ES2692173T3 - Anticuerpos monoclonales anti-RHD - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-RhD aislado que comprende: una región variable de cadena pesada que es al menos un 80% idéntica a la región variable de la SEQ ID NO: 2 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son idénticas a las respectivas primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 2, y una región variable de cadena ligera que es al menos 80% idéntica a la región variable de la SEQ ID NO: 4 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son idénticas a las respectivas primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 4; en el que las CDR del anticuerpo monoclonal se determinan usando la herramienta IMGT/V-QUEST.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpos monoclonales anti-RHD Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a la produccion y uso de anticuerpos monoclonales anti-Rhesus D y fragmented de union a antfgeno de los mismos.

Antecedentes y estado de la tecnica

El antigeno Rhesus D (tambien denominado en la tecnica antfgeno RhD, factor Rhesus y/o factor Rh) es un antigeno que puede estar presente en la superficie de los globulos rojos humanos. Aquellos individuos cuyos globulos rojos tienen este antigeno generalmente se denominan "RhD positivos", mientras que aquellos individuos cuyos globulos rojos no tienen este antfgeno se denominan "RhD negativos".

Una persona que es RhD negativa y nunca ha estado expuesta al antigeno RhD no producira anticuerpos anti-RhD (anticuerpos contra el antigeno RhD). Sin embargo, la transferencia de sangre RhD positiva a un individuo RhD negativo conducira a la sensibilizacion (inmunizacion) del individuo RhD negativo contra el antfgeno RhD. Esto puede llevar a una serie de complicaciones. En particular, cuando una mujer RhD negativa da a luz a un bebe RhD positivo, existe el riesgo de que pequenas cantidades de sangre del bebe entren en la circulacion materna, lo que hace que la madre produzca anticuerpos anti-RhD. Si bien esto normalmente no danara al primer bebe, si la madre ahora inmunizada queda embarazada de otro nino RhD positivo, entonces los anticuerpos maternos anti-RhD pueden cruzar la placenta y atacar las celulas sangumeas del bebe, lo que lleva a una condicion conocida como enfermedad hemolftica del recien nacido (HDN).

Por lo tanto, los anticuerpos anti-RhD se administran de forma rutinaria a pacientes RhD negativos cuando existe un riesgo de exposicion a sangre RhD positiva, para evitar que el paciente se inmunice contra la sangre RhD positiva. Por ejemplo, a un paciente RhD negativo se le pueden administrar anticuerpos anti-RhD: antes y/o poco despues de dar a luz o abortar a un bebe RhD positivo; despues de cualquier incidente durante el embarazo que pueda haber provocado sangrado en la placenta; como medida preventiva de rutina durante el embarazo; o antes o despues de cualquier transfusion de componentes sangumeos que contengan globulos rojos RhD positivos.

Tradicionalmente, los anticuerpos anti-RhD utilizados han sido anticuerpos policlonales obtenidos del plasma sangumeo de voluntarios RhD negativos que han sido inmunizados repetidamente contra los globulos rojos RhD positivos. Sin embargo, el uso de anticuerpos policlonales tiene varios inconvenientes reconocidos, entre los cuales se encuentran la necesidad continua de un numero suficiente de donantes voluntarios que una cantidad que satisfaga la demanda de anticuerpos, y el riesgo de contaminacion de la preparacion de anticuerpos con cualquier virus u otros patogenos que pueden estar presentes en la sangre del donante.

Mientras que los anticuerpos policlonales constituyen anticuerpos secretados por varias celulas plasmaticas diferentes, y por lo tanto constituyen una mezcla de moleculas de inmunoglobulina secretadas contra un antfgeno espedfico y potencialmente reconociendo una variedad de epftopos, los anticuerpos monoclonales se producen a partir de celulas que son todas clones de celulas progenitoras unicas, y por lo tanto constituyen una poblacion homogenea de anticuerpos, como es bien conocido en la tecnica. Las lmeas celulares a partir de las cuales se producen los anticuerpos monoclonales se desarrollan y cultivan in vitro, y esto significa que los anticuerpos monoclonales tienen el potencial de producirse cuando sea necesario, tanto en grandes cantidades como con altos niveles de pureza. Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales anti-RhD tienen una serie de ventajas potenciales sobre las preparaciones de anticuerpos policlonales anti-RhD que se han usado tradicionalmente.

Se han descrito varias tecnicas para producir anticuerpos monoclonales humanos en general, y anticuerpos anti- RhD monoclonales humanos en particular. Por ejemplo, el documento EP-A2-0251440 divulga un anticuerpo monoclonal anti-RhD que produce un heterohibridoma formado por fusion de celulas de mieloma de raton que no secretan Ig con una poblacion que produce Ig anti-RhD de linfocitos humanos transformados con el virus de Epstein Barr (EBV).

El documento US 5.665.356 describe la produccion de anticuerpos anti-RhD monoclonales humanos que tienen ciertas caractensticas definidas, producidas mediante el cultivo de linfocitos B humanos transformados con EBV seleccionados.

Los documentos US 6.312.690 y WO-A1-96/07740 describen la produccion de anticuerpos monoclonales anti-RhD mediante tecnicas recombinantes. Se selecciono una lmea celular humana inmortalizada con EBV que produce un anticuerpo monoclonal anti-Rhesus D llamado D7C2. Las secuencias que codifican las regiones variables de las cadenas pesada (H) y ligera (L) de D7C2 se clonaron, secuenciaron e insertaron en un vector de expresion de baculovirus recombinante bajo el control de un promotor de baculovirus fuerte. Se cultivaron celulas de insecto transfectadas con el baculovirus recombinante y se recupero el anticuerpo monoclonal recombinante D7C2 del sobrenadante celular. El anticuerpo monoclonal D7C2 recombinante demostro en una prueba de ADCC una lisis espedfica mas alta de globulos rojos RHD positivos que una preparacion policlonal de referencia anti-RhD.

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Beliard et al (R. Beliard et al, British Journal of Hematology, vol. 141, n. 1, abril de 2008, paginas 109-119) y Siberil et al (S. Siberil et al, Clinical Immunology, vol. 118, no.2-3, 1 de febrero de 2006, paginas 170-179) describen un anticuerpo monoclonal anti-RhD, que se conoce como R297 en Beliard et al y como T125 (YB2/0) en Siberil et al. Este anticuerpo fue seleccionado para su posterior desarrollo por los autores de estos documentos debido a su respuesta inusualmente fuerte de ADCC contra las celulas sangumeas RhD positivas que se encontro igual a las que produdan los anticuerpos policlonales anti-RhD.

Kumpel (B. Kumpel, Transfusion Clinique et Biologique, vol. 4, no. 4, julio de 1997, paginas 351-356) describe dos anticuerpos monoclonales anti-RhD, denominados BRAD-3 y BRAD-5, que demostraron tener una buena actividad funcional y, sobre esta base, se seleccionaron para los ensayos clmicos de fase I. Se ensena que, en un ensayo de ADCC, se encontro que BRAD-3 es mas potente que el RhD policlonal y se encontro que BRAD-5 es menos potente que el anti-RhD policlonal; y que, en otro ensayo de ADCC, se encontro que tanto BRAD-3 como BRAD-5 son menos potentes que los anti-RhD policlonales.

Brossard y otros (Transfusion Clinique et Biologique, vol. 3, no. 6, 1 de enero de 1996, paginas 459-463) describen los resultados de un estudio de ADCC de 54 anticuerpos anti-RhD monoclonales. Cada uno de los anticuerpos se probo en tres tipos diferentes de ensayo ADCC (ADCC-Ly, ADCC-Macro y ADCC-Mono), y los resultados de estos ensayos se compararon con los resultados obtenidos utilizando anti-RhD policlonal. De los 54 anticuerpos monoclonales anti-RhD probados, 47 fueron activos en al menos uno de los ensayos de ADCC, pero solo 6 fueron al menos tan activos como la preparacion policlonal en al menos un ensayo, y solo 1 fue al menos tan activo como la preparacion policlonal en los tres ensayos.

El documento US-A1-2003/0175969 describe un metodo para preparar anticuerpos monoclonales anti-RhD capaces de activar celulas efectoras que expresan FcyRIII, que comprende: a) purificacion de anticuerpos monoclonales obtenidos de lmeas celulares seleccionadas de heterohibridomas de linfocitos B humanos o lmeas celulares humanas o animales recombinantes (tales como celulas CHO-K, CHO-Lec10, CHO Lec-1, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, HEK293, YB2/0, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 y P3X63Ag8.653); b) agregar cada anticuerpo obtenido en la etapa a) a una mezcla de reaccion diferente que comprende globulos rojos RhD positivos, celulas efectoras que comprenden celulas que expresan FcyRIII, IgG polivalentes; y c) determinar el porcentaje de lisis de las celulas objetivo y seleccionar los anticuerpos monoclonales que activan las celulas efectoras que causan una lisis significativa de los globulos rojos RhD positivos.

El documento US 6.475.787 divulga un metodo para preparar anticuerpos monoclonales, en el que una celula huesped eucariotica adecuada se transforma con una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo, estando unidas las dos secuencias a diferentes genes marcadores amplificables para permitir la amplificacion diferencial de los ADN de las cadenas pesada y ligera con el fin de optimizar los numeros relativos de copias de los genes de los ADN de las cadenas pesada y ligera. En una realizacion preferida, la celula huesped es una celula de ovario de hamster chino (CHO) que es deficiente en DHFR (es decir, incapaz de producir dihidrofolato reductasa), uno de los genes marcadores amplificables es un gen de adenosina desaminasa (ADA), y el otro es un gen de DHFR. La amplificacion del ADN que codifica una cadena de anticuerpo y se une en el gen aDa puede lograrse mediante el tratamiento de las celulas recombinantes con concentraciones crecientes de 2'-desoxicoformicina, mientras que se logra la amplificacion del ADN que codifica la otra cadena de anticuerpo y esta unida en el gen de DHFR, tratando la celula con concentraciones crecientes de metotrexato (MTX).

Sin embargo, sigue existiendo la necesidad de anticuerpos monoclonales anti-RhD adicionales y metodos para la produccion de los mismos.

Descripcion de la invencion

Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un anticuerpo monoclonal anti-RhD aislado que comprende:

una region variable de cadena pesada que es al menos un 80% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 2 y tiene una primera, segunda y tercera CDR (regiones determinantes de la complementariedad) que son identicas a las respectivas primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera que es al menos 80% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 4 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son identicas a las primera, segunda y tercera CDR respectivas de la SEQ ID NO: 4, en donde las CDR del anticuerpo monoclonal son determinadas usando la herramienta IMGT/V-QUEST.

Como se usa en el presente documento, el termino "anticuerpo anti-RhD" se refiere tanto a anticuerpos completos como a fragmentos de los mismos que tienen especificidad de union por el antfgeno RhD. La afinidad/especificidad de union de un anticuerpo puede medirse mediante diversos ensayos, como se sabra y puede ser implementado rutinariamente por un experto en la tecnica. Por ejemplo, los anticuerpos que reconocen y se unen espedficamente al antfgeno RhD se pueden determinar usando una o mas tecnicas estandar conocidas por los expertos en la tecnica, tales como, entre otras, las siguientes: tecnicas EIA/ELISA, como EIA competitivo (inmunoensayo ligado a

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enzimas); citometna de flujo; y/o ensayos de ADCC (toxicidad celular dependiente de anticuerpos). Ejemplos de EIA competitivos, citometna de flujo y tecnicas de ADCC se describen con mas detalle en los siguientes ejemplos.

Como es bien sabido en la tecnica, los anticuerpos completos estan formados tipicamente por una o dos cadenas pesadas y una o dos ligeras. Las cadenas pesada y ligera comprenden cada una una region variable y una region constante. Las regiones variables (tambien denominadas dominios variables) dictan la especificidad de union al antigeno del anticuerpo. Cada dominio variable esta compuesto por regiones determinantes de complementariedad (CDR, de las cuales normalmente hay tres, designadas CDR1, CDR2 y CDR3) intercaladas con regiones mas conservadas conocidas como regiones marco. Al plegar el anticuerpo para adoptar la estructura cuaternaria correcta, las CDR de una cadena pesada y ligera forman juntas el sitio de union al antfgeno. La region constante de la cadena pesada esta compuesta por tres o mas dominios constantes y depende de la clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM) e isotipo (por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) del anticuerpo. Es identico en todos los anticuerpos de la misma clase e isotipo, pero difiere en los anticuerpos de diferentes isotipos. La region constante de la cadena ligera esta compuesta por un unico dominio constante del cual es uno de dos isotipos, kappa o lambda, y es igualmente identico en todos los anticuerpos del mismo isotipo. Las regiones constantes de los anticuerpos tfpicamente median la union del anticuerpo a los tejidos o factores del huesped.

Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invencion incluyen tfpicamente al menos las CDR y suficientes regiones marco para unirse espedficamente al antfgeno. Los ejemplos de tipos de fragmento incluyen, pero no se limitan a, un fragmento Fab' (que consiste en el dominio variable y un dominio constante de las cadenas ligera y pesada), un fragmento F(ab')2 (dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la region bisagra), un fragmento Fv (que consiste en los dominios variables solo de las cadenas ligera y pesada), y otros tipos de fragmentos conocidos por los expertos en la tecnica.

Las SEQ ID NO: 2 y 4 son las secuencias de aminoacidos de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal anti-RhD denominado aqu como RhD1 y se describe a continuacion con mas detalle.

Los anticuerpos de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion comprenden, por lo tanto, regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que tienen una primera, segunda y tercera regiones determinantes de complementariedad (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3) que son identicas o sustancialmente identicas a la primera, segunda y tercera regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo RhD1.

Como se usa en el presente documento, el termino "un anticuerpo monoclonal aislado" se refiere a un anticuerpo que se ha producido mediante tecnicas monoclonales y que se ha aislado de anticuerpos de otros tipos. En otras palabras, los unicos otros anticuerpos presentes seran los anticuerpos producidos por celulas de la misma lmea celular (es decir, todas las celulas se originan de la misma celula parental unica) que la celula que produjo el anticuerpo monoclonal. Por supuesto, esto contrasta con, por ejemplo, los anticuerpos policlonales en los que los anticuerpos constituyen una mezcla de diferentes anticuerpos originados de diferentes celulas plasmaticas.

En una realizacion preferida, el anticuerpo monoclonal anti-RhD aislado comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que son al menos 90%, mas preferiblemente al menos 95%, mas preferiblemente al menos 98%, mas preferiblemente 100% identicas a las regiones variables respectivas de las cadenas pesada y ligera del RhD1. Por lo tanto, en esta realizacion, el anticuerpo comprende:

una region variable de cadena pesada que es al menos 90%, 95%, 98% o 100% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 2 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son identicas a la respectiva primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 2, y una region variable de cadena ligera que es al menos 90%, 95%, 98% o 100% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 4 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son identicas a las respectivas primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 4.

Las tecnicas para identificar regiones variables de anticuerpos y CDR, comparar y alinear secuencias de aminoacidos, y determinar el % de identidad entre dos secuencias de aminoacidos son bien conocidas en la tecnica. Por ejemplo, las CDR, las regiones variables y las regiones constantes de un anticuerpo se pueden determinar usando un software tal como la herramienta IMGt/V-QUEST (
http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/) usando la configuracion predeterminada, y/o mediante la comparacion con bases de datos de secuencias de inmunoglobulina conocidas, tales como IMGT/GENE-DB (
http://imgt.cines.fr/IMGT_GENE-DB/GENElect?livret=0) o V-BASE (
http://vbase.mrc-cpe.cam.ac. uk/). Las secuencias de aminoacidos o acidos nucleicos, ya sea para anticuerpos completos o partes espedficas de los mismos, pueden alinearse y su % de identidad puede determinarse utilizando ClustalW (
http://www.ebi.ac.uk/Tools/ clustalw/), ClustalW2 (http: //
www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) o GAP (
http://genome.cs.mtu.edu/align/align.htmL) usando parametros predeterminados, o usando software patentado tal como Vector NTI v. 10.3.

En una realizacion preferida, el anticuerpo comprende ademas un dominio constante de cadena ligera y al menos un dominio constante de cadena pesada. El dominio constante de la cadena ligera puede ser de tipo kappa o lambda. El dominio constante de cadena pesada es preferiblemente un dominio constante de clase IgG. Por lo tanto, en esta realizacion, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab' o F(ab')2, como se discutio anteriormente, o puede ser un anticuerpo completo. Si es el ultimo, preferiblemente todos los dominios constantes de cadena pesada

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son dominios de IgG (es decir, el anticuerpo comprende una region constante de cadena pesada de IgG). En una realizacion particularmente preferida, el dominio o region constante es un dominio o region constante de IgG 1 o IgG 3. Preferiblemente, todos los dominios constantes (tanto ligeros como pesados) son dominios constantes humanos.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un polinucleotido aislado que codifica la cadena ligera y pesada de un anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto.

Como se usa en el presente documento, el termino un "polinucleotido aislado" se refiere a un polinucleotido que se ha aislado de un entorno celular (es decir, no esta presente en una celula u organismo), y puede estar en forma purificada (es decir, sustancialmente libre de otros polinucleotidos, protemas y componentes celulares) que forman parte de la composicion que contiene otros polinucleotidos y/o compuestos. El termino "que codifica una cadena ligera" se refiere no solo a secuencias que codifican cadenas ligeras completas, sino tambien a secuencias que codifican fragmentos de las mismas (tales como solo el dominio variable) donde el anticuerpo a expresar es un fragmento de anticuerpo como se describio anteriormente. De manera similar, el termino "que codifica una cadena pesada" se refiere no solo a las secuencias que codifican cadenas pesadas completas, sino tambien a las secuencias que codifican fragmentos de las mismas (tales como solo el dominio variable o el dominio variable mas uno o mas, pero no todos los dominios constantes) donde el anticuerpo a expresar es un fragmento de anticuerpo como se describio anteriormente.

