ES2694278T3 - Método óptico para la detección de la enfermedad de Alzheimer - Google Patents

Abstract

La curcumina para su uso en un método para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer en un mamífero, dicho método que comprende: administrar sistémicamente curcumina al mamífero; formar imágenes de la retina del mamífero con un sistema óptico de imágenes; examinar las imágenes para los péptidos Aß teñidos; y ya sea (i) diagnosticar que el mamífero tiene la enfermedad de Alzheimer si están presentes los péptidos Aß teñidos; o (ii) cuantificar el aumento/disminución de péptidos de Aß teñidos en la retina del sujeto, en comparación con un diagnóstico previo; y generar un pronóstico basado en el nivel de péptidos de Aß teñidos en la retina del sujeto.

Description

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DESCRIPCION

Metodo optico para la deteccion de la enfermedad de Alzheimer Campo de la materia

La presente materia se refiere a la curcumina para su uso en metodos para el monitoreo no invasivo de eventos patologicos tempranos espedficos de la enfermedad de Alzheimer, y por lo tanto incluye los metodos y sistemas para el diagnostico, pronostico y evaluacion de la respuesta al tratamiento de la AD.

Antecedentes de la materia

La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa dependiente de la edad, comun y devastadora. La patologfa cerebral por AD se caracteriza por la acumulacion tfpica de los productos proteolfticos de la protema precursora de amiloide (APP), peptidos p amiloides (Ap), que forman agregados extracelulares denominados placas de Ap. Se cree que estas placas contribuyen a alterar las actividades celulares y la comunicacion en el cerebro, lo que conduce a una inflamacion neurotoxica y muerte neuronal [2,3]. Las imagenes moleculares, que permiten un monitoreo no invasivo de los procesos patologicos en los sujetos vivos, tienen el potencial de mejorar la deteccion y la comprension de la enfermedad y la eficacia de los farmacos. En consecuencia, se han invertido grandes esfuerzos en el desarrollo de herramientas para permitir la deteccion no invasiva de las placas amiloides a traves del craneo de pacientes con AD vivos y modelos animales [4-9]; sin embargo, el monitoreo no invasivo de las placas amiloides sigue siendo un reto clmico y de disponibilidad limitada en alta resolucion [10-12]. Las imagenes opticas constituyen una herramienta poderosa, de alta resolucion y espedfica en la formacion de imagenes in vivo, como se demostro recientemente con el uso de la microscopfa multifotonica para obtener las imagenes de placas de Ap in vivo en el cerebro del raton a traves de una ventana craneal [13]. La presente materia plantea un enfoque alternativo y no invasivo en humanos para obtener imagenes de la retina de pacientes con AD mediante modalidades opticas, siempre y cuando las placas de Ap se desarrollen en las retinas de estos pacientes y compartan propiedades similares con las del cerebro.

La APP se expresa ampliamente en las celulas ganglionares de la retina (RGC), una sobreexpresion del sistema nervioso central (SNC), y se transporta a la membrana plasmatica axonal y los terminales nerviosos a traves del nervio optico [14]. Recientemente se investigo la formacion de placas en la retina, especialmente en dos trastornos neurodegenerativos relacionados: la degeneracion macular relacionada con la edad (AMD) y el glaucoma [50 - 53]. No estaba claro si las placas de Ap se encontraban en la retina en la etapa temprana o tardfa de los pacientes con AD. Pruebas anteriores apuntaban a la presencia de placas de Ap en las retinas de pacientes con glaucoma y con AMD y sus modelos en roedores. Por ejemplo, el deposito de Ap en la capa de RGC se ha informado en pacientes con glaucoma [50, 51]. En los modelos experimentales de glaucoma, la apoptosis de las RGC se ha asociado con la acumulacion de peptidos Ap, y se demostro que los agentes dirigidos a su formacion ejercen actividad neuroprotectora [52]. En pacientes con AMD, se encontraron depositos de Ap en drusas que se correlacionaban con la ubicacion de los fotorreceptores degenerativos y las celulas epiteliales pigmentarias de la retina [53].

En un modelo transgenico de AD en Drosophila, basado en la expresion dirigida de genes humanos mutados de APP y presenilina (PS), se encontro inmunoreactividad^ de Ap en el ojo compuesto, y en asociacion con la degeneracion de los fotorreceptores de la retina [15]. Un estudio reciente demostro depositos de Ap en la capa de fibras nerviosas de la retina (NFL) y la capa de celulas ganglionares (GCL) en ratones transgenicos con AD en una etapa avanzada de la enfermedad (mas de 10 meses de edad). Los depositos de Ap se correlacionaron aun mas con la neurodegeneracion de las RGC y con la activacion microglial [16].

A pesar de esta investigacion alentadora, continua existiendo una necesidad en la tecnica de sistemas y metodos para el diagnostico, pronostico y tratamiento de la AD. El presente tema satisface estas necesidades al descubrir la presencia de placas de Ap en retinas de ojos postmortem de pacientes con AD. Con el uso de ratones que expresan formas mutadas de los genes humanos APP y PS1 (APPswe/PS1dE9, referidos en la presente como ratones AD-Tg), la presente materia proporciona ademas la evidencia que describe la formacion temprana de placas de Ap en la retina antes de su manifestacion en el cerebro. Ademas, la presente descripcion describe una terapia basada en el sistema inmunitario, con el uso de un agonista debil de un peptido derivado de la mielina cargado en las celulas dendnticas [17, 18] , que es efectivo para reducir las placas de Ap en los cerebros y retinas de ratones AD-Tg. Finalmente, la materia demostro que la inyeccion sistemica de curcumina (diferuloilmetano), un compuesto natural que une y marca las placas de Ap [19, 20] , en animales vivos permite la visualizacion no invasiva de alta resolucion y espedfica de las placas de Ap en la retina. La presente materia muestra a la curcumina para su uso en los metodos que, por primera vez, permiten que las placas de Ap se detecten en numero y ubicacion, y que se cuenten y monitoreen repetidamente en tiempo real en la retina de los mairnferos con AD.

El documento de la patente num.US 2004/0152068 (BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL, GENERAL HOSPITAL CORP) se relaciona con un metodo para diagnosticar o proporcionar un pronostico con respecto al estado de la enfermedad de Alzheimer en un mamffero al poner en contacto un tejido ocular con un compuesto de etiqueta detectable, que se une a una protema amiloide.

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Breve descripcion de las figuras

Las modalidades representativas se ilustran en las figuras enumeradas. Se pretende que las modalidades y figuras descritas en la presente descripcion se consideren representativas en lugar de restrictivas.

