ES2692539T3 - Polipéptidos antiinflamatorios no sialilados - Google Patents

Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia modificada que comprende la SEQ ID NO: 2, en la que la secuencia modificada no está sialilada y el polipéptido tiene una actividad antiinflamatoria que es más elevada que la de un polipéptido sialilado precursor que comprende la SEQ ID NO: 1; y en la que el polipéptido aislado tiene una capacidad para unirse a DC-SIGN, hFcγRIIA, y RIIB.

Description

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DESCRIPCION

Polipeptidos antiinflamatorios no sialilados Intereses gubernamentales

La invencion que se desvela en el presente documento se realizo, al menos en parte, con apoyo gubernamental bajo Concesion N.° NIH AI035875 del National Institutes of Health. Por consiguiente, el gobierno de Estados Unidos tiene ciertos derechos en la presente invencion.

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a agentes antiinflamatorios, a composiciones y a metodos para tratar trastornos inflamatorios.

Antecedentes

Los trastornos inflamatorios, incluyendo las enfermedades autoinmunitarias, son trastornos que implican activacion anomala y posterior migracion de los globulos blancos a zonas afectadas del cuerpo. Estas afecciones incluyen una amplia gama de dolencias que afectan las vidas de millones de personas en todo el mundo. Aunque en la actualidad hay diversos tratamientos disponibles, muchos poseen efectos secundarios significativos o no son muy eficaces para aliviar todos los smtomas. Por lo tanto, existen necesidades de agentes antiinflamatorios para el tratamiento de trastornos inflamatorios y necesidades de metodos para identificar y evaluar agentes de ese tipo.

La inmunoglobulina G (IgG) se ha valorado desde hace tiempo porque es un mediador en actividades tanto pro- como antiinflamatorias a traves de interacciones mediadas por su fragmento Fc. Aunque las interacciones Fc-FcyR son responsables de las propiedades proinflamatorias de complejos inmunologicos y anticuerpos citotoxicos, la gamma globulina intravenosa (IVIG) y sus fragmentos Fc son antiinflamatorios y se usan ampliamente para suprimir enfermedades inflamatorias. Se ha propuesto que la glicosilacion de IgG es fundamental para la regulacion de la citotoxicidad y el potencial inflamatorio de la IgG. Por ejemplo, se ha sugerido que la actividad antiinflamatoria de la IVIG es una propiedad del fragmento Fc y su glicano unido, que requiere enlaces en a.2,6 de acido sialico terminales, lo que indica un requisito combinado para la estructura principal polipeptfdica espedfica y la estructura de glicano para inmunosupresion. (Anthony, et al., 2008, Science 320: 373-376 y documento WO 2007/117505).

Sin embargo, solo una poblacion menor de IgG en IVIG tiene glicanos que terminan en a.2,6 de acidos sialicos (sFc) y la actividad antiinflamatoria. Como resultado, para la supresion de la inflamacion desencadenada por autoanticuerpos en una diversidad de entornos clmicos, la IVIG se tiene que administrar en dosis elevadas (1-2 g/kg) para enriquecer las IgG sialiladas o, de otro modo aumentar la sialilacion de las IgG (Solicitudes de Estados Unidos N.os 20080206246, y 20090004179, y Nimmerjahn et al. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008)).

Lund et al. J Immunol 157, 4963-4969 (1996) desvela variantes de Fc en las que la sustitucion de los restos 241, 243, 264, 265 o 301 con alanina dio como resultado un aumento de la galactosilacion y la sialilacion con respecto a las cadenas de oligosacarido de tipo silvestre.

La presente invencion aborda y satisface las necesidades que se han mencionado anteriormente mediante la identificacion de polipeptidos antiinflamatorios sin sialilacion.

Sumario

La presente invencion se refiere a polipeptidos y a sus usos para tratar trastornos inflamatorios, por ejemplo, enfermedades autoinmunitarias.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion presenta un polipeptido aislado que comprende una secuencia modificada que comprende la SEQ ID NO: 2, en la que la secuencia modificada no esta sialilada y el polipeptido tiene una actividad antiinflamatoria que es mas elevada que la de un polipeptido sialilado precursor que comprende la SEQ ID NO: 1; y en la que el polipeptido aislado tiene una capacidad para unirse a DC-SIGn, hFcYRIIA y RIIB. En una realizacion, el polipeptido aislado tiene una capacidad para unirse a hFcYRIIA o RIIB a una Kd de 2 x 10'5 M o inferior (es decir, Ka de 5,0 x 104 M'1 o superior). En algunos ejemplos, la secuencia modificada consiste en la SEQ ID NO: 2.

La descripcion desvela un metodo para preparar un polipeptido que tiene una actividad antiinflamatoria. El metodo incluye, entre otros, etapas para proporcionar un polipeptido precursor que tiene la secuencia de una region Fc de IgG o una primera secuencia de acidos nucleicos codifica el polipeptido precursor; y modificar el polipeptido precursor para obtener un polipeptido modificado de modo que el polipeptido modificado esta libre de sialilacion e imita la estructura de una forma sialilada de la region Fc de IgG. La etapa de modificacion se puede realizar modificando la primera secuencia de acidos nucleicos para obtener un segundo acido nucleico que codifica el

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polipeptido modificado. La descripcion tambien proporciona un polipeptido preparado con el metodo que se acaba de describir.

En un segundo aspecto, la invencion presenta un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el polipeptido que se ha descrito anteriormente; un vector de expresion que comprende el acido nucleico; y una celula hospedadora que comprende el acido nucleico. La invencion tambien presenta un metodo para producir un polipeptido que comprende cultivar la celula hospedadora en un medio en condiciones que permitan la expresion de un polipeptido codificado por el acido nucleico, y purificar el polipeptido de la celula cultivada o del medio de la celula.

En un tercer aspecto, la invencion presenta una formulacion farmaceutica que comprende (i) el polipeptido o acido nucleico que se ha descrito anteriormente, y (ii) un vetnculo farmaceuticamente aceptable.

En un cuarto aspecto, la invencion proporciona un polipeptido aislado como se ha descrito anteriormente, o un acido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipeptido que se ha mencionado anteriormente, para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. La descripcion tambien desvela un metodo para tratar una enfermedad inflamatoria que incluye administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad terapeuticamente eficaz del polipeptido o acido nucleico que codifica el polipeptido que se han mencionado anteriormente. Tambien se proporciona el uso del polipeptido o acido nucleico en la preparacion de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria. La descripcion tambien presenta un polipeptido aislado, acido nucleico, vector de expresion, celula hospedadora, composicion, o metodo para tratar una enfermedad inflamatoria esencialmente como se muestra y se describe en el presente documento.

Los detalles de una o mas organizaciones de la invencion se establecen en la descripcion que sigue a continuacion. Otras caractensticas, objetos, y ventajas de la invencion seran evidentes a partir de la descripcion y las reivindicaciones.

Descripcion de las figuras

Las FIGs. 1a-c son diagramas y fotograffas que muestran que el acido sialico unido en a2,6 proporciono actividad de union de DC-SIGN a Fc de IgG1 humana recombinante.

Las FIGs. 2a-b son diagramas y fotograffas que muestran que la interrupcion de las interacciones Fc-glicano proporcionaban actividad de union de DC-SIGN a Fc de IgG1 humana recombinante.

La FIG. 3 es un conjunto de diagramas que muestran que la mutacion FA241 en Fc de hlgGI resume la actividad antiinflamatoria de sFc en a2,6.

Las FIGs. 4a-d son diagramas que muestran requisitos de caracterizacion para actividad antiinflamatoria de FA241.

La FIG. 5 es un conjunto de diagramas que muestran que la mutacion FA241 aumento la union al receptor Fcy.

Las FIGs. 6a-b son fotograffas que muestran induccion de ARNm de IL-33 en macrofagos obtenidos de medula osea por FA241.

Descripcion detallada

La presente invencion se basa, al menos en parte, en un descubrimiento inesperado de que las variantes de Fc de IgG no sialilada transmiten actividad antiinflamatoria e imitan el efecto del Fc sialilado en 2,6 como mediadores antiinflamatorios.