Los ejemplos de secuencias de acido nucleico incluyen las secuencias de codificacion relevantes de las SEQ ID NOs: 1 y 3, secuencias que son las secuencias de codificacion para, respectivamente, las SEQ ID NOs: 2 y 4 de aminoacidos. Por lo tanto, por ejemplo, si el anticuerpo comprende regiones variables identicas a las regiones variables de las SEQ ID NOs: 2 y 4 (las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-RhD designado RhD1), entonces un ejemplo de secuencia de acido nucleico podna comprender las secciones de las SEQ ID NOs: 1 y 3 que codifican dichas regiones variables. Alternativamente, tales secuencias de acido nucleico podnan modificarse para una expresion optimizada (es decir, transcripcion y/o traduccion) en la celula huesped deseada, por ejemplo, a traves de tecnicas conocidas por un experto en la materia. Por ejemplo, la optimizacion de la secuencia de acido nucleico nativa puede comprender uno o mas de: optimizacion de la distribucion de GC y estiramientos de AT/GC (para mejorar la estabilidad del ARNm); eliminacion de motivos inhibidores (tales como senales poliA prematuras); eliminacion de sitios de empalme cnpticos (para evitar un empalme alternativo e incorrecto del ARNm); optimizacion de la estructura secundaria del ARNm (para evitar que las horquillas apretadas posiblemente detengan la traduccion); optimizacion de los marcos de lectura abiertos (para evitar marcos de lectura secundarios o alternativos); y optimizacion del uso de codones (para evitar codones raros que pueden hacer mas lenta la traduccion).

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invencion, se proporciona un sistema de expresion que comprende uno o mas vectores de expresion y que incluye secuencias codificantes que codifican las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto.

El vector o los vectores de expresion pueden ser de cualquier tipo usado en la tecnica, tal como por ejemplo plasmidos y vectores virales. Los vectores de expresion de la presente invencion son preferiblemente plasmidos. Ademas de las secuencias codificantes de la cadena de anticuerpos, el vector o los vectores incluiran las secuencias reguladoras necesarias para la transcripcion y traduccion adecuadas de las secuencias codificantes en la celula huesped deseada, tal como por ejemplo un promotor adecuado y una secuencia de poliadenilacion (poliA). El vector o los vectores pueden comprender ademas una secuencia Kozak para aumentar la eficacia de la expresion y/o una secuencia que codifique un peptido senal para el transporte posterior a la traduccion de las cadenas de anticuerpos (por ejemplo, para la secrecion de los anticuerpos). Otra caractenstica preferida es la presencia de uno o mas genes de resistencia a antibioticos y/u otras formas de marcadores de seleccion, que permiten la seleccion de celulas que se han transfectado de manera estable con el vector, y/o que muestran una expresion mas fuerte de las secuencias codificantes del anticuerpo, como se discute mas adelante en forma detallada.

Las secuencias de los promotores y de poli(A) usadas para dirigir la expresion de las secuencias codificantes de cadena ligera y pesada pueden ser de cualquier tipo utilizado en la tecnica. Se conoce una variedad de secuencias de diferentes promotores y poli(A), la seleccion de secuencias apropiadas y promotores de poli(A) para uso en la celula huesped elegida esta dentro de las capacidades de un experto en la tecnica. Por ejemplo, los promotores adecuados para uso en una celula huesped de mairnfero incluyen los promotores de SV40 temprano, tardfo, del factor 1 de alargamiento (EF-1) y de citomegalovirus (CMV). Las secuencias de poli(A) adecuadas incluyen aquellas de poli(A) de SV40, de la hormona de crecimiento bovina (BGH), de timidina quinasa (TK) y de la hormona de crecimiento humana (hGH). En una realizacion preferida, las secuencias codificantes de cadena ligera y pesada estan dirigidas por el promotor del factor 1 alfa humano de alargamiento (hEF-1a) y la secuencia de poli(A) de BGH.

En una realizacion, el sistema de expresion comprende un vector de expresion que incluye tanto la secuencia de codificacion para la cadena ligera como la secuencia de codificacion para la cadena pesada.

En una realizacion alternativa, las secuencias de codificacion de cadena ligera y pesada se transportan mediante vectores separados, comprendiendo el sistema de expresion:

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un primer vector de expresion que incluye la secuencia de codificacion que codifica la cadena ligera; y

un segundo vector de expresion que incluye la secuencia de codificacion que codifica la cadena pesada.

En esta realizacion, uno o ambos de dichos primer y segundo vectores de expresion pueden incluir un marcador de seleccion de dihidrofolato reductasa (dhfr). Este marcador comprende una secuencia de codificacion para DHFR, que esta acoplada a secuencias adecuadas de un promotor y de poliadenilacion, preferiblemente las secuencias del promotor SV40 temprano (SV40E) y de poli(A). DHFR permite la smtesis nueva de la timidina precursora de ADN. Por lo tanto, al transfectar una lmea celular huesped que es deficiente en DHFR (es decir, que por sf misma es incapaz de producir DHFR), se pueden seleccionar las celulas que han integrado de forma estable el vector en su genoma haciendo crecer las celulas en un medio deficiente en desoxirribonucleosidos y ribonucleosidos. Ademas, una vez que se han aislado las celulas transfectadas con exito, la expresion de la secuencia o secuencias de codificacion deseadas (es decir, la cadena ligera y/o pesada) se pueden amplificar utilizando el metotrexato (MTX) inhibidor de DHFR, lo que hace que algunas celulas reaccionen amplificando grandes regiones de ADN que rodean al gen dhfr.

En una realizacion preferida, uno de dichos primer y segundo vectores de expresion incluye un gen de resistencia a antibioticos (una secuencia de acido nucleico que imparte resistencia al antibiotico en cuestion) pero no incluye la secuencia de codificacion de DHFR, y el otro de dichos vectores de expresion incluye la secuencia de codificacion de DHFR pero no incluye un gen que proporcione resistencia al mismo antibiotico que dicho gen de resistencia a antibioticos. El gen de resistencia a antibioticos puede ser de cualquier tipo usado en la tecnica. Por ejemplo, los genes de resistencia a antibioticos adecuados para impartir resistencia a una celula huesped de mairnfero incluyen: genes de resistencia a aminoglucosidos (por ejemplo, neomicina, higromicina B), tales como neomicina fosfotransferasa (npt) e higromicina B fosfotransferasa (hpt, hph); genes de resistencia aminonucleosidos (por ejemplo, puromicina) ) tales como puromicina N-acetiltransferasa (pac); genes de resistencia a glicopeptidos (por ejemplo, bleomicina, fleomicina) tales como el gen ble; y genes de resistencia a peptidil nucleosidos (por ejemplo, blasticidina), tales como los genes bls, bsr o bsd. Al igual que con el marcador de seleccion de dhfr, el gen de resistencia a antibioticos puede acoplarse, segun sea necesario, a cualquiera de las secuencias adecuadas del promotor y de poliadenilacion. Se prefieren las secuencias del promotor de SV40 temprano (SV40E) y de poli(A).

En una realizacion particularmente preferida, el gen de resistencia a antibioticos comprende una secuencia que codifica neomicina fosfotransferasa (NPT). Las celulas transfectadas de manera estable con el vector que incluye la secuencia codificadora de NPT pueden seleccionarse cultivando las celulas en un medio que contenga neomicina o un analogo de neomicina tal como G418, cuyos efectos toxicos se neutralizan mediante NPT.

Por lo tanto, la realizacion descrita anteriormente, en la que un vector tiene el marcador de seleccion de dhfr y el otro tiene el gen de seleccion de antibioticos, permite la seleccion de solo aquellas celulas que tienen ambos vectores integrados de manera estable en su genoma haciendo crecer las celulas en un medio deficiente en desoxirribonucleosidos y ribonucleosidos y que contiene el antibiotico relevante (como la neomicina o un analogo adecuado donde el gen de resistencia a los antibioticos es el gen npt). Las celulas que no fueron transfectadas o fueron transfectadas con un solo plasmido no sobreviviran al proceso de seleccion. Ademas, debido a que los plasmidos cotransfectados a menudo se integran en un punto del genoma, el crecimiento subsiguiente de las celulas transfectadas con exito en concentraciones crecientes de MTX todavfa se puede usar para amplificar de manera efectiva la expresion de las cadenas de anticuerpos codificadas por ambos vectores (es decir, para amplificar la expresion de ambas secuencias de cadena pesada y ligera).

Debe observarse que, si bien, en esta realizacion, el vector que porta el marcador de seleccion de dhfr no incluye el gen que proporciona resistencia al mismo antibiotico que el gen de resistencia a los antibioticos transportado por el otro vector, este y ambos vectores pueden comprender ademas un gen diferente de resistencia a los antibioticos que proporciona resistencia contra un antibiotico adicional. De nuevo, el gen antibiotico adicional puede ser de cualquier tipo usado en la tecnica. Por ejemplo, cuando uno, pero no ambos vectores, portan una secuencia codificadora de NPT (que proporciona resistencia contra la neomicina y sus analogos), ambos vectores tambien pueden incluir un gen de resistencia a la ampicilina (AmpR), con el fin de proporcionar resistencia a la ampicilina cuando se incorporan en una celula huesped bacteriana. Otros genes de resistencia a antibioticos que se usan comunmente para impartir resistencia en huespedes bacterianos incluyen: genes de p-lactamasa (que proporcionan resistencia a los antibioticos de p-lactama, como la ampicilina y otras penicilinas), tales como la p-lactamasa TEM-1; genes que proporcionan resistencia a los aminoglucosidos tales como estreptomicina, kanamicina, tobramicina y amikacina; y genes de resistencia a tetraciclina (por ejemplo, tetraciclina, doxiciclina, minociclina, oxtetraciclina), tales como los genes tetA.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente invencion proporciona una celula transformada con un sistema de expresion de acuerdo con el tercer aspecto o cuarto aspecto.

Las celulas huesped para uso en la presente invencion pueden ser de cualquier tipo adecuado. Sin embargo, en una realizacion preferida, la celula huesped (celula a transfectar) es una celula eucariota, mas preferiblemente una celula de vertebrado, mas preferiblemente una celula de mai^ero. Se dispone de una variedad de celulas huesped de marnfferos adecuadas, tales como, por ejemplo, las enumeradas en el documento USA1-2003/0175969 referido

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anteriormente. Las celulas huesped de mairnfero preferidas incluyen: todas las variantes de celulas CHO, tales como CHO K1 y CHO deficiente en dhfr (DG44, DXB11); HEK293; BHK; COS-1 y COS-7; NSO; y PER.C6. Las celulas huesped preferidas son celulas de ovario de hamster chino (CHO), en particular celulas cHo deficientes en dhfr (celulas CHO dfhr-). Las celulas huesped pueden transfectarse con los vectores de expresion usando tecnicas estandar y condiciones de transfeccion, tales como las que se conocen en la tecnica. Las condiciones de transfeccion a modo de ejemplo se proporcionan en los ejemplos mas adelante.

De acuerdo con un quinto aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para fabricar anticuerpos monoclonales, que comprende cultivar celulas recombinantes segun el cuarto aspecto y recuperar el anticuerpo monoclonal del medio de cultivo. Los medios de cultivo y condiciones a modo de ejemplo se proporcionan en los Ejemplos que siguen, pero se pueden usar cualesquiera condiciones de cultivo adecuadas y medios de cultivo comerciales o personalizados, como se emplean habitualmente en la tecnica. Del mismo modo, se puede emplear cualquier tecnica estandar para purificar anticuerpos secretados de medios de cultivo, siendo los ejemplos de las tecnicas como se describen a continuacion.

De acuerdo con un sexto aspecto, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto. Preferiblemente, la composicion farmaceutica tambien comprende un vetuculo farmaceuticamente aceptable.

Los anticuerpos monoclonales pueden formularse segun se desee, dependiendo de la via de administracion prevista. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden formularse para inyeccion (por ejemplo, intramuscular) de manera analoga a las formulaciones policlonales convencionales anti-D. Los ejemplos de dosis vanan de 150 a 300 microgramos (medido por el tttulo de aglutinacion, como se describe a continuacion con mas detalle). Los ejemplos de vetuculos incluyen: solucion salina amortiguada de fosfato; y regulador salino de glicina.

La composicion puede comprender anticuerpos monoclonales solamente de un tipo unico (es decir, los unicos anticuerpos presentes en la composicion son anticuerpos producidos por celulas de la misma lmea celular). Alternativamente, la composicion puede comprender una combinacion de mas de un tipo de anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, la composicion podna comprender dos o mas tipos distintos de anticuerpos monoclonales que estan de acuerdo con el primer aspecto de la invencion, tal como una combinacion de dos o los tres anticuerpos monoclonales RhD1, RhD2 y/o RhD3. Alternativa o adicionalmente, la composicion podna comprender, ademas de los anticuerpos monoclonales de acuerdo con el primer aspecto de la presente invencion, otros anticuerpos monoclonales anti-RhD por ejemplo, como se conocen en la tecnica. En una realizacion preferida, la composicion comprende al menos un anticuerpo monoclonal que tiene un dominio o region constante de IgG1, y al menos un anticuerpo monoclonal que tiene un dominio o region constante de IgG3.

Cuando la composicion comprende una combinacion de mas de un tipo de anticuerpo monoclonal, se prefiere que la composicion comprenda no mas de 50 tipos diferentes de anticuerpo monoclonal. Mas preferiblemente, la composicion comprende a lo sumo 25, 20, 15, 10 o 5 tipos diferentes.

Segun un septimo aspecto, la presente invencion proporciona un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto, o una composicion farmaceutica de acuerdo con el sexto aspecto, para uso en un metodo para inhibir o prevenir la inmunizacion de un paciente humano RhD negativo contra sangre RhD positiva.

Las indicaciones y/o circunstancias espedficas en las que se pueden usar los anticuerpos monoclonales corresponden a aquellos para los que se usan los anticuerpos policlonales anti-RhD existentes.

De acuerdo con un octavo aspecto, la presente invencion proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto en la fabricacion de un medicamento para inhibir o prevenir la inmunizacion de un paciente humano RhD negativo contra sangre RhD positiva.

La invencion se ilustra adicionalmente en los siguientes ejemplos no limitativos, con referencia tambien a los dibujos adjuntos en los que:

La Figura 1 es una alineacion de secuencias de aminoacidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos

monoclonales RhD1, RhD2 y RhD3, en las que las regiones variables se han subrayado y las regiones

determinantes de la complementariedad se resaltan en negrita y sombreadas;

La Figura 2 es una alineacion de secuencias de aminoacidos de las cadenas ligeras de los anticuerpos

monoclonales RhD1, RhD2 y RhD3, en las que las regiones variables se han subrayado y las regiones

determinantes de la complementariedad se resaltan en negrita;

La Figura 3 es un mapa del vector plasmido pCB3;

La Figura 4 es un mapa del vector plasmido pCB11;

La Figura 5 es un mapa de pCB3 que contiene una secuencia codificante de cadena pesada del anticuerpo anti-RhD (HC de RhD); y

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50

La Figura 6 es un mapa de pCB11 que contiene una secuencia codificante de cadena ligera del anticuerpo anti-RhD (LC de RhD);

La Figura 7 es un ejemplo de una curva de dosis - respuesta generada en un ensayo de ADCC, en el que se grafica la citotoxicidad contra el logaritmo de la concentracion de anticuerpos a la que se presensibilizaron los eritrocitos; y

La Figura 8 es un ejemplo de regresion lineal realizada en los puntos de datos relevantes tornados de la Fig. 7.

Los listados de secuencias que son 48 en numero se proporcionan despues de los Dibujos.

Los listados de secuencias tambien se proporcionan por separado en el CD acompanante en forma electronica.

Ejemplos

Aislamiento de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) y celulas B de sangre periferica de voluntarios sanos hiperinmunizados con globulos rojos Rhesus D (RhD) positivos

La sangre de voluntarios sanos RhD negativos inmunizados repetidamente con globulos rojos aislados de individuos sanos RhD positivos del mismo grupo sangumeo ABO se obtuvo de Cliniqa. Cuatro semanas despues de la ultima inmunizacion, se comprobo el tttulo de anti-RhD en suero, se tomaron muestras de sangre a los voluntarios, se separaron sus celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) de otras poblaciones de celulas sangumeas mediante centrifugacion en gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia), y las celulas fueron usadas frescas o crioconservadas para uso posterior. Las celulas T se agotaron de forma rutinaria mediante la formacion de rosetas con globulos rojos de oveja tratados con bromhidrato de bromuro de S-(2-aminoetil)isotiouronio (AET) al 2% y las celulas B enriquecidas resultantes fueron se transformaron mediante el virus de Epstein-Barr (EBV).

Transformacion de EBV

Dado que se ha demostrado que la activacion de EBV es ventajosa para la fusion posterior de celulas B humanas con la pareja de fusion respectiva, las celulas B enriquecidas se transformaron mediante EBV utilizando un sobrenadante agotado de la imea celular de titf B95-8 como fuente del virus. Las celulas B resuspendidas en un medio completo IMDM (Gibco) con 30% de suero de ternera fetal (FCS) se sembraron en placas de 96 pozos a una concentracion entre 5x103 y 2,5x104 celulas/pozo. El sobrenadante de B95-8 se anadio a los pozos en una cantidad que oscila entre el 5% y el 40% del volumen total. Las placas se incubaron en una incubadora de CO2 al 5% humidificada a 37°C durante dos a cuatro semanas antes del cribado.

Cribado de placas para transformantes que secretan anticuerpos anti-RhD

Se cribaron los sobrenadantes de celulas B transformadas para determinar la presencia de anticuerpos anti-RhD mediante inmunoensayo unido a enzima competitiva (EIA). El principio de la prueba es el siguiente: un anticuerpo de referencia anti-RhD monoclonal marcado de afinidad y especificidad de union conocida (Brad-5; NIBSC) compite con un anticuerpo no marcado (en este caso, los anticuerpos secretados en los sobrenadantes) para unirse a eritrocitos RhD positivos. Una inhibicion de la union del anticuerpo monoclonal de referencia (mAb) indica la presencia de anticuerpos espedficos de RhD que se unen al mismo epttopo inmunodominante que el mAb de referencia. El grado de inhibicion de la union del mAb de referencia se correlaciona con la concentracion y la afinidad de los anticuerpos interferentes.

