ES2690348T3 - Péptidos y composiciones para la prevención de la adhesión celular y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde dicho péptido comprende hasta 50 aminoácidos, y en donde la composición está desprovista de actividad citotóxica y citostática.

Description

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DESCRIPCION
Péptidos y composiciones para la prevención de la adhesión celular y métodos de uso de los mismos Campo de la invención
La presente invención se refiere, entre otros, a péptidos naturales aislados y su uso en la prevención de la adhesión celular.
Antecedentes de la invención
Los microorganismos pueden vivir y proliferar como células individuales que nadan libremente en el medio ambiente (como el plancton), o pueden crecer como comunidades multicelulares altamente organizadas encerradas en una matriz polimérica autoproducida en estrecha asociación con superficies e interfaces. El último estilo de vida microbiano se conoce como biopelículas. La formación de biopelículas representa un modo de crecimiento antiguo, protegido que permite la supervivencia microbiana en ambientes hostiles y permite a los microorganismos dispersarse y colonizar nuevos nichos [Hall-Stoodley y colaboradores, Nat Rev Microbiol. (2004) 2 (2):95-108].
La composición de las biopelículas es compleja y variable entre diferentes especies microbianas e incluso dentro de las mismas especies bajo diferentes condiciones medioambientales. No obstante, la formación de biopelículas representa el estilo de vida normal de los microorganismos en el medio ambiente y todos los microbios pueden formar biopelículas. Estudios previos revelaron que la formación de biopelículas bacterianas progresa a través de múltiples etapas de desarrollo que difieren en los perfiles de proteínas [Sauer y colaboradores, J Bacteriol. (2002) 184(4):1140-54], empezando con la unión a la superficie, seguido por la inmigración y división para formar microcolonias y finalmente la maduración que implica la expresión de los polímeros de matriz. Las bacterias dentro de cada etapa de la biopelícula muestran fenotipos y poseen propiedades que son marcadamente diferentes de las del mismo grupo que crecen planctónicamente [Sauer y colaboradores, J Bacteriol. (2004) 186(21):7312-26].
Las biopelículas son una causa importante de las infecciones sistémicas (por ejemplo, infecciones nosocomiales) en humanos. En el cuerpo, las biopelículas se pueden asociar con los tejidos (por ejemplo, orejas internas, dientes, encías, pulmones, válvulas cardíacas y el tracto urogenital). Se estima que un 65% de las infecciones bacterianas en humanos son biopelículas son biopelículas en naturaleza. Además, después de formar biopelículas, los microorganismos tienden a cambiar sus características, algunas veces drásticamente, de manera que las dosis de antibióticos que normalmente matan los organismos en los cultivos suspendidos son completamente inefectivas contra los mismos microorganismos cuando los organismos están en forma de biopelícula unida o conglomerada (documento de Patente U.S. Pat. No. 7189351).
Una de las principales preocupaciones con respecto a los productos que se introducen en el cuerpo (por ejemplo, lentes de contacto, catéteres venosos centrales, válvulas cardíacas mecánicas y marcapasos) o proporcionan una vía al cuerpo es la infección microbiana e invariablemente la formación de biopelículas. Dado que estas infecciones son difíciles de tratar con antibióticos, es necesario a menudo retirar el dispositivo, lo que es traumático para el paciente y aumenta el costo médico. Por consiguiente, para tales aparatos médicos, la técnica ha buscado durante mucho tiempo medios y métodos para hacer esos aparatos y dispositivos médicos antimicrobianos.
La solicitud de Patente PCT Application No. WO 06/006172 describe el uso de agentes anti-amiloides, tales como compuestos aromáticos, para evitar la formación o disgregar una biopelícula preexistente. La solicitud describe que compuestos que prevén la formación de fibrillas de aminoide en Alzheimers pueden actuar contra a la formación de fibrillas en biopelículas, y concluye que los aminoácidos que tienen un brazo aromático son eficaces contra las biopelículas. Sin embargo, el análisis se limitó a secuencias de longitud completa.
Huerta y colaboradores (Toxicon 39: 1253-1256, 2001) describen las proteínas de anémonas del mar EqTV, GIII, ST-I y St-II que comprenden la secuencia FDYNLY, FDYNFY O FDYNWY. Klyshko y colaboradores (Toxicon 44: 315-324, 2004) describen las proteínas de anémonas del mar RTXSII, RTXA, HEt3, CYT1, EQT4 y EQT5 que comprenden la secuencia FDYNLY, FDYNFY, FDYNWY o YDYNWY. El documento de Patente WO 2004/022751 describe una proteína de la anémona del mar que comprende la secuencia FDYNFY. El documento de Patente US 2003/0103912 describe el uso de D-tagatosa para interrumpir la biopelícula e inhibir la formación de la biopelícula.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona factores naturales de amplio espectro que interfieren con la formación de la biopelícula en sus etapas iniciales, en una amplia gama de microorganismos. A partir de estos factores naturales, se aislaron péptidos con altas secuencias de conservación, y mostraron alta actividad en la prevención de la adhesión microbiana en su conformación sintética. La secuencia conservada se encuentra en varios organismos marinos, incluyendo varias especies conocidas de anémonas marinas, varios peces (incluyendo el pez cebra-Danio rerio), y en el musgo Physcomitrella patens subsp.
Todos los factores mencionados anteriormente muestran actividad que se dirige exclusivamente a la prevención de la adhesión del sustrato bacteriano y la formación de biopelículas derivadas. Está desprovisto de la actividad
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bactericida letal comúnmente observada, revelada por los péptidos antibióticos y los metabolitos secundarios, que proporcionan una fuerte presión selectiva para una selección natural rápida por el “potencial biótico” microbiano intensivo. Por otro lado, una inhibición de amplio rango de la colonización bacteriana antagoniza un mecanismo fundamental de supervivencia bacteriana. Por lo tanto, una modificación adaptativa de dicho mecanismo tiene una baja probabilidad debido a su vitalidad.
Sher y colaboradores (Toxicon 45: 865-879, 2005) identificaron supuestas proteínas y polipéptidos biológicamente activos expresados por hydrae que podrían ser componentes de su sistema alomonal, utilizando una aproximación bioinformática. Se demostró que Hydrae expresa los ortólogos de las toxinas de cnidarian de la fosfolipasa A2 y citólisis que pertenece a la familia de actinoporina, y expresa proteínas similares a las fosfolipasas similares a elapid, proteínas secretoras ricas en cisteina (CRISP), polipéptidos similares a proquineticina y desoxirribonucleasas tóxicas.
Las secuencias específicas responsables de la actividad citotóxica en péptidos aislados de fuentes naturales no se han identificado hasta ahora.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden utilizar en la práctica o prueba de la presente invención, métodos y materiales adecuados se describen a continuación. En caso de conflicto, la especificación de la patente, ique incluye definiciones, controlará. Además, los materiales, métodos, y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.
Como se utiliza aquí, los términos “que comprende” y “que incluye” o variantes gramaticales de los mismos deben considerarse como especificaciones de las características, números enteros, etapas o componentes indicados pero no excluyen la adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos. Este término abarca los términos “que consiste en” y “que consiste esencialmente en”.
La frase “que consiste esencialmente en” o variantes gramaticales de la misma cuando se utiliza aquí debe tomarse como especificaciones de las características, números enteros, etapas o componentes indicados, pero no excluyen la adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos pero solo si las características, números enteros, etapas, componentes o grupos de los mismos adicionales no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición, dispositivo o método reivindicado.
El término “método” se refiere a las maneras, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea dada que incluye, pero no se limita a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos, o fáciles de utilizar, a partir de métodos, técnicas y procedimientos conocidos por los facultativos de las técnicas químicas, biológicas y biofísicas.
Como se utiliza aquí, el término “aproximadamente” se refiere a ± 10%.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, y de las reivindicaciones.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describe aquí, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines de discusión ilustrativa de las realizaciones preferidas de la presente invención solamente, y se presentan con la finalidad de proporcionar lo que se cree ser la descripción más útil y fácilmente comprensible de los principios y aspectos conceptuales de la invención. A este respecto, no se intenta mostrar los detalles estructurales de la invención con más detalle de lo que es necesario para una comprensión fundamental de la invención, la descripción tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica como las diversas formas de la invención se pueden incorporar en la práctica.
En los dibujos:
La Figura 1 muestra la estructura cristalina de la cadena A de 1GWY del estado soluble en agua de la citolisina Sticholisina II formadora de poros, la región activa se marcó en amarillo;
La Figura 2 muestra la estructura cristalina de la cadena B de 1GWY del estado soluble en agua de la citolisina Sticholisina II formadora de poros, la región activa se marcó en amarillo;
La Figura 3 muestra la estructura cristalina de la cadena A de 1KD6 de la citolisina Equinatoxina II formadora de poros eucariótica, la región activa se marcó en amarillo;
La Figura 4 muestra la construcción tridimensional de un mutante de equinatoxina, la región activa se marcó en amarillo;
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La Figura 5 es un diagrama de barras que muestra los efectos de diferentes concentraciones de proteínas sintéticas en el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 durante 24 horas; Sin efecto bactericida o bacteriostático;
La Figura 6 es un diagrama de barras que muestra los efectos de diferentes concentraciones de proteínas sintéticas en la formación de biopelículas por Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 durante 24 horas;
La Figura 7 es un diagrama de barras que muestra los efectos de diferentes concentraciones de proteínas sintéticas en el crecimiento de un aislado clínico de Acinetobacter Baumannii durante 24 horas;
La Figura 8 es un diagrama de barras que muestra los efectos de diferentes concentraciones de proteínas sintéticas en la formación de biopelículas por un aislado clínico de Acinetobacter Baumannii durante 24 horas;
La Figura 9 es un diagrama de barras que muestra los efectos de las fracciones tentaculares seleccionadas de Actinia equina en la formación de biopelículas por Acinetobacter Baumannii, con PBS como control positivo;
La Figura 10 es un diagrama de barras que muestra los efectos de la fracción 13 en la formación de biopelículas por diversas bacterias gram positivas y gram negativas;
La Figura 11 es un diagrama de barras que muestra los efectos de extractos crudos de Anemonia, Aiptasia y Physcomitrella (Musgo) en Pseudomonas aeruginosa en una concentración de proteína de 50 pg/mL;
La Figura 12 es un diagrama de barras que muestra los efectos de cinco péptidos sintéticos y material crudo del musgo de Physcomitrella patens;
La Figura 13 muestra fracciones obtenidas por separación del extracto crudo de Aiptasia pulchella en una columna Sephadex G-10;
La Figura 14 muestra los picos obtenidos por recromatografía de las fracciones de alto peso molecular de la Figura 13;
La Figura 15 muestra fracciones obtenidas mediante separación por cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) con una columna c-18, de la fracción de bajo peso molecular de la Figura 14;
Las Figuras 16A-B muestran la estructura general de un conductor cíclico con un brazo emulsionante de un péptido de acuerdo con los principios de la presente invención; y
La Figura 17 es un diagrama de flujo que muestra el desarrollo del conductor de péptido cíclico con el brazo emulsionante.
Descripción de las realizaciones preferidas
La presente invención es de composiciones que comprende un péptido que tiene uno o más efectos relacionados con la prevención de la adhesión del sustrato bacteriano y la formación de biopelículas derivadas, y opcionalmente también la prevención de la adhesión célula-célula. También se pueden proporcionar opcional, adicional o alternativamente otros efectos. El péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, FDYNWY, YDWNLY, YDWHLY y WDYNLY, que se pueden extraer de organismos tales como organismos acuáticos y musgos y métodos de uso de los mismos. Otras secuencias se describen a continuación. Por lo tanto, la presente invención se refiere a una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WdYNLy, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde dicho péptido comprende hasta 50 aminoácidos, y en donde la composición está desprovista de actividad citotóxica y citostática.
Una de las principales preocupaciones en medicina es la formación de películas microbianas. En humanos, las biopelículas son una causa de infecciones sistémicas (por ejemplo, infecciones nosocomiales) y son la principal preocupación cuando se introducen productos en el cuerpo (por ejemplo, lentes de contacto, catéteres venosos centrales, válvulas cardiacas mecánicas y marcapasos).
Las biopelículas son también un problema en muchas industrias incluyendo la industria alimentaria, farmacéutica, de pintura, aguas, industrias de transporte e ingeniería que causan, entre una amplia gama de efectos negativos, la corrosión acelerada en sistemas industriales, acidificación del petróleo y la bioincrustación. Por ejemplo, la bioincrustación se puede causar por la adhesión de organismos a cualquier superficie en un ambiente marino o de agua dulce, incluyendo torres de refrigeración, tuberías y filtros de agua en instalaciones de enfriamiento o desalinización, irrigación y centrales eléctricas, y membranas, tales como las utilizadas en aguas residuales y sistemas de desalinización. La bioincrustación ocurre también en sistemas de acuicultura en las piscifactorías.
Además, las flotas de transporte comercial del mundo consumen aproximadamente 300 millones de toneladas de combustible al año. Sin medidas antiincrustantes, ese consumo de combustible aumentaría hasta en un 40%, lo que
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equivale a 120 millones de toneladas de combustible adicionales al año. El costo económico de ésto se estimó en unos 7,5 billones de dólares en 2000; una estimación más reciente es de 30 billones de dólares.
Las biopelículas son muy difíciles de eliminar ya que los microbios que crecen en su interior están altamente organizados y pueden resistir entornos hostiles, tales como temperaturas elevadas y agentes antimicrobianos (por ejemplo, antibióticos).
Las plantas y organismos marinos y de agua dulce incluyendo los invertebrados de agua de cuerpo blando, peces y musgo, están rodeados por especies de organismos microbianos de amplio espectro. Ya que dichas plantas y organismos carecen de inmunidad específica, producen diversos factores que pueden prevenir la colonización microbiana en la superficie de su cuerpo.
Los organismos más “sensibles” son invertebrados pertenecientes al phylum cnidaria que incluye las anémonas del mar, corales, medusas, hidroides, medusas, y abanicos de mar. Tales organismos de cuerpo blando, que carecen de protección física como escamas o caparazones, utilizan proteínas y metabolitos secundarios para protegerse del medio microbiano que los rodea.
Se ha informado previamente que los organismos marinos (por ejemplo, esponjas) producen metabolitos secundarios que muestran actividades antibacterianas y antifúngicas [Amade y colaboradores, Supra]. Además, se ha demostrado que las anémonas del mar (por ejemplo Actinia equina) producen péptidos formadores de poros, tóxicos (es decir, equinatoxinas), que lisan y matan células eucarióticas de manera similar a otros pequeños péptidos antimicrobianos [Anderluh y colaboradores, Supra].
Aunque se sabe en la técnica que las secuencias de longitud completa de diversas proteínas se relacionan con su función citolísica, los péptidos específicos responsables del efecto citolísico no se han identificado previamente.
Los presentes inventores han demostrado que varias fracciones activas obtenidas de las anémonas de mar utilizando separaciones de cromatografía líquida muestran un alto nivel de prevención de la adhesión microbiana a las superficies abióticas. Las anémonas de mar incluyen 46 familias que se pueden encontrar en fuentes de agua en todo el mundo. La mayoría de las anémonas de mar son sésiles, con un pie especializado utilizado para anclarlas en sustratos blandos, o se adhieren a rocas y corales. La actividad anti-adhesiva se demostró con varias especies de anémonas de mar pertenecientes a diferentes géneros: Actinia equine, Aiptasia y Anemonia. Se ha demostrado que la región N terminal de la citotoxina de la anémona está implicada en el efecto citotóxico [Ref: Kristan K, Podlesek Z, Hojnik V, Gutiérrez-Aguirre I, Guncar G, Turk D, González-Manas JM, Lakey JH, Macek P, Anderluh G (2004): Pore formation by equinatoxin, an eukaryotic pore-forming toxin, requires a flexible N-terminal región and a stable beta sándwich. J Biol Chem. 279(45):46509-46517]. Los presentes inventores también han identificado en el pescado una proteína que tiene cierta semejanza con la región C terminal de la citoxina de la anémona, región que no está implicada en la citotoxicidad. Esta proteína tiene una región altamente conservada, con una función desconocida, que es también un dominio rico en Trp, y puede ser importante para la unión de la proteína a la membrana lipídica. Los presentes inventores también han encontrado esta región en el musgo de Physcomitrella patens.
Los presentes inventores, por tanto, plantearon la hipótesis de que esta región proporciona un péptido que es altamente eficaz en la prevención en la formación de la biopelícula, mientras que está desprovisto de la actividad citotóxica. Los presentes inventores han caracterizado y aislado un péptido natural que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, que tienen propiedades anti-película altamente eficaces.
De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido comprende parte de una secuencia que comprende hasta aproximadamente 30, hasta aproximadamente 40, o hasta aproximadamente 50 aminoácidos.