Sialilacion de IgG y Fc

La IgG es la inmunoglobulina de suero principal. Es una glicoprotema formada por dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras identicas, que a su vez estan formadas por dominio variable y constante. La IgG contiene un solo glicano unido en N en Asn297 en el dominio CH2 en cada una de sus dos cadenas pesadas. El carbohidrato complejo, unido con enlace covalente esta formado por un nucleo de polisacarido penta-polisacarido biantenario, que contiene N-acetilglucosamina (GIcNAc) y manosa (man). De forma variable se encuentra modificacion adicional de la estructura de carbohidrato nucleo se observa en anticuerpos de suero con la presencia de restos de fucosa, GIcNAc de ramificacion, galactosa (gal) y acido sialico terminal (sa). Por lo tanto se han detectado mas de 40 glicoformas diferentes que se van a unir con enlace covalente a este unico sitio de glicosilacion (Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009, 1990). Se ha mostrado que la glicosilacion de IgG es esencial para la union a todos los FcyR manteniendo una conformacion abierta de las dos cadenas pesadas. Jefferis y Lund, Immune. 1 Lett. 82, 57 (2002), Sondermann et al., J. Mol. Biol. 309, 737 (2001). Se cree que esta glicosilacion de IgG para union a FcyR representa la incapacidad de los anticuerpos de IgG desglicosilados para mediar en respuestas inflamatorias desencadenadas in vivo, tales como ADCC, fagocitosis y la liberacion de mediadores inflamatorios. Nimmerjahn y Ravetch, Immunity

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24, 19 (2006). Se han sugerido observaciones adicionales de que las glicoformas de IgG individuales pueden contribuir a la modulacion de respuestas inflamatorias por las afinidades alteradas de los FcyR individuales informados para anticuerpos de IgG que contienen lo que carecen de fucosa y sus consiguientes efectos en la citotoxicidad. Shields et al., J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn y Ravetch, Science 310, 1510 (2005). Una relacion entre estados autoinmunitarios y patrones de glicosilacion espedficos de anticuerpos de IgG se ha observado en pacientes con artritis reumatoide y varias autoimmune vasculitis en los que se ha informado de disminucion de la galactosilacion y sialilacion de anticuerpos de IgG. Parekh et al., Nature 316, 452 (1985), Rademacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al., 128, 621 (2000), Holland et al., Biochim. Biophys. Acta December 27. Tambien se informado que variaciones en glicoformas de IgG estan asociadas con envejecimiento y con inmunizacion, aunque la significancia in vivo de estas alteraciones no se ha determinado. Shikata et al., Glycoconj. J. 15, 683 (1998) Lastra, et al., Autoimmunity 28, 25 (1998).

Como se desvela en el presente documento, ciertas variantes de Fc IgG de no sialilada tambien proporcionan de forma sorprendente una actividad antiinflamatoria. Tales variantes, incluyendo la variante FA241, representan especies dentro de un genero de moleculas de mayor tamano, en virtud de la imitacion de las propiedades estructurales y biologicas del Fc sialilado, pero no requieren sialilacion, se pueden desarrollar como agentes terapeuticos antiinflamatorios.

Polipeptidos y Acidos Nucleicos

Polipeptidos

Como se desvela en el presente documento, la presente invencion proporciona polipeptidos aislados que tienen secuencias de variantes de Fc de IgG humana que carece de una cadena de polisacaridos que tiene un acido sialico terminal conectado a un resto de galactosa a traves del enlace en a2,6 en la Asn297 que se ha mencionado anteriormente. Tales variantes de Fc de IgG no sialiladas se pueden obtener de un anticuerpo que se produce de manera natural, o expresadas en una lmea celular.

En una realizacion, la region Fc incluye una o mas sustituciones de la secuencia de aminoacidos de hlgG1. Aunque no se limita a estas, las siguientes regiones de Fc de IgG1 se proporcionan como sigue a continuacion:

Fc de hl<jG1 (cemenzande desde el amineadde 210 en el sistema de Kal>at):

KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVVVDVSHE D PEVKFNWYVDCVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV3NKALP APIEKTISKAKGQPRE PQ:V Y TLP P SRDELTKNQ VSL'T CLVKGFY PSD IAVE WE SNGQ PEN NYKT T PFVLD5 DG 5FFLY 5 KL T V DK.5 RW QQ GNVFSCS VKH E AL HN H Y T QK S L 5 L 5 PGK (SF.Q id no; l.; F?.4l y F2A3 estan subrayados)

FcdehlyGl FA241:

K V DKRVE PK S C DK T H TC P PC F A PE L LGG P 5 V AL F P PK PKD T LMIS RT PE V T C V W D VS H E D PE VK FN W Y V DGV E V HN AKTKFR3EQYNSTY RVVSVLTVL HQ DNLNGKEYKCKV S NKAL P APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN HYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHHHYTQKSLSLSPGK fSEQ ID NO: 2)

FcdeblyGl FA243:

K V DKRVE PK S C DK T H TC P PC P A PE L LGG P 3 V FL A P PKPKD T LMIS RT PE V T C V V V D VS H E D ? E VK EN WY VD G V E VHNAKT'KPREEQYNSTYR,V V 3 VL T VL HQ DWLNG KE YKC K V SNKALP APIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSEIAVEWESNGQPEN NYKTTPPVLDS DGSFFLYSKL T V DK 3 R W QQ GNVFSCS VMH.E AL HN H Y T QK S L S L S PGK (SEQ ID NC: 3)

En el presente documento los terminos “peptido”, “polipeptido”, y “protema” se usan indistintamente para describir la colocacion de restos de aminoacido en un polfmero. Un peptido, polipeptido, o protema puede estar formado por los 20 aminoacidos que se produce de forma natural convencionales, ademas de aminoacidos raros y analogos de aminoacido sinteticos. Pueden ser cualquier cadena de aminoacidos, independientemente de la longitud de la modificacion posterior a la traduccion (por ejemplo, glicosilacion o fosforilacion). El peptido, polipeptido, o protema “de la presente invencion” incluye de versiones producidas de forma recombinante o de forma sintetica que tienen

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los dominios o porciones particulares que se unen a DC-SIGN, FcyRIIA, y FcyRIIB. El termino tambien incluye polipeptidos que tienen un resto de metionina amino-terminal (utiliza la expresion en celulas procariotas).

Un polipeptido o protema "aislados" se refiere a un polipeptido o protema que se ha separado de otras protemas, Kpidos, y acidos nucleicos con los que se asocia de forma natural. El polipeptido/protema puede constituir al menos un 10 % (es decir, cualquier porcentaje entre un 10 % y un 100 %, por ejemplo, un 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, y un 99 %) en peso seco de la preparacion purificada. La pureza se puede medir mediante cualquier metodo convencional apropiado, por ejemplo, por cromatograffa en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o analisis de HPLC. Un polipeptido/protema aislado que se describe en la invencion se puede purificar de una fuente natural, se puede producir mediante tecnicas de ADN recombinante, o mediante metodos qmmicos. Un equivalente funcional de Fc de IgG se refiere a un derivado polipeptfdico de Fc de IgG, por ejemplo, una protema que tiene una o mas mutaciones puntuales, inserciones, deleciones, truncamientos, una protema de fusion, o una combinacion de los mismos. Conserva esencialmente la actividad del Fc de IgG, es decir, la capacidad para unirse al respectivo receptor y desencadenar la respectiva respuesta celular. El polipeptido aislado puede contener la SEQ ID NO: 2. En general, el equivalente funcional es identico en al menos un 75% (por ejemplo, cualquier numero entre un 75 % y un 100 %, inclusive, por ejemplo, identico en un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, y un 99 %) a la SEQ ID NO: 2.

El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoacidos o de dos acidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993. Un algoritmo de ese tipo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (version 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Las busquedas de nucleotido con BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuacion = 100, longitud de palabra - 12 para obtener secuencias de nucleotidos homologas a las moleculas de acido nucleico de la invencion. Las busquedas de protema con BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuacion = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoacidos homologas a las moleculas de protema de la invencion. Cuando existen espacios entre dos secuencias, se puede usar BLAST con Espacios como se describe en Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402, 1997. Cuando se usan los programas BLAST y BLAST con Espacios, se pueden usar los parametros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST).

La composicion de los aminoacidos del polipeptido que se describe en el presente documento puede variar sin alterar la capacidad del polipeptido para unirse al respectivo receptor y desencadenarla respectiva respuesta celular. Por ejemplo, puede contener una o mas sustituciones de aminoacido conservativas. Una "sustitucion de aminoacido conservativa" es una en la que el resto de aminoacidos se sustituye con un resto de aminoacido que tiene una cadena lateral similar. En la tecnica se han definido familias de restos de aminoacido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoacidos con cadenas laterales basicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acidas (por ejemplo, acido aspartico, acido glutamico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cistema), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadenas laterales con ramificacion beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromaticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Por lo tanto, un resto de aminoacido no esencial predicho en, por ejemplo, la SEQ ID NO: 2, se sustituye preferentemente con otro resto de aminoacidos de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, se pueden introducir mutaciones de forma aleatoria a lo largo de toda o parte de las secuencias, tal como mediante mutagenesis por saturacion, y los votantes resultantes se pueden identificar sistematicamente para la capacidad para unirse al respectivo receptor y desencadenar la respectiva respuesta celular para identificar mutantes que retienen la actividad como se describe a continuacion en los ejemplos.

