ES2690526T3 - Composiciones inmunogénicas - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del Estreptococo del Grupo B (GBS) conjugado con una proteína transportadora, ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, iv) un toxoide diftérico, v) un toxoide tetánico y vi) un antígeno acelular de la tosferina y opcionalmente vii) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones inmunogénicas Campo técnico

La presente invención se encuentra en el campo de las vacunas combinadas, es decir, vacunas que contienen una mezcla de inmunógenos procedentes de más de un patógeno, de modo que la administración de la vacuna puede inmunizar simultáneamente a un sujeto frente a más de un patógeno. En particular, la invención se refiere a vacunas combinadas que contienen conjugados de sacáridos capsulares de Streptococcus agalactiae y proteínas transportadoras.

Antecedentes de la técnica

Las vacunas que contienen antígenos de más de un organismo patogénico dentro de una única dosis se conocen como vacunas "multivalentes o "combinadas". Se han aprobado diversas vacunas combinadas para su uso en seres humanos en Europa y los Estados Unidos, entre las que se incluyen vacunas para proteger contra la difteria, el tétanos y la tosferina (vacunas "DTP") y vacunas trivalentes para proteger contra el sarampión, las paperas y la rubéola (vacunas "MMR"). Las vacunas combinadas ofrecen a los pacientes la ventaja de recibir un número reducido de inyecciones, que lleva a la ventaja clínica de cumplimiento aumentado (por ejemplo, véase capítulo 29 de la referencia 1).

El Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B, GBS) es un microorganismo Gram positivo encapsulado hemolítico que coloniza el tracto anogenital del 25-30 % de mujeres sanas. El GBS causa infecciones neonatales en bebés nacidos de madres que portan las bacterias y es una causa principal de sepsis neonatal y meningitis. El patógeno también se reconoce cada vez más como una causa importante de enfermedad en adultos, particularmente aquellos con enfermedad subyacente, y en ancianos.

Se han descrito vacunas conjugadas contra Streptococcus agalactiae en documentos tales como las referencias 2 a 10. Las vacunas conjugadas para cada uno de los serotipos la, Ib, II, III y V de GBS han demostrado ser seguras e inmunogénicas en seres humanos [11]. La referencia 12 también describe diversas vacunas que contienen conjugados de GBS.

Es un objeto de la invención proporcionar más vacunas combinadas mejoradas para proteger contra el Streptococcus agalactiae y uno o más de Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis y Poliovirus.

Descripción de la invención

La invención es tal como se define en las reivindicaciones.

La invención se basa en estudios de vacunas combinadas que comprenden conjugados de GBS y uno o más antígenos seleccionados de: a) antígeno acelular de la tosferina b) un toxoide tetánico c) un toxoide diftérico y d) un antígeno de poliovirus inactivado. Los inventores han encontrado que estas vacunas combinadas producen títulos de anticuerpos específicos frente a los antígenos correspondientes con poca o ninguna interferencia inmunológica entre los diversos antígenos.

Por lo tanto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del Estreptococo del Grupo B (GBS) conjugado con una proteína transportadora, ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, iv) un toxoide diftérico, v) un toxoide tetánico y vi) un antígeno acelular de la tosferina y opcionalmente vii) un antígeno del poliovirus inactivado, en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

La descripción también proporciona un método para suscitar una respuesta inmune en un paciente, que comprende la etapa de administrar al paciente una composición inmunogénica según la invención.

La invención también proporciona un proceso para preparar la composición inmunogénica según la invención, que comprende mezclar un primer componente que comprende los conjugados de serotipo Ia, Ib y III del GBS y un segundo componente que comprende a) antígeno acelular de la tosferina, b) un toxoide tetánico, c) un toxoide diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados.

La invención también proporciona un kit para preparar la composición inmunogénica de la invención, que comprende un primer componente que comprende conjugados del serotipo Ia, Ib y III del GBS; y un segundo componente que comprende a) antígeno acelular de la tosferina, b) un toxoide tetánico, c) un toxoide diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado; en el que los dos componentes se encuentran en recipientes separados y en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados.

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Conjugado de GBS Sacárido capsular

La invención se basa en el sacárido capsular del Streptococcus agalactiae. El sacárido capsular está enlazado covalentemente a la cadena principal de peptidoglicano del GBS y es distinto del antígeno del grupo B, que es otro sacárido que está unido a la cadena principal de peptidoglicano.

Los sacáridos capsulares del GBS están químicamente relacionados, pero son antigénicamente muy distintos. Todos los sacáridos capsulares del GBS comparten el siguiente núcleo de trisacárido:

P-D-GlcpNAc(1^3)P-D-Galp(1^4)P-D-Glcp

Los diversos serotipos del GBS difieren por el modo en que está modificado este núcleo. La diferencia entre los serotipos la y III, por ejemplo, proviene del uso de o bien el GlcNAc (la) o bien el Gal (III) en su núcleo para enlazar núcleos de trisacárido consecutivos. Ambos serotipos Ia y Ib tienen un disacárido [a-D-NeupNAc(2^-3)p-D-Galp- (1^-] enlazado al GlcNAc en el núcleo, pero el enlace es o bien 1^4 (Ia) o 1^3 (Ib).

La enfermedad relacionada con el GBS aparece principalmente a partir de los serotipos la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII y VIII, y aproximadamente más del 85 % es causada por cinco serotipos: Ia, Ib, III y V. La invención usa normalmente un sacárido de uno o más de estos cuatro serotipos, particularmente, de uno o más de los serotipos: Ia, Ib y III. Los sacáridos capsulares de cada uno de estos cuatro serotipos incluyen: (a) un resto de ácido W-acetil-neuramínico (NeuNAc) terminal (comúnmente denominado como ácido siálico), que en todos los casos está enlazado 2^3 a un resto de galactosa; y (b) un resto de W-acetil-glucosamina (GlcNAc) dentro del núcleo de trisacárido. Todos los cuatro sacáridos incluyen restos de galactosa dentro del núcleo de trisacárido, pero los serotipos la, lb, II y III también contienen restos de galactosa adicionales en cada unidad repetitiva.

Las composiciones inmunogénicas pueden comprender tres, cuatro o cinco conjugados de GBS tal como se describe a continuación.

Normalmente, la composición inmunogénica de la invención comprende tres conjugados de GBS. El primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una

proteína transportadora y el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado

con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una

proteína transportadora y el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado

con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer

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conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora.

Del mismo modo, las composiciones inmunogénicas pueden comprender cuatro conjugados de GBS. En una realización, el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo lb del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora y el cuarto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En una realización, el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del gBs conjugado con una proteína transportadora, el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el cuarto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, el tercer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el cuarto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora y el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora y el cuarto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo

V del GBS conjugado con una proteína transportadora. En el presente documento también se describen composiciones en donde el primer conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora, el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora y el cuarto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora.

Del mismo modo, las composiciones inmunogénicas pueden comprender cinco conjugados de GBS. Por ejemplo, el primer conjugado de gBs es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, mientras que el segundo conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, el tercer conjugado del GBS es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, el cuarto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora y el quinto conjugado de GBS es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora.

Normalmente, las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente no comprenderán ningún conjugado de GBS distinto de aquellos mencionados específicamente, particularmente conjugados de GBS que comprenden sacáridos capsulares de serotipos de GBS distintos de aquellos mencionados específicamente. Sin embargo, en algunas realizaciones, las composiciones pueden comprender otros conjugados de GBS, que incluyen conjugados de GBS que comprenden sacáridos capsulares de otros serotipos de GBS. Por ejemplo, las composiciones pueden comprender un conjugado de GBS de sacárido capsular del serotipo VI del GBS conjugado con una proteína transportadora. En otra posibilidad, las composiciones pueden comprender un conjugado de GBS que es un sacárido capsular del serotipo VIII del GBS conjugado con una proteína transportadora.

Sacáridos útiles para la invención pueden ser en su forma nativa o pueden haber sido modificados. Por ejemplo, el sacárido puede ser más corto que el sacárido capsular nativo o puede estar químicamente modificado. En particular, el sacárido capsular del serotipo V usado en la invención puede modificarse tal como se describe en las ref. 13 y 14. Por ejemplo, un sacárido capsular del serotipo V que ha sido sustancialmente desialilatado tal como se describe en las ref. 13 y 14 está específicamente previsto para su uso en la presente invención. El sacárido capsular del serotipo

V del GBS desialilatado puede prepararse tratando el sacárido capsular del serotipo V del GBS purificado en condiciones suavemente acídicas (por ejemplo, 0,1 m de ácido sulfúrico a 80 °C durante 60 minutos) o mediante tratamiento con neuraminidasa, tal como se describe en la referencia 13. Un método preferente para la preparación de sacárido capsular del serotipo V del GBS desialilatado es tratando el sacárido purificado con 1 m de ácido acético a 81 °C +/-3 C° durante 2 h. Por lo tanto, el sacárido usado según la invención puede ser sustancialmente un polisacárido capsular de longitud completa, tal como se encuentra en la naturaleza, o puede ser más corto que su longitud natural. Los polisacáridos de longitud completa pueden despolimerizarse para proporcionar fragmentos más cortos para su uso con la invención, por ejemplo, mediante hidrólisis en ácido suave, mediante calentamiento, mediante cromatografía de calibración, etc. La longitud de cadena se ha informado que afecta a la inmunogenicidad de los sacáridos del GBS en conejos [5]. En particular, los sacáridos capsulares del serotipo II y/o III usados en la invención pueden despolimerizarse tal como se describe en las ref. 15 y 16. Estos documentos describen la despolimerización parcial de polisacáridos capsulares del tipo II y tipo III mediante escisión desaminativa suave a fragmentos antigénicos con restos de 2,5-anhidro-D-manosa de terminal reductor. En resumen, el sacárido capsular

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se disuelve en 0,5 N de NaOH y se alienta a 70 °C durante aproximadamente 1-4 h. La longitud de esta incubación controla el grado de despolimerización, que puede determinarse mediante métodos estándar (por ejemplo, mediante HPLC tal como se describe en la referencia 15). La muestra se enfría en un baño con hielo antes de añadir ácido acético glacial para llevar el pH a 4. El producto parcialmente N-deacilatado se desamina a continuación mediante la adición de NaNO2 al 5 % (en peso/vol) con agitación a 4 °C durante 2 h. Los aldehidos libres de los nuevos restos de 2,5-anhidro-D-manosa formados pueden usarse para la conjugación a una proteína transportadora, tal como se describe en la referencia [12].

Se ha informado de la despolimerización del sacárido capsular del serotipo III por endo-p-galactosidasa [ref. 2 y 5-7], que incluye el material despolimerizado para formar conjugados con un transportador toxoide tetánico. También se ha usado la ozonólisis de polisacáridos capsulares a partir de los serotipos III y VIII del GBS para la despolimerización [17]. Es preferente usar sacáridos con MW>30kDa y pueden usarse sustancialmente polisacáridos capsulares de longitud completa. Para el serotipo Ia es preferente usar polisacáridos con un MW en el intervalo de 150-400 kDa, particularmente 300-350 kDa. Normalmente, se usa un sacárido del serotipo Ia con MW aproximadamente de 330 kDa. Para el serotipo Ib, es preferente usar polisacáridos con un MW en el intervalo de 150-400 kDa, particularmente 250-300 kDa. Normalmente, se usa un sacárido del serotipo Ib con mW

aproximadamente de 280 kDa. Para el serotipo III es preferente usar polisacáridos con un MW en el intervalo de 50200 kDa, particularmente de 100-150 kDa. Normalmente, se usa un sacárido del serotipo III con MW

aproximadamente de 140kDa. Para el serotipo V también es preferente usar polisacáridos con un MW en el intervalo de 50-200 kDa, particularmente de 150-200 kDa. Normalmente, se usa un sacárido del serotipo V con MW aproximadamente de 180 kDa. Estas masas moleculares pueden medirse mediante filtración por gel con respecto a patrones de dextrano, tales como los disponibles en el Servicio Estándar de Polímero [18].

El sacárido puede modificarse químicamente con respecto al sacárido capsular tal como se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, el sacárido puede estar de-O-acetilatado (parcial o completamente), de-N-acetilatado (parcial o completamente), N-propionatado (parcial o completamente), etc. La desacetilación puede producirse antes, durante o después de la conjugación, pero se produce preferentemente antes de la conjugación. Dependiendo del sacárido particular, la desacetilación puede o no puede afectar la inmunogenicidad. La relevancia de la O-acetilación en sacáridos de GBS en diversos serotipos se comenta en la referencia 19 y en algunas realizaciones la O-acetilación de restos de ácido siálico en las posiciones 7, 8 y/o 9 se retiene antes, durante y después de la conjugación, por ejemplo, mediante protección/desprotección, mediante re-acetilación, etc. Sin embargo, normalmente el sacárido de GBS usado en la presente invención no tiene sustancialmente O-acetilación de restos de ácido siálico en las posiciones 7, 8 y/o 9. En particular, cuando se ha purificado el sacárido de GBS mediante extracción de base tal como se describe en la referencia [12], a continuación, se pierde la O-acetilación (ref. 19). El efecto de la desacetilación, etc. puede evaluarse mediante ensayo rutinarios.

Los sacáridos capsulares pueden purificarse mediante técnicas conocidas, tal como se describe en las referencias en el presente documento como las ref. 3 y 20. Un proceso normal implica extracción de base, centrifugación, filtración, tratamiento de RNasa/DNasa, tratamiento de proteasa, concentración, cromatografía por exclusión de tamaño, ultrafiltración, cromatografía de intercambio iónico y ultrafiltración adicional. El tratamiento de células de GBS con la enzima mutanolisina, que escinde la pared celular bacteriana para liberar los componentes de la pared celular, también es útil.

Como alternativa, puede usarse el proceso de purificación descrito en la referencia 21. Esto implica la extracción e base, tratamiento de etanol/CaCl2, precipitación de CTAB y re-solubilización. Se describe un proceso alternativo adicional en la referencia 22.

Sin embargo, la invención no queda limitada a sacáridos purificados a partir de fuentes naturales, y los sacáridos pueden obtenerse mediante otros métodos, tales como síntesis total o parcial.