La Figura 1 describe, para propositos de referencia e informacion, el deposito de Ap retiniana en la retina de los ratones AD-Tg visualizados con curcumina. Las Figuras 1a - 1f describen las imagenes de criosecciones cerebrales de ratones AD-Tg de 9 meses de edad (Figuras 1a - 1e) y no Tg (silvestres) (Figura 1f) tenidos con anticuerpo anti-Ap humano y curcumina ex vivo, lo que indica la colocalizacion de la tincion de las placas de Ap por ambos metodos de deteccion. Las Figuras 1d y 1e describen imagenes de mayor aumento del patron de tincion de las placas presentadas para cada canal, la Figura 1f no muestra evidencia de la presencia de placas doble positivas para anti-Ap humano y curcumina en el raton no-Tg (wt). Los nucleos celulares se marcaron con DAPI (azul). Barra de escala = 100 pm. Las Figuras 1g - 1j son imagenes representativas de la retinas humanas de montaje completo de ratones AD-Tg (n=27) y no-Tg (wt) (n=18) de 10 meses tenidos con anticuerpo anti-Ap y curcumina ex vivo. La formacion de placas de Ap (manchas amarillas de canales rojos y verdes superpuestos) se demuestra en varias capas de retina diferentes: La Figura 1g muestra la capa plexiforme interna IPL, la Figura 1h muestra las capas plexiformes nuclear interna INL/externa OPL, y la Figura 1i representa la capa nuclear externa ONL. La Figura 1J muestra que las placas de Ap estaban esencialmente ausentes en los ratones no-Tg (silvestres). (Figura 1g y 1j, fila abajo). Las imagenes de mayor aumento para canales separados demuestran los patrones de tincion de placa con ambos procedimientos. Barras de escala = 5 pm. Figuras 1k - Se representa las criosecciones sagitales oculares completas tenidas con curcumina in vivo, seguida de un anticuerpo anti- Ap humano y DAPI ex vivo. En las Figuras 1k - 1m, se detectaron las placas de Ap en la mayona de las capas retinianas y en la coroides en ratones AD-Tg de 10 meses de edad. En la Figura 1n, las placas de Ap fueron indetectables en la retina y la coroides de ratones no-Tg (wt). Barra de escala = 20 pm.

La Figura 2 muestra, para propositos de referencia e informacion, las placas de Ap en la retina humana de pacientes con enfermedad de Alzheimer. Las Figuras 2a y 2b son imagenes representativas de la retina humana de montaje completo de un paciente con AD de 87 anos de edad despues de tenirse con negro sudan B para eliminar las senales de autofluorescencia no espedficas, y despues de la tincion con curcumina ex vivo (las placas marcadas con curcumina se indican con flechas blancas). Barras de escala = 10 pm. Los nucleos celulares se marcan con DAPI (azul). Las Figuras 2c y 2d muestran imagenes de mayor aumento de la retina humana de montaje completo de un paciente con AD de 65 anos despues de la tincion con negro sudan B (manchas negras para la tincion con Sudan), y despues, la tincion con curcumina (la placa marcada con curcumina se indica mediante flechas blancas). Barras de escala = 5 pm. Las Figuras 2e - 2g proporcionan ejemplos adicionales de placas de curcumina positivas en las retinas de una serie de pacientes con AD humanos de 65 a 90 anos de edad. Las Figuras 2h - 2j son imagenes representativas de la retina humana de montaje completo de pacientes con AD de 65 y 87 anos tenidos con anticuerpos anti-Ap humano, seguido de un tratamiento con negro sudan B a varias profundidades de la retina (para incluir RGC y IPL). La Figura 2i representa una imagen de mayor aumento de la placa retiniana. La morfologfa de la placa Ap fue similar a la encontrada en las retinas y cerebros de los ratones. Barras de escala = 5 pm. Las Figuras 2k - 2m representan la tincion posterior de las mismas retinas humanas con curcumina, lo que revela que las placas se combinaron selectivamente con anticuerpos Ap humanos y curcumina (imagenes de la fila inferior para canales separados). La Figura 2n representa la doble tincion con anticuerpos Ap humanos y curcumina en un retina de montaje completo humana postmortem de un no AD que no muestra signos de placas de Ap (imagenes de la fila inferior para canales separados). Barras de escala = 5 pm.

La Figura 3 muestra, para propositos de referencia e informacion, las formaciones de la placa Ap en la retina de raton en la etapa temprana presintomatica y la acumulacion durante la progresion de la enfermedad. Despues de las inyecciones i.v. con curcumina en la vena de la cola, las placas de Ap fueron visibles en las retinas y cerebros de los ratones AD-Tg. Las Figuras 3a - 3n son imagenes representativas de la proyeccion en el eje z de retinas de montaje completo de ratones AD-Tg (n=18) y no Tg (silvestre; n=10) a diversas edades; las Figuras 3a - 3d representan los ratones AD-Tg de 2,5 meses de edad, con la Figura 3a que muestra la presencia de placas en la retina y la Figura 3b que muestra la validacion de la tincion de la placa Ap mediante el uso de un anticuerpo antihumano espedfico ex vivo en la misma ubicacion (colocalizacion de la curcumina y el anticuerpo Ap en amarillo). Barras de escala =10 pm. Las figuras 3c y 3d muestran que no se detectaron placas en el hipocampo y la corteza del cerebro. Barras de escala = 100 pm. Las Figuras 3e - 3h representan ratones AD-Tg de 5 meses de edad, con la Figura 3e representando la presencia de placas en la retina y la Figura 3f despues de la tincion con el anticuerpo Ap espedfico ex vivo. Barras de escala =10 pm. Las figuras 3g y 3h muestran la deteccion de placas en el cerebro. Barras de escala = 50 pm. Las Figuras 3i - 3k representan ratones AD-Tg de 9 meses de edad, con la Figura 3i mostrando multiples placas en la retina y las Figuras 3j y 3k mostrando placas en el cerebro. Barras de escala (i) = 10 pm y (j,k) = 50 pm. Las Figuras 3l - 3n representan un raton AD-Tg de 17 meses de edad, con la Figura 3l mostrando numerosas placas en la retina y las Figuras 3m y 3n mostrando placas en el cerebro. Barras de escala (i) = 10 pm y (m,n) =100 pm. Las Figuras 3o - 3q representan ratones no Tg (wt) de 9 meses de edad, con la Figura 3o sin placas en la retina y las Figuras 3p y 3q sin placas en el cerebro. Barras de escala (o) = 10 pm y (p,q) =100 pm.

La Figura 4, para propositos de referencia e informacion, muestra las placas de Ap disminuidas en la retina de ratones AD-Tg despues de la vacunacion con las celulas dendnticas. Las Figuras 4a - 4g son imagenes representativas de proyeccion del eje z de las preparaciones completas de retina de ratones de 10 meses de edad, las Figuras 4a - 4c muestran el control de raton AD-Tg tratado con PBS, las Figuras 4d - 4f muestran el raton AD-Tg vacunado, y la Figura 4g muestra ratones no Tg (wt) tenidos ex vivo con curcumina y anticuerpos anti-Ap humanos. Las Figuras 4b y 4c, y las

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Figuras 4e y 4f representan imagenes de canales separados para el marcaje de anticuerpos de curcumina y anti-Ap en la retina. Barras de escala = 10 pm. La Figura 4h es una ilustracion de 12 regiones alrededor del disco optico (indicado por los rectangulos 1-12) que representan el area cubierta para el analisis cuantitativo de las placas en las preparaciones completas de retina (n=4 ratones por grupo; dos retinas por raton). Barra de escala = 200 pm. La Figura 4i muestra la disminucion en el numero de placas, observada en las retinas de los ratones AD-Tg tratados con la vacunacion de base inmunologica en comparacion con los controles tratados con PBS (prueba de t de student; P=0,0028). La Figura 4j muestra una disminucion en el area promedio de la placa, observada en las retinas de ratones AD-Tg vacunados en comparacion con sus controles (prueba de t de student P=0,0002). La Figura 4k muestra que la reduccion significativa en el area total cubierta por las placas se detecto ademas en el hipocampo cerebral y la corteza de los mismos ratones despues de la vacunacion de base inmunologica (prueba t de student =0,0085). Las barras de error en cada panel representan SEM.