Un polipeptido como se describe en la presente invencion se puede obtener como un polipeptido recombinante. Para preparar un polipeptido recombinante, un acido nucleico que lo codifica (por ejemplo, FA241, SEQ ID NO: 2) se puede unir a otro acido nucleico que codifica un asociado de fusion, por ejemplo, glutation-s-transferasa (GST), etiqueta de epftopo de 6x-His, o protema del Gen 3 de M13. El acido nucleico de fusion resultante expresa, en celulas hospedadoras adecuadas, una protema de fusion que se puede aislar con metodos conocidos en la tecnica. La protema de fusion aislada se puede tratar adicionalmente, por ejemplo, mediante digestion enzimatica, para retirar el asociado de fusion y obtener el polipeptido recombinante de la presente invencion.

Acidos Nucleicos

Otro aspecto de la invencion presenta un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el polipeptido o protema que se ha descrito anteriormente. Un acido nucleico se refiere a una molecula de ADN (por ejemplo, un ADNc o ADN genomico), una molecula de ARN (por ejemplo, un ARNm), o un analogo de ADN o aRn. Un analogo de ADN o ARN se puede sintetizar a partir de analogos de nucleotido. La molecula de acido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es un ADN bicatenario. Un "acido nucleico aislado" se refiere a un acido nucleico cuya estructura no es identica a la de cualquier acido nucleico que se produce de forma natural o a la de cualquier fragmento de un acido nucleico genomico que se produce de forma natural. Por lo tanto la expresion cubre, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de la molecula de ADN genomico que se produce de forma natural pero que no esta flanqueado por ambas secuencias codificantes que flanquean parte de la

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molecula en el genoma del organismo en el que se produce de forma natural; (b) un acido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genomico de un procariota o eucariota de un modo tal que la molecula resultante no es identica a ningun vector o ADN genomico que se produce de forma natural; (c) una molecula separada tal como un ADNc, un fragmento genomico, un fragmento producido por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restriccion; y (d) una secuencia de nucleotidos recombinante que es parte de un gen tubrido, es decir, un gen que codifica una protema de fusion. El acido nucleico que se ha descrito anteriormente se puede usar para expresar la protema de fusion de la presente invencion. Para este fin, el acido nucleico se puede unir de forma operativa a secuencias reguladoras adecuadas para generar un vector de expresion.

Un vector se refiere a una molecula de acido nucleico capaz de transportar otro acido nucleico al que se ha unido. El vector puede ser capaz de replicacion autonoma o integrarse en un ADN hospedador. Los ejemplos del vector incluyen un plasmido, cosmido, o vector viral. El vector incluye un acido nucleico en una forma adecuada para expresion del acido nucleico en una celula hospedadora. Preferentemente el vector incluye una o mas secuencias reguladoras unidas de forma operativa a la secuencia de acidos nucleicos a expresar.

Una "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores, y otros elementos de control de expresion (por ejemplo, senales de poliadenilacion). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresion constitutiva de una secuencia de nucleotidos, asf como secuencias reguladoras y/o inducibles espedficas de tejido. El diseno del vector de expresion puede depender de factores tales como la eleccion de la celula hospedadora a transformar, el nivel de expresion de protema o ARN deseados, y similares. El vector de expresion se puede introducir en celulas hospedadoras para producir un polipeptido de la presente invencion. Un promotor se define como una secuencia de ADN que dirige ARN polimerasa para que se una a ADN e iniciar la smtesis de ARN. Un promotor fuerte es uno que hace que los ARNm se inicien a frecuencia elevada.

Como se ha mencionado anteriormente cualquier polinucleotido o un polinucleotido biologicamente equivalente disponible para el experto con el mismo fin pretendido se puede insertar en un vector de expresion apropiado y se puede unir con otras moleculas de ADN para formar "moleculas de ADN recombinante" que expresan este receptor. Estos vectores pueden estar formados por ADN o ARN; para la mayona de los fines de clonacion son preferentes los vectores de ADN. Los vectores habituales incluyen plasmidos, virus modificados, bacteriofagos y cosmidos, cromosomas artificiales de levadura y otras formas de ADN episomico o integrado. Dentro del alcance del experto esta determinar un vector apropiado para un uso en particular.

Para expresar los Fc de IgG que se han mencionado anteriormente se puede usar una diversidad de vectores de expresion de mamfferos. Como se ha indicado anteriormente, los vectores de expresion pueden ser secuencias de aDn que son necesarias para la transcripcion de ADN clonado y la traduccion de sus ARNm en un hospedador apropiado. Los vectores de ese tipo se pueden usar para expresar ARN eucariota en una diversidad de hospedadores tales como bacterias, algas azules y verdes, celulas vegetales, celulas de insecto y celulas de animal. Los vectores disenados de forma espedfica permiten el barajado de ADN entre hospedadores tales como celulas de bacterias-levadura o bacterias-animal. Un vector de expresion construido de forma apropiada debena contener: un origen de replicacion para replicacion autonoma en celulas hospedadoras, marcadores seleccionables, un numero limitado de sitios de enzima de restriccion utiles, un potencial para que numero de copias elevado, y promotores activos. Los vectores de expresion pueden incluir, pero no se limitan a, vectores de clonacion, vectores de clonacion modificados, plasmidos o virus disenados de forma espedfica. Los vectores de de expresion de mairnfero disponibles en el mercado que pueden ser adecuados incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), e IZD35 (ATCC 37565).

Dentro del alcance de la presente invencion tambien se encuentra una celula hospedadora que contiene el acido nucleico que se ha descrito anteriormente. Los ejemplos incluyen celulas de E. coli, celulas de insecto (por ejemplo, usando vectores de expresion de baculovirus), celulas de levadura, o celulas de mai^ero. Vease por ejemplo, Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Para producir un polipeptido de la presente invencion, una celula hospedadora se puede cultivar en un medio en condiciones que permitan la expresion del polipeptido codificado por un acido nucleico de la presente invencion, y purificar el polipeptido de la celula cultivada o del medio de la celula. Como alternativa, el acido nucleico de la presente invencion se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotor T7 y T7 polimerasa 2.

Adicionalmente, se desvela que todos los Fc de IgG que se producen de forma natural, los Fc de IgG modificados por ingeniena genetica, y los Fc de IgG sintetizados por via qmmica, se pueden usar para poner en practica la invencion que se desvela en el mismo. El Fc de IgG obtenido mediante tecnologfa del ADN recombinante puede tener la misma secuencia de aminoacidos que [FA241] SEQ ID NO: 2) o un equivalente funcional de la misma. La expresion "Fc de IgG" tambien cubre versiones qmmicamente modificadas. Los ejemplos de los Fc de IgG qmmicamente modificado incluyen los Fc de IgG sometidos a cambio de conformacion, adicion o delecion de una

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cadena de azucar, y Fc de IgG a que se ha unido un compuesto tal como polietilenglicol.

La eficacia de un polipeptido/protema preparados de ese modo se puede verificar usando un modelo animal, tal como un raton transgenico, como se describe a continuacion. Cualquier aumento estad^sticamente significativo en la expresion in vivo debas o filos de IL-33 o expresion del receptor FcyRIIB en macrofagos efectores indica que el polipeptido/protema es un candidato para el tratamiento de los trastornos que se mencionan a continuacion. En una realizacion, los ensayos que se han descrito anteriormente "se pueden basar en la medicion de una union a protema DC-SIGN o celulas DC-SIGN(+). La tecnica esta llena de diversas tecnicas disponibles para el experto en la materia que seran adecuadas para medir la capacidad de un compuesto con respecto a DC-SIGN o a celulas DC-SIGN(+) y cambios relacionados en la expresion de un gen regulado por la ruta de DC-SING, tal como IL-33. El experto en la materia sera capaz de mezclar y hacer coincidir estas diversas herramientas de investigacion sin experimentacion excesiva. Una vez purificadas y sometidas a ensayo mediante metodos convencionales o de acuerdo con los ensayos y metodos que se describen en los ejemplos que siguen a continuacion, las variantes de Fc de IgG no sialilada se pueden incluir en la composicion farmaceutica para tratar trastornos inflamatorios.

Como se usa en el presente documento, "anticuerpo" se usa en el sentido mas amplio y de forma espedfica cubre anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud completa), anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespedficos (por ejemplo, anticuerpos biespedficos), y fragmentos de anticuerpos siempre y cuando presenten la actividad biologica deseada.

Como se usa en el presente documento, los "fragmentos de anticuerpo", pueden comprender una parte de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye en la region variable o de union a antfgenos del anticuerpo intacto la region Fc de un anticuerpo que retiene la capacidad de union a FcR. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespedficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpos retienen preferentemente al menos parte de la region bisagra y opcionalmente la region CH1 de una cadena pesada de IgG. Mas preferentemente, los fragmentos de anticuerpo retienen toda la region constante de una cadena pesada de IgG, e incluyen una cadena ligera de IgG.