Las composiciones inmunogénicas descritas anteriormente pueden comprender cualquier cantidad adecuada del/de los sacárido(s) capsular(es) por dosis unitaria. Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno de sacárido individual será generalmente entre 0,1-50 |jg (medido como masa de sacárido), particularmente entre 1-50 |jg, más particularmente 2,5-7,5 jg, por ejemplo, aproximadamente 1 jg, aproximadamente 2,5 jg, aproximadamente 5 jg, aproximadamente 10 jg, aproximadamente 15 jg, aproximadamente 20 jg o aproximadamente 25 jg. Dentro de cada dosis, la cantidad total de sacáridos capsulares de GBS será generalmente < 70 jg (medido como masa de sacárido), por ejemplo, < 60 jg. En particular, la cantidad total puede ser < 40 jg (por ejemplo, < 30 jg) o < 20 jg (por ejemplo, < 15 jg). Estas cantidades totales son particularmente eficaces cuando la composición inmunogénica comprende: i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado a una proteína transportadora; ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora; y iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora. Puede resultar ventajoso minimizar la cantidad total de sacárido(s) capsular(es) por dosis unitaria para reducir la toxicidad potencial. Por consiguiente, la invención usa normalmente una cantidad total < 20 jg, por ejemplo, <15 jg, < 7,5 jg o < 1,5 jg.

Puede ser posible minimizar adicionalmente la cantidad de sacárido(s) capsular(es) por dosis unitaria. En particular, cantidades adecuadas de sacárido(s) capsular(es) pueden ser de 0,1 a 5 jg por dosis unitaria. Normalmente, cada

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sacárido capsular del GBS puede, por lo tanto, estar presente en una cantidad de 0,1 a 5 |jg, por ejemplo, 0,5, 2,5 o 5 jg, por dosis unitaria. Por ejemplo, cada sacárido capsular del GBS puede estar presente en una cantidad de 0,5 a 5 jg, de 1 a 4 jg, de 2 a 3 jg o aproximadamente de 2,5 jg por dosis unitaria. Estas cantidades son particularmente eficaces cuando la composición inmunogénica comprende i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo la del GBS conjugado con una proteína transportadora; ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora; y iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora.

La relación de la masa de un sacárido capsular dado con respecto a la masa del/de los otro(s) sacárido(s) capsular(es) puede variar. Por ejemplo, cuando la composición inmunogénica comprende sacáridos capsulares del serotipo Ia, Ib y III del GBS, la relación de las masas de los sacáridos capsulares del serotipo Ia, Ib y III del GBS es 1:1:1.

Conjugación

La invención usa conjugados de GBS que son sacáridos capsulares de los serotipos Ia, Ib, II, III o V del GBS conjugado con una proteína transportadora. Tal como se usa en el presente documento "conjugado" se refiere a un compuesto formado por enlace covalente de dos partes para formar una única estructura, en donde la primera parte es un antígeno, particularmente un polisacárido y la segunda parte es un transportador inmunogénico tal como una proteína transportadora. El enlace puede realizarse mediante un enlace químico covalente entre las moléculas o mediante el uso de un grupo de enlace, que incluye no de forma exclusiva diaminoalcanos y uno o más aminoácidos, uno de los cuales proporciona un grupo sulfhidrilo, carboxilo amino u otro libre para su conjugación con el transportador. Para los fines de la invención, generalmente el término 'conjugado' se refiere a un antígeno bacteriano, particularmente un sacárido o polisacárido bacteriano, enlazado covalentemente a una proteína transportadora. En general, la conjugación covalente de sacáridos a transportadores aumenta la inmunogenicidad de sacáridos ya que los convierte de antígenos independientes de T a antígenos dependientes de T permitiendo, de este modo, la sensibilización para la memoria inmunológica. La conjugación resulta particularmente útil para vacunas pediátricas (por ejemplo, ref. 23] y es una técnica bien conocida [por ejemplo, revisada en ref. 24 a 32]. Por lo tanto, los procesos de la invención pueden incluir la etapa adicional de conjugar el sacárido purificado a una molécula transportadora.

La conjugación de sacáridos de GBS se ha dado a conocer en gran medida, por ejemplo, véanse referencias 2 a 103567. El proceso típico de la técnica anterior para una conjugación de sacárido de GBS implica normalmente la aminación reductora de un sacárido purificado a una proteína transportadora tal como toxoide tetánico (TT) o CRM197 [3]. La aminación reductora implica un grupo amina en el lado de la cadena de un aminoácido en el transportador y un grupo aldehído en el sacárido. Puesto que los sacáridos capsulares de GBS no incluyen un grupo aldehído en su forma natural, por lo tanto, este se genera normalmente antes de la conjugación por oxidación (por ejemplo, oxidación de peryodato) de una parte (por ejemplo, entre el 5 y 40 %, particularmente entre el 10 y 30 %, preferentemente aproximadamente el 20 %) de los restos de ácido siálico del sacárido [3,33]. Las vacunas conjugadas preparadas de este modo han demostrado ser seguras e inmunogénicas en humanos para cada uno de los serotipos Ia, Ib, II, III y V del GBS [11]. Normalmente, todos los conjugados en las composiciones inmunogénicas de la presente invención se han preparado de este modo. Sin embargo, cuando la invención usa un sacárido capsular del serotipo V que está desialilatado, entonces, puede generarse un grupo aldehído en este sacárido antes de la conjugación por oxidación (por ejemplo, oxidación de peryodato) de una parte (por ejemplo, entre el 5 y 40 %, particularmente entre el 10 y 30 %, preferentemente aproximadamente el 20 %) de los restos de galactosa del sacárido [2,33]. Un proceso de conjugación alternativo implica el uso de grupos -NH2 en el sacárido, (bien a partir de la des-N-acetilación o después de la introducción de aminas) en conjunción con enlazadores bifuncionales, tal como se describen en la ref. 34. En algunas realizaciones uno o más de los conjugados en las composiciones inmunogénicas de la presente invención se han preparado de este modo. Se describe un proceso alternativo adicional en las ref. 15 y 16. En este proceso, los grupos de aldehídos libres de restos de 2,5-anhidro-D-manosa terminales a partir de la despolimerización de sacáridos capsulares del tipo II o tipo III mediante escisión desaminativa suave se usan para su conjugación mediante aminación reductora. En algunas realizaciones uno o más de los conjugados en las composiciones inmunogénicas de la presente invención se han preparado de este modo. Los conjugados pueden prepararse mediante procesos separados y combinarse en una formulación de dosificación única.

Proteína transportadora

La invención implica el uso de proteínas transportadoras. Aunque los polisacáridos son inmunogénicos por sí mismos, la conjugación de polisacáridos a proteínas transportadoras puede mejorar o aumentar la inmunogenicidad. Por lo tanto, tal como se usa en el presente documento, el término "transportador" se refiere a una sustancia inmunogénica que, cuando se conjuga con un antígeno (tal como un polisacárido) y se administra a un animal, inducirá o mejorará una respuesta inmune en el animal, particularmente una respuesta inmune protectora, y suscitará la producción de anticuerpos que se enlazarán específicamente al antígeno, por ejemplo, los polisacáridos anteriormente descritos. Proteínas transportadoras útiles incluye toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide diftérico o toxoide tetánico. También pueden usarse fragmentos de toxinas o toxoides, por ejemplo, fragmento C de toxoide tetánico [35].

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El mutante CRM197 de la toxina diftérica [36-38] es un transportador particularmente útil para su uso en la presente invención. La difteria es una enfermedad bacteriana agua, a menudo mortal, causada por Corynebacterium diphtheria y las manifestaciones clínicas de la enfermedad se deben principalmente a la presencia de toxina diftérica en circulación. Los programas de inmunización activa contra la difteria se han basado en preparaciones que contienen un toxoide diftérico producido por destoxificación de la toxina diftérica con formaldehído (véase a continuación). El material de reacción cruzada (CRM197) es una preparación genéticamente destoxificada de toxina diftérica. CRM197 difiere de la toxina diftérica (DT) en solo un único aminoácido y es, por lo tanto, altamente susceptible a la reacción cruzada con DT (CRM= material de reacción cruzada). Este mutante de toxina diftérica no requiere destoxificación con formaldehído y pueden obtenerse fácilmente preparaciones homogéneas de antígeno purificado, por ejemplo, a partir de cultivos de cepa C7 (beta197) de Corynebacterium diphtheria cultivada en casaminoácidos y medio de extracto de levadura. De forma alternativa, el CRM197 puede prepararse de forma recombinante según el documento US5.614.382. El CRM197 está autorizado para su uso en humanos como proteína transportadora para varios antígenos de polisacáridos capsulares y es una alternativa potencial al toxoide diftérico convencional preparado mediante tratamiento con formaldehído. Tal como se describe a continuación, el uso de CRM197 como un transportador puede ser ventajoso puesto que este transportador también provoca la producción de anticuerpos contra la Corynebacterium diphtheria.

Otras proteínas transportadores adecuadas incluyen la proteína de membrana externa de la N.meningitidis [39], péptidos sintéticos [40,41], proteínas de choque térmico [42,43], proteínas de la tosferina [44,45], citocinas [46], limfocinas [46], hormonas [46], factores de crecimiento [46], albúmina de suero humano (preferentemente recombinante), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocitos T CD4+ humanos de diversos antígenos derivados de patógenos [47] tales como N19 [48], proteína D de H.influenzae [49,50], proteína de superficie neumocócica PspA [51], neumolisina [52], proteínas de captación de hierro [53], toxina A o B de C.difficile [54], exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa recombinante (rEPA) [55], una proteína de GBS (particularmente GBS67) [56], etc.

La unión al transportador es preferentemente a través de un grupo -NH2, por ejemplo, en la cadena lateral de un resto de lisina en una proteína transportadora o de un resto de arginina o en el terminal N. La unión también puede ser a través del grupo -SH, por ejemplo, en la cadena lateral de un resto de cisteína.

Es posible usar más de una proteína transportadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión de transportador. Por lo tanto, pueden usarse distintas proteínas transportadoras para distintos serotipos de GBS, por ejemplo, sacáridos del serotipo Ia podría conjugarse a CRM197 mientras que sacáridos del serotipo Ib podrían conjugarse a toxoide tetánico. También es posible usar más de una proteína transportadora para un antígeno de sacárido particular, por ejemplo, sacáridos del serotipo III podría ser en dos grupos, con algunos conjugados con CRM197 y otros conjugados a toxoide tetánico. En general, sin embargo, es normal usar la misma proteína transportadora para todos los sacáridos.

Una única proteína transportadora podría llevar más de un antígeno de sacárido [57,58]. Por ejemplo, una única proteína transportadora podría tener conjugados con ella sacáridos de los serotipos Ia y Ib. Para conseguir este objetivo, pueden mezclarse distintos sacáridos antes de la reacción de conjugación. En general, sin embargo, es preferente tener conjugados separados para cada serogrupo, mezclándose con los sacáridos distintos tras su conjugación. Los conjugados separados pueden basarse en el mismo transportador.

Se usan normalmente conjugados de GBS con una relación de sacárido:proteína (p/p) entre 1:5 (es decir, proteína en exceso) y 5:1 (es decir, sacárido en exceso), en particular relaciones entre 1:5 y 2:1. Cuando la invención usa un conjugado de GBS que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, entonces la relación de sacárido:proteína (p/p) es normalmente entre aproximadamente 1:1 a 1:2 particularmente aproximadamente 1:1,3. De forma similar, cuando la invención usa un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, entonces la relación es normalmente entre aproximadamente 1:1 a 1:2, particularmente aproximadamente 1:1,3. Cuando la invención usa un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, entonces la relación sacárido:poteína (p/p) es normalmente entre aproximadamente 3:1 a 1:1 particularmente aproximadamente 2:1. Sin embargo, el serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora con una relación de sacárido:proteína (p/p) de aproximadamente 1:1 a 1:5, particularmente aproximadamente 1:3,3 también puede usarse. Cuando la invención usa un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora, entonces la relación es normalmente entre aproximadamente 2:1 a 1:1. Finalmente, cuando la invención usa un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora, entonces la relación es normalmente entre aproximadamente 2:1 a 1:1, particularmente 1,1:1. Por lo tanto, un exceso en peso de sacárido es normal, particularmente con cadenas de sacáridos más largas.

Las composiciones pueden incluir una pequeña cantidad de transportador libre [59]. Cuando una proteína transportadora dada está presente tanto en forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es normalmente no más del 5 % de la cantidad total de la proteína transportadora en la composición en su conjunto, por ejemplo, presente en menos del 2 % en peso.

Tras la conjugación, pueden separarse sacáridos libres y conjugados. Existen muchos métodos adecuados, entre

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los que se incluyen cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. [véase también ref. 60 y 61, etc.]. Se describe un método preferente en la referencia 62.

Cuando la composición de la invención incluye un oligosacárido despolimerizado, es preferente que la despolimerización preceda la conjugación.

Uno o más antígenos

Un "antígeno" es un compuesto, composición o sustancia que estimula una respuesta inmune en el cuerpo, particularmente una respuesta inmune protectora estimulando la producción de anticuerpos y/o respuesta de linfocitos T. Mientras que los conjugados de polisacáridos bacterianos descritos anteriormente son antígenos, tal como se usa en el presente documento el término 'antígeno' se usará para referirse a toxoide(s) diftéricos, toxoide(s) tetánicos, toxoide(s) de tosferina, antígeno(s) celulares de tosferina, antígeno(s) acelulares de tosferina y antígeno(s) de poliovirus, que incluye antígenos de poliovirus inactivados descritos a continuación. Por lo tanto, el término se usará para distinguir el/los componente(s) conjugado(s) que proporcionan principalmente protección contra el Streptococcus agalactiae a partir del/los componente(s) que proporcionan protección contra Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis y/o Poliovirus. El término "uno o más" tal como se usa en el presente documento, se refiere a uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más.