La Figura 5 representa la formacion de imagenes in vivo de las placas marcadas con curcumina en las retinas del raton AD-Tg. Las Figuras 5a a 5c son imagenes representativas de proyeccion en el eje z de las preparaciones completas de retina de ratones AD-Tg no perfundidos frente a ratones no Tg (wt) (10 meses de edad), seguido por la administracion i.v. de curcumina o PBS in vivo (los vasos sangumeos se indican por flechas rojas). La Figura 5a muestra que las placas de Ap estaban visibles (indicadas por flechas blancas) en las retinas del raton AD-Tg despues de la inyeccion i.v. de curcumina (n=6). La Figura 5b muestra que las placas estaban indetectables en las retinas de ratones AD-Tg despues de la inyeccion i.v. con PBS (n=5). La Figura 5c muestra que las placas estaban indetectables en las retinas de ratones no Tg (wt) despues de la inyeccion i.v. de curcumina (n=5). La Figura 5d es una imagen de proyeccion confocal representativa del eje z, que utiliza tres canales y secciones virtuales sagitales/coronales, que demuestran las placas de Ap^ (placas dentro de los vasos indicadas con flechas blancas), tenidas con anticuerpos anti-Ap humanos, en el parenquima y dentro de los vasos sangumeos de la retina de montaje completo del raton AD-Tg. Las Figuras 5e y 5f representan las imagenes capturadas con el uso de un microscopio de fluorescencia con un sistema de imagenes espectrales basado en AOTF, y analizadas y visualizadas con el programa de clasificacion y segmentacion. En la Figura 5e, las placas de Ap (en blanco) y los vasos sangumeos (indicados por flechas), fueron visibles en una retina de montaje completo tenida in vivo con curcumina y en un solo canal (ex. 562/40 nm; em. 624/40 nm). La Figura 5f representa una imagen espectralmente clasificada con el uso de una firma optica (OS) espedfica para las placas de Ap marcadas con curcumina en la misma region y retina de montaje completo. Las placas de Ap se muestran en pseudocolor (indicado por flechas blancas) y todo el tejido sin placa esta en pseudocolor verde. Barras de escala = 10 pm. Las figuras 5g - 5j son imagenes despues de una inyeccion unica de curcumina, en donde las placas (indicadas con flechas blancas) fueron visibles en las retinas de raton AD-Tg vivo (n=4) por emision de luz despues de la excitacion con una fuente espectralmente controlada (longitud de onda de 546/15 nm). Las Figuras 5i y 5j son imagenes de mayor aumento, donde las placas se detectaron principalmente en las areas cercanas al disco optico y el tamano promedio de la placa fue compatible con el observado en las preparaciones completas de retina (ex vivo). La Figura 5k no muestra placas detectadas en los ratones no Tg (wt) (n=4) inyectados i.v. con curcumina. Barras de escala (g, k) = 100 pm, y (h- j) = 10 pm. 23.

La Figura 6 representa un diagrama de flujo de un sistema de imagenes espectrales para diagnosticar, pronosticar, y analizar placas de Ap de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 7 representa un diagrama de flujo de un sistema de imagenes espectrales para diagnosticar, pronosticar y/o analizar placas de Ap de acuerdo con una modalidad de la presente invencion.

La Figura 8 muestra imagenes de alta resolucion de las placas retinianas pequenas (en su mayona <1 pm de diametro), que se originaron en el gen de APP endogeno de raton. Las imagenes son de una retina de raton no Tg (wt) de 10 meses de edad.

La Figura 9 muestra imagenes de las retinas de raton AD-Tg y no Tg (wt) vivo que muestran las placas tenidas con curcumina en la retina de AD-Tg, y la ausencia de placas tenidas con curcumina en la retina de no-Tg (wt).

Descripcion detallada de la invencion

A menos que se especifique de cualquier otra forma, los terminos tecnicos y cientfficos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el conocido comunmente por aquellos con experiencia en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Singleton y otros., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3ra ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); Marzo, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 5ta ed., J. Wiley & Sons (Nueva York, NY 2001); y Sambrook y Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3ra ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2001), proporciona a un experto en la tecnica una grna general para muchos de los terminos que se usan en la presente solicitud.

Un experto en la tecnica reconocera muchos metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripcion, los que podnan usarse en la practica de la presente invencion. Ciertamente, la presente invencion no se limita de ninguna manera a los metodos y materiales descritos.

"Administrar" y/o "Administra" como se usa en la presente descripcion se refiere a cualquier via para suministrar una composicion farmaceutica a un paciente. Las vfas de administracion pueden incluir vfas orales no invasivas (a traves de la boca), topicas (piel), transmucosas (nasales, bucales/sublinguales, vaginales, oculares y rectales) e inhaladas, asf como vfas parenterales y otros metodos conocidos en la tecnica. Parenteral se refiere a la ruta de administracion que se asocia generalmente con una inyeccion, que incluye inyeccion intraorbital, infusion, intraarterial, intracapsular, intracardiaca, intradermica, intramuscular, intraperitoneal, intrapulmonar, intraespinal, intraesternal, intratecal,

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intrauterina, intravenosa, subaracnoidea, subcapsular, subcutanea, transmucosal, o transtraqueal. Por la via de la ruta parenteral, las composiciones pueden estar en la forma de soluciones o suspensiones para infusion o para inyeccion, o como polvos liofilizados.

"Enfermedad de Alzheimer", como se usa en la presente descripcion, se refiere a toda forma de demencia, identificada como un trastorno cognitivo degenerativo y terminal. La enfermedad puede ser estatica, resultado de una lesion cerebral global unica, o progresiva, lo que resulta en un declive en la funcion cognitiva a largo plazo debido al dano o enfermedad en el cuerpo mas alla de lo que podna esperarse del envejecimiento normal.

"Degeneracion macular relacionada con la edad", como se usa en la presente descripcion, se refiere a una afeccion medica en adultos mayores que produce una perdida de la vision en el centro del campo visual (la macula) debido al dano en la retina.

"Cataratas", como se usa en la presente descripcion, se refiere a una opacidad que se desarrolla en la lente cristalina del ojo o en su envoltura, que vana en grado de opacidad leve a completa y obstruye el paso de la luz. Al inicio del desarrollo de la catarata relacionada con la edad, el poder de la lente puede aumentar, lo que ocasiona miopfa (miopfa), y el amarillamiento y opacifidad gradual de la lente pueden reducir la percepcion de los colores azules. Las cataratas generalmente progresan lentamente para causar perdida de la vision y son potencialmente cegadoras si no se tratan.

"Marcador fluorescente", como se usa en la presente descripcion, se refiere a todos y cada uno de los compuestos que contienen fluoroforos para unir el compuesto a otra molecula, como una protema o un acido nucleico. Esto se logra generalmente con el uso de un derivado reactivo del fluoroforo que se une selectivamente a un grupo funcional contenido en la molecula objetivo.

"Glaucoma", como se usa en la presente descripcion, se refiere a un grupo de enfermedades que afectan el nervio optico e implica una perdida de celulas ganglionares de la retina con un patron caractenstico. El glaucoma se clasifica como un tipo de neuropatfa optica.

"Mairnfero" como se usa en la presente se refiere a cualquier miembro de la clase Mammalia, incluyendo, sin limitacion, los humanos y los primates no humanos tales como chimpances y otros simios y monos, los animales de granja como vacas, ovejas, cerdos, cabras y caballos; marnfferos domesticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y cobayas, y similares. El termino no denota una edad o sexo particular. Por lo tanto, los sujetos adultos y recien nacidos, asf como fetos, sean macho o hembra, se pretende que esten incluidos dentro del alcance de este termino.

"Cantidad terapeuticamente eficaz" como se usa en la presente se refiere a una cantidad que es capaz de lograr resultados beneficiosos en un mamffero que se trata. Una cantidad terapeuticamente eficaz puede ser determinada sobre una base individual y se basara, al menos en parte, en la consideracion de las caractensticas fisiologicas del mamffero, el tipo de sistema de entrega o tecnica terapeutica utilizada y el tiempo de administracion en relacion con la progresion de la enfermedad, trastorno, o afeccion que se trata.

