a 80°C durante tiempos diferentes. Despues de calentar, las soluciones se colocaron inmediatamente en hielo y se realizo la medicion de las actividades de nucleosido fosforilasas tal como se describe en los ejemplos 6 y 7. No se observo perdida de las actividades de las nucleosido fosforilasas despues de 10 horas a 80°C.

Efectos de los disolventes sobre la actividad de las nucleosido fosforilasas.

Los codisolventes organicos son con frecuencia utilizados en reacciones y las enzimas aisladas deben ser capaces de sobrevivir en condiciones de concentraciones relativamente elevadas de codisolventes. Los experimentos fueron llevados a cabo con la presencia de disolventes organicos, tal como el metanol (disolvente polar protico) y dimetilsulfoxido (disolvente polar aprotico). Las nucleosido fosforilasas de la presente invencion fueron resistentes a los disolventes organicos mostrando actividad en una solucion tampon que contema 5 y 10% en volumen de disolvente organico.

Tabla 1. Estabilidad de la enzima PNPasa frente algunos disolventes organicos

Disolventes organicos

Actividad relativa (%)a

DMSO

MeOH

5% (v/v)

94 95

10% (v/v)

115 86

aLa actividad relativa del lisado celular que comprende la enzima PNPasa se determino usando el ensayo estandar descrito en el ejemplo 7 a dos concentraciones de los disolventes organicos y su actividad relativa se comparo con la actividad de los lisados celulares que comprenden la enzima PNPasa sin disolventes organicos. DMSO: dimetilsulfoxido; MeOH: metanol.

Tabla 2. Estabilidad de la enzima UPasa frente algunos disolventes organicos

Disolventes organicos

Actividad relativa (%)b

DMSO

MeOH

5% (v/v)

91 151

10% (v/v)

70 206

La actividad relativa del lisado celular que comprende la enzima UPasa se determino usando el ensayo estandar descrito en el ejemplo 6 a dos concentraciones de los disolventes organicos y su actividad relativa se comparo con la actividad de los lisados que comprenden la enzima UPasa sin disolventes organicos. DMSO: dimetilsulfoxido; MeOH: metanol

Ejemplo 11

Procedimientos generales de bioconversion

Las reacciones de transglicosilacion en una sola etapa (“one-pot”) fueron realizadas a las temperaturas y pH de reaccion seleccionados, en recipientes de reaccion con agitacion moderada. La actividad catalftica de transglicosilacion de la mezcla de lisados celulares utilizados fue de aproximadamente 12 unidades por ml (determinadas como se describe en el ejemplo 8). Los nucleosidos fueron preparados usando una mezcla del lisado celular preparado para obtener una proporcion de actividad PNPasa:UPasa de 1:1.

Los sustratos fueron:

1) 2'-desoxirribonucleosidos o ribonucleosidos naturales que actuan como donadores de 2'-desoxirribosa-1- fosfato o ribosa-1- fosfato;

2) Una base purica o pirimidmica natural o sintetica secundaria, que esta unida a la posicion 1 del azucar.

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Al final de las reacciones, la mezcla de reaccion se centrifugo y a continuacion se filtro usando un dispositivo Amicon Ultrafiltration (membrana YM-3) y los productos se separaron de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante. Los biocatalizadores pueden ser reciclados en reacciones consecutivas (normalmente entre 3-5 reacciones) mediante la adicion de mezclas de reaccion frescas. Las soluciones filtradas se monitorizaron mediante cromatograffa Kquida de alta resolucion (HPLC) utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente. Los rendimientos de bioconversion fueron calculados en base a la concentracion inicial del analogo de la base.

Ejemplo 12

Preparacion de nucleosidos de 2.6-diaminopurina

La preparacion de nucleosidos puricos es mas diffcil debido a la baja solubilidad de estas bases en medios acuosos. En la presente invencion, los inventores usaron las propiedades competitivas de las enzimas para resolver este problema. La estrategia usada por los inventores comprendfa el uso de codisolventes organicos y/o altas temperaturas para incrementar la solubilidad de los sustratos.