Como se usa en el presente documento, la expresion "fragmento de Fc" o "region Fc" se usa para definir una region C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina. La "region Fc" puede ser una region Fc de secuencia nativa o una region Fc variable. Aunque los lfmites de la region Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina podnan variar, normalmente se define que la region Fc de cadena pesada de IgG humana normalmente produce un estiramiento de un resto de aminoacido en la posicion Cys226, o de Pro230, con respecto al extremo carboxilo terminal del mismo.

Una "region Fc de secuencia nativa" comprende la secuencia de aminoacidos identica a la secuencia de aminoacidos de una region Fc encontrada en la naturaleza. Una "region Fc variable" como observa alguien con una experiencia habitual en la materia comprende una secuencia de aminoacidos que se diferencia de la de una region Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una "modificacion de aminoacido". Preferentemente, la region Fc variable tiene al menos una sustitucion de aminoacido en comparacion con una region Fc de secuencia nativa o con respecto a la region Fc de un polipeptido precursor, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoacido, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoacido en una region Fc de secuencia nativa o en la region Fc del polipeptido precursor. En el presente documento la region Fc tendra preferentemente una homologfa de al menos aproximadamente un 75 o un 80 % con una region Fc de secuencia nativa y/o con una region Fc de un polipeptido precursor, y mas preferentemente una homologfa de al menos aproximadamente un 90 % con respecto a la misma, mas preferentemente una homologfa de al menos aproximadamente un 95 % con respecto a la misma, incluso mas preferentemente, una homologfa de al menos aproximadamente un 99 % con respecto a la misma.

Los terminos "receptor de Fc" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la region Fc de un anticuerpo. En una realizacion de la invencion, FcR es un FcR humano de secuencia nativa. En otra realizacion, FcR, incluyendo FcR humano, se une a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, incluyendo variantes alelicas y como alternativa formas de corte y empalme de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activacion") y FcyRIIB (un "receptor de inhibicion"), que tienen secuencias de aminoacidos similares que se diferencian principalmente en los dominios citoplasmaticos de los mismos. El receptor de activacion FcyRIIA tiene un motivo de activacion basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) en su dominio citoplasmatico. El receptor de inhibicion FcyRIIB contiene un motivo de inhibicion basado en tirosina inmunorreceptora (ITIM) en su dominio citoplasmatico (de hacer la revision en Daron, Annu Rev Immunol, 15, 203-234 (1997); los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4, 25-34 (1994); y de Haas et al., J Lab Clin Med, 126, 330-41 (1995), Nimmerjahn y Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundamental Immunology, ed William Paul 5a Ed.

El termino "nativo" o "precursor" se refiere a un polipeptido no modificado que comprende la secuencia de aminoacidos de Fc. El polipeptido precursor puede comprender una region Fc de secuencia nativa o una region Fc con modificaciones en la secuencia de aminoacidos preexistente (tales como adiciones, deleciones y/o sustituciones).

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Composiciones

Dentro del alcance de la presente invencion se encuentra una composicion que contiene un vetuculo adecuado y el polipeptido como se define en las reivindicaciones 1 a 3, o un acido nucleico como se define en la reivindicacion 4.

La composicion puede ser una composicion farmaceutica que contiene un vetuculo farmaceuticamente aceptable o una composicion cosmetica que contiene un vetuculo cosmetica en que aceptable.

La expresion "composicion farmaceutica" se refiere a la combinacion de un agente activo con un vetuculo, inerte o activo, que hace que la composicion sea especialmente adecuada para diagnostico opuso terapeutico in vivo o ex vivo. Un "vetuculo farmaceuticamente aceptable", despues de su administracion o en un sujeto, no produce efectos fisiologicos indeseables. En la composicion farmaceutica el vetuculo debe ser "aceptable" tambien en el sentido en el que es compatible con el principio activo y puede ser capaz de estabilizarla. Uno o mas agentes solubilizantes se pueden usar como vehfculos farmaceuticos para la administracion de un compuesto activo. Los ejemplos de un vetuculo farmaceuticamente aceptable incluyen vetuculos, adyuvantes, aditivos y diluyentes biocompatibles para conseguir una composicion que se puede usar como una forma de dosificacion. Los ejemplos de otros vetuculos incluyen oxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa y lauril sulfato sodico.

La composicion que se ha descrito anteriormente, en cualquiera de las formas que se han descrito anteriormente, se puede usar para tratar trastornos caracterizados por inflamacion. Una cantidad eficaz se refiere a la cantidad de un compuesto/agente activo que se necesita para proporcionar un efecto terapeutico en un sujeto tratado. Las dosis eficaces variaran, tal como reconocen las personas con experiencia en la materia, dependiendo de los tipos de enfermedades tratadas, via de administracion, uso de excipiente, y la posibilidad de uso simultaneo con otro tratamiento terapeutico.

Una composicion farmaceutica de la presente invencion se puede administrar por via parenteral, por via oral, por via nasal, por via rectal, por via topica, o por via bucal. El termino "parenteral", como se usa en el presente documento, se refiere a inyeccion subcutanea, intracutanea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, o intracraneal, asf como cualquier tecnica de infusion adecuada.

Una composicion inyectable esteril puede ser una solucion o suspension en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no toxico. Las soluciones de ese tipo incluyen, 1,3-butanodiol, manitol, agua, solucion de Ringer, y solucion isotonica de cloruro sodico. Ademas, de forma convencional se usan aceites no volatiles como un disolvente o medio de suspension (por ejemplo, mono- o digliceridos sinteticos). Los acidos grasos, tales como acido oleico y sus derivados gliceridos, son utiles en la preparacion de inyectables, al igual que lo son los aceites farmaceuticamente aceptables naturales, tales como aceite de oliva o aceite de ricino, versiones polioxietiladas de los mismos. Estas soluciones o suspensiones oleosas tambien deben contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tal como, pero no que no se limita a, carboximetil celulosa, o a agentes de dispersion similares. Otros tensioactivos usados normalmente, tales como TWEENS o SPANS u otros agentes emulsionantes o potenciadores de la biodisponibilidad similares, que se usa normalmente en la fabricacion de formas de dosificacion solida, lfquida o de otro tipo, farmaceuticamente aceptables, tambien se pueden usar con la finalidad de formulacion.

Una composicion para administracion oral puede ser cualquier forma de dosificacion oralmente aceptable que incluye capsulas, comprimidos, emulsiones y suspensiones acuosas, dispersiones, y soluciones. En el caso de comprimidos, los vehfculos usados normalmente incluyen lactosa y almidon de mafz. Generalmente tambien se anaden agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio. Para administracion oral en una forma de capsula, los diluyentes utiles incluyen lactosa y almidon de mafz seco. Cuando las suspensiones o emulsiones acuosas se administran por via oral, el principio activo se puede suspender o disolver en una fase oleosa combinada con agentes emulsionantes o de suspension. Si se desea, se pueden anadir ciertos agentes edulcorantes, saborizantes, o colorantes.

Las composiciones farmaceuticas para administracion topica de acuerdo con la invencion que se describe se pueden formular como soluciones, pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, pastas, geles, pulverizaciones, aerosoles, o aceites. Como alternativa, las formulaciones topicas se pueden presentar en forma de parches o apositos impregnados con principio o principios activos, que opcionalmente pueden comprender uno o mas excipientes o diluyentes. En algunas realizaciones preferentes, las formaciones topicas incluyen un material que podna aumentar la absorcion o penetracion del agente o agentes activos a traves de la piel u otras zonas afectadas. La composicion topica es util para tratar trastornos inflamatorios en la piel, incluyendo eccema, acne, rosacea, psoriasis, dermatitis por contacto, y reacciones a veneno de hiedra.

Una composicion topica contiene una cantidad segura y eficaz de vehfculo dermatologicamente aceptable adecuado para aplicacion a la piel. Una composicion o componente "cosmeticamente aceptable" o "dermatologicamente aceptable" se refiere a una composicion o componente que es adecuado para su uso en contacto con la piel humana sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alergica, excesivas, y similares. El vehfculo permite la administracion de un agente activo y componente opcional a la piel a una concentracion o concentraciones apropiadas. Por lo tanto, el vehfculo puede actuar como un diluyente, dispersante, disolvente, o similar, para

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garantizar que los materiales activos se apliquen a y se distribuyan uniformemente sobre la diana seleccionada a una concentracion apropiada. El vehffculo puede ser solido, semisolido, o ffquido. El vehffculo puede estar en forma de una locion, una crema, o un gel, en particular algo que tenga un espesor o fluencia suficientes para evitar que los materiales activos sedimenten. El vehffculo puede ser inerte o tener beneficios dermatologicos. Tambien podna ser ffsica y qmmicamente compatible con los componentes activos que se describen en el presente documento, y no debena alterar de forma excesiva la estabilidad, eficacia, u otros beneficios de uso asociados con la composicion. La composicion topica puede ser un producto cosmetico o dermatologico en la forma conocida en la tecnica para aplicaciones topicas o transdermicas, incluyendo soluciones, aerosoles, cremas, geles, parches, pomada, locion, o espuma.