Los eritrocitos RhD positivos (haplotipo R2R2; ImmucorGamma) tratados con papama se fijaron con glutaraldehfdo y se inmovilizaron en el fondo de placas de prueba de fondo plano de 96 pozos. Despues de un lavado y bloqueo extensivo de las placas, los sobrenadantes de las celulas B transformadas, los estandares y los controles negativos se agregaron a los pozos y las placas se incubaron durante 30-60 minutos a temperatura ambiente (TA). Las placas se lavaron tres veces. Se anadio el mAb de referencia biotinilado y las placas se incubaron durante 30 minutos mas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron de nuevo y se incubaron con un reactivo secundario, conjugado ExtrAvidin-Fosfatasa Alcalina (Sigma) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Despues de otra etapa de lavado, se anadio el sustrato Sigma Fast PNPP (fosfato de p-nitrofenilo) (Sigma). Cuando el color se desarrollo lo suficiente, la reaccion se detuvo con NaOH 3N y la union del mAb de referencia se detecto leyendo las densidades opticas (a 405 nm) en un lector de placas (Bio-Rad). Los datos se analizaron con un paquete de software suministrado con el lector de placas.

Fusion celular

Debido a que las celulas B humanas transformadas con EBV son inestables y pueden dejar de producir anticuerpos rapidamente, generalmente es necesaria la fusion con una pareja de fusion adecuada para prolongar su vida util y permitir su subclonacion. Por lo tanto, cualquier cultivo de celulas B transformadas que produjeron anticuerpos que inhiben la union del anticuerpo de referencia biotinilado a los eritrocitos RhD+ de acuerdo a lo evaluado por EIA (vease mas arriba) se fusionaron con un heterohibridoma humano K6H6/B5 ya sea por el metodo estandar de polietilenglicol (PEG) o por electrofusion. La electrofusion se realizo con el aparato de electrofusion (Eppendorf Multiporator) y un regulador de electrofusion (Eppendorf) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

5

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35

40

Subclonacion de hibridomas.

Se cultivaron subclones en capas alimentadoras establecidas a partir de la lmea de fibroblastos de prepucio de recien nacido CCD-1114Sk (ATCC). Los alimentadores se mantuvieron en medios IMDM que conteman suero bovino fetal (FBS) al 2-20%, dependiendo del cultivo celular. Las bandejas alimentadoras se trataron con luz UV el dfa de la subclonacion. Se contaron las lmeas celulares a subclonar, se prepararon las diluciones apropiadas para la placa de aproximadamente 0,3 celulas/pozo y se pipetearon las suspensiones celulares en las placas de 96 pozos que conteman la capa alimentadora. Cada lmea celular se sembro en al menos dos placas. Los cultivos fueron alimentados cada 3-4 dfas. Los sobrenadantes de los pozos que exhiben crecimiento de hibridomas se probaron mediante EIA generalmente en 3-4 semanas.

Clones de hibridoma seleccionados para el desarrollo de lmeas de celulas recombinantes

Los clones de hibridoma seleccionados para el desarrollo de anticuerpos recombinantes se enumeran en la Tabla 1 (a continuacion). A cada clon se le asigno una designacion simplificada para el proposito del desarrollo de lmeas celulares recombinantes.

Tabla 1.

Designacion de anticuerpos anti-RhD

Clon de hibridoma

Isotipo de anticuerpo Designacion del clon

SD30.06.F5.1 G2

IgG1 humana, lambda RhD1

SD30.02.C3.3 D11

IgG1 humana, lambda RhD2

SD412.04.G11.2D10

IgG3 humana, kappa RhD3

Aislamiento de ARN

El ARN total de celulas de hibridoma se purifico usando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante con la etapa adicional de extraccion de ARN con cloroformo para eliminar trazas de fenol. La cuantificacion espectrofotometrica de ARN se llevo a cabo a 260 nm suponiendo que 1 OD era equivalente a 40 |jg/mL de ARN.

Smtesis de la primera cadena

La primera cadena de ADNc se sintetizo utilizando el sistema de primera cadena Super Script III para RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el proveedor. El cebador Oligo d(T) del kit se utilizo en todos los casos para cebar las reacciones.

Hidrolisis de ARN

La eliminacion de las moleculas de ARN de la reaccion de transcripcion inversa se llevo a cabo mediante digestion con RNasaH (sistema de primera cadena Super Script III para RT-PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc de la primera cadena se clono utilizando el kit de purificacion por PCR QIAquick (Qiagen).

Cola del ADNc de la primera cadena

Para facilitar la amplificacion del ADNc de la primera cadena con una secuencia 3' desconocida, se anexo una cola de poli(A) al extremo 3' de cada ADNc A para crear un sitio de cebado definido. Para este proposito, se utilizo la desoxinucleotidil transferasa terminal recombinante (Invitrogen). La reaccion se llevo a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El producto de reaccion se limpio utilizando el kit de purificacion de PCR QIAquick (Qiagen).

Amplificacion por PCR de cadenas pesadas (HC) y ligeras (LC) de Ig

Los cebadores (SEQ ID NOs: 13 a 19) utilizados para amplificacion por PCR de las secuencias que codifican las cadenas pesada y ligera del ADNc de la primera cadena se enumeran a continuacion (la secuencia de restriccion EcoRI en cada cebador esta subrayada).

Cebador directo (compatible con la extension poli(A) de la primera cadena de ADNc):

Para todas las cadenas:

5'-GACTGAATTC TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'

Cebadores inversos (espedficos del gen):

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15

20

25

30

35

40

45

Para cadenas gamma:

5'-ACTG GAATTC GGTGCTTTATTTCCATGCTGG-3 '

5'-ACTG GAATTC GTACGTGCCAAGCATCCTCG-3 '

Para cadenas kappa:

5'-ACTG GAATTC AGAGGCCAAAGGATGGGAGG-3 '

5'-GACT GAATTC CTGGAACTGAGGAGCAGGTGG-3'

Para cadenas lambda:

5'-GACT GAATTC CCTGGGATCCTGCAGCTC-3'

5'-ACTG GAATTC GGGGTGAGGGTTGAGAACC-3'

La PCR se llevo a cabo utilizando ADN polimerasa termoestable PfuUltra High-Fidelity (Stratagene). ^picamente, los primeros cinco ciclos se cebaron solo con el cebador directo; la temperatura de hibridacion fue de 45°C. Despues de eso, se anadio el cebador inverso, espedfico del gen y la PCR se extendio por otros 30-35 ciclos a una temperatura de hibridacion de 50-65°C. Los fragmentos resultantes se purificaron en gel usando el kit de extraccion en gel QIAquick (Qiagen), se subclonaron en el vector de clonacion pBluescript y se secuenciaron.

Subclonacion de productos de PCR en el vector de clonacion pBluescript

Los productos de PCR purificados se ligaron usando el kit de ligacion rapida (NEB) en el vector de clonacion pBluescript (Stratagene) cortado con EcoRV. Las celulas bacterianas DH5a se transformaron con el ADN resultante y se diseminaron en placas LB suplementadas con 40 pg/mL de ampicilina y se trataron previamente con 50 pL de Xgal de 20 mg/mL y 25 pL de Isopropil p-D-1-tiogalactopiranosida (IPTg) de 200 mg/mL. Las colonias se seleccionaron en azul/blanco por la presencia de un inserto.

Aislamiento de ADN plasmfdico y secuenciacion

Las colonias blancas seleccionadas se recogieron y se expandieron. El ADN se aislo con el kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). Se realizo una digestion de control con EcoRI (los cebadores de PCR directa e inversa conteman un sitio EcoRI). Se secuenciaron inserciones en plasmidos que producen el patron de digestion esperado (Biotech Core).

Codificacion de RhD1, RhD2 y RhD3 y secuencias de aminoacidos

Las secuencias de aminoacidos de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) de RhD1, RhD2 y RhD3, y las secuencias de nucleotidos correspondientes que codifican dichas cadenas pesada y ligera se exponen en la lista de secuencias adjunta, como se explica con mas detalle a continuacion.

Las secuencias se analizaron con la ayuda de bases de datos y software de IMGT (imgt.cines.fr). Mas espedficamente:

las secuencias de las regiones constantes se determinaron a partir de la base de datos IMGT/GENE-DB de secuencias genomicas de Ig (
http://imgt.cines.fr/IMGT_GENE-DB/GENElect?livret=0), seleccionando la especie, el locus y el tipo de gen, grupo (subgrupo omitido) y funcionalidad (por ejemplo, especie: Homo sapiens, locus: IGH, tipo de gen: constante, grupo: IGHC, funcionalidad: funcional) y buscando en la base de datos de la lista resultante, se selecciono el isotipo deseado (por ejemplo, IGG1) con el fin de identificar la secuencia o secuencias de referencia apropiadas de IMGT/LIGM-DB para la comparacion con la secuencia de RhD;

las regiones variables se determinaron restando las regiones constantes; y

las CDR se determinaron utilizando la herramienta IMGT/V-QUEST (
http://imgt.cines.fr/IMGT_vquest/share/textes/), seleccionando la especie de inmunoglobulina (humana), cargando la secuencia de nucleotidos de la cadena de anticuerpos completa, o solo su region variable, en formato FASTA, y analizando la secuencia usando la configuracion predeterminada de IMGT/V-QUEST.

Para obtener mas informacion sobre la herramienta IMGT/V-QUEST e IMGT/GENE-DB, consulte tambien:

Lefranc M.-P., Giudicelli V., Kaas Q., Duprat E., Jabado-Michaloud J., Scaviner D., Ginestoux C., Clement O., Chaume D. y Lefranc G. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucl. Acids Res., 2005, 33, D593-D597;

Giudicelli V., Chaume D. y Lefranc M.-P. IMGT/V-QUEST, an integrated software for immunoglobulin and T cell receptor V-J y V-D-J rearrangement analysis. Nucl. Acids Res. 2004, 32, W435-W440; y,

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50

55

Giudicelli V., Chaume D. y Lefranc M.-P. IMGT/GENE-DB: a comprehensive database for human and mouse immunoglobulin and T cell receptor genes. Nucl. Acids Res. 2005, 33, D256-D261.

V-BASE (una base de datos de todas las secuencias de region variable de lmea germinal humana;
http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/) tambien se puede usar para determinar, o corroborar, los extremos de una region variable. Bajo las alineaciones, se pueden encontrar secuencias de lmea germinal de los peptidos senal, segmentos V, segmentos D (si corresponde) y segmentos J de todas las cadenas pesada y ligera. Sera evidente a partir del analisis de IMGT que segmentos se emplean en una cadena dada de anticuerpos. Luego se puede referenciar luego el segmento J particular en V-BASE para determinar el extremo exacto.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleotidos de la region codificante de HC de RhD1. Los nucleotidos 1-57

codifican el peptido senal. Los nucleotidos 58-448 codifican la region variable, de la cual los nucleotidos 133-156

codifican CDR1, los nucleotidos 208-231 codifican CDR2 y los nucleotidos 346-414 codifican CDR3. Los nucleotidos 449-1437 codifican la region constante (siendo esta una region constante gamma1 o IgG1). La secuencia de aminoacidos de HC de RhD1 se proporciona como SEQ ID NO: 2.

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleotidos de la region codificante de LC de RhD1. Los nucleotidos 1-57

codifican el peptido senal. Los nucleotidos 58-388 codifican la region variable, de la que los nucleotidos 133-159

codifican CDR1, los nucleotidos 211-219 codifican CDR2 y los nucleotidos 328-357 codifican CDR3. Los nucleotidos 389-705 codifican la region constante (siendo esta una region constante lambda). La secuencia de aminoacidos de LC de RhD1se proporciona como la SEQ ID NO: 4.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleotidos de la region codificante de HC de RhD2. Los nucleotidos 1-57 codifican el peptido senal. Los nucleotidos 58-448 codifican la region variable, de los cuales los nucleotidos 133-156 codifican cDr1, los nucleotidos 208-231 codifican CDR2 y los nucleotidos 346-414 codifican CDR3. Los nucleotidos 449-1437 codifican la region constante (siendo esta una region constante gamma1 o IgG1). La secuencia de aminoacidos de HC de RhD2 se proporciona como la SEQ ID NO: 6.

La SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleotidos de la region codificante de LC de RhD2. Los nucleotidos 1-57 codifican el peptido senal. Los nucleotidos 58-388 codifican la region variable, de los cuales los nucleotidos 133-159 codifican cDr1, los nucleotidos 211-219 codifican CDR2 y los nucleotidos 328-357 codifican CDR3. Los nucleotidos 389-705 codifican la region constante (siendo esta una region constante lambda). La secuencia de aminoacidos de LC de RhD2 se proporciona como la sEq ID NO: 8.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleotidos de la region de codificacion de HC de RhD3. Los nucleotidos 1-57 codifican el peptido senal. Los nucleotidos 58-448 codifican la region variable, de los cuales los nucleotidos 133-162 codifican cDr1, los nucleotidos 214-234 codifican CDR2 y los nucleotidos 349-414 codifican CDR3. Los nucleotidos 449-1578 codifican la region constante (siendo esta una region constante gamma3 o IgG3). La secuencia de aminoacidos de HC de RhD3 se proporciona como la SEQ ID NO: 10.

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleotidos de la region codificante de LC de RhD3. Los nucleotidos 1-66 codifican el peptido senal. Los nucleotidos 67-391 codifican la region variable, de los cuales los nucleotidos 145-162 codifican cDr1, los nucleotidos 214-222 codifican CDR2 y los nucleotidos 331-360 codifican CDR3. Los nucleotidos 392-711 codifican la region constante (siendo esta una region constante kappa). La secuencia de aminoacidos de LC de RhD3 se proporciona como la SEQ ID NO: 12.

Alineaciones de secuencias de aminoacidos de RhD1-RhD3

Las secuencias de aminoacidos de RhD1-RhD3 se alinearon con el programa ClustalW (
www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw), utilizando los parametros predeterminados del sitio web. Las alineaciones resultantes de HC y LC se representan en las Figuras 1 y 2, respectivamente. La region variable de cada secuencia se ha subrayado, y las CDR se han resaltado en negrita (la primera CDR que aparece, que lee las secuencias de izquierda a derecha y de arriba a abajo, es la CDR1, la segunda es la cDR2 y la tercera es la CDR3). Cuando aparece el mismo aminoacido en las tres cadenas alineadas, esto se identifica con un "*" debajo del aminoacido relevante en la secuencia inferior (la de RhD3).

De manera similar, GAP (
http://genome.cs.mtu.edu/align/align.htmL) que usa parametros predeterminados (coincidencia maxima = 11; coincidencia minima = -4; penalizacion por hueco = 10; penalizacion por extension del hueco = 2) se puede utilizar para alinear y determinar el porcentaje de identidad entre pares individuales de secuencias o secciones de las mismas. Cuando se comparan de esta manera, las regiones variables de cadena ligera de RhD1 y RhD2 son 94% identicas (104 coincidencias, 6 faltas de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 540), las regiones CDR1 son 88% identicas (8 coincidencias, 1 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 43), las regiones CDR2 son 100% identicas (3 coincidencias, 0 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 16), y las regiones CDR3 son 90% identicas (9 coincidencias, 1 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 43). Las regiones variables de cadena pesada RhD1 y RhD2 son 94% identicas (123 coincidencias, 7 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 650), las regiones CDR1 son 87% identicas (7 coincidencias, 1 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 37), Las regiones CDR2 son 100%

identicas (8 coincidencias, 0 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 41), y las regiones CDR3 son 95% identicas (22 coincidencias, 1 falta de coincidencia, 0 huecos, puntaje de similitud de 131).

Vectores de expresion

Se construyeron dos vectores de expresion de plasmidos, denominados pCB3 y pCB11, para expresar las cadenas 5 pesada y ligera del anticuerpo en celulas CHO dhfr-.

pCB3

Este plasmido se ilustra en la Figura 3. Los componentes de este plasmido se enumeran en la Tabla 2.

Tabla 2 - Componentes del vector de expresion pCB3

Componente del vector

Forma corta Funcion Fuente

Factor 1 a humano de alargamiento con el primer intron

Promotor EF1a Promotor de expresion ADN genomico humano (Clontech)

Gen de resistencia a la ampicilina (p- lactamasa)

AMPr propagacion del plasmido en bacterias Vector comercial (pBluescript; Stratagene)

Origen de replicacion

pUCori Replicacion del plasmido en bacterias Vector comercial (pBluescript; Stratagene)

Senal de poliadenilato del virus de Simio

SV40E poli(A) Terminacion de la transcripcion Vector comercial (pSV40; BRL/ Invitrogen)

Secuencia promotora del virus 40E de simio

Promotor SV40E Promotor de expresion Vector comercial (pSV40; BRL/ Invitrogen)

Senal de poliadenilato de la hormona de crecimiento bovino

BGH Poli(A) Terminacion de la transcripcion Vector comercial (BRL/ Invitrogen)

Gen de dihidrofolato reductasa

DHFR marcador de seleccion de DHFR ADNc de murino (Sierra Biosource, Inc.)

10 pCB11

Este plasmido se ilustra en la Figura 4. Los componentes de este plasmido se enumeran en la Tabla 3.