"Tratamiento" y "tratar," como se usa en la presente descripcion se refiere al tratamiento terapeutico y profilactico o medidas preventivas, en donde el objetivo es prevenir, disminuir (aliviar) la afeccion, enfermedad o trastorno patologico espedfico, incluso si el tratamiento en ultima instancia, no tiene exito. Aquellos que necesitan el tratamiento pueden incluir los que ya estan con el trastorno, asf como los propensos a tener el trastorno, y en los que el trastorno debe evitarse.

El deposito de p-amiloide es fundamental para la neuropatologfa de la AD y un sello clave de la enfermedad de Alzheimer. Sin embargo, el monitoreo de las placas de Ap en los cerebros de los pacientes con Alzheimer y animales vivos esta limitado por la resolucion y especificidad actuales de la MRI y la PET, y un diagnostico definitivo de la enfermedad de Alzheimer u otra enfermedad o afeccion caracterizada por la formacion de placas de Ap solo es posible despues autopsia de tejido cerebral mediante el seguimiento del numero y distribucion de placas y ovillos. Por lo tanto, desarrollar medios para identificar las placas in vivo es esencial para el diagnostico, asf como para la evaluacion de la progresion de la enfermedad en respuesta a las terapias.

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona curcumina para su uso en metodos como se exponen en las reivindicaciones adjuntas.

Un aspecto de la invencion proporciona curcumina para su uso en un metodo para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer en un marnffero, comprendiendo dicho metodo: administrar sistemicamente curcumina al mamffero;

formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; examinar las imagenes para los peptidos Ap tenidos; y ya sea

(i) diagnosticar que el mamffero tiene la enfermedad de Alzheimer si estan presentes los peptidos Ap tenidos; o

(ii) cuantificar el aumento/disminucion de peptidos de Ap tenidos en la retina del sujeto, en comparacion con un diagnostico previo; y

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generar un pronostico basado en el nivel de peptidos de Ap tenidos en la retina del sujeto.

Otro aspecto de la invencion proporciona curcumina para su uso en un metodo para evaluar la efectividad del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un mairnfero que comprende: administrar sistemicamente curcumina al marnffero;

formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; examinar las imagenes para peptidos de Ap tenidos; y

evaluar la efectividad del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer basado en el nivel de peptidos de Ap tenidos en la retina del marnffero.

Otro aspecto de la presente invencion proporciona curcumina para su uso en un metodo para evaluar la efectividad del tratamiento para una dolencia de retina asociada al peptido de Ap en un mamffero, dicho metodo que comprende: administrar sistemicamente curcumina al mamffero;

formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; examinar las imagenes para peptidos de Ap tenidos; y

evaluar la efectividad del tratamiento para el peptido de asociado a la dolencia de la retina en funcion del nivel de peptidos de Ap tenidos en la retina del mamffero.

Otro aspecto de la presente invencion proporciona curcumina para su uso en un metodo para identificar peptidos de Ap en una retina de mamnfero, dicho metodo que comprende: administrar sistemicamente curcumina al mamffero;

formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; y examinar las imagenes para peptidos de Ap tenidos.

La presente descripcion establece la formacion de placas retinianas de Ap en mamfferos y curcumina para su uso en metodos para identificar, cuantificar y obtener imagenes de la placa retiniana de Ap. La presente materia puede incorporarse para pacientes con enfermedad de Alzheimer, demencia y otras afecciones clmicas y dolencias caracterizadas por la formacion de placas de Ap. Ademas, la presente materia descubrio que la formacion de placas de Ap en la retina de pacientes con AD precedio a su aparicion en el cerebro. Por consiguiente, la presente materia describe la curcumina para su uso en un metodo para el diagnostico temprano de AD en un mamffero que comprende las etapas de administrar un marcador fluorescente (es decir, curcumina) al paciente para tenir las placas de Ap en la retina y obtener imagenes de la retina del paciente con un sistema de imagen optico para identificar los peptidos de Ap tenidos.

Otra modalidad de la presente materia muestra la curcumina para su uso en un metodo que pronostica AD en mamfferos al medir el aumento o la disminucion de las placas de Ap en la retina de pacientes antes y despues del tratamiento. El metodo de pronostico comprende las etapas de administrar un marcador fluorescente al paciente para tenir las placas de Ap en la retina y obtener imagenes de la retina del paciente con un sistema de imagen optico para identificar los peptidos de Ap tenidos, seguido de la administracion de un tratamiento AD al paciente y dejar el debido tiempo para que el tratamiento de la AD tenga efecto. Y, volver a administrar un marcador fluorescente al paciente para tenir las placas de Ap en la retina despues del tratamiento con AD y obtener imagenes de la retina del paciente con el sistema optico de imagen para identificar un aumento o disminucion de los peptidos de Ap tenidos.

Para propositos de informacion, en la presente se describe un metodo para tratar la AD en pacientes mamfferos, que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz al paciente de peptidos derivados de la mielina y/o agonistas de los peptidos derivados de la mielina para reducir la formacion y disolver la existencia de las placas de Ap.

Para propositos de informacion, en la presente se describen metodos para mejorar la vista en pacientes de mamfferos que contienen placas de Ap retinianas, que comprenden las etapas de administrar al paciente una cantidad terapeuticamente eficaz de peptidos derivados de la mielina y/o agonistas de peptidos derivados de la mielina. El metodo para mejorar la vista puede aplicarse en los pacientes con AD, demencia u otras afecciones clmicas y dolencias caracterizadas por la formacion de placas de Ap, tal como la degeneracion macular relacionada con la edad (AMD) y el glaucoma.

La materia describe que las placas de Ap estan presentes en la retina de los mamfferos y pueden utilizarse para analizar, pronosticar y diagnosticar una multitud de otras afecciones clmicas y doelncias caracterizadas por las placas de Ap en la retina. Las afecciones clmicas y dolencias representativas pueden incluir la AMD y el glaucoma.

Los descubrimientos adicionales utiles en el contexto de la invencion incluyen un sistema de imagen optico para visualizar las placas de Ap in vivo en la retina de pacientes humanos y marnfferos no humanos. El sistema de imagenes opticas incorpora el uso de microscopios de fluorescencia, lamparas de arco de mercurio y xenon, una camara CCD, un aparato de adquisicion de imagenes espectrales basadas en AOTF (filtros de ajuste acustico-optico) y un programa de imagenes para su analisis posterior. El sistema de imagenes opticas incorpora las herramientas anteriores para proporcionar imagenes en la retina de las placas de Ap tenidas, proporcionando una representacion visual en pseudocolor de la firma espectral extrafda de las imagenes en bruto, que representa el tamano y la ubicacion de las placas de Ap objetivo.

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En una modalidad alternativa, el sistema de imagenes opticas incorpora el uso de un estereomicroscopio que se ajusta para visualizar las senales de fluorescencia y dispersion en resoluciones mas altas. El estereomicroscopio puede equiparse con una fuente de luz de longitud de onda variable Policromatica V. En modalidades adicionales, el sistema de imagenes opticas puede incorporar una camara digital en color MicroFire y una o mas lentes de aumento para mejorar la ampliacion y el detalle de la imagen. La adquisicion de imagenes se logra y se perfecciona mediante la segmentacion y clasificacion de imagenes posteriores al analisis mediante el uso de un programa de imagenes.

