RS67768B1 - Terapijski agens koji indukuje citotoksičnost - Google Patents

Description

[0001] Opis

[0003] Tehnička oblast

[0005] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. Predmetni pronalazak se odnosi na polipeptidne komplekse za upotrebu kao što je specificirano u patentnim zahtevima koji omogućavaju lečenje kancera tako što imaju T-ćelije blizu ciljnih ćelija kancera i upotrebljavaju citotoksičnu aktivnost T-ćelija prema ciljnim ćelijama kancera, postupke za proizvodnju polipeptidnih kompleksa, i terapijske agense za upotrebu koji sadrže takav polipeptidni kompleks kao aktivni sastojak za indukovanje ćelijske citotoksičnosti. Predmetna objava se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije za lečenje ili sprečavanje različitih kancera, koje sadrže prethodno pomenuti terapijski agens za indukovanje ćelijske citotoksičnosti kao aktivni sastojak, i terapijske postupke koji upotrebljavaju takve farmaceutske kompozicije.

[0007] Pozadina struke

[0009] Do danas, razvijeno je više terapijskih antitela koja imaju odličan antitumorski efekat kao farmaceutika za lečenje kancera (Nepatentni Dokument 1). Poznato je da ova terapijska antitela ispoljavaju svoj antitumorski efekat na ćelije kancera preko inhibicije signala koji su neophodni za rast ćelija kancera, indukciju signala ćelijske smrti, ćelijama posredovanu citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) (Nepatentni Dokument 2). ADCC je citotoksičnost koju ispoljavaju efektorske ćelije kao što su NK ćelije i makrofagi prema antitelom vezanim ciljnim ćelijama kancera kada se Fc region antitela veže za Fc receptor na efektorskim ćelijama. U međuvremenu, kompleks komplementa se vezuje za vezujuće mesto komplementa u strukturi antitela. CDC je citotoksičnost koja se javlja kada komponenta komplementa u kompleksu formira poru kroz ćelijsku membranu antitelom vezane ćelije, povećavajući ulazak vode ili jona u ćeliju. Iako konvencionalna terapijska antitela pokazuju odlične aktivnosti, do danas je primena takvih antitela dovela samo do nezadovoljavajućih terapijskih ishoda. Stoga, poželjno je razviti terapijska antitela koja ispoljavaju veću aktivnost ubijanja ćelija prema kanceru.

[0010] Pored prethodno pomenutih antitela koja usvajaju ADCC kao svoj antitumorski mehanizam regrutovanjem NK ćelija ili makrofaga kao efektorskih ćelija, antitela koja regrutuju T-ćelije (TR antitela) koja usvajaju citotoksičnost kao svoj antitumorski mehanizam regrutovanjem T-ćelija kao efektorskih ćelija poznata su još od 1980-ih (Nepatentni Dokumenti 3 do 5). TR antitelo je bispecifično antitelo koje sadrži antitelo prema bilo kojoj od podjedinica koje formiraju kompleks T-ćelijskog receptora (TCR) na T-ćelijama, posebno antitelo koje se vezuje za CD3 epsilon lanac, i antitelo koje se vezuje za antigen na ciljnim ćelijama kancera. T-ćelija se približava ćeliji kancera kada se TR antitelo istovremeno veže za CD3 epsilon lanac i antigen kancera, i to uzrokuje antitumorski efekat prema ćeliji kancera usled citotoksične aktivnosti T-ćelije.

[0011] Antitelo koje se naziva „trifunkcionalno antitelo“ takođe je poznato kao TR antitelo (Nepatentni Dokumenti 6 i 7). Trifunkcionalno antitelo je bispecifično antitelo tipa celog IgG kod koga jedan krak sadrži Fab koji se vezuje za antigen kancera, a drugi krak sadrži Fab koji se vezuje za CD3 epsilon lanac. Terapijski efekat prema malignom ascitesu demonstriran je primenom katumaksomaba, koji je trifunkcionalno antitelo prema EpCAM, u peritonealne duplje pacijenata sa malignim ascitesom koji imaju ćelije kancera pozitivne na ekspresiju EpCAM. Upotreba katumaksomaba je odobrena u EU za prethodno navedeno lečenje.

[0012] Štaviše, nedavno je pronađeno da TR antitelo nazvano „bispecifični T-ćelijski uključivač (bispecific T-cell engager - BiTE)“ pokazuje jak antitumorski efekat (Nepatentni Dokumenti 8 i 9). BiTE je TR antitelo sa molekulskim oblikom u kome je scFv antitela prema antigenu kancera povezan sa scFv antitela prema CD3 epsilon lancu putem kratkog polipeptidnog linkera. Objavljeno je da BiTE ima antitumorsku aktivnost superiorniju od one kod različitih poznatih TR antitela (Nepatentni Dokumenti 9 i 10). Specifično, u poređenju sa drugim TR antitelima, BiTE ispoljava antitumorski efekat čak i pri značajno nižoj koncentraciji i nižem odnosu efektorskih ćelija prema ćelijama kancera (ET odnos). Takođe je demonstrirano da se efekat može ispoljiti bez potrebe za prethodnom aktivacijom efektorskih ćelija upotrebom IL-2, CD28 agonističnog antitela ili slično. Blinatumomab (MT103), koji je BiTE prema CD19, pokazuje mnogo jaču citotoksičnu aktivnost prema ćelijama kancera in vitro nego rituksan, za koji je poznato da proizvodi odličan klinički efekat. Štaviše, objavljeno je da blinatumomab pokazuje izuzetno superioran antitumorski efekat u kliničkim ispitivanjima faze I i II koja su nedavno sprovedena (Nepatentni Dokument 11).

[0013] [0006] Činjenica da je katumaksomab odobren kao terapijski agens koji demonstrira klinički efekat leka, i da više različitih BiTE uključujući blinatumomab ispoljavaju snažan antitumorski efekat, sugeriše da TR antitela koja regrutuju T-ćelije kao efektorske ćelije imaju značajno veći potencijal kao antitumorski agens u poređenju sa konvencionalnim antitelima koja upotrebljavaju ADCC kao svoj mehanizam delovanja.

[0014] Međutim, poznato je da se trifunkcionalno antitelo istovremeno vezuje i za T-ćeliju i za ćeliju kao što je NK ćelija ili makrofag na način nezavisan od antigena kancera, i kao rezultat toga, receptori koji se eksprimiraju na ćelijama se umrežavaju, a ekspresija različitih citokina se indukuje na način nezavisan od antigena kancera. Smatra se da sistemska primena trifunkcionalnog antitela uzrokuje neželjene efekte slične citokinskoj oluji kao rezultat takve indukcije ekspresije citokina. U stvari, objavljeno je da je u kliničkom ispitivanju faze I veoma niska doza od 5 µg/telu bila maksimalna tolerantna doza za sistemsku primenu katumaksomaba pacijentima sa nesitnoćelijskim kancerom pluća, i da primena više doze uzrokuje različite teške neželjene efekte (Nepatentni Dokument 12). Kada se primenjuje u tako niskoj dozi, katumaksomab nikada ne može dostići efikasan nivo u krvi. To jest, očekivani antitumorski efekat se ne može postići primenom katumaksomaba u tako niskoj dozi.

[0015] U međuvremenu, za razliku od katumaksomaba, BiTE nema vezujuće mesto za Fcy receptor, i prema tome ne umrežava receptore koji se eksprimiraju na T-ćelijama i ćelijama kao što su NK ćelije i makrofagi na način zavisan od antigena kancera. Stoga, demonstrirano je da BiTE ne uzrokuje indukciju citokina nezavisnu od antigena kancera, što se uočava kada se primenjuje katumaksomab. Međutim, pošto je BiTE modifikovani molekul antitela male molekulske težine bez Fc regiona, problem je što je njegov poluživot u krvi posle primene pacijentu značajno kraći od antitela IgG-tipa koja se konvencionalno upotrebljavaju kao terapijska antitela. U stvari, objavljeno je da je poluživot u krvi BiTE koji je primenjen in vivo oko nekoliko sati (Nepatentni Dokumenti 13 i 14). U kliničkim ispitivanjima blinatumomaba, on se primenjuje kontinuiranom intravenskom infuzijom pomoću mini pumpe. Ovaj postupak primene nije samo izuzetno neugodan za pacijente, već nosi i potencijalni rizik od medicinskih nezgoda usled kvara uređaja ili slično. Stoga, ne može se reći da je takav postupak primene poželjan.

[0017] Dokumenti o stanju tehnike

[0019] [Nepatentni Dokumenti]

[0021]

[0022] [Nepatentni Dokument 1] Clin Cancer Res. (2010) 16 (1), 11-20

[0023] [Nepatentni Dokument 2] Drug Des Devel Ther (2009) 3, 7-16

[0024] [Nepatentni Dokument 3] Nature (1985) 314 (6012), 628-31

[0025] [Nepatentni Dokument 4] Int J Cancer (1988) 41 (4), 609-15

[0026] [Nepatentni Dokument 5] Proc Natl Acad Sci USA (1986) 83 (5), 1453-7

[0027] [Nepatentni Dokument 6] Cancer Treat Rev. (2010) 36 (6), 458-67

[0028] [Nepatentni Dokument 7] Expert Opin Biol Ther (2010) 10 (8), 1259-69

[0029] [Nepatentni Dokument 8] Proc Natl Acad Sci USA. (1995) 92 (15), 7021-5

[0030] [Nepatentni Dokument 9] Drug Discov Today (2005), 10 (18), 1237-44

[0031] [Nepatentni Dokument 10] Trends Biotechnol (2004) 22 (5), 238-44

[0032] [Nepatentni Dokument 11] Science (2008), 321 (5891), 974-7

[0033] [Nepatentni Dokument 12] Cancer Immunol Immunother (2007) 56 (10), 1637-44

[0034] [Nepatentni Dokument 13] Cancer Immunol Immunother. (2006) 55 (5), 503-14

[0035] [Nepatentni Dokument 14] Cancer Immunol Immunother. (2009) 58 (1), 95-109

[0037] Sažetak pronalaska

[0039] [Problemi koje pronalazak treba da reši]

[0041] Predmetni pronalazak je postignut u smislu prethodno navedenih okolnosti. Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima. Cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi polipeptidne komplekse za upotrebu kao što je specificirano u patentnim zahtevima koji omogućavaju lečenje kancera tako što imaju T-ćelije blizu ciljnih ćelija kancera i upotrebljavaju citotoksičnost T-ćelija prema ciljnim ćelijama kancera, postupke za proizvodnju polipeptidnih kompleksa, i terapijske agense za upotrebu koji sadrže takav polipeptidni kompleks kao aktivni sastojak za indukovanje ćelijske citotoksičnosti. Još jedan cilj predmetne objave je da obezbedi farmaceutske kompozicije za lečenje ili sprečavanje različitih kancera, koje sadrže prethodno pomenuti terapijski agens za indukovanje ćelijske citotoksičnosti kao aktivni sastojak, i terapijske postupke koji upotrebljavaju farmaceutske kompozicije.

[0043] [Načini za rešavanje problema]

[0044] Predmetni pronalazači su otkrili nove polipeptidne komplekse koji zadržavaju snažnu antitumorsku aktivnost koju poseduje BiTE i imaju dug poluživot u krvi, kao i odlična bezbednosna svojstva koja rezultuju neindukovanjem citokinske oluje nezavisne od antigena kancera ili slično. Predmetni pronalazači su takođe pronašli da polipeptidni kompleksi mogu oštetiti različite ciljne ćelije kada se antigen-vezujući domeni polipeptidnih kompleksa supstituišu. Na osnovu prethodno navedenih nalaza, predmetni pronalazači su demonstrirali da polipeptidni kompleksi za upotrebu iz predmetnog pronalaska oštećuju ćelije kancera. Predmetni pronalazači su takođe obelodanili da se efikasnija ćelijska citotoksičnost postiže regulisanjem asocijacije CH1/CL interfejsa i introdukovanjem modifikacija izbočine-uudubljenja (Knobs-into-Holes - KiH) u polipeptidne komplekse. Pored toga, predmetni pronalazači su demonstrirali da se različiti kanceri mogu lečiti ili sprečiti upotrebom terapijskih agenasa za indukovanje ćelijske citotoksičnosti koji sadrže polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska kao aktivni sastojak.

[0045] Specifičnije, predmetna objava obezbeđuje sledeće:

[0047] [1] polipeptidni kompleks koji sadrži:

[0049] (1) antigen-vezujući domen;

[0050] (2) domen koji sadrži Fc region koji ima redukovanu aktivnost vezivanja za Fcy receptor; i

[0051] (3) domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora;

[0053] [2] polipeptidni kompleks iz [1], pri čemu je domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora domen za vezivanje za T-ćelijski receptor;

[0054] [3] polipeptidni kompleks iz [1], pri čemu je domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora CD3-vezujući domen;

[0055] [4] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [3], pri čemu je antigen-vezujući domen bivalentni antigen-vezujući domen;

[0056] [5] polipeptidni kompleks iz [4], pri čemu je bivalentni antigen-vezujući domen domen koji ima F(ab’)2 strukturu;

[0057] [6] polipeptidni kompleks iz [5], u kome su dva polipeptida koji formiraju konstantni region teškog lanca domena koji ima F(ab’)2 strukturu pojedinačno povezana sa bilo kojim od dva polipeptida koji formiraju Fc domen;

[0058] [7] polipeptidni kompleks iz [6], u kome je CD3-vezujući domen povezan sa jednim ili oba od dva CH3 koji formiraju Fc domen;

[0059] [8] polipeptidni kompleks iz [7], u kome je teški lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen povezan sa jednim od CH3 koji formiraju Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen povezan je sa drugim CH3 koji formira Fc domen;

[0060] [9] polipeptidni kompleks iz [8], u kome je CH1 domen antitela povezan sa teškim lancem Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen, a CL domen antitela je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta;

[0061] [10] polipeptidni kompleks iz [6], u kome je CD3-vezujući domen povezan sa jednim ili oba od dva CL koji formiraju F(ab’)2;

[0062] [11] polipeptidni kompleks iz [6], u kome je CD3-vezujući domen povezan sa jednim ili oba od dva VH koji formiraju F(ab’)2;

[0063] [12] polipeptidni kompleks iz [6], u kome je CD3-vezujući domen povezan sa jednim ili oba od dva VL koji formiraju F(ab’)2;

[0064] [13] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [12], pri čemu je CD3-vezujući domen Fv;

[0065] [14] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [7] i [10] do [12], pri čemu je CD3-vezujući domen Fab;

[0066] [15] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [7] i [10] do [12], pri čemu je CD3-vezujući domen scFv;

[0067] [16] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [15], pri čemu je CD3-vezujući domen monovalentan;

[0068] [17] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [3], pri čemu je antigen-vezujući domen monovalentni scFv i monovalentni Fab;

[0069] [18] polipeptidni kompleks iz [17], u kome je monovalentni scFv povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem scFv koji formira CD3-vezujući domen; teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab je povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem CH1 domena; a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom;

[0070] [19] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [3], pri čemu je antigen-vezujući domen bivalentni scFv;

[0071] [20] polipeptidni kompleks iz [19], u kome je jedan monovalentni scFv povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem Fv fragmenta teškog lanca koji formira CD3-vezujući domen, a drugi monovalentni scFv je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen putem Fv fragmenta lakog lanca koji formira CD3-vezujući domen;

[0072] [21] polipeptidni kompleks iz [19], pri čemu je jedan monovalentni scFv povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem scFv koji formira CD3-vezujući domen, a drugi monovalentni scFv je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen;

[0073] [22] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [3], pri čemu su i antigen-vezujući domen i domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora monovalentni Fab;

[0074] [23] polipeptidni kompleks iz [22], u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira antigen-vezujući domen povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem CH1 domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom; i teški lanac Fv fragmenta Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen putem CH1 domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom;

[0075] [24] polipeptidni kompleks iz [22], u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira antigen-vezujući domen povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem CH1 domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom; i laki lanac Fv fragmenta Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen putem CH1 domena, a teški lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom;

[0076] [25] polipeptidni kompleks iz [22], u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira antigen-vezujući domen povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem CH1 domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom; i teški lanac Fv fragmenta Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen putem CL domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CH1 domenom;

[0077] [26] polipeptidni kompleks iz [22], u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem CH1 domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom; i laki lanac Fv fragmenta Fab koji formira antigen-vezujući domen je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen putem CH1 domena, a teški lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom;

[0078] [27] polipeptidni kompleks iz [22], u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen putem CH1 domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom; i teški lanac Fv fragmenta Fab koji formira antigenvezujući domen sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen putem CL domena, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CH1 domenom;

[0079] [28] polipeptidni kompleks iz [22] koji sadrži:

[0081] (1) antigen-vezujući domen u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentne Fab strukture koja se vezuje za antigen povezan putem CH1 domena sa jednim od polipeptida koji formiraju Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab strukture je povezan sa CL domenom; i

[0082] (2) domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentne Fab strukture koja se vezuje za kompleks T-ćelijskog receptora povezan putem CH1 domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab strukture je povezan sa CL domenom;

[0084] pri čemu su električna naelektrisanja CH1 i CL domena kontrolisana tako da se teški lanac Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena asemblira sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena, ili se teški lanac Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor asemblira sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor;

[0085] [29] polipeptidni kompleks iz [28], pri čemu aminokiselinski ostatak u CH1 domenu koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora ima isti tip električnog naelektrisanja kao aminokiselinski ostatak u CL domenu koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena;

[0086] [30] polipeptidni kompleks iz [28], pri čemu aminokiselinski ostatak u CH1 domenu koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena ima isti tip električnog naelektrisanja kao aminokiselinski ostatak u CL domenu koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora;

[0087] [31] polipeptidni kompleks iz [28], pri čemu aminokiselinski ostatak u CH1 domenu koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora ima isti tip električnog naelektrisanja kao aminokiselina u CL domenu koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena, a aminokiselinski ostatak u CH1 domenu koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena ima isti tip električnog naelektrisanja kao aminokiselina u CL domenu koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora;

[0088] [32] polipeptidni kompleks iz [29] ili [31], pri čemu aminokiselinski ostatak u CH1 domenu koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora ima električno naelektrisanje suprotno od električnog naelektrisanja aminokiselinskog ostatka u CL domenu koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor;

[0089] [33] polipeptidni kompleks iz [30] ili [31], pri čemu aminokiselinski ostatak u CH1 domenu koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena ima električno naelektrisanje suprotno od električnog naelektrisanja aminokiselinskog ostatka u CL domenu koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena;

[0090] [34] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [22] do [33], pri čemu je domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora domen za vezivanje za T-ćelijski receptor;

[0091] [35] polipeptidni kompleks iz [34], pri čemu je domen za vezivanje za T-ćelijski receptor CD3-vezujući domen;

[0092] [36] polipeptidni kompleks iz [32] ili [33], pri čemu su aminokiselinski ostaci u CH1 i CL domenima jedna, dve, ili više kombinacija aminokiselinskih ostataka koji su odabrani iz grupe koja se sastoji od kombinacija:

[0094] (a) aminokiselinskog ostatka na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 180 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0095] (b) aminokiselinskog ostatka na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 131 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0096] (c) aminokiselinskog ostatka na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 164 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0097] (d) aminokiselinskog ostatka na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 138 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0098] (e) aminokiselinskog ostatka na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 123 (EU numerisanje) u CL domenu; i (f) aminokiselinskog ostatka na poziciji 175 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 160 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0101] 1

[0102] i pri čemu aminokiselinski ostatak u CH1 domenu ima električno naelektrisanje suprotno od električnog naelektrisanja aminokiselinskog ostatka u CL domenu;

[0103] [37] polipeptidni kompleks iz [36], pri čemu su aminokiselinski ostaci odabrani iz grupe koja dodatno sadrži kombinaciju aminokiselinskih ostataka:

[0104] (g) aminokiselinskog ostatka na poziciji 213 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i aminokiselinskog ostatka na poziciji 123 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0105] [38] polipeptidni kompleks iz [36] ili [37], pri čemu je aminokiselinski ostatak koji ima suprotno električno naelektrisanje odabran od aminokiselinskog ostatka u bilo kojoj grupi:

[0107] (X) glutaminska kiselina (E) i asparaginska kiselina (D); ili

[0108] (Y) lizin (K), arginin (R), i histidin (H);

[0110] [39] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [36] do [38], pri čemu su aminokiselinski ostaci koji imaju suprotno električno naelektrisanje:

[0111] Lys na poziciji 175 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i Glu na pozicijama 131, 160, i 180 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0112] [40] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [36] do [38], pri čemu su aminokiselinski ostaci koji imaju suprotno električno naelektrisanje:

[0113] Glu na pozicijama 147 i 175 (EU numerisanje) u CH1 domenu, i Lys na pozicijama 131, 160, i 180 (EU numerisanje) u CL domenu;

[0114] [41] polipeptidni kompleks iz [40], pri čemu je aminokiselinski ostatak na poziciji 213 (EU numerisanje) u CH1 domenu Glu, a aminokiselinski ostatak na poziciji 123 (EU numerisanje) u CL domenu je Lys;

[0115] [42] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [41], pri čemu Fc domen pokazuje oslabljenu aktivnost vezivanja za Fcy receptor za FcyI, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA, i/ili FcγIIIB;

[0116] [43] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [42], pri čemu je Fc domen bilo koji od Fc domena SEQ ID NO: 23, 24, 25, i 26 u kojima su jedna ili više aminokiselina koje formiraju Fc domen mutirane;

[0117] [44] polipeptidni kompleks iz [43], pri čemu Fc domen sadrži bilo koju od aminokiselina u nastavku:

[0118] aminokiselinska sekvenca na pozicijama 118 do 260 (EU numerisanje) je sekvenca SEQ ID NO: 24; ili

[0119] aminokiselinska sekvenca na pozicijama 261 do 447 (EU numerisanje) je sekvenca SEQ ID NO: 26;

[0121] [45] polipeptidni kompleks iz [43], pri čemu aminokiseline koje formiraju Fc domen sadrže mutaciju na bilo kojoj od sledećih pozicija:

[0122] 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331, i 332 (EU numerisanje);

[0123] [46] polipeptidni kompleks iz [45], pri čemu Fc domen sadrži mutaciju u aminokiselinama SEQ ID NO: 23 koje formiraju Fc domen;

[0124] [47] polipeptidni kompleks iz [46], pri čemu je Fc domen Fc domen koji sadrži supstituciju aminokiseline na poziciji 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330, ili 331 (EU numerisanje) aminokiselinom na odgovarajućoj poziciji (EU numerisanje) u odgovarajućem IgG2 ili IgG4;

[0125] [48] polipeptidni kompleks iz [46], pri čemu Fc domen sadrži aminokiselinsku mutaciju na poziciji 234, 235, ili 297 (EU numerisanje);

[0126] [49] polipeptidni kompleks iz [48], u kome je aminokiselina(e) na poziciji 234, 235, i/ili 297 supstituisana alaninom;

[0127] [50] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [43] do [49], pri čemu su sekvence dva polipeptida koji formiraju Fc domen međusobno različite;

[0128] [51] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [50], pri čemu je aminokiselina na poziciji 349 supstituisana cisteinom i aminokiselina na poziciji 366 (EU numerisanje) je supstituisana triptofanom među aminokiselinskim ostacima jednog od dva polipeptida koji formiraju Fc domen; i pri čemu je aminokiselina na poziciji 356 supstituisana cisteinom, aminokiselina na poziciji 366 je supstituisana serinom, aminokiselina na poziciji 368 je supstituisana alaninom, i aminokiselina na poziciji 407 (EU numerisanje) je supstituisana valinom među aminokiselinskim ostacima drugog polipeptida;

[0129] [52] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [50], pri čemu je aminokiselina na poziciji 356 (EU numerisanje) supstituisana lizinom među aminokiselinskim ostacima jednog od dva polipeptida koji formiraju Fc domen; aminokiselina na poziciji 439 (EU numerisanje) je supstituisana glutaminskom kiselinom u drugom polipeptidu; i aminokiselina na poziciji 435 (EU numerisanje) je supstituisana argininom među aminokiselinskim ostacima bilo kog od dva polipeptida;

[0130] [53] polipeptidni kompleks iz [51] ili [52], pri čemu je izvršena delecija sekvence GK sa karboksilnih terminusa dva polipeptida koji formiraju Fc domen;

[0131] [54] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [53], pri čemu se antigen-vezujući domeni vezuju za isti epitop;

[0132] [55] polipeptidni kompleks iz [54], pri čemu je isti epitop prisutan u proteinu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2;

[0133] [56] polipeptidni kompleks iz [54], pri čemu je isti epitop prisutan u proteinu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4;

[0134] [57] polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [53], pri čemu se antigen-vezujući domeni vezuju svaki za različit epitop;

[0135] [58] polipeptidni kompleks iz [57], pri čemu je različit epitop prisutan u proteinu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2;

[0136] [59] polipeptidni kompleks iz [57], pri čemu je različit epitop prisutan u proteinu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4;

[0137] [60] polinukleotid koji kodira polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [59];

[0138] [61] vektor koji sadrži polinukleotid iz [60];

[0139] [62] ćelija koja sadrži vektor iz [61];

[0140] [63] postupak za proizvodnju polipeptidnog kompleksa, koji sadrži kultivaciju ćelije iz [62] i izolovanje polipeptidnog kompleksa iz supernatanta kulture;

[0141] [64] terapijski agens za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, koji kao aktivni sastojak sadrži polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [59];

[0142] [65] terapijski agens iz [64], pri čemu je terapijski agens za indukovanje ćelijske citotoksičnosti terapijski agens za kancer;

[0143] [66] terapijski agens iz [65], pri čemu je kancer kancer jetre ili kancer pluća;

[0144] [67] postupak za lečenje ili sprečavanje kancera, u kome se polipeptidni kompleks iz bilo koje od [1] do [59] primenjuje pacijentu kome je to potrebno; i

[0145] [68] terapijski ili preventivni postupak iz [67], pri čemu je kancer kancer jetre ili kancer pluća.

[0147] Predmetna objava se takođe odnosi na komplete za upotrebu u postupku iz predmetne objave, koji sadrže polipeptidni kompleks iz predmetne objave ili polipeptidni kompleks koji je proizveden pomoću postupka iz predmetne objave. Predmetna objava se takođe odnosi na

[0150] 1

[0151] upotrebu polipeptidnog kompleksa iz predmetne objave ili polipeptidnog kompleksa koji je proizveden pomoću postupka iz predmetne objave u proizvodnji terapijskog agensa za indukovanje ćelijske citotoksičnosti. Predmetna objava se takođe odnosi na polipeptidne komplekse iz predmetne objave ili polipeptidne komplekse koji su proizvedeni pomoću postupaka iz predmetne objave za upotrebu u postupku iz predmetne objave.

[0153] [Efekti pronalaska]

[0155] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove polipeptidne komplekse za upotrebu koji zadržavaju snažnu antitumorsku aktivnost BiTE i imaju dug poluživot u krvi, kao i odlična bezbednosna svojstva koja rezultuju neindukovanjem citokinske oluje nezavisne od antigena kancera ili slično. Kada se antigen-vezujući domen polipeptidnog kompleksa supstituiše, terapijski agensi koji sadrže polipeptidni kompleks kao aktivni sastojak za indukovanje ćelijske citotoksičnosti mogu ciljati i oštetiti različite ćelije, uključujući ćelije kancera. Stoga, mogu se lečiti ili sprečiti različiti kanceri. Ovo omogućava poželjna lečenja koja su veoma bezbedna i pogodna, i redukuju fizičko opterećenje za pacijente.

[0157] Kratak opis crteža

[0159]

[0161] Sl. 1 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 ERY1 (GPC3BiTE), GPC3 ERY2, i anti-GPC3 antitela IgG-tipa. Ispunjeni kvadrat (■), ispunjeni trougao (▲), i neispunjeni kvadrat (□) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 ERY1 (GPC3 BiTE), GPC3 ERY2, anti-GPC3 antitela IgG-tipa, respektivno.

[0163] Sl. 2 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 BiTE i GPC3 ERY5. Ispunjeni kvadrat (■) i neispunjeni krug (∘) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 BiTE i GPC3 ERY5, respektivno.

[0165] Sl. 3 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 BiTE i GPC3 ERY6. Ispunjeni kvadrat (■) i ispunjeni trougao (▲) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 BiTE i GPC3 ERY6, respektivno.

[0166] Sl. 4 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 BiTE i GPC3 ERY7. Ispunjeni kvadrat (■) i ispunjeni romb (◆) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 BiTE i GPC3 ERY7, respektivno.

[0168] Sl. 5 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 BiTE, GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1. Ispunjeni kvadrat (■), ispunjeni trougao (▲), neispunjeni krug (∘), i neispunjeni kvadrat (□) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 BiTE, GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1, respektivno.

[0170] Sl. 6 je grafikon koji pokazuje in vivo antitumorski efekat GPC3 ERY8‑2 u PC‑10 premiks modelu. Neispunjeni kvadrat (□) i ispunjeni romb (◆) označavaju promene u zapremini tumora grupe koja je primala GPC3 ERY7 i kontrolne grupe (primena PBS), respektivno.

[0172] Sl. 7 je grafikon koji pokazuje in vivo antitumorski efekat GPC3 ERY10‑1 u PC‑10 premiks modelu. Neispunjeni kvadrat (□) i ispunjeni romb (◆) označavaju promene u zapremini tumora grupe koja je primala GPC3 ERY10‑1 i kontrolne grupe (primena PBS), respektivno.

[0174] Sl. 8 je grafikon koji pokazuje in vivo antitumorski efekat GPC3 ERY10‑1 u modelu PC‑10 T-ćelijskog transfera. Neispunjeni kvadrat (□) i ispunjeni romb (◆) označavaju promene u zapremini tumora grupe koja je primala GPC3 ERY10‑1 i kontrolne grupe (primena PBS), respektivno.

[0176] Sl. 9 je grafikon koji pokazuje vremenski tok koncentracija u plazmi GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 određenih upotrebom GPC3-eksprimirajućih Ba/F3 ćelija. Ispunjeni romb (◆) i neispunjeni kvadrat (□) označavaju vremenski tok koncentracija u plazmi za GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1, respektivno.

[0178] Sl. 10 je grafikon koji pokazuje vremenski tok koncentracija u plazmi GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 određenih upotrebom CD3-eksprimirajućih Ba/F3 ćelija. Ispunjeni romb (◆) i neispunjeni kvadrat (□) označavaju vremenski tok koncentracija u plazmi za GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1, respektivno.

[0181] 1

[0182] Sl. 11 je grafikon koji pokazuje procenu GPC3 BiTE, GPC3 ERY9‑1, GPC3 ERY10‑1, GPC3 ERY15‑1, i katumaksomaba u pogledu njihove sposobnosti da indukuju citokine na način nezavisan od antigena kancera.

[0184] Sl. 12 je grafikon koji pokazuje in vitro citotoksičnosti GPC3 ERY18 L1, GPC3 ERY18L2, GPC3 ERY18L3, GPC3 ERY18L4, i GPC3 ERY18S1. Ispunjeni trougao (▲), ispunjeni krug (•), ispunjeni kvadrat (■), neispunjeni kvadrat (□), i neispunjeni romb (0) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 ERY18 L1, GPC3 ERY18 L2, GPC3 ERY18 L3, GPC3 ERY18 L4, i GPC3 ERY18 S1, respektivno.

[0186] Sl. 13 je grafikon koji pokazuje poređenje in vitro citotoksičnih aktivnosti GPC3 ERY18 L3 i GPC3 ERY10‑1. Ispunjeni kvadrat (■) i neispunjeni kvadrat (□) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 ERY18 L3 i GPC3 ERY10‑1, respektivno.

[0188] Sl. 14 je grafikon koji pokazuje poređenje in vitro citotoksičnih aktivnosti GPC3 ERY19‑3 i GPC3 BiTE. Neispunjeni kvadrat (□) i ispunjeni kvadrat (■) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 ERY19‑3 i GPC3 BiTE, respektivno.