Metodos de Tratamiento

La descripcion proporciona metodos para tratar en un trastorno inflamatorio en un sujeto. La expresion "trastorno inflamatorio" se refiere a un trastorno que se caracteriza por inflamacion anomala o no deseada, tal como una enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunitarias son trastornos caracterizados por la activacion cronica de celulas inmunes en condiciones no activantes. Los ejemplos incluyen psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa), artritis reumatoide, artritis psoriatica, esclerosis multiple, lupus, diabetes de tipo I, cirrosis biliar primaria, y trasplante.

Otros ejemplos de trastornos inflamatorios que se pueden tratar con los metodos de la descripcion incluyen asma, infarto de miocardio, apoplejfa, dermatosis inflamatorias (por ejemplo, dermatitis, eccema, dermatitis atopica, dermatitis por contacto alergica, urticaria, vasculitis necrotizante, vasculitis cutanea, vasculitis por hipersensibilidad, miositis eosinofflica, polimiositis, dermatomiositis, y fascitis eosinofflica), smdrome de distres respiratorio agudo, hepatitis fulminante, enfermedades pulmonares por hipersensibilidad (por ejemplo, neumonitis por hipersensibilidad, neumoma eosinofflica, hipersensibilidad de tipo retardado, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), fibrosis pulmonar idiopatica, e ILD asociada con artritis reumatoide), y rinitis alergica. Los ejemplos adicionales tambien incluyen miastenia gravis, diabetes de inicio juvenil, glomerulonefritis, tiroiditis autoinmune, espondilitis anquilosante, esclerosis sistemica, enfermedades inflamatorias agudas y cronicas (por ejemplo, anafilaxis sistemica o respuestas por hipersensibilidad, alergias farmacologicas, alergias por picadura de insecto, rechazo de aloinjerto, y enfermedad de injerto contra hospedador), y smdrome de Sjogren.

Un "sujeto" se refiere a un ser humano y un animal no humano. Los ejemplos de un animal no humano incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mairffferos, tales como mairffferos no humanos, primates no humanos (en particular primates superiores), perro, roedor (por ejemplo, raton o rata), cobaya, gato, y conejo, y no mairffferos, tales como aves, anfibios, reptiles, etc. En una realizacion, el sujeto es un ser humano. En otra realizacion, el sujeto es un animal no humano, experimental o animal adecuado como un modelo de enfermedad.

Un sujeto que se va a tratar para un trastorno inflamatorio se puede identificar mediante tecnicas de diagnostico convencionales para el trastorno. Opcionalmente, el sujeto se puede examinar con respecto al nivel o porcentaje de una o mas de citoquinas o celulas de una muestra de ensayo obtenida del sujeto mediante metodos conocidos en la tecnica. Si el nivel o porcentaje esta a, o por debajo de, un valor umbral (que se puede obtener de un sujeto normal), el sujeto es un candidato para el tratamiento que se describe en el presente documento. Para confirmar la inhibicion o tratamiento, se puede evaluar y/o verificar el nivel o porcentaje de una o mas de las citoquinas o celulas que se han mencionado anteriormente en el sujeto despues de tratamiento.

"Tratar" o "tratamiento" se refiere a la administracion de un compuesto o agente a un sujeto que tiene un trastorno con el fin de curar, aliviar, mitigar, remediar, retrasar el inicio de, prevenir, o mejorar el trastorno, es smtoma del trastorno, la patologfa secundaria al trastorno, o la predisposicion hacia el trastorno.

Una "cantidad eficaz" o "cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad del compuesto o agente que es capaz de producir un resultado medicamente deseable en un sujeto tratado. El metodo de tratamiento se puede realizar in vivo o ex vivo, solo buen conjunto con otros farmacos o terapia. Una cantidad terapeuticamente eficaz se puede administrar en una o mas administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no se pretende que se limite a una formulacion o via de administracion en particular.

El agente se puede administrar in vivo o ex vivo, solo o administrado de forma simultanea en conjunto con otros farmacos o terapia, es decir, una terapia de coctel. Como se usa en el presente documento, la expresion "administracion simultanea" o "administrado de forma simultanea" se refiere a la administracion de al menos dos agentes o terapias a un sujeto. En algunas realizaciones, la administracion simultanea de dos o mas agentes/terapias es simultanea. En otras realizaciones, un primer agente/terapia se administra antes de un segundo agente/terapia. Los expertos en la materia entienden que las formulaciones y/o vfas de administracion de los diversos agentes/terapias usadas pueden variar.

En un enfoque in vivo, un compuesto o agente se administrar a un sujeto. Generalmente, el compuesto o agente se suspende en un vehffculo farmaceuticamente aceptable (tal como, por ejemplo, pero no limitado a, solucion salina fisiologica) y se administra por via oral o mediante infusion intravenosa, o se inyecta o se implanta por via

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subcutanea, por v^a intramuscular, por via intratecal, por via intraperitoneal, por via intrarrectal, por via intravaginal, por via intranasal, por via intragastrica, por via intratraqueal, o por via intrapulmonar.

La dosificacion requerida depende de la eleccion de la via de administracion; la naturaleza de la formulacion; la naturaleza de la enfermedad del paciente; el tamano, peso, area superficial, edad y sexo del sujeto; otros farmacos que se esten administrando; y el criterio del medico que prescribe. Las dosificaciones adecuadas estan en el intervalo de 0,01-100 mg/kg. En vista de la diversidad de compuestos/agentes disponibles y las diferentes eficacia es de diversas vfas de administracion se pueden esperar variaciones en la dosificacion necesaria. Por ejemplo, se podna esperar que la administracion oral necesitara dosificaciones mas elevadas que la administracion mediante inyeccion i.v. Las variaciones en estos niveles de dosificacion se pueden ajustar usando rutinas empmcas convencionales para optimizacion tal como se entiende bien en la tecnica. La encapsulacion del compuesto en un vehmulo de administracion adecuado (por ejemplo, micropartmulas polimericas o dispositivos implantables) pueden aumentar la eficacia de la administracion con en particular para administracion oral.

Ejemplo 1: Metodos y Materiales

Este ejemplo describe metodos y materiales generales usados en los Ejemplos 2-7.

Ratones

Los ratones C57BL/6 de tipo silvestre se adquirieron en Jackson Laboratories. Los ratones SIGNR1'/_ fueron proporcionados por A. McKenzie. Los ratones transgenicos CD11c-DC-SIGN+ fueron proporcionados por T. Sparwasser. Los ratones transgenicos hDC-SIGN BAC con un antecedente de SIGNR1'/_ se generaron en el laboratorio de los inventores como se ha descrito anteriormente. Los ratones KRN TCR C57BL/6 (presentes de D. Mathis y C. Benoist) se cruzaron con ratones NOD para generar ratones K/BxN. La sangre de los ratones K/BxN (612 semanas de edad) se extrajo y el suero que contema anticuerpos artritogenicos se combino en conjunto. La transferencia pasiva de 200 pl de suero de K/BxN mediante inyeccion i.v. a ratones sin tratamiento previo (8-12 semanas de edad) indujo artritis. La inflamacion se puntuo de 0-3 para cada pata y se anadio en conjunto para una puntuacion clmica total por raton individual.

Preparacion de Fc recombinante

IDEC-114, una fuente recombinante de anticuerpo monoclonal de IgG1 humana de longitud completa, se digirio con papama durante una noche a 37 °C para escindir los fragmentos de Fab y Fc. Despues de la digestion, la reaccion se detuvo mediante la adicion de 2,5 mg/ml de yodoacetamida. Para separar los fragmentos escindidos del anticuerpo sin digerir, se hicieron pases de las muestras sobre una columna de exclusion por tamano HiPrep 26/60 S-200HR (GE HEALTHCARE). El fragmento de Fc se purifico posteriormente con perlas de agarosa con protema G. La pureza de la muestra se verifico mediante tincion de geles de SDS-poliacrilamida con azul brillante de Coomassie. Como alternativa, los Fc recombinantes se produjeron mediante transfeccion transitoria de plasmidos que expresan Fc de IgG1 humana en celulas 293T seguido de precipitacion con sulfato de amonio de fracciones de sobrenadante y purificacion de protema G. La secuencia genetica que codifica la region Fc de la IgG1 humana se amplifico a partir de 4-4-20 de IgG1 mediante protocolos convencionales de PCR y se ligo en pSecTag2 (INVITROGEN). Se introdujeron mutaciones puntuales en la secuencia codificante de Fc mediante tecnicas convencionales de mutagenesis dirigida al sitio y se verifico mediante secuenciacion de ADN. Los cebadores de PCR para la sustitucion de Phe por Ala en la posicion 241 (FA241) fueron

5'-ggggaccgtcagtcgccctcttccccccaa-3' (SEQ ID NO: 4) y 5'-ttggggggaagagggcgactgacggtcccc-3' (SEQ ID NO: 5).