El sistema de imagenes opticas puede incorporarse en los metodos descritos en la presente. Ademas, el sistema de imagenes opticas puede aumentarse con una optica adaptativa, que se utiliza para mejorar el rendimiento del sistema de imagenes opticas al reducir los efectos de la distorsion optica que cambia rapidamente.

En aun otra modalidad, la materia puede utilizarse para el desarrollo y prueba de farmacos. Dado que los metodos de imagenes no invasivas y repetitivas rapidamente pueden permitir la comparacion de varios farmacos y varias dosis de farmacos, la presente materia puede encontrar una utilidad favorable en el desarrollo y las pruebas de farmacos.

Un informe anterior identifico la patologfa de Ap en el cerebro, basandose en el hallazgo de la acumulacion de Ap en las lentes de los pacientes con AD [31]. El estudio actual proporciona evidencias de la existencia de placas de Ap en las retinas de pacientes con AD que pueden visualizarse espedficamente mediante la curcumina. Se encontraron placas de Ap en la retina de todos los pacientes con AD examinados, mientras que no se pudieron detectar en los controles sin AD. Tanto en ratones AD jovenes como en adultos, se observo una buena correlacion entre la patologfa de la placa de Ap retinal y cerebral; las placas se acumularon dependiente de la edad durante la progresion de la enfermedad, y tanto la retina como el cerebro mostraron una reduccion de la placa de Ap como respuesta a la misma modalidad terapeutica. En general, el tejido retiniano, que comparte muchas similitudes con el cerebro, puede usarse potencialmente para el diagnostico y monitoreo de la aD.

En el presente estudio, las placas de Ap en las retinas de los pacientes con AD se detectaron principalmente dentro de la capa RGC. En los ojos de ratones con AD, se observaron placas en la mayona de las capas retinianas y en la coroides. Se notificaron placas desde NFL hasta ONL, y se observaron con mayor frecuencia agrupaciones de placas de Ap en las capas internas de la retina, lo que significa la posibilidad de obtener imagenes de la placa a traves de los ojos de los sujetos vivos. Las retinas de ratones con AD experimentan un aumento dependiente de la edad con respecto a la carga de placa Ap en terminos de numero y tamano, similar a la acumulacion de placas dependiente de la edad observada en el cerebro. Nuestros resultados que demuestran la patologfa de la placa retiniana son consistentes con un informe reciente que revela el deposito de Ap retiniano en correlacion con la inflamacion y degeneracion retinianas en ratones AD-Tg adultos y longevos [16]. En la presente materia, no solo proporcionamos evidencias que apoyan un vinculo entre la patologfa de la placa retiniana y cerebral, sino que tambien mostramos que las placas de Ap son detectables en la retina antes de su deteccion en el cerebro, en ratones AD-Tg jovenes. Ademas, pudimos mostrar una reduccion significativa de las placas de Ap en las retinas de ratones AD-Tg despues de la vacunacion con el peptido derivado de la mielina; se encontro que este tratamiento, asf como los relacionados, fueron efectivos para atenuar la carga de la placa de Ap en el cerebro [17,24,25]. Estos hallazgos establecen que la evaluacion de las placas de la retina puede usarse para evaluar las respuestas a la terapia de reduccion de la placa, y que las placas de la retina pueden responder al mismo tratamiento que es efectivo en la reduccion de la placa de Ap en el cerebro.

Es importante destacar que el hecho de que se observaron placas en el GCL de los ojos humanos, que alcanzan un tamano de mas de 5 pm, hace que las imagenes de pacientes de Alzheimer a traves de la retina sean un enfoque viable, con algunas modificaciones, incluso con las herramientas actualmente disponibles para la formacion de imagenes del ojo humano, tal como un oftalmoscopio de optica adaptativa [32]. En ratones vivos, una camara retinal midriatica disponible en el mercado, se encontro que era eficaz en el registro de fotograffas del fondo de ojo permitiendo evaluar los cambios longitudinales de las celulas ganglionares de la retina [33]. Un sistema de oftalmoscopio laser de barrido confocal de luz azul (bCSLO) que se modifico para visualizar la protema fluorescente cian, proporciona ademas un enfoque no invasivo para visualizar RGC en la retina del raton vivo [34]. En la presente, para la prueba de concepto, se pudo detectar las placas marcadas con curcumina en ratones vivos con el uso de un estereomicroscopio (Leica S6E) equipado con una fuente de luz espectral policromatica V y una lente doble convexa. Ademas, al utilizar un sistema AOTF, se pudo detectar las placas retinianas de Ap mediante curcumina y eliminar las fuertes senales de autofluorescencia de fondo (de los globulos rojos).

En el presente estudio, la curcumina fue eficaz en la deteccion de las placas de Ap en la retina cuando se administra sistemicamente a una dosis unica de 7,5 mg/kg o cuando se administra por via oral. La curcumina demostro la capacidad de atravesar las barreras hematoencefalica y retina sangumea, que es un requisito para un agente util de formacion de imagenes de la placa. En terminos de seguridad, los ensayos de Fase I y II que usan curcumina en pacientes con cancer han demostrado su baja toxicidad en humanos, incluso en dosis altas (12 g/dfa), y cuando se administran durante largos penodos de tiempo [35]. Se espera que la conversion de la dosis de curcumina administrada por via intravenosa u oral, de ratones a humanos (por debajo de 1 g) para la visualizacion de la placa retiniana, se mantenga dentro de los niveles de seguridad informados. Ademas, estudios recientes han reportado varios enfoques para aumentar significativamente la estabilidad y biodisponibilidad de la curcumina en humanos [36].

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La identificacion de las placas de Ap en la retina de los pacientes con AD, brinda una nueva oportunidad para desarrollar un metodo de imagen sensible y de alta resolucion, que permitira su deteccion in vivo. Estos resultados pueden ser consistentes con las disfunciones visuales tempranas encontradas en los pacientes con AD [37,38], y con la evidencia de anormalidades retinianas como la perdida de celulas en la GCL y la atrofia de la NFL, informadas en pacientes con AD [39-44]. Aunque no esta claro si las placas de Ap se encuentran en la retina en las etapas tempranas o posteriores de la AD, el descubrimiento actual de las placas de Ap en la retina de estos pacientes en diferentes edades, y el hecho de que estas placas sean detectables en una etapa muy temprana presintomatica de la enfermedad en ratones con AD-Tg refuerza la posibilidad de que las placas marcadas con curcumina, vistas a traves de los ojos, puedan usarse para el diagnostico temprano de la enfermedad. Es importante destacar que, en funcion de su tamano y distribucion unicos dentro de las retinas, las placas observadas en los pacientes con AD pueden finalmente usarse para el diagnostico diferencial: las placas que se detectaron en la degeneracion macular relacionada con la edad se restringen localmente al pigmento retiniano del epitelio dentro de la drusa y parecen mas pequenas en tamano [45-47]. En cuanto a las anomalfas retinianas que se observan en los pacientes con Ea, es posible que una terapia reductora de placa, tal como la actual vacunacion contra la DC, puede ayudar ademas a mejorar algunas de las disfunciones visuales, incluso a mejorar la vista.

Junto con el envejecimiento de la poblacion mundial y la creciente epidemia de AD, una deteccion temprana de AD se torna cada vez mas cntica para evaluar el riesgo, evaluar nuevas terapias y tratar la AD con intervencion temprana una vez que se ha desarrollado. Se cree que la patologfa de la AD, que incluye las placas amiloides y ovillos neurofibrilares, aparece muchos anos antes de que se manifiesten los smtomas y antes de que ocurra cualquier neurodegeneracion sustancial. El descubrimiento de marcadores medibles tempranos espedficos a la AD, como las placas de Ap en la retina, que pueden predecir el desarrollo de la patologfa cerebral y el deterioro cognitivo en sujetos aun cognitivamente normales, es especialmente necesario. Los hallazgos de los inventores en modelos de ratones con AD respaldan el uso de imagenes de placas retinianas in vivomarcadas con curcumina como una herramienta no invasiva para la indicacion temprana de la patologfa de la AD y la respuesta a una intervencion terapeutica.