De acuerdo con algunas realizaciones, el péptido se selecciona del grupo que consiste en FSVPYDYNLYSNWW, MFSVPFDYNFYSNWW, MFSVPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYTNWW, MWSVPFDYNLYSNWW,
MFSVPWDYNLYKNWF, MFSVPFDYNLYKNWL, MFSVPFFDYNWYSNWW, LFSVPFDYNLYSNWW,
MASIPYDWNLYQSWA, MASIPYDWNLYSAWA, y MASIPYDWHLYNAWA. Como se muestra aquí a continuación y en la sección de Ejemplos que sigue, los presentes inventores han identificado una fracción activa extraída de la anémona de Aiptesia pulchella, utilizando el análisis de espectroscopía de masas en tándem (MS/MS).
Los presentes inventores utilizaron el programa clustaLW para identificar alineaciones de secuencia múltiple biológicamente significativas de diversas proteínas de citotoxina de anémonas e identificar un cebador universal de citotoxina de anémona para su uso en una reacción en cadena de polimerasa (PCR). Se logró la amplificación de una región de 250 pares de bases de proteínas de citotoxina a partir de dos diferentes anémonas, aiptesia y anemonia viridansm, de secuencia Eqt-F: GTR TCG ACA ACG AGT CRG G y Eqt-R252: TGA CAT YCC ACC AgT TGC TG, respectivamente. La traducción de estas regiones a péptidos, y la comparación de BlastX con el banco de genes, mostraron que estas regiones son parte del dominio conservado de la citoxina de la anémona. Como se describe con más detalle a continuación en la sección de Ejemplos, y se muestra en las Figuras 5 a 8, los presentes inventores compararon las actividades de un número de péptidos sintéticos de anémonas y musgo, y descubrieron que estos péptidos prevenían la formación de biopelículas [Figuras 6 y 8 a 12], pero no mataban ni inhibían el crecimiento de la bacteria [Figuras 5 y 7].
5
10
15
20
25
30
35
40
El efecto anti-adhesivo se demostró en varias especias bacterianas (Figura 10), lo que condujo a los presentes inventores a concluir que los materiales activos no son específicos de especies sin activos frente a una amplia gama de especies microbianas.
La región de péptido conservada se ha identificado, por ejemplo, en las siguientes proteínas naturales:
LFSVPYDYNWYSNWW
FSVPYDYNLYSNWW
MFSVPFDYNFYSNWW
MFSVPFDYNLYSNWW
MFSVPFDYNLYTNWW
MWSVPFDYNLYSNWW
MFSVPWDYNLYKNWF
MFSVPFDYNLYKNWL
EqT-IV
Actinoporina Or-A
HMg III de la Heteractis magnifica
Avt-I RTX-A
Pstx20
Physcomitrella patens Danio rerio Tetraodon nigroviridis
Opcional y preferiblemente, el péptido de la presente invención comprende la secuencia CMFSVPFDYNWYSNWWC. Opcional y preferiblemente, el péptido de la presente invención está comprendido en una proteína que tiene de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 aminoácidos.
Sin desear estar limitado por una sola hipótesis, basándose en la estructura tridimensional de dos citotoxinas de anemonas (equinatoxina y Sticholysin), como se muestra en las Figuras 1-4, la región activa mira hacia afuera.
Las Figuras 1 y 2 muestran la estructura cristalina de las cadenas A y B de 1 GWY, respectivamente, de la citolisina Sticholysin II. La Figura 3 muestra la estructura de la cadena A de 1KD6 de la citolisina equintoxina II eucariótica formadora de poros.
La Figura 4 muestra la construcción tridimensional de un mutante de equinatoxina, que tiene tres cisteínas introducidas en las posiciones 8, 18 y 69 (Cadena A de 1TZQ). Se ha demostrado anteriormente que este mutante no es hemolíticamente activo (Kristan K, Podlesek Z, Hojnik V, Gutierrez-Aguirre I, Guncar G, Turk D, González- Manas JM, Lakey JH, Macek P, Anderluh G (2004): Pore formation by equinatoxin, an eukaryotic pore-forming toxin, requires a flexible N-terminal region and a stable beta sandwich. J Biol Chem. 279(45):46509-46517). La proteína perdió así su citotoxicidad, pero todavía era activa frente a la adhesión bacteriana.
Los principios y el funcionamiento de la presente invención se pueden entender mejor con relación a los dibujos y descripciones adjuntas.
Antes de explicar al menos una realización de la invención en detalle, debe entenderse que la invención no está limitada en su aplicación a los detalles establecidos en la siguiente descripción o ejemplificados en los Ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de practicarse o llevarse a cabo de varias maneras. También, debe entenderse que la fraseología y terminología empleada aquí son para el propósito de la descripción y no deben considerarse como limitantes.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una composición que comprende un péptido, el péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, wDyNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde dicho péptido comprende hasta 50 aminoácidos, y en donde la composición está desprovista de actividad citotóxica o citostática.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un método para prevenir la adhesión de un organismo unicelular a una superficie seleccionada del grupo que consiste en una tela, una fibra, una espuma, una película, un hormigón, una mampostería, un vidrio, un metal y un plástico, comprendiendo el método poner en contacto la célula con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido natural o sintético aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, previniendo de este modo la adhesión de una célula a una superficie.
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona preferiblemente un dominio que comprende al menos uno de los péptidos anteriores y que es efectivo frente a la adhesión celular a una superficie. Más preferiblemente, el dominio se incluye como parte de una proteína. Opcional y más preferiblemente, el dominio muestra un comportamiento anti-adhesivo, por ejemplo para la prevención de la formación y/o tratamiento de una biopelícula, pero no muestra un comportamiento citotóxico.
Una selección no limitante de dominios ejemplares se proporciona en la siguiente tabla.
Secuencia de dominio
Especies
FSVPYDYNLYSNWW
Actinoporina Or-A
MFSVPFDYNFYSNWW
HMg III de Heteractis magnifica
MFSVPFDYNLYSNWW
Avt-I RTX-A
MFSVPFDYNLYTNWW
Pstx20
MWSVPFDYNLYSNWW
Physcomitrella patens
MFSVPWDYNLYKNWF
Danio rerio
MFSVPFDYNLYKNWL
Tetraodon nigroviridis
Otras secuencias ejemplares se describen aquí, relacionadas con la siguiente secuencia:
MSRLIIVFIWTMrCSATALPSKKIIDEDEEDEKRSADVAGAVIDGASLSFDILKTV
LEALGNVKRtOAVGVDNESGKTWTALNTYFRSGTSDIVLPHKVPHGKALLYNGQKDR
GPVATGAVGVLAYLMSDGNTLAVLFSVPYDYNWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYE
ELYYNLSPFRGDNGWHTRNLGYGLKSRGFMNSSGHAILEIHVSKA
Esta secuencia tiene el identificador de acceso al GenBank: >gi|48428895|sp|P61914.1|ACTP2_ACTEQ precursor 2 de la Equinatoxina (Equinatoxin II) (EqT II) (EqT II) Actinia equine y tiene 214 aminoácidos de longitud. Esta 5 secuencia es también opcionalmente una secuencia ejemplar de acuerdo con la presente invención. Las posiciones 38-213 de esta secuencia alcanzan el dominio anotado pfam06369, Anemone_cytotox, proteína citotóxica de la anémona marina; por lo tanto, esta parte de la secuencia anterior es también opcionalmente una secuencia ejemplar de acuerdo con la presente invención.
En algunas realizaciones, la presente invención también incluye cualquier secuencia relacionada con la secuencia 10 anterior de la misma. Dichas secuencias relacionadas pueden encontrarse opcionalmente ejecutando cualquier tipo de software de comparación de secuencias, incluyendo pero no limitado a BLASTP. A continuación se proporcionan resultados representativos de los taxones seleccionados y sus alineaciones con Eqtll (la secuencia anterior):
1. Anémonas marinas -
1a. Stichodactyla helianthus
15 >gi|2815496|sp|P07845.2|ACTP2_STOHE Sticholysin-2 (Sticholysin II) (StnII) (Cytolysin St II) (Cytolysin III)
(Cytotoxin)
ALAGTIIAGASLTFQVLDKVLEELGKVSRKIAVGIDNESGGTWTALNAYFRSGTTDVILP
EFVPNTKALLYSGRKDTGPVATGAVAAFAYYMSSGNTLGVMFSVPFDYNWYSNWWD
VKIYSGKRRADQGMYEDLYYGNPY
RGDNGWHEKNLGYGLRMKGIMTSAGEAKMQIKISR
Alineación
>sp|P07845.2|ACTP2_STOHE Sticholysin-2 (Sticholysin II) (StnII) (Cytolysin St II) (Cytolysin III) (Cytotoxin) 20 Longitud=175
Puntuación = 253 bits (646), Esperado = 8e-66, Método: estadísticas basadas en la composición.
Semejanzas = 118/176 (67%), Positivos = 144/176 (81%), Diferencias = 1/176 (0%)
Query
38
Sbjct
l
Query
98
Sbjct
61
Query
158
sbjct
121
DVAGAVIDGAS IiS FDIIiKTVLEALGHVKRKI AVGVDNE S GKTWTALiNTYFRS GTSDXVIiP 9 7 +AG +1 GASL+F +L VLE LG V RKIAVG+DNESG TWTALN YFRSGT+D++LP ALAGTIIAGASLTFQVLDKVLEELGKVSRKIAVGIDNESGGTWTALNAYFRSGTTDVILP g 0
HKVPHGKALLYNGQKDRGPVATGAVGVLAYLMSDGNTLAVLFSVPYDYNWYSNWWNVRIY 157 VP+ KALLY+G+KD GFVATGAV AY MS GNTL V+FSVP+DY1JWYSNWW+V+IY EFVPWTKñLLYSGRKDTG PVATGAVAAFAYYMS S GNTLGVMFSVPFDY1TWYSHWWDVKIY 120
KGKRRADQRMYBELYYNLS PFRGDNG WHTRNLGYGLKSRGFMH S S GHAILEIHVSK 213 GKRRADQ MYE+LYY +P+RGDNGWH +NLGYGL+- +G M S+G A ++X +S+ SGKRRADQGMYEDLYYG-NPYRGDNGWHEKNLGYGIiRMKGIMTSAGEAKWQIKISR 175
2. Pez huesudo 2a. Danio rerio
>gi|25821212|ref|XP_01342650.1|PREDICTED: proteína hipotética [Danio rerio]
MTESAEAVAANVSSRRHATVEITNLTNNYCFLNPKVYLENGETSNPPQPTVRPL.KTEVCTFSKSAAHATG
svgvltydlferrrndytetlaimfsvpwdynlyknwfavgiypkgkecdqalykemyyqknqiigfvree
ANGSGINFEGKNLDIRATMCPMGRAIVKVEVWDKLLSPMAQMDC
5
Alineación:
>ref|XP_001342650.1|UniGene infoGene info PREDICTED: proteína hipotética [Danio rerio] Longitud = 184 GENE ID: 100002992 apnl | proteína similar a la actinoporina [Danio rerio]
Puntuación = 199 bits (505), Esperado = 1e-49, Método: estadísticas basadas en la composición.
10 Semejanzas = 49/167 (29%), Positivos = 73/167 (43%), Diferencias = 12/167 (7%)
Query 58 sbj ct 8
LEALGNVKRKIAVGVDNESG - KTWTALNTYFRSGTSDIVLPHKVPHGKALLYNGQKDRGP 116 + A++RV + N+ + Y+G+ V K + K
VAANVS SRRHATVEITNLTNNYCFLNFKVYLENGETSNPPQPTVRFLKTEVCTFSKSAAH 6 7
Query
Sbjct
117 VATGAVGVLAYLMSD-----GNTLAVLFSVPYDYWWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYEE 170
ATG+VGVL Y + + TLA++FSVP+DYN Y NW+ V IY + DQ +Y+E
68 -ATGSVGVLTYDLFERRRNDYTETLAIMFSVPWDYNLYKNWFAVGIYPKGKECDQALYKE 126
Query
sbjct
171 LYYKLSPF---RGDNGWHTRNLGYGLKSRGFMNSSGHAXLEXHVSK 213
+YY + NG G L R M G AI+++ V
12 7 MYYQKNQHGFVREEANGSGINFEGKNLDIRATMCPMGRAIVKVEVWD 173
2b. Tetraodon nigroviridis
>gi|47218822|emb|CAG02807.1| producto proteico sin nombre [Tetraodon nigroviridis]
MESAEAVAADVSRSRSVTIEISNLTKNYCLINPRVYLESGETYNPPQPTVRPLMTEVCTFSKSSGIPTGS
VGVIjTYELLERRSTMLPETLAIMFSVFYDYSFYNNWFAVGIYETGTKCNEGLYKQMYNEKKQAEHGFVRE
KANGSGINYVGGNLDIRATMNPLGKAIMKVEVWDAFFPFSE
Alineación:
5
>emb|CAG02807.1| producto proteico sin nombre [Tetraodon nigroviridis] Longitud = 181 Puntuación = 192 bits (489), Esperado = 1e-47, Método: estadísticas basadas en la composición.
Semajanzas = 46/170 (27%), Positivos = 76/170 (44%), Diferencias = 14/170 (8%).
Query 58 Sbj ct 7
LE ALGNVKRKIAVGVDNE S - GKTWTALNTYFRS GTS DIVLPHKVPHGKALLYNGQKDRGP 115 + A + R+ + +N + YSG+ V + KG
VAADVSRSRSVTIEISNLTKNYCLINPRVYLESGETYNPPQPTVRPLMTEVCTFSKSSG- 6 5
Query 117 Sbjct 56
VATGAVGVLAYLMSD-....GMTLAVLFSVPYDYNWYSNWWNVRIYKGKRRADQRMYEE 170
+ TG+VGVL Y + + TLA++FSVPYDY++Y+NW+ V IY+ + ++ +Y++
IPTGSVGVLTYELLERRSTMLP3TLAIMFSVPYDYSFYNNWFAVGIYETGTKCNEGLYKQ 125
Query Sbj ct
171 LYYNLSPF------RGDNGWHTRNLGYGLKSRGFMNSSGHAILEIHVSKA 214
+Y NG +G L R MN G AI+++ V A
12 6 MYNEKKQAEHGFVREKANGSGINYVGGNLDIRATMNPLGKAIMKVEVWDA 175
3. Musgos
3a. Physcomitrella patens
>gi|168060237|ref|XP_001782104.1| proteína predicha [Physcomitrella patens subsp. Patens]
MWHLIAMGLRYSETIMKTARMABAIIPAAELSIKTLQNIVEGITGVDRKIAIGFKNLTDYTLENLGVYF
NSGSSDRSIAYKINAQEALLFSARKSDHTARGTVGTFSYYIQDEDKTVHVMWSVPFDYNLYSNWWNIAW
DGRQPPDSNVHDNLYNGSGGMPYPNKPDQYINNEQKGFHLFGSMTNNGQATIEVELKKA
10 >ref|XP_001782104.1| Proteína predicha de la información génica [Physcomitrella patens subsp. Patens]
gb|EDQ53098.1| Proteína predicha de la información génica [Physcomitrella patens subsp. Patens] Longitud = 199
GENE ID: 5945292 PHYPADRAFT_61094| proteína hipotética [Physcomitrella patens subsp. Patens]
Puntuación = 230 bits (586), Esperado = 7e-59, Método: estadísticas basadas en la composición.
Semejanzas = 63/183 (34%), Positivos = 101/183 (55%), Diferencias = 4/183 (2%).
5
10
Query 35 Sbjct 18
RSADVAGAVIDGASLSFDILKTVLEALGNVKRKIAVGVDNESGKTWTALNTYFRSGTSDI 94 ++A +A A+I A LS L+ ++E + V RKIA+G N + T L YF SG+SD KTARMAEA1IPAAELSIKTLQNIVEGITGVDRKX AIGFKNLTDYTLENLGVYFNSGS SDR 77
Query 95 Sbj ct 78
VLPHKVPHGKALLYNGQKDRGPVATGAVGVLAYLMSD - GNTLAVLFSVPYDYNWYSNWWN 153 4 +K+ +ALL++ +K A G VG +Y + D T+ V++SVP+DYN YSNWWN SIAYKINAQEALLFSAR.KSDH-TARGTVGTFSYYIQDEDKTVHVMWSVPFDYNLYSNWWN 136
Query 154 Sbjct 13 7
VRIYKGKRRADQRMYEEL.YYNL--S PFRGDNGWHTRMLGYGLKSRGFMKSSGHAILEIHV + + G++ D +++ LY P+ + N G G M ++G A +E+ 4 IAWDGRQPPDSNVHDNLYNGSGGMPYPNKPDQYINNEQKGFHLFGSMTNNGQATIEVEL
211
196
Query 212 SKA 214 KA
Sbjct 197 KKA 199
4. Birds
4a. Gallus gallus
>gi|118129726|ref|XP_001231839.1| PREDICHO: Isoforma 1 de la proteína hipotética [Gallus gallus]
MPPKEKKENDKPCNDNCQPKPQGKGVESLMKNIDVCRSVGLEIINRTRTVTLTDFRSYCFSGKIVTTLPF
EIGPDSKGICIFAKTPYSLRGSVGTWCKADTFFLAITFSKfPYDYILYKIEFAIiEIFTEPNHLGNLGDVF
SKMMKSKPYCGSSLFQRAVLESEHETLEVSKGSIRVQAKMSNNRKAILKVQVEDMDPPPYSKGM
>ref|XP_001231839.1|UniGene infoGene info PREDICTED: isoforma 1 de la proteína hipotética [Gallus gallus] Longitud=204
GENE ID: 769729 LOC769729 | proteína hipotética LOC769729 [Gallus gallus]
Puntuación = 150 bits (378), Esperado = 9e-35, Método: estadísticas basadas en la composición.
Semejanzas = 33/172 (19%), Positivos = 63/172 (36%), Diferencias = 22/172 (12%)
Query 58 LEñliGNVKRKIAVGVDlíES - GKTWTALNTYFRSGTSDIVXiPHKVPHGKñLLYNGQKDRGP 116
L +V R + + 4 N 4 T T +Y SG LP ++ + K
Sbjct 29 IiMKNIDVCR S VGLEX INRTRTVTLT'DFS S YC FSGKI VTTIjPF’E IG PDS KGIC1FAKT P - Y 87
Query 117 VATGAVGtVLAYLMSDGlí TLAVLFSVPYDYNWY StTWWKVR IYKGKRRADQ----RMYEEL 171
G+VG + +D LA+ FS PYDY Y 4 + 1+ 4 44 44
Sbjct 88 SLRGSVGTWCK-ADTFFIiAITFSITFYDYlIiYKIEFALEXF--TE PNHLGNLGDVFS KM 143
Query 172 YYNLSPFRG---------DNGWHFRNLGYGLKSRGFMNSSGHAIliEIHVSK 213
P+ G +4-4 M4++ AIL4+ V
Sbjct 144 MK- SKPYCGS S LFQRAVLESEHETLE VS KGSIRVQAKMSNNRKAILKVQVED 194
5
10
15
20
25
5. Ornitorrinco
5a. Ornithorhynchus anatinus
>gi|149491241 |reflXP_001516906.1| PREDICTED: proteína hipotética [Ornithorhynchus anatinus]
MAQTIEHLVHEVBAGRCVGlBITNTTNMTFRSPRTFCFSGHTLTPPTPIIHPNNAGFCIFVKRKFSLRaS
VGLLVYEIEDQTLAIMFSNPFDYNFFKVEFAVALSGYKEETQDLKAFFELLYHEKQKGWI.KMAKEKLCEC
QCPVSLENNGIRVTATMSNNAKAIIKLSSPDAKPPEGDVADVQPTTVRRPNPPPFPSPRPRIGSDLTGDQ
IiATLDFESGK
>ref|XP_001516906.1| Gene info PREDICTED: proteína hipotética [Ornithorhynchus anatinus] Longitud=220
GENE ID: 100086848 LOC100086848 | proteína hipotética LOC100086848 [Ornithorhynchus anatinus] Puntuación = 168 bits (426), Esperado = 2e-40, Método: estadísticas basadas en la composición. Semejanzas = 36/167 (21%), Positivos = 69/167 (41%), Diferencias = 12/167 (7%)
Query
58
Sbjct
8
Query
118
Sbjct
67
Query
176
Sbjct
126
IiEAlGNVKRKIAVGVDNESGKrWTALNTYFRSGTSDIVLPHKVPHGKALLYNGQKDRGPV L R + + + N + T?4 4 T4 SG 4 + A K R
LVHEVEAGRCVGIEITNTTNMTFRSPRTFCFSGHTLXPPTPIIHPNNAGPCIFVK-RKFS
ATGAVGVLAYLMSDGNTLAVLFSVPYDYNMYSNWWNVRI - - YKGKRRADQRMYEELYYNL G+VG+L Y 4 D TLA44FS P4DYN44 4 V 4 YK 4 4 4 4E LY4
LRGSVGLLVYEIED-QTLAIMFSNPFTDYNFFKVEFAVALSGYKEETQDXjKAFFELLYHEK
--------SPFRGDNGWHTRNIiGYGLKSRGFMNSSGHAILEIHVS KA 214
4 G44 M444 AX444 A
QKGWIiKMAKEKLCECQCPVSLENWGIRVTATMSNKAKAIXKLSSPDA 172
m
es
175
125
Como se utiliza aquí, el término “aislado” se refiere a una composición que se ha eliminado de su ubicación in-vivo (por ejemplo, un organismo acuático o musgo). Preferiblemente, las composiciones aisladas de la presente invención están sustancialmente libres de otras sustancias (por ejemplo, otras proteínas que no comprenden los efectos anti-adhesivos) que están presentes en sus ubicaciones in-vivo (es decir, purificada o semipurificada).
Como se utiliza aquí, la frase “organismo acuático” se refiere a un organismo que vive en un entorno acuático (marino o de agua dulce) tal como por ejemplo un pez o un organismo acuático sésil.
Como se utiliza aquí, la frase “organismo acuático sésil” se refiere a un organismo acuático que no se mueve libremente durante al menos alguna parte de su ciclo de vida. Los organismos acuáticos sésiles están usualmente unidos permanentemente a un sustrato sólido de algún tipo, tal como una roca o un casco de un barco debido al anclaje físico al sustrato, o por cualquier otra razón (por ejemplo, peces de piedra).
Organismos sésiles ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cnidarios sésiles tales como corales, anémonas de mar (por ejemplo, Actinia equine y Aiptasia pulchella), plumas marinas, larvas sésiles acuáticas (por ejemplo, larvas de medusas), anémonas tubo-vivienda e hidroides (por ejemplo, Chlorohydra viridissima e Hydra vulgaris).
Peces ejemplares que se pueden utilizar de acuerdo con las realizaciones de la presente invención son preferiblemente aquellos que viven en aguas poco profundas o aquellos que se esconden en la capa inferior del océano, a veces en agujeros o cuevas. Dichos peces incluyen anguila y bagre.
Como se utiliza aquí, la frase “musgo” se refiere a una planta no vascular de la división de briofitas, que incluye cualquiera de las clases de takakiposida, esfagnópsidas, andreaeopsida, andreaeobryopsida, polytrichopsida, o briopsida.
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El musgo puede comprender, por ejemplo, PhyscomitreNa patens, Funaria hygrometrica; Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Bryophyta; Moss Superclass V; Bryopsida; Funariidae; Funariales; Funariaceae; o Physcomitrella.
Las composiciones de la presente invención se pueden expresar también in-vivo utilizando técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, utilizando organismos sésiles acuáticos transgénicos).
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, las composiciones de la presente invención carecen de actividad citotóxica o citostática, por ejemplo, no son bactericidas o bacteriostáticas.
De acuerdo con algunas realizaciones de la presente invención, las composiciones de la presente invención son resistentes a la liofilización, por ejemplo, sus actividades se conservan después de la liofilización.
Como se utiliza aquí, la frase “organismo de célula única” se refiere a un organismo unicelular también denominado microorganismo o microbio. El organismo unicelular de la presente invención puede ser un organismo de célula única eucariótica (por ejemplo, protozoos u hongos por ejemplo, levadura) o un organismo de célula única procariota (por ejemplo, bacterias o arqueas). Los organismos unicelulares de la presente invención pueden estar en cualquier entorno celular, tal como por ejemplo, en una biopelícula, como células aisladas o como una suspensión celular.
Como se utiliza aquí, el término “biopelícula” se refiere a una matriz extracelular en la que los microorganismos se dispersan y/o forman colonias. La biopelícula está hecha típicamente de polisacáridos y otras macromoléculas.
Ejemplos de células bacterianas, cuya adhesión puede prevenirse de acuerdo con el método de la presente invención, incluyen bacterias gram positivas y bacterias gram negativas.