La expresion y la pureza de la protema se confirmaron por inmunotransferencia con anticuerpos de Fc anti-humano y/o tincion de geles de SDS-poliacrilamida con azul brillante de Coomassie.

Reaccion de sialilacidn in vitro en dos etapas

Despues de la purificacion, se hizo intercambio de tampon en 10-50 mg/ml de fragmentos de Fc por un tampon de reaccion de galactosilacion (MOPS 50 mM, pH 7,2; MnCh 20 mM) y se incubaron durante una noche a 37 °C con 50 mg de UDP-galactosa y 0,75 U de p1,4-galatosiltransferasa. La galactosilacion se confirmo mediante transferencias puntuales de lectina usando ECL para reconocer restos de galactosa terminales. A continuacion se hizo un intercambio del tampon de los Fc galactosilados en por un tampon de reaccion de sialilacion (MOPS 100 mM, 0,2 mg/ml de BSA, Triton X-100 al 0,5 %, pH 7,4) y se incubo durante una noche a 37 °C con 50 mg de CMP-acido sialico y 0,75 U de a2,6-sialiltransferasa. La sialilacion se confirmo mediante transferencias puntuales de lectina usando SNA para reconocer restos de acido sialico terminales con una union a2-6.

Transferencia adoptiva de macrofagos obtenidos a partir de medula osea

Las celulas de medula osea se lavaron abundantemente a partir de tibias y femures de ratones DC-SIGNtg o

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SIGNR1-/-, y se sembraron en placas de 10 cm tratadas con cultivo no tisular en medio de crecimiento RPMI 1640 suplementado con FBS al 10 %, Pen/Estrep al 1 %, IL-3 (5 ng/ml, PEPROTECH), y M-CSF (5 ng/ml, PEPROTECH). Despues de una incubacion durante una noche a 37 °C, las celulas no adherentes se recuperaron y se transfirieron a placas de 10 cm tratadas con cultivo no tisular con medio de crecimiento RPMI suplementado con IL-3/M-CSF, y se cultivo durante 5-7 dfas a 37 °C. Los macrofagos maduros se tripsinizaron y se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 2x106 celulas/pocillo, y se permitio que se unieran durante una noche. Al dfa siguiente los macrofagos se pulsaron con la preparacion indicada de Fc recombinante durante 30 min a 37 °C. Las celulas se recuperaron, se lavaron con PBS frio, y se administraron 1 x 106 por via i.v. a ratones C57BL/6 de tipo silvestre. Una hora despues de la inyeccion, los ratones receptores se estimularon con sueros de K/BxN.

Expresion y purificacion de DC-SIGN humano soluble

K. Drickamer proporciono un plasmido que contema la secuencia de ADNc del dominio extracelular (ECD) de DC- SIGN humano. La secuencia codificante para ECD de DC-SIGN se modifico para introducir una etiqueta de estrep N- terminal mediante tecnicas convencionales de PCR y se ligo a pET28b(+). pET28b-estrepDCSIGN se transformo en la cepa BL21/DE3 de E. coli y se cultivo en 3 l de medio de crecimiento de Tb a 37 °C hasta que el cultivo bacteriano alcanzo una DO600 de 0,7-0,8. La expresion de protemas se indujo mediante la adicion de 100 mg/l de IPTG y los cultivos se incubaron a 37 °C durante 3,5 h. Las bacterias se alimentaron por centrifugacion a 4000 x g durante 10 min a 4 °C. Los sedimentos bacterianos se volvieron a suspender en Tris-HCl 10 mM, pH 7,8, y se lisaron mediante sonicacion. Los cuerpos de inclusion se sedimentaron mediante centrifugacion a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C y se solubilizaron en 100 ml de guanidina-HCl 6 M; Tris-HCl 100 mM, pH 7,8; TRITON X-100 al 0,2 %. Las partmulas de materia se retiraron por centrifugacion a 20.000 xg durante 30 min a 4 °C, y la fraccion de sobrenadante se dializo contra NaCl 250 mM; Tris-HCl 25 mM, pH 7,8; CaCl2 25 mM. Despues de dialisis, los precipitados insolubles se retiraron por centrifugacion a 20.000xg durante 30 min a 4 °C, y la fraccion de sobrenadante se aplico a una resina Strep-Tactin (NOVAGEN) para captar ECD de DC-SIGN etiquetado con estrep. Las protemas unidas se eluyeron a partir de resina con tampon de elucion suministrado por el fabricante (NOVAGEN). Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las fracciones positivas se combinaron y se cargaron sobre una columna de manosa- agarosa para seleccionar los receptores activos. Es ECD de DC-SIGN se eluyo con NaCl 250 mM; Tris-HCl 25 mM, pH 7,8; EDTA 5 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE.

Resonancia de plasmon superficial

Para determinar la interaccion entre diversas preparaciones de Fc recombinante con respecto a hDC-SIGN soluble o los hFcYR, las mediciones de afinidad en estado estacionario se registraron en un sensor T100 de Biacore. Los receptores diluidos a 20-50 pg/ml en NaOAc a pH 5,0, se inmovilizaron sobre chips de CM5 a una densidad elevada (2000 UR) mediante acoplamiento de amina convencional. Para interacciones de hDC-SIGN, las inyecciones se realizaron a un caudal de 20 pl/min con tampon HBS-P+ disponible en el mercado ajustado a pH 9,0 y suplementado con CaCl2 2 mM y NaCl 500 mM. Para interacciones de hFcYR, las inyecciones se realizaron a un caudal de 20 pl/min con tampon HBS-EP+ disponible en el mercado. Las superficies se regeneraron con pulso corto de NaOH 50 mM. Los valores de Kd se calcularon despues de restar la union de fondo a una celula de flujo de control usando el software de Evaluacion de Biacore.

RT-PCR

El ARN total se extrajo de macrofagos obtenidos a partir de medula osea usando el kit RNeasy Mini (QIAGEN). Un microgramo de ARN total se uso para analizar la expresion del ARNm de IL-33 por RT-PCR usando el kit de RT- PCR OneStep (QIAGEN). La expresion de GAPDH sirvio como un control de carga. Los cebadores de PCR para mIL-33 fueron 5'-gaagatcccaacagaagacc-3' (SEQ ID NO: 6) y 5'-ttccggaggcgagacgtcac-3'(SEQ ID NO: 7); y para mGAPDH fueron 5'-gccgcctggagaaacctgc-3' (SEQ ID NO: 8) y 5'-tgaggtccaccaccctgttg-3' (SEQ ID NO: 9). Las condiciones de PCR fueron 94 °C durante 30 s; 55 °C durante 30 s; 72 °C durante 60 s x 35 ciclos (IL-33) o 25 ciclos (GAPDH).

Ejemplo 2: el acido sialico unido en a2,6 proporciono actividad de union de DC-SIGN a Fc de IgG1 humana recombinante

Una poblacion secundaria de anticuerpos en preparaciones de IVIG suprime la inflamacion inducida por autoanticuerpo. Estos anticuerpos, que conteman acido sialico unido en la posicion a2,6 terminal en el glicano de Fc, median una respuesta antiinflamatoria mediante union a SIGNR1 sobre macrofagos de zona marginal o su ortologo humano, DC-SIGN, en celulas mieloides.

Para estudiar la interaccion de sFc con respecto a DC-SIGN, una forma soluble del dominio extracelular de DC-SIGN (ECD de DC-SIGN) se purifico a partir de bacterias y se inmovilizo sobre chips de CM5. sFc se preparo a partir de anticuerpos IDEC-114 de longitud completa y se sialilo in vitro (Figura 1b), y se unio de forma espedfica a la superficie conjugada con DC-SIGN- (Figura 1a). Se realizaron mediciones de afinidad en estado estacionario y el valor de Kd para esta interaccion se calculo como ~1,3x10'6 M (Figura 1c). Por el contrario, una glicoforma asialilada de Fc de IDEC-114 no mostro actividad de union a DC-SIGN lo que sugiere que la sialilacion induce un

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cambio de conformacion en la estructura principal de Fc para desvelar un sitio de union a DC-SIGN.

Como se muestra en la Figura 1a, se encontro que el a2,6-sFc recombinante se une a DC-SIGN soluble tal como se mide mediante resonancia por plasmon superficial (SPR). Los Fc se prepararon mediante escision con papama de anticuerpo de IgG1 monoclonal humano de longitud completa (IDEC-114) seguido por reacciones de galactosilacion y sialilacion in vitro. Los sensogramas de SPR para union de anticuerpo a DC-SIGN inmovilizado se muestran para glicoformas sialiladas y galactosiladas de los Fc de hlgGI como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 1. Se encontro que las concentraciones de Fc fluctuaban sobre el intervalo de ECD de DC-SIGN de 3-0,8 pM. Como se muestra en la Figura 1b, la transferencia puntual de lectina con SNA confirmo la union de acido sialico con union en 2,6 sobre Fc (panel de la parte superior); los controles de carga tenidos con Coomassie se mostraron en el panel de la parte inferior. La medicion de Kd en el estado estacionario de la union de sFc a DC-SIGN (como se muestra en a.) se calculo mediante el software de Evaluacion de Biacore.