Ademas, se describen en la presente terapias de vacunacion para reducir y/o eliminar las placas de Ap en la retina, a menudo asociadas con la degeneracion de los ojos y la vista en pacientes con AD. Se usaron peptidos derivados de la mielina o agonistas debiles de los peptidos derivados de la mielina para inducir eficazmente la neuroproteccion y para reducir la formacion de placa en la retina.

En resumen, identificamos las placas de Ap en retinas humanas y describimos un nuevo enfoque para detectar y monitorear la patologfa de la placa de Alzheimer antes y mas facilmente que en el cerebro, mediante la formacion de imagen de las placas de Ap en la retina mediante el uso de un compuesto administrado sistemicamente, demostrando seguridad en los humanos. Esto puede predecir el desarrollo de la patologfa cerebral y el deterioro cognitivo en sujetos que aun son cognitivamente normales y mucho antes de que se observe un deficit funcional significativo. Estos hallazgos muestran que la imagen optica de la retina puede usarse como un enfoque no invasivo para monitorear la progresion de la AD y la respuesta a las intervenciones terapeuticas [48].

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar mejor la invencion reivindicada y no deben interpretarse como limitante del alcance de la invencion. Hasta el punto que se mencionan los materiales espedficos, es solo para propositos de ilustracion y no se pretende limitar la invencion. Un experto en la tecnica puede desarrollar medios o reactivos equivalentes sin el ejercicio de la capacidad inventiva y sin apartarse del alcance de la invencion.

Ejemplo 1 (para propositos de informacion y referencia)

Los resultados de los depositos de Ap en la retina del raton con AD pueden visualizarse mediante el uso de curcumina

Se utilizaron ratones AD-Tg que portaban los transgenes de APPswe y PS1dE9 humanos para evaluar el potencial de desarrollar una herramienta no invasiva para detectar las placas de Ap en el ojo. Primero se verifico que la curcumina tema una afinidad con las mismas placas que fueron detectadas por anticuerpos espedficos para Ap humano en el hipocampo de ratones AD-Tg (Figura 1a; canales separados Figuras 1b y 1c). A mayor aumento, las imagenes muestran el patron de tincion espedfico obtenido despues de cada procedimiento (Figuras 1d y 1e). Las placas de Ap humanas no se detectaron en los cerebros de ratones de tipo silvestre (wt) de la camada no Tg (Figura 1f). Despues se probo si las placas de Ap en los ojos de los ratones AD-Tg podfan unirse ademas a la curcumina. El examen a alta resolucion revelo la presencia de placas de Ap marcadas por curcumina y anticuerpos anti-Ap humanos en las retinas de ratones AD-Tg (Figura 1g - 1i, retina de montaje completo; Figura 1k- 1m, seccion transversal) pero no en las retinas de ratones no Tg (wt) (Figura 1j y 1n). Las imagenes representativas muestran la ubicacion de las placas de Ap en las preparaciones completas de retina a varias profundidades (adquisicion consecutiva en planos focales de 80 pm de profundidad) para incluir la capa plexiforme interna (IPL; Figura 1g), la capa nuclear interna (INL)/capa plexiforme externa (OPL; Figura 1h), y capa nuclear externa (ONL; Figura 1i). El analisis de las secciones transversales verifico ademas el deposito de la placa de Ap en las capas retinianas profundas y la coroides, con un predominio aparente en la capa de celulas ganglionares (GCL) e IPL a traves de las capas OPL (Figura 1k - 1m). Mientras que las placas de Ap humano estaban ausentes en las camadas no-Tg (wt) (Figura 1j y 1n), se detectaron pequenas placas de curcumina

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positivas ocasionales. Para determinar la naturaleza de estas placas pequenas y dispersas que se detectaron mediante la tincion con curcumina en ratones silvestres, realizamos un experimento de doble tincion con curcumina y anticuerpos espedficos para Ap de raton en las preparaciones completas de retina de ratones silvestres de 10 meses de edad. De hecho, se encontro que las pequenas placas detectadas por la curcumina en las retinas wt estaban marcadas conjuntamente con los anticuerpos anti-Ap de raton, lo que confirma su identidad como depositos de Ap de raton formados endogenamente en el raton (Figuras 8a - 8d).

Ejemplo 2 (para propositos de informacion y referencia)

Resultados de las placas de Ap que se forman en las retinas de los pacientes con AD y pueden visualizarse con curcumina

A continuacion, examinamos la presencia de placas de Ap en los ojos de pacientes con diagnostico definitivo de AD postmortem (n=9; intrvalo de edad de 48 a 94 anos; diferentes severidades de la enfermedad, categorizadas segun sus informes de neuropatologfa), y en ojos de controles normales postmortem emparejados por edad (n=4; 66 a 92 anos; ver registros de donantes oculares humanos en (ver Tabla 1). La autofluorescencia y las senales inespedficas de los ojos humanos fijados que se observaron con una excitacion de 360-710 nm y asociaron con los depositos de lipofuscina/lipidos y/o fijacion a largo plazo con formalina [21, 22] se eliminaron mediante la tincion de negro sudan B (Figura 2). Para la tincion de curcumina, primero sumergimos retinas humanas de montaje completo con negro sudan B (Figura 2a y 2c; no se observaron placas), seguido de exposicion a la curcumina (Figura 2b y 2d; las imagenes representativas muestran placas dentro de la misma ubicacion del tejido). Se encontraron placas detectadas por curcumina, que vanan en tamano de 1 a 10 pm (tfpicamente alrededor de 5 pm), en todos los ojos de pacientes con AD examinados, a varias profundidades focales correspondientes a las capas retinianas GCL, IPL e INL (Figura 2a y 2g), y con una aparente correlacion con la patologfa de placa informada en el cerebro. Se analizaron ademas las retinas humanas con anticuerpos dirigidos contra Ap humano. Identificamos placas de Ap en pacientes con AD y encontramos que su estructura era similar a la encontrada en la retina y el cerebro del raton [las Figuras 2h y 2i representan las capas retinales mas internas (es decir, GCL) donde las placas se detectan facilmente; la Figura 2i es una imagen de mayor aumento de la estructura de la placa Ap retiniana; la figura 2j representa planos focales consecutivos mas profundos (es decir, IPL)]. Las placas no pudieron detectarse cuando solo se usaron anticuerpos secundarios (datos no mostrados). La exposicion de las retinas humanas a la curcumina despues de su inmunomarcaje para Ap, confirmo su colocalizacion (Figura 2k - 2m). En ojos humanos sin AD, no se detectaron placas de Ap (Figura 2n).

Tabla 1

Paciente #

Genero1& Edad (anos) Diagnostico Premortem (Duracion de la Enfermedad) Neuropatologia post mortem Diagnostico final Causa de muerte

412

H, 48 Demencia, AD (10 anos) NP y NFT de moderados a frecuentes en el neocortex y el hipocampo AD definitivo Atrofia cerebral con hidrocefalia

404

H, 65 Demencia, AD (5 anos) Num. grande de placas difusas, NP, NFT en la corteza entorrinal e hipocampo AD definitivo N/A

435

M, 70 Demencia, AD (5 anos) Num. moderado de NP y NFT AD definitivo Neumoma de los pulmones posteriores.