El término “bacteria gram positiva” como se utiliza aquí, se refiere a bacterias que se caracterizan por tener como parte de su estructura de pared celular peptidoglicano así como polisacáridos y/o ácidos teicoicos y se caracterizan por su reacción de color azul-violeta en el procedimiento de tinción de Gram. Bacterias Gram-positivas representativas incluyen: Actinomyces spp., Bacillus anthracis, Bifidobacterium spp., Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Clostridium spp., Clostridium tetani, Corynebacterium diphtherieae, Corynebacterium jeikeium, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Erysipelothrix rhusiopathiae, Eubacterium spp., Gardnerella vaginalis, Gemella morbillorum, Leuconostoc spp., Mycobacterium abscessus, Mycobacterium avium complex, Mycobacterium chelonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium haemophilium, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium leprae, Mycobacterium marinum, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium terrae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium ulcerans, Nocardia spp., Peptococcus niger, Peptostreptococcus spp., Proprionibacterium spp., Sarcina lutea, Staphylococcus aureus, Staphylococcus auricularis, Staphylococcus capitis, Staphylococcus cohnii, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus hominis, Staphylococcus lugdanensis, Staphylococcus saccharolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Staphylococcus schleiferi, Staphylococcus similans, Staphylococcus warneri, Staphylococcus xylosus, Streptococcus agalactiae (streptococcus grupo B), Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus equi, Streptococcus milleri, Streptococcus mitior, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes (streptococcus grupo A), Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis.
El término “bacteria gram negativa” como se utiliza aquí se refiere a bacterias que se caracterizan por la presencia de una membrana doble que rodea cada célula bacteriana. Bacterias gram negativas representativas incluyen Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter baumannii, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Aeromonas hydrophila, Alcaligenes xylosoxidans, Bacteroides, Bacteroides fragilis, Bartonella bacilliformis, Bordetella spp., Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella spp., Campylobacter spp., Chalmydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chromobacterium violaceum, Citrobacter spp., Eikenella corrodens, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Flavobacterium meningosepticum, Fusobacterium spp., Haemophilus influenzae, Haemophilus spp., Helicobacter pylori, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella spp., Legionella spp., Leptospira spp., Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Mycoplasma pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pasteurella multocida, Plesiomonas shigelloides, Prevotella spp., Proteus spp., Providencia rettgeri, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas spp., Rickettsia prowazekii, Rickettsia rickettsii, Rochalimaea spp., Salmonella spp., Salmonella typhi, Serratia marcescens, Shigella spp., Shigella sonnei, Treponema carateum, Treponema pallidum, Treponema pallidum endemicum, Treponema pertenue, Veillonella spp., Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis.
El término “hongo” como se utiliza aquí se refiere a los organismos heterotróficos que se caracterizan por la presencia de una pared celular quitinosa, y en la mayoría de las especies, al crecimiento filamentoso como hifas multicelulares. Hongos representativos cuya adhesión se puede prevenir de acuerdo con el método de la presente invención incluyen Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae, Candida glabrata, Candida parapsilosis y Candida dubliniensis.
Como se utiliza aquí, la frase “que previene la adhesión” se refiere a que reducen o eliminan la unión celular a una superficie (por ejemplo, por reducción de la velocidad de crecimiento sobre una superficie). Preferiblemente, las composiciones de la presente invención previenen la adhesión celular en tanto como un 10 %, más preferiblemente
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en un 20%, más preferiblemente en un 30%, más preferiblemente en un 40%, más preferiblemente en un 50%, más preferiblemente en un 60%, más preferiblemente en un 70%, más preferiblemente en un 80%, más preferiblemente en un 90% y lo más preferible en un 100% según se midió mediante un ensayo de adhesión celular. Ejemplos de ensayos de adhesión celular se describen aquí a continuación y en la sección de Ejemplos que sigue. Se apreciará que las composiciones de la presente invención pueden ser capaces también de prevenir la agregación celular (es decir, la no agregación celular a una superficie).
La presente invención contempla la prevención de la adhesión celular a una amplia variedad de superficies incluyendo telas, fibras, espumas, películas, hormigones, mamposterías, vidrio, metales, plásticos, polímeros y similares.
De acuerdo con una realización, la superficie está comprendida en un dispositivo que es susceptible a la formación de la biopelícula. Dispositivos ejemplares cuyas superficies se contemplan en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, cascos de embarcaciones, superficies de automóviles, superficies de aviones, membranas, filtros, y equipos industriales.
La superficie se puede comprender también en dispositivos médicos, instrumentos, e implantes. Ejemplos de dichos dispositivos médicos, instrumentos e implantes incluyen cualquier objeto que es capaz de implantarse temporal o permanentemente en un organismo mamífero, tal como un ser humano. Dispositivos médicos, instrumentos e implantes representativos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención incluyen, por ejemplo, catéteres venosos centrales, catéteres urinarios, tubos endotraqueales, válvulas cardíacas mecánicas, marcapasos, injertos vasculares, stents y articulaciones protésicas. Los métodos para prevenir la unión celular a los dispositivos médicos y ejemplos adicionales de los mismos se describen aquí a continuación.
De acuerdo con otra realización la superficie está comprendida en un tejido biológico, tal como por ejemplo, tejidos de mamíferos, por ejemplo, la piel.
Como se mencionó, el método de la presente invención se efectúa poniendo en contacto la célula con una composición de un organismo capaz de prevenir la adhesión de la célula a una superficie.
Como se utiliza aquí, el término “poner en contacto” se refiere al posicionamiento de las composiciones de la presente invención de manera que están en contacto directo o indirecto con las células adhesivas de tal manera que el agente activo comprendido dentro es capaz de prevenir la adhesión de las células al mismo. Por lo tanto, la presente invención contempla tanto la aplicación de las composiciones de la presente invención a la superficie deseada y/o directamente a las células adhesivas.
La puesta en contacto se puede efectuar in vivo (es decir, dentro de un cuerpo de mamífero), ex vivo (es decir, en células eliminadas del cuerpo) y/o in vitro (es decir, fuera de un cuerpo de mamífero).
La puesta en contacto de las composiciones con una superficie se puede efectuar utilizando cualquier método conocido en la técnica incluyendo pulverización, dispersión, humectación, sumergimiento, inmersión, pintura, soldadura ultrasónica, soldadura, unión o adherencia. Las composiciones de la presente invención se pueden unir como monocapas o múltiples capas.
De acuerdo con una realización, las composiciones de la presente invención pueden estar comprendidas en un organismo vivo completo. Por ejemplo, la presente invención contempla la adición de organismos vivos acuáticos a un entorno subacuático de modo que puedan ponerse en contacto con una superficie y/o células adheridas a la misma (por ejemplo, tuberías submarinas, cascos de barcos) previniendo la adhesión de los microorganismos a la misma. Se apreciará que el agente activo se puede secretar a partir de un organismo acuático. En este caso, el organismo acuático no tiene que estar en contacto directo con la superficie o las células del microorganismo, pero en una proximidad suficiente para que el agente activo sea capaz de difundirse a su sitio de acción. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención se pueden secretar en el agua y utilizarse en tratamientos de purificación de agua tales como por ejemplo desalinización del agua del mar o agua salobre.
De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable y como un ingrediente activo un péptido aislado a partir de un péptido natural aislado, comprendiendo dicho péptido una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, o cualquier otra secuencia como las descritas aquí.
De acuerdo con otras realizaciones de la presente invención, los péptidos anteriores pueden opcionalmente alterarse para formar análogos no peptídicos, incluyendo pero no limitado a, la sustitución de uno o más enlaces con enlaces menos lábiles, ciclación (que se describe con mayor detalle a continuación) y similares. Además o alternativamente, un péptido puede convertirse opcionalmente en una molécula pequeña mediante modelado informático, como se describe, por ejemplo, en la solicitud de Patente PCT Application No. WO/2007/147098.
Un “resto orgánico peptidomimético” se puede sustituir opcionalmente por restos de aminoácidos en un péptido de acuerdo con la presente invención tanto como sustituciones conservativas como no conservativas. Estos restos se
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denominan también “aminoácidos no naturales” y pueden sustituir opcionalmente restos de aminoácidos, aminoácidos o actuar como grupos espaciadores dentro de los péptidos en un lugar de aminoácidos eliminados. Los restos orgánicos peptidomiméticos tienen opcional y preferiblemente propiedades estéricas, electrónicas o configuracionales similares a las de los aminoácidos sustituidos y dichos peptidomiméticos se utilizan para sustituir aminoácidos en posiciones esenciales, y se consideran sustituciones conservativas. Sin embargo, tales similitudes no se requieren necesariamente. La única restricción sobre el uso de los peptidomiméticos es que la composición retenga al menos sustancialmente su actividad fisiológica en comparación con el péptido nativo de acuerdo con la presente invención.
Los peptidomiméticos pueden utilizarse opcionalmente para inhibir la degradación de los péptidos mediante procesos enzimáticos y otros procesos degradativos. Los peptidomiméticos pueden introducirse opcional y preferiblemente mediante técnicas de síntesis orgánica. Los ejemplos no limitantes de peptidomiméticos adecuados incluyen D aminoácidos de los correspondientes L aminoácidos, tetrazol (Zabrocki y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 110:5875 5880 (1988)); isósteros de enlaces amida (Jones y colaboradores, Tetrahedron Lett. 29:3853 3856 (1988)); ácido LL 3 amino 2 propenidona 6 carboxílico (LL Acp) (Kemp y colaboradores, J. Org. Chem. 50:5834 5838 (1985)). Análogos similares se muestran en Kemp y colaboradores, Tetrahedron Lett. 29:5081 5082 (1988) así como en Kemp y colaboradores, Tetrahedron Lett. 29:5057 5060 (1988), Kemp y colaboradores, Tetrahedron Lett. 29:4935 4938 (1988) y Kemp y colaboradores, J. Org. Chem. 54:109 115 (1987). Otros adecuados pero a modo de ejemplo se muestran en Nagai y Sato, Tetrahedron Lett. 26:647 650 (1985); Di Maio y colaboradores, J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1687 (1985); Kahn y colaboradores, Tetrahedron Lett. 30:2317 (1989); Olson y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 112:323 333 (1990); Garvey y colaboradores J. Org. Chem. 56:436 (1990). Ejemplos de peptidomiméticos adecuados adicionales incluyen hidroxi 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolina 3 carboxilato (Miyake y colaboradores, J. Takeda Res. Labs 43:53 76 (1989)); 1,2,3,4 tetrahidroisoquinolina 3 carboxilato (Kazmierski y colaboradores, J. Am. Chem. Soc. 133:2275 2283 (1991)); ácido histidina isoquinolona carboxílico (HIC) (Zechel y colaboradores, Int. J. Pep. Protein Res. 43 (1991)); (2S, 3S) metil fenilalanina, (2S, 3R) metil fenilalanina, (2R, 3S) metil fenilalanina y (2R, 3R) metil fenilalanina (Kazmierski y Hruby, Tetraheron Lett. (1991).
Ejemplos, ilustrativos pero no limitantes de aminoácidos no naturales incluyen beta aminoácidos (beta 3 y beta 2), homo aminoácidos, aminoácidos cíclicos, aminoácidos aromáticos, derivados de Pro y Pyr, derivados de alanina 3- sustituidos, derivados de Glicina, derivados de Phe y Tyr sustituidos en el anillo, aminoácidos o diaminoácidos de núcleo lineal. Están disponibles en una variedad de proveedores, tales como Sigma-Aldrich (USA) por ejemplo.
En la presente invención cualquier parte de un péptido puede ser opcionalmente modificada químicamente, es decir, puede cambiarse mediante la adición de grupos funcionales. La modificación puede llevarse a cabo opcionalmente durante la síntesis de la molécula si se sigue un proceso de síntesis química, por ejemplo mediante la adición de un aminoácido químicamente modificado. Sin embargo, también es posible la modificación química de un aminoácido cuando ya está presente en la molécula (modificación “in situ”).
El aminoácido de una cualquiera de las regiones de secuencia de la molécula puede modificarse opcionalmente de acuerdo con uno cualquiera de los siguientes tipos ejemplares de modificación (en el péptido conceptualmente visto como “modificado químicamente”). Ejemplos de tipos de modificación no limitantes incluyen carboximetilación, acilación, fosforilación, glicosilación o acilación grasa. Los enlaces de éter se pueden utilizar opcionalmente para unir el hidroxilo de la serina o treonina al hidroxilo de un azúcar. Los enlaces amida se pueden utilizar opcionalmente para unir los grupos carboxilo del glutamato o aspartato a un grupo amino de un azúcar (Garg y Jeanloz, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Vol. 43, Academic Press (1985); Kunz, Ang. Chem. Int. Ed. English 26:294-308 (1987)). Los enlaces acetal y cetal se pueden formar también opcionalmente entre aminoácidos y carbohidratos. Derivados acilo de ácidos grasos se pueden formar opcionalmente, por ejemplo, por acilación de un grupo amino libre (por ejemplo, lisina) (Toth y colaboradores, Peptides: Chemistry, Structure and Biology, Rivier and Marshal, eds., ESCOM Publ., Leiden, 1078-1079 (1990)).
Como se utiliza aquí el término “modificación química”, cuando se refiere a un péptido de acuerdo con la presente invención, se refiere a un péptido en el que al menos uno de sus restos de aminoácido se modifica o por procesos naturales, tal como modificaciones de procesamiento u otras postraduccionales, o por técnicas de modificación química que son bien conocidas en la técnica. Ejemplos de las numerosas modificaciones conocidas incluyen típicamente, pero no se limitan a: acetilación, acilación, amidación, ADP-ribosilación, glicosilación, formación de anclaje GPI, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, metilación, miristilación, pegilación, prenilación, fosforilación, ubiquitinación, o cualquier proceso similar.
De acuerdo con algunas realizaciones de este aspecto de la presente invención, se proporciona un método para prevenir o tratar una infección patógena en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica, tratando y previniendo de este modo la infección patógena.
De acuerdo con realizaciones alternativas de este aspecto de la presente invención, se proporciona un método para prevenir la unión de bacterias exógenas al tracto gastrointestinal.
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El tracto gastrointestinal de mamíferos contiene una amplia variedad de microflora indígena, que proporciona resistencia a la colonización por patógenos entéricos. A cambio de proporcionar al huésped una mejor defensa frente a patógenos, la microflora indígena obtiene acceso a un entorno estable enriquecido con nutrientes y, por lo tanto, entra en una relación simbiótica con el tracto intestinal del huésped.
Las bacterias simbióticas se unen al epitelio gastrointestinal en los seres humanos mediante una unión de alta afinidad, mediada por el receptor. Por el contrario, las bacterias exógenas se unen al epitelio mediante un mecanismo de baja afinidad. Sin desear estar limitados por una sola hipótesis, se espera que las composiciones de la presente invención prevengan o disminuyan selectivamente esta unión de baja afinidad, evitando así la etapa inicial de formación de la biopelícula.
La composición de la presente invención es por lo tanto útil para el tratamiento o prevención de enfermedades del tracto gastrointestinal, tal como, por ejemplo la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, que incluyen, por ejemplo, colitis colagenosa, colitis linfocítica, colitis isquémica, colitis por diversión, colitis infecciosa y síndrome de Behcet.
Como se utiliza aquí una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de uno o más ingredientes activos descritos aquí con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
Como se utiliza aquí el término “ingrediente activo” se refiere a las composiciones de organismos (y agentes purificados de los mismos) responsables del efecto biológico deseado.
En lo sucesivo, las frases “vehículo fisiológicamente aceptable” y vehículo farmacéuticamente aceptable”, que se pueden utilizar indistintamente, se refieren a un vehículo o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye bajo estas frases.
Aquí, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales, y polietilenglicoles.
Técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en la última edición de “Remington's Pharmaceutical Sciences,” Mack Publishing Co., Easton, PA, que se incorporan aquí en su totalidad por referencia y se describen adicionalmente aquí a continuación.
Como se menciona, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar a un sujeto que lo necesite para prevenir o tratar una infección patógena.
Como se utiliza aquí el término “sujeto que lo necesita” se refiere a un mamífero, preferiblemente un sujeto humano.
Como se utiliza aquí el término “tratar” se refiere a curar, revertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir o detener los efectos perjudiciales de una infección patógena.
Como se utiliza aquí la frase “infección patógena” se refiere a cualquier afección médica que es causada por un organismo patógeno. Ejemplos de infecciones patógenas incluyen, pero no se limitan a, enfermedades infecciosas crónicas, enfermedades infecciosas subagudas, enfermedades infecciosas agudas, enfermedades víricas, enfermedades bacterianas, enfermedades protozoarias, enfermedades parasitarias, enfermedades fúngicas, enfermedades por micoplasma, enfermedades por arqueas y enfermedades por priones.