Toxoide diftérico

La difteria está causada por la Corynebacterium diphtheriae, una bacteria aerobia no esporulante Gram positiva. El organismo expresa una exotoxina de ADP ribosilación de codificada de profago ('toxina diftérica') que puede tratarse (por ejemplo, usando formaldehído) para proporcionar un toxoide que ya no es tóxico pero que permanece antigénico y es capaz de estimular la producción de anticuerpos anti-toxinas tras su inyección. Se describen toxoides diftéricos en más detalle en el capítulo 13 de la referencia 63. Toxoides diftéricos preferentes son los preparados mediante tratamiento con formaldehído. El toxoide diftérico puede obtenerse cultivando C.diphtheriae en medio de crecimiento (por ejemplo, medio de Fenton o medio Linggoud y Fenton), que puede complementarse con extracto bovino seguido de tratamiento con formaldehído, ultrafiltración y precipitación. El material toxoide puede, a continuación, tratarse mediante un proceso que comprende filtración estéril y/o diálisis.

Las cantidades de toxoide diftérico pueden expresarse en unidades internacionales (UI). Por ejemplo, el NIBSC [64] suministra el 'Diphtheria Toxoid Adsorbed Third International Standard 1999' [65,66] que contiene 160 UI por ampolla. Como alternativa al sistema de UI, la unidad de 'Lf' (unidades floculantes", la "dosis floculante de limas" o el "límite de floculación") se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla óptimamente floculante [67]. Por ejemplo, el NIBSC suministra 'Diphtheria Toxoid, Plain' [68], que contiene 300 Lf por ampolla, 'The 1st International Reference Reagent For Diphtheria Toxoid For Flocculation Test' [69] que contiene 900 Lf por ampolla. La conversión entre los sistemas de UI y Lf depende de la preparación de toxoide particular.

Cuando se usan materiales bovinos en el cultivo de C.diphtheriae, deben obtenerse a partir de fuentes que están libres de encefalopatía espongiforme bovina (EEB) u otras encefalopatías espongiformes transmisibles (EET).

El toxoide diftérico en las composiciones inmunogénicas de la invención está normalmente presente en una cantidad que es capaz de suscitar una respuesta inmune cuando se administra. Idealmente, el toxoide diftérico puede suscitar una respuesta inmune protectora. La cantidad de toxoide diftérico en las composiciones inmunogénicas de la invención es normalmente de 1-50 Lf/dosis. Las vacunas de refuerzo para adolescentes y adultos contienen normalmente entre 4 Lf/ml y 8 Lf/ml de toxoide diftérico, por ejemplo, 2,5 Lf, preferentemente 4 Lf por dosis de 0,5 ml. Las vacunas pediátricas contienen normalmente entre 20 y 50 Lf/ml de toxoide diftérico, por ejemplo, 10 Lf o 25 Lf por 0,5 ml de dosis.

Para vacunas combinadas pediátricas, la relación de toxoide diftérico con respecto a toxoide tetánico es normalmente superior a 1 (es decir, las vacunas pediátricas tienen normalmente un exceso de toxoide diftérico) y generalmente entre 2:1 y 3:1 (medido en unidades de Lf), por ejemplo 2,5:1. En contraste, para vacunas de refuerzo que se administran a adolescentes o adultos (que normalmente han recibido al menos una vacuna combinada pediátrica que comprende toxoide diftérico y toxoide tetánico), la relación de toxoide diftérico con respecto a toxoide tetánico es normalmente superior a 1 (es decir, la vacunas de refuerzo tienen normalmente un exceso de toxoide tetánico) y generalmente entre 1,5:1 y 2,5:1, por ejemplo 2:1. El toxoide diftérico no está conjugado.

El experto en la técnica entenderá que el "componente diftérico", en otras palabras, que parte de la composición inmunogénica que se usa para suscitar una respuesta inmune que proporciona protección frente a Corynebacterium diphtheria, puede proporcionarse en la forma de CRM197, toxoide diftérico o una combinación de estos.

En algunas realizaciones cuando el CRM197 está presente como una proteína transportadora, es decir, como parte de un conjugado, la cantidad de toxoide diftérico no conjugado ("libre") en composiciones de la invención puede reducirse. Cuando las composiciones inmunogénicas comprenden tanto toxoide diftérico no conjugado y conjugado como/o CRM197, la cantidad total de toxoide diftérico/CRM197 puede ser equivalente a 1-50 Lf/dosis, a una concentración entre 4 Lf por 0,5 ml de dosis a una concentración entre 20 y 50 Lf/ml, por ejemplo, 10 Lf por 0,5 ml

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El toxoide diftérico puede ser absorbido sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio.

Normalmente, la composición inmunogénica que comprende antígeno de toxoide diftérico está sustancialmente libre de cualquier conservante de mercurio.

Toxoide tetánico

El tétanos está causado por Clostridium tetani, un bacilo formador de esporas Gram positivo. Este organismo expresa una endopeptidasa ('toxina tetánica') que puede tratarse para proporcionar un toxoide que ya no es tóxico pero que permanece antigénico y es capaz de estimular la producción de anticuerpos anti-toxinas tras su inyección. Se describen toxoides tetánicos en más detalle en el capítulo 27 de la referencia 1. Toxoides tetánicos preferentes son aquellos preparados mediante tratamiento con formaldehído. El toxoide tetánico puede obtenerse cultivando C.tetani en medio de crecimiento (por ejemplo, un medio de Latham derivado de caseína bovina), seguido de tratamiento con formaldehído, ultrafiltración y precipitación. El material puede, a continuación, tratarse mediante un proceso que comprende filtración estéril y/o diálisis.

Las cantidades de toxoide tetánico pueden expresarse en unidades internacionales (UI). Por ejemplo, el NIBSC [70] suministra el 'Tetanus Toxoid Adsorbed Third International Standard 2000' [71,72] que contiene 469 UI por ampolla. Como alternativa al sistema de UI, la unidad de 'Lf' se define como la cantidad de toxoide que, cuando se mezcla con una Unidad Internacional de antitoxina, produce una mezcla óptimamente floculante [73]. Por ejemplo, el NIBSC suministra 'The 1st International Reference Reagent For Tetanus Toxoid For Flocculation Test' [74] que contiene 1000 Lf por ampolla. La conversión entre los sistemas de UI y Lf depende de la preparación de toxoide particular.

Cuando se usan materiales bovinos en el cultivo de C.tetani, deben obtenerse a partir de fuentes que están libres de encefalopatía espongiforme bovina (EEB) u otras encefalopatías espongiformes transmisibles (EET).

El toxoide tetánico en las composiciones inmunogénicas de la invención está normalmente presente en una cantidad que es capaz de suscitar una respuesta inmune cuando se administra. Idealmente, el toxoide tetánico puede suscitar una respuesta inmune protectora. La cantidad de toxoide tetánico en composiciones inmunogénicas de la invención es normalmente de 1-20 Lf por dosis. Las vacunas de refuerzo para adolescentes y adultos normalmente contienen 5 Lf de toxoide tetánico por 0,5 ml de dosis. Las vacunas pediátricas contienen normalmente entre 5 y 10 Lf de toxoide tetánico por 0,5 ml de dosis.

El toxoide tetánico no está conjugado. Sin embargo, será aparente para el experto en la técnica que en algunas realizaciones, el toxoide tetánico puede estar presente en tanto forma libre (no conjugada) como conjugada. Por lo tanto, la cantidad de toxoide tetánico en composiciones inmunogénicas de la invención puede referirse a un toxoide tetánico no conjugado solo, toxoide tetánico conjugado solo o la suma de toxoide tetánico no conjugado y conjugado.

El toxoide tetánico puede adsorberse sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio, pero esto no es necesario (por ejemplo, puede usarse una adsorción en el intervalo 0-10 % del toxoide tetánico total).

Normalmente, la composición inmunogénica que comprende de toxoide tetánico está sustancialmente libre de cualquier conservante de mercurio.

Toxoide de tosferina

La Bordetella pertussis es una bacteria aerobia no productora de esporas Gram negativa que causa tos convulsiva. Como se describe en más detalle en el capítulo 21 de la referencia 1, las vacunas contra la B.pertussis han estado disponibles durante muchos años y se engloban en dos categorías: celulares (wP) y acelulares (aP). Las vacunas celulares comprenden células de B.pertussis completas que se han destruido y desactivado (por ejemplo, mediante tratamiento con formalina y/o calor), mientras que las vacunas acelulares comprenden antígenos de B.pertussis purificados específicos, o bien purificados a partir de la bacteria nativa o bien purificados después de su espresión en un huésped recombinante.

Antígenos celulares de tosferina

En el presente documento también se describen antígenos acelulares de tosferina, forma de células de B.pertussis inactivadas. La preparación de antígenos celulares de tosferina está bien documentada (por ejemplo, véase capítulo 21 de la referencia 1) por ejemplo, puede obtenerse mediante inactivación térmica de cultivo de fase I de B.pertussis.

Las cantidades de antígenos de wP pueden expresarse en unidades internacionales (UI). Por ejemplo, el NIBSC suministra el 'Third International Standard For Pertussis Vaccine' [75], que contiene 46 UI por ampolla. Cada ampolla contiene el resto liofilizado de 2,0 ml de alícuotas de una solución acuosa que contenía 10 litros de suspensión bacteriana (equivalente a 180 unidades de opacidad en términos del Estándar de Opacidad de EE.UU.) diluida con ocho litros de tampón pH 7,0 de M/15 Sorensen. Como alternativa al sistema de UI, la unidad de "OU" ("unidades de

opacidad") también se usa (por ejemplo, 4 OU puede ser aproximadamente 1 UI).

El antígeno celular de tosferina en una composición inmunogénica está normalmente presente en una cantidad que es capaz de suscitar una respuesta inmune cuando se administra. Idealmente, el antígeno celular de tosferina puede suscitar una respuesta inmune protectora. La cantidad de antígeno de wP en una composición inmunogénica es 5 normalmente de al menos 4 UI/dosis.

El antígeno celular de tosferina puede adsorberse sobre o mezclarse con un adyuvante de fosfato de aluminio. Antígeno acelular de tosferina

La invención puede usar más de un antígeno acelular de tosferina (aP) en una única vacuna, por ejemplo, dos o tres de los siguientes antígenos de B.pertussis bien conocidos y bien caracterizados: (1) toxina de tosferina destoxificada 10 (toxoide de tosferina, o 'PT'); (2) hemaglutinina filamentosa ('FHA'); (3) pertactina (también conocida como la 'proteína de membrana externa de 69 kiloDáltons'). Es más preferente que todos los tres de estos antígenos deben usarse. Estos tres antígenos se preparan preferentemente mediante aislamiento a partir de cultivo de B.pertussis cultivado en medio líquido de Stainer-Scholte. El PT y FHA pueden aislarse del caldo de fermentación (por ejemplo, mediante adsorción sobre gel de hidroxiapatita), mientras que la pertactina puede extraer de células mediante 15 tratamiento térmico y floculación (por ejemplo, usando cloruro de bario). Los antígenos pueden purificare en etapas cromatográficas y/o de precipitación. El PT y FHA puede purificarse mediante cromatografía hidrófoba, cromatografía de afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. La pertactina puede purificarse mediante cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba y cromatografía por exclusión de tamaño.

El FHA y la pertactina puede tratarse con formaldehído antes de su uso según la invención. El PT está 20 preferentemente destoxificado mediante tratamiento con formaldehído y/o glutaraldehído. Como alternativa a este procedimiento de destoxificación química el PT puede ser un PT mutante en cuya actividad enzimática ha sido reducida mediante mutagénesis [76] pero es preferente la destoxificación mediante tratamiento químico.

Además, antígenos acelulares de tosferina que pueden usarse incluyen fimbria (por ejemplo, aglutinógenos 2 y 3).

El/los antígeno(s) aP pueden usarse en un estado no adsorbido pero se adsorben preferentemente sobre uno o más 25 adyuvante(s) de sal de aluminio antes de ser usados. Los antígenos aP se adsorben preferentemente sobre un adyuvante de hidróxido de aluminio.

Normalmente, la composición inmunogénica que comprende antígenos aP está sustancialmente libre de conservantes de mercurio (por ejemplo, timerosal).

El antígeno acelular está normalmente presente en las composiciones inmunogénicas de la invención en una 30 cantidad que es capaz de suscitar una respuesta inmune cuando se administra. Idealmente, el antígeno acelular de tosferina puede suscitar una respuesta inmune protectora. Las cantidades de antígenos acelulares de tosferina se expresan normalmente en microgramos. La concentración de PT en una vacuna es normalmente entre 5 y 50 pg/ml. Las concentraciones de PT normales son 5 pg/ml, 16 pg/ml, 20 pg/ml o 50 pg/ml. La concentración de FHA en una vacuna es normalmente entre 10 y 50 pg/ml. Las concentraciones de FHA normales son 10 pg/ml, 16 pg/ml o 50 35 pg/ml. La concentración de pertactina en una vacuna es normalmente entre 5 y 16 pg/ml. Las concentraciones de pertactina normales son 5 pg/ml, 6 pg/ml o 16pg/ml. Por ejemplo, una vacuna de refuerzo para adolescentes y adultos contiene normalmente de 2,5 a 8 pg de PT, entre 4 y 8 pg de FHA y entre 2,5 y 8 pg de pertactina por 0,5 ml de dosis. Normalmente, una vacuna de refuerzo comprende 4 pg de PT, 4 pg de FHA y 8 pg de pertactina, más preferentemente 5 pg de PT, 2,5 pg de FHA y 2,5 pg de pertactina, por 0,5 ml de dosis. Una vacuna pediátrica 40 normalmente comprende 7 pg de PT, 10 pg de FHA y 10 pg de pertactina, por 0,5 ml de dosis.

Cuando el componente acuoso incluye cada uno de PT, FHA y pertactina, sus relaciones en peso pueden variar pero pueden ser, por ejemplo, aproximadamente 16:16:5, aproximadamente 5:10:6, aproximadamente 20:20:3, aproximadamente 25:25:8, o aproximadamente 10:5:3 (PT:FHA:PRN).