12.1 Preparacion de nucleosidos de 2.6-diaminopurina usando codisolventes.

Los ensayos se realizaron usando concentraciones de 5 y 10% de codisolventes dipolares aproticos a 60°C; se anadieron 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 60°C y que tema la siguiente composicion de soluciones sustrato:

1. 15 mM de uridina/2'-desoxiuridina,

2. 5 mM de 2.6-diaminopurina. y

3. 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Despues de 5 horas, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. En la tabla 3, se muestran los rendimientos de produccion de nucleosidos de 2,6-diaminopurina preparados en presencia de codisolventes. Los nucleosidos de 2,6-diaminopurina (2,6-diaminopurina ribosido o 2,6- diaminopurina desoxiribosido) resultantes se analizaron mediante HPLC. En estas reacciones, los productos se obtuvieron en rendimientos elevados (sobre el 80%).

Tabla 3. Rendimientos de la produccion de nucleosidos de 2,6-diaminopurina utilizando codisolventes a diferentes concentraciones (%) a 60°C. THF: Tetrahidrofurano; DMSO:dimetilsulfoxido

Codisolvente

Sustrato Base analoga Producto Rendimiento(%)

10% DMSO

Uridina 2,6-Diaminopurina 2,6-Diaminopurina ribosido 97

10% DMSO

2'-Desoxiuridina 2,6-Diaminopurina 2,6-Diaminopurina desoxirribosido 96

5% THF

Uridina 2,6-Diaminopurina 2,6-Diaminopurina ribosido 84

5% THF

2'-Desoxiuridina 2,6-Diaminopurina 2,6-Diaminopurina desoxirribosido 90

12.2. Preparacion de nucleosidos de 2.6-Diaminopurina sin el uso de codisolventes

La preparacion de nucleosidos de 2,6-Diaminopurina sin usar codisolventes solo pudo realizarse a temperaturas por encima de 80°C debido a la baja solubilidad en agua de esta base purica. Los ensayos fueron realizados a diferentes temperaturas (80, 90 y 100°C). Se anadieron 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a la temperatura seleccionada y que tema la siguiente composicion de soluciones de sustrato:

1. 15 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

2. 5 mM de 2,6-Diaminopurina, y

3. 30 mM de tampon de fosfato de potasio, pH 7.

Despues de 5 horas, la mezcla de reaccion se filtro centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. En la tabla 3, se muestran los rendimientos de produccion de nucleosidos de 2,6-Diaminopurina preparados en presencia de codisolventes. Los nucleosidos de 2,6-diaminopurina (2,6-diaminopurina ribosido o 2,5- diaminopurina desoxiribosido) resultantes se analizaron mediante HPLC. En la tabla 4 se muestran los rendimientos de produccion de nucleosidos de 2,6-Diaminopurina preparados en ausencia de disolventes organicos. El rendimiento de byconversion de la reaccion fue de alrededor del 80% a todas las temperaturas ensayadas.

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Tabla 4. Rendimientos de la produccion de nucleosidos de 2,6-Diaminopurina a diferentes temperaturas sin coisolventes organicos.

Temperatura (°C)

80 90 100

Biotransformacion (%)

79,3 79,6 81,1

Ejemplo 13

Preparacion de otros nucleosidos

Las reacciones de tranglicosilacion se llevaron a cabo usando varias bases aceptoras. Las reacciones se llevaron a cabo a 80°C durante varios periodos de tiempo con DMSO al 10% como codisolvente para las bases puricas y sin codisolventes para las bases aceptoras pirimidmicas. El porcentaje de bioconversion se calculo en relacion a la concentracion inicial de la base aceptora y se determino mediante analisis por HPLC de la mezcla de reaccion

13.1 Preparacion de nucleosidos de trifluorometiluracilo

Se anadio un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilacion de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 80°C y que tema la siguiente composicion:

- 7,5 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

- 2,5 mM de trifluorometiluracilo, y

- 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Despues de 3 horas a 80°C, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. El rendimiento de byconversion de la reaccion fue superior al 60%. Los nucleosidos de trifluorometiluracilo resultantes (trifluorometiluridina o 2-desoxitrifluorometiluridina) se analizaron mediante HPLC.