De acuerdo con una realización, la infección patógena es causada por un organismo capaz de crecer en o sobre una biopelícula.
Ejemplos de infecciones patógenas causadas por biopelículas microbianas incluyen endocarditis valvular nativa (NVE), otitis media (OM), prostatitis bacteriana crónica, fibrosis quística (CF), y periodontitis. Infecciones patógenas adicionales que no se atribuyen específicamente a las biopelículas incluyen, pero no se limitan a infecciones urinarias, infecciones del trato genital femenino y pneumonía. Infecciones debidas a la implantación de dispositivos médicos incluyen infecciones vasculares del catéter, infecciones protésicas arteriales, infecciones de las válvulas cardíacas protésicas, infecciones articulares protésicas, infecciones del sistema nervioso central, infecciones de implantes ortopédicos, infecciones por marcapasos y desfibriladores, hemodiálisis e infecciones por diálisis peritoneal, infecciones oculares, infecciones del tracto urinario, infecciones del tracto genital femenino, infecciones asociadas con la intubación endotraqueal y traqueostomía e infecciones dentales.
Como se utiliza aquí la frase “organismo patógeno” se refiere a cualquier organismo unicelular que es capaz de causar una enfermedad, especialmente un microorganismo vivo tal como una bacteria o un hongo. Preferiblemente el organismo patógeno es capaz de crecer en o sobre una biopelícula. Muchos organismos patógenos comunes existen en los mamíferos (por ejemplo, seres humanos) como biopelículas y causan enfermedades. Estos incluyen, pero no se limitan a, Mannheimia haemolytica y Pasteurella multocida (que causan pneumonía), Fusobacterium
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necrophorum (que causa abceso hepático), Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa (que causan infecciones de heridas), Escherichia coli y Salmonella spp (que causan enteritis), Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis (que causa OM), y Streptococci sp., Staphylococci sp., Candida, y Aspergillus sp. (que causan NVE).
Se apreciará que el tratamiento de las enfermedades infecciosas de acuerdo con la presente invención se puede combinar con otros métodos de tratamiento conocidos en la técnica (por ejemplo, terapias de combinación). Estos incluyen, pero no se limitan a, agentes antimicrobianos tales como penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos, aminoglicósidos, macrólidos, lincomicinas, tetraciclinas, cloranfenicol, y griseofulvina.
Las vías adecuadas de administración pueden incluir, por ejemplo, oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal, o administración parenteral, incluyendo intramuscular, subcutánea, e inyecciones intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales, o intraoculares.
Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar por procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medios de procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención pueden formularse así de manera convencional utilizando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la ruta de administración elegida.
Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como la solución de Hank, solución de Ringer, o tampón salino fisiológica. Para administración transmucosal, se utilizan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera que se va a penetrar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Para la administración tópica, las composiciones de la presente invención se pueden formular como un gel, una crema, un lavado, un enjuague o una pulverización.
Para la administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente combinando los compuestos activos con los vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que la composición farmacéutica se formule como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, lodos, suspensiones, y similares, para la ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden preparar utilizando un excipiente sólido, moliendo opcionalmente la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, añadiendo después auxiliares adecuados según se desee, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o sales de los mismos tales como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin, se pueden utilizar soluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinil pirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden agregar colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para identificar o caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente incluyen cápsulas duras hechas de gelatina, así como cápsulas blandas, selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos mezclados con un relleno como la lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio, y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafinas líquidas, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.
Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de una manera convencional.
Para administración mediante inhalación nasal, los ingredientes activos para su uso de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano,
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triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la dosis se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para su uso en un dispensador que contienen una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.
La composición farmacéutica descrita aquí se puede formular para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para la inyección se pueden presentar en forma de dosis única, por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones, o emulsiones en un vehículo aceitoso o acuoso, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización, y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección apropiadas basadas en aceite o agua. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos, o liposomas. Suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos, para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, una solución estéril, libre de pirógenos, basada en agua, antes de su uso.
La composición farmacéutica de la presente invención puede formularse también en composiciones para vía rectal tal como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para su uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el fin pretendido. Más específicamente, una “cantidad terapéuticamente efectiva” significa una cantidad de ingredientes activos (por ejemplo, una composición de un organismo acuático o una composición de musgo) efectiva para prevenir, aliviar, o mejorar los síntomas de una infección patógena (por ejemplo, fiebre) o prolongar la supervivencia del sujeto tratado.
La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica, especialmente a la luz de la descripción detallada proporcionada aquí.
Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la dosis o la cantidad terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de los ensayos in vitro y de los cultivos celulares. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos de animales para lograr una concentración o título deseado. Tal información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos aquí se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivos celulares y en estudios en animales se pueden utilizar para formular un rango de dosificación en seres humanos. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y de la vía de administración utilizada. La formulación exacta, vía de administración, y dosificación pueden ser elegidas por el médico individual a la vista de la afección del paciente. (Véase, por ejemplo, Fingl, E y colaboradores, (1975), “The Pharmacological Basis of Therapeutics,” Ch.1, p.1.).
La cantidad de dosificación y los intervalos de administración se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles suficientes de plasma o cerebrales del ingrediente activo para inducir o suprimir el efecto biológico (es decir, concentración mínimamente efectiva, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro. Las dosis necesarias para lograr las MEC dependerán de las características individuales y de la vía de administración. Los ensayos de detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones en plasma.
Dependiendo de la gravedad y de la capacidad de respuesta de la afección que se va a tratar, la dosificación puede ser de una o varias administraciones, con un transcurso del tratamiento duradero de varios días a varias semanas, o hasta que se efectúe la cura o se logre una disminución del estado de la enfermedad.
La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se va a tratar, la gravedad de la aflicción, la forma de administración, el juicio del médico que prescribe, etc.
Las composiciones de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un equipo de reactivos aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitarias que contienen el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, comprender una lámina metálica o de plástico, tal como un envase de blíster. El envase o dispositivo dispensador puede estar acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dispositivo dispensador puede acompañarse también por un
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aviso en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, cuyo aviso refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones para su uso en seres humanos o administración veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede incluir etiquetado aprobado por la U.S. Food and Drug Administration para medicamentos recetados o de un inserto de un producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden prepararse también, colocarse en un recipiente apropiado y etiquetarse para el tratamiento de una afección indicada, como se detalló más anteriormente.
Como se mencionó, los dispositivos médicos y los implantes son comúnmente infectados con bacterias oportunistas y otros microorganismos infecciosos (por ejemplo, hongos) necesitándose en algunos casos la eliminación de los dispositivos implantables. Tales infecciones pueden también dar como resultado enfermedades, largas estadías en el hospital, o incluso la muerte. La prevención de la formación de biopelículas y la infección de los dispositivos médicos es, por lo tanto, altamente deseado.
Por lo tanto, la presente invención también contempla dispositivos médicos en los que las composiciones descritas anteriormente están unidas a los mismos.
Como se utiliza aquí, el término “dispositivo médico se refiere a cualquier implante, instrumento, aparato, utensilio, máquina, dispositivo o cualquier otro objeto similar o relacionado (incluyendo cualquier componente o accesorio), que se pretende utilizar en el diagnóstico, tratamiento, cura o prevención de enfermedades u otras afecciones. Tales dispositivos médicos se pretenden utilizan en hombres u otros animales y se prevé que afecte a la estructura o cualquier función del cuerpo. Dichos dispositivos médicos no logran sus propósitos primarios a través de la acción química y no dependen de la metabolización para el logro de sus propósitos primarios previstos.
Como se utiliza aquí, el término “implante” se refiere a cualquier objeto destinado a la colocación en un cuerpo humano que no es un tejido vivo. El implante puede ser temporal o permanente. Un implante puede ser un artículo que comprende componentes artificiales, tales como catéteres o marcapasos. Los implantes pueden incluir también objetos derivados naturalmente que se han procesado para que sus tejidos vivos se hayan desvitalizado. Como ejemplo, los injertos óseos se han procesado para que sus células vivas sean eliminadas (acelularizar), pero de modo que su forma se mantiene para servir como una plantilla para el crecimiento interno del hueso de un huésped. Como otro ejemplo, el coral natural se puede procesar para producir preparaciones de hidroxiapatito que se pueden aplicar al cuerpo para ciertas terapias ortopédicas y dentales.
La presente invención, por lo tanto, prevé revestir dispositivos médicos con las composiciones de la presente invención para prevenir la adherencia celular a la misma a fin de reducir/eliminar cualquier posible agregación celular y formación de biopelícula que se sabe que ocurre después de la implantación. Infecciones relacionadas con los dispositivos resultan generalmente de la introducción de microorganismos, principalmente bacterias, durante la inserción del dispositivo o el procedimiento de implantación, o a partir de la unión de organismos transportados por la sangre al dispositivo recién insertado y su posterior propagación sobre su superficie. El recubrimiento del dispositivo médico con las composiciones de la presente invención inhibirá, por tanto, la formación de biopelículas de una o más especies microbianas, evitará las infecciones relacionadas con los dispositivos médico, y, en consecuencia, reducirá la necesidad de un tratamiento con antibióticos o la retirada del dispositivo médico del sujeto.
Los dispositivos médicos que se pueden recubrir de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vasos sanguíneos artificiales, catéteres y otros dispositivos para la eliminación o administración de fluidos a pacientes, corazones artificiales, riñones artificiales, clavos ortopédicos, articulaciones protésicas, placas e implantes; catéteres y otros tubos (incluyendo tubos urológicos y biliares, tubos endotraqueales, catéteres venosos centrales insertables de forma periférica, catéteres de diálisis, catéteres venosos centrales tunelizados de larga duración, catéteres venosos periféricos, catéteres venosos centrales de corta duración, catéteres arteriales, catéteres pulmonares, catéteres de Swan-Ganz, catéteres urinarios, catéteres peritoneales), dispositivos urinarios (incluyendo dispositivos urinarios de larga duración, dispositivos urinarios de unión de tejidos, esfínteres urinarios artificiales, dilatadores urinarios), derivaciones (incluyendo derivaciones ventriculares o arteriovenosas); prótesis (incluyendo implantes mamarios, prótesis de pene, prótesis de injerto vascular, dispositivos de reparación de aneurismas, válvulas cardiacas mecánicas, articulaciones artificiales, laringes artificiales, implantes otológicos), dispositivos anastomóticos, puertos de catéteres vasculares, stents vasculares, grapas, dispositivos embólicos, tubos de drenaje de heridas, lentes oculares, implantes dentales, derivaciones de hidrocefalia, marcapasos y desfibriladores implantables, conectores sin aguja, prótesis de voz y similares.
Otra posible aplicacion de las composiciones de la presente invención es el recubrimiento de superficies que se encuentran en un entorno médico o dental. Dichas superficies incluyen los aspectos internos y externos de varios instrumentos y dispositivos, ya sean desechables o destinados para usos repetidos. Tales superficies incluyen todo el espectro de artículos adaptados para uso médico, que incluyen sin limitación, escalpelos, agujas, tijeras y otros dispositivos utilizados en procedimientos quirúrjicos invasivos, terapéuticos o de diagnóstico; filtros de sangre. Otros ejemplos serán fácilmente evidentes para los facultativos de estas técnicas.
Las superficies que se encuentran en el entorno médico incluyen también aspectos internos y externos de piezas de equipos médicos, equipos médicos utilizados y transportados por el personal en el entorno de atención médica.
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Dichas superficies pueden incluir superficies destinadas como barreras biológicas para organismos infecciosos en entornos médicos, como guantes, delantales y protectores faciales. Los materiales comúnmente utilizados para las barreras biológicas son materiales termoplásticos o poliméricos tales como polietileno, dacrón, nailon, poliésteres, politetrafluoroetileno, poliuretano, látex, silicona y vinilo. Otras superficies pueden incluir encimeras y accesorios en áreas utilizadas para procedimientos médicos o para la preparación de aparatos médicos, tubos y recipientes utilizados en tratamientos respiratorios, incluyendo la administración de oxígeno, de fármacos solubilizados en nebulizadores y de los agentes anestésicos. Otras superficies de este tipo pueden incluir asas y cables para equipos médicos o dentales no destinados a ser estériles. Además, dichas superficies pueden incluir aquellas superficies externas no estériles de tubos y otros aparatos que se encuentran en áreas donde se encuentran comúnmente la sangre y los fluidos corporales u otros biomateriales peligrosos.
Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar sobre la superficie de o dentro de estos dispositivos médicos para proporcionar protección a largo plazo contra la colonización de microorganismos y reducir las incidencias de infecciones relacionadas con los dispositivos. Estas composiciones también se pueden incorporar en combinación con un agente antimicrobiano (por ejemplo, un agente antibiótico) en recubrimientos para dispositivos médicos. Dicha combinación matará o inhibirá suficientemente las bacterias colonizadoras iniciales y evitará las infecciones relacionadas con los dispositivos siempre que la sustancia se presente en una concentración inhibidora en la interfaz dispositivo-microbio.
Las composiciones de la presente invención se pueden incorporar directamente en una matriz polimérica del dispositivo médico en la etapa de la síntesis del polímero o en la etapa de fabricación del dispositivo. Las composiciones también pueden unirse covalentemente al polímero del dispositivo médico. Estos y otros muchos métodos de recubrimiento de los dispositivos médicos son evidentes para los expertos en la técnica.
Superficies adicionales que se pueden tratar de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen aspectos internos y externos de aquellos artículos implicados en la purificación del agua, almacenamiento del agua y suministro de agua, y aquellos artículos implicados en el procesamiento de alimentos. Por lo tanto, la presente invención prevé recubrir una superficie sólida de un recipiente para alimentos o bebidas para extender la vida útil de sus contenidos.
Las superficies relacionadas con la salud pueden incluir también los aspectos internos y externos de los artículos domésticos que participan en la provisión de nutrición, saneamiento o prevención de enfermedades. Por lo tanto, las composiciones de la presente invención se pueden utilizar para eliminar los microorganismos que causan enfermedades de las superficies externas. Estos pueden incluir, por ejemplo, equipos de procesamiento de alimentos para uso doméstico, materiales para el cuidado infantil, tampones, jabón, detergentes, productos para la salud y el cuidado de la piel, productos de limpieza para el hogar y tazas de inodoros.