Antígenos de poliovirus inactivado

45 La poliomielitis puede estar causada por uno de los tres tipos de poliovirus. Los tres tipos son similares y causan síntomas idénticos, pero son antigénicamente muy distintos y la infección por un tipo no protege frente a la infección por otros. Tal como se explica en el capítulo 24 de la referencia 1, es preferente, de este modo, usar tres antígenos de poliovirus en las composiciones inmunogénicas de la invención - poliovirus tipo 1 (por ejemplo, cepa Mahoney), poliovirus tipo 2 (por ejemplo, cepa MEF-1) y poliovirus tipo 3 (por ejemplo, cepa Saukett).

50 Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir un antígeno de poliovirus inactivado.

Los poliovirus se pueden cultivar en cultivo celular. Un cultivo preferente utiliza una línea celular Vero, que es una línea celular continua derivada de riñón de mono. Las células Vero pueden ser de forma conveniente microportadores cultivados. El cultivo de células Vero antes y durante la inyección vírica puede implicar el uso de material derivado bovino tal como suero de ternero y de hidrolizado de lactalbúmina (por ejemplo, obtenida mediante

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degradación enzimática de lactalbúmina). Tal material derivado bovino debe obtenerse a partir de fuentes que están libres de EEB u otras EET. Preferentemente, los poliovirus se crecen en células cultivadas en un medio libre de componentes derivados de animales. Después de su crecimiento, pueden purificarse viriones usando técnicas tales como ultrafiltración, diafiltración y cromatografía. Antes de su administración a pacientes, los poliovirus deben inactivarse y esto puede lograrse mediante tratamiento con formaldehído antes de que los virus se usen en las composiciones inmunogénicas de la invención.

Los tres poliovirus se cultivan, purifican e inactivan individualmente y, a continuación, se combinan para proporcionar una mezcla para su uso en la invención.

Las poliovirus combinados pueden adsorberse sobre adyuvantes de aluminio.

Normalmente, la composición inmunogénica que comprende antígenos IPV está sustancialmente libre de conservantes de mercurio (por ejemplo, timerosal).

Las cantidades de antígenos IPV se expresa típicamente en la unidad "DU" (la unidad de antígeno D" [77]). Los antígenos IPV en las composiciones inmunogénicas de la invención están presentes normalmente en una cantidad que es capaz de suscitar una respuesta inmune cuando se administran. Idealmente, los antígenos IPV pueden suscitar una respuesta inmune protectora.

La vacuna combinada normalmente comprende entre 1-100 DU por tipo polioviral por dosis, por ejemplo, aproximadamente 40 DU de poliovirus de tipo 1, aproximadamente 8 DU de poliovirus de tipo 2 y aproximadamente 32 DU de poliovirus de tipo 3, pero es posible usar dosis inferiores que estas [78,79], por ejemplo, 10-20 DU para tipo 1, 2-4 DU para tipo 2 y 8-20 DU para tipo 3. Preferentemente, una vacuna combinada de la invención incluye una 'dosis baja' de un poliovirus. Para un poliovirus de tipo 1 esto significa que la concentración de virus en la composición es de 20 DU/ml, por ejemplo, <18, <16, <14, <12, <10, etc. Para un poliovirus de tipo 2 esto significa que la concentración de virus en la composición es de <4 DU/ml, por ejemplo, <3, <2, <1, <0.5, etc. Para un poliovirus de tipo 3 esto significa que la concentración de virus en la composición es de <16 DU/ml, por ejemplo, <14, <12, <10, <8, <6, etc. Cuando todos los tres tipos 1, 2 y 3 de poliovirus están presentes, los tres antígenos pueden estar presentes a una relación DU de 5:1:4 respectivamente o en cualquier relación adecuada, por ejemplo, una relación de 15:32:45 cuando se usan cepas Sabin [80]. Una dosis baja de antígeno de cepas Sabin es particularmente útil con <10 DU tipo 1, <20 DU tipo 2 y <30 Du tipo 3 (dosis unitaria, normalmente 0,5 ml).

Cuando se usa un componente IPV, los poliovirus se cultivan sobre células Vero, una composición de vacuna contiene preferentemente menos de 10 ng/ml, preferentemente <1 ng/ml, por ejemplo, <500 pg/ml o <50 pg/ml de ADN de célula Vero, por ejemplo, menos de 10 ng/ml de ADN de célula Vero que es >50 pares de bases de longitud.

Composiciones inmunogénicas específicas de la invención

Composiciones inmunogénicas de la invención específicamente previstas comprenden:

• (i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, (ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iv) un toxoide diftérico, (v) un toxoide tetánico, (vi) un antígeno acelular de la tosferina en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

• (i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, (ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iv) un toxoide diftérico, (v) un toxoide tetánico, (vi) una toxina de tosferina destoxificada (vii) hemaglutinina filamentosa y (viii) pertactina en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

• (i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, (ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iv) un toxoide diftérico, (v) un toxoide tetánico, (vi) un antígeno acelular de la tosferina y (vii) un antígeno de poliovirus inactivado en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

• (i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del (GBS) conjugado con una proteína transportadora, (ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iv) un toxoide diftérico, (v) un toxoide tetánico, (vi) toxina de la tosferina destoxificada, (vii) hemaglutinina filamentosa, (viii) pertactina y (ix) un antígeno de poliovirus inactivado en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

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• (i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo la del GBS conjugado con una proteína transportadora, (ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iv) un toxoide diftérico, (v) un toxoide tetánico, (vi) una toxina de tosferina destoxificada (vii) hemaglutinina filamentosa, (viii) pertactina, (ix) un antígeno de una cepa de poliovirus tipo 1, (x) un antígeno de una cepa de poliovirus tipo 2 y (xi) un antígeno de una cepa de poliovirus tipo 3 en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

• (i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora, (ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, (iv) un toxoide diftérico, (v) un toxoide tetánico, (vi) un antígeno acelular de la tosferina, (vii) un antígeno de una cepa de poliovirus tipo 1, (viii) un antígeno de una cepa de poliovirus tipo 2 y (ix) un antígeno de una cepa de poliovirus tipo 3 en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.

Normalmente, la proteína transportadora en el conjugado de GBS que comprende un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS, la proteína transportadora en el conjugado de GBS que comprende el sacárido capsular del serotipo Ib del GBS y la parte transportadora en el conjugado de GBS que comprende el sacárido capsular del serotipo III del GBS es CRM197.

Métodos y usos farmacéuticos

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden comprender un transportador farmacéuticamente aceptable. 'Portadores farmacéuticamente aceptables' típicos incluyen cualquier transportador que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos al individuo que recibe la composición. Transportadores adecuados son normalmente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticas, ácido poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa [81], trehalosa [82], lactosa y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas). Tales transportadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Las vacunas también pueden incluir diluyentes tales como agua, suero fisiológico, glicerol, etc. Adicionalmente, puede haber presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponadoras de pH y similares. El suelo fisiológico tamponado con fosfato, libre de pirógenos es un transportador típico. Una discusión exhaustiva de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 83.

Las composiciones de la invención pueden estar en forma acuosa (es decir, soluciones o suspensiones) o en una forma seca (por ejemplo, liofilizado). Si se usa una vacuna en seco, entonces, se reconstituirá en un medio líquido antes de su inyección. La liofilización de vacunas conjugadas es conocida en la técnica, por ejemplo, el producto de Menjugate™ se presente en forma liofilizada. Cuando las composiciones inmunogénicas de la invención incluyen conjugados que comprenden sacáridos capsulares de más de un serotipo de GBS, es normal que los conjugados se preparen de forma separada, se mezclen y, a continuación, se liofilicen. De este modo, pueden prepararse composiciones liofilizadas que comprenden dos, tres o cuatro, etc. conjugados tal como se describe en el presente documento.

Para estabilizar los conjugados durante la liofilización, pueden añadirse componentes no activos, por ejemplo, como estabilizantes antes del deshidratado por congelación. Estabilizantes preferentes para su inclusión son lactosa, sacarosa y manitol, así como mezclas de los mismos, por ejemplo, mezclas lactosa/sacarosa, mezclas sacarosa/manitol, etc. Una vacuna final obtenida mediante reconstitución acuosa del material liofilizado puede contener, de este modo, lactosa y/o sacarosa. Es preferente usar excipientes amorfos y/o tampones amorfos cuando se preparan las vacunas liofilizadas [84].

Puede preferirse incluir un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) y/o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa), por ejemplo, a entre 1 mg/ml y 30 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 25 mg/ml) en la composición. El uso de sacarosa se ha recomendado como estabilizante para vacunas conjugadas de GBS (ref. 85). Sin embargo, es típico para el estabilizador de la presente invención que sea manitol. Cuando la vacuna en seco se reconstituye en un medio líquido antes de su inyección, la concentración de manitol residual será normalmente de aproximadamente 2-20 mg/ml, por ejemplo, 3,75 mg/ml, 7,5 mg/ml o 15 mg/ml.

Las composiciones pueden presentarse en viales o pueden presentarse en jeringas ya cargadas. Las jeringas pueden suministrarse con o sin ajugas. La jeringa incluirá una única dosis de la composición, mientras que un vial puede incluir una única dosis o múltiples dosis.

Las composiciones de la invención se administran preferentemente a pacientes en dosis unitarias de 0,5 ml. Las referencias a dosis de 0,5 ml se entenderán que incluyen una varianza normal, por ejemplo 0,5 ml ± 0.05 ml. Para situaciones de multidosis, se extraerán múltiples cantidades de dosis y se envasarán juntas en un único recipiente, por ejemplo, 5 ml para un recipiente multidosis de 10 dosis (o 5,5 ml con un 10 % de sobrellenado).

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Las composiciones acuosas de la invención también son adecuadas para reconstituir otras vacunas desde una forma liofilizada. Cuando una composición de la invención va a usarse para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit, que puede comprender dos viales, o puede comprenden una jeringa ya cargada y un vial, con los contenidos de la jeringa siendo usados para reactivar el contenido del vial antes de su inyección.

Las vacunas también se pueden preparar en una forma en la que la vacuna puede prepararse extemporáneamente en el tiempo/punto de uso mezclando juntos dos componentes. Tales realizaciones de dos componentes incluyen mezclado líquido/líquido y mezclado líquido/sólido, por ejemplo, mezclando material acuoso con material liofilizado.

Por lo tanto, un kit útil para la invención comprende un primer componente que comprende conjugados del serotipo Ia, Ib y III del GBS; y un segundo componente que comprende uno o más antígenos seleccionados de: a) antígeno acelular de la tosferina, b) un toxoide tetánico, c) un toxoide diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado; en el que los dos componentes se encuentran en recipientes separados (por ejemplo, viales y/o jeringas) y en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados. Los conjugados de GBS en el primer componente pueden estar liofilizados. En algunas realizaciones, el primer componente no comprende un adyuvante. El segundo componente puede comprender antígenos acuosos. En algunas realizaciones, el segundo componente comprende un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante de sal de aluminio.

Otro kit útil de la invención puede comprender un primer componente que está libre de antígeno, de modo que todos los componentes antigénicos en la composición inmunogénica final se derivan del segundo componente. Por ejemplo, un kit puede comprender un primer componente que comprende antígenos acuosos que comprenden: (i) conjugados del serotipo Ia, Ib y III del GBS y (ii): a) antígeno acelular de tosferina, b) toxoide tetánico, c) toxoide diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados; y un segundo componente que comprende adyuvante acuoso. La composición inmunogénica de la invención puede prepararse mezclando el primer componente y el segundo componente.

La invención también proporciona un proceso para preparar la composición inmunogénica de la invención, que comprende mezclar un primer componente que comprende los conjugados del serotipo Ia, Ib y III del GBS y un segundo componente que comprende: a) antígeno acelular de la tosferina, b) un toxoide tetánico, c) un toxoide diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados. Los conjugados de GBS en el primer componente pueden estar liofilizados. El segundo componente puede comprender antígenos acuosos. El proceso puede comprender una etapa adicional de reconstitución de los conjugado de GBS liofilizados en el primer componente con los antígenos acuosos del segundo componente. El primer componente puede no comprender un adyuvante. El segundo componente puede comprender adyuvante, por ejemplo, un adyuvante de sal de aluminio.

Las composiciones de la invención pueden envasarse en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiple. Para formas de dosis múltiple, son preferentes viales con respecto a jeringas pre-cargadas. Los volúmenes de dosificación eficaces pueden establecerse de forma rutinaria, pero una dosis humana normal de la composición tiene un volumen de 0,5 ml, por ejemplo, para una inyección intramuscular.

El pH de la composición es preferentemente entre 6 y 8, preferentemente aproximadamente 7. Puede mantenerse un pH estable mediante el uso de un tampón. Composiciones acuosas administradas a un paciente pueden tener un pH entre 5,0 y 7,5, y más normalmente entre 5,0 y 6,0 para una estabilidad óptima, cuando hay presente un toxoide diftérico y/o toxoide tetánico, el pH es idealmente entre 6,0 y 7,0.

Las composiciones inmunogénicas de la invención comprenden normalmente un tampón fosfato de dihidrógeno potásico. El tampón fosfato de dihidrógeno potásico puede comprender aproximadamente 1-10 mM de fosfato de dihidrógeno potásico, por ejemplo 1,25 mM, 2,5 mM o 5,0 mM. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, es preferente usar un tampón de histidina [86]. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a humano.

Las composiciones de la invención son inmunogénicas y son más preferentemente composiciones de vacuna. Las vacunas según la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero serán normalmente profilácticas. Las vacunas profilácticas no garantizan la protección completa de una enfermedad porque incluso si el paciente desarrolla anticuerpos, puede existir un desfase o retraso antes de que el sistema inmune sea capaz de luchar contra la infección. Por lo tanto, y para evitar dudas, el término vacuna profiláctica también puede referirse a vacunas que mejoran los efectos de una futura infección, por ejemplo, reduciendo la gravedad o duración de tal una infección.

