ES2694131T3 - Plantas de Brassica híbridas y métodos para producir las mismas - Google Patents

Abstract

Una planta de colza oleaginosa que comprende en su genoma nuclear al menos una copia del evento de élite MSB2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de élite en la ATCC con el número de depósito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850 y al menos una copia del evento de élite RF-BN1, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de élite en la ATCC con el número de depósito ATCC_PTA- 730, en la que dicha planta de colza oleaginosa pertenece a la especie Brassica napus o Brassica juncea.

Description

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DESCRIPCION

Plantas de Brassica hibridas y metodos para producir las mismas Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a plantas, material vegetal y semillas de Brassica transgenica, en particular a plantas de colza oleaginosa, caracterizadas porque estas plantas albergan una combinacion de dos eventos de transformacion especificos, en particular por la presencia de un gen de esterilidad masculina, en una ubicacion especifica en el genoma de Brassica y un gen de restablecimiento de la fertilidad en otra ubicacion especifica en el genoma de Brassica. La invencion tambien se refiere a una pareja de plantas de Brassica transgenica, en particular plantas de colza oleaginosa, que son particularmente adecuadas para la produccion de semillas hibridas. Mas especificamente, una de las plantas se caracteriza por ser esteril-masculina, debido a la presencia en su genoma de un gen de esterilidad masculina, mientras que la otra se caracteriza por tener un gen restablecedor de la fertilidad, capaz de evitar la actividad del gen de esterilidad masculina. La pareja de plantas de Brassica de la invencion combina la capacidad de formar semillas hibridas con un rendimiento agronomico global optimo, estabilidad genetica y adaptabilidad a diferentes acervos geneticos.

Antecedentes de la invencion

La expresion fenotipica de un transgen en una planta esta determinada tanto por la estructura del propio gen como por su ubicacion en el genoma de la planta. Al mismo tiempo, la presencia del transgen (en un ADN extrano) en diferentes ubicaciones en el genoma influira en el fenotipo global de la planta de diferentes maneras. La introduccion satisfactoria desde el punto de vista agronomico o industrial de un rasgo comercialmente interesante en una planta mediante manipulacion genetica puede ser un procedimiento largo que depende de diferentes factores. La transformacion y regeneracion reales de plantas transformadas geneticamente son solo las primeras de una serie de etapas de seleccion que incluyen la caracterizacion genetica exhaustiva, la reproduccion y la evaluacion en ensayos de campo.

El termino "colza" incluye todas las semillas de la especie Brassica. Brassica se cultiva desde China e India hasta Finlandia y Canada como uno de los cultivos de aceite mas valiosos. La mayoria de los tipos de Brassica pertenecen a la familia de las cruciferas. Se originaron como una especie diploide que tiene un numero de cromosomas aneuploides que varia de 7 (Brassica fruticulosa) a 12 (Sinapsis alba). La especie de Brassica mas cultivada en Canada se conoce como nabina o Brassica campestris (aa, n = 10). Brassica oleracea (cc, n = 9) se ha diversificado en la historia evolutiva reciente en al menos seis tipos horticolas principales, incluyendo el brocoli, la coliflor y el repollo. La Brassica nigra (bb, n = 8) o mostaza negra es un cultivo menos importante comercialmente y es conocida principalmente por sus semillas de las que se hizo originariamente la mostaza. De estos tipos basicos, han derivado hibridos anfiploides en etapas evolutivas mas recientes por entrecruzamiento. De estos, los mas importantes son Brassica napus (aacc), del cual los tipos de invierno proporcionan los rendimientos de colza mas altos en el norte de Europa y Brassica juncea (aabb) o mostaza parda, que es uno de los principales cultivos de aceite del subcontinente indio. Aunque el entrecruzamiento entre diferentes especies de Brassica (en particular aquellas con genomas compatibles) es posible y con frecuencia se hace con fines de reproduccion, no todos los rasgos (o genes) seran susceptibles de transferirse de una especie a la otra ni, cuando se transfieran a una especie diferente, conservaran caracteristicas identicas (o patrones de expresion). Por tanto, un locus genetico que confiere la expresion optima de un gen natural o quimerico en una especie de Brassica, no necesariamente tendra el mismo efecto en otra.

Las especies de Brassica son bisexuales y normalmente el 60-70 % se autopolinizan. La produccion de hibridos y la introduccion de la variacion genetica como base para la seleccion dependian tradicionalmente de la adaptacion de fenomenos de origen natural tales como la autoincompatibilidad y la esterilidad masculina citoplasmica. No se aplican ampliamente en la reproduccion de Brassica metodos de control de la polinizacion artificial, tales como la emasculacion manual o el uso de gametocidas, debido a su practicabilidad limitada y alto coste, respectivamente.

Se han desarrollado metodos transgenicos para la produccion de plantas masculinas o esteriles-femeninas, que proporcionan alternativas interesantes a las tecnicas tradicionales.

El documento EP 0.344.029 describe un sistema para obtener esterilidad masculina nuclear por el que las plantas se transforman con un gen de esterilidad masculina, que comprende, por ejemplo, un ADN que codifica una molecula de barnasa bajo el control de un promotor TA29 especifico del tapete, que cuando se incorpora en una planta garantiza una destruccion selectiva de las celulas del tapete. La transformacion de plantas de tabaco y colza oleaginosa con un gen de este tipo dio como resultado plantas en las que se evito completamente la formacion de polen (Mariani et al. 1990, Nature 347: 737-741).

De Block y De Brouwer (1993, Planta 189: 218-225) describen el analisis citoquimico e histoquimico del desarrollo de antera de plantas de Brassica napus que comprenden el gen quimerico PTA29:barnasa.

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Para restablecer la fertilidad en la progenie de una planta esteril-masculina, se desarrollo un sistema por el que la planta esteril-masculina se cruza con una planta transgenica que lleva un gen restablecedor de la fertilidad, que cuando se expresa es capaz de inhibir o evitar la actividad del gen de esterilidad masculina (documento US 5.689.041; documento US 5.792.929; De Block y De Brouwer, citado anteriormente). El uso de genes correguladores en la produccion de plantas esteriles-masculinas para aumentar la frecuencia de transformantes que tengan un buen rendimiento agronomico se describe en el documento WO 96/26283. Normalmente, cuando el ADN de esterilidad codifica una barnasa, el ADN corregulador codificara una barstar.

Se ha descrito exhaustivamente el Evento de Elite MS-B2 y plantas esteriles-masculinas que comprenden este evento de elite que confiere esterilidad masculina en el documento WO01/31042, incluyendo la caracterizacion del transgen y de las secuencias de ADN de la planta que flanquean inmediatamente el transgen insertado.

La semilla de referencia que comprende el evento de elite MS-B2 se deposito en la ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) el 14 de octubre de 1999, con el numero de acceso de la ATCC PTA-850. Otra muestra de la misma semilla se deposito con el numero de acceso PTA-2485. Un nombre alternativo para MS-B2 es MS 11.

Se ha descrito exhaustivamente el Evento de Elite RF-BN1 y plantas que comprenden este evento de elite que confiere esterilidad masculina en el documento WO01/41558, incluyendo la caracterizacion del transgen y de las secuencias de ADN de la planta que flanquean inmediatamente el transgen insertado.

La semilla de referencia que comprende el evento de elite RF-BN1 se deposito en la ATCC (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209) el 20 de septiembre de 1999, con el numero de acceso de la ATCC PTA-730. Un nombre alternativo para RF-BN1 es Rf 3.

El documento WO01/41558 tambien describe el evento de elite MS-BN1, plantas esteriles masculinas que comprenden el evento, asi como metodos para identificar dichas plantas y la progenie de las mismas. Un nombre alternativo para MS-BN1 es MS 8.

Los eventos MS-BN1 y RF-BN1 estan comprendidos en plantas hibridas de B. napus que se comercializan con el nombre comercial In Vigor® Canola.

Estos documentos mencionados anteriormente no describen la combinacion particular MS-B2 y RF-BN1 en plantas de Brassica ni el uso de la misma en la produccion de semillas hibridas. Tampoco se ha descrito hasta ahora RF- BN1 en Brassica juncea, asi como tampoco el uso de MS-B2 para aumentar el rendimiento de plantas de semillas oleaginosas de Brassica.

Sumario de la invencion

En una realizacion, la invencion proporciona una planta de colza oleaginosa, que es una planta de Brassica napus o Brassica juncea, que comprende en su genoma nuclear al menos una copia del evento de elite MS-B2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850 y al menos una copia del evento de elite RF-BN1, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730. Tambien se proporcionan celulas o tejidos o semillas de dichas plantas de colza oleaginosa.