Ejemplo 3 las mutaciones que interrumpen las interacciones de Fc-glicano transmitieron actividad de union de DC-SIGN a Fc de IgG1 humana recombinante

La cadena de oligosacarido nucleo unido a Asn297 proporciona interacciones no covalentes amplias con la estructura principal de aminoacidos del Fc. Los cambios conformacionales en el Fc de inducidos por diferentes restos de azucar unidos al glicano nucleo estan mediados por estas interacciones de protema-carbohidrato. Parece que las sustituciones de alanina que erradican los puntos de contacto fundamentales entre la estructura principal de Fc y los restos de glicano proporcionan una actividad de union a DC-SIGN.

Como se muestra en la Figura 2A, las mutaciones FA241 y FA243 presentan actividad de union a DC-SIGN sin procesamiento enzimatico in vitro. Los valores de Kd aparentes vanan de 6 x 10'7 M para FA241 a 3 x 10'7 M para FA243. Los informes previos indican que estas mutaciones aumentan la sialilacion de anticuerpos, supuestamente por hacer que el glicano sea mas accesible para glicosiltransferasas, cuando se expresan en celulas de mairnfero. Para verificar esto, una transferencia puntual de lectina se realizo para determinar si la union de FA241 y FA243 a DC-SIGN se debe al aumento de la sialilacion de protemas expresadas de forma transitoria. Como se muestra en la Figura 2B, las transferencias puntuales de SNA no detectaron restos de acido sialico terminales en FA241 y FA243 purificados lo que indica que la interaccion con DC-SIGN era independiente de la modificacion de acido sialico.

De forma mas espedfica, los restos F241, F243, D265, y R301 junto con la estructura principal de aminoacido de Fc de IgG1 se sustituyeron con alanina para interrumpir las interacciones no covalente es con restos de oligosacarido. Los Fc se expresaron y se purificaron a partir de celulas 293T y se analizaron para actividad de union a DC-SIGN con resonancia de plasmon superficial como se ha descrito anteriormente. Se encontro que los Fc que portaban mutaciones FA241 o FA243 presentaban un aumento de la afinidad hacia DC-SIGN con respecto mediciones de afinidad para sFc (Figura 1 a). Las transferencias puntuales de lectina con ECL (Figura 1 b, panel de la parte media) y SNA (panel de la parte superior) se realizaron para determinar restos de azucar terminales en los Fc purificados a partir de celulas 293T. Como un control positivo para los Fc sialilados, FA241 se sialilo in vitro como se describe en la Figura 1a. Los controles de carga tenidos con Coomassie se muestran en el panel de la parte inferior de la Figura 1b.

Ejemplo 4 La mutacion FA241 en Fc de hlgGI sintetizo la actividad antiinflamatoria de sFc en a2,6

Para ver si las mutaciones FA241 y FA243 imitan la actividad de union a DC-SIGN de sFc, se realizaron ensayos para examinar si estas mutaciones se podnan replicar en la actividad antiinflamatoria de sFc in vivo. Los ratones SIGNR17' y hDC-SIGN+/SIGNR1'/' emparejados por edad y sexo se estimularon con sueros de K/BxN artritogenico y se trataron con sFc, FA241, o FA243 a una dosis eficaz de 0,033 g/kg. De acuerdo con los hallazgos previos, sFc suprimio la hinchazon de la almohadilla plantar en ratones DC-SIGN+ pero no en ratones SIGNR17'.

De forma analoga, FA241 demostro una actividad antiinflamatoria comparable a la de sFc en ratones hDC- SIGN+/SIGNR17'. Los ratones a los que se les administra FA243 no mostraron reduccion de la inflamacion en la articulacion. Estos hallazgos sugieren que los Fc recombinantes que portan una mutacion F241A (FA241) sintetiza la union a DC-SIGN y la actividad antiinflamatoria de sFc en ausencia de modificacion con acido sialico.

Como se muestra en la Figura 3, a los ratones hDC-SIGN+/SIGNR1'/_ (cuadrados de color blanco) y SIGNR17' (cuadrados de color negro) se les administraron 0,7 mg/raton de sFc, FA241, o FA243 mediante inyeccion i.v. Los ratones estimularon posteriormente con sueros de K/BxN 1 h mas tarde. La hinchazon de la almohadilla plantar se controlo y se puntuo durante varios dfas. Como se ha informado anteriormente, la actividad antiinflamatoria de sFc depende de DC-SIGN (panel de la parte izquierda). FA241 tambien suprimio la inflamacion artntica en ratones estimulados con K/BxN de una manera dependiente de DC-SIGN. FA243 no redujo la hinchazon de la almohadilla plantar de forma significativa el dfa 6. Las medias y ETM de puntuaciones clmicas de 4-5 ratones por grupos se representan en el Dfa 6.

Ejemplo 5 Requisitos de caracterizacion para actividad antiinflamatoria de FA241

5

10

15

20

25

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40

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50

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60

65

Para identificar los determinates de la actividad antiinflamatoria de FA241, los macrofagos obtenidos a partir de medula osea (BMMO) de ratones CD11c.DC-SIGN+ y SIGNR1'/_ se estimularon con FA241 u otras preparaciones de Fc y se transfirieron a ratones receptores C57BL/6 de WT estimulados con sueros de K/BxN.

En resumen, los macrofagos obtenidos a partir de medula osea de ratones CD11c.DC-SIGN+ y SIGNR1'/_ se cultivaron en IL-3 (5 ng/ml) y M-CSF (5 ng/ml) durante 5-7 dfas. Como se muestra en la Figura 4, los BMMO de DC- SIGN) se cursaron con 0,5 mg/ml de glicoformas asialiladas (barras de color negro) o sialiladas (barras de color blanco) de preparaciones de Fc indicadas. Los BMMO tratados con se transfirieron a ratones receptores C57BL/6 de WT seguido por estimulacion con K/BxN. Como se muestra en la Figura 4b, los BMMO de SIGNR1'/_ (barras de color negro) y DC-SIGN+ (barras de color blanco) se expulsaron con 0,5 mg/ml de la preparacion de Fc indicada y se transfirieron a ratones receptores C57BL/6 de WT seguido por estimulacion con K/BxN. De forma analoga, los BMMO de DC-SIGN+ se pulsaron con cualquiera de 0,5 mg/ml de FA241 o FA241 desglicosilado (Figura 4c, barras de color blanco) o PBS (Figura 4c, barra de color negro) y se transfirieron a ratones receptores C57BL/6 de WT seguido por estimulacion con K/BxN. FA241 se desglicosilo con PNGasa F y la eliminacion de glicano se confirmo mediante transferencia puntual de lectina. Los BMMO de DC-SIGN+ se pulsaron con la preparacion de Fc asialilado indicado o PBS (Figura 4d, cfrculo de color negro) y se transfirieron a ratones receptores C57BL/6 de WT seguido por estimulacion con K/BxN. En todos los casos, la hinchazon de la almohadilla plantar se superviso y se puntuo durante varios dfas. Se representan las medias y ETM de las puntuaciones clmicas de 4-5 ratones por grupo. *P < 0,05, como se determina mediante un analisis de ensayo de varianza (ANOVA), seguido de un ensayo de Tukey a posteriori.

Como se muestra en la Figura 4A, las preparaciones de FA241 asialilado o sialilado fueron igualmente eficaces para suprimir la inflamacion de la articulacion en comparacion con sFc. Las preparaciones de Fc de WT, sin embargo, necesitaron acido sialico unido en a2,6 ya que los BMMO de DC-SIGN+ expulsados con Fc de WT asialilado no transfenan proteccion a ratones receptores. De acuerdo con los resultados que se muestran en la Figura 3, tanto sFc como FA241 necesitaron expresion de DC-SIGN en BMMO para transferir proteccion (Figura 4B). Aunque FA241 no requiere acido sialico para transferir proteccion, la desglicosilacion con PNGasa F anulo las propiedades anti inflamatorias de FA241 (Figura 4C) lo que sugiere que el glicano de Fc todavfa es necesario. Ademas, para mostrar que la actividad antiinflamatoria observada es especffica para la mutacion F241A, los BMMO de DC-SIGN+ se expulsaron con los Fc que portaban mutaciones alternativas que no transmitfan un aumento de la union a DC-SIGN. Solamente los BMMO estimulados con FA241 protegieron a los ratones receptores estimulados con K/BxN.