Tabla 3 - Componentes del vector de expresion pCB11

Componente del vector

Forma corta Funcion Fuente

Factor 1 a humano de alargamiento con el primer intron

Promotor EF1a Promotor de expresion ADN genomico humano (Clontech)

Gen de resistencia a la Ampicilina (p-lactamase)

AMPr Propagacion del plasmido en bacterias Vector comercial (pBluescript; Stratagene)

Origen de replicacion

pUCori Replicacion del plasmido en bacterias Vector comercial (pBluescript; Stratagene)

Senal poliadenilato del virus de Simio

SV40E poli(A) Terminacion de la transcripcion Vector comercial (pSV40; BRL/Invitrogen)

Neomicina fosfotransferasa (mutante)

nuevo mutante Marcador de seleccion de antibioticos Vector comercial (pSV-Neo; BRL/Invitrogen) modificado por Sierra Biosource, Inc.

secuencia promotora del Virus 40E de simio

Promotor SV40E Promotor de expresion Vector comercial (pSV40; BRL/Invitrogen)

Senal de poliadenilato de la

BGH Poli(A) Terminacion de la Vector comercial (BRL/Invitrogen)

5

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15

20

25

30

hormona del crecimiento bovino

transcripcion

Insercion de genes de inmunoglobulina recombinante en vectores de expresion

Se uso una segunda PCR para amplificar las HC y LC con sitios de restriccion apropiados anadidos de manera que los fragmentos pudieran insertarse en vectores de expresion. El diseno de los cebadores directos espedficos del gen se baso en las secuencias obtenidas. El motivo Kozak de consenso (GCCACC), conocido por aumentar la eficiencia de la traduccion eucariota, se incluyo en cada cebador directo (Tabla 5).

Los cebadores (SEQ ID NOs: 20 a 27) para insercion de HC y LC de RhD1-RhD3 en vectores de expresion fueron los siguientes.

HC de RhD1:

Cebador directo espedfico de gen (GSP):

5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3'

HC de RhD2:

GSP directo:

5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3'

HC de RhD3:

GSP directo:

5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACACACTTTGCTACACACTCC-3'

El cebador inverso utilizado para todas las cadenas pesadas:

5'-TGACGAATTCCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3'

LC de RhD1-RhD2:

GSP directo:

5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGCCTGGGCTCTGCTATTC-3' cebador inverso:

5'-ACTGGAATTCGAACCTATGAACATTCTGTAGGGG-3'

LC de RhD3:

GSP directo:

5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCG-3'

Cebador inverso:

5'-GACTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3 '

El ciclo de PCR para la insercion de las HC y LC de RhD1-RhD3 en vectores de expresion comprendio las siguientes etapas:

94°C

2 min

94°C

20 s \

55°C

20 s 35x

72°C

2 min (1 min para LC de RhD1, RhD2 /

72°C

10 min

5

10

15

20

25

30

4°C mantener

Construccion de la variante de IgG3 del anticuerpo RhD1

Se diseno una variante IgG3 de RhD1 como una quimera entre la region variable de RhD1 y la region constante de RhD3. La quimerizacion se aprovecho de los extremos 5' identicos de las regiones constantes de RhD1 (IgG1) y RhD3 (IgG3). El cebador inverso espedfico para el dominio variable de RhD1 se diseno para superponer tres codones de la region constante y para introducir mutaciones silenciosas que crearon un sitio de restriccion Nhel. Se introdujo una modificacion identica en el extremo 5' de la region constante de RhD3 mediante el cebador directo. El sitio de restriccion de Nhel permitio una clonacion conveniente en el marco del dominio variable amplificado de RhD1 frente a la region constante de RhD3. Esto se realizo en dos etapas.

Primero, la region constante de HC de IgG3 del anticuerpo RhD3 se amplifico, se corto con las enzimas Xbal y EcoRI, y se ligo en el vector pCB3 digerido con Xbal/EcoRI. En la segunda etapa, este plasmido intermediario se corto nuevamente con las endonucleasas Xbal y Nhel, y se inserto la region variable amplificada de RhD1, digerida con las mismas enzimas.

Los cebadores (SEQ ID NO: 28-31) usados para la construccion de la variante de IgG3 de RhD fueron los siguientes.

Los cebadores utilizados para la amplificacion de la region constante de RhD3:

Directo:

5'-ATCGTCTAGAGTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC-3'

Inverso:

5'-TGACGAATTCCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3'

Los cebadores utilizados para la amplificacion del dominio variable de RhD1:

Directo:

5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3'

Inverso:

5'-GATGCTAGCTGAGGAGACGGTGATCGTGG-3'

El ciclo de PCR para la construccion de la variante de IgG3 de RhD1 comprendio los siguientes pasos:

94°C

2 min

94°C

20 s \

55°C

20 s 35x

72°C

2 min /

72°C

10 min

4°C

mantener

Enzima de PCR: ADN polimerasa termoestable PfuUltra High-Fidelity (Stratagene).

Vectores de expresion que contienen genes de anticuerpos clonados

Las secuencias de codificacion de HC de RhD1, LC de RhD1, HC de RhD2, LC de RhD2, HC de RhD3, LC de RhD3, HC de RhD1V3C (quimera compuesta por el dominio variable de la cadena pesada de RhD1 y la region constante de la cadena pesada de RhD3) que se insertan en los vectores de expresion, incluyendo tambien los

5

10

15

20

25

30

35

motivos Kozak anadidos y los sitios de restriccion, se presentan como las SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37 y 38, respectivamente. La Figura 5 es un mapa de pCB3 que ilustra la ubicacion de la cadena pesada del anticuerpo anti- RhD insertado, y la Figura 6 es un mapa de pCB11 que ilustra la ubicacion de la cadena ligera del anticuerpo anti- RhD insertado (siendo la ubicacion de la insercion la misma, independientemente de la cadena pesada o ligera espedfica de RtiD1, RhD2, RhD3 o RhD1V3C que es expresada).

Optimizacion del gen

Las secuencias codificantes de los anticuerpos RhD1 y RhD3 se optimizaron mediante GENEART AG utilizando algoritmos patentados. Las secuencias de codificacion optimizadas para HC de RhD1, LC de RhD1, HC de RhD3 y LC de RhD3 se proporcionan como laa SEQ ID NOs: 39, 40, 41 y 42, respectivamente.

Clonacion de genes optimizados de RhD1 en vectores de expresion

Los genes optimizados para RhD1 se subclonaron en vectores de expresion pCB. Para agregar los sitios de restriccion necesarios para la clonacion, las regiones codificantes se amplificaron mediante PCR utilizando los cebadores que se enumeran a continuacion. Cada fragmento amplificado se inserto en el vector respectivo y se verifico mediante secuenciacion.

Los cebadores (SEQ ID NOs: 43 a 46) que se usaron para anexar los sitios de restriccion compatibles con los vectores de expresion de pCB a los genes optimizados de RhD1 son los siguientes.

HC optimizada de RhD1:

Directo:

5'-ATCG TCTAGA GCCACCATGGACTGGACCTG-3'

Inverso:

5'-ATC GGGATCC TCATCACTTGCCGGGGGAC-3'

LC optimizada de RhD1:

Directo:

5'-ATCG TCTAGA GCCACCATGGCCTGGGCCC-3'

Inverso:

5'-ATCG GGATCC TCATCAGCTGCACTCGGTGGGG-3'

Los sitios de Xbal y BamHI en los cebadores estan subrayados.

Las secuencias de codificacion optimizadas de HC de RhD1 y LC de RhD1 como las insertadas en los vectores de expresion, incluidos los motivos Kozac anadidos y los sitios de restriccion, se proporcionan como las SEQ ID NOs: 47 y 48.

Cultivo celular

Medios de cultivo

El medio de cultivo MEMa se uso en todas las etapas del trabajo de desarrollo de la lmea celular CHO recombinante. Los componentes, formulacion y fuentes del material se muestran en la Tabla 4. Despues de la adicion de todos los componentes, se filtro el medio completo a traves de un filtro de 0,22 pm (unidad filtrante de 0,22 pm, Stericup-GP Millipore o equivalente).

Tabla 4 - Medios de cultivo

Medio

Componentes Proveedores Catalogo # Concentration final

Medio de cultivo 1 de

MEMa Gibco o 32561-037 o 1x

celulas huesped CHO DXB11

sin ribonucleosidos y Cellgro CV2561-049 1x

desoxiribonucleosidos HT, 250x Gibco 31985-070 SH30079.33 1x

Suero fetal bovino dializado (dFBS)

irradiado con radiacion gamma GlutaMax, 100x Hyclone Gibco 35050-061 7,5% 1x

Medio de cultivo 2 de

MEMa Gibco 32571-036 1x

celulas huesped CHO

DXB11

sin ribonucleosidos y

desoxiribonucleosidos, Hyclone SH30070.03 7,5%

Suero fetal bovino (FBS) irradiado con Gibco 35050-061 1x

radiacion gamma,

GlutaMax, 100x

Medio de seleccion

MEMa Gibco o 32561-037 o 1x

transfectante

sin ribonucleosidos y Cellgro CV2561-049 1x

desoxiribonucleosidos Hyclone SH30079.33 7,5%

dFBS, irradiado con radiacion gamma, Gibco 35050-061 1x

10131-027 0,5 mg/mL

GlutaMax, 100x Gibco

Geneticina (una formulacion de G-418)

5

Medios de congelacion

La composicion de los medios de congelacion utilizados para crioconservacion de celulas se proporciona en la Tabla 5.

Tabla 5 - Componentes de los medios de congelacion

Medio de congelacion 1:

Componentes

proveedores Catalogo # Volumen por 100 mL

dFBS irradiado con radiacion gamma

HyClone SH30079.33 95 mL

dimetil sulfoxido (DMSO)

Sigma D2438 5 mL

Medio de congelacion 2:

Componentes

Proveedores Catalogo # Volumen por 100 mL

FBS irradiado con radiacion gamma

HyClone SH30070.03 90 mL

DMSO

Sigma D2438 10 mL

Mantenimiento de las celulas

Se cultivaron celulas CHO DXB11 deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) en medio 1 o 2 de cultivo de celulas 10 huesped (Tabla 4) y se dividieron cada 3-4 dfas.

Densidad celular y mediciones de viabilidad.

La densidad de celulas viables y la viabilidad celular se determinaron usando el metodo de exclusion con Trypan Blue y un hemocitometro (Hausser Scientific).

Transfeccion estable y amplificacion en metotrexato (MTX)

15 Las celulas CHO DXB11 se cotransfectaron con cantidades iguales de ADN plasmfdico que codifica para las cadenas ligera y pesada de la IgG humana (Tabla 6). Las transfecciones se realizaron utilizando el reactivo

5

10

15

20

25

30

35

40

Lipofectamina 2000 (Invitrogen) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Los transfectantes estables se seleccionaron utilizando un medio de seleccion transfectante (Tabla 4).

Tabla 6 - Condiciones para una transfeccion tipica de celulas CHO DXB11

Recipiente

Cantidad de ADN de HC Cantidad de ADN de LC Cantidad de Lipofectamina 2000

Matraz T75 o placa de 10 cm

15pg 15pg 30-75 |jL

Las celulas transfectadas se cultivaron durante 2 dfas a 37°C y 5% de CO2 en el medio de cultivo 1 o 2 de celula huesped antes del inicio del proceso de seleccion reemplazando el medio de cultivoo con el medio de seleccion transfectante (Tabla 4).

Durante el proceso de seleccion, el medio gastado se elimino y se reemplazo con medio fresco cuando fue necesario. Despues de que se completo el proceso de seleccion y las celulas transfectadas volvieron a crecer, las celulas fueron

- transferidas al medio de seleccion transfectante (Tabla 4) que contiene varios niveles de MTX (Calbiochem) para la amplificacion de los genes del anticuerpo, o

- subclonadaso (vease mas abajo). En este caso, se seleccionaron 12 clones de la mejor produccion y se agruparon para una amplificacion adicional en MTX.

Clonacion de celulas individuales

Con el fin de seleccionar clones de una sola celula, las celulas transfectadas de manera estable se colocaron en placas en un numero apropiado de placas de 96 pozos de fondo plano a razon de 0,5-1 celulas por pozo. Durante el proceso, el crecimiento y salud de las celulas se controlo bajo el microscopio. Las celulas se cultivaron durante aproximadamente dos semanas antes de la seleccion de los mejores clones productores mediante cribado por ELISA.

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)

Los tftulos de anticuerpos durante todas las etapas del desarrollo de la lmea celular se evaluaron con el kit de cuantificacion de IgG humana de ELISA (Bethyl Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las placas Nunc Maxisorp para ELISA se recubrieron con anticuerpo policlonal anti-IgG humano de cabra espedfico para Fc en solucion salina regulada con fosfato (PBS). Las placas se incubaron durante la noche a 4°C. Al dfa siguiente, las placas se lavaron tres veces y se bloquearon durante 1 hora con leche en polvo sin grasa disuelta en el regulador de lavado. Despues de la etapa de lavado, las muestras y los estandares se pipetearon en las placas y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de tres lavados. Luego se anadio anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rabano picante (HRP) a cada pozo y las placas se incubaron nuevamente a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con regulador de lavado, se enjuagaron una vez con agua destilada y se secaron. Se anadio a cada pozo un sustrato que contema tetrametilbenzidina (TMB) y se dejo que se desarrollara el color durante 15 minutos a temperatura ambiente. La reaccion se detuvo con acido sulfurico y las placas se leyeron en un lector de placas (Bio-Rad, Molecular Dynamics o Dynex Technologies) a 450 nm. Los datos se analizaron con un paquete de software suministrado con el lector de placas.

Expresion de anticuerpos recombinantes de agrupaciones de celulas transfectadas de forma estable con ADNc no optimizados

El esquema de transfecciones (realizado segun la Tabla 6) y las designaciones de las celulas transfectadas se proporcionan en la Tabla 7.

Tabla 7 - Nombre designado para los grupos transfectados.

ADN de HC en pCB3

ADN de LC en pCB11 Nombre del grupo estable Isotipo de IgG recombinante

RhD1 gamma

RhD1 lambda RhD1 IgG1

RhD1V3C gamma

RhD1 lambda RhD4 IgG3

RhD2 gamma

RhD2 lambda RhD2 IgG1

RhD3 gamma

RhD3 kappa RhD3 IgG3

5

10

15

20

25

En general, se alcanzo una mejor expresion cuando las celulas transfectadas se subclonaron despues del proceso de seleccion, los clones se clasificaron para la produccion de anticuerpos por ELISA y solo los grupos de 12 clones con mejor produccion se amplificaron en MTX. La amplificacion de transfectantes seleccionados pero no subclonados dio como resultado grupos que exhibfan una menor productividad, aunque en un tiempo mas corto. A continuacion se muestra un esquema tfpico de amplificacion de MTX:

- Las celulas seleccionadas (MTX 0 nM) se transfirieron en paralelo al medio de seleccion transfectante que contiene MTX 50 nM o 100 nM (Etapa 1)

- Las celulas recuperadas de la etapa 1 se expandieron y se dividieron en MTX 200 nM y 500 nM (etapa 2)

- Las celulas que sobrevivieron a la etapa 2 se expandieron y se sometieron a amplificacion en MTX 1000 nM (etapa 3)

En cada etapa, la productividad del anticuerpo se evaluo mediante ELISA (Tabla 8).

Tabla 8 - Ejemplos de productividad de grupos no amplificados y amplificados de los 12 mejores clones

Grupos de los 12 mejores clones

Nivel de MTX (nM) Niveles de expression de anticuerpos despues de 7 dfas de cultivo (mg/ml)

RhD1

0 10,8

RhD1

50 5,66

RhD1

200 6,44

RhD1

500 9,12

RhD1

1000 27,8

RhD2

0 9,25

RhD2

50 12,25

RhD2

100 12,75

RhD2

200 18,4

RhD3

0 4,08

RhD3

200 3,14

RhD3

500 6,85

RhD4

0 1,2

RhD4

0 2

Los grupos que produjeron los mejores tttulos de anticuerpos se expandieron en matraces de cultivo de tejidos en medio de seleccion transfectante (sin MTX y Geneticina y que conteman FBS con baja IgG de bovino en lugar de FBS regular). Los sobrenadantes de estos cultivos se recogieron y se usaron para la purificacion de los anticuerpos.

Expresion de anticuerpos RhD1 y RhD3 por poblaciones de celulas clonales transfectadas y amplificadas adaptadas a medios sin suero.

Como los niveles de expresion de anticuerpos obtenidos de los grupos de celulas (Tabla 8) aun no eran tan altos como se deseaba, el proceso de transfeccion, seleccion y amplificacion se llevo a cabo nuevamente, esta vez empleando una etapa de subclonacion (como se describio anteriormente) despues de cada etapa de amplificacion, ademas despues de la etapa de seleccion inicial, para obtener lmeas celulares clonales (clones de celulas individuales) que expresan niveles amplificados de anticuerpo anti-RhD.

Mas espedficamente, las celulas CHO DXB11 se transfectaron con plasmidos que codifican las cadenas pesada y ligera de RhD1 o RhD3. La transfeccion y seleccion de celulas transfectadas de manera estable se llevo a cabo esencialmente de la misma manera que se describio anteriormente. Las celulas transfectadas se subclonaron y los

clones resultantes se cribaron para la produccion de anticuerpos. Las lmeas celulares clonales mas productivas fueron amplificadas. Despues de la amplificacion, las celulas se subclonaron nuevamente y los clones mas productivos se sometieron a una ronda adicional de amplificacion y subclonacion. Los medios de seleccion y los medios de amplificacion utilizados para la primera y segunda etapas de amplificacion, se enumeran en la Tabla 9.

5 Las lmeas celulares clonales finales mejor producidas (obtenidas despues de ambas rondas de amplificacion) se adaptaron al cultivo de la suspension en medios comerciales sin suero (IS CHO_CD4MR, Irvine Scientific). Esta tarea se realizo en los matraces de agitacion o en botellas giratorias sembrando las celulas en una mezcla 1:1 del medio de amplificacion final (Tabla 9) y un medio sin suero que contema el mismo nivel de MTX, y luego aumentando gradualmente la proporcion del medio sin suero durante un penodo de cuatro a seis semanas hasta que las celulas 10 fueron completamente capaces de crecer en medio sin suero al 100%.

Las productividades maximas de las mejores lmeas celulares clonales productoras de RhD1 y RhD3, antes y despues de la adaptacion a medios sin suero, se enumeran en la Tabla 9. Los sobrenadantes de estos cultivos se recogieron de nuevo y se usaron para la purificacion de los anticuerpos.