Tambien se proporciona una celula o tejido o semilla de la planta de colza oleaginosa de acuerdo con la invencion que comprende en su genoma nuclear al menos una copia del evento de elite MS-B2 y al menos una copia del evento de elite RF-BN1.

En otra realizacion mas de la invencion, se proporciona una pareja de plantas de colza oleaginosa, consistiendo dicha pareja en dos plantas de colza oleaginosa en combinacion, adecuada para su uso en la produccion de semillas hibridas mediante cruce entre si, en la que una de las plantas de colza oleaginosa es una planta de colza oleaginosa hembra esteril-masculina que comprende el evento de elite MS-B2 que comprende un gen de esterilidad masculina, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850, y siendo la otra de dichas plantas de colza oleaginosa una planta de colza oleaginosa fertil-masculina que comprende el evento de elite RF-BN1 que comprende un gen de restablecimiento de la fertilidad, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730, en la que la planta que comprende el evento de elite RF-BN1 tiene la capacidad de restablecer la fertilidad en plantas que comprenden el evento de elite MS-B2.

Tambien es un objeto de la invencion proporcionar ADN genomico de una planta de colza oleaginosa, que es la planta de Brassica napus o Brassica juncea, que comprende en su genoma nuclear al menos una copia del evento de elite elite MS-B2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA850 y al menos una copia del evento de elite RF-BN1,

estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730.

La invencion tambien proporciona Brassica juncea, asi como celulas y semillas de la misma, que comprenden el evento de elite RF-BN1, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la 5 ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA730. Dichas plantas pueden comprender adicionalmente el evento de elite MS-B2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850.

Se describe adicionalmente el uso del evento de elite MS-B2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850 para 10 aumentar el rendimiento de semillas en una planta de colza oleaginosa transgenica tal como una planta de Brassica juncea.

Tambien se describe un metodo para aumentar el rendimiento en plantas de colza oleaginosa que comprende la etapa de proporcionar a la planta de colza oleaginosa un evento de elite MS-B2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC 15 _PTA-850.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: Comparacion del vigor, despues de la aplicacion, de herbicidas de estirpes de B. napus hibrida MS/RF. Panel A: sin aplicacion de glufosinato de amonio. Panel B: una aplicacion de glufosinato de amonio. Panel C: dos aplicaciones de glufosinato de amonio. Cuadrados: plantas MS-BN1/RF-BN1; Puntos: plantas MS-B2/RF-BN1.

20 Figura 2: Comparacion del rendimiento, despues de la aplicacion de herbicidas, de estirpes de B. napus hibridas MS/RF. Panel A: sin aplicacion de glufosinato de amonio. Panel B: una aplicacion de glufosinato de amonio. Panel C: dos aplicaciones de glufosinato de amonio. Barras de color gris oscuro: plantas MS-BN1/RF-BN1; Barras de color gris claro: plantas MS-B2/RF-BN1. Loci a Loc5: ubicaciones de ensayo de campo; PROM: promedio en todas las ubicaciones. El rendimiento se presenta como % en comparacion con plantas MS-BN1/RF-BN1 establecidas como 25 el 100 %.

Descripcion detallada

La presente invencion describe una nueva combinacion de un evento de esterilidad masculina MS-B2 y un evento de restablecimiento de la fertilidad RF-BN1 en plantas de colza oleaginosa, en particular Brassica napus y Brassica juncea.

30 La presente invencion se basa, entre otras cosas, en el hallazgo inesperado de que el evento de elite RF-BN1 que confiere restablecimiento de la fertilidad es suficientemente eficaz en las plantas de colza oleaginosa Brassica para restablecer la fertilidad cuando la planta tambien contiene adicionalmente el evento de elite MS-B2 que confiere esterilidad masculina. Aunque RF-BN1 se ha utilizado anteriormente satisfactoriamente para restablecer la fertilidad en plantas de colza oleaginosa, que comprendian el evento de elite MS-BN1, era impredecible si RF-BN1 tambien 35 podria usarse para restablecer la fertilidad en plantas de colza oleaginosa que comprendieran el evento de elite MS- B2. Los diferentes eventos de elite que comprenden esterilidad masculina tienen diferentes niveles de expresion del producto barnasa expresado por el gen de esterilidad masculina transgenico y no puede predecirse que los niveles de inhibidor de la barnasa, barstar, producidos por el gen de restablecimiento de la fertilidad transgenico en RF-BN1 igualen la expresion de la barnasa en otros eventos individuales de esterilidad masculina. Como se indica en los 40 ejemplos a continuacion, la combinacion de la presente invencion dio como resultado rendimientos intrinsecamente mas altos que la combinacion del mismo evento de esterilidad masculina MS-B2 con otros eventos de restablecimiento de la fertilidad.

Ademas, se ha descrito previamente que RF-BN1 esta ubicado en el genoma C (vease el documento WO 01/31042; vease tambien, por ejemplo,
www.agbios.com/dbase.php?action=showProd&data=MS8xRF3. En consecuencia, la 45 introduccion de RF-BN1 de B. napus (aacc) en B. juncea (aabb) que no contiene un genoma C no se consideraria sencilla por el experto en la materia. La presente memoria descriptiva proporciona datos de que RF-BN1 se ubica sin embargo en el genoma A, permitiendo la introduccion en B. juncea mediante cruce.

Ademas, los ensayos de campo han descubierto que la presencia de MS-B2 aumenta el rendimiento promedio (rendimiento de grano) cuando se compara con una estirpe de plantas isogenicas que no contienen MS-B2.

50 En el presente documento se describe un metodo para producir semillas hibridas a partir de plantas de colza oleaginosa, tales como Brassica napus o Brassica juncea, que comprende las etapas de

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- proporcionar una planta de colza oleaginosa parental femenina esteril-masculina que comprenda el evento de elite MS-B2 que comprende un gen de esterilidad masculina,

- proporcionar una planta de colza oleaginosa parental masculina fertil-masculina que comprenda el evento de elite RF-BN1 que comprende un gen de restablecimiento de la fertilidad, preferentemente en forma homocigotica;

- permitir que el polen de la planta de colza oleaginosa parental masculina polinice la planta de colza oleaginosa parental femenina; y

- cosechar semillas hibridas de la planta parental femenina.

El termino "gen" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier secuencia de ADN que comprenda varios fragmentos de ADN unidos operativamente tal como un promotor y una region no traducida 5' (la 5'UTR), que juntos forman la region promotora, una region codificante (que puede o puede no codificar una proteina) y una region 3' sin traducir (3'UTR) que comprende un sitio de poliadenilacion. Normalmente, en celulas vegetales, la 5'UTR, la region codificante y la 3'UTR se transcriben en un ARN que, en el caso de un gen que codifica proteina, se traduce en la proteina. Un gen puede incluir fragmentos de ADN adicionales tales como, por ejemplo, intrones. Como se usa en el presente documento, un locus genetico es la posicion de un gen dado en el genoma de una planta.

El termino "quimerico" cuando se refiere a un gen o secuencia de ADN se usa para indicar que el gen o secuencia de ADN comprende al menos dos fragmentos de ADN funcionalmente relevantes (tales como promotor, 5'UTR, region codificante, 3'UTR, intron) que no estan naturalmente asociados entre si y provienen, por ejemplo, de diferentes fuentes. "Extrano" referido a un gen o una secuencia de ADN con respecto a una especie de planta se usa para indicar que el gen o la secuencia de ADN no se encuentra de forma natural en esa especie de planta, o no se encuentra de forma natural en ese locus genetico en esa especie de planta. La expresion "ADN extrano" se usara en el presente documento para referirse a una secuencia de ADN que se ha incorporado en el genoma de una planta como resultado de la transformacion. El "ADN transformante", como se usa en el presente documento, se refiere a una molecula de ADN recombinante utilizada para la transformacion. El ADN transformante, por lo general, comprende al menos un "gen de interes" (por ejemplo, un gen quimerico) que es capaz de conferir una o mas caracteristicas especificas a la planta transformada. La expresion "molecula de ADN recombinante" se usa para ejemplificar y, por tanto, puede incluir, una molecula de acido nucleico aislada que puede ser ADN y que puede obtenerse a traves de procedimientos recombinantes u otros.

Como se usa en el presente documento, el termino "transgen" se refiere a un gen de interes que se incorpora en el genoma de una planta. Una "planta transgenica" se refiere a una planta que comprende al menos un transgen en el genoma de todas sus celulas.