[0190] Sl. 15A je hromatogram koji pokazuje rezultate analize ekskluzione hromatografije CM u kom je eksprimiran NTA1L/NTA1R/GC33-k0. Sl.15B je hromatogram koji prikazuje rezultate analize ekskluzione hromatografije CM u kom je eksprimiran NTA2L/NTA2R/GC33-k0.

[0192] Sl. 16 pokazuje dijagrame koji predstavljaju domene koji formiraju sledeće polipeptidne komplekse koji su opisani u ovde navedenim Primerima: GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, GPC3 ERY5, GPC3 ERY6, GPC3 ERY7, GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, GPC3 ERY 10‑1, GPC3 ERY15, GPC3 ERY18, i GPC3 ERY19‑3. Domen sa unakrsnim linijama predstavlja varijabilni region H-lanca anti-kancerski antigen (GPC3, EpCAM, EGFR) antitela; domen sa dijagonalnim linijama predstavlja varijabilni region L-lanca antikancerski antigen (GPC3, EpCAM, EGFR) antitela; domen sa tačkastim linijama predstavlja varijabilni region H-lanca anti-CD3 antitela; ispunjeni domen predstavlja varijabilni region L-lanca anti-CD3 antitela; neispunjeni domen predstavlja konstantni region antitela; krst predstavlja tihu mutaciju Fc; a zvezda predstavlja mutaciju koja promoviše heteromernu asocijaciju Fc.

[0195] 1

[0196] Sl. 17 pokazuje dijagrame GPC3 BiTE (A); GPC3 ERY 10 (B); GPC3 ERY2 (C); GPC3 ERY5 (D); GPC3 ERY6 (E); GPC3 ERY7 (F); GPC3 ERY8‑2 (G); GPC3 ERY9‑1 (H); GPC3 ERY10‑1 (I); GPC3 ERY15 (J); GPC3 ERY18 (K); i GPC3 ERY19‑3 (L).

[0198] Sl. 18 pokazuje aminokiselinske ostatke koji formiraju Fc domene IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 i njihovo Kabat EU numerisanje (ovde se takođe naziva „EU INDEX“).

[0200] Sl. 19 pokazuje dijagrame koji predstavljaju domene koji formiraju sledeće polipeptidne komplekse koji su opisani u ovde navedenim Primerima: GPC3 ERY17‑2, GPC3 ERY17‑3, EpCAM ERY17‑2, i EpCAM ERY17‑3. Domen sa unakrsnim linijama predstavlja varijabilni region H-lanca anti-kancerski antigen (GPC3, EpCAM, EGFR) antitela; domen sa dijagonalnim linijama predstavlja varijabilni region L-lanca antikancerski antigen (GPC3, EpCAM, EGFR) antitela; domen sa tačkastim linijama predstavlja varijabilni region H-lanca anti-CD3 antitela; ispunjeni domen predstavlja varijabilni region L-lanca anti-CD3 antitela; neispunjeni domen predstavlja konstantni region antitela; krst predstavlja tihu mutaciju Fc; a zvezda predstavlja mutaciju koja promoviše heteromernu asocijaciju Fc.

[0202] Sl. 20 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 BiTE, GPC3 ERY17‑2, GPC3 ERY17‑3, i GPC3 ERY10‑1. Ispunjeni kvadrat (■), ispunjeni trougao (▲), neispunjeni krug (∘), i neispunjeni kvadrat (□) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 BiTE, GPC3 ERY17‑2, GPC3 ERY17‑3, i GPC3 ERY10‑1, respektivno.

[0204] Sl. 21 je grafikon koji pokazuje in vivo antitumorski efekat GPC3 ERY17‑2 u modelu PC‑10 T-ćelijskog transfera. Neispunjeni kvadrat (□) i ispunjeni romb (◆) označavaju promene u zapremini tumora grupe koja je primala GPC3 ERY17‑2 i kontrolne grupe (primena PBS), respektivno.

[0206] Sl. 22 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GPC3 ERY17‑2 i GPC3 ERY17‑2-M20. Ispunjeni trougao (▲) i neispunjeni krug (∘) predstavljaju citotoksične aktivnosti GPC3 ERY17‑2 i GPC3 ERY17‑2-M20, respektivno.

[0209] 1

[0210] Sl. 23 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3. Ispunjeni trougao (▲) i neispunjeni kvadrat (□) predstavljaju citotoksične aktivnosti EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3, respektivno.

[0212] Sl. 24 pokazuje dijagrame koji predstavljaju domene koji formiraju sledeće polipeptidne komplekse koji su opisani u ovde navedenim Primerima: GM1, GM2, i GM0. „A“ pokazuje polipeptidni kompleks u kome je regulisana asocijacija CH1/CL interfejsa i introdukovane su izbočine-u-udubljenja (KiH) modifikacije. „B“ pokazuje polipeptidni kompleks koji nema regulaciju asocijacije CH1/CL interfejsa ili introdukciju KiH modifikacija. Domen sa unakrsnim linijama predstavlja varijabilni region H-lanca antikancerski antigen (GPC3 ili EpCAM) antitela; domen sa dijagonalnim linijama predstavlja varijabilni region L-lanca anti-kancerski antigen (GPC3 ili EpCAM) antitela; domen sa tačkastim linijama predstavlja varijabilni region H-lanca anti-CD3 antitela; ispunjeni domen predstavlja varijabilni region L-lanca anti-CD3 antitela; neispunjeni domen predstavlja konstantni region antitela; krst predstavlja tihu mutaciju Fc; zvezda predstavlja mutaciju koja promoviše heteromernu asocijaciju Fc; a simbol u obliku krofne predstavlja mutaciju koja reguliše interakciju CH1/CL interfejsa.

[0214] Sl. 25 je grafikon koji pokazuje poređenje citotoksičnih aktivnosti GM1, GM2, i GM0. Ispunjeni trougao (▲), neispunjeni kvadrat (□), i neispunjeni krug (∘) predstavljaju citotoksične aktivnosti GM1, GM2, i GM3, respektivno.

[0216] Sl. 26 je grafikon koji pokazuje citotoksičnu aktivnost EGFR ERY17‑2. Ispunjeni trougao (▲) predstavlja citotoksičnu aktivnost EGFR ERY17‑2.

[0218] Način za izvođenje pronalaska

[0220] Definicije u nastavku su obezbeđene kako bi olakšale razumevanje predmetnog pronalaska.

[0222] Antitelo

[0224] Ovde, „antitelo“ označava prirodni imunoglobulin ili imunoglobulin proizveden delimičnom ili potpunom sintezom. Antitela se mogu izolovati iz prirodnih izvora kao što su

[0227] 1

[0228] plazma i serum koji se javljaju u prirodi, ili supernatanti kulture hibridoma koji proizvode antitela. Alternativno, antitela se mogu delimično ili u potpunosti sintetisati upotrebom tehnika kao što je genetička rekombinacija. Poželjna antitela uključuju, na primer, antitela izotipa imunoglobulina ili podklase koja mu pripada. Poznati humani imunoglobulini uključuju antitela sledećih devet klasa (izotipova): IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, i IgM. Od ovih izotipova, antitela uključuju IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.

[0229] Postupci za proizvodnju antitela sa željenom aktivnošću vezivanja poznati su onima sa iskustvom u struci. U nastavku je primer koji opisuje postupak za proizvodnju antitela (anti-GPC3 antitelo) koje se vezuje za GPC3, koji pripada porodici GPI-usidrenih receptora (Int J Cancer. (2003) 103(4), 455‑65). Antitela koja se vezuju za antigen koji nije GPC3 takođe se mogu proizvesti u skladu sa primerom koji je opisan u nastavku.

[0230] Anti-GPC3 antitela se mogu dobiti kao poliklonska ili monoklonska antitela upotrebom poznatih postupaka. Anti-GPC3 antitela koja se poželjno proizvode su monoklonska antitela poreklom iz sisara. Takva monoklonska antitela poreklom iz sisara uključuju antitela proizvedena od strane hibridoma ili ćelija domaćina koje su transformisane, tehnikama genetičkog inženjeringa, sa ekspresionim vektorom koji nosi gen antitela.

[0231] Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela mogu se proizvesti upotrebom poznatih tehnika, na primer, kao što je opisano u nastavku. Specifično, sisari se imunizuju konvencionalnim postupcima imunizacije upotrebom GPC3 proteina kao senzibilizujućeg antigena. Vrši se fuzija rezultujućih imunskih ćelija sa poznatim roditeljskim ćelijama konvencionalnim postupcima ćelijske fuzije. Zatim, hibridomi koji proizvode anti-GPC3 antitelo mogu se odabrati pregledom ćelija koje proizvode monoklonska antitela upotrebom konvencionalnih postupaka pregleda.

[0232] Specifično, monoklonska antitela se pripremaju kao što je navedeno u nastavku. Prvo, GPC3 gen čija je nukleotidna sekvenca objavljena u RefSeq pristupnom broju NM _001164617.1 (SEQ ID NO: 1) može se eksprimirati kako bi se proizveo GPC3 protein koji je prikazan u RefSeq pristupnom broju NP_001158089.1 (SEQ ID NO: 2), koji će se upotrebljavati kao senzibilizujući antigen za pripremu antitela. To jest, genska sekvenca koja kodira GPC3 se insertuje u poznati ekspresioni vektor, a odgovarajuće ćelije domaćini se transformišu sa ovim vektorom. Željeni humani GPC3 protein se prečišćava iz ćelija domaćina ili njihovih supernatanata kulture poznatim postupcima. Na primer, kako bi se pripremio solubilni GPC3 iz supernatanata kulture, vrši se delecija aminokiselina na pozicijama 564 do 580 koje formiraju hidrofobni region koji odgovara GPI-sidrenoj sekvenci koja se upotrebljava za usidravanje GPC3 u ćelijsku membranu iz GPC3 polipeptidne

[0235] 1

[0236] sekvence SEQ ID NO: 2, a zatim se rezultujući protein eksprimira umesto GPC3 proteina SEQ ID NO: 2. Alternativno, moguće je upotrebljavati prečišćeni prirodni GPC3 protein kao senzibilizujući antigen.

[0237] Prečišćeni GPC3 protein može se upotrebljavati kao senzibilizujući antigen za imunizaciju sisara. Delimični GPC3 peptid se takođe može upotrebljavati kao senzibilizujući antigen. U ovom slučaju, delimični peptid se može pripremiti hemijskom sintezom koja je zasnovana na aminokiselinskoj sekvenci humanog GPC3, ili insertovanjem delimičnog GPC3 gena u ekspresioni vektor za ekspresiju. Alternativno, delimični peptid se može proizvesti degradacijom GPC3 proteina proteazom. Dužina i region delimičnog GPC3 peptida nisu ograničeni na posebne primere izvođenja. Poželjni region može biti proizvoljno odabran iz aminokiselinske sekvence na aminokiselinskim pozicijama 564 do 580 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 2. Broj aminokiselina koje formiraju peptid koji se upotrebljava kao senzibilizujući antigen poželjno je najmanje pet ili više, šest ili više, ili sedam ili više. Specifičnije, peptid od 8 do 50 ostataka, poželjnije 10 do 30 ostataka može se upotrebljavati kao senzibilizujući antigen.

[0238] Za senzibilizujući antigen, alternativno je moguće upotrebljavati fuzioni protein koji je pripremljen fuzionisanjem željenog delimičnog polipeptida ili peptida GPC3 proteina sa različitim polipeptidom. Na primer, Fc fragmenti antitela i peptidne oznake se poželjno upotrebljavaju za proizvodnju fuzionih proteina koji se upotrebljavaju kao senzibilizujući antigeni. Vektori za ekspresiju takvih fuzionih proteina mogu se konstruisati fuzionisanjem uz očuvanje okvira čitanja (in-frame) gena koji kodiraju dva ili više željenih fragmenata polipeptida i insertovanjem fuzionog gena u ekspresioni vektor kao što je prethodno opisano. Postupci za proizvodnju fuzionih proteina opisani su u Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab. Press). Postupci za pripremu GPC3 koji se upotrebljava kao senzibilizujući antigen, i postupci imunizacije upotrebom GPC3 su specifično opisani u WO 2003/000883, WO 2004/022754, i WO 2006/006693.

[0239] Ne postoji posebno ograničenje u pogledu sisara koji se imunizuju senzibilizujućim antigenom. Međutim, poželjno je odabrati sisare uzimajući u obzir njihovu kompatibilnost sa roditeljskim ćelijama koje će se upotrebljavati za ćelijsku fuziju. Generalno, poželjno se upotrebljavaju glodari kao što su miševi, pacovi, i hrčci, zečevi, i majmuni.

[0240] Prethodno navedene životinje se imunizuju senzibilizujućim antigenom pomoću poznatih postupaka. Generalno izvedeni postupci imunizacije uključuju, na primer, intraperitonealnu ili subkutanu injekciju senzibilizujućeg antigena u sisare. Specifično,

[0243] 2

[0244] senzibilizujući antigen se odgovarajuće razblaži sa PBS (fosfatom puferisanim fiziološkim rastvorom), fiziološkim rastvorom, ili slično. Po želji, konvencionalni adjuvans kao što je Frojndov (Freund’s) kompletni adjuvans se meša sa antigenom, a smeša se emulguje. Zatim se senzibilizujući antigen primenjuje sisaru nekoliko puta u intervalima od 4 do 21 dan. Odgovarajući nosači mogu se upotrebljavati u imunizaciji senzibilizujućim antigenom. Posebno, kada se delimični peptid male molekulske težine upotrebljava kao senzibilizujući antigen, ponekad je poželjno kuplovati senzibilizujući antigenski peptid za protein nosač kao što je albumin ili hemocijanin iz puža prilepka ključaonice radi imunizacije.

[0245] Alternativno, hibridomi koji proizvode željeno antitelo mogu se pripremiti upotrebom DNK imunizacije kao što je pomenuto u nastavku. DNK imunizacija je postupak imunizacije koji daje imunostimulaciju ekspresijom senzibilizujućeg antigena kod imunizovane životinje kao rezultat primene vektorske DNK konstruisane tako da omogući ekspresiju gena koji kodira antigenski protein kod životinje. U poređenju sa konvencionalnim postupcima imunizacije u kojima se proteinski antigen primenjuje životinjama koje se imunizuju, očekuje se da će DNK imunizacija biti superiornija u tome što:

[0247] - imunostimulacija se može obezbediti uz zadržavanje strukture membranskog proteina kao što je GPC3; i

[0248] - nema potrebe za prečišćavanjem antigena za imunizaciju.

[0250] Kako bi se pripremilo monoklonsko antitelo upotrebom DNK imunizacije, prvo se DNK koja eksprimira GPC3 protein primenjuje životinji koja se imunizuje. DNK koja kodira GPC3 može se sintetisati pomoću poznatih postupaka kao što je PCR. Dobijena DNK se insertuje u odgovarajući ekspresioni vektor, a zatim se on primenjuje životinji koja se imunizuje. Poželjno upotrebljeni ekspresioni vektori uključuju, na primer, komercijalno dostupne ekspresione vektore kao što je pcDNA3.1. Vektori se mogu primeniti organizmu upotrebom konvencionalnih postupaka. Na primer, DNK imunizacija se vrši upotrebom genskog pištolja kako bi se introdukovale ekspresionim vektorom obložene zlatne čestice u ćelije u telu životinje koja se imunizuje. Antitela koja prepoznaju GPC3 takođe se mogu proizvesti postupcima koji su opisani u WO 2003/104453.

[0251] Posle imunizacije sisara kao što je prethodno opisano, potvrđuje se povećanje titra GPC3-vezujućeg antitela u serumu. Zatim, imunske ćelije se sakupljaju iz sisara, a zatim podvrgavaju ćelijskoj fuziji. Konkretno, splenociti se poželjno upotrebljavaju kao imunske ćelije.

[0252] Ćelija mijeloma sisara se upotrebljava kao ćelija koja će se fuzionisati sa prethodno pomenutim imunocitom. Ćelije mijeloma poželjno sadrže pogodni selekcioni marker za pregled. Selekcioni marker daje ćelijama karakteristike za njihovo preživljavanje (ili smrt) pod specifičnim uslovima kulture. Deficijencija hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (ovde u daljem tekstu skraćeno kao deficijencija HGPRT) i deficijencija timidin kinaze (ovde u daljem tekstu skraćeno kao deficijencija TK) poznati su kao selekcioni markeri. Ćelije sa deficijencijom HGPRT ili TK imaju osetljivost na hipoksantin-aminopterin-timidin (ovde u daljem tekstu skraćeno kao HAT osetljivost). HAT-osetljive ćelije ne mogu da sintetišu DNK u HAT selekcionom medijumu, i stoga bivaju ubijene. Međutim, kada su ćelije fuzionisane sa normalnim ćelijama, one mogu da nastave sintezu DNK upotrebljavajući put spasavanja normalnih ćelija, i prema tome mogu da rastu čak i u HAT selekcionom medijumu.

[0253] Ćelije sa deficijencijom HGPRT i deficijencijom TK mogu biti selektovane u medijumu koji sadrži 6-tioguanin, 8-azaguanin (ovde u daljem tekstu skraćeno kao 8AG), ili 5'-bromodezoksiuridin, respektivno. Normalne ćelije se ubijaju pošto u svoju DNK inkorporišu ove pirimidinske analoge. U međuvremenu, ćelije koje su deficijentne za ove enzime mogu preživeti u selekcionom medijumu, pošto ne mogu da inkorporišu ove pirimidinske analoge. Pored toga, selekcioni marker koji se označava kao G418 rezistencija koju obezbeđuje gen rezistencije na neomicin daje rezistenciju na 2-dezoksistreptaminske antibiotike (analozi gentamicina). Poznati su različiti tipovi ćelija mijeloma koje su pogodne za ćelijsku fuziju.

[0254] Na primer, poželjno se mogu upotrebljavati ćelije mijeloma, uključujući sledeće ćelije:

[0256] P3(P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123 (4), 1548-1550);

[0257] P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978)81, 1-7);

[0258] NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976)6 (7), 511-519);

[0259] MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415);

[0260] SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685), 269-270);

[0261] FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21);

[0262] S194/5. XX0BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323);

[0263] R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133), itd.

[0265] Ćelijske fuzije između imunocita i ćelija mijeloma se u suštini sprovode upotrebom poznatih postupaka, na primer, postupka koji su razvili Koler (Kohler) i Milštajn (Milstein) et al. (Methods Enzymol. (1981) 73: 3‑46).

[0266] Specifičnije, ćelijska fuzija može se sprovesti, na primer, u konvencionalnom medijumu za kulturu u prisustvu agensa za podsticanje fuzije ćelija. Agensi za podsticanje fuzije uključuju, na primer, polietilen glikol (PEG) i Sendai virus (HVJ). Po potrebi, dodaje se i pomoćna supstanca kao što je dimetil sulfoksid radi poboljšanja efikasnosti fuzije.

[0267] Odnos imunocita prema ćelijama mijeloma može se odrediti po sopstvenom nahođenju, poželjno, na primer, jedna ćelija mijeloma za svakih jedan do deset imunocita. Medijumi za kulturu koji se upotrebljavaju za ćelijske fuzije uključuju, na primer, medijume koji su pogodni za rast ćelijskih linija mijeloma, kao što su RPMI1640 medijum i MEM medijum, i drugi konvencionalni medijumi za kulturu koji se upotrebljavaju za ovu vrstu ćelijske kulture. Pored toga, serumski suplementi kao što je fetalni teleći serum (FCS) mogu se poželjno dodati u medijum za kulturu.

[0268] Za ćelijsku fuziju, unapred određene količine prethodno navedenih imunskih ćelija i ćelija mijeloma se dobro pomešaju u prethodno navedenom medijumu za kulturu. Zatim, u to se dodaje PEG rastvor (na primer, prosečna molekulska težina je oko 1.000 do 6.000) prethodno zagrejan na oko 37 °C u koncentraciji od generalno 30% do 60% (tež./zapr.). Ovo se nežno meša kako bi se proizvele željene fuzione ćelije (hibridomi). Zatim se ćelijama postepeno dodaje odgovarajući prethodno pomenuti medijum za kulturu, a zatim se više puta centrifugira kako bi se uklonio supernatant. Stoga, mogu se ukloniti agensi za fuziju ćelija i slični koji su nepovoljni za rast hibridoma.

[0269] Tako dobijeni hibridomi mogu se odabrati pomoću kulture upotrebom konvencionalnog selekcionog medijuma, na primer, HAT medijuma (medijum za kulturu koji sadrži hipoksantin, aminopterin, i timidin). Ćelije koje nisu željeni hibridomi (nefuzionisane ćelije) mogu se ubiti nastavljanjem kulture u prethodno navedenom HAT medijumu tokom dovoljnog vremenskog perioda. Tipično, period je od nekoliko dana do nekoliko nedelja. Zatim, hibridomi koji proizvode željeno antitelo se pregledaju i pojedinačno kloniraju konvencionalnim postupcima graničnog razblaženja.

[0270] Tako dobijeni hibridomi mogu se odabrati upotrebom selekcionog medijuma zasnovanog na selekcionom markeru koji poseduje mijelom koji se upotrebljava za ćelijsku fuziju. Na primer, ćelije sa deficijencijom HGPRT ili TK mogu se odabrati pomoću kulture upotrebom HAT medijuma (medijum za kulturu koji sadrži hipoksantin, aminopterin, i timidin). Specifično, kada se HAT-osetljive ćelije mijeloma upotrebljavaju za ćelijsku fuziju, ćelije uspešno fuzionisane sa normalnim ćelijama mogu selektivno proliferisati u HAT medijumu. Ćelije koje nisu željeni hibridomi (nefuzionisane ćelije) mogu se ubiti nastavljanjem kulture u prethodno navedenom HAT medijumu tokom dovoljnog vremenskog

[0273] 2

[0274] perioda. Specifično, željeni hibridomi mogu se odabrati pomoću kulture generalno od nekoliko dana do nekoliko nedelja. Zatim, hibridomi koji proizvode željeno antitelo se pregledaju i pojedinačno kloniraju konvencionalnim postupcima graničnog razblaženja.

[0275] Željena antitela mogu biti poželjno odabrana i pojedinačno klonirana postupcima pregleda koji su zasnovani na poznatoj antigen/antitelo reakciji. Na primer, GPC3-vezujuće monoklonsko antitelo može se vezati za GPC3 koji se eksprimira na površini ćelije. Takvo monoklonsko antitelo može se pregledati pomoću sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS). FACS je sistem koji procenjuje vezivanje antitela za površinu ćelije analiziranjem ćelija koje su dovedene u kontakt sa fluorescentnim antitelom upotrebom laserskog snopa, i merenjem fluorescencije koju emituju pojedinačne ćelije.

[0276] Kako bi se pregledali hibridomi koji proizvode monoklonsko antitelo pomoću FACS, prvo se pripremaju GPC3-eksprimirajuće ćelije. Ćelije koje se poželjno upotrebljavaju za pregled su ćelije sisara u kojima je GPC3 prisilno eksprimiran. Kao kontrola, aktivnost antitela da se vezuje za GPC3 na površini ćelije može se selektivno detektovati upotrebom netransformisanih ćelija sisara kao ćelija domaćina. Specifično, hibridomi koji proizvode anti-GPC3 monoklonsko antitelo mogu se izolovati odabirom hibridoma koji proizvode antitelo koje se vezuje za ćelije koje prisilno eksprimiraju GPC3, ali ne i za ćelije domaćina.

[0277] Alternativno, aktivnost antitela da se vezuje za imobilisane GPC3-eksprimirajuće ćelije može se proceniti na osnovu principa ELISA testa. Na primer, GPC3-eksprimirajuće ćelije imobilišu se na bunariće ELISA ploče. Supernatanti kulture hibridoma se dovode u kontakt sa imobilisanim ćelijama u bunarićima, i detektuju se antitela koja se vezuju za imobilisane ćelije. Kada su monoklonska antitela poreklom iz miša, antitela vezana za ćelije mogu se detektovati upotrebom anti-mišjeg imunoglobulinskog antitela. Hibridomi koji proizvode željeno antitelo koje ima sposobnost vezivanja antigena odabiraju se prethodno navedenim pregledom, i mogu se klonirati postupkom graničnog razblaženja ili slično.

[0278] Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela, pripremljeni na ovaj način, mogu se pasažirati u konvencionalnom medijumu za kulturu, i čuvati u tečnom azotu tokom dužeg perioda.

[0279] Prethodno navedeni hibridomi se kultivišu konvencionalnom postupkom, a željena monoklonska antitela mogu se pripremiti iz supernatanata kulture. Alternativno, hibridomi se primenjuju kompatibilnim sisarima i gaje u njima, a monoklonska antitela se pripremaju iz ascitesa. Prvi postupak je pogodan za pripremu antitela visoke čistoće.

[0280] [0043] Antitela kodirana genima antitela koji su klonirani iz ćelija koje proizvode antitela, kao što su prethodno navedeni hibridomi, takođe se mogu poželjno upotrebljavati. Klonirani gen antitela se insertuje u odgovarajući vektor, a ovaj se introdukuje u domaćina kako bi se eksprimiralo antitelo koje je kodirano genom. Postupci za izolovanje gena antitela, insertovanje gena u vektore, i transformaciju ćelija domaćina već su uspostavljeni, na primer, od strane Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192(3), 767‑775). Postupci za proizvodnju rekombinantnih antitela su takođe poznati kao što je opisano u nastavku.

[0281] Na primer, cDNA koja kodira varijabilni region (V region) anti-GPC3 antitela priprema se iz ćelija hibridoma koje eksprimiraju anti-GPC3 antitelo. U tu svrhu, ukupna RNK se prvo ekstrahuje iz hibridoma. Postupci koji se upotrebljavaju za ekstrakciju iRNK iz ćelija uključuju, na primer:

[0283] - postupak ultracentrifugiranja sa guanidinom (Biochemistry (1979) 18(24), 5294‑5299), i

[0284] - AGPC postupak (Anal. Biochem. (1987) 162(1), 156‑159)

[0286] Ekstrahovane iRNK mogu se prečistiti upotrebom kompleta za prečišćavanje iRNK (GE Healthcare Bioscience) ili slično. Alternativno, kompleti za ekstrakciju ukupne iRNK direktno iz ćelija, kao što je QuickPrep komplet za prečišćavanje iRNK (GE Healthcare Bioscience), takođe su komercijalno dostupni. iRNK se mogu pripremiti iz hibridoma upotrebom takvih kompleta. cDNA koje kodiraju V region antitela mogu se sintetisati iz pripremljenih iRNK upotrebom reverzne transkriptaze. cDNA se mogu sintetisati upotrebom kompleta za sintezu prvog lanca cDNA sa reverznom transkriptazom AMV (Seikagaku Co.) ili slično. Štaviše, SMART RACE komplet za amplifikaciju cDNA (Clontech) i postupak 5'-RACE zasnovan na PCR (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85(23), 8998‑9002; Nucleic Acids Res. (1989) 17(8), 2919‑2932) mogu se odgovarajuće upotrebljavati za sintezu i amplifikaciju cDNA. U takvom procesu sinteze cDNA, odgovarajuća mesta za restrikcioni enzim opisana u nastavku mogu biti introdukovana na oba kraja cDNA.

[0287] Fragment cDNA od interesa se prečišćava iz rezultujućeg PCR proizvoda, a zatim se ligira za vektorsku DNK. Tako se konstruiše rekombinantni vektor, i introdukuje u E. coli ili slično. Posle odabira kolonije, željeni rekombinantni vektor može se pripremiti iz E. coli koja formira koloniju. Zatim, poznatim postupkom kao što je postupak završavanja lanca didezoksi nukleotidima testira se da li rekombinantni vektor ima nukleotidnu sekvencu cDNK od interesa.

[0288] 5’-RACE postupak koji upotrebljava prajmere za amplifikaciju gena varijabilnog regiona pogodno se upotrebljava za izolovanje gena koji kodira varijabilni region. Prvo, 5’-

[0291] 2

[0292] RACE cDNA biblioteka se konstruiše sintezom cDNA upotrebom RNK koja je ekstrahovana iz ćelija hibridoma kao templat. Komercijalno dostupan komplet, kao što je SMART RACE komplet za amplifikaciju cDNA, na odgovarajući način se upotrebljava za sintezu 5’-RACE cDNA biblioteke.

[0293] Gen antitela se amplifikuje pomoću PCR upotrebom pripremljene 5’-RACE cDNA biblioteke kao templata. Prajmeri za amplifikaciju mišjeg gena antitela mogu se dizajnirati na osnovu poznatih sekvenci gena antitela. Nukleotidne sekvence prajmera variraju u zavisnosti od podklase imunoglobulina. Prema tome, poželjno je da se podklasa unapred odredi upotrebom komercijalno dostupnog kompleta kao što je Iso Strip komplet za izotipizaciju mišjeg monoklonskog antitela (Roche Diagnostics).

[0294] Specifično, na primer, prajmeri koji omogućavaju amplifikaciju gena koji kodiraju teške lance y1, y2a, y2b, i y3 i lake lance κ i λ upotrebljavaju se za izolaciju mišjih gena koji kodiraju IgG. Generalno, prajmer koji se vezuje za mesto konstantnog regiona blizu varijabilnog regiona upotrebljava se kao 3’-strani prajmer za amplifikaciju gena varijabilnog regiona IgG. U međuvremenu, prajmer koji je prikačen za 5’ RACE komplet za konstrukciju cDNA biblioteke upotrebljava se kao 5’-strani prajmer.

[0295] Tako amplifikovani PCR proizvodi upotrebljavaju se za preoblikovanje imunoglobulina koji su sačinjeni od kombinacije teških i lakih lanaca. Željeno antitelo može se odabrati upotrebom GPC3-vezujuće aktivnosti preoblikovanog imunoglobulina kao indikatora. Na primer, kada je cilj izolovanje antitela prema GPC3, poželjnije je da je vezivanje antitela za GPC3 specifično. GPC3-vezujuće antitelo može se pregledati, na primer, sledećim koracima:

[0297] (1) dovođenjem u kontakt GPC3-eksprimirajuće ćelije sa antitelom koje sadrži V region koji je kodiran od strane cDNA koja je izolovana iz hibridoma;

[0298] (2) detektovanjem vezivanja antitela za GPC3-eksprimirajuću ćeliju; i

[0299] (3) odabirom antitela koje se vezuje za GPC3-eksprimirajuću ćeliju.

[0301] Postupci za detektovanje vezivanja antitela za GPC3-eksprimirajuće ćelije su poznati. Specifično, vezivanje antitela za GPC3-eksprimirajuće ćelije može se detektovati prethodno opisanim tehnikama kao što je FACS. Imobilisani uzorci GPC3-eksprimirajuće ćelije se odgovarajuće upotrebljavaju za procenu aktivnosti vezivanja antitela.

[0302] Poželjni postupci pregleda antitela koji upotrebljavaju aktivnost vezivanja kao indikator takođe uključuju postupke selekcije (panning) upotrebom fagnih vektora. Postupci

[0305] 2

[0306] pregleda koji upotrebljavaju fagne vektore su povoljni kada su geni antitela izolovani iz biblioteka podklasa teških lanaca i lakih lanaca iz ćelijske populacije koja eksprimira poliklonska antitela. Geni koji kodiraju varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca mogu biti povezani odgovarajućom linkerskom sekvencom kako bi se formirao jednolančani Fv (scFv). Fagi koji prezentuju scFv na svojoj površini mogu se proizvesti insertovanjem gena koji kodira scFv u fagni vektor. Fagi se dovode u kontakt sa antigenom od interesa. Zatim, DNK koja kodira scFv koji ima aktivnost vezivanja od interesa može se izolovati sakupljanjem faga koji su vezani za antigen. Ovaj proces se može ponoviti po potrebi kako bi se obogatio scFv koji ima aktivnost vezivanja od interesa.