La superficie puede ser también artículos de laboratorio que incluyen, pero no se limitan a, portaobjetos microscópicos, una campana de cultivo, una placa Petri o cualquier otro tipo adecuado de recipiente o contenedor de cultivo tisular conocido en la técnica.
Los inventores de esta solicitud también prevén el uso de las composiciones de la presente invención como agentes antiincrustantes.
Como se utiliza aquí el término “agentes antiincrustantes” se refiere a compuestos utilizados para proteger las superficies subacuáticas de la unión de organismos unicelulares. Estos organismos unicelulares incluyen microorganismos tales como bacterias y hongos.
Estas superficies subacuáticas incluyen cualquier superficie sumergida, incluyendo los cascos de barcos/embarcaciones (es decir, el cuerpo o armazón de un buque o barco), vehículos de inmersión, dispositivos de navegación, pantallas, redes, construcciones, plataformas flotantes o plataformas marinas emplazadas (por ejemplo, muelles), boyas, equipos de señalización y artículos que entran en contacto con agua de mar o agua salada. Otras superficies subacuáticas incluyen estructuras expuestas al agua de mar, incluyendo pilotes, marcadores marinos, medios de transporte submarino como cables y tuberías, redes de pesca, mamparas, torres de refrigeración, y cualquier dispositivo o estructura que funcione sumergida.
Las composiciones de la presente invención se pueden incorporar en recubrimientos marinos para limitar el incrustamiento marino indeseable. Por lo tanto, los agentes antiincrustantes de la presente invención se pueden formular de manera que no contengan materiales tóxicos (tales como metales pesados), y retengan aún su eficacia. La pintura antiincrustante de la presente invención puede contener además aglutinante(s), pigmento(s), disolvente(s) y aditivo(s).
Ejemplos de disolventes que se pueden utilizar incluyen hidrocarburos aromáticos tales como xileno y tolueno; hidrocarburos alifáticos tales como hexano y heptano, ésteres tales como acetato de etilo y acetato de butilo; amidas tales como N-metil pirrolidona y N,N-dimetilformamida; alcoholes tales como alcohol isopropílico y alcohol butílico; éteres tales como dioxano, THF y dietil éter; y cetonas tales como metil etil cetona, metil isobutil cetona y metil isoamil cetona. Los disolventes se pueden utilizar solos o una combinación de los mismos.
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Ejemplos de aglutinantes que se pueden utilizar incluyen resinas alquílicas, emulsiones acrílicas o vinílicas, resinas de poliuretano, resinas epoxi, resinas basadas en silicona, resinas acrílicas, resinas basadas en silicatos inorgánicos, resinas vinílicas, particularmente un copolímero de cloruro de vinilo/acetato de vinilo, y colofonía.
Ejemplos de pigmentos que se pueden utilizar incluyen dióxido de titanio, óxido cuproso, óxido de hierro, talco, escamas de aluminio, escamas de mica, óxido férrico, tiocianato cuproso, óxido de zinc, acetato cúprico meta- arseniato, cromato de zinc, dimetil ditiocarbamato de zinc, etilen bis(ditiocarbamato) de zinc y dietil ditiocarbamato de zinc.
Ejemplos de aditivos que se pueden incorporar en la composición de recubrimiento incluyen deshumidificadores, agentes humectantes/dispersantes, agentes antisedimentación, agentes antiadesollamiento, agentes de secado/curado, agentes antiadherentes y aditivos habitualmente empleados en composiciones de recubrimiento como agentes estabilizantes y antiespumantes. Además, cualquier antibiótico que sea relativamente insoluble en agua de mar se puede utilizar con una pintura marina antiincrustante.
Los métodos de preparación de pinturas antiincrustamiento marinas se explican en detalle en los documentos de Patente U.S: Pat. No. 4,678,512; U.S. Pat. No. 4,286,988; U.S. Pat. No. 4,675,051; U.S. Pat. No. 4,865,909; y U.S. Pat. No. 5,143,545.
Las composiciones de la presente invención se pueden utilizar también para proporcionar propiedades antibacterianas en cosméticos, para evitar la descomposición del producto.
Las composiciones pueden utilizarse además para proporcionar un efecto antibacteriano a la boca, dientes y encías, por ejemplo, mediante la incorporación en una pasta de dientes, enjuague bucal o goma de mascar. Tomándolas en conjunto, las presentes enseñanzas describen una amplia gama de nuevos agentes antiadherentes aslados de organismos tales como organismos acuáticos y musgo. El amplio espectro de los efectos antiadhesivos de estos agentes (por ejemplo, inhibiendo la adhesión de bacterias gram positivas y gram negativas) junto con su capacidad para efectuar las etapas iniciales y vulnerables de la formación de biopelículas microbianas, hace que estos agentes sean candidatos principales como agentes antipelículas. Además, los agentes antiadhesivos descritos aquí son modificaciones que permiten la clonación y producción masiva de los mismos, Además, su estabilidad (es decir, su resistencia a las condiciones ambientales) hace que estos agentes sean adecuados para una amplia gama de aplicaciones.
Objetos adicionales, ventajas y nuevas características de la presente invención serán evidentes para un experto habitual en la técnica tras el examen de los siguientes ejemplos, que no están destinados a ser limitantes. Además, cada una de las diversas realizaciones y aspectos de la presente invención tal y como se delinearon anteriormente y como se reivindica a continuación en la sección de reivindicaciones encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.
Generalmente, la nomenclatura utilizada aquí y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas de DNA molecular, bioquímico, microbiológico y recombinante. Dichas técnicas se explican minuciosamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook y colaboradores, (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel y colaboradores, “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson y colaboradores, “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren y colaboradores, (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y colaboradores (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles están extensamente descritos en documentos de Patente y bibliografía científica, véase, por ejemplo, los documentos de Patente U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., and Higgins S. J., eds (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., y Higgins S. J. Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” iRl Press, (1986); “A Practial Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) y “Methods in Enzimology” Vol. 1-317, Academic Press; “PcR Protocols: A Guide To Methods and Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaboradores, “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996). Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos en éste son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para comodidad del lector.
Ejemplos
Ahora se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con la descripción anterior, ilustran la invención de una manera no limitante.
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Ejemplo 1: análisis MS/MS de una fracción activa extraída de la anémona Aiptesia
El extracto crudo de la Aiptasia pulchella (organismo completo) se separó en una columna Sephadex G-10 dando como resultado 2 fracciones, mostrando ambas, actividad de formación de anti-adherencia/biopelícula (Figura 13).
La recromatografía de la fracción de alto peso molecular de la Sephadex G-10 en Sephadex G-75 dio como resultado dos picos principales que representan las fracciones de alto y bajo peso molecular (Figura 14).
La separación mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) con una columna c-18, de la fracción molecular baja de la columna G-75, en gradientes lineales de acetonitrilo (3-80% de 5 a 75 minutos) en TFA al 0,1% a una velocidad de flujo de 2 ml/min, dio como resultado varias fracciones activas como compuestos antiadhesivos en Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Las fracciones se recogieron cada 2 minutos (Figura 15).
Todas las fracciones activas se digirieron con tripsina, se analizaron mediante LC-MS/MS en un Qtof Premier (Waters) y en un LTQ-Orbitrap (Thermo) y se identificaron mediante el software Pep-Miner y Sequest frente a la parte de Eucariotas de la base de datos nr. Se encontró que la función activa eluida a un 72,3% de acetonitrilo (marcada en la flecha roja) era similar a la Equinatoxina 5 de Actinia equine.
Ejemplo 2: identificación de una región conservada de la citotoxina de anémona
Se preparó una platilla de DNA purificado a partir de 25 mg de Aiptasia pulchella y Anemonia viridans utilizando el equipo de reactivos de purificación de DNA genómico Wizard (Promega, USDA), de acuerdo con el protocolo del fabricante para el aislamiento del DNA genómico del tejido animal. La PCR se llevó a cabo en 500 ng de la plantilla de DNA purificado de Aiptasia pulchella y Anemonia viridans utilizando el Master Mix Reddy Mix PCR (ABgene, UK), con el siguiente protocolo: 95°C-5 min (95°C 30 s, 52°C 30 s y 72°C 1 min) X35, 72°C durante 10 min.
Los cebadores Eqt-F (GTR TCG ACA ACG AGT CRG G) y Eqt-R252 (TGA CAT YCC ACC AGT TGC TG) se añadieron a la mezcla de reacción, a una concentración final de 0,5 pM cada uno.
Las reacciones de PCR positivas que dieron un amplicón de DNA con tamaño de -250 pares de bases se enviaron para la secuenciación del DNA.
Un amplicón de PCR de aiptasia pulchella dio la siguiente secuencia de 265 pares de bases:
GTGT CGCCAACGAGTCGGG ATGC ACTTGGG AAAAGCCA AATACATACTT CTTCT CT G GTA C T GÁGGTATA AAGTG CCTCC CTCTÁAAGCTTüAGAATAAXAATyGUÁ CTTTTGTA CGGCCCACGTAAGACAACAGGGCCTGTTGCCACGGGAGCTGTTGGAGTGCTCACTT ACAAAATGTTGTGCACCAATGAGACGAACACTCTGGCTGTTCTTTTCAGTGTACCCT TCGACTACAACTTGTACAGCAACTGGTGGAAATGTCAA
La comparación de BLASTx de la secuencia de aminoácidos predicha codificada por la secuencia de polinucleótidos anterior con las secuencias de proteínas conocidas en el banco de genes proporcionó los siguientes resultados: Semejanzas = 54/88 (61%); Positivos = 62/88 (70%). A otras citotoxinas de anémonas similares: toxina hemolítica [Actineria villosa], PsTX-20A [Phyllodiscus semoni], precursor de citolisina I [Sagartia rosea] y precursor de equinatoxina IV [Actinia equina]; (números de acceso: BAD74019.1, BAC45007.1, AAP04347.1 y AF057028_1).
La secuencia peptídica relevante [FSVPFDYNLYSNWW] aparece en la secuencia de Aiptasial.
El amplicón de PCR de Anemonia viridans dio la siguiente secuencia de 254 pares de bases:
TGTGTCGACAACGAGTCgGGCaagacgtGgaCCGCAntgaaCACATACTTCCGTTCTGGcAC CTCTGAT nTCrTCCTTCCCC AT ACAGTTCC AC AT GGT AAGGC ACTGCT CT AC AACGGT CAGAAAGATCGTGGTCCAGTTGCGACTGGCGtgGTTGGAGTACTTGCTTATGcCATGA GCgATGGAAACACCCtGGCCGTTTTgTTCAGCrTTCCCTaTGACTATAACCtGTACAGCA ACTGGTGGAATGTCAA
La comparación de BLASTn con las secuencias de nucleótidos conocidas en el banco de genes dio semejanzas del 97%, 96% y 95% con Equinatoxinas 5 [número de acceso: AEU519001. 4 [número de acceso: AF057028] y 2 [número de acceso: AEU41661], en la correspondencia.
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La secuencia de aminoácidos predicha basada en la traducción del segundo ORF positivo dio la siguiente secuencia de aminoácidos:
CRQRVGMHLGKAKYILLLWY*GIKCLPLKLENKKALLYGPRKTTGPVATGAVGVLTYK
MLCTNETNTLAVLFSVPFDYNLYSNWWKCQ
Ejemplo 3: Comparación de la actividad de los péptidos sintéticos
Los péptidos listados a continuación se sintetizaron utilizando métodos en fase sólida y la purificación a escala del 90% se llevó a cabo mediante Peptron Inc. (Taejeon, Korea).
Los péptidos se disolvieron utilizando 20 pl de dimetil sulfóxido (DMSO) y se diluyeron al doble en agua destilada a una concentración de 5 mg/ml. Diluciones adicionales se llevaron a cabo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
Las actividades de los siguientes péptidos sintéticos se estudiaron en un aislado clínico de Acinetobacter Baumannii y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 a concentraciones peptídicas que oscilan de 500 a 0,5 pg/ml. Los péptidos diluidos a las concentraciones apropiadas se incubaron con las bacterias durante 24-48 horas.
Para los bioensayos de adherencia bacteriana, las biopelículas se cultivaron en placas de poliestireno de fondo redondo de 96 pocillos. Brevemente, 180 pl de cultivos de una noche se añadieron a los pocillos suplementados con 20 pl del péptido apropiado diluido en pBs. Después de 24 horas de incubación a 37°C, cada pocillo se lavó con agua y se tiñó con 250 pl de una solución de cristal violeta. El colorante se eliminó después mediante lavado a fondo con agua. Para la cuantificación de las células unidas, el cristal violeta se solubilizó en 250 pl de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 1% y se midió la absorbancia a 595 nm.
CMFSVPFDYNWYSNWWC
Ac-MFSVPFDYNWYSNWW-NH2
CFSVPFDYNWYSNWWC
FDYNWY
CFDYNWYC
AbacZ-17C AbacZ-15 AbacZ-16C AbacZ-6 AbacZ-8C
Los resultados se muestran en las Figuras 1 a 12. Como se ve en las Figuras 1, 3, 5 y 7, los péptidos no mataron ni inhibieron el crecimiento de las bacterias. Las Figuras 2, 4, 6, 8 y 10 a 12, demuestran que los péptidos prevén la formación de biopelículas.
Ejemplo 4: identificación de péptidos preferidos
Con el fin de identificar los péptidos cíclicos más activos de acuerdo con la presente invención, se utiliza un sintetizador manual Parallel Peptide con purificador de péptidos para producir péptidos que difieren entre sí en la estrategia de longitud y ciclación. Cada péptido se prueba para su actividad anti-adhesiva en ensayos en microplacas y celdas de flujo, y se lleva a cabo la selección de los péptidos altamente activos. La modelación computarizada de varias versiones de péptidos se utiliza para optimizar la selección de los compuestos activos.
Para un cribado más sensible, el bioensayo se amplía utilizando el ensayo de viabilidad de células microbianas Bac Titer-Glo de Promega, USA. Este método utiliza una técnica de espectrometría más sensible basada en luminiscencia.
Se utilizan diversas estrategias de ciclación para obtener un péptido cíclico optimizado a partir de un análogo lineal con bioactividad satisfactoria. La Figura 16A muestra la estructura generalizada de un conductor cíclico con un brazo emulsionante. El análogo lineal es un péptido de 14 mer con un núcleo hidrofóbico (6aa) que se define como un farmacóforo. Los conductores cíclicos se preparan, conservando este farmacóforo y se añade después un brazo emulsionante (resto hidrofóbico) tal como polietileno, polipropileno, Teflón, etc. para proporcionar capacidades absorbentes a una superficie polimérica hidrofóbica (Figura 16B).
Las metodologías de mapeo epitópico, escaneo y Cycloscan se utilizan para revelar péptidos más cortos, más rentables, que poseen la actividad biológica deseada.
El conductor cíclico se prepara utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida del 9H-fluoren-9-ilmetoxicarbonilo (Fmoc SPPS).
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De acuerdo con un procedimiento representativo, como se muestra en la Figura 17, el primer aminoácido protegido se condensa con resina de clorotitrilo (Cl-Trt) utilizando N,N-diisopropiletilamina (DIEA) en diclorometano (DCM) o con amida de Rink utilizando O-benzotriazol-N,NN',N'-tetrametil-uronio-hexafluoro fosfato (HBTU) como agente de acoplamiento.
Los siguientes acoplamientos se realizan utilizando un protocolo de Fmoc estándar con 2-(1H-7-Azabenzotriazol-1- il)-1,1,3,3-tetrametil uranio hexafluorofosfato Metanaminio (HATU) o benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBoP), DIEA en N-metil-2-pirrolidona (NMP). Los grupos alcoxicarbonilos (alloc) se desprotegen mediante Pd-trifenilfosfina (Tetrakis) utilizando una mezcla de hidróxido de acetilo/N-metil maleimida/cloruro de dieteno (AcOH/NMM/DCE).
La etapa de ciclación se lleva a cabo como una reacción de acoplamiento estándar (en el caso de la formación de un enlace amida) o por burbujeo de oxígeno (en el caso de la formación de un puente disulfuro). También se pueden realizar otros tipos de ciclaciones como se conoce en la técnica.
Los péptidos se liberan de la resina por tratamiento con ácido trifluoroacético:diclorometano:tri-iso-propilsilano (TFA:DCM:TIS), 1:98:1 en presencia de 1,2-etanoditiol durante 30 minutos en el caso de la resina Cl-Trt, y en la presencia de TFA al 95%, TIS y H2O en el caso de la amida de Rink.
El producto crudo en la solución (AcOH/H2O 1:1) se purifica mediante HPLC preparativo o MPLC para conducir al péptido cíclico puro. La pureza se determina por HPLC analítico. Las estructuras se confirman por LC-MS y análisis de AA.
La siguiente etapa implica la unión del brazo hidrofóbico para introducir propiedades absorbentes al conductor peptídico cíclico. Este brazo se une utilizando el protocolo SPPS estándar.
La Figura 17 muestra un diagrama de flujo que describe el proceso para el desarrollo de un conductor peptídico cíclico con un brazo emulsionante.
Ejemplo 4: tratamiento de agua o un medio fluido
Los péptidos y/o composiciones y/o organismos anteriores pueden opcional y preferiblemente usarse para tratar agua y/o un medio fluido, o un sistema o aparato que los contenga, incluyendo pero no limitado a un filtro de ósmosis inversa y/o aparato o sistema de filtración.
El efecto de los extractos de Actiniaria en la formación de biopelículas utilizando cupones de poliamida en una celda de flujo sin filtración se prueba de la siguiente manera. El efecto del crecimiento de la biopelícula se analiza en una celda de flujo dedicada para microscopía confocal sobre una superficie de poliamida similar como una capa activa de RO (ósmosis inversa). Una celda de flujo de doble canal (FC 270, Biosurface Technologies, Montana, USA) se opera tanto con cepas modelo como inóculo microbiano real tomado de un cupón de la membrana de ósmosis inversa (RO) ubicado en lugares seleccionados en el mar Mediterraneo suplementado con diferentes concentraciones (desde nanogramos a microgramos por ml) de los extractos. El régimen de flujo en las celdas de flujo es laminar y similar a las condiciones típicas de flujo operacional de RO. Para las cepas modelo, se determinan los medios sintéticos de agua de mar (véase (Fritzmann y colaboradores, 2007: Fritzmann, C., Lowenberg, J., Wintgens, T., and Melin, T. (2007) State-of-the-art of reverse osmosis desalination. Desalination 216: 1-76) e informes IDE
http://www.ide-tech.tech.com/) y se utilizan para experimentos de crecimiento de biopelículas de unión celular. Para el consorcio microbiano que se aisló de la planta de desalinización en Palmachim, el agua de mar real se utiliza como medio para la unión microbiana y los experimentos de crecimiento de la biopelícula. Las cepas modelo que se utilizarán son Vibro fisheri y Caulobacter crescentus. En la celda de flujo de doble canal, un canal se suplementa con un extracto y el otro sirve como un control son solo el disolvente que se añade al medio (por ejemplo, cuando el extracto se disuelve en etanol).