El ADN extrano presente en las plantas de la presente invencion comprendera preferentemente dos genes de interes, mas especificamente, un gen de esterilidad masculina y un gen de resistencia a herbicidas, o un gen restablecedor de la fertilidad y un gen de resistencia a herbicidas.

Un "gen de esterilidad masculina" como se usa en el presente documento se refiere a un gen que tras la expresion en la planta hace que la planta sea incapaz de producir polen viable y fertil. Un ejemplo de un gen de esterilidad masculina es un gen que comprende una secuencia de ADN que codifica barnasa, bajo el control de un promotor que dirige la expresion en celulas del tapete. Mas especificamente, de acuerdo con la presente invencion, el gen de esterilidad masculina es "TA29-barnasa" como se describe en el presente documento.

Un "gen restablecedor de la fertilidad", como se usa en el presente documento se refiere a un gen que tras la expresion en una planta que comprende un gen de esterilidad masculina, es capaz de evitar la expresion fenotipica del gen de esterilidad masculina, restaurando la fertilidad en la planta. Mas especificamente, el gen restablecedor de la fertilidad comprendera un ADN que codifique una proteina o polipeptido capaz de evitar la expresion fenotipica del gen de esterilidad masculina, bajo el control de un promotor que dirija la expresion en al menos las celulas en las que se expresa el ADN de esterilidad masculina. Mas especificamente, de acuerdo con la presente invencion, el gen restablecedor de la fertilidad es "TA29-barstar" como se describe en el presente documento.

La incorporacion de una molecula de ADN recombinante en el genoma de la planta normalmente es resultado de la transformacion de una celula o tejido (o de otra manipulacion genetica). El sitio particular de incorporacion se debe ya sea al azar o esta en una ubicacion predeterminada (si se usa un proceso de integracion dirigida).

El ADN extrano puede caracterizarse por la ubicacion y la configuracion en el sitio de incorporacion de la molecula de ADN recombinante en el genoma de la planta. El sitio en el genoma de la planta donde se ha insertado un ADN recombinante tambien se denomina "sitio de insercion" o "sitio diana". La insercion del transgen en el genoma de la planta puede asociarse a una supresion del ADN de la planta, denominada "supresion del sitio diana". Una "region flanqueante" o "secuencia flanqueante" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de al menos 20 pb, preferentemente al menos 50 pb y hasta 5000 pb del genoma de la planta que se ubica ya sea inmediatamente corriente arriba y contigua, o inmediatamente corriente abajo y contigua, al ADN extrano. Los procedimientos de transformacion que conducen a la integracion aleatoria del aDn extrano daran como resultado

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transformantes con diferentes regiones flanqueantes, que son caracteristicas y unicas para cada transformante. Cuando el transgen se introduce en una planta a traves del cruce tradicional, su sitio de insercion en el genoma de la planta o sus regiones flanqueantes generalmente no cambiaran. Una "region de insercion" como se usa en el presente documento se refiere a la region que corresponde a la region de al menos 40 pb, preferentemente al menos 100 pb y hasta mas de 10000 pb, abarcada por las regiones flanqueantes corriente arriba y corriente abajo de un transgen en el genoma de la planta (sin transformar) e incluye el sitio de insercion (y la posible supresion del sitio diana). Teniendo en cuenta las diferencias menores debidas a mutaciones dentro de una especie, una region de insercion conservara al menos el 85 %, preferentemente el 90 %, mas preferentemente el 95 % y mucho mas preferentemente el 100 % de identidad de secuencia con la secuencia que comprende las regiones flanqueantes corriente arriba y corriente abajo del ADN extrano en una planta dada de esa especie.

La expresion de un gen de interes se refiere al hecho de que el gen confiere a la planta uno o mas rasgos fenotipicos (por ejemplo, tolerancia a herbicidas) que se pretendian conferir mediante la introduccion de la molecula de ADN recombinante, el ADN transformante, utilizado durante la transformacion (basandose en la estructura y la funcion de una parte del gen o todo el gen o los genes de interes).

Un "evento" se define como un locus genetico (artificial) que, como resultado de la manipulacion genetica, transporta un ADN extrano que comprende al menos una copia del gen o los genes de interes. Los estados alelicos habituales de un evento son la presencia o ausencia del ADN extrano. Como se usa en el presente documento, un evento "MS" y un evento "RF" se referiran a eventos que llevan los transgenes "TA29-barnasa" y "TA29-barstar" respectivamente. Un evento se caracteriza fenotipicamente por la expresion de uno o mas transgenes. A nivel genetico, un evento es parte de la composicion genetica de una planta. A nivel molecular, un evento se caracteriza por el mapa de restriccion (por ejemplo, determinado por transferencia Southern) y/o por las secuencias flanqueantes corriente arriba y/o corriente abajo del transgen, y/o la configuracion molecular del transgen. Por lo general, la transformacion de una planta con un ADN transformante que comprende al menos un gen de interes conduce a una multitud de eventos, cada uno de los cuales es unico.

Un "evento de elite", como se usa en el presente documento, es un evento que se selecciona entre un grupo de eventos, obtenidos por transformacion con el mismo ADN transformante o mediante retrocruce con plantas obtenidas mediante dicha transformacion, basandose en la expresion y estabilidad del transgen y su compatibilidad con las caracteristicas agronomicas optimas de la planta que lo comprende. Por tanto, los criterios para la seleccion de eventos de elite son uno o mas, preferentemente dos o mas, ventajosamente todos los siguientes:

a) Que la presencia del transgen no comprometa otras caracteristicas deseadas de la planta, tales como las relacionadas con el rendimiento agronomico o el valor comercial;

b) Que el evento se caracterice por una configuracion molecular bien definida que se herede de manera estable y para la que puedan desarrollarse herramientas de diagnostico apropiadas para el control de identidad;

c) Que el gen o los genes de interes en el transgen muestren una expresion fenotipica espacial y temporal correcta, apropiada y estable, tanto en condiciones heterocigoticas (o hemicigoticas) como homocigoticas del evento, a un nivel aceptable comercialmente en una gama de condiciones ambientales a las que las plantas que llevan el evento se expongan posiblemente en el uso agronomico normal.

Se prefiere que el ADN extrano se asocie a una posicion en el genoma de la planta que permita la introgresion a acervos geneticos comerciales deseados.

El estado de un evento como un evento de elite se confirma mediante la introgresion del evento de elite en diferentes acervos geneticos relevantes y observando el cumplimiento de uno, dos o todos los criterios, por ejemplo, a), b) y c) anteriores.

Adicionalmente, para los transgenes que codifican la esterilidad masculina y el restablecimiento de la fertilidad que se describen en el presente documento, la seleccion de los eventos de elite tambien se determinara basandose en la compatibilidad entre estos eventos, mas especificamente en que la progenie resultante de un cruce entre una planta que lleva un evento de esterilidad masculina y una planta que lleva un evento restablecedor de la fertilidad, en la que ambos eventos estan presentes, tenga las siguientes caracteristicas:

a) expresion fenotipica adecuada del fenotipo restablecido de fertilidad, es decir, fertilidad masculina; y

b) expresion fenotipica a un nivel comercialmente aceptable en un intervalo de condiciones ambientales a las que las plantas que llevan los dos eventos probablemente esten expuestas en el uso agronomico normal.

Por tanto, un "evento de elite" se refiere a un locus genetico que comprende un transgen, que responde a los criterios descritos anteriormente. Una planta, material vegetal o progenie, tal como las semillas, pueden comprender uno o mas eventos de elite en su genoma.

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El evento Elite MS-B2 se ha caracterizado exhaustivamente como se describe en el documento WO 01/31042 (veanse en particular los ejemplos 1 y 3). El ADN transformante se ha descrito en el Ejemplo 1. Las secuencias flanqueantes de ADN de la planta despues de la insercion del transgen se han aislado e identificado (vease el documento WO 01/31042, en particular, los ejemplos 3.2, asi como las SEQ ID NO: 1 y 2). Tambien se ha descrito una PCR de diagnostico que permite la identificacion del evento de elite MS-B2 en material biologico en el documento WO 01/31042, en particular en el Ejemplo 5. Cuando el evento de elite MS-B2 esta presente en plantas, celulas, semillas o tejidos de Brassica, el ADN genomico del mismo puede usarse para amplificar un fragmento de ADN de entre 160 y 200 pb, en particular de aproximadamente 183 pb, usando una reaccion en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tengan la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente. La semilla de referencia se ha depositado en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-850 o PTA-2485. Un nombre alternativo para el evento de Elite MS-B2 es MS 11.