[0307] Posle izolacije cDNA koja kodira V region anti-GPC3 antitela od interesa, cDNA se digestira restrikcionim enzimima koji prepoznaju restrikciona mesta koja su introdukovana na oba kraja cDNA. Poželjni restrikcioni enzimi prepoznaju i isecaju nukleotidnu sekvencu koja se javlja u nukleotidnoj sekvenci gena antitela na niskoj učestalosti. Štaviše, restrikciono mesto za enzim koji proizvodi lepljivi kraj se poželjno introdukuje u vektor kako bi se insertovao jednokopijski digestiran fragment u ispravnoj orijentaciji. cDNA koja kodira V region anti-GPC3 antitela se digestira kao što je prethodno opisano, a zatim se insertuje u odgovarajući ekspresioni vektor kako bi se konstruisao ekspresioni vektor antitela. U ovom slučaju, ukoliko se gen koji kodira konstantni region antitela (C region) i gen koji kodira prethodno navedeni V region fuzionišu uz očuvanje okvira čitanja, dobija se himerno antitelo. Ovde, „himerno antitelo“ znači da je oridžin konstantnog regiona drugačiji od oridžina varijabilnog regiona. Stoga, pored mišjih/humanih heterohimernih antitela, u himerna antitela ovde su uključena i humana/humana alohimerna antitela. Ekspresioni vektor himernog antitela može se konstruisati insertovanjem prethodno navedenog gena V regiona u ekspresioni vektor koji već ima konstantni region. Specifično, na primer, sekvenca prepoznavanja za restrikcioni enzim koji iseca prethodno navedeni gen V regiona može se na odgovarajući način postaviti na 5' stranu ekspresionog vektora koji nosi DNK koja kodira željeni konstantni region antitela (C region). Ekspresioni vektor himernog antitela se konstruiše fuzionisanjem uz očuvanje okvira čitanja dva gena digestirana istom kombinacijom restrikcionih enzima.

[0308] Kako bi se proizvelo anti-GPC3 monoklonsko antitelo, geni antitela se insertuju u ekspresioni vektor tako da se geni eksprimiraju pod kontrolom regulatornog regiona ekspresije. Regulatorni region ekspresije za ekspresiju antitela uključuje, na primer, pojačivače i promotore. Štaviše, odgovarajuća signalna sekvenca može biti prikačena za amino terminus tako da se eksprimirano antitelo sekretuje u spoljašnju sredinu iz ćelija. U

[0311] 2

[0312] Primerima koji su opisani u nastavku, peptid koji ima aminokiselinsku sekvencu MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 72) upotrebljava se kao signalna sekvenca. U međuvremenu, mogu se prikačiti i druge odgovarajuće signalne sekvence. Eksprimirani polipeptid se iseca na karboksilnom terminusu prethodno navedene sekvence, a rezultujući polipeptid se sekretuje u spoljašnju sredinu iz ćelija kao zreli polipeptid. Zatim, odgovarajuće ćelije domaćini se transformišu sa ekspresionim vektorom, i dobijaju se rekombinantne ćelije koje eksprimiraju DNK koja kodira anti-GPC3 antitelo.

[0313] DNK koje kodiraju teški lanac (H lanac) i laki lanac (L lanac) antitela se odvojeno insertuju u različite ekspresione vektore kako bi se eksprimirao gen antitela. Molekul antitela koji ima H i L lance može se eksprimirati kotransfekcijom iste ćelije domaćina sa vektorima u koje su respektivno insertovani geni za H-lanac i L-lanac. Alternativno, ćelije domaćini mogu se transformisati sa jednim ekspresionim vektorom u koji su insertovane DNK koje kodiraju H i L lance (videti WO 94/11523).

[0314] Postoje različite poznate kombinacije ćelija domaćin/ekspresioni vektor za pripremu antitela introdukovanjem izolovanih gena antitela u odgovarajuće domaćine. Svi ovi ekspresioni sistemi su primenljivi za izolaciju antigen-vezujućih domena i CD3-vezujućih domena. Odgovarajuće eukariotske ćelije koje se upotrebljavaju kao ćelije domaćini uključuju životinjske ćelije, biljne ćelije, i ćelije gljivica. Specifično, životinjske ćelije uključuju, na primer, sledeće ćelije.

[0316] (1) ćelije sisara: CHO, COS, mijelom, bubreg mladunca hrčka (BHK), HeLa, Vero, ili slično;

[0317] (2) ćelije vodozemaca: Xenopus oocite, ili slično; i

[0318] (3) ćelije insekata: sf9, sf21, Tn5, ili slično.

[0320] Pored toga, kao biljna ćelija, poznat je ekspresioni sistem gena antitela koji upotrebljava ćelije poreklom iz roda Nicotiana, kao što je Nicotiana tabacum. Ćelije kultivisane u kalusu mogu se na odgovarajući način upotrebljavati za transformaciju biljnih ćelija.

[0321] Štaviše, sledeće ćelije mogu se upotrabljavati kao ćelije gljivica:

[0323] kvasci: rod Saccharomyces kao što je Saccharomyces cerevisiae, i rod Pichia kao što je Pichia pastoris;

[0324] i

[0327] 2

[0328] filamentozne gljivice: rod Aspergillus kao što je Aspergillus niger.

[0330] Štaviše, poznati su i ekspresioni sistemi gena antitela koji koriste prokariotske ćelije. Na primer, kada se upotrabljavaju bakterijske ćelije, ovde se mogu pogodno koristiti E. coli ćelije, Bacillus subtilis ćelije, i slične. Ekspresioni vektori koji nose gene antitela od interesa introdukuju se u ove ćelije transfekcijom. Transfektovane ćelije se kultivišu in vitro, a željeno antitelo se može pripremiti iz kulture transformisanih ćelija.

[0331] Pored prethodno opisanih ćelija domaćina, transgene životinje se takođe mogu upotrebljavati za proizvodnju rekombinantnog antitela. To jest, antitelo se može dobiti od životinje u koju je introdukovan gen koji kodira antitelo od interesa. Na primer, gen antitela može se konstruisati kao fuzioni gen insertovanjem uz očuvanje okvira čitanja u gen koji kodira protein koji se proizvodi specifično u mleku. Kozji β-kazein ili slično može se upotrebljavati, na primer, kao protein koji se sekretuje u mleku. Fragmenti DNK koji sadrže fuzionisani gen insertovan sa genom antitela injektiraju se u kozji embrion, a zatim se ovaj embrion introdukuje u ženku koze. Željena antitela mogu se dobiti kao protein fuzionisan sa proteinom mleka iz mleka koje proizvodi transgena koza koju je rodila koza primalac embriona (ili njeno potomstvo). Pored toga, kako bi se povećala zapremina mleka koje sadrži željeno antitelo koje proizvodi transgena koza, hormoni se mogu primeniti transgenoj kozi po potrebi (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12 (7), 699-702).

[0332] Kada se polipeptidni kompleks koji je ovde opisan primenjuje ljudima, antigenvezujući domen poreklom iz genetički rekombinantnog antitela koje je veštački modifikovano kako bi se redukovala heterologa antigenost prema ljudima i slično, može se na odgovarajući način upotrebljavati kao antigen-vezujući domen kompleksa. Takva genetički rekombinantna antitela uključuju, na primer, humanizovana antitela. Ova modifikovana antitela se na odgovarajući način proizvode pomoću poznatih postupaka.

[0333] Varijabilni region antitela koji se upotrebljava za proizvodnju antigen-vezujućeg domena polipeptidnog kompleksa koji je ovde opisan generalno je formiran od tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) koji su razdvojeni sa četiri regiona okvira (FR). CDR je region koji suštinski određuje specifičnost vezivanja antitela. Aminokiselinske sekvence CDR su veoma raznovrsne. S druge strane, aminokiselinske sekvence koje formiraju FR često imaju visoku identičnost čak i među antitelima sa različitim specifičnostima vezivanja. Prema tome, generalno, specifičnost vezivanja određenog antitela može se introdukovati u drugo antitelo putem CDR graftovanja.

[0336] 2

[0337] Humanizovano antitelo se takođe naziva preoblikovano humano antitelo. Specifično, poznata su humanizovana antitela pripremljena pomoću graftovanja CDR ne-humanog životinjskog antitela, kao što je mišje antitelo, na humano antitelo i slično. Takođe su poznate uobičajene tehnike genetičkog inženjeringa za dobijanje humanizovanih antitela. Specifično, na primer, PCR sa preklapanjem i ekstenzijom (overlap extension PCR) je poznat kao postupak za graftovanje CDR mišjeg antitela na humani FR. U PCR sa preklapanjem i ekstenzijom, nukleotidna sekvenca koja kodira CDR mišjeg antitela koji se graftuje dodaje se prajmerima za sintezu FR humanog antitela. Prajmeri se pripremaju za svaki od četiri FR. Generalno se smatra da je prilikom graftovanja mišjeg CDR na humani FR, odabir humanog FR koji ima visoku identičnost sa mišjim FR povoljan za održavanje funkcije CDR. To jest, generalno je poželjno upotrebljavati humani FR koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima visoku identičnost sa aminokiselinskom sekvencom FR koja je susedna mišjem CDR koji se graftuje.

[0338] Nukleotidne sekvence koje se ligiraju dizajnirane su tako da će biti povezane jedna sa drugom uz očuvanje okvira čitanja. Humani FR se pojedinačno sintetišu upotrebom respektivnih prajmera. Kao rezultat, dobijaju se proizvodi u kojima je DNK koja kodira mišji CDR prikačena za pojedinačne DNK koje kodiraju FR. Nukleotidne sekvence koje kodiraju mišji CDR svakog proizvoda dizajnirane su tako da se međusobno preklapaju. Zatim se sprovodi reakcija sinteze komplementarnih lanaca kako bi se vezali preklapajući CDR regioni proizvoda sintetisanih upotrebom gena humanog antitela kao templata. Humani FR se ligiraju putem mišjih CDR sekvenci pomoću ove reakcije.

[0339] Gen V regiona pune dužine, u kome su ultimativno ligirana tri CDR i četiri FR, amplifikuje se upotrebom prajmera koji se vezuju za njegov 5'- ili 3'-kraj, koji se dodaju sa pogodnim sekvencama za prepoznavanje restrikcionog enzima. Ekspresioni vektor za humanizovano antitelo može se proizvesti insertovanjem DNK koja je dobijena kao što je prethodno opisano i DNK koja kodira C region humanog antitela u ekspresioni vektor tako da će se ligirati uz očuvanje okvira čitanja. Pošto se rekombinantni vektor transfektuje u domaćina kako bi se uspostavile rekombinantne ćelije, rekombinantne ćelije se kultivišu, a DNK koja kodira humanizovano antitelo se eksprimira kako bi se proizvelo humanizovano antitelo u ćelijskoj kulturi (videti, Evropsku patentnu publikaciju br. EP 239400 i Međunarodnu patentnu publikaciju br. WO 1996/002576).

[0340] [0066] Kvalitativnim ili kvantitativnim merenjem i procenom antigen-vezujuće aktivnosti humanizovanog antitela koje je proizvedeno kao što je prethodno opisano, mogu se na pogodan način odabrati FR humanih antitela koji omogućavaju CDR da formiraju povoljno antigen-vezujuće mesto kada se ligiraju preko CDR. Aminokiselinski ostaci u FR mogu se supstituisati po potrebi, tako da CDR preoblikovanog humanog antitela formiraju odgovarajuće antigen-vezujuće mesto. Na primer, mutacije aminokiselinske sekvence mogu se introdukovati u FR primenom PCR postupka koji se upotrebljava za graftovanje mišjeg CDR u humani FR. Specifičnije, delimične mutacije nukleotidne sekvence mogu se introdukovati u prajmere koji se vezuju za FR. Mutacije nukleotidne sekvence introdukuju se u FR sintetisane upotrebom takvih prajmera. Mutantne FR sekvence koje imaju željene karakteristike mogu se odabrati merenjem i procenom aktivnosti mutantnog antitela sa supstituisanom aminokiselinom da se vezuje za antigen prethodno pomenutim postupkom (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53: 851‑856).

[0341] Alternativno, željena humana antitela mogu se dobiti imunizacijom transgenih životinja koje imaju ceo repertoar gena humanih antitela (videti WO 1993/012227; WO 1992/003918; WO 1994/002602; WO 1994/025585; WO 1996/034096; WO 1996/033735) pomoću DNK imunizacije.

[0342] Štaviše, poznate su i tehnike za pripremu humanih antitela pomoću selekcije upotrebom biblioteka humanih antitela. Na primer, V region humanog antitela se eksprimira kao jednolančano antitelo (scFv) na površini faga pomoću postupka prikazivanja faga. Fagi koji eksprimiraju scFv koji se vezuje za antigen mogu se odabrati. DNK sekvenca koja kodira V region humanog antitela koji se vezuje za antigen može se odrediti analizom gena odabranih faga. Određuje se DNK sekvenca scFv koji se vezuje za antigen. Ekspresioni vektor se priprema fuzionisanjem sekvence V regiona uz očuvanje okvira čitanja sa sekvencom C regiona željenog humanog antitela, i insertovanjem ovoga u odgovarajući ekspresioni vektor. Ekspresioni vektor se introdukuje u ćelije pogodne za ekspresiju, kao što su one koje su prethodno opisane. Humano antitelo se može proizvesti ekspresijom gena koji kodira humano antitelo u ćelijama. Ovi postupci su već poznati (videti WO 1992/001047; WO 1992/020791; WO 1993/006213; WO 1993/011236; WO 1993/019172; WO 1995/001438; WO 1995/015388).

[0344] Antigen-vezujući domen

[0346] Ovde, „antigen-vezujući domen“ označava deo antitela koji sadrži region koji se specifično vezuje i komplementaran je celom antigenu ili njegovom delu. Kada je molekulska težina antigena velika, antitelo se može vezati samo za određeni deo antigena. Taj određeni deo se naziva „epitop“. Antigen-vezujući domen može biti obezbeđen od jednog ili više

[0349] 1

[0350] varijabilnih domena antitela. Poželjno, antigen-vezujući domeni sadrže i varijabilni region lakog lanca antitela (VL) i varijabilni region teškog lanca antitela (VH). Takvi poželjni antigen-vezujući domeni uključuju, na primer, „jednolančani Fv (scFv)“, „jednolančano antitelo“, „Fv“, „jednolančani Fv2 (scFv2)“, „Fab“ i „F(ab’)2“.

[0351] Antigen-vezujući domeni polipeptidnih kompleksa mogu se vezati za isti epitop. Epitop može biti prisutan u proteinu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili 4. Alternativno, antigen-vezujući domeni polipeptidnih kompleksa mogu se pojedinačno vezati za različite epitope. Epitop može biti prisutan u proteinu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 2 ili 4.

[0353] Specifičnost

[0355] „Specifično“ znači da molekul koji se specifično vezuje za jednog ili više partnera za vezivanje ne pokazuje nikakvo značajno vezivanje za molekule koji nisu ti partneri. Štaviše, „specifično“ se takođe upotrebljava kada je antigen-vezujući domen specifičan za određeni epitop višestrukih epitopa koji su sadržani u antigenu. Kada je epitop vezan antigenvezujućim domenom sadržan u više različitih antigena, polipeptidni kompleks koji sadrži antigen-vezujući domen može se vezati za različite antigene koji imaju taj epitop.

[0357] Antigen

[0359] Ovde ne postoji posebno ograničenje u pogledu antigena, i moguće je upotrebljavati bilo koji antigen osim CD3. Takvi antigeni uključuju, na primer, receptore, antigene kancera, MHC antigene, i antigene diferencijacije. Receptori uključuju, na primer, one koji pripadaju porodici receptora hematopoetskog faktora rasta, porodici receptora citokina, porodici receptora tirozin kinaze, porodici receptora serin/treonin kinaze, porodici TNF receptora, porodici receptora spregnutih sa G proteinom, porodici GPI-usidrenih receptora, porodici receptora tirozin fosfataze, porodici faktora adhezije, i porodici hormonskih receptora. Receptori koji pripadaju ovim porodicama receptora i njihove karakteristike opisani su u različitim dokumentima, na primer, u preglednim radovima kao što su Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehensive Biochemistry Vol. 18B "Hormones and their Actions Part II" pp. 1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.; i SAIBO KOGAKU (Cell Technology) Supplementary Volume Handbook Series "Secchaku Inshi Handbook (Handbook for Adhesion factors)" M. Miyasaka Ed. (1994) Shujunsha, Tokyo, Japan; i Patthy

[0362] 2

[0363] (Cell(1990) 61(1), 13-14); Ullrich et al., (Cell(1990) 61(2), 203-212); Massagué (Cell (1992) 69(6), 1067-1070); Miyajima et al., (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331); Taga et al., (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396); Fantl et al., (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith et al., (Cell (1994) 76(6) 959-962), Flower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422(3) 207-234.

[0364] Specifično, receptori koji pripadaju prethodno navedenim porodicama receptora poželjno uključuju, na primer, humane i mišje receptore eritropoetina (EPO) (Blood (1990) 76(1), 31‑35; Cell (1989) 57(2), 277‑285), humane i mišje receptore faktora stimulacije kolonija granulocita (G-CSF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87(22), 8702‑8706; mG-CSFR, Cell (1990) 61(2), 341‑350), humane i mišje receptore trombopoetina (TPO) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89(12), 5640‑5644; EMBO J. (1993) 12(7), 2645‑53), humane i mišje receptore insulina (Nature (1985) 313(6005), 756‑761), humane i mišje receptore Flt‑3 liganda (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91(2), 459‑463), humane i mišje receptore faktora rasta poreklom iz krvnih pločica (PDGF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85(10), 3435‑3439), humane i mišje receptore interferona (IFN)-α i -β (Cell (1990) 60(2), 225‑234; i Cell (1994) 77(3), 391‑400), humane i mišje leptinske receptore, humane i mišje receptore hormona rasta (GH), humane i mišje receptore interleukina (IL)‑10, humane i mišje receptore insulinu sličnog faktora rasta (IGF)‑I, humane i mišje receptore inhibitornog faktora leukemije (LIF), i humane i mišje receptore cilijarnog neurotrofičnog faktora (CNTF).

[0365] Antigeni kancera su antigeni koji se eksprimiraju kada ćelije postanu maligne, a nazivaju se i „tumor-specifični antigeni“. Štaviše, abnormalni lanci šećera koji se eksprimiraju na površini ćelije ili proteinski molekuli kada ćelije postanu kancerske su takođe antigeni kancera, i nazivaju se „ugljenohidratni antigen povezan sa kancerom“. Takvi antigeni kancera uključuju, na primer, GPC3 (Int J Cancer. (2003) 103(4), 455‑65), EpCAM (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1989) 86(1), 27‑31), EGFR, CA19‑9, CA15‑3, i sijalil SSEA‑1 (SLX). GPC3 pripada prethodno pomenutoj porodici GPI-usidrenih receptora i eksprimira se u nekoliko vrsta kancera, uključujući kancer jetre. EpCAM se eksprimira u više vrsta kancera, uključujući kancer pluća, a njegove polinukleotidne i polipeptidne sekvence su objavljene u RefSeq pristupnim brojevima NM_002354.2 (SEQ ID NO: 3) i NP_002345.2 (SEQ ID NO: 4), respektivno.

[0366] Generalno, MHC antigeni se kategorišu u MHC antigene klase I i klase II. MHC antigeni klase I uključuju HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, i -H, dok MHC antigeni klase II uključuju HLA-DR, -DQ, i -DP.

[0367] Antigeni diferencijacije uključuju CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, i CDw130.

[0369] Epitop

[0371] „Epitop“ označava antigenu determinantu u antigenu, i označava mesto antigena za koje se vezuje antigen-vezujući domen polipeptidnog kompleksa koji je ovde objavljen. Stoga, na primer, epitop može biti definisan u skladu sa svojom strukturom. Alternativno, epitop može biti definisan u skladu sa antigen-vezujućom aktivnošću polipeptidnog kompleksa koji prepoznaje epitop. Kada je antigen peptid ili polipeptid, epitop može biti specificiran aminokiselinskim ostacima koji formiraju epitop. Alternativno, kada je epitop šećerni lanac, epitop može biti specificiran svojom specifičnom strukturom šećernog lanca.

[0372] Linearni epitop je epitop koji sadrži epitop čija se primarna aminokiselinska sekvenca prepoznaje. Takav linearni epitop tipično sadrži najmanje tri, a najčešće najmanje pet, na primer, oko 8 do 10 ili 6 do 20 aminokiselina u svojoj specifičnoj sekvenci.

[0373] Za razliku od linearnog epitopa, „konformacioni epitop“ je epitop u kome primarna aminokiselinska sekvenca koja sadrži epitop nije jedina determinanta prepoznatog epitopa (na primer, primarna aminokiselinska sekvenca konformacionog epitopa nije nužno prepoznata od strane epitop-definišućeg antitela). Konformacioni epitopi mogu sadržati veći broj aminokiselina u poređenju sa linearnim epitopima. Antitelo koje prepoznaje konformacioni epitop prepoznaje trodimenzionalnu strukturu peptida ili proteina. Na primer, kada se molekul proteina savije i formira trodimenzionalnu strukturu, aminokiseline i/ili glavni lanci polipeptida koji formiraju konformacioni epitop postaju poravnati, i epitop postaje takav da ga antitelo može prepoznati. Postupci za određivanje konformacija epitopa uključuju, na primer, rendgensku kristalografiju, dvodimenzionalnu nuklearnu magnetnu rezonancu, spin obeležavanje specifično za mesto, i elektronsku paramagnetnu rezonancu, ali nisu ograničeni na njih. Videti, na primer, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology (1996), Vol.66, Morris (ed.).

[0374] Primeri postupaka za procenu vezivanja epitopa pomoću test polipeptidnog kompleksa koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen opisani su u nastavku. Prema primerima koji su

[0377] 4

[0378] navedeni u nastavku, postupci za procenu vezivanja epitopa pomoću test polipeptidnog kompleksa koji sadrži antigen-vezujući domen za antigen koji nije GPC3, takođe se mogu odgovarajuće sprovesti.

[0379] Na primer, da li test polipeptidni kompleks koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen prepoznaje linearni epitop u GPC3 molekulu može se potvrditi na primer kao što je pomenuto u nastavku. Linearni peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja formira vanćelijski domen GPC3 sintetiše se u prethodno navedenu svrhu. Peptid se može sintetisati hemijski, ili dobiti tehnikama genetičkog inženjeringa upotrebom regiona koji kodira aminokiselinsku sekvencu koja odgovara vanćelijskom domenu u GPC3 cDNA. Zatim se test polipeptidni kompleks koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen procenjuje na svoju aktivnost vezivanja prema linearnom peptidu koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja formira vanćelijski domen. Na primer, imobilisani linearni peptid može se upotrebljavati kao antigen pomoću ELISA testa za procenu aktivnosti vezivanja polipeptidnog kompleksa prema peptidu. Alternativno, aktivnost vezivanja prema linearnom peptidu može se proceniti na osnovu nivoa na kom linearni peptid inhibira vezivanje polipeptidnog kompleksa za GPC3-eksprimirajuće ćelije. Ovi testovi mogu demonstrirati aktivnost vezivanja polipeptidnog kompleksa prema linearnom peptidu.

[0380] Da li test polipeptidni kompleks koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen prepoznaje konformacioni epitop može se proceniti na sledeći način. GPC3-eksprimirajuće ćelije se pripremaju u prethodno navedenu svrhu. Može se odrediti da test polipeptidni kompleks koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen prepoznaje konformacioni epitop kada se snažno vezuje za GPC3-eksprimirajuće ćelije pri kontaktu, ali se ne vezuje suštinski za imobilisani linearni peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja formira vanćelijski domen GPC3. Ovde, „ne vezuje se suštinski“ znači da je aktivnost vezivanja 80% ili manje, generalno 50% ili manje, poželjno 30% ili manje, a posebno poželjno 15% ili manje u poređenju sa aktivnošću vezivanja prema ćelijama koje eksprimiraju humani GPC3.

[0381] Postupci za testiranje aktivnosti vezivanja test polipeptidnog kompleksa koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen prema GPC3-eksprimirajućim ćelijama uključuju, na primer, postupke koji su opisani u Antibodies: A Laboratory Manual (Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420). Specifično, procena se može izvesti na osnovu principa ELISA ili sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS) upotrebom GPC3-eksprimirajućih ćelija kao antigena.

[0382] [0084] U ELISA formatu, aktivnost vezivanja test polipeptidnog kompleksa koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen prema GPC3-eksprimirajućim ćelijama može se kvantitativno proceniti upoređivanjem nivoa signala koji je generisan enzimskom reakcijom. Specifično, test polipeptidni kompleks se dodaje na ELISA ploču na kojoj su imobilisane GPC3-eksprimirajuće ćelije. Zatim, test polipeptidni kompleks vezan za ćelije detektuje se upotrebom enzimom-obeleženog antitela koje prepoznaje test polipeptidni kompleks. Alternativno, kada se upotrebljava FACS, priprema se serija razblaženja test polipeptidnog kompleksa, a titar vezivanja antitela za GPC3-eksprimirajuće ćelije može se odrediti kako bi se uporedila aktivnost vezivanja test polipeptidnog kompleksa prema GPC3-eksprimirajućim ćelijama.

[0383] Vezivanje test polipeptidnog kompleksa za antigen koji se eksprimira na površini ćelija koje su suspendovane u puferu ili slično može se detektovati upotrebom protočnog citometra. Poznati protočni citometri uključuju, na primer, sledeće uređaje:

[0385] FACSCanto™ II

[0386] FACSAria™

[0387] FACSArray™

[0388] FACSVantage™ SE

[0389] FACSCalibur™ (sva su trgovačka imena kompanije BD Biosciences)

[0390] EPICS ALTRA HyPerSort

[0391] Cytomics FC 500

[0392] EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC

[0393] Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (sva su trgovačka imena kompanije Beckman Coulter)

[0395] [0086] Poželjni postupci za testiranje aktivnosti vezivanja test polipeptidnog kompleksa koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen prema antigenu uključuju, na primer, sledeći postupak. Prvo, GPC3-eksprimirajuće ćelije reaguju sa test polipeptidnim kompleksom, a zatim se ovo oboji sekundarnim FITC-obeleženim antitelom koje prepoznaje polipeptidni kompleks. Test polipeptidni kompleks se odgovarajuće razblaži pogodnim puferom kako bi se pripremio kompleks u željenoj koncentraciji. Na primer, kompleks se može upotrebljavati u koncentraciji unutar opsega od 10 µg/ml do 10 ng/ml. Zatim, intenzitet fluorescencije i broj ćelija određuju se upotrebom FACSCalibur (BD). Intenzitet fluorescencije dobijen analizom upotrebom CELL QUEST softvera (BD), tj. vrednost geometrijske srednje vrednosti, odražava količinu antitela koje je vezano za ćelije. To jest, aktivnost vezivanja test polipeptidnog kompleksa, koja je predstavljena količinom vezanog test polipeptidnog kompleksa, može se odrediti merenjem vrednosti geometrijske srednje vrednosti.

[0396] Da li test polipeptidni kompleks koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen deli zajednički epitop sa drugim polipeptidnim kompleksom može se proceniti na osnovu kompeticije između dva kompleksa za isti epitop. Kompeticija između polipeptidnih kompleksa može se detektovati testom unakrsnog blokiranja ili slično. Na primer, kompetitivni ELISA test je poželjan test unakrsnog blokiranja.

[0397] Specifično, u testu unakrsnog blokiranja, GPC3 protein imobilisan u bunarićima mikrotitarske ploče se prethodno inkubira u prisustvu ili odsustvu kandidat kompetitora polipeptidnog kompleksa, a zatim se u to dodaje test polipeptidni kompleks. Količina test polipeptidnog kompleksa koji je vezan za GPC3 protein u bunarićima je u indirektnoj korelaciji sa sposobnošću vezivanja kandidat kompetitora polipeptidnog kompleksa koji je u kompeticiji za vezivanje za isti epitop. To jest, što je veći afinitet kompetitor polipeptidnog kompleksa za isti epitop, to je niža aktivnost vezivanja test polipeptidnog kompleksa prema GPC3 proteinom-obloženim bunarićima.

[0398] Količina test polipeptidnog kompleksa koji je vezan za bunariće putem GPC3 proteina može se lako odrediti prethodnim obeležavanjem polipeptidnog kompleksa. Na primer, biotinom obeleženi polipeptidni kompleks se meri upotrebom avidin/peroksidaza konjugata i odgovarajućeg supstrata. Konkretno, test unakrsnog blokiranja koji upotrebljava enzimske obeleživače kao što je peroksidaza naziva se „kompetitivni ELISA test“. Polipeptidni kompleks se takođe može obeležiti drugim supstancama za obeležavanje koje omogućavaju detekciju ili merenje. Specifično, poznati su radioobeleživači, fluorescentni obeleživači, i slično.

[0399] Kada kandidat kompetitor polipeptidni kompleks može da blokira vezivanje test polipeptidnog kompleksa koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen za najmanje 20%, poželjno najmanje 20 do 50%, i poželjnije najmanje 50% u poređenju sa aktivnošću vezivanja u kontrolnom eksperimentu koji je sproveden u odsustvu kompetitor polipeptidnog kompleksa, određeno je da se test polipeptidni kompleks suštinski vezuje za isti epitop koji je vezan od strane kompetitor polipeptidnog kompleksa, ili je u kompeticiji za vezivanje za isti epitop.

[0400] [0091] Kada je struktura epitopa koji je vezan za test polipeptidni kompleks koji sadrži GPC3 antigen-vezujući domen već identifikovana, da li test i kontrolni polipeptidni kompleksi dele zajednički epitop može se proceniti upoređivanjem aktivnosti vezivanja dva polipeptidna kompleksa prema peptidu koji je pripremljen introdukovanjem aminokiselinskih mutacija u peptid koji formira epitop.

[0401] Kako bi se izmerile prethodno navedene aktivnosti vezivanja, na primer, aktivnosti vezivanja test i kontrolnih polipeptidnih kompleksa prema linearnom peptidu u koji je introdukovana mutacija upoređuju se u prethodno navedenom ELISA formatu. Pored ELISA postupaka, aktivnost vezivanja prema mutantnom peptidu koji je vezan za kolonu može se odrediti propuštanjem test i kontrolnih polipeptidnih kompleksa u koloni, a zatim kvantifikacijom polipeptidnog kompleksa koji je eluiran u rastvoru za eluiranje. Poznati su postupci za adsorpciju mutantnog peptida na kolonu, na primer, u obliku GST fuzionog peptida.

[0402] Alternativno, kada je identifikovani epitop konformacioni epitop, da li test i kontrolni polipeptidni kompleksi dele zajednički epitop može se proceniti sledećim postupkom. Prvo, pripremaju se GPC3-eksprimirajuće ćelije i ćelije koje eksprimiraju GPC3 sa mutacijom introdukovanom u epitop. Test i kontrolni polipeptidni kompleksi se dodaju u ćelijsku suspenziju pripremljenu suspendovanjem ovih ćelija u odgovarajućem puferu kao što je PBS. Zatim, ćelijske suspenzije se odgovarajuće isperu puferom, a zatim im se dodaje FITC-obeleženo antitelo koje prepoznaje test i kontrolne polipeptidne komplekse. Intenzitet fluorescencije i broj ćelija obojenih obeleženim antitelom određuju se upotrebom FACSCalibur (BD). Test i kontrolni polipeptidni kompleksi se odgovarajuće razblažuju upotrebom pogodnog pufera, i upotrebljavaju u željenim koncentracijama. Na primer, mogu se upotrebljavati u koncentraciji unutar opsega od 10 µg/ml do 10 ng/ml. Intenzitet fluorescencije određen analizom upotrebom CELL QUEST softvera (BD), tj. vrednost geometrijske srednje vrednosti, odražava količinu obeleženog antitela koje je vezano za ćelije. To jest, aktivnosti vezivanja test i kontrolnih polipeptidnih kompleksa, koje su predstavljene količinom vezanih obeleženih antitela, mogu se odrediti merenjem vrednosti geometrijske srednje vrednosti.