539

M. 78 Demencia (3 anos) Num grande de NP con nucleos y NFT abundantes y placas difusas AD definitivo Hematoma subdural

484

M, 86 Demencia, AD (11anos) NFT y NP abundantes en el neocortex e hipocampo AD definitivo Infarto de cerebro y cerebelo

664

M, 87 Demencia, AD (8 anos) NP moderados a frecuentes con NFT en el neocortex e hipocampo CA-1 AD definitivo Infarto de cerebro

486

H, 88 Demencia, AD (6 anos) NP y NFT severos AD definitivo Neumoma

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H, 90 Demencia, AD2 (14 anos) NP leves5 y NFT abundantes4 AD definitivo6 Infarto de hemorragia cerebral focal

525

H, 94 Demencia, AD (11 anos) NP abundantes con nucleos maduros y numerosos NFT AD definitivo Infarto de cerebro

93-78

M, 66 Ausencia de demencia normal N/A Cerebro normal Insuficiencia hepatica

93-111

M, 77 Ausencia de demencia normal N/A Cerebro normal Sepsis

476

M, 88 Ausencia de demencia occipital CVA5 NP y NFT neocorticales dispersos Cerebro normal Infartos cerebrales

529

H, 92 Ausencia de demencia normal Num. moderado de placas difusas y num. pequeno de NP solo en el hipocampo Cerebro normal Infarto cerebrales remotos multiples

1 Genero: F=Hembra, M=Macho 2 AD - enfermedad de Alzheimer 3 Placas neunticas (NP) 4y Ovillos Neurofibrilares (NFT) se determinaron mediante tincion de plata (Gallyas o Bielschowsky) y tincion de tioflavina en varios sitios del SNC: Hipocampo CA-1, Corteza Entorinal, Frontal Medio, Sup./Mid. Temporal, Parietal inferior, Visual primario, Area de asociacion visual. 5 CVA - Accidente vascular cerebral o accidente cerebrovascular. 6 AD definitivo - De acuerdo con los criterios de CERAD.

Ejemplo 3 (para propositos de informacion y referencia)

Los resultados de las placas de Ap en ratones con AD, tenidas in vivo con curcumina, se detectan en la retina antes que en el cerebro y se acumulan durante la progresion de la enfermedad

Para establecer el uso de la curcumina en las placas de imagen en la retina, se probo su biodisponibilidad en el ojo cuando se inyecta sistemicamente. Con esta finalidad, los ratones se inyectaron por via intravenosa con la curcumina. Placas marcadas que siguen a la curcumina administrada se pudieron detectar en las retinas y los cerebros de los ratones AD-Tg, pero no en los controles no-Tg (wt) (Figura 3). Estos hallazgos confirmaron que la curcumina atraviesa la barrera hematoencefalica y sugiere que atraviesa tambien la barrera de la retina en sangre y tiene una alta afinidad por las placas de Apin vivo. Es importante destacar que las placas marcadas con curcumina podnan detectarse despues de una unica inyeccion de curcumina o despues de multiples inyecciones. Las proyecciones representativas del eje z del hipocampo de la retina y el cerebro y las imagenes corticales de ratones con AD-Tg a las edades de 2,5, 5, 9 y 17 meses demostraron una correlacion dependiente de la edad entre el deposito de la placa en la retina y el cerebro, y una mayor acumulacion en el transcurso de la progresion de la enfermedad (Figura 3a - n). Es importante destacar que las placas se detectaron en la retina (Figura 3a y 3b) pero no en el cerebro (Figura 3c y 3d) tan pronto como a los 2,5 meses de edad en ratones con AD-Tg despues de la administracion in vivo de la curcumina, lo que sugiere que las placas de Ap en las retinas preceden a la patologfa cerebral. Confirmamos ademas que estas placas marcadas con curcumina se colocalizan ex vivo con la tincion del anticuerpo anti-Ap humano (Figura 3b y 3f). Las placas de Ap se detectaron por primera vez en el cerebro a la edad de 5 meses (Figura 3g y 3h), en lmea con las descripciones previas del inicio de la enfermedad y la progresion en esta cepa de ratones AD-Tg [23]. En los ratones silvestres, las placas de Ap no se detectaron tanto en la retina (Figura 3o) como en el cerebro (Figura 3p y 3q) hasta los 9 meses de edad.

Ejemplo 4 (para propositos de informacion y referencia)

Resultados de la carga de la placa de Ap disminuye en la retina despues de la terapia de vacunacion

Se investigo ademas si el destino de las placas retinianas observadas en los ratones AD-Tg es similar al de las placas de Ap en el cerebro en respuesta al mismo tratamiento. Se ha demostrado que los peptidos derivados de la mielina o los agonistas debiles de los peptidos derivados de la mielina inducen eficazmente la neuroproteccion y reducen la formacion de placa [24-26]. Para garantizar el efecto beneficioso de la vacunacion sin el riesgo de inducir encefalomielitis autoinmune, elegimos vacunar ratones AD-Tg con un peptido alterado derivado de la mielina (MOG45D, derivado de MOG 35-5527,28) con el uso de celulas dendnticas (DC) como portador y adyuvante. Las preparaciones completas de retinas de ratones AD-Tg de 10 meses inyectados ya sea con las DC cargadas con MOG45D o con PBS, y las camadas silvestres (4 ratones/8 retinas por grupo), se marcaron ex vivo para placas de Ap, mediante el uso tanto de curcumina como de anticuerpo anti-Ap (Figura 4). Las imagenes representativas de proyeccion axial (pila-z) demostraron una reduccion sustancial del numero de placas de Ap en ratones AD-Tg vacunados en comparacion con

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los controles tratados con PBS (Figura 4a - 4c frente la Figura 4d y 4f, respectivamente; canales separados en las Figuras 4b y 4c, y las Figuras 4e y 4f). No se detectaron placas de Ap (doble tincion con curcumina y anticuerpo antihumano Ap) en los ratones silvestres (Figura 4g). En imagenes de alta resolucion, se detectaron placas retinianas pequenas (en su mayona <1 pm de diametro), que se originaron a partir del gen de APP endogeno de raton (Figura 8). Estas pequenas placas se tineron con curcumina pero no con anticuerpos anti-Ap humanos en los tres grupos experimentales (Figuras 4a, 4d y 4g). Ademas, se cuantifico el numero y el tamano de la placa capturando 12 areas (un total de aproximadamente 0,45 mm2) alrededor del disco optico, y se cuantificaron las placas en una profundidad de barrido de 60 pm en cada area (Figura 4h; cada area se indica mediante el rectangulo 1-12). Se encontro una disminucion significativa en el numero de placas detectadas con la tincion con curcumina en las retinas de ratones AD- Tg vacunados en comparacion con los controles tratados con PBS (Figura 4i; P=0,0028). Tambien se observo una reduccion sustancial en el area promedio cubierta por las placas retinianas en ratones AD-Tg vacunados frente a los tratados con PBS (Figura 3j; P=0,0002). Notablemente, se observo una reduccion significativa, en relacion con los ratones tratados con PBS, en el area total de la placa en el hipocampo y la corteza de los cerebros de los mismos ratones vacunados (Figura 4k; P=0,0085).