Ejemplo 6 La mutacion FA241 aumento de la union al receptor Fcy

Si una sustitucion de alanina en la posicion 241 induce un cambio de conformacion en el Fc, entonces quiza a la afinidad hacia receptores Fcy humanos se alterara. Anteriormente se informo de que la sialilacion reduce la afinidad de las IgG hacia los FcyR, atenuando en consecuencia la actividad de ADCC in vivo.

Los Fc de IgG1 recombinante que se unen a los FcyR solubles se midio mediante resonancia de plasmon superficial (SPR). Los Fc se prepararon de la forma que se ha descrito anteriormente. Los sensogramas de SPR para union de anticuerpo a hFcYRIIAi3iR y hFcYRIIB inmovilizados se muestran en la Figura 5 para glicoformas asialiladas y sialiladas de Fc de hlgGI de WT y para de Fc FA241 asialilado.

Como se muestra en la Figura 5, las glicoformas asialiladas de Fc de WT se unieron a hFcYRIIA y RIIB con un valor de Kd observado de ~2-3 x 10'5 M. Sin embargo, no parecfa que sFc se uniera a cualquiera de hFcYRIIA o RIIB. De forma sorprendente, parece que FA241 se une tanto a hFcYRIIA como a RIIB con un orden de magnitud de afinidad mas elevada (Kd = ~2 x 10'6 M).

Ejemplo 7 Induccion de ARNm de IL-33 en macrofagos obtenidos a partir de medula osea por FA241

Los sFc inducen una ruta antiinflamatoria dependiente de Th2 que requiere secrecion de IL-4 a partir de una poblacion de leucocitos FceRI+, probablemente basofilos, para regular de forma positiva FcyRIIB en macrofagos reguladores. La administracion de IL-33 in vivo o in vitro estimula los basofilos para liberar reservas de IL-4. La expresion del ARNm de IL-33 se regula de forma positiva en vasos de ratones C57BL/6 de WT tratados con sFc o IVIG, pero no en ratones SIGNR1'/_. Esto sugiere que los sFc pueden inducir la expresion de IL-33 en celulas SIGNR1+ o DC-SIGN+. En este ejemplo, los ensayos se realizaron y muestran que parece que la estimulacion de los BMMO de DC-SIGN+ con FA241 regula de forma positiva la expresion de IL-33.

De forma mas especffica, los macrofagos obtenidos a partir de medula osea de raton es CD11c.DC-SIGN+ y SIGNR1'/_ se cultivaron de la forma que se ha descrito anteriormente. Los BMMO se sembraron en placas de l2 pocillos en medio RPMI sin suero y se permitio que se adhirieran durante una noche a 37 °C. Al dfa siguiente, las celulas se pulsaron con 0,5 mg/ml del Fc indicado en medio RPMI sin suero durante 1 h (Figura 6a.) o 4 h (Figura 6b.) a 37 °C. El ARNm se cosecho a partir de celulas en momentos especificados y se uso 1 |jg de ARN total para amplificacion de ARNm de IL-33 por RT-PCR (paneles de la parte superior). La amplificacion por GAPDH sirvio como un control de carga (paneles de la parte inferior). El Fc de DA265 y la sialiltransferasa humana (ST6Ga11) que expresan plasmido de forma simultanea se transfectar unen celulas 293T proporcionando rendimiento de Fc

5

10

15

20

25

30

35

recombinante altamente sialilado (ST6-DA265).

Como se muestra en la Figura 6, parece que la estimulacion de los BMMO de DC-SIGN+ con FA241 regula de forma positiva la expresion de IL-33. A pesar de los niveles de expresion basales mas elevados de IL-33 en comparacion con los BMMO de DC-SIGN+, los BMMO de SIGNR1'/_ regularon de forma negativa la expresion del ARNm de IL-33 como respuesta al tratamiento con FA241.

El ejemplo y la descripcion de las realizaciones preferentes que se han mencionado anteriormente se debenan tomar como ilustrativos, en lugar de limitantes de la presente invencion tal como se define con las reivindicaciones.

Listado de secuencias

<110> The Rockefeller University Ravetch, Jeffrey V Pincetic, Andrew

<120> POLIPEPTIDOS ANTIINFLAMATORIOS NO SIALILADOS

<130> RU1062/070413.20147

<140> PCT/US TBD <141>

<150> US 61/577.361 <151>

<160>9

<170> Patentln version 3.5

<210> 1 <211>238 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 15 10 15

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu lieu lieu Gly Gly Pro Ser Val Phe 20 25 30

lieu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr lieu Met lie Ser Arg Thr Pro 35 40 45

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 50 55 60

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 65 70 75 80

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 85 90 95

Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 100 105 110

Lys Val Ser Asn Lys Ala lieu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 115 120 125

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr lieu Pro Pro 130 135 140

Ser Arg Asp Glu lieu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 145 150 155 160

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 165 170 175

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val lieu Asp Ser Asp 180 185 190

Gly Ser Phe Phe lieu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 195 200 205

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 210 215 220

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230 235

<210>2

5 <211> 238

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mutante de FA241

<400>2 5

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 15 10 15

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Ala 20 25 30

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 35 40 45

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 50 55 60

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 65 70 75 80

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 85 90 95

lieu Thr Val lieu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 100 105 110

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser

115 120 125

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 130 135 140

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 145 150 155 160

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 165 170 175

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 180 185 190

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 195 200 205

Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 210 215 220

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser lieu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 235

<210>3 <211> 238 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Mutante de FA243

10

<400> 3

Claims (8)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1. Un polipeptido aislado que comprende una secuencia modificada que comprende la SEQ ID NO: 2, en la que la secuencia modificada no esta sialilada y el polipeptido tiene una actividad antiinflamatoria que es mas elevada que la de un polipeptido sialilado precursor que comprende la SEQ ID NO: 1; y en la que el polipeptido aislado tiene una capacidad para unirse a DC-SIGN, hFcYRIlA, y RIIB.
2. 2. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1, en la que el polipeptido aislado tiene una capacidad para unirse a hFcYRlIA o RIIB a una Kd de 2 x 10-5 M o inferior (es decir, Ka de 5,0 x 104 M-1 o superior).
3. 3. El polipeptido aislado de la reivindicacion 1 o 2, en la que la secuencia modificada consiste en la SEQ ID NO: 2.
4. 4. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. 5. Un vector de expresion o una celula hospedadora que comprende un acido nucleico de la reivindicacion 4.
6. 6. Un metodo para producir un polipeptido, que comprende cultivar la celula hospedadora de la reivindicacion 5 en un medio en condiciones que permitan la expresion de un polipeptido codificado por el acido nucleico, y purificar el polipeptido de la celula cultivada o del medio de la celula.
7. 7. Una formulacion farmaceutica que comprende (i) el polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o un acido nucleico de la reivindicacion 4, y (ii) un vehfculo farmaceuticamente aceptable.
8. 8. Un polipeptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o un acido nucleico de la reivindicacion 4 para su uso en el tratamiento de una enfermedad inflamatoria.

   Respuesta (UR) Respuesta (UR)

   b1,4 Gal Fc

   imagen1

   a2,6 sFc

   imagen2

   FIGURA 1A

   Respuesta (UR)

   imagen3

   C.

   imagen4

   FIGURAS 1 B-C

   Respuesta (UR) Respuesta (UR)

   FA241

   600

   500

   400

   300

   200

   100

   0

   ■too

   -100

   imagen5

   -I-

   100 200 300

   Tiempo (segundos)

   400

   500

   FA243

   imagen6

   FIGURA2 A

   imagen7

   imagen8

   Puntuacion clinica

   imagen9

   imagen10

   imagen11

   on)

   o-.

   (fl ■

   8U03-0U-S3

   9I-S0982I-3

   O

   Puntuacion clinica Dia7

   imagen12

   Puntuacion clinica Dia 6

   O W 4* O) 09

   I____l_____i_____i_____L.

   imagen13

   o

   _L

   imagen14

   P

   Puntuacion clinica

   imagen15

   imagen16

   CT

   imagen17

   □ I

   o tt>

   9 5

   03 Z

   imagen18

   8l0Z-0l.-£Z

   9I-S098ZI-3

   FIGURA4

   Respuesta (UR)

   asial Fc

   imagen19

   imagen20

   FIGURA 5

   Respuesta (UR) Respuesta (UR)

   imagen21

   250

   200

   150

   100

   50

   0

   -50

   hFcYR2B

   imagen22

   imagen23

   -i— 300

   —1— 400

   FIGURA 5 Continuacion

   Respuesta (UR) Respuesta (UR)

   FA241

   imagen24

   imagen25

   FIGURA 5 Continuacion

   FIGURA6

   a.

   mlL33

   GAPDH

   BMMd) de DC-SIGN+

   ST6“

   Unt FA241 DA265

   BMM(b de SIGNR1-A ST6-

   Unt FA241 DA26S

   imagen26

   b. BMMd) de DC-SIGN+ BMMd) de SIGNR17

   imagen27