[0403] [0094] U prethodno navedenom postupku, da li se polipeptidni kompleks „suštinski ne vezuje za ćelije koje eksprimiraju mutantni GPC3“ može se proceniti, na primer, pomoću sledećeg postupka. Prvo, test i kontrolni polipeptidni kompleksi vezani za ćelije koje eksprimiraju mutantni GPC3 boje se obeleženim antitelom. Zatim, određuje se intenzitet fluorescencije ćelija. Kada se FACSCalibur upotrebljava za detekciju fluorescencije pomoću protočne citometrije, određeni intenzitet fluorescencije može se analizirati upotrebom CELL QUEST softvera. Iz vrednosti geometrijske srednje vrednosti u prisustvu i odsustvu polipeptidnog kompleksa, može se izračunati vrednost poređenja (ΔGeo-srednja vrednost) u skladu sa sledećom formulom kako bi se odredio odnos povećanja intenziteta fluorescencije kao rezultat vezivanja od strane polipeptidnog kompleksa.

[0405] ΔGeo-srednja vrednost = Geo-srednja vrednost (u prisustvu polipeptidnog kompleksa)/Geosrednja vrednost (u odsustvu polipeptidnog kompleksa)

[0407] Vrednost poređenja geometrijske srednje vrednosti (ΔGeo-srednja vrednost za mutantni GPC3 molekul) određena pomoću prethodno navedene analize, koja odražava količinu test polipeptidnog kompleksa koji je vezan za ćelije koje eksprimiraju mutantni GPC3, upoređuje se sa vrednošću poređenja ΔGeo-srednje vrednosti koja odražava količinu test polipeptidnog kompleksa koji je vezan za GPC3-eksprimirajuće ćelije. U ovom slučaju, koncentracije test polipeptidnog kompleksa koje se upotrebljavaju za određivanje vrednosti poređenja ΔGeo-srednje vrednosti za GPC3-eksprimirajuće ćelije i ćelije koje eksprimiraju mutantni GPC3 posebno su poželjno podešene da budu jednake ili suštinski jednake. Polipeptidni kompleks za koji je potvrđeno da prepoznaje epitop u GPC3 upotrebljava se kao kontrolni polipeptidni kompleks.

[0408] Ukoliko je vrednost poređenja ΔGeo-srednja vrednost test polipeptidnog kompleksa za ćelije koje eksprimiraju mutantni GPC3 manja od vrednosti poređenja ΔGeo-srednja vrednost test polipeptidnog kompleksa za GPC3-eksprimirajuće ćelije za najmanje 80%, poželjno 50%, poželjnije 30%, i posebno poželjno 15%, onda se test polipeptidni kompleks „suštinski ne vezuje za ćelije koje eksprimiraju mutantni GPC3“. Formula za određivanje vrednosti Geosrednje vrednosti (geometrijska srednja vrednost) opisana je u korisničkom vodiču CELL QUEST softvera (BD biosciences). Kada poređenje pokaže da su vrednosti poređenja suštinski ekvivalentne, može se odrediti da je epitop za test i kontrolni polipeptidni kompleks isti.

[0410] Varijabilni fragment (Fv)

[0412] [0097] Ovde, termin „varijabilni fragment (Fv)“ označava minimalnu jedinicu antigenvezujućeg domena poreklom iz antitela, koja je sačinjena od para varijabilnog regiona lakog lanca (VL) antitela i varijabilnog regiona teškog lanca (VH) antitela. Godine 1988, Skera (Skerra) i Plaktun (Pluckthun) pronašli su da se homogena i aktivna antitela mogu pripremiti iz periplazmatske frakcije E. coli insertovanjem gena antitela nizvodno od bakterijske signalne sekvence i indukovanjem ekspresije gena u E. coli (Science (1988) 240(4855), 1038‑1041). U Fv koji je pripremljen iz periplazmatske frakcije, VH se povezuje sa VL na način da se vezuje za antigen.

[0413] Ovde, Fv poželjno uključuje, na primer, par Fv koji je polipeptidni kompleks ili slično koji sadrži:

[0415] (1) bivalentni antigen-vezujući domen, koji je bivalentni scFv, pri čemu je jedan monovalentni scFv bivalentnog scFv povezan sa jednim polipeptidom koji formira Fc domen pomoću Fv fragmenta teškog lanca koji formira CD3-vezujući domen, a drugi monovalentni scFv je povezan sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen pomoću Fv fragmenta lakog lanca koji formira CD3-vezujući domen;

[0416] (2) domen koji sadrži Fc domen koji nema aktivnost vezivanja za Fcy receptor, i koji je poreklom iz aminokiselina koje formiraju Fc domen IgG1, IgG2a, IgG3, ili IgG4; i

[0417] (3) barem monovalentni CD3-vezujući domen,

[0419] pri čemu se Fv fragmenti lakog lanca i teškog lanca povezuju kako bi formirali CD3-vezujući domen tako da se može vezati za CD3 antigen.

[0421] scFv, jednolančano antitelo, i sc(Fv)2

[0423] Ovde, termini „scFv“, „jednolančano antitelo“, i „sc(Fv)2“ svi označavaju fragment antitela jednog polipeptidnog lanca koji sadrži varijabilne regione koji su poreklom iz teških i lakih lanaca, ali ne i konstantni region. Generalno, jednolančano antitelo takođe sadrži polipeptidni linker između VH i VL domena, što omogućava formiranje željene strukture za koju se smatra da omogućava vezivanje antigena. Jednolančano antitelo je detaljno razmotreno od strane Plaktuna u „The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, 269-315 (1994)“. Videti takođe Međunarodnu patentnu publikaciju WO 1988/001649; S.A.D. patente br. 4,946,778 i 5,260,203. U posebnom primeru izvođenja, jednolančano antitelo može biti bispecifično i/ili humanizovano.

[0424] scFv je antigen-vezujući domen u kome su VH i VL koji formiraju Fv povezani peptidnim linkerom (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85(16), 5879‑5883). VH i VL mogu se zadržavati u neposrednoj blizini pomoću peptidnog linkera.

[0425] sc(Fv)2 je jednolančano antitelo u kome su četiri varijabilna regiona, dva VL i dva VH, povezana linkerima kao što su peptidni linkeri kako bi se formirao jedan lanac (J

[0428] 4

[0429] Immunol. Methods (1999) 231(1‑2), 177‑189). Dva VH i dva VL mogu biti poreklom iz različitih monoklonskih antitela. Takav sc(Fv)2 poželjno uključuje, na primer, bispecifični sc(Fv)2 koji prepoznaje dva epitopa koji su prisutni u jednom antigenu, kao što je objavljeno u Journal of Immunology (1994) 152(11), 5368‑5374. sc(Fv)2 se može proizvesti pomoću postupaka koji su poznati onima sa iskustvom u struci. Na primer, sc(Fv)2 se može proizvesti povezivanjem scFv pomoću linkera kao što je peptidni linker.

[0430] Ovde, oblik antigen-vezujućeg domena koji formira sc(Fv)2 uključuje antitelo u kome su dve VH jedinice i dve VL jedinice raspoređene redosledom VH, VL, VH, i VL ([VH]‑linker‑[VL]‑linker‑[VH]‑linker‑[VL]) počevši od N-terminusa jednolančanog polipeptida. Redosled dve VH jedinice i dve VL jedinice nije ograničen na prethodno navedeni oblik, i mogu biti raspoređene bilo kojim redosledom. Primer redosleda oblika je nabrojan u nastavku.

[0432] [VL]-linker-[VH]-linker-[VH]-linker-[VL]

[0433] [VH]-linker-[VL]-linker-[VL]-linker-[VH]

[0434] [VH]-linker-[VH]-linker-[VL]-linker-[VL]

[0435] [VL]-linker-[VL]-linker-[VH]-linker-[VH]

[0436] [VL]-linker-[VH]-linker-[VL]-linker-[VH]

[0438] Molekulski oblik sc(Fv)2 je takođe detaljno opisan u WO 2006/132352. U skladu sa ovim opisima, oni sa iskustvom u struci mogu na odgovarajući način pripremiti željeni sc(Fv)2 kako bi proizveli polipeptidne komplekse koji su ovde objavljeni.

[0439] Štaviše, polipeptidni kompleksi mogu biti konjugovani sa polimernim nosačem kao što je PEG ili organskim jedinjenjem kao što je antikancerski agens. Alternativno, sekvenca za dodavanje šećernog lanca poželjno se insertuje u polipeptidne komplekse tako da šećerni lanac proizvodi željeni efekat.

[0440] [0105] Linkeri koji se upotrebljavaju za povezivanje varijabilnih regiona antitela sadrže proizvoljne peptidne linkere koji se mogu introdukovati pomoću genetičkog inženjeringa, sintetičke linkere, i linkere koji su objavljeni, na primer, u Protein Engineering, 9(3), 299‑305, 1996. Međutim, ovde su poželjni peptidni linkeri. Dužina peptidnih linkera nije posebno ograničena, i mogu je pogodno odabrati oni sa iskustvom u struci u skladu sa svrhom. Dužina je poželjno pet aminokiselina ili više (bez posebnog ograničenja, gornja granica je generalno 30 aminokiselina ili manje, poželjno 20 aminokiselina ili manje), i posebno poželjno 15 aminokiselina. Kada sc(Fv)2 sadrži tri peptidna linkera, njihova dužina može biti ista ili različita.

[0441] Na primer, takvi peptidni linkeri uključuju:

[0443] Ser

[0444] Gly·Ser

[0445] Gly·Gly·Ser

[0446] Ser·Gly·Gly

[0447] Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 5)

[0448] Ser·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 6)

[0449] Gly·Gly·Gly·Gly· Ser (SEQ ID NO: 7)

[0450] Ser·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 8)

[0451] Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 9)

[0452] Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 10)

[0453] Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 11)

[0454] Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 12)

[0455] (Gly·Gly·Gly·Gly·Ser (SEQ ID NO: 7))n

[0456] (Ser·Gly·Gly·Gly·Gly (SEQ ID NO: 8))n

[0457] gde je n ceo broj od 1 ili veći. Dužinu ili sekvence peptidnih linkera mogu u skladu sa time odabrati oni sa iskustvom u struci, u zavisnosti od svrhe.

[0459] Sintetički linkeri (hemijski agensi za umrežavanje) rutinski se upotrebljavaju za umrežavanje peptida, i na primer:

[0461] N-hidroksi sukcinimid (NHS),

[0462] disukcinimidil suberat (DSS),

[0463] bis(sulfosukcinimidil) suberat (BS<3>),

[0464] ditiobis(sukcinimidil propionat) (DSP),

[0465] ditiobis(sulfosukcinimidil propionat) (DTSSP),

[0466] etilen glikol bis(sukcinimidil sukcinat) (EGS),

[0467] etilen glikol bis(sulfosukcinimidil sukcinat) (sulfo-EGS),

[0468] disukcinimidil tartarat (DST), disulfosukcinimidil tartarat (sulfo-DST), bis[2-(sukcinimidoksikarboniloksi)etil] sulfon (BSOCOES),

[0469] i bis[2-(sulfosukcinimidoksikarboniloksi)etil] sulfon (sulfo-BSOCOES). Ovi agensi za umrežavanje su komercijalno dostupni.

[0471] Generalno, potrebna su tri linkera kako bi se povezala četiri varijabilna regiona antitela. Linkeri koji se upotrebljavaju mogu biti istog ili različitog tipa.

[0473] Fab, F(ab’)2, i Fab’

[0475] „Fab“ se sastoji od jednog lakog lanca, i CH1 domena i varijabilnog regiona iz jednog teškog lanca. Teški lanac Fab molekula ne može da formira disulfidne veze sa drugim molekulom teškog lanca.

[0476] „F(ab’)2“ ili „Fab“ se proizvodi tretiranjem imunoglobulina (monoklonskog antitela) proteazom kao što su pepsin i papain, i označava fragment antitela koji je generisan digestijom imunoglobulina (monoklonskog antitela) u blizini disulfidnih veza koje su prisutne između regiona zgloba u svakom od dva H lanca. Na primer, papain iseca IgG uzvodno od disulfidnih veza koje su prisutne između regiona zgloba u svakom od dva H lanca kako bi se generisala dva homologa fragmenta antitela, u kojima je L lanac koji sadrži VL (varijabilni region L-lanca) i CL (konstantni region L-lanca) povezan sa fragmentom H-lanca koji sadrži VH (varijabilni region H-lanca) i CHγ1 (γ1 region u konstantnom regionu H-lanca) putem disulfidne veze u njihovim C-terminusnim regionima. Svaki od ova dva homologa fragmenta antitela naziva se Fab’.

[0477] „F(ab’)2“ se sastoji od dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže konstantni region CH1 domena i deo CH2 domena tako da se disulfidne veze formiraju između dva teška lanca. F(ab’)2 koji formira polipeptidni kompleks koji je ovde objavljen može se poželjno proizvesti kao što sledi. Celo monoklonsko antitelo ili takvo koje sadrži željeni antigen-vezujući domen delimično se digestira proteazom kao što je pepsin; a Fc fragmenti se uklanjaju adsorpcijom na protein A koloni. Proteaza nije posebno ograničena, sve dok može da iseca celo antitelo na selektivan način kako bi proizvela F(ab’)2 pod odgovarajućim postavkama uslova enzimske reakcije kao što je pH. Takve proteaze uključuju, na primer, pepsin i ficin.

[0479] Fc domen

[0481] Fc domen koji formira polipeptidni kompleks koji je ovde objavljen može se poželjno proizvesti na sledeći način. Antitelo, kao što je monoklonsko antitelo, delimično se digestira

[0484] 4

[0485] proteazom kao što je pepsin. Zatim, rezultujući fragment se adsorbuje na protein A ili protein G koloni, i eluira sa odgovarajućim puferom za eluiranje. Proteaza nije posebno ograničena, sve dok može da iseca antitela kao što su monoklonska antitela pod odgovarajućim postavkama uslova enzimske reakcije kao što je pH. Takve proteaze uključuju, na primer, pepsin i ficin.

[0486] Polipeptidni kompleksi koji su ovde opisani sadrže Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor, koji uključuje aminokiseline koje formiraju Fc domen IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4.

[0487] Izotip antitela se određuje u skladu sa strukturom konstantnog regiona. Konstantni regioni izotipova IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 nazivaju se Cγ1, Cy2, Cy3, i Cy4, respektivno. Aminokiselinske sekvence polipeptida Fc domena koje formiraju humane Cγ1, Cγ2, Cy3, i Cy4 pokazane su putem primera u SEQ ID NO: 23, 24, 25, i 26, respektivno. Odnos između aminokiselinskih ostataka koji formiraju svaku aminokiselinsku sekvencu i Kabatovog EU numerisanja (ovde se takođe označava kao EU INDEX) pokazan je na Sl.18.

[0488] Fc domen označava region pored F(ab’)2 koji sadrži dva laka lanca i dva teška lanca koji sadrže deo konstantnog regiona koji sadrži CH1 domen i region između CH1 i CH2 domena, tako da se disulfidne veze formiraju između dva teška lanca. Fc domen koji formira polipeptidni kompleks koji je ovde objavljen može se poželjno proizvesti kao što sledi. Monoklonsko IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitelo ili slično se delimično digestira proteazom kao što je pepsin, nakon čega sledi elucija frakcije adsorbovane na protein A koloni. Proteaza nije posebno ograničena, sve dok može da iseca celo antitelo na selektivan način kako bi proizvela F(ab’)2 u odgovarajućim postavkama uslova enzimske reakcije kao što je pH. Takve proteaze uključuju, na primer, pepsin i ficin.

[0490] Fcy receptor

[0492] [0116] Fcy receptor označava receptor koji je sposoban da se vezuje za Fc domen monoklonskih IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela, i uključuje sve članove koji pripadaju porodici proteina koje suštinski kodira gen Fcy receptora. Kod ljudi, porodica uključuje FcyRI (CD64), uključujući izoforme FcyRIa, FcyRIb i FcyRIc; FcyRII (CD32), uključujući izoforme FcyRIIa (uključujući alotip H131 i R131), FcyRIIb (uključujući FcyRIIb‑1 i FcyRIIb‑2), i FcyRIIc; i FcγRIII (CD16), uključujući izoformu FcγRIIIa (uključujući alotip V158 i F158) i FcyRIIIb (uključujući alotip FcγRIIIb-NA1 i FcyRIIIb-NA2); kao i sve neidentifikovane humane FcyR, FcyR izoforme, i njihove alotipove. Međutim, Fcy receptor nije ograničen na ove primere. Bez da bude ograničen na njih, FcyR uključuje one poreklom od ljudi, miševa, pacova, zečeva, i majmuna. FcyR može biti poreklom iz bilo kog organizma. Mišji FcyR uključuje, bez da bude ograničen na, FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), i FcyRIII‑2 (CD16‑2), kao i sve neidentifikovane mišje FcyR, FcγR izoforme, i njihove alotipove. Takvi poželjni Fcy receptori uključuju, na primer, humani FcyI (CD64), FcyIIA (CD32), FcyIIB (CD32), FcγIIIA (CD16), i/ili FcγIIIB (CD16). Polinukleotidna sekvenca i aminokiselinska sekvenca FcyI pokazane su u SEQ ID NO: 13 (NM_000566.3) i 14 (NP_000557.1), respektivno; polinukleotidna sekvenca i aminokiselinska sekvenca FcyIIA pokazane su u SEQ ID NO: 15 (BC020823.1) i 16 (AAH20823.1), respektivno; polinukleotidna sekvenca i aminokiselinska sekvenca FcyIIB pokazane su u SEQ ID NO: 17 (BC146678.1) i 18 (AAI46679.1), respektivno; polinukleotidna sekvenca i aminokiselinska sekvenca FcyIIIA pokazane su u SEQ ID NO: 19 (BC033678.1) i 20 (AAH33678.1), respektivno; i polinukleotidna sekvenca i aminokiselinska sekvenca FcγIIIB pokazane su u SEQ ID NO: 21 (BC128562.1) i 22 (AAI28563.1), respektivno (RefSeq pristupni broj je pokazan u svakoj zagradi). Da li Fcy receptor ima aktivnost vezivanja za Fc domen monoklonskog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela može se proceniti pomoću ALPHA pregleda (Amplifikovani luminescentni homogeni test blizine), BIACORE postupkom koji je zasnovan na površinskoj rezonanci plazmona (SPR), i drugima (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005‑4010), pored prethodno opisanih FACS i ELISA formata.

[0493] U međuvremenu, „Fc ligand“ ili „efektorski ligand“ označava molekul i poželjno polipeptid koji se vezuje za Fc domen antitela, formirajući Fc/Fc ligand kompleks. Molekul može biti poreklom iz bilo kog organizma. Vezivanje Fc liganda za Fc poželjno indukuje jednu ili više efektorskih funkcija. Takvi Fc ligandi uključuju, ali nisu ograničeni na, Fc receptore, FcγR, FcαR, FcεR, FcRn, C1q, i C3, manan-vezujući lektin, receptor za manozu, Staphylococcus protein A, Staphylococcus protein G, i virusne FcγR. Fc ligandi takođe uključuju homologe Fc receptora (FcRH) (Davis et al., (2002) Immunological Reviews 190, 123‑136), koji su porodica Fc receptora homologih sa FcyR. Fc ligandi takođe uključuju neidentifikovane molekule koji se vezuju za Fc.

[0495] Aktivnost vezivanja za Fcy receptor

[0497] Oslabljena aktivnost vezivanja Fc domena za bilo koji od Fcy receptora FcyI, FcyIIA, FcyIIB, FcyIIIA, i/ili FcγIIIB može se proceniti upotrebom prethodno opisanih FACS i ELISA formata, kao i ALPHA pregleda (Amplifikovani luminescentni homogeni test blizine)

[0500] 4

[0501] i BIACORE postupkom koji je zasnovan na površinskoj rezonanci plazmona (SPR) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005‑4010).

[0502] ALPHA pregled se izvodi pomoću ALPHA tehnologije koja je zasnovana na principu koji je opisan u nastavku, upotrebom dve vrste perli: donorskih i akceptorskih perli. Luminescentni signal se detektuje samo kada molekuli koji su povezani sa donorskim perlama biološki interaguju sa molekulima koji su povezani sa akceptorskim perlama i kada se dve perle nalaze u neposrednoj blizini. Pobuđen laserskim snopom, fotosenzibilizator u donorskoj perli konvertuje kiseonik oko perle u pobuđeni singletni kiseonik. Kada singletni kiseonik difunduje oko donorskih perli i dospe do akceptorskih perli koje se nalaze u neposrednoj blizini, indukuje se hemiluminescentna reakcija unutar akceptorskih perli. Ova reakcija na kraju rezultuje emisijom svetlosti. Ukoliko molekuli koji su povezani sa donorskim perlama ne interaguju sa molekulima koji su povezani sa akceptorskim perlama, singletni kiseonik koji proizvode donorske perle ne dospeva do akceptorskih perli i hemiluminescentna reakcija se ne dešava.

[0503] Na primer, biotinom obeležen polipeptidni kompleks je imobilisan na donorske perle, a glutation S-transferazom (GST) označen Fcy receptor je imobilisan na akceptorske perle. U odsustvu polipeptidnog kompleksa koji sadrži kompetitorski mutantni Fc domen, Fcy receptor interaguje sa polipeptidnim kompleksom koji sadrži Fc domen divljeg tipa, indukujući signal od 520 do 620 nm kao rezultat. Polipeptidni kompleks koji ima neoznačeni mutantni Fc domen u kompeticiji je sa polipeptidnim kompleksom koji sadrži Fc domen divljeg tipa za interakciju sa Fcy receptorom. Relativni afinitet vezivanja može se odrediti pomoću kvantifikacije redukcije fluorescencije kao rezultat kompeticije. Poznati su postupci za biotinilaciju polipeptidnih kompleksa, kao što su antitela koja upotrebljavaju Sulfo-NHS-biotin ili slično. Odgovarajući postupci za dodavanje GST oznake Fcy receptoru uključuju postupke koji uključuju fuziju polipeptida koji kodiraju Fcy i GST uz očuvanje okvira čitanja, ekspresiju fuzionog gena upotrebom ćelija koje su introdukovane sa vektorom koji nosi gen, a zatim prečišćavanje upotrebom glutationske kolone. Indukovani signal se poželjno može analizirati, na primer, fitovanjem na model kompeticije na jednom mestu koje je zasnovano na nelinearnoj regresionoj analizi upotrebom softvera kao što je GRAPHPAD PRISM (GraphPad; San Diego).

[0504] Jedna od supstanci za posmatranje njihove interakcije je imobilisana kao ligand na tankom sloju zlata senzorskog čipa. Kada se svetlost baci na zadnju površinu senzorskog čipa tako da dođe do potpune refleksije na granici između tankog sloja zlata i stakla, intenzitet reflektovane svetlosti se delimično redukuje na određenom mestu (SPR signal). Druga

[0507] 4

[0508] supstanca za posmatranje njihove interakcije se injektira kao analit na površinu senzorskog čipa. Masa imobilisanog molekula liganda se povećava kada se analit vezuje za ligand. Ovo menja indeks prelamanja rastvarača na površini senzorskog čipa. Promena indeksa prelamanja uzrokuje pozicioni pomak SPR signala (obrnuto, disocijacija pomiče signal nazad na originalnu poziciju). U Biacore sistemu, količina pomaka koja je prethodno opisana (tj. promena mase na površini senzorskog čipa) prikazana je u grafičkom formatu na vertikalnoj osi, i stoga je promena mase tokom vremena pokazana kao izmereni podatak (senzorogram). Kinetički parametri (konstanta stope asocijacije (ka) i konstanta stope disocijacije (kd)) se određuju iz krive senzograma, a afinitet (KD) se određuje iz odnosa između ove dve konstante. Test inhibicije se poželjno upotrebljava u BIACORE postupcima. Primeri takvog testa inhibicije opisani su u Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11), 4005‑4010.

[0509] Ovde, „aktivnost vezivanja za Fcy receptor je redukovana“ znači, na primer, da je na osnovu prethodno opisanog postupka analize kompetitivna aktivnost test polipeptidnog kompleksa 50% ili manje, poželjno 45% ili manje, 40% ili manje, 35% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, ili 15% ili manje, i posebno poželjno 10% ili manje, 9% ili manje, 8% ili manje, 7% ili manje, 6% ili manje, 5% ili manje, 4% ili manje, 3% ili manje, 2% ili manje, ili 1% ili manje od kompetitivne aktivnosti kontrolnog polipeptidnog kompleksa.

[0510] Polipeptidni kompleksi koji sadrže Fc domen monoklonskog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela mogu se na odgovarajući način upotrebljavati kao kontrolni polipeptidni kompleksi. Strukture Fc domena su pokazane u SEQ ID NO: 23 (A je dodato na N-terminus RefSeq pristupnog broja AAC82527.1), 24 (A je dodato na N-terminus RefSeq pristupnog broja AAB59393.1), 25 (A je dodato na N-terminus RefSeq pristupnog broja CAA27268.1), i 26 (A je dodato na N-terminus RefSeq pristupnog broja AAB59394.1). Štaviše, kada se polipeptidni kompleks koji sadrži mutantni Fc domen antitela određenog izotipa upotrebljava kao test supstanca, efekat mutacije mutanta na aktivnost vezivanja za Fc receptor procenjuje se upotrebom polipeptidnog kompleksa koji sadrži Fc domen istog izotipa kao kontrole. Kao što je prethodno opisano, polipeptidni kompleksi koji sadrže mutantni Fc domen čija je aktivnost vezivanja za Fcy receptor procenjena kao redukovana pripremljeni su na odgovarajući način.

[0511] Takvi poznati mutanti uključuju, na primer, mutante koji imaju deleciju aminokiselina 231A‑238S (EU numerisanje) (WO 2009/011941), kao i mutante C226S, C229S, P238S, (C220S) (J. Rheumatol (2007) 34, 11); C226S i C229S (Hum. Antibod. Hybridomas (1990) 1(1), 47‑54); C226S, C229S, E233P, L234V, i L235A (Blood (2007) 109, 1185‑1192).

[0514] 4

[0515] Specifično, poželjni polipeptidni kompleksi uključuju one koji sadrže Fc domen sa supstitucijom aminokiseline na poziciji 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 325, 327, 328, 329, 330, 331, ili 332 (EU numerisanje) u aminokiselinama koje formiraju Fc domen antitela određenog izotipa. Izotip antitela od kog potiče Fc domen nije posebno ograničen, i moguće je upotrebljavati odgovarajući Fc domen poreklom iz monoklonskog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 antitela. Poželjno je upotrebljavati Fc domene poreklom iz IgG1 antitela.

[0516] Poželjni polipeptidni kompleksi uključuju, na primer, one koji sadrže Fc domen koji ima bilo koju od supstitucija koje su pokazane u nastavku, čije su pozicije specificirane u skladu sa EU numerisanjem (svaki broj predstavlja poziciju aminokiselinskog ostatka u EU numerisanju; a jednoslovni simbol aminokiseline ispred broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije, dok jednoslovni simbol aminokiseline posle broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije) u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG1 antitela:

[0518] (a) L234F, L235E, P331S;

[0519] (b) C226S, C229S, P238S;

[0520] (c) C226S, C229S; ili

[0521] (d) C226S, C229S, E233P, L234V, L235A;

[0523] kao i one koje imaju Fc domen koji ima deleciju aminokiselinske sekvence na pozicijama 231 do 238.

[0524] Štaviše, poželjni polipeptidni kompleksi takođe uključuju one koji sadrže Fc domen koji ima bilo koju od supstitucija koje su pokazane u nastavku, čije su pozicije specificirane u skladu sa EU numerisanjem u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG2 antitela:

[0526] (e) H268Q, V309L, A330S, i P331S;

[0527] (f) V234A;

[0528] (g) G237A;

[0529] (h) V234A i G237A;

[0530] (i) A235E i G237A; ili

[0531] (j) V234A, A235E, i G237A. Svaki broj predstavlja poziciju aminokiselinskog ostatka u EU numerisanju; a jednoslovni simbol aminokiseline ispred broja predstavlja

[0534] 4

[0535] aminokiselinski ostatak pre supstitucije, dok jednoslovni simbol aminokiseline posle broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije.

[0537] Štaviše, poželjni polipeptidni kompleksi takođe uključuju one koji sadrže Fc domen koji ima bilo koju od supstitucija koje su pokazane u nastavku, čije su pozicije specificirane u skladu sa EU numerisanjem u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG3 antitela:

[0539] (k) F241A;

[0540] (l) D265A; ili

[0541] (m) V264A. Svaki broj predstavlja poziciju aminokiselinskog ostatka u EU numerisanju; a jednoslovni simbol aminokiseline ispred broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije, dok jednoslovni simbol aminokiseline posle broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije.

[0543] Štaviše, poželjni polipeptidni kompleksi takođe uključuju one koji sadrže Fc domen koji ima bilo koju od supstitucija koje su pokazane u nastavku, čije su pozicije specificirane u skladu sa EU numerisanjem u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG4 antitela:

[0545] (n) L235A, G237A, i E318A;

[0546] (o) L235E; ili

[0547] (p) F234A i L235A. Svaki broj predstavlja poziciju aminokiselinskog ostatka u EU numerisanju; a jednoslovni simbol aminokiseline ispred broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije, dok jednoslovni simbol aminokiseline posle broja predstavlja aminokiselinski ostatak pre supstitucije.

[0549] Drugi poželjni polipeptidni kompleksi uključuju, na primer, one koji sadrže Fc domen u kome je bilo koja aminokiselina na poziciji 233, 234, 235, 236, 237, 327, 330, ili 331 (EU numerisanje) u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG1 antitela supstituisana aminokiselinom odgovarajuće pozicije u EU numerisanju u odgovarajućem IgG2 ili IgG4.

[0550] Poželjni polipeptidni kompleksi takođe uključuju, na primer, one koji sadrže Fc domen u kome je bilo koja jedna ili više aminokiselina na pozicijama 234, 235, i 297 (EU numerisanje) u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG1 antitela supstituisana drugim aminokiselinama. Tip aminokiseline posle supstitucije nije posebno ograničen; međutim,

[0553] 4

[0554] posebno su poželjni polipeptidni kompleksi koji sadrže Fc domen u kome je bilo koja jedna ili više aminokiselina na pozicijama 234, 235, i 297 supstituisana alaninom.

[0555] Poželjni polipeptidni kompleksi takođe uključuju, na primer, one koji sadrže Fc domen u kome je aminokiselina na poziciji 265 (EU numerisanje) u aminokiselinama koje formiraju Fc domen IgG1 antitela supstituisana drugom aminokiselinom. Tip aminokiseline posle supstitucije nije posebno ograničen; međutim, posebno su poželjni polipeptidni kompleksi koji sadrže Fc domen u kome je aminokiselina na poziciji 265 supstituisana alaninom.

[0557] Fc domen poreklom iz bispecifičnog antitela

[0559] Ovde, odgovarajući Fc domeni poreklom iz bispecifičnog antitela takođe se upotrebljavaju kao Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor. Bispecifično antitelo je antitelo koje ima dve različite specifičnosti. Bispecifično antitelo IgG-tipa može se sekretovati iz hibridnog hibridoma (kvadroma) koji je proizveden fuzionisanjem dva tipa hibridoma koji proizvode IgG antitela (Milstein C et al., Nature (1983) 305, 537‑540).

[0560] Alternativno, bispecifično antitelo IgG-tipa može se takođe sekretovati introdukovanjem ukupno četiri gena, gena L lanaca i H lanaca koji formiraju dva tipa IgG od interesa, u ćelije i njihovom koekspresijom. Međutim, u teoriji, postoji deset kombinacija IgG H lanaca i L lanaca koji se proizvode takvim postupcima. Teško je prečistiti IgG koji se sastoji od željene kombinacije H lanca i L lanca iz deset tipova IgG. Pored toga, u teoriji, količina sekretovanog IgG sa željenom kombinacijom je takođe značajno redukovana, što zahteva kulturu u velikim razmerama. Ovo dodatno povećava troškove proizvodnje.