Las expresiones "protección contra la infección" y/o "proporcionar inmunidad protectora" significan que el sistema inmune de un sujeto ha sido preparado (por ejemplo, mediante vacunación) para desencadenar una respuesta inmune y repeler la infección. Particularmente, la respuesta inmune desencadenada es capaz de repeler la infección contra una cantidad de patógenos, tales como distintas cepas de bacterias. Un sujeto vacunado puede, por lo tanto, infectarse, pero es mejor capaz de repeler la infección que un sujeto de control. Composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno(s), así como otros componentes, según sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz' se refiere a que la administración de

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esa cantidad a un individuo, bien en una única dosis o como parte de una seria, es eficaz para el tratamiento o prevención. Comúnmente, el resultado deseado es la producción de una respuesta inmune específica a antígeno (por ejemplo, patógeno) que sea capaz de o contribuya a proteger el sujeto contra el patógeno. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y condición física del sujeto a tratar, edad, grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo en sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del doctor tratante de la situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad entre en un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse mediante ensayos rutinarios.

Las composiciones de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, bien como soluciones líquida o suspensiones. La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo final o un aerosol. La composición puede prepararse como un supositorio o un pesario. La composición puede prepararse para administración vía nasal, oral u ocular, por ejemplo, como aerosol, gotas, gel o polvo [por ejemplo, ref. 87 y 88]. Se ha informado sobre el éxito con la administración nasal de sacáridos neumocócicos [89,90], sacáridos Hib [91], sacáridos MenC [92] y mezclas de conjugados de sacáridos Hib y MenC [93].

Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasan en un formato de dosis múltiple.

Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes están generalmente a unos niveles bajos, por ejemplo, <0,01 %.

Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro sódico) para proporcionar tonicidad. Una concentración de 10+2 mg/ml de NaCl es normal. En algunas realizaciones, 'se puede usar una concentración de 4-10 mg/ml de NaCl, por ejemplo, 9,0, 7,0, 6,75 o 4,5 mg/ml.

Las composiciones tendrán generalmente una osmolaridad entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y entrarán más preferentemente en el intervalo de 280-320 mOsm/kg. Se ha informado previamente que la osmolaridad no tiene un impacto sobre el dolor causado por la vacunación [94] pero, sin embargo, es preferente mantener la osmolaridad en este intervalo.

Las composiciones de la invención incluirán generalmente un tampón. En normal un tampón fosfato.

Las composiciones de la invención pueden administrarse junto con otros agentes inmunoreguladores. En particular, las composiciones pueden incluir uno o más adyuvantes. Tales adyuvantes incluyen, aunque no están limitados a:

A. Composiciones que contienen minerales

Composiciones que contienen minerales adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de los mismos). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" descritas en la ref. 95). Sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., tomando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo, cristalina, amorfa, etc.). Es preferente la adsorción de estas sales. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal de metal [96].

Pueden usarse los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan únicamente por comodidad, ni tampoco son una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase capítulo 9 de la referencia 97). La invención puede usar cualquiera de los adyuvantes de "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son normalmente sales de oxihidróxido de aluminio, que son normalmente al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son normalmente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Pueden obtenerse mediante precipitación y las condiciones de reacción y concentraciones durante precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal.

Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en microfotografías electrónicas de transmisión) es normal para adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pl de adyuvantes de hidróxido de aluminio es normalmente de aproximadamente 11, es decir, el adyuvante mismo tiene una carga de superficie positiva a un pH fisiológico. Se ha informado de capacidades adsorptivas en el intervalo 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a un pH 7,4 para adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de alumino generalmente tienen una relación molar de PO4/Al entre 0,3 y 1,2 preferentemente entre 0,8 y 1,2 y más preferentemente de 0,95 + 0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante normal es hidroxifosfato de aluminio amorgo con una relación molar PO^Al entre 0,84 y 0,92 incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. El fosfato de alumino será generalmente particulado (por ejemplo, morfología similar a placa como se ha observado en micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros normales de las partículas se encuentran en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo,

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aproximadamente 5-10 pm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se ha informado de capacidades adsorptivas en el intervalo 0,7-1,5 mg de proteína por mg de Al+++ a un pH 7,4 para adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PCC) de fosfato de alumino está inversamente relacionado con el grado de sustitución de fosfato para hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar dependiendo de las condiciones de reacción y concentración de reactivos usados para preparar la sal mediante precipitación. El PCC también se altera cambiando las concentraciones de iones de fosfato libre en la solución (más fosfato = más PCC acídico) o añadiendo un tampón como un tampón de histidina (hace el PCC más básico). Los fosfatos de aluminio usado según la invención tendrán generalmente un PCC entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, aproximadamente 5,7.

Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar composiciones de la invención pueden contener un tampón (por ejemplo, un tampón de fosfato o histidina o Tris), pero no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y/o libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones de fosfato acuoso libre, por ejemplo, presente a una concentración entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM y más preferentemente de aproximadamente 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro sódico.

La invención puede usar una mezcla de tanto un hidróxido de aluminio como un fosfato de aluminio. En este caso puede haber más fosfato de aluminio que de hidróxido, por ejemplo, una relación de peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para su administración a un paciente es preferentemente inferior a 10 mg/ml, por ejemplo, <5 mg/ml, <4 mg/ml, <3 mg/ml, <2 mg/ml, <1 mg/ml, etc. Un intervalo preferente está entre 0,3 y 1 mg/ml. Un máximo de 0,85 mg/dosis es preferente.

Un adyuvante normal de adyuvante de fosfato de aluminio es hidroxifosfato de aluminio amorgo con una relación molar PO^Al entre 0,84 y 0,92 incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. Puede usarse adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio, por ejemplo, entre 50 y 100 pg Al3+ por conjugado por dosis.

B. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de ref. 97]

También se pueden usar formulaciones de saponina como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glicósidos de esterol y glicósidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies de plantas. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se han estudiado ampliamente como adyuvantes. La saponina también puede obtenerse comercialmente a partir de Smilax ornata (sarsaparilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (raíz de planta del jabón). Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lípidas, tales como ISCOM.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado las fracciones purificadas específicas que usan estas técnicas, que incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Se describe un método de producción de WS21 en la ref. 98. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [99].

Pueden usarse combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimuladores (ISCOM) [capítulo 23 de la ref. 97]. Los ISCOM normalmente también incluye un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidcolina. Puede usarse cualquier saponina conocida en los ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las ref. 99-101. Opcionalmente, los ISCOM pueden estar desprovistos de detergente(s) adicional(es) [102].

Puede encontrarse una revisión del desarrollo de adyuvantes a base de saponina en las ref. 103 y 104.

C. Virosomas y partículas tipo virus

Los virosomas y partículas tipo virus (PTV) también pueden usarse como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas a partir de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Son normalmente no patogénicos, no replicativos y generalmente no contienen ninguno del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse recombinantemente o aislarse de los virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o PTV incluyen proteínas derivadas de virus de la gripe (tal como HA o NA), virus de la Hepatitis B (tal como proteínas de núcleo o de la cápside), virus de la Hepatitis E, virus del sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, Qp-fago (tal como proteínas de cápside), fago de AG, fago rf, fago de AP205 y Ty (tal como retrotransposón Ty de proteína p1). Las PTV se describen adicionalmente en las ref. 105-110. Los virosomas se describen adicionalmente en, por ejemplo, la ref. 111

D. Derivados bacterianos o microbianos

Adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como

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oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxina de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de los mismos. Oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de oligonucleótidos que contienen un motivo de CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada enlazada por un enlace de fosfato a una guanosina). ARN bicatenarios y oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también han mostrado ser inmunoestimulantes.

El CpG puede incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 112, 113 y 114 describen posibles sustituciones análogas, por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2'-deoxi-7-deazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos de CpG se describe adicionalmente en las ref. 115-120.

La secuencia de CpG puede dirigirse a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [121]. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de Th1, tal como un ODN de CpG-A o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN de CpG-B. ODN de CpG-A y CpG-B se describen en las ref. 122-124. Preferentemente, el CpG es un ODN de CpG-A.

Preferentemente el oligonucleótido de CpG está construido de modo que el extremo 5' es accesible para el reconocimiento de receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos de CpG pueden unirse en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véase, por ejemplo. ref. 121 y 125-127.

Las toxinas de ribosilación de ADP bacterianas y derivados destoxificados de los mismos pueden usarse como adyuvantes en la invención. Preferentemente la proteína se deriva de E.coli (enterotoxina lábil al calor de E.coli "LT'), cólera ("CT") o tosferina ("PT"). El uso de toxinas de ribosilación de ADP como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 128 y como adyuvantes parenterales en la ref. 129. La toxina o toxoide se encuentra preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende subunidades tanto A como B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación detoxificante; preferentemente la subunidad B no está mutada. Preferentemente el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas de ribosilación de ADP y derivados destoxificados de los mismos, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes se puede encontrar en las ref. 130-137. La referencia numérica para sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas de ribosilación de ADP que se indican en la ref. 138.

E. Inmunomoduladores humanos

Inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, L-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [139], etc.) [140], interferones (por ejemplo, interferon-Y), factor estimulante de colonia de macrófagos y factor de necrosis tumoral.

F. Bioadhesivos y mucoadhesivos

También se pueden usar bioadhesivos y mucoadhesivos como adyuvantes en la invención. Bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificadas [141] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de ácido poliacrílico, alcohol de polivinilo, pirolidona de polivinilo, polisacáridos y carboximetilcelulosa. También se puede usar kitosán y derivados del mismo como adyuvantes en la invención [142].

G. Micropartículas

También se pueden usar micropartículas como adyuvantes en la invención. Son preferentes micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a —150 mm de diámetro, más preferentemente de ~200 nm a ~30 pm de diámetro, y más preferentemente de —500 nm a —10 pm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradames y no tóxicos (por ejemplo, un ácido poli(a-hidroxi), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc), con poli(lactido-co-glicolido), tratadas opcionalmente para que tengan una superficie negativamente cargada (por ejemplo, con SDS) o una superficie positivamente cargada (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

H. Liposomas (Capítulos 13 y 14 de la ref. 97)

Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las ref. 143-145.

I. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [146]. Tales formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de éster de sorbitán de polioxietileno en combinación con un octoxinol [147] así como éteres de alquilo de polioxietileno o tensioactivos de éster en combinación con al menos un tensioactivo adicional no iónico tal como un octoxinol [148]. Éteres de polioxietileno preferentes se seleccionan del siguiente grupo: éter de polioxietileno-9-laurilo (laureth 9), éter de polioxietileno-9-esteorilo, éster de polioxietileno-8-esteorilo, éter de polioxietileno-4-laurilo, éter de polioxietileno-35-laurilo y éter de polioxietileno-23- laurilo.

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J. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones PCPP se describen, por ejemplo, en las refs. 149 y 150.

K. Péptidos de muramilo

Ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil- muramil-L-treonil-D-isoglutamina

(thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no-MDP) y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L- alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina

MTP-PE).

L. Compuestos de imidazoquinolona.

Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo “Resiquimod 3M”, descritos con más detalles en las ref. 151 y 152.

M. Compuestos de tiosemicarbazona

Ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, así como métodos de formulación, fabricación y detección para compuestos todos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen aquellos descritos en la ref. 153. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

N. Compuestos de triptantrina.

Ejemplos de compuestos de triptantrina, así como métodos de formulación, fabricación y detección para compuestos todos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen aquellos descritos en la ref. 154. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes descritos anteriormente.

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimuladores se describen en el capítulo 7 de la ref. 97.

El uso de adyuvantes de sal de aluminio es particularmente preferente y los antígenos se adsorben generalmente en tales sales. Es posible en composiciones de la invención adsorber algunos antígenos en un hidróxido de aluminio, pero tener otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. En general, sin embargo, es preferente usar solo una única sal, por ejemplo, un hidróxido o un fosfato, pero no ambos. No todos los conjugados necesitar adsorberse, es decir, algunos o todos pueden estar libres en solución.

Métodos de tratamiento

La descripción también proporciona un método para suscitar una respuesta inmune en un mamífero, que comprende la administración de una composición farmacéutica según la invención a un mamífero. La respuesta inmune es preferentemente protectora e involucra preferentemente anticuerpos. El método puede suscitar una respuesta de refuerzo. Las composiciones de la invención se administran preferentemente a pacientes en dosis de 0,5 ml (tal como se ha comentado anteriormente).

El mamífero es preferentemente un humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un bebé, particularmente un neonato) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferentemente un adulto. La vacuna destinada para niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Una clase preferente de humanos para su tratamiento son mujeres de edad fértil (por ejemplo, adolescentes y más mayores). Otra clase preferente son mujeres embarazadas. Pacientes mayores (por ejemplos, los que superan los 50, 60, 70, 80 o 90 etc. años de edad, particularmente por encima de los 65 años de edad), especialmente los que viven en residencias de ancianos donde el riesgo de infección por GBS puede verse aumentado ([155]) son otra clase preferente de humanos para su tratamiento.

En algunos casos, el paciente ha sido pre-inmunizado con un toxoide diftérico o un derivado del mismo. En otros casos, el paciendo ha sido pre-inmunizado con un toxoide tetánico o un derivado del mismo.

La descripción también proporciona una composición de la invención para su uso como un medicamento. El medicamento es preferentemente capaz de suscitar una respuesta inmune a un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es más preferentemente una vacuna.

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La descripción también proporciona el uso de una composición de la invención en la fabricación de un medicamento para suscitar una respuesta inmune en un mamífero.

Estos usos y métodos son preferentemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por el Streptococcus agalactiae y una o más de Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis y Poliovirus. Una enfermedad causada por el S.agalactiae puede ser la sepsis neonatal o bacteriemia, neumonía neonatal, meningitis neonatal, endometritis, osteomielitis, artritis séptica, etc. La C.diphtheria puede causar difteria; el C.tetani puede causar tétano; el B.pertussis puede causar tosferina y el Poliovirus puede causar polio.