Tabla 9 - Medios de seleccion y amplificacion para cinco clones RhD seleccionados. Se incluyen datos de 15 productividad antes y despues de la adaptacion al medio sin suero.

Clon recombinante:

Clon 1 de RhD1 Clon 6 de RhD1 Clon1 de RhD3 Clon 4 de RhD3

Optimizacion del gen:

Sf Sf No No

Medios de Seleccion y Amplificacion.

Seleccion: Medio de seleccion transfectante Medio de seleccion transfectante Medio de seleccion transfectante MTX 20 nM Medio de seleccion transfectante MTX 20 nM

La composicion del medio de seleccion transfectante se enumera en la Tabla 4.

Etapa 1 de amplificacion: Medio de seleccion transfectante No G418 300nM MTX Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 300 nM Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 200 nM Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 200 nM

Etapa 2 de amplificacion: Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 2.400 nM Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 1.200 nM Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 800 nM Medio de seleccion transfectante No G418 MTX 800 nM

Productividad del anticuerpo

Antes de la adaptacion al medio sin suero 87 pg/mL 100 pg/mL 128 pg/mL 87 pg/mL

Despues de la adaptacion al medio sin suero

419 pg/mL 431 pg/mL 320 pg/mL 326 pg/mL

Purificacion de anticuerpos

El pH de los sobrenadantes de cultivo se ajusto a pH 7,2 con NaOH 1 N. Cada sobrenadante se filtro a traves de un filtro de 0,2 p y se cargo en una columna de protema A previamente equilibrada en solucion salina regulada con 20 fosfato (PBS). La columna se lavo con PBS para eliminar todo el material no unido del sobrenadante de cultivo. El anticuerpo unido a la columna de protema A se eluyo con glicina 0,1 M (pH 2,5). El eluato se neutralizo con regulador Tris 2 M ajustado a pH 8,0. El eluato que contema anticuerpo monoclonal se dializo frente a PBS. La concentracion de anticuerpos anti-RhD se determino mediante un ensayo de aglutinacion usando eritrocitos D positivos. La concentracion de anticuerpos se determino espectrofotometricamente a 280 nm utilizando un valor de 25 densidad optica de 1,4 OD para una solucion de 1 mg/mL basada en el coeficiente de extincion molar para el anticuerpo monoclonal humano.

Ensayo de cuantificacion anti-D mediante hemaglutinacion

Los niveles de anticuerpos anti-RhD en los sobrenadantes y el anticuerpo purificado se cuantificaron midiendo la aglutinacion de eritrocitos RhD positivos tratados con bromelama utilizando el sistema Technicon Autoanalyzer como

se describio anteriormente por Gunson et. al (HH Gunson, PK Phillips y F. Stratton J. Clin. Path., 1972, 25, 198-205. Se utilizaron anticuerpos policlonales anti-RhD de NIBSC (2do estandar internacional 01/572) como estandar.

En resumen, los globulos rojos RhD positivos tratados con bromelina se incuban con diversas concentraciones de anticuerpos anti-RhD. Las celulas se dejan aglutinar durante un penodo de tiempo. Las celulas aglutinadas se 5 eliminan en el autoanalizador y el resto de los eritrocitos se lisan con detergente. La densidad optica de la hemoglobina liberada se mide espectrofotometricamente. Las concentraciones de anti-D de las muestras se calculan utilizando un grafico estandar obtenido de varias concentraciones del estandar Anti-D.

Ensayo de citometna de flujo

Cada anticuerpo humano monoclonal anti-RhD se diluyo en serie 1 en 3 por debajo de 0,5 mg/mL para preparar el 10 total de 15 diluciones. Cada dilucion se anadio a 1-5 x 105 globulos rojos humanos (RBC) RhD positivos o RhD negativos, con genotipos por lo demas similares, pretratados con papama para hacer que los componentes antigenicos de RhD sean mas accesibles a los anticuerpos. Se uso un anticuerpo anti-IgG humano marcado con isotiocianato de fluorescema (FITC) como un anticuerpo secundario para tenir anticuerpos unidos a los RBC.

Las muestras se analizaron en el instrumento FACSort (Becton-Dickinson). La poblacion de globulos rojos se 15 clasifico segun los parametros de dispersion hacia delante y hacia los lados. La fluorescencia de las muestras RhD negativas se considero como referencia, ya que estas celulas carecen del antfgeno RhD al que se dirigen los anticuerpos anti-RhD. Las celulas RhD negativas incubadas con una concentracion particular de anticuerpo, por lo tanto, sirvieron como control negativo para las celulas RhD positivas incubadas con la misma dilucion de anticuerpos. Luego se determinaron la fluorescencia espedfica y el porcentaje de celulas RhD positivas unidas por 20 el anticuerpo anti-RhD (y tenidas con IgG antihumana marcada con FITC), para cada dilucion de anticuerpo anti- RhD, con base en la diferencia entre el nivel de fluorescencia en las muestras RhD positivas y RhD negativas. Para cada anticuerpo anti-RhD, el porcentaje de celulas positivas unidas por el anticuerpo se grafico frente al logaritmo de la concentracion de anticuerpo, y se estimo la EC50 a partir de este grafico. Esto proporciono informacion basica sobre la afinidad de union y la especificidad de los anticuerpos para el antfgeno RhD.

25 Ensayo de ADCC

La eficacia de los anticuerpos anti-RhD para eliminar los globulos rojos RhD positivos in vivo, y por lo tanto la utilidad de los anticuerpos para prevenir la inmunizacion de un individuo RhD negativo expuesto a sangre RhD positiva, se midio mediante un ensayo de toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

El ensayo de ADCC se baso en el metodo descrito por Miescher et al. (British Journal of Hematology 2000 111: 15730 166). Los eritrocitos RhD positivos se trataron con papama y posteriormente se marcaron con el colorante

fluorescente 5-(y 6) ester succinimidflico de diacetato de carboxifluorescema. Los eritrocitos marcados se preincubaron con concentraciones variables (0,1-50 ng/mL) de anticuerpos anti-RhD durante 1 hora. Se anadieron celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) a la suspension de eritrocitos y se incubaron durante 18 horas en una incubadora de CO2 a 37°C. La extension de la lisis de las celulas objetivo al final de la incubacion se 35 determino midiendo la liberacion del colorante de los globulos rojos lisados en el sobrenadante con un fluorometro. El porcentaje de citotoxicidad se calculo de acuerdo con la siguiente formula:

FCcxp — FCmod

% lisis espedfica = -----------------x 100

FCdet — FCmed

en la que

Fcexp = fluorescencia de las muestras

40 Fcdet = control de fluorescencia maxima (obtenido al lisar los RBC con un detergente (Triton-X100 al 1%))

FCmed = control de fluorescencia de referencia (liberacion espontanea del colorante de los RBC en ausencia de PBMC y anticuerpo)

El porcentaje de citotoxicidad se grafico luego en funcion del logaritmo de la concentracion de anticuerpos a la que se preincubaron los eritrocitos, y estos datos se utilizaron para calcular la EC50, es decir, la concentracion efectiva 45 de anticuerpos que causa el 50% de la lisis espedfica maxima alcanzable por ese anticuerpo. A modo de ejemplo, la Fig. 7 es un grafico del porcentaje de citotoxicidad de nuevo la concentracion de anticuerpo generada a partir de los resultados de un ensayo de ADCC utilizando un estandar de NIBSC (anticuerpos policlonales anti-RhD). Esta dependencia dosis-respuesta teoricamente produce una curva sigmoidea con una region media casi lineal. Para realizar una aproximacion lineal en esta region, se puede ajustar una lmea recta a los puntos de datos pertinentes 50 mediante regresion lineal utilizando un paquete de software adecuado (tal como, por ejemplo, Microsoft ExcelMR). La Fig. 8, por ejemplo, es una regresion lineal realizada en los puntos de datos relevantes de la Fig. 7. Una ecuacion que representa esta lmea recta se puede usar para calcular la EC50. Por ejemplo, para los datos de la Fig. 7, donde

la lisis espedfica maxima causada por el anticuerpo policlonal estandar de NIBSC fue aproximadamente del 88% en comparacion con la lisis inducida por el detergente (100%), se calculo el valor de EC50 para el valor de lisis espedfica igual a 44 %.

Resultados del ensayo de hemaglutinacion y ADCC

5 Los resultados de los ensayos de hemaglutinacion y ADCC, realizados de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, se muestran a continuacion en la Tabla 10. Los tttulos de aglutinacion se expresan como microgramos de anticuerpo activo (union al antigeno RhD) por mg de protema. Los valores de EC50 se determinaron a partir de dos experimentos independientes.

Tabla 9 - Tftulos de aglutinacion y valores de EC50 para los anticuerpos RhD1, RhD3 y RhD4. Se incluyen un 10 anticuerpo policlonal de control (estandar de NIBSC) y dos lotes de un anticuerpo monoclonal de control para la

comparacion.

Anticuerpo

Tftulo de aglutinacion (|jg de Ab activo por mg de protema) EC50 de ADCC (ng de Ab activo/mL)

Experimento 1

Experimento 2 Promedio

mAb anti-RhD de control Lote No, 1

100,0 1,2 2,1 1,7

mAb anti-RhD de control Lote No, 2

100,0 0,9 1,9 1,4

Estandar de NIBSC (Ab policlonal anti- RhD)

7,1 0,5 1,3 0,9

Clon 1 de RhD1

716,2 0,7 1,5 1,1

Clon 6 de RhD1

378,1 0,4 0,9 0,7

Clon 1 de RhD3

324,3 0,2 0,3 0,3

Clon 4 de RhD3

275,3 0,1 0,2 0,2

RhD4

303,3 0,1 0,5 0,3

Formulaciones

Los anticuerpos anti-RhD monoclonales purificados se pueden formular para administracion por cualquier via 15 adecuada. Tfpicamente, los anticuerpos se administran a traves de inyeccion. En tales circunstancias, el anticuerpo se formula tfpicamente como una suspension lfquida de los anticuerpos en una solucion reguladora adecuada. Los ejemplos de reguladores incluyen:

solucion salina regulada con fosfato (regulador de fosfato 20 mM (pH 6,8) que contiene NaCl 150 mM); y

regulador de solucion salina de glicina (glicina 0,3 M que contiene NaCl 0,15 M ajustada a pH 6,5).

20 Las formulaciones preferidas comprenden tanto anticuerpos monoclonales que tienen una region constante de IgG1 como anticuerpos monoclonales que tienen una region constante de IgG3. Por lo tanto, se prefieren las formulaciones que comprenden anticuerpos RhD1 (que son del isotipo IgG1) en combinacion con anticuerpos RhD3 (que son del isotipo IgG3) y/o anticuerpos RhD4 (que consisten en la cadena pesada RhD1V3C y la cadena ligera RhD1).

25 Listado de secuencias

<110> BHARAT SERUMS AND VACCINES LTD.

<120> ANTICUERPOS MONOCLONALES ANTI-RHD <130> PCT-ANTID-01 <150> 2730/MUM/2008

<151> 31 de diciembre de 2008 <160> 48

SEQ ID NO: 1 (secuencia de nucleotidos de la region codificante de HC de RhD1)

Peptido senal: 1-57 5 Region variable: 58-448 CDR1: 133-156 CDR2: 208-231 CDR3: 346-414

Region constante:

449-1437 (gamma1)

1

MDWTWRFLFVVAAATGVQSQ ATG GAC TGG ACC TGG AGG TTC CTC TTT GTG GTG GCA GCA GCT ACA GGT GTC CAG TCC CAG

61

VQLVQSGAEVKKPGSSVKVS GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCG GTG AAG GTC TCC

121

CKASGGIFRTYAISWVRQAP TGC AAG GCT TCT GGA GGC ATC TTC AGA ACC TAT GCT ATC AGC TGG GTG CGA CAG GCC CCT

181

GQGLEWMGGIIPMFGTVNYA GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA GGG ATC ATC CCT ATG TTT GGT ACA GTA AAC TAC GCA

241

QKFQGRVTISADKSTSTAYM * CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACG ATT AGC GCG GAC AAA TCC ACG AGC ACA GCC TAT ATG

301

ELSRLRSEDTAVYYCARPPS GAA CTG AGC AGA CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGG CCG CCT TCC

361

GGCGGDCSRRGYYYAMDVWG GGG GGT TGT GGT GGT GAC TGC TCA CGG AGG GGC TAC TAC TAC GCC ATG GAC GTC TGG GGC

421

QGTTITVSSASTKGPSVFPL CAA GGG ACC ACG ATC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG

481

APSSKSTSGGTAALGCLVKD GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC

541

YFPEPVTVSWNSGALTSGVH ' TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC

601

TFPAVLQSSGLYSLSSVVTV ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG

661

PSSSLGTQTYICNVNHKPSN CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC

721

TKVDKKVEPKSCDKTHTCPP ' ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG

781

CPAPELLGGPSVFLFPPKPK TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG

841

DTLMISRTPEVTCVVVDVSH GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK

10

901 GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG

TKPREEQYNSTYRVVSVLTV 961 ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC

LHQDWLNGKEYKCKVSNKAL 1021 CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC

PAPIEKTISKAKGQPREPQV 1081 CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG

YTLPPSRDELTKNQVSLTCL 1141 TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG

VKGFYPSDIAVEWESNGQPE 1201 GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYS 1261 AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVM 1321 AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG

HEALHNHYTQKSLSLSPGK*

1381 CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

SEQ ID NO: 2 (secuencia de aminoacidos de HC de RhD1)

1 MDWTWRFLFV VAAATGVQSQ VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKASGGIFRT YAISWVRQAP

61 GQGLEWMGGI IPMFGTVNYA QKFQGRVTIS ADKSTSTAYM ELSRLRSEDT AVYYCARPPS 121 GGCGGDCSRR GYYYAMDVWG QGTTITVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 181 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN 241 TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCVWDVSH

301 EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL 361 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE

421 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 3 (secuencia de nucleotidos de la region codificante de LC de RhD1)

5 Peptido senal: 1-57

Region variable: 58-388

CDR1: 133-159

CDR2: 211-219

CDR3: 328-357

10 Region constante: 389-705 (lambda)

MAWALLFLTLLTQGTGSWAQ 1 ATG GCC TGG GCT CTG CTA TTC CTC ACC CTC CTC ACT CAG GGC ACA GGG TCC TGG GCC CAG

SALT QPASVSGSPGQSITIS 61 TCT GCC CTG ACT CAA CCT GCC TCC GTG TCT GGG TCT CCT GGA CAG TCG ATC ACC ATC TCC

CSGSSSDVGGYKYVSWYQQH 121 TGC AGT GGA AGC AGC AGT GAC GTT GGT GGT TAT AAG TAT GTC TCC TGG TAC CAA CAA CAC

PGKAPQLMIYDVNNRPSGVS 181 CCA GGC AAA GCC CCC CAA CTC ATG ATT TAT GAT GTC AAT AAT CGG CCC TCA GGG GTT TCT

NRFSGSKSGNTASLTISGLQ 241 AAT CGC TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC TCC CTG ACC ATC TCT GGG CTC CAG

AEDEADYYCSSYTSSSTRVF 301 GCT GAG GAC GAG GCT GAT TAT TAC TGC AGC TCA TAT ACA AGC AGC AGC ACT CGA GTG TTC

GGGTKLTVLGQPKAAPSVTL 361 GGC GGA GGG ACG AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTG

421

FPPSSEELQANKATLVCLIS TTC CCA CCC TCC TCT GAG GAG CTT CAA GCC AAC AAG GCC ACA CTG GTG TGT CTC ATA AGT

481

DFYPGAVTVAWKADSSPVKA ' GAC TTC TAC CCG GGA GCC GTG ACA GTG GCC TGG AAG GCA GAT AGC AGC CCC GTC AAG GCG GVETTTPSKQSNNKYAASSY

541

GGA GTG GAG ACC ACC ACA CCC TCC AAA CAA AGC AAC AAC AAG TAC GCG GCC AGC AGC TAC

601

LSLTPEQWKSHKSYSCQVTH CTG AGC CTG ACG CCT GAG CAG TGG AAG TCC CAC AAA AGC TAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT

661

EGSTVEKTVAPTECS* GAA GGG AGC ACC GTG GAG AAG ACA GTG GCC CCT ACA GAA TGT TCA TAG

SEQ ID NO: 4 (LC de RhD1: secuencia de aminoacidos)

1

MAWALLFLTL LTQGTGSWAQ SALTQPASVS GSPGQSITIS CSGSSSDVGG YKYVSWYQQH

61 121 181

PGKAPQLMIY DVNNRPSGVS NRFSGSKSGN TASLTISGLQ AEDEADYYCS SYTSSSTRVF GGGTKLTVLG QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA GVETTTPSKQ SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HKSYSCQVTH EGSTVEKTVA PTECS

SEQ IDNO: 5 (secuencia de nucleotidos de la region codificante de HC de RhD2) 5 Peptido senal: 1-57

Region variable: 58-448 CDR1: 133-156 CDR2: 208-231 CDR3: 346-414

10 Region constante: 449-1437 (gamma1)

1

MDWTWRFLFVVAAATGVQSQ ATG GAC TGG ACC TGG AGG TTC CTC TTT GTG GTG GCA GCA GCT ACA GGT GTC CAG TCC CAG

61

VQLVQSGAEVKKPGSSVKVS GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG CCT GGG TCC TCG GTG AAG GTC TCC

121

CKPSGGIFSTYAISWVRQAP TGC AAA CCT TCT GGA GGC ATC TTC AGC ACC TAT GCT ATC AGC TGG GTG CGA CAG GCC CCG

181

GQGLEWMGGIIPMFGTVNYA GGA CAA GGG CTT GAG TGG ATG GGA GGG ATC ATC CCT ATG TTT GGG ACA GTA AAC TAC GCA

241

QKFQGRVTISAGKSTSTADM CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT AGC GCG GGC AAA TCC ACG AGC ACA GCC GAT ATG

301

ELSRLRSEDTAVYYCARPPS GAA CTG AGC AGA CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG TAT TAC TGT GCG AGG CCG CCT TCC