[0561] U ovom slučaju, odgovarajuća aminokiselinska supstitucija može se introdukovati u CH3 domen koji formira Fc domen H-lanca, kako bi se preferencijalno sekretovao IgG sa heterologom kombinacijom H lanaca. Specifično, ovaj postupak se sprovodi supstitucijom aminokiseline koja ima veći bočni lanac (izbočina (što znači „kvrga“)) za aminokiselinu u CH3 domenu jednog od H lanaca, i supstitucijom aminokiseline koja ima manji bočni lanac (udubljenje (što znači „praznina“)) za aminokiselinu u CH3 domenu drugog H lanca tako da se izbočina postavlja u udubljenje. Ovo promoviše formiranje heteromernog H lanca i istovremeno inhibira formiranje homomernog H lanca (WO 1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617‑621; Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677‑681).

[0562] S druge strane, u odnosu na L lanac, varijabilni region L-lanca je manje polimorfan od varijabilnog regiona H-lanca, i stoga se očekuje dobijanje zajedničkog L lanca koji može dati sposobnost vezivanja oboma H lancima. Efikasna ekspresija bispecifičnog IgG može se postići introdukovanjem gena takvog zajedničkog L lanca i dva H lanca u ćelije kako bi se eksprimirao IgG (Nature Biotechnology (1998) 16, 677‑681). Međutim, teško je realizovati ovu ideju pošto je mala verovatnoća da su dva tipa antitela koja sadrže isti L lanac nasumično odabrana. Stoga, predložen je postupak za odabir zajedničkog L lanca koji pokazuje jaku sposobnost vezivanja za bilo koje različite H lance (WO 2004/065611).

[0563] Štaviše, takođe su poznate tehnike za proizvodnju bispecifičnog antitela primenom postupaka za kontrolu asocijacije polipeptida, ili asocijacije heteromernih multimera koji su formirani od polipeptida na asocijaciju između dva polipeptida koji formiraju Fc domen. Specifično, postupci za kontrolu asocijacije polipeptida mogu se koristiti za proizvodnju bispecifičnog antitela (WO 2006/106905), u kome su aminokiselinski ostaci koji formiraju interfejs između dva polipeptida koji formiraju Fc domen izmenjeni kako bi se inhibirala asocijacija između Fc domena koji imaju istu sekvencu i kako bi se omogućilo formiranje polipeptidnih kompleksa koji su formirani od strane dva Fc domena različitih sekvenci.

[0564] Prethodno opisana dva polipeptida koji formiraju Fc domen poreklom iz bispecifičnog antitela mogu se ovde na odgovarajući način upotrebljavati kao domen koji obuhvata Fc domen. Specifičnije, takva poželjna dva polipeptida koji formiraju Fc domen uključuju one u kojima su aminokiseline na pozicijama 349 i 366 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida cistein i triptofan, respektivno, a aminokiseline na pozicijama 356, 366, 368, i 407 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida su cistein, serin, alanin, i valin, respektivno.

[0565] U sledećem primeru izvođenja, poželjni domeni koji obuhvataju Fc domen ovde uključuju dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome je aminokiselina na poziciji 409 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida asparaginska kiselina, a aminokiselina na poziciji 399 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida je lizin. U prethodno navedenom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji 409 može biti glutaminska kiselina umesto asparaginske kiseline, dok aminokiselina na poziciji 399 može biti arginin umesto lizina. Štaviše, asparaginska kiselina na poziciji 360 ili 392 takođe može biti poželjno kombinovana sa lizinom na poziciji 399.

[0566] U sledećem primeru izvođenja, poželjni domeni koji obuhvataju Fc domen ovde uključuju dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome je aminokiselina na poziciji 370 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida glutaminska kiselina, a

[0569] 1

[0570] aminokiselina na poziciji 357 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida je lizin.

[0571] U još jednom primeru izvođenja, poželjni domeni koji obuhvataju Fc domen ovde uključuju dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome je aminokiselina na poziciji 439 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida glutaminska kiselina, a aminokiselina na poziciji 356 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida je lizin.

[0572] Pored toga, poželjni domeni koji obuhvataju Fc domen ovde uključuju primere izvođenja sa njihovom kombinacijom:

[0574] dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome su aminokiseline na pozicijama 409 i 370 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida asparaginska kiselina i glutaminska kiselina, respektivno, a aminokiseline na pozicijama 399 i 357 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida su obe lizin (u ovom primeru izvođenja, glutaminska kiselina na poziciji 370 može biti zamenjena sa asparaginskom kiselinom, a glutaminska kiselina na poziciji 370 može biti zamenjena sa asparaginskom kiselinom na poziciji 392);

[0575] dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome su aminokiseline na pozicijama 409 i 439 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida asparaginska kiselina i glutaminska kiselina, respektivno, a aminokiseline na pozicijama 399 i 356 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida su obe lizin (u ovom primeru izvođenja, glutaminska kiselina na poziciji 439 može biti zamenjena sa asparaginskom kiselinom na poziciji 360, 392, ili 439);

[0576] dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome su aminokiseline na pozicijama 370 i 439 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida obe glutaminska kiselina, a aminokiseline na pozicijama 357 i 356 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida su obe lizin; i

[0577] dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome su aminokiseline na pozicijama 409, 370, i 439 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida asparaginska kiselina, glutaminska kiselina, i glutaminska kiselina, respektivno, a aminokiseline na pozicijama 399, 357, i 356 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida su sve lizin (u ovom primeru izvođenja, aminokiselina na poziciji 370 možda neće biti supstituisana glutaminskom kiselinom; alternativno, umesto supstituisanja aminokiseline na poziciji 370 sa glutaminskom kiselinom,

[0580] 2

[0581] glutaminska kiselina na poziciji 439 može biti zamenjena sa asparaginskom kiselinom, ili glutaminska kiselina na poziciji 439 može biti zamenjena sa asparaginskom kiselinom na poziciji 392).

[0583] U još jednom primeru izvođenja, poželjni domeni koji obuhvataju Fc domen ovde uključuju dva polipeptida koji formiraju Fc domen, u kome je aminokiselina na poziciji 356 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci jednog polipeptida lizin, a aminokiseline na pozicijama 435 i 439 (EU numerisanje) u aminokiselinskoj sekvenci drugog polipeptida su arginin i glutaminska kiselina, respektivno.

[0584] Kada se prethodno opisana dva polipeptida koji formiraju Fc domen poreklom iz bispecifičnog antitela upotrebljavaju kao domen koji obuhvata Fc domen ovde, antigenvezujući domeni i/ili CD3-vezujući domeni ovde mogu biti aranžirani u željenoj kombinaciji.

[0586] Fc domen sa redukovanom C-terminusnom heterogenošću

[0588] Ovde se Fc domeni sa poboljšanom C-terminusnom heterogenošću Fc domena, pored prethodno opisane karakteristike na odgovarajući način upotrebljavaju kao Fc domeni sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor. Specifičnije, obezbeđeni su Fc domeni u kojima je izvršena delecija glicina i lizina na pozicijama 446 i 447 (EU numerisanje), respektivno, u aminokiselinskim sekvencama dva polipeptida koji formiraju Fc domen poreklom iz IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4.

[0590] Domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora

[0592] Ovde, „domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora“ označava deo antitela kompleksa T-ćelijskog receptora, koji sadrži region koji se specifično vezuje i komplementaran je celom ili delu kompleksa T-ćelijskog receptora. Takav kompleks T-ćelijskog receptora može biti T-ćelijski receptor sâm, ili adapterski molekul koji zajedno sa T-ćelijskim receptorom formira kompleks T-ćelijskog receptora. Poželjni adapter je CD3.

[0594] Domen za vezivanje za T-ćelijski receptor

[0595] Ovde, „domen za vezivanje za T-ćelijski receptor“ označava deo antitela T-ćelijskog receptora, koji sadrži region koji se specifično vezuje i komplementaran je celom ili delu T-ćelijskog receptora.

[0596] Moguće je upotrebljavati varijabilni region ili konstantni region T-ćelijskog receptora. Međutim, poželjni epitopi za koje se vezuje CD3-vezujući domen su oni koji su locirani u konstantnom regionu. Sekvence konstantnog regiona uključuju, na primer, one iz α lanca T-ćelijskog receptora (RefSeq pristupni broj CAA26636.1; SEQ ID NO: 67), β lanca T-ćelijskog receptora (RefSeq pristupni broj C25777; SEQ ID NO: 68), γ1 lanca T-ćelijskog receptora (RefSeq pristupni broj A26659; SEQ ID NO: 69), y2 lanca T-ćelijskog receptora (RefSeq pristupni broj AAB63312.1; SEQ ID NO: 70), i δ lanca T-ćelijskog receptora (RefSeq pristupni broj AAA61033.1; SEQ ID NO: 71).

[0598] CD3-vezujući domen

[0600] Ovde, „CD3-vezujući domen“ označava deo CD3 antitela, koji sadrži region koji se specifično vezuje i komplementaran je celom ili delu CD3. CD3-vezujući domen može biti poreklom iz jednog ili više varijabilnih domena antitela. Poželjno, CD3-vezujući domen uključuje i varijabilni region lakog lanca (VL) CD3 antitela i varijabilni region teškog lanca (VH) CD3 antitela. Takvi poželjni CD3-vezujući domeni uključuju, na primer, „jednolančani Fv (scFv)“, „jednolančano antitelo“, „Fv“, „jednolančani Fv2 (scFv2)“, „Fab“, i „F(ab’)2“.

[0601] CD3-vezujući domen ovde može da se vezuje za bilo koji epitop, sve dok je epitop lociran unutar sekvence γ lanca, δ lanca, ili ε lanca koji formiraju humani CD3. Ovde, poželjni CD3-vezujući domeni uključuju one koji sadrže varijabilni region lakog lanca (VL) CD3 antitela i varijabilni region teškog lanca (VH) CD3 antitela, koji se vezuju za epitop u vanćelijskom domenu ε lanca humanog CD3 kompleksa. Takvi poželjni CD3-vezujući domeni uključuju one koji sadrže varijabilni region lakog lanca (VL) CD3 antitela i varijabilni region teškog lanca (VH) CD3 antitela antitela OKT3 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4914‑4917) ili različitih poznatih CD3 antitela. Štaviše, takvi odgovarajući CD3-vezujući domeni uključuju one koji su poreklom iz CD3 antitela sa željenim karakteristikama, koji se dobijaju imunizacijom željene životinje sa γ lancem, δ lancem, ili ε lancem koji formiraju humani CD3 postupcima koji su prethodno opisani. Odgovarajuća anti-CD3 antitela iz kojih je poreklom CD3-vezujući domen uključuju humana antitela i antitela koja su na odgovarajući način humanizovana kao što je prethodno opisano. Strukture γ lanca, δ lanca, i ε lanca koji formiraju CD3 pokazane su kao polinukleotidne sekvence u SEQ ID NO: 27

[0604] 4

[0605] (NM_000073.2), 29 (NM_000732.4), i 31 (NM_000733.3), respektivno, i kao polipeptidne sekvence u SEQ ID NO: 28 (NP_000064.1), 30 (NP_000723.1), i 32 (NP_000724.1), respektivno (RefSeq pristupni broj je pokazan u zagradama).

[0607] Polipeptidni kompleks

[0609] Struktura polipeptidnog kompleksa nije ograničena, sve dok sadrži

[0611] (1) antigen-vezujući domen;

[0612] (2) domen koji sadrži Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor; i

[0613] (3) domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora, kao što je prethodno opisano.

[0615] U predmetnom pronalasku, domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora je domen za vezivanje za T-ćelijski receptor koji je CD3-vezujući domen. Svaki od domena koji su prethodno opisani može biti direktno povezan putem peptidne veze. Na primer, (1) F(ab’)2 se upotrebljava kao antigen-vezujući domen, i (2) Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor se upotrebljava kao domen koji sadrži Fc domen sa redukovnom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor. U ovom slučaju, kada je antigen-vezujući domen iz (1) povezan putem peptidne veze sa domenom koji sadrži Fc domen iz (2), povezani polipeptid formira strukturu antitela. Takvo antitelo može biti pripremljeno prečišćavanjem medijuma za kulturu hibridoma koji su prethodno opisani ili prečišćavanjem medijuma za kulturu željenih ćelija domaćina koje stabilno nose polinukleotid koji kodira polipeptid koji formira antitelo.

[0616] [0152] Kada je CD3-vezujući domen iz (3) povezan sa strukturom antitela, CD3-vezujući domen može biti povezan putem peptidne veze sa C-terminusom konstantnog regiona strukture antitela. U sledećem primeru izvođenja, CD3-vezujući domen je povezan putem peptidne veze sa N-terminusom varijabilnog regiona teškog lanca ili varijabilnog regiona lakog lanca strukture antitela. U drugom primeru izvođenja, CD3-vezujući domen može biti povezan putem peptidne veze sa C-terminusom konstantnog regiona lakog lanca strukture antitela. CD3-vezujući domen koji treba povezati može imati bilo koju željenu strukturu; međutim, takav odgovarajući CD3-vezujući domen uključuje poželjno Fv, i poželjnije scFv. Valentnost CD3-vezujućeg domena koji se vezuje za strukturu antitela nije ograničena. Kako bi se dvovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, monovalentni CD3 vezujući domen može biti povezan putem peptidne veze sa odgovarajućim C-terminusima dva Fc domena koji formiraju konstantni region strukture antitela. Alternativno, kako bi se dvovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, dvovalentni scFv (tj. sc(Fv)2) može biti povezan putem peptidne veze sa C-terminusom jednog od dva Fc domena. U ovom slučaju, polipeptidni kompleks u kome je dvovalentni scFv (tj. sc(Fv)2) povezan sa C-terminusom samo jednog od dva Fc domena koji formiraju konstantni region strukture antitela efikasno se proizvodi upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela. Alternativno, kako bi se monovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, monovalentni scFv može biti povezan putem peptidne veze sa C-terminusom jednog od dva Fc domena. U ovom slučaju, polipeptidni kompleks u kome je monovalentni scFv povezan sa C-terminusom samo jednog od dva Fc domena koji formiraju konstantni region strukture antitela efikasno se proizvodi upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela.

[0617] Štaviše, kada je CD3-vezujući domen iz (3) povezan putem peptidne veze sa C-terminusom konstantnog regiona strukture antitela, odgovarajući polipeptidni kompleksi uključuju one u kojima je teški lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen povezan sa C-terminusom jednog konstantnog regiona (CH3 domen) koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen je povezan sa C-terminusom drugog konstantnog regiona (CH3 domen) koji formira Fc domen. U ovom slučaju, odgovarajući linker kao što je Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7) insertuje se kako bi se teški ili laki lanac Fv fragmenta povezao sa C-terminusom konstantnog regiona (CH3 domen). Broj ponovaka u linkeru nije ograničen; međutim, bira se od 1 do 10, poželjno od 2 do 8, ili poželjnije od 2 do 6. Specifično, moguće je insertovati odgovarajući linker u kome je broj [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser] (SEQ ID NO: 7) ponovaka 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ili 10.

[0618] Alternativno, kada se proizvodi polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen povezan sa C-terminusom jednog konstantnog regiona (CH3 domen) koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta CD3-vezujućeg domena je povezan sa C-terminusom drugog konstantnog regiona (CH3 domen) koji formira Fc domen, odgovarajuće izmene aminokiselinskih ostataka koje omogućavaju formiranje disulfidnih veza između teškog lanca Fv fragmenta i lakog lanca Fv fragmenta mogu se upotrebljavati za poboljšanje asocijacije između teškog lanca Fv fragmenta i lakog lanca Fv fragmenta.

[0619] [0155] U sledećem primeru izvođenja, kada se proizvodi polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen povezan sa C-terminusom jednog konstantnog regiona (CH3 domen) koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta koji formira CD3-vezujući domen je povezan sa C-terminusom drugog konstantnog regiona (CH3 domen) koji formira Fc domen, CH1 i CL domeni antitela mogu biti povezani sa svakim od teškog lanca Fv fragmenta i lakog lanca Fv fragmenta kako bi se poboljšala asocijacija između teškog lanca Fv fragmenta i lakog lanca Fv fragmenta.

[0620] U još jednom primeru izvođenja, kako bi se dvovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, monovalentni CD3-vezujući domen može biti povezan putem peptidne veze sa odgovarajućim C-terminusima dva konstantna regiona lakog lanca ili odgovarajućim N-terminusima varijabilnih regiona lakog lanca strukture antitela. Alternativno, kako bi se dvovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, dvovalentni scFv (tj. sc(Fv)2) može biti povezan putem peptidne veze sa odgovarajućim C-terminusima dva konstantna regiona lakog lanca ili odgovarajućim N-terminusima varijabilnih regiona lakog lanca. U ovom slučaju, polipeptidni kompleksi u kojima je dvovalentni scFv (tj. sc(Fv)2) povezan sa C- ili N-terminusom jednog od dva varijabilna regiona lakog lanca strukture antitela mogu se efikasno proizvesti upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela. Alternativno, kako bi se monovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, monovalentni scFv može biti povezan putem peptidne veze sa C- ili N-terminusom jednog od dva varijabilna regiona lakog lanca. U ovom slučaju, polipeptidni kompleksi u kojima je monovalentni scFv povezan sa N- ili C-terminusom jednog varijabilnog regiona lakog lanca od dva varijabilna regiona lakog lanca strukture antitela mogu se efikasno proizvesti upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela.

[0621] U sledećem primeru izvođenja, kako bi se dvovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, monovalentni CD3-vezujući domen može biti povezan putem peptidne veze sa odgovarajućim N-terminusima dva varijabilna regiona teškog lanca strukture antitela. Alternativno, kako bi se dvovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, dvovalentni scFv (tj. sc(Fv)2) može biti povezan putem peptidne veze sa N-terminusom jednog od dva varijabilna regiona teškog lanca. U ovom slučaju, polipeptidni kompleksi u kojima je dvovalentni scFv (tj. sc(Fv)2) povezan sa N-terminusom samo jednog od dva varijabilna regiona teškog lanca strukture antitela mogu se efikasno proizvesti upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela. Alternativno, kako bi se monovalentni CD3-vezujući domen povezao sa strukturom antitela, monovalentni scFv može biti povezan putem peptidne veze sa N-terminusom jednog od dva varijabilna regiona teškog lanca. U ovom slučaju, polipeptidni kompleksi u kojima je monovalentni scFv povezan sa Nterminusom jednog od dva varijabilna regiona teškog lanca strukture antitela mogu se efikasno proizvesti upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela.

[0622] Štaviše, prethodno opisani polipeptidni kompleks može se proizvesti direktnim povezivanjem svakog domena putem peptidne veze ili vezivanjem peptida putem peptidnog linkera. U ovom slučaju, linker koji se upotrebljava uključuje linker koji je prethodno opisan kao primer i odgovarajuće linkere sa peptidnom oznakom, na primer, His-oznakom, HA-oznakom, myc-oznakom, ili FLAG-oznakom. Pored toga, poželjno je upotrebljavati svojstvo međusobnog vezivanja zasnovano na vodoničnoj vezi, disulfidnoj vezi, kovalentnoj vezi, ili jonskoj interakciji, ili njihovoj kombinaciji. Na primer, moguće je koristiti afinitet između CH1 i CL antitela, ili se prethodno opisani Fc domeni poreklom iz bispecifičnog antitela mogu upotrebljavati za heteromernu asocijaciju Fc domena. Štaviše, međudomenske disulfidne veze mogu se poželjno upotrebljavati kao što je opisano u Primerima.

[0623] U sledećoj strukturi polipeptidnog kompleksa, na primer, monovalentni Fv i monovalentni Fab se poželjno upotrebljavaju kao (1) antigen-vezujući domen. U ovom slučaju, upotrebljava se sledeća struktura. Teški lanac (VH) Fv fragmenta ili laki lanac (VL) Fv fragmenta monovalentnog Fv je povezan putem peptidne veze sa CH1 domenom teškog lanca. CH1 domen teškog lanca je povezan putem peptidne veze sa jednim od dva Fc domena sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor iz (2) koji formiraju polipeptidni kompleks. Drugi VL ili VH fragment monovalentnog Fv je povezan putem peptidne veze sa CH domenom lakog lanca koji je povezan putem disulfidne veze sa CH1 domenom teškog lanca. Stoga, VH i VL, respektivno povezani sa terminusima CH1 domena teškog lanca i CL domena lakog lanca, formiraju antigen-vezujući domen. sc(Fv)2, koji formira i (1) antigenvezujući domen i (3) CD3-vezujući domen, može biti povezan putem peptidne veze sa N-terminusom drugog Fc domena od dva koji su prethodno opisani. U ovom slučaju, polipeptidni kompleks koji ima strukturu u kojoj je CH1 domen teškog lanca povezan putem peptidne veze sa jednim od dva Fc domena koji formiraju polipeptidni kompleks, a sc(Fv)2 je povezan putem peptidne veze sa drugim Fc domenom, može se proizvesti upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela. Prethodno opisani polipeptidni kompleks može se proizvesti direktnim povezivanjem svakog domena putem peptidne veze ili vezivanjem peptida putem peptidnog linkera. U ovom slučaju, linker koji se upotrebljava uključuje linkere koji su prethodno opisani kao primer i odgovarajuće linkere sa peptidnom oznakom, na primer, His-oznakom, HA-oznakom, myc-oznakom, ili FLAG-oznakom.

[0624] U sledećoj poželjnoj strukturi polipeptidnog kompleksa, na primer, dvovalentni scFv se takođe upotrebljava kao (1) antigen-vezujući domen. U primeru izvođenja strukture, takođe je moguće proizvesti polipeptidni kompleks u kome je jedan od dvovalentnih scFv povezan putem peptidne veze preko VH, koji formira (3) CD3-vezujući domen, sa jednim od dva (2) Fc domena sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor, a drugi dvovalentni scFv je povezan putem peptidne veze preko VL, koji formira (3) CD3-vezujući domen, sa jednim od dva (2) Fc domena sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor. U ovom slučaju, moguće je upotrebljavati prethodno opisani Fc domen poreklom iz bispecifičnog antitela. Prethodno opisani polipeptidni kompleks može se proizvesti direktnim povezivanjem svakog domena putem peptidne veze ili vezivanjem peptida putem peptidnog linkera. U ovom slučaju, linker koji se upotrebljava uključuje linkere koji su prethodno opisani kao primer i odgovarajuće linkere sa peptidnom oznakom, na primer, His-oznakom, HA-oznakom, mycoznakom, ili FLAG-oznakom.

[0625] U sledećem primeru izvođenja strukture gde se dvovalentni scFv upotrebljava kao (1) antigen-vezujući domen, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome je jedan od dvovalentnih scFv povezan putem peptidne veze scFv koji formira (3) CD3-vezujući domen, sa jednim od dva (2) Fc domena sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor, a drugi dvovalentni scFv je povezan putem peptidne veze sa drugim (2) Fc domenom sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor. U ovom slučaju, polipeptidni kompleks u kome je scFv, koji formira antigen-vezujući domen, povezan putem peptidne veze preko scFv, koji formira CD3-vezujući domen, sa jednim od dva Fc domena koji formiraju polipeptidni kompleks, a scFv, koji formira antigen-vezujući domen, je povezan putem peptidne veze sa drugim Fc domenom, može se proizvesti upotrebom prethodno opisanog Fc domena poreklom iz bispecifičnog antitela. Prethodno opisani polipeptidni kompleks može se proizvesti direktnim povezivanjem svakog domena putem peptidne veze ili vezivanjem peptida putem peptidnog linkera. U ovom slučaju, linker koji se upotrebljava uključuje linkere koji su prethodno opisani kao primer i odgovarajuće linkere sa peptidnom oznakom, na primer, His-oznakom, HA-oznakom, myc-oznakom, ili FLAG-oznakom.

[0626] [0162] U strukturi polipeptidnog kompleksa za upotrebu iz predmetnog pronalaska, na primer, i antigen-vezujući domen i domen za vezivanje kompleksa T-ćelijskog receptora su svaki struktura monovalentnog Fab. U primeru izvođenja strukture, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira antigen-vezujući domen povezan preko CH1 domena sa jednim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom, dok je teški lanac Fv fragmenta Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan preko CH1 domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom.

[0627] U sledećem primeru izvođenja strukture, takođe je moguće proizvesti polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira antigenvezujući domen povezan preko CH1 domena sa jednim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom, dok je laki lanac Fv fragmenta Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan preko CH1 domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a teški lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom. Alternativno, takođe je moguće proizvesti polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan preko CH1 domena sa jednim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom, dok je laki lanac Fv fragmenta Fab koji formira antigen-vezujući domen povezan preko CH1 domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a teški lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom.

[0628] U sledećem primeru izvođenja strukture, takođe je moguće proizvesti polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira antigenvezujući domen povezan preko CH1 domena sa jednim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom, dok je teški lanac Fv fragmenta Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan preko CL domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CH1 domenom. Alternativno, takođe je moguće proizvesti polipeptidni kompleks u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentnog Fab koji formira domen za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan preko CH1 domena sa jednim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CL domenom, dok je teški lanac Fv fragmenta Fab koji formira antigen-vezujući domen povezan preko CL domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab je povezan sa CH1 domenom.

[0629] U primeru izvođenja druge strukture polipeptidnog kompleksa za upotrebu iz predmetnog pronalaska u kojem su i antigen-vezujući domen i domen za vezivanje kompleksa T-ćelijskog receptora svaki struktura monovalentnog Fab, poželjni polipeptidi uključuju one koji imaju:

[0631] (1) antigen-vezujući domen u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentne Fab strukture koja se vezuje za antigen povezan preko CH1 domena sa jednim od prethodno opisanih polipeptida koji formiraju Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab strukture je povezan sa CL domenom; i

[0632] (2) domen za vezivanje kompleksa T-ćelijskog receptora u kome je teški lanac Fv fragmenta monovalentne Fab strukture koja se vezuje za kompleks T-ćelijskog receptora povezan preko CH1 domena sa drugim polipeptidom koji formira Fc domen, a laki lanac Fv fragmenta Fab strukture je povezan sa CL domenom;

[0634] i u kome su električna naelektrisanja CH1 i CL domena kontrolisana tako da je teški lanac Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigenvezujućeg domena, ili je teški lanac Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor. U ovom primeru izvođenja, struktura (struktura sa kontrolisanom asocijacijom) polipeptidnog kompleksa nije ograničena na određenu strukturu, sve dok su električna naelektrisanja CH1 i CL domena kontrolisana tako da je teški lanac Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena, ili je teški lanac Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor.

[0635] U primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena.

[0636] U primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora.

[0637] U primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena, a aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju ista električna

[0640] 1

[0641] naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora.

[0642] U sledećem primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena, a aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju električna naelektrisanja suprotna onima aminokiselinskih ostataka CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora.

[0643] U još jednom primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena; aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora; i aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju električna naelektrisanja suprotna onima aminokiselinskih ostataka CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor.

[0644] U još jednom primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora, a aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju električna naelektrisanja suprotna onima aminokiselinskih ostataka CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena.

[0645] U alternativnom primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog

[0648] 2

[0649] receptora imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena; aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora; i aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigenvezujućeg domena imaju električna naelektrisanja suprotna onima aminokiselinskih ostataka CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena.

[0650] U još jednom primeru izvođenja strukture sa kontrolisanom asocijacijom, moguće je proizvesti polipeptidni kompleks u kome aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena; aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju ista električna naelektrisanja kao aminokiselinski ostaci CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora; aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora imaju električna naelektrisanja suprotna onima aminokiselinskih ostataka CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta domena za vezivanje za T-ćelijski receptor; i aminokiselinski ostaci CH1 domena koji je povezan sa teškim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena imaju električna naelektrisanja suprotna onima aminokiselinskih ostataka CL domena koji je povezan sa lakim lancem Fv fragmenta antigen-vezujućeg domena.

[0652] Kontrola električnih naelektrisanja CH1 i CL domena

[0654] Kako bi se dobio bispecifični polipeptidni kompleks koji prepoznaje epitop domena za vezivanje za T-ćelijski receptor pomoću teških i lakih lanaca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor, i epitop antigena pomoću teških i lakih lanaca antigen-vezujućeg domena, teorijski se proizvodi deset vrsta molekula polipeptidnog kompleksa ukoliko se svaki od četiri lanca eksprimira prilikom proizvodnje polipeptidnog kompleksa.

[0655] [0175] Ipak, željeni molekul polipeptidnog kompleksa može se preferencijalno dobiti, na primer, kontrolisanjem domena tako da se inhibira asocijacija između teškog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor i lakog lanca antigen-vezujućeg domena, i/ili asocijacija između teškog lanca antigen-vezujućeg domena i lakog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor.

[0656] Primeri uključuju izmene aminokiselinskih ostataka koji formiraju interfejs između CH1 teškog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor i CL lakog lanca antigenvezujućeg domena u pozitivno naelektrisane aminokiselinske ostatke, i izmene aminokiselinskih ostataka koji formiraju interfejs između CH1 teškog lanca antigenvezujućeg domena i CL lakog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor u negativno naelektrisane aminokiselinske ostatke. Kao rezultat takvih izmena, neželjena asocijacija između CH1 teškog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor i CL lakog lanca antigen-vezujućeg domena je inhibirana pošto su električna naelektrisanja aminokiselinskih ostataka koji formiraju interfejs oba pozitivna, a neželjena asocijacija između CH1 teškog lanca antigen-vezujućeg domena i CL lakog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor je takođe inhibirana pošto su električna naelektrisanja aminokiselinskih ostataka koji formiraju interfejs oba negativna. Željeni polipeptidni kompleks može se efikasno proizvesti kao rezultat željene asocijacije između CH1 teškog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor i CL lakog lanca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor, kao i željene asocijacije između CH1 teškog lanca antigen-vezujućeg domena i CL lakog lanca antigen-vezujućeg domena. Štaviše, željena asocijacija između teških i lakih lanaca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor je poželjno promovisana pošto aminokiselinski ostaci koji formiraju interfejs imaju međusobno suprotna električna naelektrisanja. Željena asocijacija između teških i lakih lanaca antigen-vezujućih domena je takođe poželjno promovisana pošto aminokiselinski ostaci koji formiraju interfejs imaju međusobno suprotna električna naelektrisanja. Ovo omogućava efikasnu proizvodnju polipeptidnog kompleksa sa željenom asocijacijom.

[0657] Štaviše, kontrola asocijacije može se upotrebljavati i za inhibiranje asocijacije između CH1 (teških lanaca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor i antigen-vezujućeg domena) ili između CL (lakih lanaca domena za vezivanje za T-ćelijski receptor i antigen-vezujućeg domena).

[0658] Oni sa iskustvom u struci mogu na odgovarajući način pronaći u željenom polipeptidnom kompleksu čija je asocijacija kontrolisana tipove aminokiselinskih ostataka koji su locirani u neposrednoj blizini CH1/CL interfejsa nakon asocijacije.

[0659] Štaviše, upotrebom javnih baza podataka ili sličnih, oni sa iskustvom u struci mogu na odgovarajući način pronaći upotrebljive sekvence CH1 i CL antitela u organizmu kao što su čovek, majmun, miš, ili zec. Specifičnije, informacije o aminokiselinskoj sekvenci CH1 i CL mogu se dobiti pomoću postupaka koji su opisani u nastavku u Primerima.