El sujeto en el cual se previene la enfermedad puede que no sea el mismo que el sujeto que recibe la composición inmunogénica de la invención. Por ejemplo, puede administrarse una composición inmunogénica a una mujer (antes o durante el embarazo) para proteger la descendencia (denominado 'inmunización materna' [156-158]). La inmunización de la mujer embarazada proporciona inmunidad mediada por anticuerpos al bebé mediante inmunidad material pasiva. La inmunidad pasiva se produce de forma natural cuando los anticuerpos maternos se transfieren al feto a través de la placenta. La inmunidad pasiva resulta especialmente importante para los bebés puesto que nacen sin ninguna inmunidad activamente adquirida. La administración de las composiciones de la invención a una mujer embarazada mejora la inmunidad en la mujer y los anticuerpos se pasan al neonato a través de la placenta, confiriéndole una inmunidad maternal pasiva al bebé. Sin embargo, la inmunidad pasiva en bebés es solo temporal y empieza a disminuir después de las primeras semanas o meses de vida. Puesto que la inmunidad pasiva es solo temporal puede ser importante para el bebé recibir la administración de una composición de la invención para inducir inmunidad activa al bebé, antes de que la inmunidad pasiva disminuya. La administración de una segunda composición inmunogénica al bebé tras su nacimiento induce inmunidad activa al bebé y extiende la inmunidad pasada desde la madre durante su embarazo.

Tal como se usa en el presente documento, un bebé es un individuo por debajo de un año de edad (por ejemplo, inferior a un día de edad, 1 semana de edad, 2 semanas de edad, 3 semanas de edad, 4 semanas de edad, 2 meses de edad, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses de edad, 9 meses de edad, 10 meses de edad, 11 meses de edad, inferior a 12 meses de edad).

Se puede administrar a la mujer embarazada la composición de la invención en cualquier momento durante su embarazo. Por ejemplo, la composición puede administrarse a la mujer durante el primer, segundo o tercer trimestre de su embarazo. En algunos casos, la composición se administra a la mujer durante las últimas 6-12 semanas de embarazo (por ejemplo, 28 semanas de gestación, 29 semanas de gestación, 30 semanas de gestación, 31 semanas de gestación, 32 semanas de gestación, 33 semanas de gestación, 34 semanas de gestación, 35 semanas de gestación, 36 semanas de gestación, 37 semanas de gestación, 38 semanas de gestación, 39 semanas de gestación). Particularmente, la composición puede administrarse a la mujer embarazada al menos cuatro semanas antes del parto del bebé. En algunos casos, se administra un régimen de una dosis a la mujer embarazada entre las semanas 32 y 36 de gestación. En otros casos, se administra un régimen de dos dosis a la mujer embarazada, administrándose la primera dosis aproximadamente a las 32 semanas de gestación y administrándose la segunda dosis aproximadamente a las 36 semanas de gestación.

Se puede administrar al bebé la composición en cualquier momento durante su primer año de vida y posteriormente si se desea. Generalmente, la composición se administrará al bebé, una, dos, tres, cuatro o más veces durante el primer año de vida. Por ejemplo, la composición de la invención puede administrarse al bebé una o más veces seleccionadas desde el nacimiento, a las 2 semanas de edad, 4 semanas de edad, 6 semanas de edad, 2 meses de edad, 3 meses de edad, 4 meses de edad, 6 meses de edad, 9 meses de edad y 12 meses de edad. Particularmente, la composición de la invención se administra al bebé en el momento antes de que los anticuerpos maternos hayan disminuidos a títulos no protectores. Las administraciones posteriores pueden producirse en cualquier programación deseada.

También se desvela un método de protección de un bebé frente a una enfermedad causada por Streptococcus agalactiae y una o más de Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis y Poliovirus que comprende las etapas de (a) administrar una composición de la invención a una mujer durante su embarazo con dicho bebé; y (b) administrar opcionalmente una composición de la invención al bebé que ha nacido del embarazo.

Por lo tanto, también se describe un método de protección de un bebé frente a una enfermedad causada por S.agalactiae y una o más de difteria, tétano, tosferina y polio que comprende las etapas de (a) administrar una composición de la invención a una mujer durante su embarazado con dicho bebé; y (b) administrar opcionalmente una composición de la invención al bebé que ha nacido del embarazo.

Composiciones preferentes de la invención que pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que es superior al criterio de seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujeto humanos. Antígenos con un título de antígenos asociado por encima del cual se considera que un huésped está seroconvertido frente el antígeno son bien conocidos y tales títulos se publican por organizaciones tales como la OMS. Preferentemente más del 80 % de una muestra estadísticamente significante de sujetos está seroconvertida, más preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 93 % y lo más preferentemente del 96-100 %.

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Las composiciones de la invención se administrarán generalmente directamente a un paciente. La administración directa puede conseguirse mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o al especio intersticial de un tejido) o por vía rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auricular, pulmonar u otra administración por mucosa. Es preferente la administración intramuscular al muslo o parte superior del brazo. La inyección puede mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica) pero de modo alternativo puede usarse una inyección sin aguja. Una dosis normal intramuscular es de 0,5 ml.

La invención puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o de la mucosa.

Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse en una única o en múltiples dosis. La administración de una única dosis es preferente en la invención. De modo alternativo, una dosis unitaria adicional seguida por una primera dosis unitaria puede ser eficaz. Normalmente, la segunda (o tercera, cuarta, quinta, etc.) dosis unitaria es idéntica a la primera dosis unitaria. Normalmente, las composiciones inmunogénicas de la invención se administran en tres dosis unitarias. Normalmente, las composiciones inmunogénicas de la invención se administrarán por vía intramuscular, por ejemplo, administración intramuscular al muslo o a la parte superior del brazo.

Puede usarse múltiples dosis en una programación de inmunización primaria y/o en una programación de inmunización de refuerzo. Una programación de dosificación primaria puede ser seguida por una programación de dosificación de refuerzo. El tiempo adecuado entre las dosis de sensibilización (por ejemplo, entre 4-16 semanas) y entre la sensibilización y el refuerzo, puede determinarse de forma rutinaria.

Para tener una eficacia total, una programación de inmunización primaria normal (particularmente para un niño) puede implicar la administración de más de una dosis. Por ejemplo, las dosis pueden ser a los: 0 y 6 meses (siendo el tiempo 0 la primera dosis); a los 0, 1, 2 y 6 meses; al día 0, día 21 y posteriormente una tercera dosis entre los 6 y 12 meses; a los 2, 4 y 6 meses; a los 3, 4 y 5 meses; a las 6, 10 y 14 semanas; a los 2, 3 y 4 meses o a los 0, 1, 2, 6 y 12 meses. Las composiciones pediátricas también pueden usarse como dosis de refuerzo, por ejemplo, para niños, en el segundo año de vida.

Las composiciones también pueden usarse como dosis de refuerzo, por ejemplo, para niños en el segundo año de vida. Las composiciones de vacuna de refuerzo para adolescentes de la invención se administran en una única dosis a persones de 10 años de edad y más mayores. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden administrarse como una vacuna de refuerzo a un paciente que ha sido previamente vacunado contra tanto difteria como tétano y también preferentemente contra la tosferina. Estos pacientes pueden distinguirse de la población general por tener una respuesta de memoria inmunológica frente a la vacuna previa. Los pacientes pueden haber recibido sus vacunas de difteria y/o tétano más recientes al menos cinco años antes de recibir la vacuna de la invención. Los pacientes que reciben las vacunas pueden tener una edad entre 4 y 65 años de edad, por ejemplo 11-64 años, 10-18 años, etc.

Puede usarse cualquier vía adecuada de administración. Por ejemplo, una composición puede administrarse vía intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica o intradérmica. Si se desea, la composición puede administrarse a través de una vía de la intramucosa tal como vía intra-oral, intra-nasal, intra-vaginal e intra-rectal. La administración a la mujer embarazada y el bebé puede ser a través de la misma vía o distintas vías. Las composiciones de la invención pueden administrarse mediante inyección intramuscular, por ejemplo, en el brazo o la pierna.

Las vacunas producidas por la invención pueden administrarse a pacientes al mismo tiempo como una vacuna separada, por ejemplo, al mismo tiempo que una vacuna conjugada neumocócica tal como PREVNAR™, al mismo tiempo que una vacuna de la gripe, al mismo tiempo que una vacuna del rotavirus, al mismo tiempo que una vacuna SPR, etc.

Cuando las composiciones de la invención incluyen un adyuvante a base de aluminio, puede producirse el asentamiento de los componentes durante su almacenamiento. Por lo tanto, la composición debe agitarse antes de ser administrada al paciente. La composición agitada será una suspensión de color blanco turbio.

General

La expresión "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X + Y.

El término "que consiste en" significa "que consiste solo en". Una composición "que consiste en X" puede no incluir ningún otro componente. Una composición "que consiste esencialmente en X" puede no incluir ningún otro componente activo. El término "que consiste esencialmente en" significa que la composición, método o estructura puede incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero solo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran significativamente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicado.

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El término "aproximadamente" con respecto a un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10 %.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente libre" de Y puede estar completamente libre de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

Se apreciará que pueden existir anillos de azúcar en forma abierta y cerrada y que, mientras que las formas cerradas se muestran en la fórmula estructural del presente documento, las formas abiertas también quedan abarcadas por la invención. De forma similar, se apreciará que pueden existir azúcares en formas de piranosa y furanosa y que, mientras que se muestran las formas de piranosa en la fórmula estructural del presente documento, las formas de furanosa también quedan abarcadas. También quedan abarcadas distintas formas anoméricas de azúcares.

A menos que se indique específicamente, un proceso que comprende una etapa de mezcla de dos o más componentes no requiere ningún orden específico en su mezcla. Por lo tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces pueden combinarse dos componentes entre sí y entonces la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.

Los anticuerpos serán generalmente específicos para su diana. Por lo tanto, tendrán una afinidad superior para su diana que para una proteína de control irrelevante, tal como albúmina de suero bovino.

El término "aproximadamente" con respecto a un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10 %.

Cuando un componente se describe como ser "adsorbido" en un adyuvante, es preferente que al menos el 50 % (en peso) del antígeno sea adsorbido, por ejemplo, el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 % o más. Si un componente se adsorbe totalmente entonces ninguno debe ser detectable en el sobrenadante de una composición tras su centrifugación.

A menos que se indique específicamente, un proceso que comprende una etapa de mezcla de dos o más componentes no requiere ningún orden específico en su mezcla. Por lo tanto, los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Cuando hay tres componentes, entonces pueden combinarse dos componentes entre sí y entonces la combinación puede combinarse con el tercer componente, etc.

Las cantidades de conjugados se proporcionan generalmente en términos de masa de sacárido (es decir, la dosis del conjugado (transportador + sacárido) como un todo es superior que la dosis indicada) para evitar la variación debido a la elección del transportador.

Grupos que contienen fósforo empleados con la invención pueden existir en un número de formas protonadas y desprotonadas dependiendo del pH del entorno circundante, por ejemplo, el pH del disolvente en el que se disuelven. Por lo tanto, aunque puede ilustrarse en el presente documento una forma particular, se prevé, a menos que se mencione lo contrario, que estas ilustraciones sean meramente representativas y no se limiten a una forma protonada o desprotonada. Por ejemplo, en el caso de un grupo fosfato, este puede ilustrarse como -OP(O)(OH)2 pero la definición incluye las formas protonadas -[OP(O)(OH2)(OH)]+ y -[OP(O)(OH2)2]2+ que pueden existir en condiciones acídicas y las formas desprotonadas -[OP(O)(OH)(O)]- y [OP(O)(O)2]2" que pueden existir en condiciones básicas. La invención abarca todas tales formas.

Cuando se administra un compuesto al cuerpo como parte de una composición entonces ese compuesto puede reemplazarse de forma alternativa mediante un profármaco adecuado.

Cuando se usan materiales animales (y particularmente bovinos) en el cultivo de células, deben obtenerse a partir de fuentes que están libres de encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) y en particular libres de encefalopatía espongiforme bovina (EEB).

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra títulos de lgG frente a (A) la de GBS, (B) lb de GBS y (C) III de GBS en los grupos de ratón descritos en la Tabla 1. Se agrupó suero para todos los ratones en los grupos 5 y 6. Los títulos de GMT se indican por la barra central. Las barras superiores e inferiores indican el 95 % de intervalos de confianza.

La Figura 2 muestra títulos de lgG frente a (A) Toxoide diftérico, (B) Toxoide tetánico, (C) Toxoide de tosferina, (D) FHA de tosferina y (E) 69K de tosferina en grupos de ratones descritos en la Tabla 1. La significancia estadística se indica por * (p<0,05). Los títulos de GMT se indican por la barra central. Las barras superiores e inferiores indican el 95 % de intervalos de confianza.

La Figura 3 muestra títulos de OPK frente a (A) la de GBS, (B) lb de GBS y (C) III de GBS en los grupos de ratón descritos en la Tabla 1. Se agrupó suero de todos los ratones en cada grupo (excepto para los grupos 5 y 6) para cada experimento (experimento repetido dos veces). Se agrupó suero de ambos experimentos para cada uno de los grupos 5 y 6. Los títulos de GMT se indican por la barra central.

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La Figura 4 muestra títulos de IgG frente a (A) la de GBS, (B) Ib de GBS y (C) III de GBS en grupos de ratón descritos en la Tabla 3. La significancia estadística se indica por * (p<0,05). Los títulos de GMT se indican por la barra central. Las barras superiores e inferiores indican el 95 % de intervalos de confianza.

La Figura 5 muestra títulos de lgG frente a (A) Toxoide diftérico, (B) Toxoide tetánico, (C) Toxoide de tosferina, (D) FHA de tosferina y (E) 69K de tosferina en grupos de ratones descritos en la Tabla 3. La significancia estadística se indica por **(< 0,01) y * (p<0,05). Los títulos de GMT se indican por la barra central. Las barras superiores e inferiores indican el 95 % de intervalos de confianza.

La Figura 6 muestra títulos de OPK frente a (A) la de GBS, (B) lb de GBS y (C) III de GBS en grupos de ratón descritos en la Tabla 3. Se agrupó suero de todos los ratones en cada grupo para cada experimento. Los títulos de GMT se indican por la barra central.

La Figura 7 muestra títulos de lgG frente a (A) la de GBS, (B) lb de GBS y (C) III de GBS en grupos de ratón descritos en la Tabla 5. Se agrupó suero para los grupos 5, 6 y 7. La significancia estadística se indica por *** (p<0,01). Los títulos de GMT se indican por la barra central. Las barras superiores e inferiores indican el 95 % de intervalos de confianza.