361

GGCGGDCSRRGYYYGMDVWG GGG GGT TGT GGT GGT GAC TGC TCA CGG AGG GGC TAT TAT TAT GGT ATG GAC GTC TGG GGC

421

QGTTVIVSSASTKGPSVFPL CAA GGG ACC ACG GTC ATC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG

481

APSSKSTSGGTAALGCLVKD GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC

541

YFPEPVTVSWNSGALTSGVH TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC

601

T.FPAVLQSSGLYSLSSVVTV ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG

661

PSSSLGTQTYICNVNHKPSN CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ATC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC

721

TKVDKKVEPKSCDKTHTCPP ACC AAG GTG GAC AAG AAA GTT GAG CCC AAA TCT TGT GAC AAA ACT CAC ACA TGC CCA CCG

CPAPELLGGPSVFLFPPKPK 781 TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG

DTLMI SRTPEVTCVVVDVSH 841 GAC ACC CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACA TGC GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAK 901 GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG

TKPREEQYNSTYRVVSVLTV 961 ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TAC AAC AGC ACG TAC CGT GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC

LHQDWLNGKEYKCKVSNKAL 1021 CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAT GGC AAG GAG TAC AAG TGC AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC

PAPIEKTISKAKGQPREPQV 1081 CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA GCC AAA GGG CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG

YTLPPSRDELTKNQVSLTCL 1141 TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAT GAG CTG ACC AAG AAC CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG

VKGFYPSDIAVEWESNGQPE 1201 GTC AAA GGC TTC TAT CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG GAG AGC AAT GGG CAG CCG GAG

NNYKTTPPVLDSDGSFFLYS 1261 AAC AAC TAC AAG ACC ACG CCT CCC GTG CTG GAC TCC GAC GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC

- KLTVDKSRWQQGNVFSCSVM

1321 AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC GTC TTC TCA TGC TCC GTG ATG

HEALHNHYTQKSLSLSPGK*

1381 CAT GAG GCT CTG CAC AAC CAC TAC ACG CAG AAG AGC CTC TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

SEQ ID NO: 6 (HC de RhD2: secuencia de aminoacidos)

1 MDWTWRFLFV VAAATGVQSQ VQLVQSGAEV KKPGSSVKVS CKPSGGIFST YAISWVRQAP

61 GQGLEWMGGIIPMFGTVNYA QKFQGRVTIS AGKSTSTADM ELSRLRSEDT AVYYCARPPS 121 GGCGGDCSRR GYYYGMDVWG QGTTVIVSSA STKGPSVFPL APSSKSTSGG TAALGCLVKD 181 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLQSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY ICNVNHKPSN

241 TKVDKKVEPK SCDKTHTCPP CPAPELLGGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH 301 EDPEVKFNWY VDGVEVHNAK TKPREEQYNS TYRWSVLTV LHQDWLNGKE YKCKVSNKAL 361 PAPIEKTISK AKGQPREPQV YTLPPSRDEL TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA VEWESNGQPE 421 NNYKTTPPVL DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM HEALHNHYTQ KSLSLSPGK

SEQ ID NO: 7 (secuencia de nucleotidos de la region codificante de LC de RhD2)

5 Peptido senal: 1-57

Region variable: 58-388 CDR1: 133-159 CDR2: 211-219 CDR3: 328-357

10 Region constante: 389-705 (lambda)

MAWALLFLTLLTQGTGSWAQ 1 ATG GCC TGG GCT CTG CTA TTC CTC ACC CTC CTC ACT CAG GGC ACA GGG TCC TGG GCC CAG

SALTQPASVSGSPGQSITIS 61 TCT GCC CTG ACT CAG CCT GCC TCC GTG TCT GGG TCT CCT GGA CAG TCG ATC ACC ATC TCC

CSGSSSDVGAYKYVSWYGQH 121 TGC AGT GGA AGC AGC AGT GAC GTT GGT GCT TAT AAG TAT GTC TCC TGG TAC CAA CAA CAC

PGKTPKLMIYDVNNRPSGVS ■

181 CCA GGC AAA ACC CCC AAA CTC ATG ATT TAT GAT GTC AAT AAT CGG CCC TCA GGG GTT TCT

DRFSGSKSGNTAFLTISGLQ 241 GAT CGC TTC TCT GGC TCC AAG TCT GGC AAC ACG GCC TTT CTG ACC ATC TCT GGG CTC CAG

AEDEADYYCNSYTSSSTRVF 301 GCT GAG GAC GAG GCT GAT TAT TAC TGC AAC TCA TAT ACA AGC AGC AGC ACT CGA GTG TTC

GGGTKLTVLGQPKAAPSVTL 361 GGC GGA GGG ACC AAG CTG ACC GTC CTA GGT CAG CCC AAG GCT GCC CCC TCG GTC ACT CTG

FPPSSEELQANKATLVCLIS 421 TTC CCA CCC TCC TCT GAG GAG CTT CAA GCC AAC AAG GCC ACA CTG GTG TGT CTC ATA AGT

DFYPGAVTVAWKADSSPVKA 481 GAC TTC TAC CCG GGA GCC GTG ACA GTG GCC TGG AAG GCA GAT AGC AGC CCC GTC AAG GCG

GVETTTPSKQSNNKYAASSY 541 GGA GTG GAG ACC ACC ACA CCC TCC AAA CAA AGC AAC AAC AAG TAC GCG GCC AGC AGC TAC

LSLTPEQWKSHKSYSCQVTH 601 CTG AGC CTG ACG CCT GAG CAG TGG AAG TCC CAC AAA AGC TAC AGC TGC CAG GTC ACG CAT

EGSTVEKTVAPTECS*

661 GAA GGG AGC ACC GTG GAG AAG ACA GTG GCC CCT ACA GAA TGT TCA TAG

SEQ ID NO: 8 (LC de RhD2: secuencia de aminoacidos)

1 MAWALLFLTL LTQGTGSWAQ SALTQPASVS GSPGQSITIS CSGSSSDVGA YKYVSWYQQH

61 PGKTPKLMIY DVNNRPSGVS DRFSGSKSGN TAFLTISGLQ AEDEADYYCN SYTSSSTRVF 121 GGGTKLTVLG QPKAAPSVTL FPPSSEELQA NKATLVCLIS DFYPGAVTVA WKADSSPVKA 181 GVETTTPSKQ SNNKYAASSY LSLTPEQWKS HKSYSCQVTH EGSTVEKTVA PTECS

SEQ ID NO: 9 (secuencia de nucleotidos de la region codificante de HC de RhD3)

5 Peptido senal: 1-57

Region variable: 58-448 CDR1: 133-162 CDR2: 214-234 CDR3: 349-414

10 Region constante: 449-1578 (gamma3)

MDTLCYTLLLLTTPSWVLSQ 1 ATG GAC ACA CTT TGC TAC ACA CTC CTG CTG CTG ACC ACC CCT TCC TGG GTC TTG TCC CAG

VTLKESGPVLVKPTETLTLT 61 GTC ACC TTG AAG GAG TCT GGT CCT GTG CTG GTG AAA CCC ACA GAG ACC CTC ACG CTG ACC

CTVSGFSLNNARMGVSWIRQ 121 TGC ACC GTC TCT GGG TTC TCA CTC AAC AAT GCT AGA ATG GGT GTG AGC TGG ATC CGT CAG

PPGKALEWLAHIFSNDEKSY 181 CCC CCA GGG AAG GCC CTG GAG TGG CTT GCA CAC ATT TTT TCG AAT GAC GAA AAA TCC TAC

STSLKSRLTISKDTSKSQVF 241 AGC ACA TCT CTG AAG AGC AGG CTC ACC ATC TCC AAG GAC ACC TCC AAA AGC CAG GTG TTC

LTMTNMDPVDTATYYCARTP 301 CTT ACC ATG ACC AAC ATG GAC CCT GTG GAC ACA GCC ACA TAT TAC TGT GCA CGG ACC CCT

ITMVRGAIRLYYYYYMDVWG 361 ATT ACT ATG GTT CGG GGA GCT ATT AGG CTA TAC TAC TAC TAC TAC ATG GAC GTC TGG GGC

KGTTVTVSSASTKGPSVFPL 421 AAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA GCT TCC ACC AAG GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG

APCSRSTSGGTAALGCLVKD

481 GCG CCC TGC TCC AGG AGC ACC TCT GGG GGC ACA GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC

YFPEPVTVSWNSGALTSGVH 541 TAC TTC CCC GAA CCG GTG ACG GTG TCG TGG AAC TCA GGC GCC CTG ACC AGC GGC GTG CAC

TFPAVLQSSGLYSLSSVVTV 601 ACC TTC CCG GCT GTC CTA CAG TCC TCA GGA CTC TAC TCC CTC AGC AGC GTG GTG ACC GTG

PSSSLGTQTYTCNVNHKPSN 661 CCC TCC AGC AGC TTG GGC ACC CAG ACC TAC ACC TGC AAC GTG AAT CAC AAG CCC AGC AAC

TKVDKRVELKTPLGDTTHTC 721 ACC AAG GTG GAC AAG AGA GTT GAG CTC AAA ACC CCA CTT GGT GAC ACA ACT CAC ACA TGC

PRCPEPKSCDTPPPCPRCPE 781 CCA CGG TGC CCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC ACA CCT CCC CCG TGC CCA CGG TGC CCA GAG

PKSCDTPPPCPRCPEPKSCD 841 CCC AAA TCT TGT GAC ACA CCT CCC CCA TGC CCA CGG TGC CCA GAG CCC AAA TCT TGT GAC

TPPPCPRCPAPELLGGPSVF 901 ACA CCT CCC CCA TGC CCA CGG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTG GGA GGA CCG TCA GTC TTC

LFPPKPKDTLMISRTPEVTC 961 CTC TTC CCC CCA AAA CCC AAG GAT ACC CTT ATG ATT TCC CGG ACC CCT GAG GTC ACG TGC

VVVDVSHEDPEVQFKWYVDG 1021 GTG GTG GTG GAC GTG AGC CAC GAA GAC CCC GAG GTC CAG TTC AAG TGG TAC GTG GAC GGC

VEVHNAKTKPREEQFNSTFR 1081 GTG GAG GTG CAT AAT GCC AAG ACA AAG CCG CGG GAG GAG CAG TTC AAC AGC ACG TTC CGT

VVSVLTVLHQDWLNGKEYKC 1141 GTG GTC AGC GTC CTC ACC GTC CTG CAC CAG GAC TGG CTG AAC GGC AAG GAG TAC AAG TGC

KVSNKALPAPIEKTISKTKG 1201 AAG GTC TCC AAC AAA GCC CTC CCA GCC CCC ATC GAG AAA ACC ATC TCC AAA ACC AAA GGA

QPREPhVYTLPPSREEMTKN ■

1261 CAG CCC CGA GAA CCA CAG GTG TAC ACC CTG CCC CCA TCC CGG GAG GAG ATG ACC AAG AAC

QVSLTCLVKGFYPSDIAVEW 1321 CAG GTC AGC CTG ACC TGC CTG GTC AAA GGC TTC TAC CCC AGC GAC ATC GCC GTG GAG TGG

ESSGQPENNYNTTPPMLDSD 1381 GAG AGC AGC GGG CAG CCG GAG AAC AAC TAC AAC ACC ACG CCT CCC ATG CTG GAC TCC GAC

GSFFLYSKLTVDKSRWQQGN 1441 GGC TCC TTC TTC CTC TAC AGC AAG CTC ACC GTG GAC AAG AGC AGG TGG CAG CAG GGG AAC

IFSCSVMHEALHNRFTQKSL 1501 ATC TTC TCA TGC TCC GTG ATG CAT GAG GCT CTG CAC AAC CGC TTC ACG CAG AAG AGC CTC

S L S P G K *

1561 TCC CTG TCT CCG GGT AAA TGA

SEQ ID NO: 10 (HC de RhD3: secuencia de aminoacidos)

1 MDTLCYTLLL LTTPSWVLSQ VTLKESGPVL VKPTETLTLT CTVSGFSLNN ARMGVSWIRQ

61 PPGKALEWLA HIFSNDEKSY STSLKSRLTI SKDTSKSQVF LTMTNMDPVD TATYYCARTP 121 ITMVRGAIRL YYYYYMDVWG KGTTVTVSSA STKGPSVFPL APCSRSTSGG TAALGCLVKD 181 YFPEPVTVSW NSGALTSGVH TFPAVLGSSG LYSLSSWTV PSSSLGTQTY TCNVNHKPSN 241 TKVDKRVELK TPLGDTTHTC PRCPEPKSCD TPPPCPRCPE PKSCDTPPPC PRCPEPKSCD 301 TPPPCPRCPA PELLGGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVQFKWYVDG 361 VEVHNAKTKP REEQFNSTFR VVSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKTKG 421 QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESSGQPENNY NTTPPMLDSD 481 GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN IFSCSVMHEA LHNRFTQKSL SLSPGK

SEQ ID NO: 11 (secuencia de nucleotidos de la region codificante de LC de RhD3)

5 Peptido senal: 1-66

Region variable: 67-391

CDR1: 145-162

CDR2: 214-222

CDR3: 331-360 (kappa)

Region constante: 392-711

•MDMRVPAQLLGLLLLWLRGA 1 ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTA CTC TGG CTC CGA GGT GCC

RCDIQVTQSPSSLSASVGDR 61 AGA TGT GAC ATC CAG GTG ACC CAG TCT CCG TCC TCC CTG TCT GCG TCT GTA GGA GAC AGA

VTINCRASQSIGTYLNWYQQ 121 GTC ACC ATC AAT TGC CGG GCA AGT CAG AGC ATT GGC ACC TAT TTA AAT TGG TAT CAG CAG

KPGKAPNLLIYAASSLQSGV 181 AAA CCA GGG AAA GCC CCT AAC CTC CTG ATC TAT GCT GCA TCC AGT TTG CAG AGT GGG GTC

PSRFSGSGSGTDFTLTISSL 241 CCA TCA AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTG

QPEDFATYYCQQTYSTPTWT 301 CAA CCT GAA GAT TTT GCA ACT TAT TAC TGT CAA CAG ACT TAC AGT ACC CCC ACG TGG ACG

FGRGTKVEIKRTVAAPSVFI 361 TTC GGC CGA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAG CGA ACT GTG GCT GCA CCA TCT GTC TTC ATC

FPPSDEQLKSGTASVVCLLN 421 TTC CCG CCA TCT GAT GAG CAG TTG AAA TCT GGA ACT GCC TCT GTT GTG TGC CTG CTG AAT

NFYPREAKVQWKVDNALQSG 481 AAC TTC TAT CCC AGA GAG GCC AAA GTA CAG TGG AAG GTG GAT AAC GCC CTC CAA TCG GGT

NSQESVTEQDSKDSTYSLSS 541 AAC TCC CAG GAG AGT GTC ACA GAG CAG GAC AGC AAG GAC AGC ACC TAC AGC CTC AGC AGC

TLTLSKADYEKHKLYACEVT .

601 ACC CTG ACG CTG AGC AAA GCA GAC TAC GAG AAA CAC AAA CTC TAC GCC TGC GAA GTC ACC

HQGLSSPVTKSFNRGEC*

661 CAT CAG GGC CTG AGC TCG CCC GTC ACA AAG AGC TTC AAC AGG GGA GAG TGT TAG

SEQ ID NO: 12 (LC de RhD3: secuencia de aminoacidos)

1 MDMRVPAQLL GLLLLWLRGA RCDIQVTQSP SSLSASVGDR VTINCRASQS IGTYLNWYQQ

61 KPGKAPNLLI YAASSLQSGV PSRFSGSGSG TDFTLTISSL QPEDFATYYC QQTYSTPTWT

121 FGRGTKVEIK RTVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASWCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG

181 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKLYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGEC

5 SEQ ID NO: 13 (cebador directo de PCR)

5-GACTGAATTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTV-3'

SEQ ID NO: 14 (cebador inverso de cadena gamma de PCR) 5'-ACTGGAATTCGGTGCTTTATTTCCATGCTGG-3'

SEQ ID NO: 15 (cebador inverso de cadena gamma de PCR)

10 5'-ACTGGAATTCGTACGTGCCAAGCATCCTCG-3'

SEQ ID NO: 16 (cebador inverso de cadena kappa de PCR) 5'-ACTGGAATTCAGAGGCCAAAGGATGGGAGG-3'

SEQ ID NO: 17 (cebador inverso de cadena kappa de PCR) 5'-GACTGAATTCCTGGAACTGAGGAGCAGGTGG-3'

15 SEQ ID NO: 18 (cebador inverso de cadena lambda de PCR) 5'-GACTGAATTCCCTGGGATCCTGCAGCTC-3'

SEQ ID NO: 19 (cebador inverso de cadena lambda de PCR) 5'-ACTGGAATTCGGGGTGAGGGTTGAGAACC-3'

5

10

15

20

25

SEQ ID NO: 20 (cebador espedfico del gen directo de HC de RhD1) 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3'

SEQ ID NO: 21 (cebador espedfico del gen directo de HC de RhD2) 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3'

SEQ ID NO: 22 (cebador espedfico del gen directo de HC de RhD3) 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACACACTTTGCTACACACTCC-3'

SEQ ID NO: 23 (cebador inverso usado para todas las cadenas pesadas) 5'-TGACGAATTCCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3'

SEQ ID NO: 24 (cebador espedfico del gen directo de LC de RhD1 y RhD2) 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGCCTGGGCTCTGCTATTC-3'

SEQ ID NO: 25 (cebador inverso de LC de RhD1 y RhD2) 5'-ACTGGAATTCGAACCTATGAACATTCTGTAGGGG-3'

SEQ ID NO: 26 (cebador espedfico de gen directo de LC de RhD3) 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCG-3'