[0662] 4

[0663] Specifično, kao što je pokazano u Primerima koji su opisani u nastavku, specifični primeri kombinacija aminokiselinskih ostataka koji su locirani u neposrednoj blizini (okrenuti jedan prema drugome ili u kontaktu) na CH1/CL interfejsu nakon asocijacije između CH1 i CL, koji su respektivno povezani sa VH i VL, formirajući domen za vezivanje za T-ćelijski receptor ili antigen-vezujući domen, uključuju:

[0665] - lizin (K) na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 (na primer, pozicija 147 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 1) i treonin (T) na poziciji 180 (EU numerisanje) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) CL;

[0666] - lizin (K) na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i serin (S) na poziciji 131 (EU numerisanje) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) CL;

[0667] - lizin (K) na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i treonin (T) na poziciji 164 (EU numerisanje) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) CL;

[0668] - lizin (K) na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i asparagin (N) na poziciji 138 (EU numerisanje) u CL, koji su okrenuti (kontaktni) jedan prema drugom;

[0669] - lizin (K) na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i glutaminska kiselina (E) na poziciji 123 (EU numerisanje) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) CL;

[0670] - glutamin (Q) na poziciji 175 (EU numerisanje) u CH1 i glutamin (Q) na poziciji 160 (EU numerisanje) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) CL; ili

[0671] - lizin (K) na poziciji 213 (EU numerisanje) u CH1 i glutaminska kiselina (E) na poziciji 123 (EU numerisanje) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) CL.

[0673] Ove pozicije su numerisane u skladu sa dokumentom Kabata et al. (Kabat EA et al., 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH).

[0674] Ovde, brojevi označeni EU numerisanjem su dodeljeni u skladu sa EU numerisanjem (Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242). Ovde, „aminokiselinski ostatak na poziciji X (EU numerisanje)“ i „aminokiselina na poziciji X (EU numerisanje)“ (gde je X proizvoljan broj) naizmenično se upotrebljavaju sa „aminokiselinski ostatak koji odgovara poziciji X (EU numerisanje)“, „aminokiselina koja odgovara poziciji X (EU numerisanje)“.

[0675] Kao što je opisano u Primerima u nastavku, željeni polipeptidni kompleks može se preferencijalno dobiti izmenom aminokiselinskih ostataka i sprovođenjem postupaka koji su ovde opisani.

[0676] Poznato je da su aminokiselinski ostaci koji su prethodno opisani visoko konzervirani kod ljudi i miševa (J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113‑120). Stoga, asocijacija između CH1 i CL u konstantnom regionu polipeptidnog kompleksa koji nije neki od polipeptidnih kompleksa koji su opisani u Primerima takođe može biti kontrolisana izmenom aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su prethodno opisani.

[0677] Specifično, polipeptidni kompleksi su obezbeđeni sa kontrolisanom asocijacijom između teškog lanca i lakog lanca, u kojima jedan, dva ili više parova koji su odabrani iz grupe koja se sastoji od parova aminokiselinskih ostataka koji su opisani u (a) do (f) u nastavku imaju ista električna naelektrisanja:

[0679] (a) aminokiselinski ostatak na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 180 (EU numerisanje) u CL;

[0680] (b) aminokiselinski ostatak na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 131 (EU numerisanje) u CL;

[0681] (c) aminokiselinski ostatak na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 164 (EU numerisanje) u CL;

[0682] (d) aminokiselinski ostatak na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 138 (EU numerisanje) u CL;

[0683] (e) aminokiselinski ostatak na poziciji 147 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 123 (EU numerisanje) u CL; i

[0684] (f) aminokiselinski ostatak na poziciji 175 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 160 (EU numerisanje) u CL.

[0686] Štaviše, u sledećem primeru izvođenja, obezbeđena su antitela u kojima aminokiselinski ostaci u paru aminokiselinskih ostataka koji su opisani u (g) u nastavku imaju ista električna naelektrisanja: (g) aminokiselinski ostatak na poziciji 213 (EU numerisanje) u CH1 i aminokiselinski ostatak na poziciji 123 (EU numerisanje) u CL.

[0687] [0187] Aminokiselinski ostaci u svakom od parova koji su prethodno opisani locirani su u neposrednoj međusobnoj blizini nakon asocijacije, kao što je opisano u PRIMERIMA u nastavku. Modeliranjem homologije ili drugim postupcima upotrebom komercijalno dostupnog softvera, oni sa iskustvom u struci mogu na odgovarajući način pronaći željene CH1 ili CL aminokiselinske pozicije koje odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su prethodno opisani u (a) do (g), i mogu na odgovarajući način izmeniti aminokiselinske ostatke na tim pozicijama.

[0688] Takav „električno naelektrisani aminokiselinski ostatak“ u antitelu koje je prethodno opisano poželjno je odabran, na primer, od aminokiselinskih ostataka koji pripadaju grupi (X) ili (Y) koje su opisane u nastavku:

[0690] (X) glutaminska kiselina (E) i asparaginska kiselina (D); i

[0691] (Y) lizin (K), arginin (R) i histidin (H).

[0693] U polipeptidnim kompleksima koji su prethodno opisani, „ima isto električno naelektrisanje“ znači da, na primer, svi od dva ili više aminokiselinskih ostataka pripadaju jednoj od prethodno opisanih grupa (X) i (Y). S druge strane, „ima suprotno električno naelektrisanje“ znači da, na primer, barem jedan od dva ili više aminokiselinskih ostataka ima aminokiselinski ostatak koji pripada jednoj od prethodno opisanih grupa (X) i (Y), dok ostali aminokiselinski ostaci imaju aminokiselinske ostatke koji pripadaju drugoj grupi.

[0694] Postupci proizvodnje polipeptidnih kompleksa koji su prethodno opisani i postupci za kontrolu asocijacije izmenom aminokiselinskih ostataka u prethodnim grupama (a) do (g) u aminokiselinske ostatke koji imaju isto električno naelektrisanje takođe su ovde poželjni primeri izvođenja.

[0695] Ovde, aminokiselinski ostaci „koje treba izmeniti“ nisu ograničeni na aminokiselinske ostatke konstantnog regiona koji su prethodno opisani. Modeliranjem homologije ili drugim postupcima upotrebom komercijalno dostupnog softvera, oni sa iskustvom u struci mogu na odgovarajući način identifikovati aminokiselinske ostatke koji formiraju interfejs u mutantnom polipeptidu ili heteromernom multimeru i na odgovarajući način izmeniti aminokiselinske ostatke na tim pozicijama kako bi kontrolisali asocijaciju.

[0696] [0192] U tehnikama za inhibiranje neželjene asocijacije između teškog lanca i lakog lanca introdukovanjem odbijajućeg naelektrisanja na interfejsu između varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca, aminokiselinski ostaci u međusobnom kontaktu na interfejsu između varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) uključuju, na primer, glutamin (Q) na poziciji 39 (na primer, pozicija 39 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6 u WO 2006/106905) u varijabilnom regionu teškog lanca FR2 i glutamin (Q) na poziciji 38 (na primer, pozicija 44 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 8 u WO 2006/106905) u ka njemu okrenutom (kontaktnom) varijabilnom regionu lakog lanca FR2. Takvi poželjni aminokiselinski ostaci takođe uključuju, na primer, leucin (L) na poziciji 45 (na primer, pozicija 45 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 6 u WO 2006/106905) u varijabilnom regionu teškog lanca FR2 i prolin (P) na poziciji 44 (na primer, pozicija 44 u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 8 u WO 2006/106905) u ka njemu okrenutom varijabilnom regionu lakog lanca FR2. Ove pozicije su numerisane u skladu sa dokumentom Kabata et al. (Kabat EA et al., 1991. Sequence of Proteins of Immunological Interest. NIH).

[0697] Poznato je da su aminokiselinski ostaci koji su prethodno opisani visoko konzervirani kod ljudi i miševa (J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113‑120). Stoga, asocijacija između VH i VL u varijabilnim regionima antitela koja nisu neki od polipeptidnih kompleksa koji su opisani u Primerima takođe može biti kontrolisana izmenom aminokiselinskih ostataka koji odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su prethodno opisani.

[0698] Specifičnije, takva antitela koja imaju varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca uključuju ona u kojima aminokiselinski ostaci iz (1) i (2), ili (3) i (4) koji su opisani u nastavku imaju ista električna naelektrisanja:

[0700] (1) aminokiselinski ostatak koji odgovara poziciji 39 (EU numerisanje) u varijabilnom regionu teškog lanca;

[0701] (2) aminokiselinski ostatak koji odgovara poziciji 38 (EU numerisanje) u varijabilnom regionu lakog lanca;

[0702] (3) aminokiselinski ostatak koji odgovara poziciji 45 (EU numerisanje) u varijabilnom regionu teškog lanca;

[0703] (4) aminokiselinski ostatak koji odgovara poziciji 44 (EU numerisanje) u varijabilnom regionu lakog lanca.

[0705] Aminokiselinski ostaci iz (1) i (2), ili (3) i (4) koji su prethodno opisani locirani su u neposrednoj međusobnoj blizini nakon asocijacije. Modeliranjem homologije ili drugim postupcima upotrebom komercijalno dostupnog softvera, oni sa iskustvom u struci mogu na odgovarajući način identifikovati u željenom varijabilnom regionu teškog lanca ili lakog lanca aminokiselinske pozicije koje odgovaraju aminokiselinskim ostacima koji su prethodno opisani u (1) do (4), i mogu na odgovarajući način izmeniti aminokiselinske ostatke na tim pozicijama.

[0706] U antitelu koje je prethodno opisano, „električno naelektrisani aminokiselinski ostatak“ je poželjno odabran, na primer, od aminokiselinskih ostataka koji pripadaju grupi (X) ili (Y) u nastavku:

[0707] (X) glutaminska kiselina (E) i asparaginska kiselina (D); i

[0708] (Y) lizin (K), arginin (R), i histidin (H).

[0710] Kod ljudi i miševa, generalno, aminokiselinski ostaci iz (1) do (4) koji su prethodno opisani su:

[0712] (1) glutamin (Q);

[0713] (2) glutamin (Q);

[0714] (3) leucin (L); i

[0715] (4) prolin (P), respektivno.

[0717] U poželjnom primeru izvođenja ovde, aminokiselinski ostaci koji su prethodno opisani su izmenjeni (na primer, supstitucija sa naelektrisanom aminokiselinom). Tipovi aminokiselinskih ostataka (1) do (4) koji su prethodno opisani nisu ograničeni na one koji su prethodno opisani. Ove aminokiseline mogu biti bilo koje druge aminokiseline koje odgovaraju onima koje su prethodno opisane. Na primer, u slučaju ljudi, aminokiselina koja odgovara aminokiselini na poziciji 38 (EU numerisanje) u varijabilnom regionu lakog lanca može biti histidin (H). Pozivajući se na objavljene dokumente (na primer, J. Mol. Recognit. (2003) 16, 113‑120) ili slično, oni sa iskustvom u struci mogu pronaći tip aminokiselinskog ostatka koji odgovara proizvoljnoj poziciji u lakom lancu, i stoga mogu na odgovarajući način izmeniti aminokiselinski ostatak (na primer, supstitucija sa naelektrisanom aminokiselinom).

[0718] U tehnikama za inhibiranje neželjene asocijacije između teškog lanca i lakog lanca supstituisanjem električno naelektrisanih polarnih aminokiselina za aminokiselinske ostatke koji formiraju hidrofobno jezgro na interfejsu između varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca, poželjni aminokiselinski ostaci sposobni da formiraju hidrofobno jezgro na interfejsu između varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) uključuju, na primer, leucin (L) na poziciji 45 u varijabilnom regionu teškog lanca i prolin (P) na poziciji 44 u ka njemu okrenutom varijabilnom regionu lakog lanca.

[0719] [0199] Generalno, „hidrofobno jezgro“ označava deo gde se bočni lanci hidrofobnih aminokiselina asembliraju unutar povezanog polipeptida. Hidrofobne aminokiseline uključuju, na primer, alanin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, triptofan, i valin. U međuvremenu, aminokiselinski ostaci koji nisu hidrofobne aminokiseline (na primer, tirozin) takođe mogu biti uključeni u formiranje hidrofobnog jezgra. Zajedno sa hidrofilnom površinom od spoljašnjeg izlaganja bočnih lanaca hidrofilnih aminokiselina, hidrofobno jezgro služi kao pokretačka snaga za promociju asocijacije polipeptida koji su rastvorljivi u vodi. Kada su hidrofobne aminokiseline dva različita domena prisutne na molekulskoj površini i izložene molekulima vode, entropija se povećava, što rezultuje povećanjem slobodne energije. Prema tome, dva domena se međusobno povezuju kako bi smanjila slobodnu energiju radi stabilizacije. Hidrofobne aminokiseline na interfejsu su zakopane unutar molekula i formiraju hidrofobno jezgro.

[0720] Smatra se da, kada se hidrofobne aminokiseline koje formiraju hidrofobno jezgro u polipeptidnoj asocijaciji izmene u polarne aminokiseline sa električnim naelektrisanjem, inhibira se formiranje hidrofobnog jezgra. To rezultuje inhibicijom polipeptidne asocijacije.

[0721] Druge poznate tehnologije su takođe primenljive na polipeptidne komplekse. Na primer, kako bi se promovisala asocijacija prvog VH (VH1) i prvog VL (VL1), i/ili drugog VH (VH2) i drugog VL (VL2), pored „izmena“ koje su ovde opisane, aminokiseline u jednom od varijabilnih regiona H lanca su supstituisane onima koje imaju veći bočni lanac (izbočina; kvrga), a aminokiseline u drugom varijabilnom regionu H lanca su supstituisane onima koje imaju manji bočni lanac (udubljenje; praznina) tako da se izbočina postavlja u udubljenje. Ovo promoviše asocijaciju VH1 i VL1, i/ili VH2 i VL2, što rezultuje dodatnom inhibicijom asocijacije između VH1 i VL2 i/ili između VH2 i VL1 polipeptida (WO 1996/027011; Ridgway JB et al., Protein Engineering (1996) 9, 617‑621; Merchant AM et al., Nature Biotechnology (1998) 16, 677‑681).

[0722] U proizvodnji polipeptidnog kompleksa koji je prethodno opisan, svaki domen može biti direktno povezan putem peptidne veze ili vezivanjem peptida putem peptidnog linkera. U ovom slučaju, linker koji se upotrebljava uključuje linker koji je prethodno opisan kao primer i odgovarajuće linkere sa peptidnom oznakom, na primer, His-oznakom, HA-oznakom, mycoznakom, ili FLAG-oznakom. Pored toga, poželjno je upotrebljavati svojstvo međusobnog vezivanja zasnovano na vodoničnoj vezi, disulfidnoj vezi, kovalentnoj vezi, ili jonskoj interakciji, ili njihovoj kombinaciji. Na primer, moguće je koristiti afinitet između CH1 i CL antitela, ili se prethodno opisani Fc domeni poreklom iz bispecifičnog antitela mogu upotrebljavati za heteromernu asocijaciju Fc domena. Štaviše, međudomenske disulfidne veze mogu se poželjno upotrebljavati kao što je opisano u PRIMERIMA.

[0723] Polipeptidni kompleksi za upotrebu iz predmetnog pronalaska uključuju, na primer, primere izvođenja koji su pokazani na Sl.17, 19, i 24.

[0724] Polipeptidni kompleksi za upotrebu iz predmetnog pronalaska mogu se proizvesti istim postupcima kao što su prethodno opisani postupci za proizvodnju rekombinantnih antitela.

[0725] Štaviše, predmetni pronalazak se odnosi na polinukleotide koji kodiraju polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska. Polinukleotid se može insertovati u bilo koje ekspresione vektore. Odgovarajući domaćin se transformiše sa ekspresionim vektorom kako bi se dobile ćelije koje eksprimiraju polipeptidni kompleks. Polipeptidni kompleks kodiran polinukleotidom može se dobiti kultivacijom ćelija koje eksprimiraju polipeptidni kompleks i sakupljanjem proizvoda ekspresije iz supernatanta kulture. Specifično, predmetni pronalazak se odnosi na vektore koji nose polinukleotid koji kodira polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska, ćelije koje sadrže vektore, i postupke proizvodnje polipeptidnog kompleksa za upotrebu iz predmetnog pronalaska, u kojima se ćelije kultivišu i polipeptidni kompleks se sakuplja iz supernatanta kulture. Oni koji su prethodno opisani mogu se dobiti istim tehnologijama koje su prethodno opisane za rekombinantna antitela.

[0727] Farmaceutska kompozicija

[0729] U sledećem aspektu, obezbeđene su farmaceutske kompozicije koje kao aktivni sastojak sadrže polipeptidni kompleks koji sadrži:

[0731] (1) antigen-vezujući domen;

[0732] (2) domen koji sadrži Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor; i

[0733] (3) CD3-vezujući domen.

[0735] Takođe su obezbeđeni terapijski agensi za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, koji sadrže prethodno opisani kompleks kao aktivni sastojak (terapijski agensi za indukovanje ćelijske citotoksičnosti), agense za supresiju rasta ćelija, i antikancerske agense. Farmaceutske kompozicije mogu se upotrebljavati kao terapijski ili preventivni agens za kancer. Terapijski agensi za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agensi za supresiju rasta ćelija, i antikancerski agensi poželjno se primenjuju subjektima sa kancerom ili verovatnoćom ponovne pojave kancera.

[0736] Ovde, terapijski agensi za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agensi za supresiju rasta ćelija, i antikancerski agensi, koji kao aktivni sastojak sadrže polipeptidni kompleks koji sadrži:

[0738] (1) antigen-vezujući domen;

[0741] 1

[0742] (2) domen koji obuhvata Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor; i

[0743] (3) CD3-vezujući domen

[0745] mogu se takođe opisati kao postupak za sprečavanje ili lečenje kancera, koji sadrži korak primene polipeptidnog kompleksa subjektu, ili upotrebu polipeptidnog kompleksa u proizvodnji terapijskih agenasa za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agenasa za supresiju rasta ćelija, ili antikancerskih agenasa.

[0746] Ovde, „sadrži kao aktivni sastojak polipeptidni kompleks koji sadrži:

[0748] (1) antigen-vezujući domen;

[0749] (2) domen koji obuhvata Fc domen sa redukovanom aktivnošću vezivanja za Fcy receptor; i

[0750] (3) CD3-vezujući domen“

[0752] znači sadrži polipeptidni kompleks kao glavni aktivni sastojak; međutim, odnos sadržaja polipeptidnog kompleksa nije ograničen.

[0753] Farmaceutska kompozicija, terapijski agens za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agens za supresiju rasta ćelija, ili antikancerski agens ovde mogu biti formulisani sa različitim tipovima polipeptidnih kompleksa, ukoliko je potrebno. Na primer, citotoksično dejstvo prema ćelijama koje eksprimiraju antigen može biti pojačano koktelom višestrukih polipeptidnih kompleksa koji se vezuju za isti antigen. Alternativno, terapijski efekat može biti povećan formulisanjem polipeptidnog kompleksa koji sadrži antigen-vezujući domen koji se vezuje za antigen kancera u kombinaciji sa drugim polipeptidnim kompleksima koji sadrže antigen-vezujući domen prema drugom antigenu.

[0754] Ukoliko je potrebno, polipeptidni kompleksi mogu biti inkapsulirani u mikrokapsule (mikrokapsule koje su napravljene od hidroksimetilceluloze, želatina, poli[metilmetakrilata], i slično), i napravljeni u komponentama koloidnih sistema za isporuku lekova (lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice, i nanokapsule) (na primer, videti „Remington’s Pharmaceutical Science 16th edition“, Oslo Ed. (1980)). Štaviše, poznati su postupci za pripremu agenasa kao agenasa sa produženim oslobađanjem, i oni se mogu primeniti na polipeptidne komplekse (J. Biomed. Mater. Res. (1981) 15, 267‑277; Chemtech. (1982) 12, 98‑105; S.A.D. patent br.3773719; Evropske patentne prijave (EP) br. EP58481 i EP133988; Biopolymers (1983) 22, 547‑556).

[0757] 2

[0758] Farmaceutske kompozicije, agensi za supresiju rasta ćelija, ili antikancerski agensi mogu se primenjivati pacijentima bilo oralno ili parenteralno. Parenteralna primena je poželjna. Specifično, takvi postupci primene uključuju injekciju, nazalnu primenu, transpulmonalnu primenu, i perkutanu primenu. Injekcije uključuju, na primer, intravenske injekcije, intramuskularne injekcije, intraperitonealne injekcije, i subkutane injekcije. Na primer, farmaceutske kompozicije, terapijski agensi za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agensi za supresiju rasta ćelija, ili antikancerski agensi mogu se primenjivati lokalno ili sistemski pomoću injekcije. Štaviše, odgovarajući postupci primene mogu se odabrati u skladu sa starošću i simptomima pacijenta. Primenjena doza može se odabrati, na primer, iz opsega od 0,0001 mg do 1.000 mg po kg telesne težine za svaku primenu. Alternativno, doza se može odabrati, na primer, iz opsega od 0,001 mg/telu do 100.000 mg/telu po pacijentu. Međutim, doza farmaceutske kompozicije nije ograničena na ove doze.

[0759] Farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa konvencionalnim postupcima (na primer, Remington’s Pharmaceutical Science, najnovije izdanje, Mark Publishing Company, Easton, S.A.D.), i mogu takođe sadržati farmaceutski prihvatljive nosače i aditive. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, surfaktante, ekscipijense, agense za bojenje, agense za poboljšanje ukusa, konzervanse, stabilizatore, pufere, agense za suspendovanje, izotonične agense, bajndere, dezintegrante, lubrikante, agense za poboljšanje fluidnosti, i korigense, a mogu se pogodno upotrebljavati i drugi nosači koji se uobičajeno upotrebljavaju. Specifični primeri nosača uključuju laku anhidrovanu silicijumsku kiselinu, laktozu, kristalnu celulozu, manitol, skrob, karmelozu kalcijum, karmelozu natrijum, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, polivinilacetal dietilaminoacetat, polivinilpirolidon, želatin, triglicerid sa lancem srednje dužine, polioksietilen, očvrsnuto ricinusovo ulje 60, saharozu, karboksimetil celulozu, kukuruzni skrob, neorgansku so, i slično.

[0760] [0213] Takođe su obezbeđeni postupci za oštećivanje ćelija koje eksprimiraju antigen kancera ili za supresiju rasta ćelija dovođenjem u kontakt ćelija koje eksprimiraju antigen kancera sa polipeptidnim kompleksom koji se vezuje za antigen kancera. Monoklonska antitela koja se vezuju za antigen kancera opisana su prethodno kao polipeptidni kompleks koji se vezuje za antigen kancera, koji je uključen u terapijske agense za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agense za supresiju rasta ćelija, i antikancerske agense ovde. Ćelije za koje se vezuje polipeptidni kompleks koji se vezuje za antigen kancera za upotrebu iz predmetnog pronalaska nisu posebno ograničene, sve dok eksprimiraju antigen kancera. Specifično, ovde, poželjne ćelije koje eksprimiraju antigen kancera uključuju ćelije kancera jajnika, ćelije kancera prostate, ćelije kancera dojke, ćelije kancera materice, ćelije kancera jetre, ćelije kancera pluća, ćelije kancera pankreasa, ćelije kancera želuca, ćelije kancera mokraćne bešike, i ćelije kancera kolona. Kada je antigen kancera GPC3, ćelije nisu ograničene sve dok su to ćelije kancera koje eksprimiraju GPC3. Međutim, poželjne ćelije kancera uključuju ćelije hepatokarcinoma, ćelije kancera pluća, i ćelije kancera jajnika.

[0761] Ovde, „kontakt“ se može izvršiti, na primer, dodavanjem polipeptidnog kompleksa koji se vezuje za antigen kancera u medijum za kulturu ćelija koje eksprimiraju antigen kancera koje se kultivišu in vitro. U ovom slučaju, polipeptidni kompleks koji se dodaje može se upotrebljavati u odgovarajućem obliku, kao što je rastvor ili čvrsta supstanca pripremljena liofilizacijom ili slično. Kada se polipeptidni kompleks dodaje kao vodeni rastvor, rastvor može biti čist vodeni rastvor koji sadrži samo polipeptidni kompleks ili rastvor koji sadrži, na primer, prethodno opisani surfaktant, ekscipijens, agens za bojenje, agens za poboljšanje ukusa, konzervans, stabilizator, agens za puferisanje, agens za suspendovanje, agens za postizanje izotoničnosti, bajnder, dezintegrator, lubrikant, ubrzivač fluidnosti, i korigens. Dodata koncentracija nije posebno ograničena; međutim, krajnja koncentracija u medijumu za kulturu je poželjno u opsegu od 1 pg/ml do 1 g/ml, poželjnije 1 ng/ml do 1 mg/ml, a još poželjnije 1 µg/ml do 1 mg/ml.

[0762] U sledećem primeru izvođenja, „kontakt“ se takođe može izvršiti primenom nehumanim životinjama kojima su transplantirane ćelije koje eksprimiraju antigen kancera in vivo ili životinjama koje imaju ćelije kancera koje endogeno eksprimiraju antigen kancera. Postupak primene može biti oralni ili parenteralni. Parenteralna primena je posebno poželjna. Specifično, parenteralni postupak primene uključuje injekciju, nazalnu primenu, pulmonarnu primenu, i perkutanu primenu. Injekcije uključuju, na primer, intravenske injekcije, intramuskularne injekcije, intraperitonealne injekcije, i subkutane injekcije. Na primer, farmaceutske kompozicije, terapijski agensi za indukovanje ćelijske citotoksičnosti, agensi za supresiju rasta ćelija, i antikancerski agensi ovde mogu se primenjivati lokalno ili sistemski pomoću injekcije. Štaviše, odgovarajući postupak primene može se odabrati u skladu sa starošću i simptomima životinjskog subjekta. Kada se polipeptidni kompleks primenjuje kao vodeni rastvor, rastvor može biti čist vodeni rastvor koji sadrži samo polipeptidni kompleks ili rastvor koji sadrži, na primer, prethodno opisani surfaktant, ekscipijens, agens za bojenje, agens za poboljšanje ukusa, konzervans, stabilizator, agens za puferisanje, agens za suspendovanje, agens za postizanje izotoničnosti, bajnder, dezintegrator, lubrikant, ubrzivač fluidnosti, i korigens. Doza koja se primenjuje može se odabrati, na primer, iz opsega od 0,0001 do 1.000 mg po kg telesne težine za svaku primenu. Alternativno, doza se može

[0765] 4

[0766] odabrati, na primer, iz opsega od 0,001 do 100.000 mg/telu za svakog pacijenta. Međutim, doza polipeptidnog kompleksa nije ograničena na ove primere.

[0767] Postupci koji su opisani u nastavku poželjno se upotrebljavaju kao postupak za procenu ili određivanje ćelijske citotoksičnosti uzrokovane dovođenjem u kontakt polipeptidnog kompleksa sa ćelijama koje eksprimiraju antigen, za koje se vezuje antigenvezujući domen koji formira polipeptidni kompleks. Postupci za procenu ili određivanje citotoksične aktivnosti in vitro uključuju postupke za određivanje aktivnosti citotoksičnih T-ćelija ili slično. Da li polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska ima aktivnost indukovanja ćelijske citotoksičnosti posredovane T-ćelijama može se odrediti pomoću poznatih postupaka (videti, na primer, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). U testu citotoksičnosti, polipeptidni kompleks čiji se antigen-vezujući domen vezuje za antigen koji se razlikuje od onog koji prepoznaje antigen-vezujući domen polipeptidnog kompleksa za upotrebu iz predmetnog pronalaska i koji se ne eksprimira u ćelijama upotrebljava se kao kontrolni polipeptidni kompleks. Kontrolni polipeptidni kompleks se testira na isti način. Zatim se aktivnost procenjuje testiranjem da li polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska pokazuje jaču citotoksičnu aktivnost od one kontrolnog polipeptidnog kompleksa.

[0768] U međuvremenu, in vivo citotoksična aktivnost se procenjuje ili određuje, na primer, sledećom procedurom. Ćelije koje eksprimiraju antigen za koji se vezuje antigen-vezujući domen koji formira polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska, transplantiraju se intrakutano ili subkutano ne-humanom životinjskom subjektu. Zatim, od dana transplantacije ili nakon toga, test polipeptidni kompleks se primenjuje u venu ili peritonealnu duplju svakog dana ili u intervalima od nekoliko dana. Veličina tumora se meri tokom vremena. Razlika u promeni veličine tumora može se definisati kao citotoksična aktivnost. Kao i u in vitro testu, primenjuje se kontrolni polipeptidni kompleks. Može se proceniti da polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska ima citotoksičnu aktivnost kada je veličina tumora manja u grupi kojoj je primenjen polipeptidni kompleks za upotrebu iz predmetnog pronalaska nego u grupi kojoj je primenjen kontrolni polipeptidni kompleks.

[0769] [0218] MTT postupak i merenje preuzimanja izotopom obeleženog timidina u ćelije poželjno se upotrebljavaju za procenu ili određivanje efekta kontakta sa polipeptidnim kompleksom za upotrebu iz predmetnog pronalaska radi supresije rasta ćelija koje eksprimiraju antigen za koji se vezuje antigen-vezujući domen koji formira polipeptidni kompleks. U međuvremenu, isti postupci koji su prethodno opisani za procenu ili određivanje citotoksične aktivnosti in vivo mogu se poželjno upotrebljavati za procenu ili određivanje aktivnosti supresije rasta ćelija in vivo.

[0770] Predmetna objava takođe obezbeđuje komplete za upotrebu u postupku ovde, koji sadrže polipeptidni kompleks ili polipeptidni kompleks proizveden postupkom ovde. Kompleti mogu biti upakovani sa dodatnim farmaceutski prihvatljivim nosačem ili medijumom, ili uputstvom za upotrebu koje opisuje kako se kompleti upotrebljavaju, itd.

[0771] Pored toga, predmetni pronalazak se odnosi na polipeptidne komplekse za upotrebu u postupku kao što je specificirano u patentnim zahtevima.

[0773] [Primeri]

[0775] U nastavku, predmetni pronalazak je specifično opisan uz pozivanje na Primere, ali se ne sme tumačiti da je ograničen na njih.

[0777] [Primer 1] Konstrukcija i procena GPC3 ERY2

[0779] (1) Kratak pregled

[0781] [0222] Postoji dobro poznat postupak za produženje poluživota u krvi proteina koji se primenjuje in vivo, koji se zasniva na FcRn posredovanom recikliranju upotrebom proteina od interesa konjugovanog za Fc domen antitela. Međutim, konjugacija prirodnog tipa Fc za BiTE mogla bi dovesti do indukcije različitih citokina, pošto bi se jedan molekul vezao za T-ćeliju putem anti-CD3 scFv svoje BiTE funkcionalne grupe i istovremeno za FcgR (Fcy receptor) na ćelijskoj membrani, na primer, NK ćelije ili makrofaga putem svog Fc domena, a rezultujuće umrežavanje bi aktiviralo ove ćelije na način nezavisan od antigena kancera. Stoga, pripremljen je molekul nazvan ERY2, u kome je BiTE povezan putem polipeptidnog linkera sa Fc domenom koji ima redukovanu aktivnost vezivanja za Fcy receptor (tihi Fc), a aktivnost ERY2 je procenjena poređenjem sa aktivnošću BiTE. scFv anti-CD3 epsilon antitela je povezan putem kratkog peptidnog linkera sa scFv antitela prema Glipikanu 3 (GPC3), koji je GPI-usidreni protein za koji se zna da se eksprimira u visokom nivou u ćelijama kancera jetre, kako bi se proizveo BiTE prema GPC3 (GPC3 BiTE) (Sl.17A). Ovo je zatim povezano sa tihim Fc kako bi se proizveo ERY2 prema GPC3 (GPC3 ERY2) (Sl. 17C). Štaviše, konstruisano je anti-GPC3 antitelo normalnog IgG-tipa za poređenje. Anti-GPC3 antitelo IgG-tipa je pripremljeno kao antitelo sa redukovanim sadržajem fukoze u svojoj funkcionalnoj grupi šećernog lanca, tj. antitelo sa niskim sadržajem fukoze, za koje je poznato da ima poboljšanu ADCC aktivnost.