Las biopelículas de la celda de flujo se analizan microscópicamente a diferentes puntos de tiempo (hasta 14 días del experimento) cuando las células viables, las células muertas y las sustancias poliméricas extra-celulares (EPS) se tiñen con sondas fluorescentes (diferentes lectinas marcadas fluorescentes se utilizan para sondear diferentes constituyentes de polisacáridos en las EPS) y se visualizan con microscopía confocal de escaneo laser (LSCM). El análisis microscópico se lleva a cabo utilizando softwares de análisis de procesamiento de imagen tal como Imaris bitplane y COMSTAT (Heydorn y colaboradores, 2002: Ersboll, B., Kato, J., Hentzer, M., Parsek, M.R., Tolker- Nielsen, T. y colaboradores (2002) Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expresión. Applied and Environmental Microbiology 68: 2008-2017).
El calcio, que tiene un efecto significativo sobre la adhesividad y la compacidad de la biopelícula, también se monitoriza y visualiza con LSCM utilizando fluorocromos específicos de calcio tales como Fura-2 (Grynkiewicz y colaboradores, 1985: Grynkiewicz, G., Poenie, M., y Tsien, R.Y. (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry 260: 3440-3450; Neu y colaboradores, 2002: Neu, T.R., Kuhlicke, U., y Lawrence, J.R. (2002) Assessment of Fluorochromes for Two-Photon Laser Scanning Microscopy of Biofilms. Applied and Environmental Microbiology 68: 901-909).
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Las propiedades antiincrustantes se examinan también analizando la adherencia de diferentes tipos de EPC/bacterias con cristales modificados en las superficies QCM-D unidos covalentemente a diferentes péptidos.
QCM-D emplea un sensor de masas ultra sensible (cristal de cuarzo recubierto de sílice) ubicado dentro de una celda de flujo con unas características geométricas e hidrodinámicas bien definidas, un diseño que permite la monitorización en tiempo real de la adsorción en masa sin requerir marcaje. El cristal de cuarzo piezoeléctrico oscila lateralmente con una amplitud de 1-2 nm cuando se aplica un voltaje a los electrodos fijados al cristal de cuarzo. Como la deposición (adsorción) ocurre en la superficie del cristal, conduce a un desplazamiento en la frecuencia vibratoria del cristal. Además de monitorizar el desplazamiento de frecuencia para determinar la masa adsorbida, el espesor y la conformación estructural de la capa adsorbida se pueden extraer mediante la monitorización simultánea de la energía de disipación, que es la suma de todas las pérdidas de energía dentro del sistema por ciclo de oscilación. Curiosamente, además de medir la adsorción y la adherencia de los diferentes tipos de EPS (es decir, cambios en los contenidos de polisacáridos/proteínas) bajo diferentes condiciones ambientales (es decir, cambios en las concentraciones de catión divalente), el QCM-D puede también revelar las propiedades visco-elásticas, cambios conformacionales y el espesor de la nano capa precipitada.
Ejemplo 5: Efecto de los péptidos activos en la bioincrustación de ósmosis inversa bajo condiciones de desalinización.
Se determina el efecto de los extractos de Actiniaria en la bioincrustación de ósmosis inversa bajo condiciones de desalinización.
Dos unidades de escala de laboratorio de RO (ósmosis inversa) se utilizaron para la desalinización del agua de mar, y se llevaron a cabo los experimentos de bioincrustación tanto con cepas modelo candidatas como con consorcio microbiano aislado de la planta de desalinización GES (como se mencionó anteriormente) en un medio de agua de mar sintético y agua de mar real. Las membranas de lámina plana comercializadas SW-30 de Dow-Filmtec se utilizaron para estos experimentos de bioincrustación. Se obtienen medidas específicas de las condiciones del proceso: flujo permeado, carbono orgánico total (TOC), concentraciones de oxígeno en el permeado y en la solución de cloruro de sodio saturada, tasa de absorción de oxígeno, y el rechazo de diferentes iones y cationes por la membrana. Se analizan los diferentes componentes de la biopelícula: el análisis químico de la capa de bioincrustación incluirá la caracterización de proteínas, carbohidratos, lípidos, y DNA. La observación microscópica y el análisis se realizan como se mencionó anteriormente.
La descripción comprende los siguientes ítems:
1. Un péptido seleccionado del grupo que consiste en YDYNWY, YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY.
2. Un método para prevenir la adherencia de un organismo unicelular a una superficie seleccionada del grupo que consiste en una tela, una fibra, una espuma, una película, un hormigón, una mampostería, un vidrio, un metal y un plástico, comprendiendo el método poner en contacto el organismo unicelular con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNWY, YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde la composición prevé o reduce la adhesión de un organismo unicelular a la superficie.
3. El método del ítem 2, en donde la secuencia YDYNWY se comprende en una proteína de secuencia LFSVPYDYNWYSNWW o LFSVPYDYNLYSNWW.
4. El método del ítem 2, en donde la secuencia YDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPYDYNLYSNWV.
5. El método del ítem 2, en donde la secuencia FDYNFY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNFYSNWW o LFSVPFDYNFYSNWW.
6. El método del ítem 2, en donde la secuencia de FDYNLY se comprende en una proteína de secuencia seleccionada del grupo que consiste en LFSVPFDYNLYSNWW, LFSIPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYTNWW, MWSVPFDYNLYSNWW y MFSVPFDYNLYKNWL.
7. El método del ítem 2, en donde la secuencia WDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNLYKNWL o MFSVPFDYNLYKNWF.
8. El método del ítem 2, en donde la secuencia FDYNWY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNWYSNWW.
9. El método del ítem 2, en donde la secuencia YDWNLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWNLYQSWA o MASIPYDWNLYSAWA.
10. El método del ítem 2, en donde la secuencia YDWHLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWHLYNAWA.
5
10
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25
30
35
40
45
11. El método del ítem 2, en donde el péptido se aísla de un organismo acuático.
12. El método del ítem 11, en donde el organismo acuático se selecciona del grupo que consiste en un pez y un
organismo sésil.
13. El método del ítem 12, en donde el organismo sésil es una anémona seleccionada del grupo que consiste en Aiptesia pulchella y Anemonia viridans.
14. El método del ítem 2, en donde el péptido se aísla de un musgo.
15. El método del ítem 14, en donde el musgo se selecciona del grupo que consiste en Physcomitrella patens,
Funaria hygrometrica; Eukariota; Viridiplantae; Streptophyta; Embtyophyta; Bryophita; Moss Superclass V; Bryopsida; Funariidae; Funariales; Funariaceae; y Physcomitrella.
16. El método del ítem 2, en donde la composición es resistente a la liofilización.
17. El método del ítem 2, en donde la composición inhibe la agregación de células.
18. El método del ítem 2, en donde el organismo unicelular se comprende en una biopelícula.
19. El método del ítem 2, en donde el organismo unicelular se selecciona del grupo que consiste en una bacteria,
un hongo, un protozoo y una arquea.
20. El método del ítem 19, en donde el hongo comprende una levadura.
21. El método del ítem 2, en donde la composición está en una forma seleccionada del grupo que consiste en un aerosol, un gel y una pintura.
22. Un dispositivo médico que comprende una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNWY, YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde la composición está cubierta en una superficie del dispositivo o se incorpora en una matriz polimérica del dispositivo médico y el dispositivo médico es un dispositivo intracorpóreo o un dispositivo extracorpóreo.
23. El dispositivo médico del ítem 22, en donde el dispositivo es un dispositivo médico implantable o un instrumento médico.
24. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia YDYNWY se comprende en una proteína de secuencia LFSVPYDYNWYSNWW o LFSVPYDYNLYSNWW.
25. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia YDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPYDYNLYSNWV.
26. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia FDYNFY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNFYSNWW o LFSVPFDYNFYSNWW.
27. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia FDYNLY se comprende en una proteína de secuencia seleccionada del grupo que consiste en LFSVPFDYNLYSNwW, LFSIPFDyNlYSNWW, MFSVPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYTNWW, MWSVPFDYNLYSNWW y MFSVPFDYNLYKNWL.
28. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia WDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNLYKNWL o MFSVPFDYNLYKNWF.
29. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia FDYNWY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNWYSNWW.
30. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia YDWNLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWNLYQSWA o MASIPYDWNLYSAWA.
31. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la secuencia YDWHLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWHLYNAWA.
32. El dispositivo médico del ítem 22, en donde el péptido se aísla de un organismo acuático.
33. El dispositivo médico del ítem 22, en donde el organismo acuático se selecciona del grupo que consiste en un pez y un organismo sésil.
34. El dispositivo médico del ítem 33, en donde el organismo sésil es una anémona seleccionada del grupo que consiste en Aiptesia pulchella y Anemonia viridans.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
35. El dispositivo médico del ítem 22, en donde el péptido se selecciona de un musgo.
36. El dispositivo médico del ítem 35, en donde el musgo se selecciona del grupo que consiste en Physcomitrella
patens, Funaria hygrometrica; Eukariota; Viridiplantae; Streptophyta; Embtyophyta; Bryophita; Moss Superclass V; Bryopsida; Funariidae; Funariales; Funariaceae; y Physcomitrella.
37. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la composición es resistente a la liofilización.
38. El dispositivo médico del ítem 22, en donde la composición inhibe la agregación de células.
39. Un método de tratamiento del agua para prevenir o reducir la formación de biopelículas o ensuciamiento de un filtro, que comprende tratar el agua con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNWY, YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY.
40. El método del ítem 39, en donde la secuencia YDYNWY se comprende en una proteína de secuencia LFSVPYDYNWYSNWW o LFSVPYDYNLYSNWW.
41. El método del ítem 39, en donde la secuencia YDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPYDYNLYSNWV.
42. El método del ítem 39, en donde la secuencia FDYNFY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNFYSNWW o LFSVPFDYNFYSNWW.
43. El método del ítem 39, en donde la secuencia FDYNLY se comprende en una proteína de secuencia seleccionada del grupo que consiste en LFSVPFDYNLYSNWW, LFSIPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYTNWW, MWSVPFDYNLYSNWW y MFSVPFDYNLYKNWL.
44. El método del ítem 39, en donde la secuencia WDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNLYKNWL o MFSVPFDYNLYKNWF.
45. El método del ítem 39, en donde la secuencia FDYNWY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNWYSNWW.
46. El método del ítem 39, en donde la secuencia YDWNLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWNLYQSWA o MASIPYDWNLYSAWA.
47. El método del ítem 39, en donde la secuencia YDWHLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWHLYNAWA.
48. El método del ítem 39, en donde el péptido se aísla de un organismo acuático.
49. El método del ítem 48, en donde el organismo acuático se selecciona del grupo que consiste en un pez o un organismo sésil.
50. El método del ítem 49, en donde el organismo sésil es una anémona seleccionada del grupo que consiste en Aiptesia pulchella y Anemonia viridans.
51. El método del ítem 39, en donde el péptido se aísla de un musgo.
52. El método del ítem 51, en donde el musgo se selecciona del grupo que consiste en Physcomitrella patens, Funaria hygrometrica; Eukariota; Viridiplantae; Streptophyta; Embtyophyta; Bryophita; Moss Superclass V; Bryopsida; Funariidae; Funariales; Funariaceae; y Physcomitrella.
53. El método del ítem 39, en donde la composición es resistente a la liofilización.
54. El método del ítem 39, en donde la composición inhibe la agregación de células.
55. El método del ítem 39, en donde el agua tratada se aplica a un filtro de ósmosis inversa.
56. El método del ítem 39, en donde la biopelícula se forma por un organismo unicelular seleccionado del grupo
que consiste en una bacteria, un hongo, un protozoo y una arquea.
57. El método del ítem 56, en donde los hongos comprenden una levadura.
58. Un método para prevenir o reducir la formación de biopelículas en un fluido externo que no se origina en un cuerpo animal, que comprende tratar el fluido con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido aislado que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNWY, YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY.
5
10
15
20
25
30
59. El método del ítem 58, en donde la secuencia YDYNWY se comprende en una proteína de secuencia LFSVPYDYNWYSNWW o LFSVPYDYNLYSNWW.
60. El método del ítem 58, en donde la secuencia YDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPYDYNLYSNWV.
61. El método del ítem 58, en donde la secuencia FDYNFY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNFYSNWW o LFSVPFDYNFYSNWW.
62. El método del ítem 58, en donde la secuencia FDYNLY se comprende en una proteína de secuencia seleccionada del grupo que consiste en LFSVPFDYNLYSNWW, LFSIPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYTNWW, MWSVPFDYNLYSNWW y MFSVPFDYNLYKNWL.
63. El método del ítem 58, en donde la secuencia WDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNLYKNWL o MFSVPFDYNLYKNWF.
64. El método del ítem 58, en donde la secuencia FDYNWY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNWYSNWW.
65. El método del ítem 58, en donde la secuencia YDWNLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWNLYQSWA o MASIPYDWNLYSAWA.
66. El método del ítem 58, en donde la secuencia YDWHLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWHLYNAWA.
67. El método del ítem 58, en donde el péptido se aísla de un organismo acuático.
68. El método del ítem 67, en donde el organismo acuático se selecciona del grupo que consiste en un pez y un organismo sésil.
69. El método del ítem 68, en donde el organismo sésil es una anémona seleccionada del grupo que consiste en Aiptesia pulchella y Anemonia viridans.
70. El método del ítem 58, en donde el péptido se aísla de un musgo.
71. El método del ítem 70, en donde el musgo se selecciona del grupo que consiste en Physcomitrella patens, Funaria hygrometrica; Eukariota; Viridiplantae; Streptophyta; Embtyophyta; Bryophita; Moss Superclass V; Bryopsida; Funariidae; Funariales; Funariaceae; y Physcomitrella.
72. El método del ítem 58, en donde la composición es resistente a la liofilización.
73. El método del ítem 58, en donde la composición inhibe la agregación de células.
74. El método del ítem 58, en donde el fluido se aplica a un filtro de ósmosis inversa.
75. El método del ítem 58, en donde la biopelícula se forma por un organismo unicelular seleccionado del grupo
que consiste en una bacteria, un hongo, un protozoo y una arquea.
76. El método del ítem 75, en donde el hongo comprende una levadura.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Listado de secuencias
<110> TEL HASHOMER MEDICAL RESEARCH INFRASTRUCTURE AND SERVICES LTD.
<120> Péptidos y composiciones para la prevención de la adhesión celular y métodos de uso de los mismos
<130> T1458 EP/1 S3
<140> EP 09 74 0951.0 <141 >
<150> 61/136.673 <151>
<160> 62
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo "
<400> 1
Tyr Asp Tyr Asn Trp Tyr 1 5
<210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo "
<400> 2
Tyr Asp Tyr Asn Leu Tyr 1 5
<210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo"
<400> 3
Phe Asp Tyr Asn Phe Tyr 1 5
<210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo"
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr 1 5
<210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota-'Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo" <400> 5
Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr 1 5
<210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo" <400> 6
Tyr Asp Trp Asn Leu Tyr 1 5
<210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo" <400> 7
Tyr Asp Trp His Leu Tyr 1 5
<210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo" <400> 8
Trp Asp Tyr Asn Leu Tyr 1 5
<210> 9 <211> 15
<212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221> source
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de organismo acuático o musgo" <400> 9
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Leu Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp
10
15
<210>
<211>
<212>
<213>
10
14
PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 10
Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10
<210>
<211>
<212>
<213>
11
15
PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 11
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Phe Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
12
15
PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 12
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
13
15
PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuendia peptídica"
<400> 13
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
14
15 PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica" <400> 14
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Met Trp Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
<220> <221 > <223>
15
15
PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 15
Met Phe Ser Val Pro Trp Asp Tyr Asn Leu Tyr Lys Asn Trp Phe 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
<220> <221 > <223>
16
15
PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 16
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Lys Asn Trp Leu 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
<220> <221 > <223>
17
16
PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 17
Met Phe Ser Val Pro Phe Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
<220> <221 > <223>
18
15
PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 18
Leu Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
<211>
<212>
<213>
19
15
PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica" <400> 19
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Met Ala Ser lie Pro Tyr Asp Trp Asn Leu Tyr Gln Ser Trp Ala 15 10 15
<210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 20
Met Ala Ser lie Pro Tyr Asp Trp Asn Leu Tyr Ser Ala Trp Ala 15 10 15
<210> 21 <211> 15
<212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 21