13.2 Preparacion de nucleosidos de 5-fluoruracilo

Se prepararon nucleosidos de 5-fluorouracilo tal como se ha descrito previamente. Se anadio un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilacion de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 80°C y que tema la siguiente composicion:

- 7,5 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

- 2,5 mM de 5-fluorouracilo y

- 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Despues de 3 horas a 80°C, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 xg durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. El rendimiento de byconversion de la reaccion fue superior al 50%. Los nucleosidos de 5- fluorouracilo resultantes (5-fluorouridina y 5-fluoro-2'-desoxiuridina) se analizaron mediante HPLC.

13.3 Preparacion de nucleosidos de trans-Zeatina

Se prepararon nucleosidos de trans-zeatina tal como se ha descrito previamente. Se anadio un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilacion de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 80°C y que tema la siguiente composicion:

- 7,5 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

- 2,5 mM de trans-zeatina y

- 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como codisolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Despues de 5 horas a 80°C, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. El rendimiento de byconversion de la reaccion fue superior al 80%. Los nucleosidos de trans-zeatina resultantes (trans-zeatina ribosido y trans-zeatina desoxiribosido) se analizaron

mediante HPLC.

13.4 Preparacion de nucleosidos de 2-cloro-6-metilaminopurina.

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Se prepararon nucleosidos de 2-cloro-6-metilaminopurina tal como se ha descrito previamente. Se anadio un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilacion de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 80°C y que tema la siguiente composicion:

- 15 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

- 5 mM de 2-cloro-6-metilaminopurina y

- 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como codisolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Despues de 5 horas a 80°C, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. El rendimiento de bioconversion de la reaccion fue superior al 80%. Los nucleosidos de 2-cloro-6-metilaminopurina resultantes (2-cloro-6-metilaminopurina ribosido y 2-cloro-6- metilaminopurina desoxiribosido) se analizaron mediante HPLC.

13.5 Preparacion de nucleosidos de 6-dimetilaminopurina

Se prepararon nucleosidos de 6-dimetilaminopurina tal como se ha descrito previamente. Se anadio un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilacion de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 80°C y que tema la siguiente composicion:

- 15 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

- 5 mM de 6-dimetilaminopurina y

- 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como codisolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Despues de 5 horas a 80°C, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. El rendimiento de byconversion de la reaccion fue superior al 80%. Los nucleosidos de 6-dimetilaminopurina resultantes (6-dimetilaminopurina ribosido y 6-dimetilaminopurina desoxiribosido) se analizaron mediante HPLC.

13.6. Preparacion de nucleosidos de 6-mercaptopurina

Se prepararon nucleosidos de 6-mercaptopurina tal como se ha descrito previamente. Se anadio un mililitro de catalizador (lisado celular) con actividad de transglicosilacion de aproximadamente 12 unidades/ml de lisado celular a 150 ml de una solucion mantenida termostaticamente a 80°C y que tema la siguiente composicion:

- 15 mM de uridina/2'-Desoxiuridina,

- 5 mM de 6-mercaptopurina y

- 30 mM de tampon fosfato de potasio, pH 7.

Los ensayos se realizaron en DMSO al 10% (v/v) como codisolvente utilizando las condiciones descritas anteriormente. Despues de 5 horas a 80°C, la mezcla de reaccion se filtro por centrifugacion a 2000 *g durante 30 min, a 4°C, usando un Amicon ultra-4 Centrifugal Filter Devices (Millipore, Bedford, MA) con un tamano de corte de 3000 Da y se recupero el filtrado. El rendimiento de byconversion de la reaccion fue superior al 50%. Los nucleosidos de 6-mercaptopurina resultantes (6-mercaptopurina ribosido y 6-mercaptopurina desoxiribosido) se analizaron mediante HPLc.

Referencias

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5

10

15

20

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archaeon Sulfolobus solfataricus. (Traducido del ingles) FEBS J 272(8):1886-1899 (en ingles).