[0783] (2) Konstrukcija GPC3 BiTE

[0785] PCR amplifikacijom upotrebom ekspresionog vektora za anti-GPC3 antitelo kao templata, dobijene su cDNA koje sve kodiraju varijabilni region H lanca (anti-GPC3 VH) ili varijabilni region L lanca (anti-GPC3 VL). PCR je izvedena upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence i prethodno navedene cDNA kao templata za konstruisanje fragmenta cDNA koji kodira anti-GPC3 scFv koji ima aminokiselinsku sekvencu u kojoj su anti-GPC3 VH i anti-GPC3 VL povezani putem linkera sa tri ponovka Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7).

[0786] Štaviše, pripremljen je niz oligonukleotida, od kojih je svaki imao nukleotidnu sekvencu koja kodira delimičnu sekvencu varijabilnog regiona H lanca (M12 VH) ili varijabilnog regiona L lanca (M12 VL) anti-CD3 antitela (M12), i imao je komplementarne sekvence na krajevima. Oligonukleotidi su dizajnirani tako da se povezuju putem delova komplementarnih sekvenci polimeraznom reakcijom kako bi se sintetisao polinukleotid koji odgovara varijabilnom regionu H lanca (M12 VH) i varijabilnom regionu L lanca (M12 VL). Oligonukleotidi su pomešani, a zatim asemblirani pomoću PCR kako bi se dobile dve cDNA koje kodiraju aminokiselinske sekvence odgovarajućih varijabilnih regiona. PCR je izvedena upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence i prethodno navedene cDNA kao templata kako bi se proizveo fragment cDNA koji kodira M12 scFv koji ima amino sekvencu u kojoj su M12 VL i M12 VH povezani putem linkera koji ima tri ponovka Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7).

[0787] Zatim, pomoću PCR upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence i fragmente cDNA od kojih svaki kodira anti-GPC3 scFv ili M12 scFv kao templata, konstruisan je fragment cDNA koji je kodirao aminokiselinsku sekvencu u kojoj su anti-GPC3 scFv i M12 scFv povezani putem linkera sačinjenog od Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 7) i njegov C-terminus je imao His oznaku (osam histidina) (sekvenca SEQ ID NO: 33 bez svojih 19 aminokiselina na amino terminusu).

[0788] [0226] Upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence i kao templat fragment cDNA koji kodira aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 33 kojoj nedostaje 19 aminokiselina na amino terminusu, izvedena je PCR kako bi se proizveo fragment cDNA u kome su EcoRI sekvenca isecanja, Kozac sekvenca, i nukleotidna sekvenca koja kodira signalnu sekvencu za sekreciju bile prikačene za 5' kraj prethodno pomenutog fragmenta cDNA, a NotI sekvenca isecanja za 3' kraj. Rezultujući fragment cDNA je isečen pomoću EcoRI i NotI, i insertovan u ekspresioni vektor ćelija sisara kako bi se dobio ekspresioni vektor za GPC3 BiTE (SEQ ID NO: 33; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0789] Vektor je introdukovan u CHO DG44 ćelije pomoću elektroporacije. Posle graničnog razblaženja, ćelije su kultivisane u prisustvu 1 mg/ml geneticina kako bi se izolovale ćelijske linije rezistentne na lek. Supernatant kulture dobijenih ćelijskih linija analiziran je pomoću Western blotovanja upotrebom anti-His oznaka antitela kako bi se selektovala ćelijska linija koja eksprimira GPC3 BiTE.

[0790] Supernatant kulture koji je dobijen kulturom ćelija u velikim razmerama ćelijske linije koja je prethodno opisana napunjen je na SP Sepharose FF kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja kolone, frakcija koja sadrži GPC3 BiTE je eluirana gradijentom koncentracija NaCl. Frakcija je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja kolone, frakcija koja sadrži GPC3 BiTE je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija je koncentrovana ultrafiltracijom, a zatim je koncentrat napunjen na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Sakupljena je samo monomerna GPC3 BiTE frakcija kako bi se dobio prečišćeni GPC3 BiTE.

[0792] (3) Konstrukcija GPC3 ERY2

[0794] PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće dodatne sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan i postupku koji je dobro poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je postupak koji upotrebljava QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), izvedene su kako bi se proizveli ekspresioni vektori u koje je insertovan polinukleotid koji kodira GPC3 ERY2_Hk (SEQ ID NO: 34; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) ili GPC3 ERY2_Hh (SEQ ID NO: 35; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0795] [0230] Ovi ekspresioni vektori su kointrodukovani u FreeStyle293-F ćelije (Invitrogen) kako bi se GPC3 ERY2 prolazno eksprimirao. Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži GPC3 ERY2 je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži GPC3 ERY2 je koncentrovana ultrafiltracijom, a koncentrat je napunjen na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna GPC3 ERY2 frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio prečišćeni GPC3 ERY2.

[0797] (4) Konstrukcija anti-GPC3 antitela sa niskim sadržajem fukoze

[0799] Ekspresioni vektor za anti-GPC3 antitelo (koje se označava kao humanizovano GC33 antitelo u WO 2006/006693) introdukovan je u CHO DXB 11 ćelije sa GDP fukoza nokautom (Cancer Sci. (2010) 101(10), 2227‑33) pomoću elektroporacije. Posle graničnog razblaženja, ćelije su kultivisane u prisustvu 0,5 mg/ml geneticina kako bi se odabrale linije koje su rezistentne na lek, i dobijena je ćelijska linija koja eksprimira anti-GPC3 antitelo sa niskim sadržajem fukoze. Iz supernatanta kulture koji je dobijen kultivacijom ovih ćelija, frakcija antitela je pripremljena konvencionalnim afinitetnim prečišćavanjem upotrebom Hitrap® Protein A (Pharmacia). Zatim, frakcija antitela je podvrgnuta prečišćavanju pomoću gel filtracije upotrebom Superdex 20026/60 (Pharmacia). Monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobilo anti-GPC3 antitelo sa niskim sadržajem fukoze.

[0801] (5) Test citotoksičnosti upotrebom humanih mononukleusnih ćelija periferne krvi

[0803] (5‑1) Priprema suspenzije humanih mononukleusnih ćelija periferne krvi (PBMC)

[0805] Od zdravih dobrovoljaca (odraslih), uzeto je 50 ml periferne krvi upotrebom špriceva u koje je prethodno dodato 100 µl rastvora heparina od 1.000 jedinica/ml (Novo-Heparin 5000 jedinica za injekcije; Novo Nordisk). Periferna krv je dvostruko razblažena sa PBS(‑), podeljena na četiri jednaka alikvota, i dodata u epruvete za separaciju limfocita Leucosep (kat. br. 227290; Greiner bio-one) u koje je prethodno ubrizgano 15 ml Ficoll-Paque PLUS i centrifugirane su. Posle centrifugiranja (2.150 o/min, 10 minuta, sobna temperatura) epruveta za separaciju, sakupljen je sloj frakcije mononukleusnih ćelija. Ćelije u frakciji mononukleusnih ćelija su jednom isprane sa Dulbekovim modifikovanom Iglovim medijumom (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (SIGMA) koji sadrži 10% FBS (ovde i u daljem tekstu se označava kao 10%FBS/D-MEM), a zatim je gustina ćelija podešena na 4 x 10<6>ćelija/ml upotrebom 10%FBS/D-MEM. Tako pripremljena ćelijska suspenzija je upotrebljena kao suspenzija humanih PBMC u narednim eksperimentima.

[0806] (5‑2) Test citotoksične aktivnosti

[0808] Citotoksična aktivnost je procenjena na osnovu stope inhibicije rasta ćelija koja je određena upotrebom xCELLigence analizatora ćelija u realnom vremenu (Roche Diagnostics). Ciljna ćelija koja je upotrebljena bila je ćelijska linija SK-pca13a uspostavljena prisilnom ekspresijom humanog GPC3 u ćelijskoj liniji SK-HEP‑1. SK-pca13a ćelije su odvojene od posuda, i zasejane na E-Plate 96 ploču (Roche Diagnostics) u koncentraciji od 1 x 10<4>ćelija/bunariću (100 µl/bunariću). Zatim je započeto testiranje vijabilnosti ćelija upotrebom xCELLigence analizatora ćelija u realnom vremenu. Sledećeg dana, ploča je uklonjena iz xCELLigence analizatora ćelija u realnom vremenu, i na ploču je dodato 50 µl svakog antitela koje je pripremljeno u različitim koncentracijama (0,004, 0,04, 0,4, i 4 nM). Posle 15 minuta reakcije na sobnoj temperaturi, dodato je 50 µl suspenzije humanih PBMC (2 x 10<5>ćelija/bunariću) koje su pripremljene u (5‑1). Ploča je ponovo stavljena u xCELLigence analizator ćelija u realnom vremenu kako bi se započelo testiranje vijabilnosti ćelija. Reakcija je sprovedena pod 5% gasom ugljen-dioksida na 37 °C. Stopa inhibicije rasta ćelija (%) određena je u skladu sa formulom koja je pokazana u nastavku upotrebom vrednosti ćelijskog indeksa na 72 sata posle dodavanja humanih PBMC. Vrednost ćelijskog indeksa koja je upotrebljena u proračunu je normalizovana tako da je vrednost ćelijskog indeksa neposredno pre dodavanja antitela uzeta kao 1.

[0811]

[0814] A označava srednju vrednost ćelijskog indeksa za bunarić bez antitela (samo ciljna ćelija i humane PBMC), dok B označava srednju vrednost ćelijskog indeksa za svaki bunarić. Merenje je sprovedeno u triplikatu.

[0815] Citotoksična aktivnost GPC3 BiTE, GPC3 ERY2, i anti-GPC3 antitela IgG-tipa izmerena je upotrebom PBMC (mononukleusnih ćelija periferne krvi) koje su pripremljene iz humane krvi kao efektorskih ćelija. GPC3 BiTE je pokazao veoma jaku aktivnost (Sl.1). Ova aktivnost je bila mnogo jača od aktivnosti anti-GPC3 antitela sa niskim sadržajem fukoze. Stoga, GPC3 BiTE može poslužiti kao odličan terapijski agens za kancer koji prevazilazi antitela IgG-tipa. S druge strane, aktivnost GPC3 ERY2 nije bila tako jaka kao aktivnost GPC3 BiTE, iako je bila veća od aktivnosti anti-GPC3 antitela IgG-tipa. Ovo sugeriše da samo dodavanje Fc u BiTE ne omogućava stvaranje željenog molekula.

[0816] [Primer 2] Konstrukcija i procena GPC3 ERY5, GPC3 ERY6, i GPC3 ERY7

[0818] Sledeće, u pokušaju da se poboljša specifična aktivnost, antigen kancera (GPC3)-vezujući domen je učinjen bivalentnim kako bi se poboljšala aktivnost vezivanja za ćelije kancera. Još jedan anti-GPC3 scFv je dodat GPC3 ERY2 kako bi se konstruisao GPC3 ERY5 (Sl. 17D). Štaviše, umesto scFv, dodat je Fab-tip GPC3-vezujućeg domena kako bi se proizveo GPC3 ERY7 (Sl.17F). Pored toga, konstruisan je i GPC3 ERY6 (Sl.17E) u kome je anti-CD3 epsilon scFv iz GPC3 ERY5 podeljen u dva kraka.

[0819] Specifično, postupak koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće dodatne sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan, izveden je kako bi se proizveo niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira GPC3 ERY5_Hh, GPC3 ERY6_Hk, GPC3 ERY6_Hh, GPC3 ERY7_Hh, ili GPC3 ERY7_L.

[0820] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[0822] A. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY5

[0823] Polipeptidi kodirani polinukleotidima insertovanim u ekspresione vektore: GPC3 ERY5_Hh (SEQ ID NO: 36; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) i GPC3 ERY2_Hk

[0825] B. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY6

[0826] Polipeptidi kodirani polinukleotidima insertovanim u ekspresione vektore: GPC3 ERY6_Hk (SEQ ID NO: 37; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) i GPC3 ERY6_Hh (SEQ ID NO: 38; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[0828] C. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY7

[0829] Polipeptidi kodirani polinukleotidima insertovanim u ekspresione vektore: GPC3 ERY7_Hh (SEQ ID NO: 39; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY7_L (SEQ ID NO: 40; zrela

[0832] 1

[0833] sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY2_Hk

[0835] Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul koncentrovana je ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio svaki prečišćeni dizajnirani molekul.

[0836] Ovi polipeptidni kompleksi su upoređeni sa GPC3 BiTE u smislu citotoksične aktivnosti. Rezultat je pokazao da citotoksična aktivnost ovih polipeptidnih kompleksa nije bila toliko velika kao aktivnost GPC3 BiTE (Sl.2 do 4). Ovaj nalaz sugeriše da dodavanje Fc strukturi BiTE ili njegovoj mimetičkoj strukturi i konfiguracija koja omogućava bivalentno vezivanje za antigen kancera ne omogućavaju stvaranje željenog molekula.

[0838] [Primer 3] Konstrukcija i procena GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1

[0840] (1) Konstrukcija GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1

[0842] Sledeće, dizajnirani su molekuli koji nemaju BiTE strukturu, ali poseduju željenu aktivnost. Anti-kancerski antigen (GPC3) IgG je upotrebljen kao okosnica, i konstruisan je molekul u kome je anti-CD3 epsilon scFv dodat ovoj okosnici. IgG Fc koji je upotrebljen kao okosnica bio je tihi Fc koji ima redukovanu aktivnost vezivanja za FcgR (Fcy receptor), kao u prethodno opisanim slučajevima. Konstruisani su GPC3 ERY8‑2 (Sl. 17G), GPC3 ERY10‑1 (Sl. 17I), i GPC3 ERY9‑1 (Sl. 17H) u kojima je anti-CD3 epsilon scFv bio prikačen za N-terminus H lanca, C-terminus H lanca, i C-terminus L lanca anti-GPC3 antitela IgG, respektivno.

[0843] Specifično, pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće dodatne sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan, konstruisan je niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira GPC3 ERY8‑2_Hk (SEQ ID NO: 41; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY8‑2_Hh (SEQ ID NO: 42; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna

[0846] 2

[0847] sekvenca), GPC3 ERY9‑1_H (SEQ ID NO: 43; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY9‑1_L-His (SEQ ID NO: 44; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY9‑1_L-FLAG (SEQ ID NO: 45; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY10‑1_Hh (SEQ ID NO: 46; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0848] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[0850] D. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY8‑2

[0851] Polipeptidi kodirani polinukleotidima insertovanim u ekspresione vektore: GPC3 ERY8‑2_Hk (SEQ ID NO: 41; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY8‑2_Hh (SEQ ID NO: 42; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7_L

[0853] E. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY9‑1

[0854] Polipeptidi kodirani polinukleotidima insertovanim u ekspresione vektore: GPC3 ERY9‑1_H (SEQ ID NO: 43; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY9‑1_L-His (SEQ ID NO: 44; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY9‑1_L-FLAG (SEQ ID NO: 45; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[0856] F. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY10‑1

[0857] Polipeptidi kodirani polinukleotidima insertovanim u ekspresione vektore: GPC3 ERY10‑1_Hh (SEQ ID NO: 46; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) i GPC3 ERY8‑2_Hk, GPC3 ERY7_L

[0859] [0243] Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je koncentrovana ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio svaki prečišćeni dizajnirani molekul.

[0860] Ovi molekuli su procenjeni na citotoksičnu aktivnost in vitro. Rezultat je pokazao da su svi molekuli pokazali citotoksičnu aktivnost uporedivu sa ili veću od aktivnosti GPC3 BiTE (Sl.5). Konkretno, pronađeno je da GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 jasno imaju veću citotoksičnu aktivnost od GPC3 BiTE. Predmetni pronalazak po prvi put demonstrira da molekuli koji su napravljeni dodavanjem anti-CD3 epsilon scFv anti-kancerski antigen IgG takođe imaju citotoksičnu aktivnost uporedivu sa ili veću od aktivnosti BiTE. Posebno je iznenađujuće da su molekuli kao što su GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 jasno pokazali veću citotoksičnu aktivnost od BiTE iako je postojala velika udaljenost između njihovog kancerski antigen-vezujućeg domena i CD3 epsilon-vezujućeg domena.

[0862] (2) Procena efikasnosti GPC3 ERY8‑2 i GPC3 ERY10‑1 in vivo:

[0864] GPC3 ERY8‑2 i GPC3 ERY10‑1, za koje je demonstrirano da imaju citotoksičnu aktivnost uporedivu sa ili veću od aktivnosti GPC3 BiTE u testu in vitro koji je opisan u (1), procenjeni su na efikasnost in vivo. Ćelije GPC3-eksprimirajuće ćelijske linije humanog kancera pluća PC‑10 pomešane su sa humanim PBMC, a zatim transplantirane NOD scid miševima. Miševi su tretirani primenom GPC3 ERY8‑2 ili GPC3 ERY10‑1 (označeno kao model pre mešanja).

[0865] Specifično, test efikasnosti za GPC3 ERY8‑2 upotrebom PC‑10 modela pre mešanja sproveden je kao što sledi. PBMC su izolovane iz krvi koja je sakupljena od zdravih dobrovoljaca. NK ćelije su uklonjene iz PBMC upotrebom CD56 MicroBeads, humanih (MCAS Miltenyi biotec). Ćelijska linija humanog pločastog karcinoma pluća PC‑10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (5 x 10<6>ćelija), humane PBMC bez NK ćelija (4,5 x 10<6>ćelija), i Matrigel matriks bazalne membrane (BD) su pomešani, a zatim subkutano transplantirani u ingvinalnu regiju NOD scid miševa (CLEA Japan Inc.; ženke, 7W). Dan transplantacije je označen kao dan 0. Na dan pre transplantacije, miševima je intraperitonealno primenjeno anti-asijalo GM1 antitelo (Wako Pure Chemical Industries) u dozi od 0,2 mg/glavi. Posle dva sata od transplantacije, GPC ERY8‑2 je intraperitonealno primenjen u dozi od 30 µg/glavi. GPC ERY8‑2 je primenjen ukupno pet puta tokom perioda od dana 0 do 4.

[0868] 4

[0869] Štaviše, test efikasnosti za GPC3 ERY10‑1 upotrebom PC‑10 modela pre mešanja sproveden je kao što sledi. PBMC su izolovane iz krvi koja je sakupljena od zdravih dobrovoljaca. NK ćelije su uklonjene iz PBMC upotrebom CD56 MicroBeads, humanih (MCAS Miltenyi biotec). Ćelijska linija humanog pločastog karcinoma pluća PC‑10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (5 x 10<6>ćelija), humane PBMC bez NK ćelija (4,5 x 10<6>ćelija), i Matrigel matriks bazalne membrane (BD) su pomešani, a zatim subkutano transplantirani u ingvinalnu regiju NOD scid miševa (CLEA Japan Inc.; ženke, 7W). Dan transplantacije je označen kao dan 0. Na dan pre transplantacije, miševima je intraperitonealno primenjeno anti-asijalo-GM1 antitelo (Wako Pure Chemical Industries) u dozi od 0,2 mg/glavi. Posle dva sata od transplantacije, GPC ERY10‑1 je intraperitonealno primenjen u dozi od 30 µg/glavi. GPC ERY10‑1 je primenjen ukupno 13 puta tokom perioda od dana 0 do 4, od dana 7 do 11, i od dana 14 do 16.

[0870] Rezultat je pokazao da je u grupama kojima su primenjeni GPC3 ERY8‑2 i GPC3 ERY10‑1 rast tumora bio jasno suprimiran u poređenju sa grupom kojoj je primenjen rastvarač (PBS) (Sl.6 i 7).

[0871] Štaviše, GPC3 ERY10‑1 je takođe procenjen na efikasnost in vivo upotrebom alternativnog modela. Specifično, T-ćelije su uzgajane kultivacijom humanih PBMC in vitro, a zatim introdukovane u NOD scid miševe koji su razvili tumore poreklom iz transplantiranih PC‑10. Miševi su tretirani primenom GPC3 ERY10‑1 (označeno kao model transfera T-ćelija).

[0872] Specifično, test efikasnosti za GPC3 ERY10‑1 upotrebom PC‑10 modela transfera T-ćelija sproveden je kao što sledi. Ekspanziona kultura T-ćelija sprovedena je upotrebom kompleta za aktivaciju/ekspanziju T-ćelija/humanih (MACS Miltenyi biotec) i PBMC izolovanih iz krvi koja je sakupljena od zdravih dobrovoljaca. Ćelije ćelijske linije humanog pločastog karcinoma pluća PC‑10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (1 x 10<7>ćelija) pomešane su sa Matrigel matriksom bazalne membrane (BD), a zatim subkutano transplantirane u ingvinalnu regiju NOD scid miševa (CLEA Japan Inc.; ženke, 7W). Dan transplantacije označen je kao dan 0. Na dan pre transplantacije i na dane 6, 8, 12, 16, i 20, miševima je intraperitonealno primenjeno anti-asijalo-GM1 antitelo (Wako Pure Chemical Industries) u dozi od 0,2 mg/glavi. Na dan 6 od transplantacije, miševi su grupisani po veličini tumora i telesnoj težini, a zatim su T-ćelije koje su pripremljene ekspanzionom kulturom kao što je prethodno opisano transplantirane u količini od 1 x 10<7>ćelija/glavi u peritonealnu duplju. Posle dva sata od transplantacije, GPC ERY10‑1 je intraperitonealno primenjen u dozi od 30 µg/glavi. GPC ERY10‑1 je primenjen ukupno pet puta, na dane 7, 8, 12, 16, i 17.

[0873] Rezultat je pokazao da je grupa ovog modela kojoj je primenjen GPC3 ERY10‑1 takođe pokazala jasan antitumorski efekat u poređenju sa grupom kojoj je primenjen rastvarač (Sl. 8).

[0874] Nalaz koji je prethodno opisan demonstrira da niz molekula u kojima je jedan scFv anti-CD3 epsilon antitela dodat IgG okosnici koja ima tihi Fc pokazuje jasan in vivo antitumorski efekat.

[0876] (3) Procena zadržavanja u plazmi

[0878] Kako bi se procenilo da li molekuli kao što su GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1 imaju značajno duži poluživot u plazmi od GPC3 BiTE, GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 su primenjeni u dozi od 30 µg/glavi NOD scid miševima kojima nisu transplantirane ćelije kancera, i njihove koncentracije u plazmi su merene tokom vremena.

[0879] Specifično, PK analiza je sprovedena na sledeći način. GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 su intraperitonealno primenjeni NOD scid miševima (CLEA Japan Inc.; ženke, 8W) u dozi od 30 µg/glavi. Krv je sakupljena iz bukalne vene miševa upotrebom hematokritnih kapilara (Terumo) na 15 minuta, dva sata, 1 dan, 2 dana, i 7 dana posle primene. Plazma je pripremljena iz krvi.

[0880] GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 su odgovarajuće razblaženi i dodati GPC3-eksprimirajućim Ba/F3 ćelijama (GPC3/BaF) ili humanim CD3 epsilon-eksprimirajućim Ba/F3 ćelijama (CD3/BaF) kako bi se omogućilo da GPC3 ERY9‑1 ili GPC3 ERY10‑1 reaguju sa GPC3/BaF i CD3/BaF. Posle ispiranja ovih ćelija, FITC-obeleženo sekundarno antitelo je dodato za dodatnu reakciju. Posle ispiranja ćelija, intenzitet fluorescencije obeleživača na ćelijama je izmeren upotrebom protočnog citometra Epics XL (Beckman coulter) kako bi se pripremila kalibraciona kriva za svako antitelo.

[0881] Krv je sakupljana tokom vremena od miševa kojima je dat GPC3 ERY9‑1 ili GPC3 ERY10‑1. Plazma je pripremljena iz krvi i odgovarajuće razblažena. Na isti način kao za pripremu kalibracionih krivi koje su prethodno opisane, uzorci plazme su reagovali sa GPC3/BaF ili CD3/BaF kako bi se odredila količina GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 u plazmi koja je vezana za svaku ćeliju. Koncentracija svakog antitela u plazmi je izračunata upotrebom određenih vrednosti i kalibracionih krivi koje su prethodno opisane.

[0882] [0257] Rezultat je pokazao da je koncentracija i GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 u krvi ostala viša od 10 nM posle dva dana od primene (Sl. 9 i 10). Ovaj nalaz demonstrira da molekuli kao što su GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1 imaju značajno poboljšan poluživot u plazmi u poređenju sa BiTE.

[0884] (4) Efekat tihog Fc na indukciju citokina nezavisnu od antigena kancera

[0886] (4‑1) Konstrukcija GPC3 ERY15‑1 koji ima FcgR-vezujući Fc

[0888] GPC3 ERY15‑1 koji ima FcgR-vezujući Fc (Sl.17J) je konstruisan kako bi se testiralo da li molekuli kao što su GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1 indukuju citokine na način nezavisan od antigena kancera.

[0889] Specifično, kao u prethodno opisanom postupku, izvedena je PCR upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence i postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je postupak upotrebom QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), kako bi se konstruisali ekspresioni vektori u koje je insertovan polinukleotid koji kodira GPC3 ERY15‑1_Hh (SEQ ID NO: 47; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) ili GPC3 ERY15‑1_Hk (SEQ ID NO: 48; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0890] Ekspresioni vektori za GPC3 ERY15‑1_Hh (SEQ ID NO: 47; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY15‑1_Hk (SEQ ID NO: 48; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7_L kointrodukovani su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se GPC3 ERY15‑1 prolazno eksprimirao. Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži GPC3 ERY15‑1 je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži GPC3 ERY15‑1 je koncentrovana ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna GPC3 ERY15‑1 frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio prečišćeni GPC3 ERY15‑1.

[0892] (4‑2) Test za sposobnost indukovanja citokina nezavisnu od antigena kancera

[0894] [0261] Sposobnost GPC3 ERY15‑1 da indukuje citokine nezavisno od antigena kancera upoređena je sa sposobnostima GPC3 BiTE, GPC3 ERY9‑1, GPC3 ERY10‑1, i katumaksomaba. Upotrebom postupka koji je prethodno opisan, PBMC su pripremljene iz krvi koja je sakupljena od zdravih dobrovoljaca. Pedeset µl svakog antitela podešenog na 40 nM dodato je u 50 µl suspenzije humanih PBMC (2 x 10<5>ćelija/bunariću), a zatim je u to dodato 100 µl 10%FBS/D-MEM. Reakciona smeša je inkubirana pod 5% gasom ugljendioksida na 37 °C. Posle 72 sata inkubacije, sakupljen je supernatant kulture, a citokini koji su sekretovani u supernatantu kulture kvantifikovani su pomoću Cytometric Beads Array (CBA) testa upotrebom Human Th1/Th2/Th17 Kit (BD). Test je sproveden u triplikatu postupkom u skladu sa priloženim protokolom.

[0895] Kao rezultat, GPC3 ERY15‑1 i katumaksomab, koji imaju FcgR-vezujući Fc, pokazali su jasnu indukciju citokina. Nasuprot tome, nije uočena indukcija citokina za GPC3 BiTE, koji nema Fc, i GPC3 ERY9‑1 i GPC3 ERY10‑1, koji poseduju tihi Fc (Sl.11). Ovaj rezultat sugeriše da su molekuli koji imaju tihi Fc, kao što su GPC3 ERY8‑2, GPC3 ERY9‑1, i GPC3 ERY10‑1, visoko bezbedni molekuli koji ne indukuju citokine na način nezavisan od antigena kancera.

[0897] [Primer 4] Konstrukcija i procena GPC3 ERY18 L1, L2, L3, L4, i S1

[0899] Procenjeni su molekuli koji imaju CD3-vezujući domen drugačiji od scFv strukture. Konstruisan je GPC3 ERY18 (Sl. 17K) u kome su VH i VL domeni anti-CD3 antitela povezani sa C-terminusima dva H lanca anti-kancerski antigen (GPC3) IgG. U ovoj konstrukciji, proizveden je niz molekula (GPC3 ERY18 L1, L2, L3, i L4) koji imaju jednu do četiri linkerske jedinice (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) na spoju. Istovremeno, konstruisan je još jedan molekul (GPC3 ERY18 S1) u kome su aminokiseline na odgovarajućim pozicijama supstituisane sa Cys kako bi se omogućila introdukcija disulfidne veze.

[0900] [0264] Specifično, postupak koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan, izveden je kako bi se konstruisao niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira GPC3 ERY18 L1 Hh (SEQ ID NO: 49; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L1_Hk (SEQ ID NO: 50; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L2_Hh (SEQ ID NO: 51; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L2_Hk (SEQ ID NO: 52; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L3_Hh (SEQ ID NO: 53; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L3_Hk (SEQ ID NO: 54; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L4_Hh (SEQ ID NO: 55; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L4_Hk (SEQ ID NO: 56; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 S1_Hh (SEQ ID NO: 57; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), ili GPC3 ERY18 S1_Hk (SEQ ID NO: 58; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0901] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[0903] G. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY18 L1

[0904] Ekspresioni vektori: GPC3 ERY18 L1_Hh (SEQ ID NO: 49; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L1_Hk (SEQ ID NO: 50; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7 L

[0906] H. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY18 L2

[0907] Ekspresioni vektori: GPC3 ERY18 L2_Hh (SEQ ID NO: 51; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L2_Hk (SEQ ID NO: 52; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7 L

[0909] I. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY18 L3

[0910] Ekspresioni vektori: GPC3 ERY18 L3_Hh (SEQ ID NO: 53; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L3_Hk (SEQ ID NO: 54; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7 L

[0912] J. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY18 L4

[0913] Ekspresioni vektori: GPC3 ERY18 L4_Hh (SEQ ID NO: 55; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 L4_Hk (SEQ ID NO: 56; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7 L

[0915] K. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY18 S1

[0916] Ekspresioni vektori: GPC3 ERY18 S1_Hh (SEQ ID NO: 57; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY18 S1 Hk (SEQ ID NO: 58; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7 L

[0918] Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je koncentrovana ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio svaki prečišćeni dizajnirani molekul.

[0919] Molekuli GPC3 ERY18 L1, GPC3 ERY18L2, GPC3 ERY18L3, GPC3 ERY18L4, i GPC3 ERY18S1 su svi procenjeni na citotoksičnu aktivnost in vitro (Sl. 12 i 13). Rezultat je pokazao da svi molekuli osim GPC3 ERY18 L1 imaju aktivnost uporedivu sa aktivnošću GPC3 ERY10‑1. Ovaj rezultat demonstrira da molekuli koji imaju ne-scFv strukturu imaju uporedivu citotoksičnu aktivnost. Očekuje se da struktura u kojoj su VH i VL domeni CD3 antitela povezani svaki sa C-terminusima dva H lanca anti-kancerski antigen (GPC3) IgG doprinese stabilizaciji polipeptidnih kompleksa ovde.

[0921] [Primer 5] Konstrukcija i procena GPC3 ERY19‑3

[0923] [0268] Sledeće, procenjeni su molekuli koji imaju Fab-sličan CD3-vezujući domen. Konstruisan je GPC3 ERY19‑3 (Sl. 17L) u kome su VH i CH1 domeni, i VL i CL domeni CD3 antitela povezani svaki sa C-terminusima dva H lanca anti-kancerski antigen (GPC3) IgG antitela. Specifično, postupkom koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže odgovarajuće dodatne sekvence na isti način kao u postupku koji je prethodno opisan, konstruisani su ekspresioni vektori u koje je insertovan polinukleotid koji kodira GPC3 ERY19‑3_Hh (SEQ ID NO: 59; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) ili GPC3 ERY19‑3_Hk (SEQ ID NO: 60; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0924] Ekspresioni vektori za GPC3 ERY19‑3_Hh (SEQ ID NO: 59; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), GPC3 ERY19‑3_Hk (SEQ ID NO: 60; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i GPC3 ERY7_L kointrodukovani su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se GPC3 ERY19‑3 prolazno eksprimirao. Rezultujući supernatant kulture je napunjen na HiTrap rProtein A FF kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana kiselinom. Frakcija koja sadrži GPC3 ERY19‑3 je koncentrovana ultrafiltracijom, a zatim napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna GPC3 ERY19‑3 frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio prečišćeni GPC3 ERY19‑3.