Met Ala Ser lie Pro Tyr Asp Trp His Leu Tyr Asn Ala Trp Ala 15 10 15
<210> 22

<211> 19
<212> DNA
<213> Aiptesia pulchella
<400> 22

gtrtcgacaa cgagtcrgg 19
<210> 23 <211> 20 <212> DNA
<213> Anemonia viridansm <400> 23
tgacatycca ccagttgctg 20
<210> 24 <211> 15
<212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de EqT-IV"
<400> 24
Leu Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
25
<211>
14
<212>
PRT
<213>
Desconocida
<220>
<221 >
fuente
5
10
15
20
25
30
35
40
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de Actinoporina Or-A"
<400> 25
Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10
<210> 26 <211> 15 <212> PRT
<213> Heteractis magnifica
<400> 26
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Phe Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210> 27 <211> 15
<212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de Avt-I RTX-A"
<400> 27
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210> 28 <211> 15
<212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia de Pstx20"
<400> 28

Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Thr Asn Trp Trp 15 10 15

<210> 29 <211> 15
<212> PRT
<213> Physcomitrella patens
<400> 29

Met Trp Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15

<210> 30 <211> 15
<212> PRT <213> Danio rerio
<400> 30

Met Phe Ser Val Pro Trp Asp Tyr Asn Leu Tyr Lys Asn Trp Phe 15 10 15

<210> 31 <211> 15
<212> PRT
<213> Tetraodon nigroviridis
<400> 31
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Lys Asn Trp Leu 15 10 15
<210> <211> 5 <212>
<213>
32
17
PRT
Desconocida
<220>
<221 > fuente
<223> /nota-'Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
10 <400> 32
Cys Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
Cys
15
<210>
33
<211>
213
<212>
PRT
<213>
Actinia equina
<400> 33
Met Ser Arg Leu lie lie Val Phe lie Val Val Thr Met lie 15 10
Ala Thr Ala Leu Pro Ser Lys Lys lie lie Asp Glu Asp Glu 20 25 30
Glu Lys Arg Ser Ala Asp Val Ala Gly Ala Val lie Asp Gly 35 40 45
Leu Ser Phe Asp lie Leu Lys Thr Val Leu Ala Leu Gly Asn 50 55 60
Arg Lys lie Ala Val Gly Val Asp Asn Glu Ser Gly Lys Thr 65 70 75
Ala Leu Asn Thr Tyr Phe Arg Ser Gly Thr Ser Asp lie Val 85 90
His Lys Val Pro His Gly Lys Ala Leu Leu Tyr Asn Gly Gln 100 105 110
Arg Gly Pro Val Ala Thr Gly Ala Val Gly Val Leu Ala Tyr 115 120 125
Ser Asp Gly Asn Thr Leu Ala Val Leu Phe Ser Val Pro Tyr 130 135 140
Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp Asn Val Arg lie Tyr Lys Gly 145 150 155
Arg Ala Asp Gln Arg Met Tyr Glu Glu Leu Tyr Tyr Asn Leu 165 170
Phe Arg Gly Asp Asn Gly Trp His Thr Arg Asn Leu Gly Tyr 180 185 190
Lys Ser Arg Gly Phe Met Asn Ser Ser Gly His Ala lie Leu 195 200 205
His Val Ser Lys Ala
210
Cys Ser 15
Glu Asp Ala Ser Val Lys
Trp Thr 80
Leu Pro 95
Lys Asp
Leu Met
Asp Tyr
Lys Arg 160
Ser Pro 175
Gly Leu Glu lie
<210>
34
<211 >
175
<212>
PRT
<213>
Stichodactyla helianthus
<400> 34
Ala Leu Ala Gly Thr lie lie Ala 1 5
Leu Asp Lys Val Leu Glu Glu Leu 20
Val Gly lie Asp Asn Glu Ser Gly 35 40
Tyr Phe Arg Ser Gly Thr Thr Asp 50 55
Asn Thr Lys Ala Leu Leu Tyr Ser 65 70
Ala Thr Gly Ala Val Ala Ala Phe 85
Thr Leu Gly Val Met Phe Ser Val 100
Asn Trp Trp Asp Val Lys lie Tyr 115 120
Gly Met Tyr Glu Asp Leu Tyr Tyr 130 135
Gly Trp His Glu Lys Asn Leu Gly 145 150
Met Thr Ser Ala Gly Glu Ala Lys 165
Gly Ala
Ser Leu Thr Phe Gln Val
10 15
Gly
Lys Val Ser Arg Lys lie Ala
25
30
Gly
Thr Trp Thr Ala Leu Asn Ala
45
Val lie Leu Pro Glu Phe Val Pro 60
Gly Arg Lys Asp Thr Gly Pro Val 75 80
Ala Tyr Tyr Met Ser Ser Gly Asn 90 95
Pro Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser 105 110
Ser Gly Lys Arg Arg Ala Asp Gln 125
Gly Asn Pro Tyr Arg Gly Asp Asn 140
Tyr Gly Leu Arg Met Lys Gly lie 155 160
Met Gln lie Lys lie Ser Arg 170 175
5
<210>
35
<211 >
176
<212>
PRT
<213>
Actinia equina
<400>
35
Asp Val 1
Leu Lys
Val Gly
Tyr Phe 50
Ala
Gly Ala Val lie Asp Gly Ala Ser Leu Ser
5 10
Thr
Val Leu Glu Ala Leu Gly Asn Val Lys Arg
20 25
Val
Asp Asn Glu Ser Gly Lys Thr Trp Thr Ala
35
40 45
Arg
Ser Gly Thr Ser Asp lie Val Leu Pro His
Phe Asp lie 15
Lys lie Ala 30
Leu Asn Thr
Lys Val Pro
55
60

His Gly Lys Ala Leu Leu Tyr Asn Gly Gln Lys Asp Arg Gly Pro Val 65 70 75 80
Ala Thr Gly Ala Val Gly Val Leu Ala Tyr Leu Met Ser Asp Gly Asn 85 90 95
Thr Leu Ala
Asn Trp Trp 115
Val 100
Leu Phe Ser Val Pro 105 Tyr Asp Tyr Asn Trp 110
Asn
Val Arg lie Tyr Lys Gly Lys Arg Arg Ala
Tyr Ser
Asp Gln
120
125

Arg Met Tyr Glu Glu Leu Tyr Tyr Asn Leu Ser Pro Phe Arg Gly Asp 130 135 140

Asn Gly Trp His Thr Arg Asn Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Gly 145 150 155 160

Phe Met Asn Ser Ser Gly His Ala lie Leu Glu lie His Val Ser Lys 165 170 175
<210> 36 <211> 114 <212> PRT <213> Danio rerio
<400> 36

Met Thr Glu Ser Ala Glu Ala Val Ala Ala Asn Val Ser Ser Arg Arg 15 10 15

His Ala Thr Val Glu lie Thr Asn Leu Thr Asn Asn Tyr Cys Phe Leu 20 25 30

Asn Pro Lys Val Tyr Leu Glu Asn Gly Glu Thr Ser Asn Pro Pro Gln 35 40 45

Pro Thr Val Arg Pro Leu Lys Thr Glu Val Cys Thr Phe Ser Lys Ser 50 55 60
5
imagen1
<210> 37 <211> 156 <212> PRT <213> Actinia equina
<400> 37
imagen2
<210> 38 <211> 166 <212> PRT <213> Danio rerio
5

Val Ala Ala Asn Val Ser Ser Arg Arg His Ala Thr Val Glu lie Thr 15 10 15

Asn Leu Thr Asn Asn Tyr Cys Phe Leu Asn Pro Lys Val Tyr Leu Glu 20 25 30

Asn Gly Glu Thr Ser Asn Pro Pro Gln Pro Thr Val Arg Pro Leu Lys 35 40 45

Thr Glu Val Cys Thr Phe Ser Lys Ser Ala Ala His Ala Thr Gly Ser 50 55 60

Val Gly Val Leu Thr Tyr Asp Leu Phe Glu Arg Arg Arg Asn Asp Tyr 65 70 75 80

Thr Glu Thr Leu Ala lie Met Phe Ser Val Pro Trp Asp Tyr Asn Leu 85 90 95

Tyr Lys Asn Trp Phe Ala Val Gly lie Tyr Pro Lys Gly Lys Glu Cys 100 105 110

Asp Gln Ala Leu Tyr Lys Glu Met Tyr Tyr Gln Lys Asn Gln His Gly 115 120 125

Phe Val Arg Glu Glu Ala Asn Gly Ser Gly lie Asn Phe Glu Gly Lys 130 135 140

Asn Leu Asp lie Arg Ala Thr Met Cys Pro Met Gly Arg Ala lie Val 145 150 155 160
Lys Val Glu Val Trp Asp 165
<210> 39 <211> 181 <212> PRT
5 <213> Tetraodon nigroviridis
<400> 39

Met Glu Ser Ala Glu Ala Val Ala Ala Asp Val Ser Arg Ser Arg Ser 15 10 15

Val Thr lie Glu lie Ser Asn Leu Thr Lys Asn Tyr Cys Leu lie Asn 20 25 30

Pro Arg Val Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Thr Tyr Asn Pro Pro Gln Pro 35 40 45

Thr Val Arg Pro Leu Met Thr Glu Val Cys Thr Phe Ser Lys Ser Ser 50 55 60

Gly lie Pro Thr Gly Ser Val Gly Val Leu Thr Tyr Glu Leu Leu Glu 65 70 75 80

Arg Arg Ser Thr Met Leu Pro Glu Thr Leu Ala lie Met Phe Ser Val 85 90 95

Pro Tyr Asp Tyr Ser Phe Tyr Asn Asn Trp Phe Ala Val Gly lie Tyr 100 105 110

Glu Thr Gly Thr Lys Cys Asn Glu Gly Leu Tyr Lys Gln Met Tyr Asn 115 120 125

Glu Lys Lys Gln Ala Glu His Gly Phe Val Arg Glu Lys Ala Asn Gly 130 135 140

Ser Gly lie Asn Tyr Val Gly Gly Asn Leu Asp lie Arg Ala Thr Met 145 150 155 160

Asn Pro Leu Gly Lys Ala lie Met Lys Val Glu Val Trp Asp Ala Phe 165 170 175
Phe Pro Phe Ser Glu 180
5
<210>
40
<211 >
157
<212>
PRT
<213>
Actinia equina
<400> 40
imagen3
85
90
95

Val Arg lie Tyr Lys Gly Lys Arg Arg Ala Asp Gln Arg Met Tyr Glu 100 105 110

Glu Leu Tyr Tyr Asn Leu Ser Pro Phe Arg Gly Asp Asn Gly Trp His 115 120 125

Thr Arg Asn Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Gly Phe Met Asn Ser 130 135 140

Ser Gly His Ala lie Leu Glu lie His Val Ser Lys Ala 145 150 155
<210> 41 <211> 169 <212> PRT
5 <213> Tetraodon nigroviridis
<400> 41

Val Ala Ala Asp Val Ser Arg Ser Arg Ser Val Thr lie Glu lie Ser 15 10 15

Asn Leu Thr Lys Asn Tyr Cys Leu lie Asn Pro Arg Val Tyr Leu Glu 20 25 30

Ser Gly Glu Thr Tyr Asn Pro Pro Gln Pro Thr Val Arg Pro Leu Met 35 40 45

Thr Glu Val Cys Thr Phe Ser Lys Ser Ser Gly lie Pro Thr Gly Ser 50 55 60

Val Gly Val Leu Thr Tyr Glu Leu Leu Glu Arg Arg Ser Thr Met Leu 65 70 75 80

Pro Glu Thr Leu Ala lie Met Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Ser Phe 85 90 95

Tyr Asn Asn Trp Phe Ala Val Gly lie Tyr Glu Thr Gly Thr Lys Cys 100 105 110

Asn Glu Gly Leu Tyr Lys Gln Met Tyr Asn Glu Lys Lys Gln Ala Glu 115 120 125

His Gly Phe Val Arg Glu Lys Ala Asn Gly Ser Gly lie Asn Tyr Val 130 135 140

Gly Gly Asn Leu Asp lie Arg Ala Thr Met Asn Pro Leu Gly Lys Ala 145 150 155 160
imagen4
<210>
42
<211 >
199
<212>
PRT
<213>
Physcomitrella patens
<400> 42
Met Val Val His 1
Met Lys Thr Ala 20
Ser lie Lys Thr 35
Arg Lys lie Ala 50
Asn Leu Gly Val 65
Tyr Lys lie Asn
Asp His Thr Ala 100
Asp Glu Asp Lys 115
Asn Leu Tyr Ser 130
Pro Pro Asp Ser 145
Met Pro Tyr Pro
Gly Phe His Leu 180
Glu Val Glu Leu 195
<210> 43
<211 > 180
10
<212> PRT
<213> Actinia equina
Leu lie Ala Met Gly Leu 5 10
Arg Met Ala Glu Ala lie 25
Leu Gln Asn lie Val Glu 40
lie Gly Phe Lys Asn Leu 55
Tyr Phe Asn Ser Gly Ser 70
Ala Gln Glu Ala Leu Leu 85 90
Arg Gly Thr Val Gly Thr 105
Thr Val His Val Met Trp 120
Asn Trp Trp Asn lie Ala 135
Asn Val His Asp Asn Leu 150
Asn Lys Pro Asp Gln Tyr 165 170
Phe Gly Ser Met Thr Asn 185
Lys Lys Ala
Arg Tyr Ser
lie Pro Ala
Gly lie Thr 45
Thr Asp Tyr 60
Ser Asp Arg 75
Phe Ser Ala
Phe Ser Tyr
Ser Val Pro 125
Val Val Asp 140
Tyr Asn Gly 155
lie Asn Asn
Asn Gly Gln
Glu
Ala
30
Gly
Thr
Ser
Arg
Tyr
110
Phe
Gly
Ser
Glu
Ala
190
Thr lie 15
Glu Leu Val Asp Leu Glu
lie Ala 80
Lys Ser 95
lie Gln
Asp Tyr
Arg Gln
Gly Gly 160
Gln Lys 175
Thr lie
<400> 43
imagen5
<210> 44 <211> 182 <212> PRT
<213> Physcomitrella patens <400> 44
imagen6
5

Lys lie Ala lie Gly Phe Lys Asn Leu Thr Asp Tyr Thr Leu Glu Asn 35 40 45

Leu Gly Val Tyr Phe Asn Ser Gly Ser Ser Asp Arg Ser lie Ala Tyr 50 55 60

Lys lie Asn Ala Gln Glu Ala Leu Leu Phe Ser Ala Arg Lys Ser Asp 65 70 75 80

His Thr Ala Arg Gly Thr Val Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr lie Gln Asp 85 90 95

Glu Asp Lys Thr Val His Val Met Trp Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn 100 105 110

Leu Tyr Ser Asn Trp Trp Asn lie Ala Val Val Asp Gly Arg Gln Pro 115 120 125

Pro Asp Ser Asn Val His Asp Asn Leu Tyr Asn Gly Ser Gly Gly Met 130 135 140

Pro Tyr Pro Asn Lys Pro Asp Gln Tyr lie Asn Asn Glu Gln Lys Gly 145 150 155 160

Phe His Leu Phe Gly Ser Met Thr Asn Asn Gly Gln Ala Thr lie Glu 165 170 175
Val Glu Leu Lys Lys Ala 180
<210> 45 <211> 204 <212> PRT
5 <213> Gallus gallus
<400> 45

Met Pro Pro Lys Glu Lys Lys Glu Asn Asp Lys Pro Cys Asn Asp Asn 15 10 15

Cys Gln Pro Lys Pro Gln Gly Lys Gly Val Glu Ser Leu Met Lys Asn 20 25 30

lie Asp Val Cys Arg Ser Val Gly Leu Glu lie lie Asn Arg Thr Arg 35 40 45

Thr Val Thr Leu Thr Asp Phe Arg Ser Tyr Cys Phe Ser Gly Lys lie 50 55 60

Val Thr Thr Leu Pro Phe Glu lie Gly Pro Asp Ser Lys Gly lie Cys 65 70 75 80
lie Phe Ala Lys Thr Pro Tyr Ser Leu Arg Gly Ser Val Gly Thr Val

85 90 95
Val Cys Lys Ala Asp Thr Phe Phe Leu Ala lie Thr Phe Ser Asn Pro

100 105 110
Tyr Asp Tyr lie Leu Tyr Lys lie Glu Phe Ala Leu Glu lie Phe Thr

115 120 125
Glu Pro Asn His Leu Gly Asn Leu Gly Asp Val Phe Ser Lys Met Met

130 135 140
Lys Ser Lys Pro Tyr Cys Gly Ser Ser Leu Phe Gln Arg Ala Val Leu

145 150 155 160
Glu Ser Glu His Glu Thr Leu Glu Val Ser Lys Gly Ser lie Arg Val

165 170 175
Gln Ala Lys Met Ser Asn Asn Arg Lys Ala lie Leu Lys Val Gln Val

180 185 190
Glu Asp Met Asp Pro Pro Pro Tyr Ser Lys Gly Met

195 200
5
<210>
46
<211 >
166
<212>
PRT
<213>
Gallus gallus
<400> 46
imagen7

Ser Lys Met Met Lys Ser Lys Pro Tyr Cys Gly Ser Ser Leu Phe Gln 115 120 125

Arg Ala Val Leu Glu Ser Glu His Glu Thr Leu Glu Val Ser Lys Gly 130 135 140

Ser lie Arg Val Gln Ala Lys Met Ser Asn Asn Arg Lys Ala lie Leu 145 150 155 160
Lys Val Gln Val Glu Asp 165
<210> 47 <211> 220 <212> PRT
5 <213> Ornithorhynchus anatinus
<400> 47