El evento de elite RF-BN1 se ha caracterizado exhaustivamente como se describe en el documento WO 01/41558 (veanse en particular los ejemplos 1b y 4.2.2). El ADN transformante se ha descrito en el Ejemplo 1b. Las secuencias flanqueantes de ADN de la planta despues de la insercion del transgen se han aislado e identificado (vease el documento WO 01/31042, en particular, los ejemplos 4.2.2, asi como las SEQ ID NO: 5 y 6). Tambien se ha descrito una PCR de diagnostico que permite la identificacion del evento de elite RF-BN1 en material biologico en el documento WO 01/41558, en particular, en el Ejemplo 5.2. Cuando el evento de elite RF-BN1 esta presente en las plantas, celulas, semillas o tejidos de Brassica, el ADN genomico del mismo puede usarse para generar un fragmento de ADN de entre 195 y 235 pb, en particular de 215 pb, usando una reaccion en cadena de la polimerasa con dos cebadores que tengan la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 7 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente. La semilla de referencia se ha depositado en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730. Los nombres alternativos para RF-BN1 son RF3 o ACS-BN003-6.

Las plantas que albergan RF-BN1 o MS-B2, por ejemplo, pueden obtenerse de las semillas depositadas en la ATCC. Dichas plantas pueden propagarse adicionalmente y/o pueden usarse en un esquema de reproduccion convencional para introducir el evento de elite de la invencion en otros cultivares de la misma especie de planta. Las semillas depositadas pertenecen a la especie Brassica napus. Sin embargo, los metodos para introducir alelos o transgenes ubicados en el genoma A de B. napus en B. juncea son bien conocidos en la tecnica e incluyen la retrocruce repetida.

La invencion proporciona por primera vez plantas, semillas, celulas y tejidos de B. juncea que comprenden en su genoma nuclear el evento RF-BN1, que comprende un genoma de restablecimiento de la fertilidad. La informacion disponible anteriormente indicaba que el evento de elite RF-BN1 estaba presente en el genoma C; sin embargo, la informacion que se proporciona en el presente documento ubico la insercion RF-BN1 en el genoma A permitiendo la transferencia del evento de elite a B. juncea.

Las plantas de Brassica que albergan MS-B2 y/o RF-BN1 tambien se caracterizan por su tolerancia al glufosinato, que en el contexto de la presente invencion incluye que las plantas son tolerantes al herbicida Liberty™. La tolerancia a Liberty™ se define segun el criterio de que la pulverizacion de las plantas en la etapa de tres a cuatro hojas (3V a 4V) con al menos 200 gramos de principio activo/hectarea (g.p.a./ha), preferentemente 400 g.p.a./ha y posiblemente hasta a 1600 g.p.a./ha, no mata las plantas. Las plantas que albergan MS-B2 y/o RF-BN1 pueden caracterizarse adicionalmente por la presencia en sus celulas de fosfinotricina acetil transferasa segun se determina mediante un ensayo de PAT (De Block et al, 1987, EMBO J. 6: 2513-2518). Las plantas de Brassica de la presente invencion pueden cultivarse de una manera convencional. La presencia del gen 35S-bar garantiza que son tolerantes al glufosinato. Por tanto, las malezas en los campos donde se cultivan dichas plantas de Brassica pueden controlarse mediante la aplicacion de herbicidas que comprenden glufosinato como principio activo (tales como Liberty™).

Los ensayos de campo han revelado adicionalmente que la presencia de MS-B2 en plantas de Brassica da como resultado un aumento en el rendimiento de semillas o granos en comparacion con la estirpe de plantas isogenicas sin MS-B2. En consecuencia, es adecuado para la presente invencion un metodo para aumentar el rendimiento de semillas en plantas de colza oleaginosa que comprende la etapa de proporcionar a la planta de colza oleaginosa un MS-B2 de elite.

Como se usa en las siguientes reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, el termino "planta" tiene por objeto abarcar tejidos vegetales, en cualquier etapa de madurez, asi como cualesquier celulas, tejidos u organos tomados o derivados de cualquier planta de este tipo, incluyendo sin limitacion, cualquier semilla, hojas, tallos, flores, raices, celulas individuales, gametos, cultivos celulares, cultivos tisulares o protoplastos. Las celulas vegetales como se usan en el presente documento abarcan celulas vegetales no regenerables.

Las plantas de "Brassica", como se usan en el presente documento, se refieren a plantas de la familia de las Brassicaceas, preferentemente plantas que comprenden un genoma A. Preferentemente, la planta de Brassica pertenecera a una de las especies Brassica napus, Brassica rapa (o campestris) o Brassica juncea. Como alternativa, la planta puede pertenecer a una especie originada del entrecruzamiento de estas especies de Brassica,

tales como B. napocampestris, o de un cruce artificial de una de estas especies de Brassica con otra especie de las Cruciferaceas. Como se usa en el presente documento, "planta oleaginosa" se refiere a una cualquiera de las especies Brassica napus, Brassica rapa (o campestris) o Brassica juncea.

Las plantas oleaginosas de acuerdo con la presente invencion tambien pueden tratarse con herbicidas incluyendo 5 clopiralida, diclofop, fluazifop, glufosinato, glifosato, metazaclor, trifluralina etametsulfuron, quinmeraco, quizalofop, cletodim, tepraloxidim; con fungicidas, incluyendo azoxistrobina, carbendazim, fludioxonilo, iprodiona, procloraz, vinclozolina o con insecticidas, incluyendo carbofurano, organofosfatos, piretroides, tiacloprid, deltametrina, imidacloprid, clotianidina, tiametoxam, acetamiprid, dinetofurano, (3-ciflutrina, gamma y lambda cihalotrina, tau- fluvaleriato, etiprol, spinosad, spinotoram, flubendiamida, rinaxipir, cazipir o 4-[[6-clorpiridin-3-il)metil](2,2- 10 difluoretil)amino]furan-2(5H)-on.

Como se usa en el presente documento, "que comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de las caracteristicas, numeros enteros, etapas o componentes indicados, pero no excluye la presencia o adicion de una o mas caracteristicas, numeros enteros, etapas o componentes o grupos del mismo. Por tanto, por ejemplo, un acido nucleico o proteina que comprende una secuencia de nucleotidos o aminoacidos puede comprender mas 15 nucleotidos o aminoacidos que los citados en realidad, es decir, puede estar incluido en un acido nucleico o proteina mas grande. Un gen quimerico que comprende una secuencia de ADN que esta definida funcional o estructuralmente, puede comprender secuencias de ADN adicionales, etc.

Los siguientes ejemplos describen las caracteristicas de las plantas de colza oleaginosa que albergan los eventos de elite MS-B2 y RF-BN1.

20 A menos que se indique lo contrario, todas las tecnicas de ADN recombinante se realizan de acuerdo con los protocolos convencionales descritos en Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY y en los volumenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, EE.UU. Se describen materiales y metodos convencionales para el trabajo molecular en plantas en Plant Molecular Biology Labfax (1993) de R.D.D. Croy publicado por BIOS 25 Scientific Publications Ltd (Reino Unido) y Blackwell Scientific Publications, Reino Unido.

En la descripcion y los ejemplos, se hace referencia a las siguientes secuencias:

SEQ ID NO 1: SEQ ID NO 2: SEQ ID NO 3:

30 SEQ ID NO 4:

SEQ ID NO 5: SEQ ID NO 6: SEQ ID NO 7: SEQ ID NO 8:

35 SEQ ID NO 9:

SEQ ID NO 10:

secuencia flanqueante 5’ MS-B2

secuencia flanqueante 3' MS-B2

cebador oligonucleotidico 1 para la deteccion de MS-B2

cebador oligonucleotidico 2 para la deteccion de MS-B2

secuencia flanqueante 5’ RF-BN1

secuencia flanqueante 3' RF-BN1

cebador oligonucleotidico 1 para la deteccion de RF-BN1

cebador oligonucleotidico 2 para la deteccion de RF-BN1

plasmido pTHW118

plasmido pTCO113

La descripcion anterior de la invencion tiene por objeto ser ilustrativa y no limitante. A los expertos en la materia pueden ocurrirseles diversos cambios o modificaciones en las realizaciones descritas. Estos pueden realizarse sin apartarse del espiritu o alcance de la invencion.

40 Ejemplos

Ejemplo 1. Breve descripcion de MS-B2 y RF-BN1 1.1 Evento de elite MS-B2

El evento de elite MS-B2 se genero mediante transformacion mediada por Agrobacterium de plantas de B. napus con un ADN quimerico que comprende el gen de barnasa bajo el control de un promotor especifico del tapete 45 (pTCO113).