[0925] Molekul GPC3 ERY19‑3 je procenjen na citotoksičnu aktivnost in vitro. Rezultat je pokazao da molekul ima aktivnost uporedivu sa GPC3 BiTE (Sl. 14). Očekuje se da CD3-vezujući domen sa Fab-sličnom strukturom doprinese stabilizaciji molekula polipeptidnog kompleksa za upotrebu iz predmetnog pronalaska.

[0927] [Primer 6] Priprema polipeptidnih kompleksa upotrebom samo protein A koraka prečišćavanja introdukcijom mutacije u CH3 domen GPC3 ERY 10‑1

[0929] (1) Kratak pregled

[0931] U GPC3 ERY10‑1 koji je pripremljen u Primeru 3, CH3 domen ima izbočine-uudubljenja strukturu. Željeni GPC3 ERY10‑1 molekul, u kome su dva H lanca heteromerno povezana, prečišćen je pomoću dva tipa afinitetnog prečišćavanja upotrebom His oznake i FLAG oznake koje su prikačene za C-terminus svakog H lanca. Ukoliko se molekul GPC3 ERY10‑1 proizvodi kao farmaceutik, protein A hromatografija se prvo izvodi na supernatantu kulture ćelija koje eksprimiraju GPC3 ERY10‑1 kako bi se prečistio polipeptidni kompleks koji ima Fc domen. Ovaj korak mora biti praćen dodatnim korakom hromatografskog prečišćavanja upotrebom afinitetne hromatografije sa His oznakom i afinitetne hromatografije sa FLAG oznakom. Ovo rezultuje povećanim troškovima procesa prečišćavanja. Stoga, u ovom Primeru su ispitane molekulske modifikacije koje omogućavaju prečišćavanje željenog molekula GPC3 ERY10‑1 koji ima dva heteromerno povezana H lanca samo pomoću protein A hromatografije bez upotrebe His oznake i FLAG oznake.

[0934] 1

[0935] Specifično, ispitane su modifikacije za eliminisanje vezivanja proteina A u jednom od dva H lanca. Kao rezultat takvih modifikacija, kada su ne-protein A-vezujući H lanci homomerno povezani, molekul se ne može vezati za protein A i prema tome prolazi kroz protein A hromatografiju. S druge strane, molekul u kome je ne-protein A-vezujući H lanac heteromerno povezan sa protein A-vezujućim H lancem, i molekul u kome su protein A-vezujući H lanci homomerno povezani, mogu se razdvojiti upotrebom protein A hromatografije na osnovu razlike u afinitetu za protein A. Međutim, u Fc domenu antitela, vezujuće mesto za protein A se preklapa sa vezujućim mestom za FcRn, što je ključno za zadržavanje antitela u plazmi. Stoga, neophodno je selektivno redukovati samo aktivnost vezivanja za protein A, uz održavanje aktivnosti vezivanja za FcRn. Kao takva modifikacija, otkrivena je supstitucija His na poziciji 435 (EU numerisanje) sa Arg. Kombinacija ove mutacije sa mutacijama koje su opisane u WO 2006/106905 (supstituisanje Asp na poziciji 356 (EU numerisanje) u jednom od H lanaca sa Lys, i Lys na poziciji 439 (EU numerisanje) u drugom H lancu sa Glu), koje promovišu heteromernu asocijaciju dva H lanca, testirana je kako bi se odredilo da li može omogućiti prečišćavanje polipeptidnih kompleksa kao što je GPC3 ERY10‑1 upotrebom samo protein A hromatografije.

[0937] (2) Konstrukcija ekspresionih vektora za gene antitela i ekspresija odgovarajućih antitela

[0939] Za varijabilni region H lanca antitela, gen koji kodira GC33(2)H (varijabilni region H lanca anti-humani Glipikan-3 antitela, SEQ ID NO: 61; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) konstruisan je pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci. Slično, za L lanac antitela, gen koji kodira GC33-k0 (L lanac anti-humani Glipikan-3 antitela, SEQ ID NO: 62; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) konstruisan je pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci. Zatim, za konstantni region H lanca antitela, geni koji su opisani u nastavku konstruisani su pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci.

[0941] L. Dizajnirani molekul: LALA-G1d

[0942] LALA-G1d (SEQ ID NO: 63; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), u kojoj je Leu na pozicijama 234 i 235 (EU numerisanje) supstituisan sa Ala, Asn na poziciji 297 je supstituisan sa Ala, a Gly i Lys na C-terminusu su uklonjeni u sekvenci IgG1

[0945] 2

[0946] M. Dizajnirani molekul: LALA-G1d-CD3

[0947] LALA-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 64; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), u kojoj je CD3 scFv (varijabilni region H lanca anti-humani CD3 antitela i varijabilni region L lanca anti-humani CD3 antitela povezani su putem polipeptidnog linkera) povezan sa C-terminusom LALA-G1d (SEQ ID NO: 63; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[0949] N. Dizajnirani molekul: LALA-G3S3E-G1d

[0950] LALA-G3S3E-G1d (SEQ ID NO: 65; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), u kojoj je His na poziciji 435 (EU numerisanje) supstituisan sa Arg, a Lys na poziciji 439 (EU numerisanje) je supstituisan sa Glu u sekvenci LALA-G1d (SEQ ID NO: 63; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[0952] O. Dizajnirani molekul: LALA-S3K-G1d-CD3

[0953] LALA-S3K-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 66; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), u kojoj je Asp na poziciji 356 (EU numerisanje) supstituisan sa Lys u sekvenci LALA-G1d-CD3 (SEQ ID NO: 64; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[0955] Geni NTA1L i NTA1R H lanca anti-humani GPC3 antitela konstruisani su povezivanjem LALA-G1d-CD3 ili LALA-G1d nizvodno od GC33(2)H, respektivno. U međuvremenu, geni NTA2L i NTA2R H lanca anti-humani GPC3 antitela konstruisani su povezivanjem LALA-S3K-G1d-CD3 ili LALA-G3S3E-G1d nizvodno od GC33(2)H, respektivno.

[0956] [0275] Ekspresioni vektori za NTA1L, NTA1R, NTA2L, NTA2R (H lanci), i GC33-k0 (L lanac) konstruisani su insertovanjem svakog gena u ekspresioni vektor životinjske ćelije. Ovi vektori su kombinovani kao što je pokazano u nastavku i introdukovani u FreeStyle293 ćelije (Invitrogen) pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci za prolaznu ekspresiju polipeptidnih kompleksa koji su opisani u nastavku. Kao što je pokazano u nastavku, polipeptidni kompleksi se označavaju nazivima gena koji su introdukovani kombinovano po redosledu [prvi H lanac/drugi H lanac/L lanac].

[0958] NTA1L/NTA1R/GC33-k0

[0959] NTA2L/NTA2R/GC33-k0

[0961] (3) Prečišćavanje uzoraka koji su eksprimirani i procena formiranja heteromernih kompleksa

[0963] Supernatant kulture FreeStyle293 ćelija (ovde u daljem tekstu označeno kao CM) koji sadrži polipeptidni kompleks koji je pokazan u nastavku upotrebljen je kao uzorak.

[0965] NTA1L/NTA1R/GC33-k0

[0966] NTA2L/NTA2R/GC33-k0

[0968] CM je filtriran kroz ϕ0,22 µm filter i napunjen na rProtein A Sepharose Fast Flow kolonu (GE Healthcare) uravnoteženu sa D-PBS. Koraci ispiranja 1 i 2, i korak eluiranja 1 su sprovedeni upotrebom pufera koji su pokazani u Tabeli 1. Količina CM koja se puni podešena je tako da je količina antitela koja se puni bila 20 mg/ml smole. Eluirane frakcije su sakupljene i analizirane pomoću ekskluzione hromatografije kako bi se identifikovale komponente u frakcijama.

[0970] [Tabela 1]

[0973]

[0976] Rezultat analize ekskluzione hromatografije svake eluirane frakcije pokazan je na Sl.

[0977] 15 i u Tabeli 2. Vrednosti označavaju procenat površine elucionog pika. Kada je eksprimirano NTA1L/NTA1R/GC33-k0 ili NTA2L/NTA2R/GC33-k0, anti-GPC3 homomerno antitelo (NTA1L/GC33-k0 ili NTA2L/GC33-k0) bilo je gotovo nedetektabilno u CM. U međuvremenu, anti-GPC3 homomerno antitelo (NTA2R/GC33-k0) bilo je samo oko 2% u

[0980] 4

[0981] CM gde je eksprimirano NTA2L/NTA2R/GC33-k0, dok je u CM gde je eksprimirano NTA1L/NTA1R/GC33-k0 bilo oko 76%. Ovaj rezultat demonstrira da, kada se His na poziciji 435 (EU numerisanje) supstituiše sa Arg i, kako bi se omogućilo efikasno formiranje heteromernog molekula odgovarajućih H lanaca, Asp na poziciji 356 (EU numerisanje) u polipeptidnoj sekvenci jednog od H lanaca supstituiše sa Lys i Lys na poziciji 439 (EU numerisanje) u polipeptidnoj sekvenci drugog H lanca supstituiše sa Glu, heteromerni polipeptidni kompleksi koji imaju isti molekulski oblik kao GPC3 ERY10‑1 mogu se efikasno prečistiti sa čistoćom većom od 98% samo pomoću koraka prečišćavanja upotrebom proteina A.

[0983] [Tabela 2]

[0985]

[0988] [Primer 7] Konstrukcija i procena GPC3 ERY 17‑2 i GPC3 ERY 17‑3

[0990] (1) Konstrukcija GPC3 ERY 17‑2 i GPC3 ERY 17‑3

[0992] Sledeće, konstruisan je molekul upotrebom anti-kancerski antigen (GPC3) IgG kao okosnice i supstituisanjem jednog od Fab sa CD3 epsilon-vezujućim domenom. Kao i u prethodno opisanim slučajevima, Fc okosnice IgG bio je tihi Fc koji ima redukovanu aktivnost vezivanja za FcgR (Fcy receptor). Za CD3 epsilon-vezujuće domene, VH i VL domeni anti-CD3 epsilon Fab su zamenjeni kako bi se proizveo GPC3 ERY17‑2 (Sl. 19A), a CH1 i CL domeni su zamenjeni kako bi se proizveo GPC3 ERY17‑3 (Sl.19B).

[0993] [0280] Specifično, postupkom koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće dodatne sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan, konstruisan je niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira ERY17‑2_Hh (SEQ ID NO: 73; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), ERY17‑2_L (SEQ ID NO: 74; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), ERY17‑3_Hh (SEQ ID NO: 75; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), ili ERY17‑3_L (SEQ ID NO: 76; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[0994] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[0996] P. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY17‑2

[0997] Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su insertovani u ekspresione vektore: GPC3 ERY8‑2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17‑2_Hh (SEQ ID NO: 73; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i ERY17‑2_L (SEQ ID NO: 74; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[0999] Q. Dizajnirani molekul: GPC3 ERY17‑3

[1000] Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su insertovani u ekspresione vektore: GPC3 ERY8‑2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17‑3 Hh (SEQ ID NO: 75; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), i ERY17‑3_L (SEQ ID NO: 76; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca)

[1002] (2) Prečišćavanje GPC3 ERY 17‑2 i GPC3 ERY 17‑3

[1004] Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je koncentrovana ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio svaki prečišćeni dizajnirani molekul.

[1006] (3) Citotoksična aktivnost GPC3 ERY 17‑2 i GPC3 ERY 17‑3

[1008] [0283] GPC3 ERY 17‑2 i GPC3 ERY 17‑3 su procenjeni na citotoksičnu aktivnost in vitro (Sl. 20). Rezultat je pokazao da oba molekula jasno pokazuju veću citotoksičnu aktivnost od GPC3 BiTE. Stoga, predmetni pronalazak po prvi put demonstrira da molekuli u kojima se anti-kancerski antigen IgG upotrebljava kao okosnica i jedan od Fab je supstituisan sa CD3 epsilon-vezujućim domenom, pokazuju citotoksičnu aktivnost uporedivu sa ili veću od aktivnosti BiTE.

[1010] (4) Test efikasnosti za GPC3 ERY17‑2 upotrebom PC‑10 modela transfera T-ćelija

[1012] GPC3 ERY17‑2, za koji je demonstrirano da ima citotoksičnu aktivnost uporedivu sa ili veću od aktivnosti GPC3 BiTE u in vitro testu, procenjen je na efikasnost in vivo upotrebom PC‑10 modela transfera T-ćelija. Specifično, test efikasnosti GPC3 ERY17‑2 upotrebom PC‑10 modela transfera T-ćelija sproveden je kao što sledi. T-ćelijska ekspanziona kultura sprovedena je upotrebom kompleta za aktivaciju/ekspanziju T-ćelija/humanih (MACS Miltenyi biotec) i PBMC izolovanih iz krvi koja je sakupljena od zdravih dobrovoljaca. Ćelije ćelijske linije humanog pločastog karcinoma pluća PC‑10 (Immuno-Biological Laboratories Co., Ltd.) (1 x 10<7>ćelija) pomešane su sa Matrigel matriksom bazalne membrane (BD), a zatim transplantirane subkutano u ingvinalnu regiju NOD scid miševa (CLEA Japan Inc.; ženke, 7W). Dan transplantacije označen je kao dan 0. Na dan pre transplantacije i dane 13, 17, 21, i 25, miševima je intraperitonealno primenjeno anti-asijalo-GM1 antitelo (Wako Pure Chemical Industries) u dozi od 0,2 mg/glavi. Na dan 13 posle transplantacije, miševi su grupisani prema veličini tumora i telesnoj težini. Na dan 14 posle transplantacije, T-ćelije koje su pripremljene ekspanzionom kulturom kao što je prethodno opisano transplantirane su u količini od 3 x 10<7>ćelija/glavi u peritonealnu duplju. Posle dva sata od transplantacije, GPC ERY17‑2 je intravenski primenjen u dozi od 30 µg/glavi. GPC ERY17‑2 je primenjen ukupno pet puta na dane 14, 15, 16, 17, i 18.

[1013] Rezultat je pokazao da je jasan antitumorski efekat takođe uočen u grupi kojoj je primenjen GPC3 ERY17‑2 iz ovog modela, u poređenju sa grupom kojoj je primenjen rastvarač (Sl.21).

[1014] Nalaz koji je prethodno opisan demonstrira da molekuli u kojima se anti-kancerski antigen IgG upotrebljava kao okosnica i jedan od Fab je supstituisan sa CD3 epsilonvezujućim domenom, proizvode jasan antitumorski efekat in vivo.

[1016] [Primer 8] Konstrukcija i procena GPC3 ERY17‑2-M20

[1018] (1) Konstrukcija GPC3 ERY17‑2-M20

[1019] Sledeće, konstruisan je molekul koji zadržava željenu aktivnost čak i posle izmena CD3 epsilon-vezujućeg domena. Konstruisan je GPC3 ERY17‑2-M20 (Sl. 19A) u kome je izmenjena sekvenca CD3 epsilon-vezujućeg domena. Specifično, upotrebljavajući kao templat ekspresioni vektor za anti-CD3 antitelo (M20), izveden je postupak koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće sekvence kao u postupcima koji su prethodno opisani, kako bi se proizveo niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira ERY17‑2-M20_Hh (SEQ ID NO: 77; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) ili ERY17‑2-M20_L (SEQ ID NO: 78; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[1021] (2) Prečišćavanje GPC3 ERY17‑2-M20

[1023] Ekspresioni vektori za GPC3 ERY8‑2_Hk, GPC3 ERY7_L, ERY17‑2-M20_Hh (SEQ ID NO: 77), i ERY17‑2-M20_L (SEQ ID NO: 78) kointrodukovani su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se GPC3 ERY17‑2-M20 prolazno eksprimirao. Rezultujući supernatant kulture je filtriran kroz od ϕ0,22 µm filter, a zatim je napunjen na uravnoteženu rProtein A Sepharose Fast Flow kolonu (GE Healthcare). Prečišćeni GPC3 ERY17‑2-M20 je dobijen koracima ispiranja 1 i 2, i korakom eluiranja 1 upotrebom pufera koji su pokazani u Tabeli 3.

[1025] [Tabela 3]

[1028]

[1031] (3) Citotoksična aktivnost GPC3 ERY17‑2-M20

[1033] [0289] GPC3 ERY17‑2-M20 je testiran na citotoksičnu aktivnost in vitro, i pokazao je citotoksičnu aktivnost uporedivu sa aktivnošću GPC3 ERY17‑2 (Sl. 22). Ovaj nalaz demonstrira da čak i molekuli koji imaju izmenjenu sekvencu u CD3 epsilon-vezujućem domenu imaju uporedivu citotoksičnu aktivnost.

[1035] [Primer 9] Konstrukcija i procena EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3

[1037] (1) Konstrukcija EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3

[1039] Sledeće, konstruisani su molekuli koji ciljno deluju na drugačiji antigen kancera ali zadržavaju željenu aktivnost. Proizvedeni su EpCAM ERY17‑2 (Sl. 19A), u kome je anti-GPC3 Fab u GPC3 ERY17‑2 zamenjen sa anti-EpCAM Fab, i EpCAM ERY17‑3 (Sl.19B), u kome je anti-GPC3 Fab u GPC3 ERY17‑3 zamenjen sa anti-EpCAM Fab. Specifično, upotrebljavajući kao templat ekspresioni vektor za anti-EpCAM antitelo, izveden je postupak koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan, kako bi se proizveo niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira EpCAM ERY17_Hk (SEQ ID NO: 79; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) ili EpCAM ERY17_L (SEQ ID NO: 80; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[1040] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[1042] R. Dizajnirani molekul: EpCAM ERY17‑2

[1043] Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su insertovani u ekspresione vektore: EpCAM ERY17_Hk (SEQ ID NO: 79; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), EpCAM ERY17_L (SEQ ID NO: 80; zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), ERY17‑2_Hh, i ERY17‑2_L

[1045] S. Dizajnirani molekul: EpCAM ERY17‑3

[1046] Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su insertovani u ekspresione vektore: EpCAM ERY17_Hk, EpCAM ERY17_L, ERY17‑3_Hh, i ERY17‑3_L

[1048] (2) Prečišćavanje EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3

[1049] Rezultujući supernatant kulture je napunjen na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je koncentrovana ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio svaki prečišćeni dizajnirani molekul.

[1051] (3) Citotoksična aktivnost EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3

[1053] EpCAM ERY17‑2 i EpCAM ERY17‑3 su testirani na citotoksičnu aktivnost in vitro i oba su pokazala jaku citotoksičnu aktivnost (Sl.23). Stoga, predmetni pronalazak demonstrira da molekuli u kojima se anti-kancerski antigen IgG upotrebljava kao okosnica i jedan od Fab je supstituisan sa CD3 epsilon-vezujućim domenom, imaju citotoksičnu aktivnost čak i kada je tip antigena kancera promenjen.

[1055] [Primer 10] Konstrukcija i procena bispecifičnih antitela sa moduliranom CH1/CL međupovršinskom asocijacijom

[1057] (1) Dizajn bispecifičnog antitela

[1059] Introdukovanjem mutacija u svaki od CH1 i CL domena bispecifičnog antitela i time moduliranjem CH1/CL međupovršinske asocijacije upotrebom odbijajućeg električnog naelektrisanja na CH1/CL interfejsu, može se dozvoliti da se dogodi specifična asocijacija između anti-GPC3 H lanca i L lanca i između anti-CD3 H lanca i L lanca. Kako bi se modulirala CH1/CL međupovršinska asocijacija upotrebom odbijajućeg električnog naelektrisanja, aminokiselinski ostaci u CH1 H lanaca ili CL L lanaca supstituisani su sa Lys, koji je pozitivno naelektrisan, ili sa Glu, koja je negativno naelektrisana.

[1061] (2) Konstrukcija ekspresionih vektora za gene antitela i ekspresija odgovarajućih antitela

[1063] Bispecifično antitelo (Sl. 24A) je kreirano moduliranjem CH1/CL međupovršinske asocijacije anti-CD3 antitela M12 (H lanac, SEQ ID NO: 81; L lanac, SEQ ID NO: 82) i anti-GPC3 antitela GC33(2) (H lanac, SEQ ID NO: 83; L lanac, SEQ ID NO: 84) i dodatnim

[1066] 1

[1067] introdukovanjem izbočine-u-udubljenja (KiH) modifikacija (WO 1996/027011; Ridgway JB et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617‑621), Merchant AM et al. (Nat. Biotechnol. (1998) 16, 677‑681)) u njih kako bi se izbegla međusobna asocijacija H lanaca. Takođe je konstruisano kontrolno bispecifično antitelo (Sl. 24B), u koje nisu introdukovane ni modulacija CH1/CL međupovršinske asocijacije niti modifikacije izbočine-u-udubljenja (KiH). Specifično, ekspresioni vektori koji kao insert imaju polinukleotid koji kodira M12_TH2h (SEQ ID NO: 85), u kome je nekoliko aminokiselina u CH1 H lanca M12 (SEQ ID NO: 81) supstituisano sa Lys, ili M12_TL17 (SEQ ID NO: 86), u kome je nekoliko aminokiselina u CL L lanca (SEQ ID NO: 82) supstituisano sa Glu, konstruisani su pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci. Slično tome, ekspresioni vektori koji kao insert imaju polinukleotid koji kodira GC33(2)_TH13k (SEQ ID NO:87) ili GC33(2)_TH15k (SEQ ID NO:88), u kojima je nekoliko aminokiselina u CH1 H lanca GC33(2) (SEQ ID NO: 83) supstituisano sa Glu, ili GC33(2)_TL16 (SEQ ID NO: 89) ili GC33(2)_TL19 (SEQ ID NO: 90), u kojima je nekoliko aminokiselina u CL L lanca (SEQ ID NO: 84) supstituisano sa Lys, konstruisani su pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci.

[1068] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[1070] T. Dizajnirani imolekul: GM1

[1071] Ekspresioni vektori: M12_TH2h (SEQ ID NO: 85), M12_TL17 (SEQ ID NO: 86), GC33(2)_TH13k (SEQ ID NO: 87), i GC33(2)_TL16 (SEQ ID NO: 89)

[1073] U. Dizajnirani molekul: GM2

[1074] Ekspresioni vektori: M12_TH2h (SEQ ID NO: 85), M12_TL17 (SEQ ID NO: 86), GC33(2)_TH15k (SEQ ID NO: 88), i GC33(2)_TL19 (SEQ ID NO: 90)

[1076] V. Dizajnirani molekul: GM0

[1077] Ekspresioni vektori: H lanac M12 (SEQ ID NO: 81), L lanac M12 (SEQ ID NO: 82), H lanac GC33(2) (SEQ ID NO: 83), i L lanac GC33(2) (SEQ ID NO: 84)

[1079] Iz rezultujućeg supernatanta kulture, antitela su prečišćena pomoću postupka koji je poznat onima sa iskustvom u struci upotrebom rProtein A Sepharose™ Fast Flow (GE Healthcare).

[1082] 1 1

[1083] (3) Citotoksična aktivnost GM1, GM2, i GM0

[1085] Polipeptidni kompleksi GM1, GM2, i GM0 procenjeni su na citotoksičnu aktivnost in vitro. Rezultat je pokazao da GM1 i GM2 pokazuju uporedivu citotoksičnu aktivnost, i ova aktivnost je bila jasno veća od aktivnosti GM0 (Sl. 25). Stoga, predmetni pronalazak demonstrira da kombinacija modulacije CH1/CL međupovršinske asocijacije i KiH modifikacija omogućava efikasnu proizvodnju bispecifičnih antitela.

[1087] [Primer 11] Konstrukcija i procena EGFR ERY17‑2

[1089] (1) Konstrukcija EGFR ERY17‑2

[1091] Štaviše, pripremljen je molekul koji ima željenu aktivnost koja cilja drugi antigen kancera. EGFR ERY17‑2 (Sl. 19A) je konstruisan zamenom anti-GPC3 Fab iz GPC3 ERY17‑2 sa anti-EGFR Fab. Specifično, upotrebljavajući kao templat ekspresioni vektor za anti-EGFR antitelo, izveden je postupak koji je poznat onima sa iskustvom u struci, kao što je PCR upotrebom prajmera koji sadrže iste odgovarajuće sekvence kao u postupku koji je prethodno opisan, kako bi se proizveo niz ekspresionih vektora u koje je insertovan polinukleotid koji kodira EGFR ERY17_Hk (SEQ ID NO: 91: zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca) ili EGFR ERY17_L (SEQ ID NO: 92: zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca).

[1092] Sledeće kombinacije ekspresionih vektora introdukovane su u FreeStyle293-F ćelije kako bi se svaki dizajnirani molekul prolazno eksprimirao.

[1094] W. Dizajnirani molekul: EGFR ERY17‑2

[1096] Polipeptidi kodirani polinukleotidima koji su insertovani u ekspresione vektore: EGFR ERY17_Hk (SEQ ID NO: 91: zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), EGFR ERY17_L (SEQ ID NO: 92: zrela sekvenca ne sadrži 19 aminokiselina na amino terminusu koje služe kao signalna sekvenca), ERY17‑2_Hh, i ERY17‑2_L.

[1098] (2) Prečišćavanje EGFR ERY17‑2

[1101] 1 2

[1102] Rezultujući supernatanti kulture su napunjeni na Anti FLAG M2 kolonu (Sigma). Posle ispiranja, kolona je eluirana sa 0,1 mg/ml FLAG peptida (Sigma). Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je napunjena na HisTrap HP kolonu (GE Healthcare). Posle ispiranja, kolona je eluirana gradijentom koncentracija imidazola. Frakcija koja sadrži dizajnirani molekul je koncentrovana ultrafiltracijom. Zatim, frakcija je napunjena na Superdex 200 kolonu (GE Healthcare). Samo monomerna frakcija je sakupljena iz eluata kako bi se dobio svaki prečišćeni dizajnirani molekul.

[1104] (3) Citotoksična aktivnost EGFR ERY17‑2

[1106] EGFR ERY17‑2 je testiran na citotoksičnu aktivnost in vitro, i pokazao je jaku citotoksičnu aktivnost (Sl. 26). Stoga, predmetni pronalazak demonstrira da molekuli u kojima se anti-kancerski antigen IgG upotrebljava kao okosnica i jedan od Fab je supstituisan sa CD3 epsilon-vezujućim domenom, imaju citotoksičnu aktivnost čak i kada je antigen kancera GPC3 ili EpCAM ili je tip antigena kancera dodatno promenjen.

[1108] Industrijska primenljivost

[1110] Predmetni pronalazak obezbeđuje nove polipeptidne komplekse za upotrebu kao što je specificirano u patentnim zahtevima koji zadržavaju snažnu antitumorsku aktivnost BiTE i imaju dug poluživot u krvi, kao i odlična bezbednosna svojstva koja ne rezultuju indukovanjem citokinske oluje nezavisne od antigena kancera ili slično. Kada se antigenvezujući domen polipeptidnog kompleksa za upotrebu iz predmetnog pronalaska supstituiše, terapijski agensi koji sadrže polipeptidni kompleks kao aktivni sastojak za indukovanje ćelijske citotoksičnosti mogu ciljati i oštetiti različite ćelije, uključujući ćelije kancera. Stoga, mogu se lečiti ili sprečiti različiti kanceri. Ovo omogućava poželjna lečenja koja su veoma bezbedna i pogodna, i redukuju fizičko opterećenje za pacijente.

[1113] 1

Claims (10)

1. Patentni zahtevi

1. Polipeptidni kompleks za upotrebu u postupku za lečenje kancera, naznačeno time što postupak sadrži korak primene polipeptidnog kompleksa subjektu, pri čemu polipeptidni kompleks usvaja citotoksičnost kao svoju antitumorsku aktivnost regrutovanjem T-ćelija kao efektorskih ćelija, i polipeptidni kompleks ne indukuje citokine na način nezavisan od antigena kancera,

pri čemu navedeni polipeptidni kompleks sadrži:

(a) monovalentni Fab domen za vezivanje za antigen kancera, pri čemu antigen kancera nije CD3; i

(b) monovalentni Fab domen za vezivanje za kompleks T-ćelijskog receptora, koji vezuje CD3; i

(c) Fc domen za produženje poluživota u krvi;

pri čemu Fc domen sadrži mutacije L234A, L235A, i/ili N297A u aminokiselinama Fc domena SEQ ID NO: 23 u skladu sa EU numerisanjem, pri čemu mutirani Fc domen ima redukovanu aktivnost vezivanja za Fcy receptor u poređenju sa kontrolnim polipeptidnim kompleksom koji ima Fc domen SEQ ID NO: 23.

2. Polipeptidni kompleks za upotrebu prema patentnom zahtevu 1,

naznačen time što su mutacija(e) u Fc domenu odabrane od sledećeg: supstitucija(e) na bilo kojoj od sledećih pozicija: 220, 226, 229, 231, 232, 233, 234,

235, 236, 237, 238, 239, 240, 264, 265, 266, 267, 269, 270, 295, 296, 297, 298, 299,

300, 325, 327, 328, 329, 330, 331, i 332, pri čemu su pozicije u skladu sa EU numerisanjem.

3. Polipeptidni kompleks za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 2, naznačen time što je aktivnost vezivanja za Fcy receptor 50% ili manje, poželjno 45% ili manje, 40% ili manje, 35% ili manje, 30% ili manje, 20% ili manje, ili 15% ili manje, i posebno poželjno 10% ili manje, 9% ili manje, 8% ili manje, 7% ili manje, 6% ili

manje, 5% ili manje, 4% ili manje, 3% ili manje, 2% ili manje, ili 1% ili manje od aktivnosti kontrolnog polipeptidnog kompleksa koji sadrži Fc domen SEQ ID NO: 23.

4. Polipeptidni kompleks za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time što su sekvence dva polipeptida koji formiraju Fc domen međusobno različite.

5. Polipeptidni kompleks naznačen time što je za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4,

1) pri čemu je aminokiselina na poziciji 349 supstituisana cisteinom i aminokiselina na poziciji 366 u skladu sa EU numerisanjem je supstituisana triptofanom među aminokiselinskim ostacima jednog od dva polipeptida koji formiraju Fc domen; i pri čemu je aminokiselina na poziciji 356 supstituisana cisteinom, aminokiselina na poziciji 366 je supstituisana serinom, aminokiselina na poziciji 368 je supstituisana alaninom, i aminokiselina na poziciji 407 u skladu sa EU numerisanjem je supstituisana valinom među aminokiselinskim ostacima drugog polipeptida, naročito pri čemu je izvršena delecija sekvence GK sa karboksilnih terminusa dva polipeptida koji formiraju Fc domen,

ili

2) pri čemu je aminokiselina na poziciji 356 u skladu sa EU numerisanjem supstituisana lizinom među aminokiselinskim ostacima jednog od dva polipeptida koji formiraju Fc domen; aminokiselina na poziciji 439 u skladu sa EU numerisanjem je supstituisana glutaminskom kiselinom u drugom polipeptidu; i aminokiselina na poziciji 435 u skladu sa EU numerisanjem je supstituisana argininom među aminokiselinskim ostacima bilo kog od dva polipeptida, naročito pri čemu je izvršena delecija sekvence GK sa karboksilnih terminusa dva polipeptida koji formiraju Fc domen.

6. Polinukleotid naznačen time što kodira polipeptidni kompleks prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5.

7. Vektor naznačen time što sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 6.

8. Ćelija domaćin naznačena time što sadrži vektor prema patentnom zahtevu 7.

1

9. Postupak za proizvodnju polipeptidnog kompleksa, koji je naznačen time što sadrži kultivaciju ćelije prema patentnom zahtevu 8 i izolovanje polipeptidnog kompleksa iz supernatanta kulture.

10. Polipeptidni kompleks za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačenо time što je kancer kancer jetre ili kancer pluća.

1