Met Ala Gln Thr lie Glu His Leu Val His Glu Val Glu Ala Gly Arg 15 10 15

Cys Val Gly lie Glu lie Thr Asn Thr Thr Asn Met Thr Phe Arg Ser 20 25 30

Pro Arg Thr Phe Cys Phe Ser Gly His Thr Leu Thr Pro Pro Thr Pro 35 40 45

lie lie His Pro Asn Asn Ala Gly Phe Cys lie Phe Val Lys Arg Lys 50 55 60

Phe Ser Leu Arg Gly Ser Val Gly Leu Leu Val Tyr Glu lie Glu Asp 65 70 75 80

Gln Thr Leu Ala lie Met Phe Ser Asn Pro Phe Asp Tyr Asn Phe Phe 85 90 95

Lys Val Glu Phe Ala Val Ala Leu Ser Gly Tyr Lys Glu Glu Thr Gln 100 105 110

Asp Leu Lys Ala Phe Phe Glu Leu Leu Tyr His Glu Lys Gln Lys Gly 115 120 125

Trp Leu Lys Met Ala Lys Glu Lys Leu Cys Glu Cys Gln Cys Pro Val 130 135 140

Ser Leu Glu Asn Asn Gly lie Arg Val Thr Ala Thr Met Ser Asn Asn 145 150 155 160
Ala Lys Ala lie lie Lys Leu Ser Ser Pro Asp Ala Lys Pro Pro Glu

165 170 175

Gly Asp Val Ala Asp Val Gln Pro Thr Thr Val Arg Arg Pro Asn Pro 180 185 190

Pro Pro Phe Pro Ser Pro Arg Pro Arg lie Gly Ser Asp Leu Thr Gly 195 200 205

Asp Gln Leu Ala Thr Leu Asp Phe Glu Ser Gly Lys 210 215 220
5
<210>
48
<211 >
157
<212>
PRT
<213>
Actinia equina
<400> 48

Leu Glu Ala Leu Gly Asn Val Lys Arg Lys lie Ala Val Gly Val Asp 15 10 15

Asn Glu Ser Gly Lys Thr Trp Thr Ala Leu Asn Thr Tyr Phe Arg Ser 20 25 30

Gly Thr Ser Asp lie Val Leu Pro His Lys Val Pro His Gly Lys Ala 35 40 45

Leu Leu Tyr Asn Gly Gln Lys Asp Arg Gly Pro Val Ala Thr Gly Ala 50 55 60

Val Gly Val Leu Ala Tyr Leu Met Ser Asp Gly Asn Thr Leu Ala Val 65 70 75 80

Leu Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp Asn 85 90 95

Val Arg lie Tyr Lys Gly Lys Arg Arg Ala Asp Gln Arg Met Tyr Glu 100 105 110

Glu Leu Tyr Tyr Asn Leu Ser Pro Phe Arg Gly Asp Asn Gly Trp His 115 120 125

Thr Arg Asn Leu Gly Tyr Gly Leu Lys Ser Arg Gly Phe Met Asn Ser 130 135 140

Ser Gly His Ala lie Leu Glu lie His Val Ser Lys Ala 145 150 155
<210> 49 <211> 165 10 <212> PRT
<213> Ornithorhynchus anatinus

Leu Val His Glu Val Glu Ala Gly Arg Cys Val Gly lie Glu lie Thr 15 10 15

Asn Thr Thr Asn Met Thr Phe Arg Ser Pro Arg Thr Phe Cys Phe Ser 20 25 30

Gly His Thr Leu Thr Pro Pro Thr Pro lie lie His Pro Asn Asn Ala 35 40 45

Gly Phe Cys lie Phe Val Lys Arg Lys Phe Ser Leu Arg Gly Ser Val 50 55 60

Gly Leu Leu Val Tyr Glu lie Glu Asp Gln Thr Leu Ala lie Met Phe 65 70 75 80

Ser Asn Pro Phe Asp Tyr Asn Phe Phe Lys Val Glu Phe Ala Val Ala 85 90 95
Leu Ser Gly Tyr Lys Glu Glu Thr Gln Asp Leu Lys Ala Phe Phe Glu 100 105 110
Tyr 115
His Glu Lys Gln Lys 120 Gly Trp Leu Lys Met 125
Cys
Glu Cys Gln Cys 135 Pro Val Ser Leu Glu 140 Asn
Thr
Ala Thr Met 150 Ser Asn Asn Ala Lys 155 Ala lie
Pro
Asp Ala 165
Leu Leu
Lys Leu 130
Arg Val 145
Ser Ser
<210> 50
<211> 265
<212> DNA
<213> Aiptasia pulchella
<400> 50
gtgtcgccaa
ctgaggtata
acgtaagaca
gtgcaccaat
gtacagcaac
<210> 51
<211> 14
<212> PRT
<213> Aiptasia pulchella
Ala Lys Glu
Asn Gly lie
lie Lys Leu 160
cgagtcggga
tgcacttggg aaaagccaaa tacatacttc ttctctggta 60
aagtgcctcc
ctctaaagct tgagaataaa aaagcacttt tgtacggccc 120
acagggcctg
ttgccacggg agctgttgga gtgctcactt acaaaatgtt 180
gagacgaaca
ctctggctgt tcttttcagt gtacccttcg actacaactt 240
tggtggaaat
gtcaa 265
5
10
15
20
25
30
<400> 51
Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10
<210> 52 <211> 254 <212> DNA
<213> Anemonia viridans <220>
<221 > base_modificada <222> (37)..(37)
<223> a, c, t, g, desconocido u otro <220>
<221 > base_modificada <222> (70)..(70)
<223> a, c, t, g, desconocido u otro <400> 52
tgtgtcgaca acgagtcggg caagacgtgg accgcantga acacatactt ccgttctggc
acctctgatn tcrtccttcc ccatacagtt ccacatggta aggcactgct ctacaacggt
cagaaagatc gtggtccagt tgcgactggc gtggttggag tacttgctta tgccatgagc
gatggaaaca ccctggccgt tttgttcagc rttccctatg actataacct gtacagcaac
tggtggaatg tcaa
<210> 53 <211> 20 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético"
<400> 53
Cys Arg Gln Arg Val Gly Met His Leu Gly Lys Ala Lys Tyr lie Leu 15 10 15
Leu Leu Trp Tyr 20
<210> 54 <211> 15
<212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<221 > fuente
<223> /nota="Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético"
<400> 54
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210>
55
<211>
16
<212>
PRT
<213>
Secuencia Artificial
60
120
180
240
254
5
10
15
20
25
30
35
40
45
<220>
<221>
<223>
<400>
<210> <211 > <212> <213>
<220>
<221>
<223>
<400>
<210> <211 > <212> <213>
<220>
<221>
<223>
<400>
<210> <211 > <212> <213>
<220>
<221>
<223>
<400>
<210> <211 > <212> <213>
<220>
<221>
<223>
<400>
<210> <211 > <212> <213>
fuente
/nota="Descripción de la Secuencia Artificia: Péptido sintético" 55
Cys Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr Ser Asn Trp Trp Cys 15 10 15
56
8
PRT
Secuencia Artificial
fuente
/nota="Descripción de la Secuencia Artificial: Péptido sintético"
56
Cys Phe Asp Tyr Asn Trp Tyr Cys 1 5
57 15 PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
57
Leu Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
58 15 PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
58
Met Phe Ser Val Pro Tyr Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Val 15 10 15
59 15 PRT
Desconocida
fuente
/nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
59
Leu Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Phe Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
60 15 PRT
Desconocida
5
10
15
20
25
<220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica''
<400> 60
Leu Phe Ser lie Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Ser Asn Trp Trp 15 10 15
<210> 61 <211> 15 <212> PRT <213> Desconocida
<220>
<221> fuente
<223> /nota=''Descripción de Desconocida: Secuencia peptídica"
<400> 61
Met Phe Ser Val Pro Phe Asp Tyr Asn Leu Tyr Lys Asn Trp Phe 15 10 15
<210> 62 <211> 67 <212> PRT
<213> Secuencia Artificial <220>
<221> fuente
<223> /nota="Descripción de la Secuencia Artificial: Polipéptido sintético"
<400> 62
imagen8
Lys Cys Gln 65

Claims (26)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Una composición que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde dicho péptido comprende hasta 50 aminoácidos, y en donde la composición está desprovista de actividad citotóxica y citostática.
  2. 2. Un dispositivo médico que comprende una composición desprovista de actividad citotóxica y citostática y que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFy, FDYNLY, WDYnLy, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde la composición se cubre en una superficie del dispositivo o se incorpora en una matriz polimérica del dispositivo médico.
  3. 3. El dispositivo médico de la reivindicación 2, en donde el dispositivo médico es un dispositivo médico implantable o un instrumento médico.
  4. 4. El dispositivo médico de la reivindicación 3, en donde dicho dispositivo médico se selecciona del grupo que consiste en vasos sanguíneos artificiales, catéteres, dispositivos para la eliminación o administración de fluidos a pacientes, corazones artificiales, riñones artificiales, clavos ortopédicos, articulaciones protésicas, placas e implantes, tubos urológicos y biliares, tubos endotraqueales, catéteres venosos centrales insertables de forma periférica, catéteres de diálisis, catéteres venosos centrales tunelizados de larga duración, catéteres venosos periféricos, catéteres venosos centrales de corta duración, catéteres arteriales, catéteres pulmonares, catéteres de Swan-Ganz, catéteres urinarios, catéteres peritoneales, dispositivos urinarios de larga duración, dispositivos urinarios de unión de tejidos, esfínteres urinarios artificiales, dilatadores urinarios, derivaciones ventriculares, derivaciones arteriovenosas, implantes mamarios, prótesis de pene, prótesis de injerto vascular, dispositivos de reparación de aneurismas, válvulas cardiacas mecánicas, articulaciones artificiales, laringes artificiales, implantes otológicos, dispositivos anastomóticos, puertos de catéteres vasculares, stents vasculares, grapas, dispositivos embólicos, tubos de drenaje de heridas, lentes oculares, implantes dentales, derivaciones de hidrocefalia, marcapasos y desfibriladores implantables, conectores sin aguja y prótesis de voz.
  5. 5. Un dispositivo susceptible de formar biopelículas, que comprende una composición desprovista de actividad citotóxica y citostática y que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde la composición se cubre en una superficie del dispositivo o se incorpora en una matriz polimérica del dispositivo.
  6. 6. El dispositivo de la reivindicación 5, en donde el dispositivo se selecciona del grupo que consiste en cascos de embarcaciones, superficies de automóviles, superficies de aviones, membranas, filtros, y equipos industriales,
  7. 7. Un método para prevenir la adhesión de un organismo unicelular a una superficie seleccionada del grupo que consiste en una tela, una fibra, una espuma, una película, un hormigón, una mampostería, un vidrio, un metal y un plástico, que comprende poner en contacto el organismo unicelular con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY, en donde la composición prevé o reduce la adhesión del organismo unicelular a la superficie.
  8. 8. Un método de tratamiento del agua para prevenir o reducir la formación de biopelículas o ensuciamiento del filtro, que comprende tratar el agua con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYnFy, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY.
  9. 9. Un método para prevenir o reducir la formación de biopelículas en un fluido externo que no se origina de un cuerpo animal, que comprende tratar el fluido con una composición desprovista de actividad citotóxica o citostática y que comprende un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YDYNLY, FDYNFY, FDYNLY, WDYNLY, FDYNWY, YDWNLY y YDWHLY.
  10. 10. La composición de la reivindicación 1, en donde el péptido tiene una longitud de no más de 30 o 40 aminoácidos; o un dispositivo médico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, el dispositivo de la reivindicación 5 o 6, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el péptido tiene una longitud de no más de 30, 40 o 50 aminoácidos.
  11. 11. El dispositivo médico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, o el método de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la secuencia YDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPYDYNLYSNWV o LFSVPYDYNLYSNWW; o en donde la secuencia FDYNFY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNFYSNWW o LFSVPFDYNFYSNWW; o
    en donde la secuencia FDYNLY se comprende en una proteína de secuencia seleccionada del grupo que consiste en LFSVPFDYNLYSNWW, LFSIPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYSNWW, MFSVPFDYNLYTNWW, MWSVPFDYNLYSNWW y MFSVPFDYNLYKNWL; o
    en donde la secuencia WDYNLY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPWDYNLYKNWF; o
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    en donde la secuencia FDYNWY se comprende en una proteína de secuencia MFSVPFDYNWYSNWW; o
    en donde la secuencia YDWNLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWNLYQSWA o MASIPYDWNLYSAWA; o
    en donde la secuencia YDWHLY se comprende en una proteína de secuencia MASIPYDWHLYNAWA.
  12. 12. La composición de la reivindicación 1, el dispositivo médico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, el dispositivo de la reivindicación 5 o 6, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9,
    en donde el péptido se aísla de un organismo acuático, en donde el organismo acuático es, en particular, seleccionado del grupo que consiste en un pez y un organismo sésil.
  13. 13. La composición, dispositivo médico, dispositivo o método de la reivindicación 12, en donde el organismo sésil es una anémona seleccionada del grupo que consiste en Aiptasia pulchella y Anemonia viridans.
  14. 14. La composición de la reivindicación 1, el dispositivo médico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, el dispositivo de la reivindicación 5 o 6, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9,
    en donde el péptido se aísla de un musgo, en donde el musgo es, en particular, seleccionado del grupo que consiste en Physcomitrella patens, Funaria hygrometrica; Eukariota; Viridiplantae; Streptophyta; Embtyophyta; Bryophita; Moss Superclass V; Bryopsida; Funariidae; Funariales; Funariaceae; y Physcomitrella.
  15. 15. La composición de la reivindicación 1, el dispositivo médico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, el dispositivo de la reivindicación 5 o 6, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9,
    en donde la composición es resistente a la liofilización.
  16. 16. La composición de la reivindicación 1, el dispositivo médico de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, el dispositivo de la reivindicación 5 o 6, o el método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9,
    en donde la composición inhibe la agregación de células.
  17. 17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 16, en donde el organismo unicelular se comprende en una biopelícula.
  18. 18. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, en donde el organismo unicelular se selecciona del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, un protozoo y una arquea, en donde el hongo comprende, en particular, una levadura.
  19. 19. El método de la reivindicación 7, en donde la composición está en una forma seleccionada del grupo que consiste en un aerosol, un gel y una pintura; o en donde la superficie se comprende en un dispositivo seleccionado del grupo que consiste en un casco de embarcación, una superficie de automóvil, una superficie de avión, membranas, filtros, y equipos industriales.
  20. 20. El método de la reivindicación 8, en donde el agua tratada se aplica a un filtro de ósmosis inversa.
  21. 21. El método de la reivindicación 9, en donde el fluido se aplica a un filtro de ósmosis inversa.
  22. 22. El método de la reivindicación 8 o 9, en donde la biopelícula se forma por un organismo unicelular seleccionado
    del grupo que consiste en una bacteria, un hongo, un protozoo y una arquea, en donde el hongo comprende, en
    particular, una levadura.
    imagen1
    Figura 1: Cadena A de 1GWY, estructura cristalina del estado agua-S de la citolisina Sticholysin II formadora de poros
    imagen2
    Figura 2: Cadena B de 1GWY, estructura cristalina del estado W de la citolisina Sticholysin II formadora de poros
    imagen3
    Figura 3: Cadena A de 1KD6, estructura en solución de la citolisina Equinatoxina II formadora de poros
    imagen4
    Figura 4: Cadena A de 1TZQ, estructura cristalina del mutante de doble cisteina de la Equinatoxin II 8-69
    Crecimiento a 24 h de las Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
    imagen5
    2
    Contro
    bacteria positivo
    rt
    1- AbacZ-17C
    2- AbacZ-17
    3- AbacZ-16C
    4- AbacZ-6
    5“ AbacZ-8C
    -JUUQ6S (JO
    Prevención de la formación de biopelículas de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
    imagen6
    1- AbacZ-17C
    2- AbacZ-17
    3- AbacZ-16C
    4- AbacZ-6
    5- AbacZ-flC
    UIUS6S ero
    Crecimiento a 24 horas de Acinetobacter Baumannii (aislado clínico)
    imagen7
    2 3 4 5 solo Control
    bacteria positivo
    praliia ni'
    1- AbacZ-17C
    2- AbacZ-17
    3- AbacZ-16C
    4- AbacZ-6 5* AbacZ-8C
    Prevención de la formación de biopelícula de Acinetobacter Baumannii (aislado clínico)
    imagen8
    Prevención de la formación de biopelículas en las fracciones equina de Actinetobacter
    baumannii
    imagen9
    5
    Prevención de la formación de biopelículas para la fracción 13
    imagen10
    Prevención de la formación de biopelículas de Anemonia, Aiptasia y Physcomitrella (Musgo) de Pseudomonas aeruginosa
    imagen11
    Figura 11
    5
    Ensayos de anti-adherencia con péptidos Abac Z y Musgo en S.a
    n ni I
    i;ílft ,|| «llí lililí tliclíí 'musgo
    *Las concentraciones de musgo son: 50 |jg/ml, 5 |jg/ml y 0,5 jg/ml
    [i
    ¡I
    5
    imagen12
    imagen13
    O)
    00
    % de adherencia
    -*-*—*—*—‘ y kl U KJ KJ u
    oÉié8S8^5B83B5S3S
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    imagen14
    CQ C —s 03
    OI
    imagen15
    imagen16
    imagen17
    DIAGRAMA DE FLUJO DEL DESARROLLO DE UN PEPTIDO
    CICLICO CON BRAZO EMULSIONANTE
    1. Montaje paralelo y delación del peptido pegado a
    SPPS (química de Fmoc)
    AAj*AA yR
    X = amida, urea, S-S, S, cidobutano, Ph, etc.
  23. 2. Bio-cribado de peptidos cíclicos para definir el modo
    de ciclacion
  24. 3. Adición paralela y secuencial del enlazador emulsionante
    ; - - Enlazador: JwJZr--------AArM r aL
  25. 4. Volver a enviar al bioensayo y al experimento de
    absorción
  26. 5. Evaluación de resultados
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