SEQ ID NO: 27 (cebador inverso de LC de RhD3) 5'-GACTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-3'

SEQ ID NO: 28 (cebador directo para la amplificacion de la region constante de RhD3) 5'-ATCGTCTAGAGTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC-3'

SEQ ID NO: 29 (cebador inverso para amplificacion de la region constante de RhD3) 5'-TGACGAATTCCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3'

SEQ ID NO: 30 (cebador directo para la amplificacion del dominio variable de RhD1) 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3'

SEQ ID NO: 31 (cebador inverso para la amplificacion del dominio variable de RhD1) 5'-GATGCTAGCTGAGGAGACGGTGATCGTGG-3'

SEQ ID NO: 32 (secuencia del inserto de HC de RhD1 para el vector de expresion pCB3)

1

Xbal Kozak Inicio TCTAGAGCCA CCATGGACTG GACCTGGAGG TTCCTCTTTG TGGTGGCAGC AGCTACAGGT

61

GTCCAGTCCC AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGGGCTGAGG TGAAGAAGCC TGGGTCCTCG

121

GTGAAGGTCT CCTGCAAGGC TTCTGGAGGC ATCTTCAGAA CCTATGCTAT CAGCTGGGTG

181

CGACAGGCCC CTGGACAAGG GCTTGAGTGG ATGGGAGGGA TCATCCCTAT GTTTGGTACA

241

GTAAACTACG CACAGAAGTT CCAGGGCAGA GTCACGATTA GCGCGGACAA ATCCACGAGC

301

ACAGCCTATA TGGAACTGAG CAGACTGAGA TCTGAGGACA CGGCCGTGTA TTACTGTGCG

361

AGGCCGCCTT CCGGGGGTTG TGGTGGTGAC TGCTCACGGA GGGGCTACTA CTACGCCATG

421

GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGATCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG

481

GTCTTCCCCC TGGCACCCTC CTCCAAGAGC ACCTCTGGGG GCACAGCGGC CCTGGGCTGC

541

CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG CGCCCTGACC

601

AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC

661

GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAGCTTGGGC ACCCAGACCT ACATCTGCAA CGTGAATCAC

721

AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAA GTTGAGCCCA AATCTTGTGA CAAAACTCAC

781

ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC

841

CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG

901

GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG

961

CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC

1021

GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC

1081

AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATC GAG AAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA

1141

GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC

1201

CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT

1261

GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC

1321

TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA

1381

TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT Detention EcoRI

1441

CCGGGTAAAT GAGTGGAATT C

SEQ ID NO: 33 (secuencia del inserto de LC de RhD1 para el vector de expresion pCB11)

1

Xbal Kozak Inicio TCTAGAGCCA CCATGGCCTG GGCTCTGCTA TTCCTCACCC TCCTCACTCA GGGCACAGGG

61

TCCTGGGCCC AGTCTGCCCT GACTCAACCT GCCTCCGTGT CTGGGTCTCC TGGACAGTCG

121

ATCACCATCT CCTGCAGTGG AAGCAGCAGT GACGTTGGTG GTTATAAGTA TGTCTCCTGG

181

TACCAACAAC ACCCAGGCAA AGCCCCCCAA CTCATGATTT ATGATGTCAA TAATCGGCCC

241

TCAGGGGTTT CTAATCGCTT CTCTGGCTCC AAGTCTGGCA ACACGGCCTC CCTGACCATC

301

TCTGGGCTCC AGGCTGAGGA CGAGGCTGAT TATTACTGCA GCTCATATAC AAGCAGCAGC

361

ACTCGAGTGT TCGGCGGAGG GACGAAGCTG ACCGTCCTAG GTCAGCCCAA GGCTGCCCCC

421

TCGGTCACTC TGTTCCCACC CTCCTCTGAG GAGCTTCAAG CCAACAAGGC CACACTGGTG

481

TGTCTCATAA GTGACTTCTA CCCGGGAGCC GTGACAGTGG CCTGGAAGGC AGATAGCAGC

541

CCCGTCAAGG CGGGAGTGGA GACCACCACA CCCTCCAAAC AAAGCAACAA CAAGTACGCG

601

GCCAGCAGCT ACCTGAGCCT GACGCCTGAG CAGTGGAAGT CCCACAAAAG CTACAGCTGC Detention

661

CAGGTCACGC ATGAAGGGAG CACCGTGGAG AAGACAGTGG CCCCTACAGA ATGTTCATAG EcoR!

721

GTTCGAATTC

SEQ ID NO: 34 (secuencia del inserto de HC de RhD2 para el vector de expresion pCB3)

1

Xbal Kozak Initio TCTAGAGCCA CCATGGACTG GACCTGGAGG TTCCTCTTTG TGGTGGCAGC AGCTAGAGGT

61

GTCCAGTCCC AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGGGCTGAGG TGAAGAAGCC TGGGTCCTCG

121

GTGAAGGTCT CCTGCAAACC TTCTGGAGGC ATCTTCAGCA CCTATGCTAT CAGCTGGGTG

181

CGACAGGCCC CGGGACAAGG GCTTGAGTGG ATGGGAGGGA TCATCCCTAT GTTTGGGACA

241

GTAAACTACG CACAGAAGTT CCAGGGCAGA GTCACCATTA GCGCGGGCAA ATCCACGAGC

301

ACAGCCGATA TGGAACTGAG CAGACTGAGA TCTGAGGACA CGGCCGTGTA TTACTGTGCG

361

AGGCCGCCTT CCGGGGGTTG TGGTGGTGAC TGCTCACGGA GGGGCTATTA TTATGGTATG

421

GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGGTCATC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG

481

GTCTTCCCCC TGGCACCCTC CTCCAAGAGC ACCTCTGGGG GCACAGCGGC CCTGGGCTGC

541

CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG CGCCCTGACC

601

AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC

661

GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAGCTTGGGC ACCCAGACCT ACATCTGCAA CGTGAATCAC

721

AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAA GTTGAGCCCA AATCTTGTGA CAAAACTCAC

781

ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC CGTCAGTCTT CCTCTTCCCC

841

CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG

901

GACGTGAGCC ACGAAGACCC TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG

961

CATAATGCCA AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC

1021

GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC

1081

AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA

1141

GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC CGGGATGAGC TGACCAAGAA CCAGGTCAGC

1201

CTGACCTGCC TGGTCAAAGG CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAT

1261

GGGCAGCCGG AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC

1321

TTCCTCTACA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA CGTCTTCTCA

1381

TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC AGAAGAGCCT CTCCCTGTCT Detention EcoRI .

1441

CCGGGTAAAT GAGTGGAATT C

SEQ ID NO: 35 (Secuencia del inserto de LC de RhD2 para el vector de expresion pCB11)

1

Xbal Kozak Inicio TCTAGAGCCA CCATGGCCTG GGCTCTGCTA TTCCTCACCC TCCTCACTCA GGGCACAGGG

61

TCCTGGGCCC AGTCTGCCCT GACTCAGCCT GCCTCCGTGT CTGGGTCTCC TGGACAGTCG

121

ATCACCATCT CCTGCAGTGG AAGCAGCAGT GACGTTGGTG CTTATAAGTA TGTCTCCTGG

181

TACCAACAAC ACCCAGGCAA AACCCCCAAA CTCATGATTT ATGATGTCAA TAATCGGCCC

241

TCAGGGGTTT CTGATCGCTT CTCTGGCTCC AAGTCTGGCA ACACGGCCTT TCTGACCATC

301

TCTGGGCTCC AGGCTGAGGA CGAGGCTGAT TATTACTGCA ACTCATATAC AAGCAGCAGC

361

ACTCGAGTGT TCGGCGGAGG GACCAAGCTG ACCGTCCTAG GTCAGCCCAA GGCTGCCCCC

421

TCGGTCACTC TGTTCCCACC CTCCTCTGAG GAGCTTCAAG CCAACAAGGC CACACTGGTG

481

TGTCTCATAA GTGACTTCTA CCCGGGAGCC GTGACAGTGG CCTGGAAGGC AGATAGCAGC

541

CCCGTCAAGG CGGGAGTGGA GACCACCACA CCCTCCAAAC AAAGCAACAA CAAGTACGCG

601

GCCAGCAGCT ACCTGAGCCT GACGCCTGAG CAGTGGAAGT CCCACAAAAG CTACAGCTGC Detention

661

CAGGTCACGC ATGAAGGGAG CACCGTGGAG AAGACAGTGG CCCCTACAGA ATGTTCATAG EcoRI

721

GTTCGAATTC

SEQ ID NO: 36 (secuencia del inserto de HC de RhD3 para el vector de expresion pCB3)

1

Xbal Kozak Inicio TCTAGAGCCA CCATGGACAC ACTTTGCTAC ACACTCCTGC TGCTGACCAC CCCTTCCTGG

61

GTCTTGTCCC AGGTCACCTT GAAGGAGTCT GGTCCTGTGC TGGTGAAACC CACAGAGACC

121

CTCACGCTGA CCTGCACCGT CTCTGGGTTC TCACTCAACA ATGCTAGAAT GGGTGTGAGC

181

TGGATCCGTC AGCCCCCAGG GAAGGCCCTG GAGTGGCTTG CACACATTTT TTCGAATGAC

241

GAAAAATCCT ACAGCACATC TCTGAAGAGC AGGCTCACCA TCTCCAAGGA CACCTCCAAA

301

AGCCAGGTGT TCCTTACCAT GACCAACATG GACCCTGTGG ACACAGCCAC ATATTACTGT

361

GCACGGACCC CTATTACTAT GGTTCGGGGA GCTATTAGGC TATACTACTA CTACTACATG

421

GACGTCTGGG GCAAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CTTCCACCAA GGGCCCATCG

481

GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCTGGGG GCACAGCGGC CCTGGGCTGC

541

CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG CGCCCTGACC

601

AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC

661

GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAGCTTGGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTGAATCAC

721

AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAGA GTTGAGCTCA AAACCCCACT TGGTGACACA

781

ACTCACACAT GCCCACGGTG CCCAGAGCCC AAATCTTGTG ACACACCTCC CCCGTGCCCA

841

CGGTGCCCAG AGCCCAAATC TTGTGACACA CCTCCCCCAT GCCCACGGTG CCCAGAGCCC

901

AAATCTTGTG ACACACCTCC CCCATGCCCA CGGTGCCCAG CACCTGAACT CCTGGGAGGA

961

CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGATACCC TTATGATTTC CCGGACCCCT

1021

GAGGTCACGT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAAGTGG

1081

TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTTCAAC

1141

AGCACGTTCC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAACGGCAAG

1201

GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC

1261

AAAACCAAAG GACAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGAGGAG

1321

ATGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC

1381

GCCGTGGAGT GGGAGAGCAG CGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAACACCAC GCCTCCCATG

1441

CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA CCGTGGACAA GAGCAGGTGG

1501

CAGCAGGGGA ACATCTTCTC ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCGCTTCACG Detencion EcoRI

1561

CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC TCCGGGTAAA TGAGTGGAAT TC

SEQ ID NO: 37 (Secuencia de insertion de LC de RhD3 para el vector de expresion pCB11)

1

Xbal Kozak Inicio TCTAGAGCCA CCATGGACAT GAGGGTCCCC GCTCAGCTCC TGGGGCTCCT GCTACTCTGG

61

CTCCGAGGTG CCAGATGTGA CATCCAGGTG ACCCAGTCTC CGTCCTCCCT GTCTGCGTCT

121

GTAGGAGACA GAGTCACCAT CAATTGCCGG GCAAGTCAGA GCATTGGCAC CTATTTAAAT

181

TGGTATCAGC AGAAACCAGG GAAAGCCCCT AACCTCCTGA TCTATGCTGC ATCCAGTTTG

241

CAGAGTGGGG TCCCATCAAG GTTCAGTGGC AGTGGATCTG GGACAGATTT CACTCTCACC

301

ATCAGCAGTC TGCAACCTGA AGATTTTGCA ACTTATTACT GTCAACAGAC TTACAGTACC

361

CCCACGTGGA CGTTCGGCCG AGGGACCAAG GTGGAAATCA AGCGAACTGT GGCTGCACCA

421

TCTGTCTTCA TCTTCCCGCC ATCTGATGAG CAGTTGAAAT CTGGAACTGC CTCTGTTGTG

481

TGCCTGCTGA ATAACTTCTA TCCCAGAGAG GCCAAAGTAC AGTGGAAGGT GGATAACGCC

541

CTCCAATCGG GTAACTCCCA GGAGAGTGTC ACAGAGCAGG ACAGCAAGGA CAGCACCTAC

601

AGCCTCAGCA GCACCCTGAC GCTGAGCAAA GCAGACTACG AGAAACACAA ACTCTACGCC

661

TGCGAAGTCA CCCATCAGGG CCTGAGCTCG CCCGTCACAA AGAGCTTCAA CAGGGGAGAG Detencion EcoRI s

721

TGTTAGGAAT TC

SEQ ID NO: 38 (Secuencia del inserto de HC de RhD1V3C para el vector de expresion pCB3)

1

Xbal Kozak Inicio TCTAGAGCCA CCATGGACTG GACCTGGAGG TTCCTCTTTG TGGTGGCAGC AGCTACAGGT

61

GTCCAGTCCC AGGTGCAGCT GGTGCAGTCT GGGGCTGAGG TGAAGAAGCC TGGGTCCTCG

121

GTGAAGGTCT CCTGCAAGGC TTCTGGAGGC ATCTTCAGAA CCTATGCTAT CAGCTGGGTG

181

CGACAGGCCC CTGGACAAGG GCTTGAGTGG ATGGGAGGGA TCATCCCTAT GTTTGGTACA

241

GTAAACTACG CACAGAAGTT CCAGGGCAGA GTCACGATTA GCGCGGACAA ATCCACGAGC

301

ACAGCCTATA TGGAACTGAG CAGACTGAGA TCTGAGGACA CGGCCGTGTA TTACTGTGCG

361

AGGCCGCCTT CCGGGGGTTG TGGTGGTGAC TGCTCACGGA GGGGCTACTA CTACGCCATG

c 421

Nhel GACGTCTGGG GCCAAGGGAC CACGATCACC GTCTCCTCAG CTAGCACCAA GGGCCCATCG

481

GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCTGGGG GCACAGCGGC CCTGGGCTGC

541

CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT GGAACTCAGG CGCCCTGACC

601

AGCGGCGTGC ACACCTTCCC GGCTGTCCTA CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC

661

GTGGTGACCG TGCCCTCCAG CAGCTTGGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTGAATCAC

721

AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAGA GTTGAGCTCA AAACCCCACT TGGTGACACA

781

ACTCACACAT GCCCACGGTG CCCAGAGCCC AAATCTTGTG ACACACCTCC CCCGTGCCCA

841

CGGTGCCCAG AGCCCAAATC TTGTGACACA CCTCCCCCAT GCCCACGGTG CCCAGAGCCC

901

AAATCTTGTG ACACACCTCC CCCATGCCCA CGGTGCCCAG CACCTGAACT CCTGGGAGGA

961

CCGTCAGTCT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGATACCC TTATGATTTC CCGGACCCCT

1021

GAGGTCACGT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAAGACC CCGAGGTCCA GTTCAAGTGG

1081

TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GCAGTTCAAC

1141

AGCACGTTCC GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC AGGACTGGCT GAACGGCAAG

1201

GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGCC CTCCCAGCCC CCATCGAGAA AACCATCTCC

1261

AAAACCAAAG GACAGCCCCG AGAACCACAG GTGTACACCC TGCCCCCATC CCGGGAGGAG

1321

ATGACCAAGA ACCAGGTCAG CCTGACCTGC CTGGTCAAAG GCTTCTACCC CAGCGACATC

1381

GCCGTGGAGT GGGAGAGCAG CGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAACACCAC GCCTCCCATG

1441

CTGGACTCCG ACGGCTCCTT CTTCCTCTAC AGCAAGCTCA CCGTGGACAA GAGCAGGTGG

1501

CAGCAGGGGA ACATCTTCTC ATGCTCCGTG ATGCATGAGG CTCTGCACAA CCGCTTCACG Detention EcoRI

1561

CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC TCCGGGTAAA TGAGTGGAAT TC

SEQ ID NO: 39 (Secuencia de nucleotidos de la region codificante optimizada de HC de RhD1)

1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381

Bam HI Kozak l.nicio GGATCCGCCA CCATGGACTG GACCTGGCGC TTCCTGTTCG TGGTGGCCGC CGCCACCGGC GTGCAGAGCC AGGTGCAGCT GGTGCAGAGC GGCGCCGAGG TGAAGAAGCC CGGCAGCAGC GTCAAGGTGT CCTGCAAGGC CAGCGGCGGC ATCTTCCGCA CCTACGCCAT CTCTTGGGTC CGGCAGGCTC CCGGGCAGGG GCTCGAGTGG ATGGGCGGCA TCATCCCCAT GTTCGGCACC GTGAACTACG CCCAGAAGTT CCAGGGCCGC GTCACCATCA GCGCCGACAA GAGCACCAGC ACCGCCTACA TGGAGCTGTC CCGCCTGCGC TCCGAGGACA CCGCCGTGTA CTACTGTGCT AGGCCTCCCA GCGGCGGCTG CGGCGGCGAC TGCAGCCGCA GGGGCTACTA CTACGCTATG GACGTGTGGG GCCAGGGCAC CACCATCACC GTGAGCAGCG CTAGCACCAA GGGCCCCAGC GTGTTCCCCC TGGCCCCCAG CAGCAAGAGC ACCTCCGGCG GCACCGCCGC CCTGGGCTGC CTGGTGAAGG ACTACTTCCC CGAGCCCGTG ACCGTGAGCT GGAACAGCGG CGCCCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC CGCCGTGCTG CAGAGCAGCG GCCTGTACAG CCTGAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCAGCAG CAGCCTGGGC ACCCAGACCT ACATCTGCAA CGTGAACCAC AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAG GTGGAGCCCA AGAGCTGCGA CAAGACCCAC ACCTGCCCCC CCTGCCCCGC CCCCGAGCTG CTGGGCGGCC CCTCCGTGTT CCTGTTCCCC CCCAAGCCCA AGGACACCCT GATGATCAGC CGCACCCCCG AGGTGACCTG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAGGACCC CGAGGTGAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CACAACGCCA AGACCAAGCC CCGCGAGGAG CAGTACAACA GCACCTACCG CGTGGTGTCC GTGCTGACCG TGCTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC AACAAGGCCC TGCCCGCCCC CATCGAGAAG ACCATCAGCA AGGCCAAGGG GCAGCCTAGA GAGCCCCAGG TCTACACCCT GCCTCCATCC CGCGACGAGC TGACCAAGAA CCAGGTGTCC CTGACCTGTC TGGTCAAGGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAC GGCCAGCCCG AGAACAACTA CAAGACCACC CCCCCCGTGC TGGACAGCGA CGGCAGCTTC TTCCTGTACA GCAAGCTGAC CGTGGACAAG AGCCGCTGGC AGCAGGGCAA CGTGTTCAGC TGCAGCGTGA TGCACGAGGC CCTGCACAAC CACTACACCC AGAAGAGCCT GAGCCTGTCC ‘ Detencion Notl