El plasmido pTCO113 derivo esencialmente del vector intermedio pGSV1. El vector pGSV1 deriva a su vez de pGSC1700 (Cornelissen y Vandewielle, 1989), pero comprende una region T artificial que consiste en las secuencias de los bordes izquierdo y derecho de la forma de ADN-TL pTiB6S3 y sitios de clonacion de multienlazador que permiten la insercion de genes quimericos entre las repeticiones del borde de ADN-T. El vector pGSV1 esta provisto 50 de un gen de barstar en el marco de lectura principal del plasmido, con senales reguladoras para la expresion en E. coli.

Una descripcion completa del ADN comprendido entre las repeticiones del borde de pTCO113 se proporciona en la Tabla 1 (SEQ ID NO. 10):

Tabla 1. Posiciones de nucleotidos del ADN comprendido entre las repeticiones del borde de ADN-T de TCPO113

Posiciones de Nt

Orientacion Descripcion y referencias

1-25

Repeticion del borde derecho del ADN-TL de pTiB6S3 (Gielen et al. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).

26-53

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

54-90

Secuencia residual del ADN-TL en la repeticion del borde derecho

91-97

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

309-98

Sentido contrario a las agujas del reloj El extremo 3' sin traducir del gen de ADN-TL 7 (3'g7) de pTiB6S3 (Velten y Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).

310-331

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

883-332

Sentido contrario a las agujas del reloj La secuencia codificante del gen de resistencia a bialafos (bar) de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal 6: 2519-2523). Los dos codones N-terminales de la region codificante de bar de tipo silvestre han sido sustituidos por los codones ATG y GAC, respectivamente.

2609-884

Sentido contrario a las agujas del reloj El promotor de la subunidad pequena de la atS1A ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759).

2610-2659

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

2920-2660

Sentido contrario a las agujas del reloj Un fragmento TaqI de 260 pb del extremo 3' sin traducir del gen de la nopalina sintasa (3'nos) del ADN-T de pTiT37 y que contiene senales de poliadenilacion de la planta (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573).

2921-2936

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

3032-2937

Region 3’ sin traducir corriente abajo de la secuencia codificante de barnasa de B. amyloliquefaciens

3368-3033

Sentido contrario a las agujas del reloj La region codificante del gen barnasa de Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202: 913-915).

4878-3369

Sentido contrario a las agujas del reloj La region promotora del gen TA29 especifico de antera de Nicotiana tabacum. El promotor comprende los 1,5 kb de la secuencia corriente arriba del codon de iniciacion ATG (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403).

4879-4924

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

4925-5215

Sentido de las agujas del reloj El promotor del gen de la nopalina sintasa del ADN-T de pTiT37 de Agrobacterium tumefaciens (PNos). La secuencia de nucleotidos del promotor PNos se describe en Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561 -573.

5216-5217

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

5218-5490

Sentido de las agujas del reloj La region codificante del gen barstarde Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202: 913-915).

5491-5530

Secuencia del extremo 3' sin traducir del gen barstar de Bacillus amyloliquefaciens

5531-5554

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

5555-5766

Sentido de las agujas del reloj El extremo 3' sin traducir del gen 7 de ADN-TL (3'g7) de pTiB6S3 (Velten y Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).

5767-5773

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

5774-5810

Secuencias residuales de la ADN-TL en la repeticion del borde derecho

5811-5840

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

5841-5865

Repeticion del borde izquierdo del ADN-TL de pTiB6S3 (Gielen et al. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).

Las secuencias flanqueantes se aislaron como se describe en el documento WO 01/31042.

Region flanqueante derecha (5')

La region flanqueante 5' se amplifico como un fragmento de aproximadamente 415 pb, cuya secuencia completa se determino (SEQ ID NO. 1). La secuencia entre el nucleotido 1 y el 234 corresponde al ADN de la planta, mientras que la secuencia entre el nucleotido 235 y el 415 corresponde al ADN-T.

5 Region flanqueante izquierda (3')

La region flanqueante 3' se amplifico como un fragmento de aproximadamente 416 pb, cuya secuencia completa se determino (SEQ ID NO. 2). La secuencia entre el nucleotido 1 y el 193 corresponde al ADN-T, mientras que la secuencia entre el nucleotido 194 y el 416 corresponde al ADN de la planta.

Identificacion por PCR de MS-B2

10 Como se describe en el documento WO 01/31042, MS-B2 que comprende material biologico puede identificarse usando el protocolo de identificacion de PCR descrito en el mismo.

Pueden usarse los siguientes cebadores, que reconocen especificamente el ADN extrano y una secuencia flanqueante de MS-B2:

B01: 5’-gAA.ATC.CAT.gTA.AAg.CAg.CAg.gg-3’ (diana: ADN de la planta (SEQ ID NO. 3)

15 B02: 5’-gCT.Tgg.ACT.ATA.ATA.CTT.gAC-3’ (diana: ADN-T) (SEQ ID NO. 4)

Los fragmentos amplificados esperados en la reaccion de PCR son:

para el par de cebadores B01-B02: 183 pb (Evento de Elite MS-B2)

1.2. Evento de Elite RF-BN1

El Evento de Elite RF-BN1 se genero mediante la transformacion mediada por Agrobacterium de plantas de B. 20 napus con un ADN quimerico que comprende el gen de barstar bajo el control de un promotor TA29 (pTHW118).

El plasmido pTHW118 tambien derivo esencialmente del vector intermedio pGSV1 (descrito anteriormente). Una descripcion completa del ADN comprendido entre las repeticiones de borde de pTHW118 se proporciona en la Tabla 2 (SEQ ID NO. 9):

Tabla 2. ADN-T del plasmido pTHW118

Posiciones de Nt

Orientacion Descripcion y referencias

1-25

Repeticion del borde derecho del ADN-TL de pTiB6S3 (Gielen et al (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).

26-53

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

54-90

Secuencia residual del ADN-TL en la repeticion del borde derecho.

91-97

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

309-98

Sentido contrario a las agujas del reloj El extremo 3' sin traducir del gen 7 del ADN-TL (3'g7) de pTiB6S3 (Velten y Schell. (1985) Nucleic Acids Research 13: 6981-6998; Dhaese et al. (1983) The EMBO Journal 3: 835-846).

310-330

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

883-331

Sentido contrario a las agujas del reloj La secuencia codificante del gen de resistencia a bialafos (bar) de Streptomyces hygroscopicus (Thompson et al. (1987) The EMBO Journal6: 2519-2523). Los dos codones de N-terminales de la region codificante bar de tipo silvestre han sido sustituidos por los codones ATG y GAC, respectivamente.

2608-883

Sentido contrario a las agujas del reloj El promotor de la subunidad pequena de la atS1A ribulosa-1,5-bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana (PssuAra) (Krebbers et al. (1988) Plant Molecular Biology 11: 745-759).

2609-2658

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

2919-2659

Sentido contrario a las agujas del reloj Un fragmento TaqI de 260 pb del extremo 3' sin traducir del gen de la nopalina sintasa (3'nos) del ADN-T de pTiT37 y que contiene senales de poliadenilacion de la planta (Depicker et al. (1982) Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561 - 573).

2920-2940

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

Posiciones de Nt

Orientacion Descripcion y referencias

2941-2980

Region 3’ sin traducir corriente abajo de la secuencia codificante de barstar de Bacillus amyloliquefaciens

3253-2981

Sentido contrario a las agujas del reloj La region codificante del gen barstar de Bacillus amyloliquefaciens (Hartley (1988) Journal of Molecular Biology 202: 913-915).

4762-3254

Sentido contrario a las agujas del reloj La region promotora del gen TA29 especifico de antera de Nicotiana tabacum. El promotor comprende las 1,5 kb de la secuencia corriente arriba del codon de iniciacion ATG (Seurinck et al. (1990) Nucleic Acids Research 18: 3403).

4763-4807

Secuencias derivadas del polienlazador sintetico

4808-4832

Repeticion del borde izquierdo del ADN-TL de pTiB6S3 (Gielen et al. (1984) The EMBO Journal 3: 835-846).

Las secuencias flanqueantes se aislaron como se describe en el documento WO 01/41558.

Region flanqueante derecha (5')

La region flanqueante 5' se amplifico como un fragmento de aproximadamente 1077 pb, cuya secuencia completa se determino (SEQ ID NO. 5). La secuencia entre el nucleotido 1 y el 881 corresponde al ADN de la planta, mientras 5 que la secuencia entre el nucleotido 882 y el 1077 corresponde al ADN-T.