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Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Vector de expresion recombinante que comprende: la secuencia que codifica una purina nucleosido fosforilasa (PNPasa, E.C. 2.4.2.1) con la secuencia que codifica una uridina fosforilasa (UPasa, E.C. 2.4.2.3); cada una de las secuencias unida operativamente con una o mas secuencias de control que dirigen la produccion de dichas fosforilasas en un hospedador de expresion adecuado; originandose dichas secuencias de la clase Archaea Thermoprotei, caracterizado porque la PNPasa es de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO. 7) y la UPasa es de Aeropyrum pernix (SEQ ID NO. 8) y porque dicho hospedador de expresion adecuado es la cepa bacteriana BL21 de E. coli; y ademas porque dicho vector comprende un promotor T7 que permite la union de ARN polimerasa T7, un operador lac que permite la inhibicion de la expresion cuando el isopropiltiogalactopiranosido (IPTG) no esta presente y tioredoxina con parche de histidinas.
2. 2. Celula hospedadora de E. coli que comprende el vector de expresion recombinante segun la reivindicacion 1.
3. 3. Lisado obtenido mediante el lisado de la celula hospedora, segun la reivindicacion 2.
4. 4. Procedimiento de transglicosilacion entre una nucleobase unida a un azucar ribosa o desoxirribosa a traves de un enlace beta-glicosfdico y una nucleobase o nucleobase modificada en presencia de iones fosfato, caracterizado porque dicho procedimiento comprende la utilizacion de una purina nucleosido fosforilasa de Sulfolobus solfataricus (SEQ ID NO. 7) con una uridina fosforilasa de Aeropyrum pernix (SEQ ID NO. 8), caracterizado porque dichas fosforilasas son producidas por el vector de expresion recombinante segun la reivindicacion 1.
5. 5. Procedimiento de transglicosilacion, segun la reivindicacion 4, en el que la UPasa de Aeropyrum pernix y la PNPasa de Sulfolobus solfataricus son proporcionadas por una celula hospedadora segun cualquiera de las reivindicaciones 2-3.
6. 6. Procedimiento de transglicosilacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 4-5, en el que los productos obtenidos son principios activos farmaceuticos (API) o intermedios de los mismos.
7. 7. Procedimiento de transglicosilacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 4-6, en el que la nucleobase unida a un azucar ribosa o desoxirribosa a traves de un enlace beta-glicosfdico se selecciona entre nucleosidos naturales o modificados que contienen D-ribosa o 2'-desoxirribosa; nucleosidos que contienen el grupo ribosa modificado en las posiciones 2', 3' y/o 5'; y nucleosidos en los que el azucar es beta-D-arabinosa, alfa-L-xilosa, 3'-desoxirribosa, 3',5'- didesoxirribosa, 2',3'-didesoxirribosa, 5'-desoxirribosa, 2',5'-didesoxirribosa, 2'-amino-2'-desoxirribosa, 3'-amino-3'- desoxirribosa o 2'-fluoro-2'-desoxirribosa.
8. 8. Procedimiento de transglicosilacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 4-7, en el que la nucleobase o nucleobase modificada se selecciona entre bases pirimidmicas y puricas naturales o sustituidas; bases puricas sustituidas en una o mas de las posiciones 1, 2, 6; bases pirimidmicas sustituidas en una o mas de las posiciones 3, 5; y purina, 2-azapurina, 8-azapurina, 1-deazapurina (imidazopiridina), 3-deazapurina, 7-deazapurina, 2,6- diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, trans-zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina, 6-mercaptopurina.
9. 9. Procedimiento de transglicosilacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 4-8, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo entre 60°C y 100°C.
10. 10. Procedimiento de transglicosilacion, segun cualquiera de las reivindicaciones 4-9, en el que dicho procedimiento se lleva a cabo en medio acuoso o en un sistema de codisolventes polares aproticos.
11. 11. Procedimiento de transglicosilacion, segun la reivindicacion 10, en el que el sistema de codisolventes polares aproticos se selecciona entre dimetilsulfoxido, tetrahidrofurano, 2- metiltetrahidrofurano, y dimetilformamida.
12. 12. Procedimiento de transglicosilacion segun cualquiera de las reivindicaciones 4-11, en el que el nucleosido donador de azucar se selecciona ente uridina y 2'-desoxiuridina y la base aceptora se selecciona entre 2,6- diaminopurina, 5-fluorouracilo, 5-trifluorometiluracilo, trans-zeatina, 2-cloro-6-metilaminopurina, 6-dimetilaminopurina y 6-mercaptopurina.