La Figura 8 muestra títulos de lgG frente a (A) Toxoide tetánico y (B) Toxoide diftérico en grupos de ratón descritos en la Tabla 5. La significancia estadística se indica por * (p<0,05). Los títulos de GMT se indican por la barra central. Las barras superiores e inferiores indican el 95 % de intervalos de confianza.

La Figura 9 muestra títulos de OPK frente a (A) la de GBS, (B) lb de GBS y (C) III de GBS en grupos de ratón descritos en la Tabla 5. Se agrupó suero de todos los ratones en cada grupo para cada experimento. Los títulos de GMT se indican por la barra central.

Modos para llevar a cabo la invención

Materiales y métodos Vacunas

La vacuna trivalente de GBS utilizada en los siguientes experimentos está compuesta de polisacáridos capsulares derivados de tres serotipos principales: Ia, Ib y III cada uno conjugado con CRM197. La vacuna de TdaP(H4) contiene adyuvante de hidróxido de aluminio y contiene toxoide tetánico, toxoide diftérico y antígenos acelulares de tosferina (PT, FHA y 69K).

La vacuna TdaP(H4)-IPV contiene adyuvante de hidróxido de aluminio y contiene toxoide tetánico, toxoide diftérico y antígenos acelulares de tosferina (PT, FHA y 69K) y antígenos de Polio (IPV1, IPV2 y IPV3).

Se utilizaron vacunas líquidas disponibles en el mercado de Tétano y Tétano/Difteria.

ELISA

Se midieron títulos de lgG contra polisacáridos de GBS de Ia, Ib y III en suero de ratones inmunizados mediante ELISA tal como se ha explicado en la referencia 159. Generalmente, hay una buena correlación entre Abs de lgG ELISA y títulos OPK.

Ensayo de eliminación opsonofagocítica (OPK)

Un enfoque viable para evaluar la eficacia de una vacuna es utilizar un sustituto de protección que en el caso de los GBS es la actividad opsonizante del anticuerpo de suero. El ensayo de eliminación opsonofagocítica mide la capacidad de anticuerpos de suero en opsonizar GBS para eliminar mediante células efectoras en presencia de un complemento. Los ensayos de OPS para medir la actividad funcional de anticuerpos provocados en ratones inmunizados contra polisacáridos de gBs de la, lb y III se realizaron utilizando HL-60, una línea celular de leucemia pro-mielocítica obtenida a partir de la Colección de Cultivos Tipo de EE.UU. (ATCC, CCL-240). Se usaron las cepas GBS 515, GBS H36b y GBS COH1 para medir la eliminación de aislados de serotipo Ia, Ib y III, respectivamente. Se realizaron reacciones de control negativo bien en presencia de complemento inactivado de calor o en ausencia de anticuerpos o células efectoras, o utilizando sueros pre-inmunes o placebo. Las reacciones se incubaron en placa de agar de soja tríptico y se determinaron los recuentos bacterianos. El porcentaje de eliminación se calculó como (UFC medio en T0 - UFC medio en T60)/(UFC medio en T0). Se expresaron los títulos de OPK como la disolución de suero recíproca que lleva al 50 % de eliminación de bacterias. El ensayo de OPK se realizó según el protocolo de ensayo a base de eliminación de opsonofagocitosis descrito en la referencia 160.

Ensayo multiplex a base de Luminex

Se utilizó un ensayo multiplex a base de Luminex para la cuantificación de lgG de antígenos de tétano, difteria y tosferina. El toxoide diftérico (TD), toxoide tetánico (TT) y toxoide de tosferina (PT), antígenos de FHA de tosferina y 69K de tosferina se conjugaron covalentemente cada uno a microesferas (Luminex Corporation, Austin, TX). Se

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analizaron muestras de suero de ratón para evaluar los títulos de anticuerpo específicos a cada antígeno. Se realizaron experimentos en duplicado y se ponderaron los valores a partir de los duplicados. Se preparó un suero de referencia agrupando suero de ratón CD1 inmunizado con antígenos de TdaP + Alum.

Estudio 1: GBS reconstituidos en TdaP y TdAP-IPV

Este estudio investigó la inmunogenicidad de vacunas trivalentes de GBS liofilizadas (polisacáridos la, lb, III conjugados a CRM197) reconstituidas con: (i) Vacuna líquida con adyuvante de Alum que contiene antígenos de tétano, difteria y acelulares de tosferina (TdaP) y (ii) vacuna líquida con adyuvante de Alum que contiene antígenos de tétano, difteria, acelulares de tosferina y de Polio (TdaP-IPV).

El protocolo de inmunización se comenta en la Tabla 1 y se repitió dos veces. En cada experimento, se inmunizaron 8 ratones hembra CD1 intraperitonealmente en los días 0 y 21 con 2 dosis de vacunas que se muestran en la Tabla 1 y se purgaron los días 0 y 35.

Tabla 1. Protocolo de inmunización para el estudio 1.

Grupo n.°

Tipo de vacuna

Composición de vacuna

Vía de volumen

Dosis de antígenos

Dosis de adyuvante

N.° de ratones

PSIa-CRM 5 |jg/ml

PSIb-CRM 5 jg/ml

PSIa-CRM 1 jg

PSIII-CRM 5 jg/ml

PSIb-CRM 1 jg

T 10 Lf/ml

PSIII-CRM 1 jg

GBS + TdaP(H4)

D 8 Lf/ml

i.p. 200 jl

T 2 Lf

400 jg de Alum

PT 8 jg/ml

D 1,6 Lf

FHA 8 jg/ml

PT 1,6 jg

69K 16 jg/ml

FHA 1,6 jg

Alum 2 mg/ml

69K 3,2 jg

PSIa-CRM 5 jg/ml

PSIb-CRM 5 jg/ml

PSIa-CRM 1 jg

PSIII-CRM 5 jg/ml

PSIb-CRM 1 jg

T 10 Lf/ml

PSIII-CRM 1 jg

D 8 Lf/ml

T 2 Lf

GBS + TdaP(H4)-IPV

PT 8 jg/ml

FHA 8 jg/ml

i.p. 200 jl

D 1,6 Lf

PT 1,6 jg

400 jg de Alum

69K 16 jg/ml

FHA 1,6 jg

IPV1 80 dU/ml

69K 3,2 jg

IPV2 16 dU/ml

IPV1 16 dU

IPV3 64 dU/ml

IPV2 3,2 dU

Alum 2 mg/ml

IPV3 12,8 dU

PSIa-CRM 5 jg/ml

GBS solo

PSIb-CRM 5 jg/ml

PSIII-CRM 5 jg/ml

i.p. 200 jl

PSIa-CRM 1 jg

PSIb-CRM 1 jg

400 ug de Alum

Alum 2 mg/ml

PSIII-CRM 1 jg

PSIa-CRM 5 jg/ml

GBS solo

PSIb-CRM 5 jg/ml

PSIII-CRM 5 jg/ml

i.p. 200 jl

PSIa-CRM 1 jg

PSIb-CRM 1 jg

400 jg de Alum

Alum 2 mg/ml

PSIII-CRM 1 jg

Sin antígenos

Alum 2 mg/ml

i.p. 200 jl

400 jg de

1

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2

8

3

8

4

8

5

8

Grupo n.°

Tipo de vacuna Composición de vacuna Vía de volumen Dosis de antígenos Dosis de adyuvante N.° de ratones

Alum

T 10 Lf/ml

D 8 Lf/ml T2 Lf

PT 8 |jg/ml D 1,6 Lf

FHA 8 jg/ml PT 1,6 jg 400 jg de Alum

6

TdaP(H4)-IPV 69K 16 jg/ml i.p. 200 jl FHA 1,6 jg 8

IPV1 80 dU/ml 69K 3,2 jg

IPV2 16 dU/ml IPV1 16 dU

IPV3 64 dU/ml IPV2 3,2 dU

Alum 2 mg/ml IPV3 12,8 dU

El suero de los ratones inmunizados se analizó para determinar la presencia de anticuerpos de IgG frente a cada antígeno específico de serotipo de GBS (tipos la, Ib y III) mediante ELISA. Los anticuerpos frente a toxoide tetánico (TT), toxoide diftérico (DT) y antígenos acelulares de tosferina (PT, FHA y 69K) se cuantificaron mediante ensayo de 5 Luminex. La actividad funcional de los anticuerpos frente a antígenos de GBS se evaluó mediante ensayo de eliminación opsonofagocítica (OPK).

Las Figuras 1 y 2 muestran los títulos lgG frente a los diversos antígenos de los seis grupos de ratones sometidos a ensayo en el estudio 1 (resultados fusionados a partir de 8 + 8 ratones de los dos experimentos). Los títulos de GMT se indican en la Tabla 2 a continuación.

10 Tabla 2: Títulos lgG de suero de GMT después de 2 inmunizaciones en ratones sometidos a ensayo en el estudio 1.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6

Ia de GBS

112 97 87 82 13 13

Ib de GBS

561 97 229 185 13 13

III de GBS

683 537 625 762 13 13

DT

187,55 48,94 N/E N/E <LLOQ 89,95

TT

560,67 268,97 N/E N/E <LLOQ 626,72

PT

280,43 121,10 N/E N/E 2,10 232,60

FHA

789,00 450,81 N/E N/E <LLOQ 749,95

69K

789,0 450,8 N/E N/E <LLOQ 88,6

<LLOQ = por debajo del límite de cuantificación

En general, toda la formulación de vacuna proporcionó inmunogenicidad que fue comparable con el control y no se observó ninguna interferencia inmunológica significante. Para los títulos lgG tras la 2a inmunización frente a la, lb y III de GBS, no se detectaron diferencias significantes en respuestas de lg mediante el ensayo U de Mann-Whitney 15 entre los grupos de vacuna para cualquiera de los serotipos, lo que indica una ausencia de interferencia. Para los títulos lgG tras la 2a inmunización frente a DT, TT, PT, FHA y 69K, GBS + TDaP provocó aproximadamente 2 veces superiores de títulos de GMT que GBS + TDaP + IPV (P<0,05 mediante ensayo U de Mann-Whitney, lo que sugiere unos efectos negativos menores de IPV en todos los antígenos de TDaP. Adicionalmente, para el TT, la vacuna TDaP + IPV proporcionó títulos 2 veces superiores que TDaP + IPV + GBS (ensayo U, P<0,026), lo que sugiere 20 efectos negativos menores de GBS sobre TT en presencia de IPV.

La Figura 3 muestra los títulos de OPK frente a la, lb y III de GBS de los seis grupos de animales sometidos a ensayo en el estudio 1. Tal como se muestra, no se detectaron diferencias principales en títulos de OPK frente a la, lb o III de GBS (en el intervalo de ensayo y variabilidad biológica) en ninguna de las formulaciones de vacuna.

Estudio 2: GBS reconstituidos en TdaP

25 Este estudio investigó la inmunogenicidad de distintas cantidades de vacunas trivalentes de GBS liofilizadas

(polisacáridos la, Ib, III conjugados a CRM197) reconstituidas con vacuna líquida con adyuvante de Alum que contiene Tétano, Difteria y antígenos acelulares de tosferina (TdaP).

Se inmunizaron ocho grupos de 16 ratones hembra CD1 por vía subcutánea en los días 0, 21 y 35 con 3 dosis de vacunas y se purgaron en los días 0, 35 (post-2) y 49 (post-3). El protocolo de inmunización se comenta en la Tabla 3.

5 Tabla 3 Protocolo de inmunización para el estudio 2.

Grupo n.°

Tipo de vacuna Composición de vacuna Vía de volumen Dosis de antígenos Dosis de adyuvante N.° de ratones

PSIa-CRM 5 |jg/ml

PSIb-CRM 5 jg/ml PSIa-CRM 1 jg

PSIII-CRM 5 jg/ml PSIb-CRM 1 jg

T 10 Lf/ml PSIII-CRM 1 jg

1

GBS + TdaP(H2) D 4 Lf/ml s.c. 200 jl T2 Lf 400 jg de Alum 8

PT 8 jg/ml D 0,8 Lf

FHA 8 jg/ml PT 1,6 jg

69K 16 jg/ml FHA 1,6 jg

Alum 2 mg/ml 69K 3,2 jg

T 10 Lf/ml T2 Lf

D 4 Lf/ml D 0,8 Lf

2

TdaP(H2) PT 8 jg/ml s.c. 200 jl 400 ug de Alum 8

FHA 8 jg/ml

PT 1,6 jg

69K 16 jg/ml FHA 1,6 jg

Alum 2 mg/ml 69K 3,2 jg

PSIb-CRM 0,25 jg

PSIII-CRM 5 jg/ml PSIII-CRM 0,25 jg

T 10 Lf/ml T2 Lf

3

GBS + TdaP(L2) D 4 Lf/ml s.c. 200 jl D 0,8 Lf 400 jg de Alum 8

PT 2 jg/ml

PT 0,4 jg

FHA 2 jg/ml FHA 0,4 jg

69K 4 jg/ml 69K 0,8 jg

Alum 2 mg/ml

T 10 Lf/ml T2 Lf

D 4 Lf/ml D 0,8 Lf 0,4

4

TdaP(L2) PT 2 jg/ml s.c. 200 jl 400 jg de Alum 8

FHA 2 jg/ml

PT jg

69K 4 jg/ml FHA 0,4 jg

Alum 2 mg/ml 69K 0,8 jg

PSIa-CRM 5 jg/ml

5

GBS (H) PSIb-CRM 5 jg/ml s.c. 200 jl PSIa-CRM 1 jg 400 jg de Alum 8

PSIII-CRM 5 jg/ml

PSIb-CRM 1 jg

Alum 2 mg/ml PSIII-CRM 1 jg

6

GBS (L) PSIa-CRM 5 jg/ml s.c. 200 jl PSIa-CRM 0,25 jg 400 jg de Alum 8

PSIb-CRM 5 jg/ml

PSIb-CRM 0,25 jg

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Grupo n.°

Tipo de vacuna Composición de vacuna Vía de volumen Dosis de antígenos Dosis de adyuvante N.° de ratones

PSIII-CRM 5 jg/ml PSIII-CRM 0,25 jg

7

Sin antígenos (1) Alum 2 mg/ml s.c 200 jl - 400 jg de Alum 8

8

Sin antígenos (2) Alum 2 mg/ml s.c. 200 jl - 400 jg de Alum

8

Las Figuras 4 y 5 muestran los títulos de IgG frente a los diversos antígenos para todos los grupos después de 3 inmunizaciones para los grupos de ratones sometidos a ensayo en el estudio 2. Los títulos de GMT se indican en la Tabla 4 a continuación.