1441

CCCGGCAAGT GATGAGCGGC CGC

SEQ ID NO: 40 (Secuencia de nucleotidos de la region de codificacion optimizada de LC de RhD1)

BamHI Kozak Inicio

1 GGATCCGCCA CCATGGCCTG GGCCCTGCTG TTCCTGACCC TGCTGACCCA GGGCACCGGC

61 AGCTGGGCCC AGAGCGCCCT GACCCAGCCC GCCAGCGTGA GCGGCAGCCC CGGCCAGTCT

121 ATCACCATCT CTTGTAGCGG CAGCAGCAGC GACGTGGGCG GCTACAAGTA CGTGTCTTGG

181 TATCAGCAGC ACCCCGGCAA GGCCCCCCAG CTGATGATCT ACGACGTGAA CAACCGCCCC

241 AGCGGCGTGA GCAACCGCTT CAGCGGCTCC AAGAGCGGCA ACACCGCCAG CCTGACCATC

301 TCTGGGCTGC AGGCTGAGGA CGAGGCCGAC TACTACTGCA GCAGCTACAC CAGCAGCTCC

361 ACCCGCGTGT TCGGCGGCGG CACCAAGCTG ACCGTGCTGG GCCAGCCCAA GGCCGCCCCC

421 AGCGTGACCC TGTTCCCCCC CAGCAGCGAG GAGCTCCAGG CCAACAAGGC TACCCTGGTG

481 TGCCTGATCA GCGACTTCTA CCCCGGCGCC GTGACCGTCG CCTGGAAGGC CGACAGCAGC

541 CCCGTGAAGG CCGGCGTGGA GACCACCACC CCCAGCAAGC AGAGCAACAA CAAGTACGCC

601 GCCAGCAGCT ACCTGAGCCT GACCCCCGAG CAGTGGAAGA GCCACAAGAG CTACAGCTGC

Detencion

661 CAGGTGACCC ACGAGGGCAG CACCGTGGAG AAGACCGTGG CCCCCACCGA GTGCAGCTGA

Notl

721 TGAGCGGCCG C

SEQ ID NO: 41 (Secuencia de nucleotidos de la region de codificacion optimizada de HC de RhD3)

BamHI Kozak Inicio

1 GGATCCGCCA CCATGGACAC CCTGTGCTAC ACCCTGCTGC TGCTGACCAC CCCCAGCTGG

61 GTGCTGTCCC AGGTGACCCT GAAGGAGAGC GGCCCTGTCC TGGTGAAGCC CACCGAGACC

121 CTGACCCTGA CCTGCACCGT GAGCGGCTTC AGCCTGAACA ACGCCCGCAT GGGCGTGAGC

181 TGGATCAGGC AGCCCCCTGG CAAGGCCCTG GAGTGGCTGG CCCACATCTT CAGCAACGAC

241 GAGAAGAGCT ACAGCACCAG CCTGAAGAGC CGCCTGACCA TCAGCAAGGA CACCAGCAAG 301 AGCCAGGTGT TCCTGACCAT GACCAACATG GACCCCGTGG ACACCGCCAC CTACTACTGC 361 GCCCGCACCC CCATCACAAT GGTCAGAGGC GCCATCCGCC TGTACTACTA CTATTACATG

421 GACGTGTGGG GCAAGGGCAC CACCGTGACC GTGAGCAGCG CTAGCACCAA GGGCCCCAGC 481 GTGTTCCCCC TGGCCCCCTG CAGCCGCAGC ACCTCTGGCG GCACCGCCGC TCTGGGCTGC 541 CTGGTGAAGG ACTACTTCCC CGAGCCTGTG ACCGTGTCCT GGAACTCTGG CGCCCTGACC 601 AGCGGCGTGC ACACCTTCCC CGCCGTGCTG CAGAGCAGCG GCCTGTACAG CCTGAGCAGC

661 GTGGTGACCG TGCCCAGCAG CAGCCTGGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTGAACCAC

721 AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGCGC GTGGAGCTGA AGACCCCCCT GGGCGACACC

781 ACCCACACCT GCCCCAGATG TCCCGAGCCC AAGAGCTGCG ACACCCCCCC TCCCTGCCCT 841 CGCTGCCCTG AGCCTAAGTC CTGTGACACC CCTCCCCCTT GCCCCCGGTG TCCAGAGCCA

901 AAGTCTTGCG ATACCCCACC CCCCTGTCCA AGGTGCCCTG CCCCCGAGCT GCTGGGCGGA

961 CCCTCCGTGT TCCTGTTCCC CCCCAAGCCC AAGGACACCC TGATGATCAG CCGCACCCCC

1021 GAGGTGACCT GCGTGGTGGT GGACGTGAGC CACGAGGACC CCGAGGTGCA GTTCAAGTGG 1081 TACGTGGACG GCGTGGAGGT GCACAACGCC AAGACCAAGC CCCGCGAGGA GCAGTTTAAC 1141 AGCACCTTCC GCGTGGTGTC TGTGCTGACC GTGCTGCACC AGGACTGGCT GAACGGCAAG 1201 GAATACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAGGCC CTGCCTGCCC CCATCGAGAA GACCATCTCT 1261 AAGACCAAGG GCCAGCCTCG CGAGCCCCAG GTGTACACCC TGCCCCCCAG CCGCGAGGAG 1321 ATGACCAAGA ACCAGGTGTC CCTCACCTGC CTCGTGAAGG GCTTCTACCC CAGCGACATC 1381 GCCGTGGAGT GGGAGTCCAG CGGCCAGCCC GAGAACAACT ACAACACCAC CCCCCCCATG 1441 CTGGACAGCG ACGGCAGCTT CTTCCTGTAC AGCAAGCTGA CCGTGGACAA GAGCCGCTGG 1501 CAGCAGGGCA ACATCTTCTC TTGCAGCGTG ATGCACGAGG CCCTGCACAA CCGCTTCACC Detencion Notl

1561 CAGAAGAGCC TGAGCCTGTC CCCCGGCAAG TAATGAGCGG CCGC ,

SEQ ID NO: 42 (Secuencia de nucleotidos de la region de codificacion optimizada de LC de RhD3)

BamHI Kozak Inicio -

1 GGATCCGCCA CCATGGACAT GCGCGTGCCC GCCCAGCTGC TGGGCCTGCT GCTGCTGTGG

61 CTGAGGGGCG CCCGCTGCGA CATCCAGGTG ACCCAGAGCC CCAGCAGCCT GAGCGCCAGC

121 GTGGGCGACC GCGTGACCAT CAACTGCCGC GCCAGCCAGA GCATCGGCAC CTACCTGAAC

181 TGGTATCAGC AGAAGCCCGG CAAGGCCCCC AACCTGCTGA TCTACGCCGC CAGCTCCCTG 241 CAGAGCGGCG TGCCCAGCCG CTTCAGCGGC AGCGGCTCCG GCACCGACTT CACCCTGACC 301 ATCAGCAGCC TGCAGCCCGA GGACTTCGCC ACCTACTACT GCCAGCAGAC CTACAGCACC 361 CCCACCTGGA CCTTCGGCAG GGGCACCAAG GTGGAGATCA AGCGCACCGT GGCCGCCCCC

421 AGCGTGTTCA TCTTCCCCCC CAGCGACGAG CAGCTGAAGA GCGGCACCGC TAGCGTGGTG

481 TGCCTGCTGA ACAACTTCTA CCCCCGCGAG GCCAAAGTGC AGTGGAAGGT GGACAACGCC

541 CTGCAGTCCG GCAACAGCCA GGAGAGCGTC ACCGAGCAGG ACAGCAAGGA CTCCACCTAC

601 AGCCTGAGCA GCACCCTGAC CCTGAGCAAG GCCGACTACG AGAAGCACAA GCTGTACGCC 661 TGCGAGGTGA CCCACCAGGG CCTGTCCAGC CCCGTGACCA AGAGCTTCAA CCGCGGCGAG

Detencion Notl

721 TGCTGATGAG CGGCCGC

SEQ ID NO: 43 (Ccebador directo optimizado de HC de RhD1) 5-ATCG TCTAGA GCCACCATGGACTGGACCTG-3'

SEQ ID NO: 44 (Cebador inverso optimizado de HC de RhD1) 10 5-ATCG GGATCC TCATCACTTGCCGGGGGAC-31

SEQ ID NO: 45 (Cebador directo optimizado de LC de RhD1) 5‘-ATCG TCTAGA GCCACCATGGCCTGGGCCC-3'

SEQ ID NO 46 (Cebador inverso optimizado de LC de RhD1) 5-ATCG GGATCC TCATCAGCTGCACTCGGTGGGG-31

5 SEQ ID NO: 47 (Secuencia de la HC optimizada de RhD1 para insercion en el vector pCB3)

Xbal Kozak Inicio

1 TCTAGAGCCA CCATGGACTG GACCTGGCGC TTCCTGTTCG TGGTGGCCGC CGCCACCGGC

61 GTGCAGAGCC AGGTGCAGCT GGTGCAGAGC GGCGCCGAGG TGAAGAAGCC CGGCAGCAGC

121 GTCAAGGTGT CCTGCAAGGC CAGCGGCGGC ATCTTCCGCA CCTACGCCAT CTCTTGGGTC 181 CGGCAGGCTC CCGGGCAGGG GCTCGAGTGG ATGGGCGGCA TCATCCCCAT GTTCGGCACC 241 GTGAACTACG CCCAGAAGTT CCAGGGCCGC GTCACCATCA GCGCCGACAA GAGCACCAGC 301 ACCGCCTACA TGGAGCTGTC CCGCCTGCGC TCCGAGGACA CCGCCGTGTA CTACTGTGCT

361 AGGCCTCCCA GCGGCGGCTG CGGCGGCGAC TGCAGCCGCA GGGGCTACTA CTACGCTATG

421 GACGTGTGGG GCCAGGGCAC CACCATCACC GTGAGCAGCG CTAGCACCAA GGGCCCCAGC 481 GTGTTCCCCC TGGCCCCCAG CAGCAAGAGC ACCTCCGGCG GCACCGCCGC CCTGGGCTGC 541 CTGGTGAAGG ACTACTTCCC CGAGCCCGTG ACCGTGAGCT GGAACAGCGG CGCCCTGACC

601 AGCGGCGTGC ACACCTTCCC CGCCGTGCTG CAGAGCAGCG GCCTGTACAG CCTGAGCAGC 661 GTGGTGACCG TGCCCAGCAG CAGCCTGGGC ACCCAGACCT ACATCTGCAA CGTGAACCAC 721 AAGCCCAGCA ACACCAAGGT GGACAAGAAG GTGGAGCCCA AGAGCTGCGA CAAGACCCAC 781 ACCTGCCCCC CCTGCCCCGC CCCCGAGCTG CTGGGCGGCC CCTCCGTGTT CCTGTTCCCC 841 CCCAAGCCCA AGGACACCCT GATGATCAGC CGCACCCCCG AGGTGACCTG CGTGGTGGTG

901 GACGTGAGCC ACGAGGACCC CGAGGTGAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG

961 CACAACGCCA AGACCAAGCC CCGCGAGGAG CAGTACAACA GCACCTACCG CGTGGTGTCC

1021 GTGCTGACCG TGCTGCACCA GGACTGGCTG AACGGCAAGG AGTACAAGTG CAAGGTCTCC 1081 AACAAGGCCC TGCCCGCCCC CATCGAGAAG ACCATCAGCA AGGCCAAGGG GCAGCCTAGA 1141 GAGCCCCAGG TCTACACCCT GCCTCCATCC CGCGACGAGC TGACCAAGAA CCAGGTGTCC 1201 CTGACCTGTC TGGTCAAGGG CTTCTACCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCAAC 1261 GGCCAGCCCG AGAACAACTA CAAGACCACC CCCCCCGTGC TGGACAGCGA CGGCAGCTTC 1321 TTCCTGTACA GCAAGCTGAC CGTGGACAAG AGCCGCTGGC AGCAGGGCAA CGTGTTCAGC 1381 TGCAGCGTGA TGCACGAGGC CCTGCACAAC CACTACACCC AGAAGAGCCT GAGCCTGTCC Detencion BamHI

1441 CCCGGCAAGT GATGAGGATCC

SEQ ID NO: 48 (Secuencia de la LC optimizada de RhD1 para insercion en el vector pCB11)

Xbal Kozak Inicio

1 TCTAGAGCCA CCATGGCCTG GGCCCTGCTG TTCCTGACCC TGCTGACCCA GGGCACCGGC

61 AGCTGGGCCC AGAGCGCCCT GACCCAGCCC GCCAGCGTGA GCGGCAGCCC CGGCCAGTCT

121 ATCACCATCT CTTGTAGCGG CAGCAGCAGC GACGTGGGCG GCTACAAGTA CGTGTCTTGG

181 TATCAGCAGC ACCCCGGCAA GGCCCCCCAG CTGATGATCT ACGACGTGAA CAACCGCCCC

241 AGCGGCGTGA GCAACCGCTT CAGCGGCTCC AAGAGCGGCA ACACCGCCAG CCTGACCATC

301 TCTGGGCTGC AGGCTGAGGA CGAGGCCGAC TACTACTGCA GCAGCTACAC CAGCAGCTCC

361 ACCCGCGTGT TCGGCGGCGG CACCAAGCTG ACCGTGCTGG GCCAGCCCAA GGCCGCCCCC

421 AGCGTGACCC TGTTCCCCCC CAGCAGCGAG GAGCTCCAGG CCAACAAGGC TACCCTGGTG

481 TGCCTGATCA GCGACTTCTA CCCCGGCGCC GTGACCGTCG CCTGGAAGGC CGACAGCAGC

541 CCCGTGAAGG CCGGCGTGGA GACCACCACC CCCAGCAAGC AGAGCAACAA CAAGTACGCC

601 GCCAGCAGCT ACCTGAGCCT GACCCCCGAG CAGTGGAAGA GCCACAAGAG CTACAGCTGC

Detencion

661 CAGGTGACCC ACGAGGGCAG CACCGTGGAG AAGACCGTGG CCCCCACCGA GTGCAGCTGA

BamHI

721 TGAGGATCC

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo monoclonal anti-RhD aislado que comprende:

   una region variable de cadena pesada que es al menos un 80% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 2 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son identicas a las respectivas primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 2, y

   una region variable de cadena ligera que es al menos 80% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 4 y tiene una primera, segunda y tercera CDR que son identicas a las respectivas primera, segunda y tercera CDR de la SEQ ID NO: 4;

   en el que las CDR del anticuerpo monoclonal se determinan usando la herramienta IMGT/V-QUEST.
2. 2. El anticuerpo de la reivindicacion 1, en el que la region variable de la cadena pesada es al menos el 90% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 2 y la region variable de la cadena ligera es al menos el 90% identica a la region variable de la SEQ ID NO: 4.
3. 3. El anticuerpo de cualquier reivindicacion precedente, en el que el anticuerpo comprende un dominio constante de cadena ligera y un dominio constante de cadena pesada.
4. 4. El anticuerpo de la reivindicacion 3, en el que el anticuerpo comprende una region constante de cadena pesada.
5. 5. El anticuerpo de la reivindicacion 3 o 4, en el que dicho dominio o region constante de cadena pesada es un dominio o region constante de IgG 1 o IgG 3.
6. 6. Un polinucleotido aislado que codifica la cadena ligera y pesada de un anticuerpo de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente.
7. 7. Un vector de expresion que incluye secuencias de codificacion que codifican las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
8. 8. Un sistema de expresion que incluye secuencias codificantes que codifican las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo el sistema de expresion:

   un primer vector de expresion que incluye la secuencia de codificacion que codifica la cadena ligera; y

   un segundo vector de expresion que incluye la secuencia de codificacion que codifica la cadena pesada.
9. 9. Una celula transformada con un vector o sistema de expresion de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8.
10. 10. Un metodo para fabricar anticuerpos monoclonales, que comprende cultivar celulas recombinantes de acuerdo con la reivindicacion 9, y recuperar el anticuerpo monoclonal del medio de cultivo.
11. 11. Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
12. 12. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 11, en la que la composicion farmaceutica comprende un primer anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un segundo anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que dicho primer y segundo anticuerpos monoclonales son distintos entre sf.
13. 13. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 12, en la que el primer anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada que comprende un dominio o region constante de IgG 1, y el segundo anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada que comprende un dominio o region constante de IgG 3.
14. 14. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una composicion farmaceutica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, para uso en un metodo para inhibir o prevenir la inmunizacion de un paciente humano RhD negativo contra sangre RhD positiva.
15. 15. Uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en la fabricacion de un medicamento para inhibir o prevenir la inmunizacion de un paciente humano RhD negativo contra sangre RhD positiva.