Region flanqueante izquierda (3')

La region flanqueante 3' se amplifico como un fragmento de aproximadamente 1500 pb, cuya secuencia completa se determino (SEQ ID NO. 6). La secuencia entre el nucleotido 1 y el 166 corresponde al ADN-T, mientras que la secuencia entre el nucleotido 167 y el 1441 corresponde al ADN de la planta.

10 Identificacion por PCR de RF-BN1

Como se describe en el documento WO 01/41558, puede identificarse material biologico que comprende RF-BN1 usando el protocolo de identificacion por PCR que se describe en el presente documento.

Para identificar material vegetal que comprende RF-BN1, se usan los siguientes cebadores, que reconocen especificamente el transgen y una secuencia flanqueante de RF-BN1:

15 BNA03: 5’-TCA.TCT.ACg.gCA.ATg.TAC.CAg-3’ (diana: transgen) (SEC ID 7)

BNA04: 5’-Tgg.ACC.CCT.Agg.TAA.ATg.CC-3’ (diana: ADN de la planta) (SEC ID 8)

Los fragmentos amplificados esperados en la reaccion de PCR son:

Para el par de cebadores BNA03-BNA04: 215 pb (Evento de elite RF-BN1)

Ejemplo 2. Identificacion del genoma en el que se ubica el locus RF-BN1 e introduccion en Brassica juncea

20 Para determinar si el locus RF-BN1 esta ubicado en el genoma A o C de Brassica napus, la co-herencia o la union de RF-BN1 con marcadores conocidos en el genoma de Brassica se analizo en 4 poblaciones de B. napus BC1 segregantes diferentes derivadas de un cruce entre la estirpe donadora que contenia el transgen RF-BN1 en un estado homocigotico y un progenitor recurrente que no contiene el transgen. El metodo de PLFA se uso para generar marcadores geneticos. El analisis de PLFA se adapto de Vos et al. (1995, NAR 23: 4407-4414, documento 25 EP0534858 y US 6.045.994). Con el fin de identificar los marcadores de PLFA unidos a RF-BN1, se realizo un

analisis de segregantes en masa (ASM) de acuerdo con Michelmore et al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:

9828-9823).

Todos los marcadores geneticos de PLFA que mostraron amplificacion diferencial entre los grupos de plantas positivas para RF-BN1 (que contenian un marcador visible de PLFA) y plantas negativas para RF-BN1 (donde el 30 mismo marcador no era visible) se analizaron en al menos 46 muestras individuales de poblacion BC1 en la que se ha demostrado que el marcador PLFA esta potencialmente unido en el analisis de ASM. Solo los marcadores que mostraron una cantidad considerable de co-segregacion con el marcador de PCR RFBN1 se mantuvieron, los demas marcadores potenciales que no satisficieron este criterio se descartaron como falsos positivos del analisis ASM. Se realizo un analisis de union usando los datos de los marcadores PLFA conservados y los datos del

35 marcador de PCR RF-BN1 generados en plantas individuales para cada poblacion BC1 por separado usando

5

10

15

20

25

30

35

40

JoinMap version 3.0 (Van Ooijen y Vorrips (2001) JoinMap Version 3.0, Software for the calculation of genetic linkage maps, Plant Research International, Wageningen, Pafses Bajos). Como los 4 mapas individuales alrededor del locus RF-BN1 mostraron un acuerdo considerable, estos 4 mapas de BC1 pudieron integrarse en un mapa de BC1 que representaba la region alrededor del locus RF-BN1 usando el mismo software, permitiendo el cartografiado local del locus RF-BN1.

Despues, el mapa local resultante de la region RF-BN1 se comparo con un mapa de referencia genetico que representa todos los cromosomas de B. napus. Para este mapa de referencia, ya se habfan asignado numeros de cromosomas de acuerdo con Sharpe et al. (1995, Genome 38: 112-1121) y Parkin et al. (1995, Genome 38: 11221131). N01 a N10 son cromosomas de genoma A, mientras que N11 a N19 son cromosomas de genoma C. Se descubrio una correlacion muy clara entre el mapa de la region RF-BN1 y el cromosoma N07 del mapa de referencia, que se sabe que es un cromosoma de genoma A. RFBN1 se posiciona en el genoma A de B. napus.

El evento RF-BN1 se introdujo mediante retrocruzamiento repetido de plantas de la variedad Drakkar que comprendfan el evento RFBN1 en un cultivar de Brassica juncea. Despues de al menos 4 generaciones de retrocruces acelerados, se examinaron las plantas de B. juncea y se establecio que:

a) la presencia del ADN extrano no comprometfa otras caracterfsticas deseadas de la planta, tales como las relacionadas con el rendimiento agronomico o el valor comercial;

b) el evento se caracterizo por una configuracion molecular bien definida que se heredo de manera estable; y

c) el gen o los genes de interes en el ADN extrano mostraron una expresion fenotfpica espacial y temporal correcta, apropiada y estable, tanto en condiciones heterocigoticas (o hemicigoticas) como homocigoticas del evento, a un nivel comercialmente aceptable en una gama de condiciones ambientales a las que las plantas que llevan el evento probablemente esten expuestas en un uso agronomico normal. Ademas, las plantas se evaluaron para determinar sus caracterfsticas agronomicas y su rendimiento en comparacion con las especies de Brassica juncea de tipo silvestre.

Ensayos exhaustivos en el campo demostraron que RF-BN1 en Brassica juncea dio como resultado plantas que mostraron una expresion adecuada de los genes de interes en el ADN extrano, es decir, un fenotipo esteril- masculino, combinada con un rendimiento agronomico optimo. Por tanto, aunque originariamente se desarrollo en B. napus, se descubrio sorprendentemente que RF-BN1 tambien era un evento de elite en Brassica juncea. Ademas, RF-BN1 pudo usarse eficientemente para restablecer la fertilidad en plantas de B. juncea que comprendfan MS-B2.

Ejemplo 3. Rendimiento agronomico de plantas MS-B2/RF-BN1

Se sometieron a ensayo de campo plantas de colza oleaginosa Brassica que comprendfan eventos MS-B2/RF-BN1, junto con controles de comprobacion isogenicas no transgenicas, asf como plantas MS-B2 que comprendfan otros eventos restablecedores. Los datos de rendimiento relevantes se resumen en las tablas a continuacion.

Tengase en cuenta que se incluyeron datos de los ensayos de campo para estirpes de plantas adicionales en el analisis para el calculo de la media, la significancia, etc.

Quedara claro que las estirpes de plantas que comprenden MS-B2 y RF-BN1 tienen un rendimiento uniformemente mas alto que las estirpes de plantas que comprenden MS-B2 y otros eventos de restablecimiento-masculino tales como RF-BN2.

Adicionalmente quedara claro que las estirpes de plantas que comprenden MS-B2 tienen un rendimiento mayor que las estirpes de plantas isogenicas no transgenicas.

Tabla 3. Ensayos de campo en la localizacion geografica 1

Descripcion de la variable

Rendimiento (9) Rendimiento (9)

kg

kg

Estudio genealogico

Media % de comprobaciones

MS-B2 BC4

1458,95 102,31

Estirpe isogenica

1529,45 107,26

Estirpe isogenica

1552,57 108,88

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 75 %)

1560,60 109,44

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 50 %)

1560,93 109,46

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 50 %)

1573,65 110,35

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 75 %)

1581,22 110,89

MS-B2 BC4

1886,26 132,28

Descripcion de la variable

Rendimiento (9) Rendimiento (9)

kg kg

Estudio genealogico

Media % de comprobaciones

MS-B2 BC4 x RF-BN 1+ accBC3

1468,76 103,00

MS-B2 BC4 x RF-BN2

1013,52 71,08

MS11 BC4 x RF-BN1+ accBC3

1486,27 104,23

MS11 BC4 x RF-BN2+ BC4

1017,70 71,37

MS11 BC4 x RF-BN1+ accBC3

1522,29 106,75

MS11 BC4 x RF-BN2+ BC5

1183,72 83,01

MS11 BC4 x RF-BN1+ accBC3

1565,97 109,82

MS11 BC4 x RF-BN2+ BC5

1172,28 82,21

Media

1403,99 98,46

Media de comprobaciones

1425,99 100,00

Significancia

** **

d.s.m.p. 5 %

362,98 25,45

d.s.m.p. 1 %

479,76 33,64

i.s.m.p. 5 %

486,84 34,14

i.s.m.p. 1 %

548,55 38,47

CV

20,50 % 20,50 %

Desv. tipica res.