Tabla 4: Títulos lgG de suero de GMT después de 3 inmunizaciones en ratones sometidos a ensayo en el estudio 2.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 Grupo 7 Grupo 8

Ia de GBS

155,5 12,5 237,0 N/E 598,6 418,3 20,4 12,5

Ib de GBS

107,5 15,1 90,6 N/E 250,4 271,7 15,7 12,5

III de GBS

588,2 12,5 677,7 N/E 958,9 946,4 23,1 12,5

DT

141,3 164,3 164,5 228,2 N/E N/E N/E 0,1

TT

333,6 382,1 457,2 509,6 N/E N/E N/E 0,1

PT

191,4 187,1 149,9 128,1 N/E N/E N/E 0,2

FHA

423,8 544,6 476,1 314,9 N/E N/E N/E 0,1

69K

374,7 435,4 328,2 337,9 N/E N/E N/E 0,1

Para los títulos de lgG después de la 3a inmunización frente a la, lb y III de GBS, la primera observación es que dos ratones del grupo 7 recibieron probablemente una vacuna por error (títulos de lgG elevados a todos los tres antígenos, nunca se había observado previamente en grupos placebo similares). En segundo lugar, se observó una tendencia de títulos de lgG inferiores a todos los tres antígenos de GBS en los grupos reconstituidos con TdaP (2-4 veces de GMT, P<0,05 en algunos de los casos) en comparación con vacunas de GBS sin TdaP. Se observó la misma tendencia para títulos lgG post-2 en todos los serotipos.

Para los títulos de lgG post 3a inmunización frente a DT, TT, PT, FHA y 69K, respectivamente, no se detectaron diferencias significantes en las respuestas de lgG entre cualquiera de los grupos mediante ensayo de Mann- Whitney, lo que indica la completa ausencia de interferencia. No se observó respuesta a la dosis para DT y TT, mientras que se observaron títulos ligeramente superiores para dosis superiores en comparación con dosis inferiores de antígenos de PT, FHA y 69K.

Cuando se compararon los títulos de lgG frente a la, lb y III de GBS en los grupos 5 y 6 cuyas respuestas a dosis de vacuna de GBS de 1 |jg (elevado, L) y 0,25 |jg (bajo, L), la variabilidad en las respuestas individuales a la y lb de GBS fue superior que a la del III de GBS. No se observaron diferencias significantes entre dosis bajas y elevadas para ninguno de los serotipos, mientras que se detectaron un número inferior que no respondían y respuestas significativamente superiores en post-3 en comparación con post-2 para todos los serotipos (ensayo U de Mann- Whitney).

La Figura 6 muestra los títulos de OPK frente a la, lb y III de GBS de los siete grupos de ratones sometidos a ensayo en el estudio 2. Hay una tendencia de títulos ligeramente inferiores en vacunas de GBS formuladas con TdaP en comparación a GBS solo.

Estudio 3: GBS reconstituidos en vacunas líquidas de Tétano y Tétano/Difteria

Este estudio investigó la inmunogenicidad de vacunas trivalentes de GBS liofilizadas (polisacáridos la, Ib, III conjugados a CRM197) reconstituidas con vacunas líquidas con adyuvante de Alum que contiene (i) antígeno de tétano o (ii) antígenos de tétano y difteria.

El protocolo de inmunización se comenta en la Tabla 5 y se repitió dos veces.

5 En cada protocolo, se inmunizaron siete grupos de 8 ratones hembra CD1 subcutáneamente en los días 0 y 21 con 2 dosis de vacunas que se muestran en la Tabla 5 y se purgaron los días 0 y 35.

Tabla 5: Protocolo de inmunización para el estudio 3.

Grupo n.°

Tipo de vacuna Composición de vacuna Vía de volumen Dosis de antígenos Dosis de adyuvante N.° de ratones

PSIa-CRM 5 |jg/ml

PSIb-CRM 5 jg/ml PSIa-CRM 1 jg

1

GBS + T PSIII-CRM 5 jg/ml s.c. 200 jl PSIb-CRM 1 jg 600 jg de Alum 8

T 40 Ul/ml PSIII-CRM 1 jg

Alum 3 mg/ml T 8 UI

PSIa-CRM 5 jg/ml

PSIb-CRM 5 jg/ml PSIa-CRM 1 jg

2

GBS + TD PSIII-CRM 5 jg/ml s.c. 200 jl PSIb-CRM 1 jg 600 jg de Alum 8

T 40 Ul/ml PSIII-CRM 1 jg

D 4 Ul/ml T 8 UI

Alum 3 mg/ml D 0,8 UI

PSIa-CRM 5 jg/ml

3

GBS solo (1) PSIb-CRM 5 jg/ml s.c. 200 jl PSIa-CRM 1 jg 600 jg de Alum 8

PSIII-CRM 5 jg/ml PSIb-CRM 1 jg

Alum 3 mg/ml PSIII-CRM 1 jg

PSIa-CRM 5 jg/ml

4

GBS solo (2) PSIb-CRM 5 jg/ml s.c. 200 jl PSIa-CRM 1 jg Alum 8

PSIII-CRM 5 jg/ml PSIb-CRM 1 jg 600 jg

Alum 3 mg/ml PSIII-CRM 1 jg

5

Sin antígenos Alum 3 mg/ml s.c. 200 jl - 600 jg de Alum 8

6

T solo T 40 Ul/ml s.c. 200 jl T 8 UI 600 jg de Alum 8

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Grupo n.°

Tipo de vacuna Composición de vacuna Vía de volumen Dosis de antígenos Dosis de adyuvante N.° de ratones

Alum 3 mg/ml

7

TD solo T 40 Ul/ml s.c. 200 |jl T 8 UI 600 jg de Alum 8

D 4 Ul/ml

Alum 3 mg/ml

D 0,8 UI

Las Figuras 7 y 8 muestran los títulos IgG frente a los diversos antígenos de todos los grupos de ratones sometidos a ensayo en el estudio 3 (resultados fusionados a partir de 8 + 8 ratones de los dos experimentos). Los títulos de GMT se indican en la Tabla 6 a continuación.

Tabla 6: Títulos lgG de suero de GMT después de 2 inmunizaciones en ratones sometidos a ensayo en el estudio 3.

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 Grupo 7

Ia de GBS

65 162 458 235 13 13 13

Ib de GBS

217 402 550 417 13 13 13

III de GBS

854 1018 1186 924 13 13 13

TT

742,00 882,70 N/E N/E 6,60 1295,00 1038,00

DT

7,49 111,6 N/E N/E <LLOQ <LLOQ 28,52

<LLOQ = por debajo del límite de cuantificación

Para los títulos de lgG frente a la, lb y III de GBS medidos mediante ELISA, el ensayo de Mann-Whitney no reveló ninguna diferencia significativa entre los grupos de vacuna, excepto para el serotipo La, en el que la vacuna constituida por GBS solo (grupo 3) proporcionó títulos significativamente superiores que en la que contenía GBS más toxoide tetánico. En el ensayo de OPK, no se detectaron diferencias principales en títulos de OPK frente a la, lb o III de GBS (en el intervalo de ensayo y variabilidad biológica) en ninguna de las formulaciones de vacuna.

Los títulos de lgG frente a TT fueron significativamente inferiores (P=0,03) en el grupo que contenía vacuna de GBS y TT en comparación con TT solo, aunque la diferencia en los títulos de GMT fue inferior a 2 veces. Con respecto a las respuestas de lgG a DT, fueron superiores en grupos que contenían vacuna de GBS, como se esperaba por el efecto de CRM197 (DT destoxificado).

La Figura 9 muestra los títulos de OPK frente a la, lb y III en sueros de todos los grupos de ratones sometidos a ensayo en el estudio 3. Tal como se muestra, no se detectaron diferencias principales en títulos de OPK frente a la, lb o III de GBS (en el intervalo de ensayo y variabilidad biológica) en ninguna de las formulaciones de vacuna.

Conclusiones

Se realizaron las siguientes observaciones respecto a la inmunogenicidad de las formulaciones de vacuna investigadas:

• Las vacunas trivalentes de GBS, contra Difteria, Tétanos y Tosferina suscitaron títulos de anticuerpos específicos frente a los antígenos correspondientes, en ratones inmunizados con la totalidad de las formulaciones investigadas.

• Se investigó la interferencia inmunológica entre el GBS y la vacuna contra Tétanos/Difteria/Tosferina/Polio en los estudios 1 (inmunización intraperitoneal con 2 dosis de vacuna) y 2 (inmunización subcutánea con dosis de vacuna 2 y 3). No se observó interferencia en el estudio 1, en donde las respuestas de lgG y de

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anticuerpos funcionales a antígenos de GBS, Difteria, Tétanos y Tosferia fueron comparables independientemente de su uso, solas o en combinación. En el estudio 2, se observó una tendencia de títulos de lgG inferiores en todos los tres antígenos de GBS reconstituidos en TdaP en comparación con GBS solo, aunque las diferencias en los títulos de GMT nunca fueron superiores a 4 veces.

• Se investigó la interferencia inmunológica entre vacunas de GBS y Tétanos o Tétanos/Difteria en el estudio 3. El ensayo de Mann-Whitney no reveló diferencias significantes en las respuestas de GBS entre cualquiera de los grupos de vacuna excepto para el serotipo Ia, en donde la vacuna constituida por GBS solo proporcionó títulos significativamente superiores que la que contenía GBS más Toxoide tetánico. El mismo estudio reveló una ligera interferencia de la vacuna de GBS hacia el TT (diferencia de GMT de 2 veces, P=0,03 para la diferencia en títulos de lgG frente a TT, en el grupo que contenía la vacuna de GBS en comparación a TT solo). Con respecto a las respuestas de lgG a dT, fueron superiores en grupos que contenían vacuna de GBS, como se esperaba por el efecto de CRM197 (DT destoxificado).

En conclusión, no hubo indicios de una fuerte interferencia entre ninguna de las vacunas investigadas. Se comprenderá que la invención se ha descrito a modo de ejemplo solo y se pueden realizar modificaciones siempre y cuando permanezcan dentro del alcance de la invención definida en las reivindicaciones adjuntas.

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Claims (17)

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composición inmunogénica que comprende i) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo la del Estreptococo del Grupo B (GBS) conjugado con una proteína transportadora, ii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora, iii) un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora, iv) un toxoide diftérico, v) un toxoide tetánico y vi) un antígeno acelular de la tosferina y opcionalmente vii) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde el iv) toxoide diftérico y v) toxoide tetánico no están conjugados.
2. 2. La composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que cada sacárido capsular de GBS está presente en una cantidad de 0,1 a 30 |jg por dosis.
3. 3. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde el conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ia del GBS conjugado con una proteína transportadora tiene una relación de sacárido:proteína (p/p) entre aproximadamente 1:1 y 1:2; el conjugado que es un sacárido capsular del serotipo Ib del GBS conjugado con una proteína transportadora tiene una relación sacárido:proteína (p/p) entre aproximadamente 1:1 y 1:2; y/o el conjugado que es un sacárido capsular del serotipo III del GBS conjugado con una proteína transportadora tiene una relación de sacárido:proteína (p/p) entre aproximadamente 3:1 y 1:1.
4. 4. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína transportadora es un toxoide diftérico, un toxoide tetánico o CRM197.
5. 5. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende adicionalmente: un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo II del GBS conjugado con una proteína transportadora; y/o un conjugado que es un sacárido capsular del serotipo V del GBS conjugado con una proteína transportadora.
6. 6. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno acelular de tosferina comprende toxina de tosferina destoxificada, hemaglutinina filamentosa y pertactina.
7. 7. La composición inmunogénica de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, en donde el antígeno de poliovirus inactivado comprende antígenos de cada una de una cepa de poliovirus Tipo 1, una cepa de poliovirus Tipo 2 y una cepa de poliovirus Tipo 3.
8. 8. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el toxoide diftérico no conjugado está presente en una concentración entre 4 Lf/ml y 8 Lf/ml, por ejemplo, 4 Lf por 0,5 ml de dosis.
9. 9. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el toxoide tetánico no conjugado está presente en una concentración entre 5 y 10 Lf por 0,5 ml de dosis.
10. 10. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición inmunogénica contiene un adyuvante a base de sal de aluminio.
11. 11. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición es una vacuna.
12. 12. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición es para su administración a un humano.
13. 13. La composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composición es para su uso como un medicamento.
14. 14. La composición inmunogénica de acuerdo con cualquier reivindicación precedente para su uso en un método para suscitar una respuesta inmune en un paciente, que comprende la etapa de administrar la composición al paciente.
15. 15. Un proceso para preparar la composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende mezclar un primer componente que comprende los conjugados del serotipo Ia, Ib y III del GBS y un segundo componente que comprende a) antígeno acelular de la tosferina, b) un toxoide tetánico, c) un toxoide diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados.
16. 16. El proceso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde los conjugados de GBS en el primer componente están liofilizados y en donde el segundo componente comprende antígenos acuosos.
17. 17. Un kit para preparar la composición inmunogénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un primer componente que comprende los conjugados del serotipo Ia, Ib y III del GBS y un segundo componente que comprende a) antígeno acelular de la tosferina, b) un toxoide tetánico, c) un toxoide

    diftérico y opcionalmente d) un antígeno de poliovirus inactivado, en donde los dos componentes están en recipientes separados y en donde el toxoide diftérico y el toxoide tetánico no están conjugados.