289,36 20,29

N.° de repeticiones analizadas

4 4

Tabla 4. Ensayos de campo en la ubicacion geografica 2

Descripcion de la variable

Rendimiento (9) Rendimiento (9)

kg

kg

Estudio genealogico

Media % de comprobaciones

MS-B2 BC4

1573,12 93,52

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 50 %)

1671,86 99,39

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 75 %)

1689,03 100,41

Estirpe isogenica

1692,71 100,63

MS-B2 BC4 x RF-BN1+ accBC3

1776,16 105,59

MS-B2 BC4 x RF-BN2+ BC4

1285,16 76,40

MS-B2 BC4 x RF-BN1+ accBC3

1716,48 102,04

MS-B2 BC4 x RF-BN2+ BC5

1255,13 74,61

MS-B2 BC4 x RF-BN1 RF-BN1 BC5F2

1973,41 117,31

Media 1586.57

94,32

Media de comprobaciones 1682.23

100.00

Significancia **

**

d.s.m.p. 5 % 186,23

11.07

d.s.m.p. 1 % 247,68

14.72

i.s.m.p. 5 % 274,69

16.33

i.s.m.p. 1 % 326,83

19.43

CV 8,28 %

8.28 %

Desv. tipica res. 131,68

7.83

N.° de repeticiones analizadas 4

4

Tabla 5. Los ensayos de campo en la localizacion geografica 3

Descripcion de la variable

VIGAB Rendimiento (9) Rendimiento (9)

1-9

kg kg

Codigo de la variable

Estudio genealogico

Media Media % de comprobaciones

MS-B2 BC4

4,91 1914,55 102,88

MS-B2 BC4

4,94 1932,70 103,85

MS-B2 BC4

4,89 1952,49 104,92

Estirpe isogenica

7,34 1783,81 95,85

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 50 %)

7,33 1784,18 95,87

Estirpe isogenica

7,31 1786,08 95,98

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 75 %)

7,37 1792,20 96,30

Estirpe isogenica (densidad de semillas del 50 %)

7,33 1811,31 97,33

MS-B2 BC4

4,90 1946,01 104,57

MS-B2 BC4 x RF-BN1+ accBC3

5,56 2066,72 111,06

MS-B2 BC4 x RF-BN2+ BC4

5,23 1690,12 90,82

MS-B2 BC4 x RF-BN2+ BC4

5,19 1719,02 92,37

MS-B2 BC4 x RF-BN2+ BC5

5,22 1742,14 93,61

MS-B2 BC4 x RF-BN2+ BC5

5,20 1755,62 94,34

MS-B2 BC4 x RF-BN1+ accBC3

5,98 1954,28 105,01

MS-B2 BC4 x RF-BN1 RF-BN1 BC5F2

6,27 1965,55 105,62

MS-B2 BC4 x RF-BN1+ accBC3

6,01 1996,10 107,26

MS-B2 BC4 x RF-BN1+ accBC3

5,51 20 62,47 110,83

MS-B2 BC4 x RF-BN1 RF-BN1 BC5F2

5,55 1921,95 103,28

Media

5,93 1853,67 99,61

Media de comprobaciones

6,91 1860,98 100,00

Significancia

** ** **

d.s.m.p. 5 %

0,42 140,25 7,54

d.s.m.p. 1 %

0,55 185,37 9,96

i.s.m.p. 5 %

0,56 188,52 10,11

i.s.m.p. 1 %

0,63 211,95 11,39

CV

5,67 % 6,17 % 6,17 %

Desv. ti'pica res.

0,34 113,87 6,12

N.° de repeticiones analizadas

4 4 4

Tabla 6. Resumen de los ensayos de campo

PROMEDIO (N = 7)

RENDIMIENTO (G)

ESTUDIO GENEALOGICO

NTR 1 AP

MS-B2 X RF-BN1

108,1 % 113,7 %

ESTIRPE ISOGENICA NO TRANGENICA

100 % 104,5 %

MS-B2

114,1 % 112,1 %

RF-BN1

95,1 % 92,3 %

CV

MDS

10,6 %

Ejemplo 4. Rendimiento agronomico de plantas de B. napus MS-B2/RF-BN1 en comparacion con plantas de B. napus MS-BN1/RF-BN1

5 Los ensayos de campo se realizaron en 5 ubicaciones (4 replicas/parcelas completas) para confirmar el restablecimiento y evaluar la tolerancia a herbicidas y el rendimiento agronomico de los hibridos de B. napus MS- B2/RF-BN1 en comparacion con los hibridos MS-BN1/RF-BN1 con el mismo acervo genetico.

Se determinaron el rendimiento y el vigor en ausencia de una pulverizacion de glufosinato (A) o cuando se trataron

5

10

15

20

25

30

35

40

una vez (B) o dos veces (C) con aplicaciones convencionales de glufosinato (Liberty®).

Los resultados se resumen en la Figura 1. El vigor de los hnbridos MS-B2/RF-BN1 es siempre superior al vigor de MS-BN1/RF-BN1, ya sea sin tratar (A), tratado una vez (B) o tratado dos veces (C) con glufosinato de amonio.

En general, los hnbridos MS-B2/RF-BN1 tendieron a florecer (inicio y final) antes y maduraron antes que los hfbridos MSBN1/RF-BN1.

El rendimiento tambien se determino para los ensayos de campo del tipo A, B, C descritos anteriormente y los resultados se resumen en la Figura 2. Los hfbridos MS-B2/RF-BN1 tienen un rendimiento de un 2 a un 5 % mas alto que los hfbridos MS-BN1/RF-BN1.

Tambien se observo que el restablecimiento en MS-B2/RF-BN1 fue completo en todos los genotipos y ubicaciones. LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bayer CropScience NV

<120> Plantas de Brassica hnbridas y metodos para producir las mismas <130> BCS 13-2007 <160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1 <211> 415 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Region flanqueante del borde 5’ del evento de elite MS-B2

<400> 1

gtcgagtttg

tacggatgag

gtatatatac

atggtttcaa

gaaaaggcaa

tgataaaata

tttaaattca

<210>2 <211> 416 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Region flanqueante del borde 3’ del evento de elite MS-B2 <400>2

gtgttcatga

ttttgggttt tgactcttoa ccattacata ttgaaactct 60

aacaactcac

aagcattaat catgttcata taaatatatg tacattatac 120

acgtatacaa

atagtagcga agaaatccat gtaaagcagc agggggcacc 180

gtattatata

attataatta taattatggt aggatgtaca tggccgataa 240

tttgtagatg

ttaattccca tcttgaaaga aatatagttt aaatatttat 300

acaagtcagg

tattatagtc caagcaaaaa cataaattta ttgatgcaag 360

gaaatatttc

aataactgat tatatcagct ggtacattgc cgtag 415

5

10

15

20

25

30

ctacggcaat

gtaccagctg atataatcag ttattgaaat atttctgaat ttaaacttgc 60

atcaataaaw

ttatgttttt gcttggacta taatacctga cttgttattt tatcaataaa 120

tatttaaact

atatttcttt caagatggga attaacatct acaaattgcc ttttcttatc 180

gaccatgtac

atcctaccat aattataatt ataattatat aatactgaaa ccatggtgcc 240

ccctgctgct

ttacatggat ttctccgcta ctatttgtat acgtgtatat ataccgtata 300

atgtacatat

atttatatga acatgattaa tgcttgtgag ttgttctcat ccgtaagagt 360

ttcaatatgt

aatggtgaag agtcaaaacc caaaatcatg aacacccaaa ctcgat 416

<210>3 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotidico 1 para la deteccion de MS-B2 <400> 3

gaaatccatg taaagcagca ggg 23

<210>4 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotidico 2 para la deteccion de MS-B2 <400>4

gcttggacta taatacttga c 21

<210>5 <211> 694 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Region flanqueante 5’ de RF-BN1 <400>5

ggttttcgga

ggtccgagac gagttcaaaa atacatttta cataatatat ttttoatata 60

tatatatata

tataacattc aaaagtttga attattacat aaacgttttc taaattttct 120

tcaccaaaat

tttataaact aaaattttta aatcatgaac aaaaagtatg aatttgtaat 180

ataaatacaa

agatacaaat ttttgattga aatattggta gctgtcaaaa aagtaaatct 240

tagaatttaa

attaactata gtaaactata tattgaaaat attataaatt tttatcaaat 300

tctcataaat

atataaaata aatctaactc atagcatata aaaagaagac taatgtggat 360

caaaatattt

acagtttttt agaagtagaa tctttatagt tttatttaaa atatagcaaa 420

aatgatcaca

aacctagtta ctttaaccag aagtccaatt caaaatcaaa taaaaataaa 480

aatctatcta

aaaaaatatg ttaactacca tgcaaaagta tttttttttg taattagaaa 540

ccctgaaatt

tgtacaaaac ttggacccct aggtaaatgc ctttttcatc tcgcgataag 600

aaaaggcaat

ttgtagatgt taattcccat cttgaaagaa atatagttta aatatttatt 660

gataaaataa

caagtcaggt attatagtcc aagc 694

<210>6 <211> 1279 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Region flanqueante 3’ de RF-BN1

10

<400>6

5

10

15

gggggttttt

ttttttgatc aataactttg ttgggcttat ggtegataag cgtgcgcatg 60

tctgatggta

cat get aa at getatattte tgtttaaagt gttaaaatca ttttctgatg 120

gaactaaatc

cagttttaag agtaactgac aagtacaatt aagcacaaca ataaaatagt 180

agtaattggc

atetttgatt gttaaatatc aaacaataaa gttcaaaaaa aaataccaac 240

ccaataatga

agacttggcg gagacagtgc cgtgcgaagg ttttcggagg teegagaega 300

gttcaaaaat

acattttaca taatatattt ttcatatata tatatatata taacattcaa 360

aagtttgaat

tattacataa acgttttcta aattttcttc accaaaattt tataaactaa 420

aatttttaaa

tcatgaacaa aaagtatgaa tttgtaatat aaatacaaag atacaaattt 480

ttgattgaaa

tattggtagc tgtcaaaaaa gtaaatctta gaatttaaat taactatagt 540

aaactatata

ttgaaaatat tataaatttt tatcaaattc tcataaatat ataaaataaa 600

tctaactcat

ageatataaa aagaagacta atgtggatca aaatatttac agttttttag 660

aagtagaatc

tttatagttt tatttaaaat atagcaaaaa tgatcacaaa cctagttact 720

ttaaccagaa

gtccaattca aaatcaaata aaaataaaaa tetatetaaa aaaatatgtt 780

aactaccatg

caaaagtatt tttttttgta attagaaacc ctgaaatttg tacaaaactt 840

ggacccctag

gtaaattccc tagaaagtat cctattagcg tcgacaaact gttgctcata 900

tttttctctc

ettaetttat atcatacact aatataaaaa gatgatetaa ttaattattc 960

atttcoatgc

tagetaatte aagaaaaaga aaaaaaactt attatetaaa ettatatteg 1020

agcaacacct

cggagataac aggatatatg tcattaatga atgcttgaac tcatctcgcg 1080

aactcatctc

gcatcgctta tagccacaaa gatccaaccc ctctcttcaa tcatatatca 1140

gtagtacaat

acaaatagat attgtgagca catatgccgt ctagtactga tgtgtatatg 1200

tagaggagcc

gcaaatgttt agtcactcca acaaatgagc atgaccacgc atettetgat 1260

gatgtacagc

cgtcccttt 1279

<210>7 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotidico 1 para la deteccion de RF-BN1 <400> 7

tcatctacgg caatgtacca g 21

<210>8 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223> Cebador oligonucleotidico 2 para la deteccion de RF-BN1 <400>8

tggaccccta ggtaaatgcc 20

<210>9 <211> 4832 <212> ADN

5 <213> Artificial

<220>

<223> Plasmido pTHW118 10 <400> 9

aattacaacg

gtatatatcc tgocagtact cggccgtcga actcggccgt cgagtacatg 60

gtcgataaga

aaaggcaatt tgtagatgtt aattcccatc ttgaaagaaa tatagtttaa 120

atatttattg

ataaaataac aagtcaggta ttatagtcca agcaaaaaca taaatttatt 180

gatgcaagtt

taaattcaga aatatttcaa taactgatta tatcagctgg tacattgccg 240

tagatgaaag

actgagtgcg atattatgtg taatacataa attgatgata tagctagctt 300

agctcatcgg

gggatcctag acgcgtgaga tcagatctcg gtgacgggca ggaccggacg 360

gggcggtacc

ggcaggctga agtccagctg ccagaaaccc acgtcatgcc agttcccgtg 420

cttgaagccg

gccgcccgca gcatgccgcg qqqqqcatat ccgagcgcct cgtgcatgcg 480

cacgctcggg

tcgttgggca gcccgatgac agcgaccacg ctcttgaagc cctgtgcctc 540

cagggacttc

agcaggtggg tgtagagcgt ggagcccagt cccgtccgct ggtggcgggg 600

ggagacgtac

acggtcgact cggccgtcca gtcgtaggcg ttgcgtgcct tccaggggcc 660

cgcgtaggcg

atgccggcga cctcgccgtc cacctcggcg acgagccagg gatagcgctc 720

ccgcagacgg

acgaggtcgt ccgtccactc ctgcggttcc tgcggctcgg tacggaagtt 780

gaccgtgctt

gtctcgatgt agtggttgac gatggtgcag accgccggca tgtccgcctc 840

ggtggcacgg

cggatgtcgg ccgggcgtcg ttctgggtoc attgttcttc tttactottt 900

gtgtgactga

ggtttggtct agtgctttgg tcatctatat ataatgataa caacaatgag 960

aacaagcttt

ggagtgatcg gagggtctag gatacatgag attcaagtgg actaggatct 1020

acaccgttgg

attttgagtg tggatatgtg tgaggttaat tttacttggt aacggccaca 1080

aaggcctaag

gagaggtgtt gagaccctta tcggcttgaa ccgctggaat aatgccacgt 1140

ggaagataat

tccatgaatc ttatcgttat ctatgagtga aattgtgtga tggtggagtg 1200

gtgcttgctc

attttacttg cctggtggac ttggcccttt ccttatgggg aatttatatt 1260

ttacttacta

tagagctttc ataccttttt tttaccttgg atttagttaa tatataatgg 1320

tatgattcat

gaataaaaat gggaaatttt tgaatttgta ctgctaaatg cataagatta 1380

ggtgaaactg

tggaatatat atttttttoa tttaaaagca aaatttgcot tttactagaa 1440

Claims (7)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   REIVINDICACIONES

   1. Una planta de colza oleaginosa que comprende en su genoma nuclear al menos una copia del evento de elite MS- 82, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850 y al menos una copia del evento de elite RF-BN1, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA- 730, en la que dicha planta de colza oleaginosa pertenece a la especie Brassica napus o Brassica juncea.
2. 2. Una celula o tejido o semilla de la planta de colza oleaginosa de la reivindicacion 1 que comprende en su genoma nuclear al menos una copia del evento de elite MS-B2 como se describe en la reivindicacion 1, y al menos una copia del evento de elite RF-BN1 como se describe en la reivindicacion 1.
3. 3. Una pareja de plantas de colza oleaginosa, consistiendo dicha pareja en dos plantas de colza oleaginosa en combinacion, adecuadas para la produccion de semillas hibridas mediante cruce entre si, siendo una de dichas plantas de colza oleaginosa una planta de colza oleaginosa femenina esteril-masculina que comprende el evento de elite MS-B2 que comprende un gen de esterilidad masculina, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850 y siendo la otra de dichas plantas de colza oleaginosa una planta de colza oleaginosa fertil-masculina que comprende el evento de elite RF-BN1 que comprende un gen restablecedor de la fertilidad, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730, en la que la planta que comprende el evento de elite RF-BN1 tiene la capacidad de restablecer la fertilidad en plantas que comprenden el evento de elite MS-B2.
4. 4. ADN genomico de una planta de colza oleaginosa de acuerdo con la reivindicacion 1, comprendiendo dicho ADN genomico al menos una copia del evento de elite MS-B2 como se describe en la reivindicacion 1 y al menos una copia del evento de elite RF-BN1 como se describe en la reivindicacion 1.
5. 5. Una planta o celula vegetal de Brassica juncea que comprende el evento de elite RF-BN1, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730.
6. 6. Semilla de la planta de Brassica juncea de acuerdo con la reivindicacion 5 que comprende el evento de elite RF- BN1, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA-730.
7. 7. La planta o celula de acuerdo con la reivindicacion 5, que comprende adicionalmente el evento de elite MS-B2, estando depositada la semilla de referencia que comprende dicho evento de elite en la ATCC con el numero de deposito ATCC_PTA 2485 o ATCC_PTA-850.

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   Figura 2