Ejemplo 5

Resultados de las imagenes in vivo de las placas de Ap en los ojos con el uso de la curcumina inyectada sistemicamente

Para investigar mas a fondo el potencial de visualizacion de las placas de Ap con la curcumina en los ojos de sujetos vivos, primero se probo nuestra capacidad para identificar las placas de Ap en las preparaciones completas de retinas de ratones que no se perfundieron antes de su enucleacion ocular, un entorno mas fisiologico. Las imagenes representativas de la proyeccion axial demostraron que incluso bajos esas condiciones, que inclrnan senales de fondo de los globulos rojos en los capilares, las placas podfan identificarse en las retinas de los ratones AD-Tg que habfan sido previamente inyectados i.v. con la curcumina (Figura 5a). Es importante destacar que, en ausencia de la curcumina, las placas fueron indetectables en los ratones AD-Tg que habfan sido inyectados i.v. con PBS (Figura 5b), lo que sugiere que cuando se usan estas modalidades de imagen, las placas son apenas detectables en la retina unicamente mediante sus senales de autofluorescencia. Como se esperaba, en los ratones no-Tg (wt) inyectados con curcumina, tampoco se detectaron placas (Figura 5c). El marcaje adicional de las placas con anticuerpos anti-Ap humanos ex vivo, confirmo la especificidad de Ap de la tincion con curcumina (datos no mostrados). Se encontraron las placas de Ap en las preparaciones completas de retinas de ratones ADTg marcados con anticuerpos anti-Ap dentro de los vasos sangumeos, asf como en sus cercamas parenquimales (Figura 5d; corte transversal confocal virtual). Se evaluo ademas si sena posible detectar placas de Ap al tiempo de reducir la senal de fondo que emerge de los vasos sangumeos. Con esta finalidad, se monitoreo la firma optica espedfica con el uso de un microscopio de fluorescencia (Nikon TE2000) que incluye una tecnologfa de imagenes multiespectrales, compuesta por las imagenes espectrales con filtros sintonizables acustico-opticos (AOTF) [29] e imagenes de tiempo de vida fluorescente con el uso de una camara cerrada; la adquisicion de la imagen se siguio por una segmentacion y clasificacion de la imagen despues del analisis mediante el uso de un programa que se desarrollo previamente [30]. Se observaron las placas marcadas con curcumina obtenidas mediante un microscopio equipado con AOTF en un solo canal de longitud de onda en la retina del raton AD- Tg (Figura 5e). Al aplicar la imagen basada en AOTF, capturar la firma espectral de las placas marcadas con curcumina y la traduccion posterior a imagenes digitales clasificadas por color, se pudo identificar la firma optica espedfica de las placas de Ap como senales "verdaderas", mientras que eliminamos el ruido de la autofluorescencia generado por los vasos sangumeos (Figura 5f). Para investigar la factibilidad de nuestro enfoque para la deteccion de la placa no invasiva, se realizo una imagen in vivo de la retina en ratones vivos mediante el uso de un estereomicroscopio modificado (Leica S6E) con una fuente de luz controlada por longitud de onda y una camara digital. Despues de una inyeccion unica de curcumina (7,5 mg/kg) dos horas antes de la obtencion de imagenes, las placas marcadas con curcumina estaban visibles en la retina de ratones AD-Tg espedficamente a una longitud de onda de excitacion de 546/15 nm (Figura 5g - 5j). Se detectaron las placas en su mayona en las areas cercanas al disco optico. El tamano promedio de la placa fue compatible con el observado en la preparacion completa de la retina (ex vivo). No se detectaron placas en los ratones no-Tg (wt) inyectados i.v. con curcumina (Figura 5k) o en ratones AD-Tg que no recibieron inyeccion de curcumina (datos no mostrados). Para verificar que las senales capturadas por el estereomicroscopio modificado se originaron a partir de las placas, los ratones se sometieron a eutanasia y se confirmo la presencia de las placas marcadas con curcumina en las preparaciones completas de la retina (datos no mostrados).

Ejemplo 6 (para propositos de informacion y referencia)

Ratones

Ratones doble transgenicos (hembras y machos en igual numero) que albergan los genes de la APP quimerica de raton/humano (APPswe) y la presenilina 1 humana mutante (supresion en el exon 9 - PSEN1AE9) y sus camadas no-Tg pareadas por edad se adquirieron en los Laboratorios Jackson (Bar Harbor, ME, cepa # 4462) y se criaron y mantuvieron en el centro animal de medicina comparativa del Centro Medico Cedars-Sinai (Los Angeles, CA). Todos los experimentos se aprobaron y realizaron de acuerdo con los reglamentos disenados por el Comite Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Cedars-Sinai.

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Ejemplo 7 (para propositos de informacion y referencia)

Genotipado

El ADN genomico se extrajo a partir de 0,5 cm de la punta de la cola con el uso de un estuche de extraccion de ADN (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Los ratones utilizados en este estudio se genotiparon para la presencia de los transgenes por PCR como se describio anteriormente (Jankowsky, 2004, Ref. #120).

Ejemplo 8 (para propositos de informacion y referencia)

Preparaciones de vacunacion

El peptido derivado de la mielina modificado (MOG45D) se deriva del peptido encefalitogenico MOG(35-55) (Koehler, 2002, Ref. #285; Shao, 2002, Ref. #283; Zhong, 2002, Ref. #284; Hauben, 2001, Ref. #28; y Hauben, 2001, Ref. #35). Para las vacunaciones, se agrego MOG45D (Invitrogen, Carlsbad, CA) a las celulas dendnticas derivadas de la medula osea de ratones donadores de la camada no-Tg. La preparacion de las celulas dendnticas para la vacunacion fue como se describio anteriormente (Hauben, 2003, Ref. #34).

Ejemplo 9 (para propositos de informacion y referencia)

Regimen Experimental de Vacunaciones

Ratones AD-Tg a la edad de 7 meses se inyectaron con DC-MOG45 (0,5x106 celulas/200 ml en PBS1x por animal) una vez al mes durante tres meses. Los grupos de control de ratones AD-Tg de 7 meses de edad se inyectaron con PBS 1 x de acuerdo con los regfmenes correspondientes. Al final del estudio, todos los ratones se perfundieron bajo anestesia con PBS 1 x despues del paraformaldehndo al 2,5% ("PFA") (Sigma) y se recogieron sus cerebros y ojos para un analisis adicional.

Ejemplo 10 (para propositos de informacion y referencia)

Tejido animal

Los ratones se anestesiaron y se perfundieron con PFAtamponado al 4% enfriado con hielo, y un grupo de ratones no se perfundio. Sus ojos se enuclearon y se fijaron inmediatamente con PFA fresco al 4% durante la noche. Para las preparaciones completas de retinas, se diseccionaron los ojos y se extrajo la parte anterior. Los oculares se empaparon durante 10 minutos en hialuronidasa (tipo I-S) (0,07 mg/ml) (Sigma) para licuar y eliminar los residuos vftreos, despues se lavaron durante 10 minutos x 3 en PBS, y se recogieron todas las preparaciones completas de las retinas. Para seccionar todo el ojo, los ojos se pusieron en sacarosa al 30% en PFA al 4% durante 2 horas, despues se lavaron durante 15 minutos x3 en pBs. Los ojos se embebieron en O.C.T y se congelaron lentamente en hielo seco, despues se seccionaron en el plano sagital (7 pm) con el criostato. Se recolectaron los cerebros y se fijaron inmediatamente en PFA fresco al 4% durante la noche. Los cerebros se colocaron en un gradiente de sacarosa al 30% (en PFA al 4%). Se lavaron los cerebros durante 15 minutos x3 en PBS, despues se embebieron en O.C.T y se congelaron lentamente en hielo seco, despues se seccionaron en el plano coronario (30 pm) con el criostato.

Ejemplo 11 (para propositos de informacion y referencia)

Autopsia de ojos humanos

La autopsia de los ojos de pacientes con Alzheimer se obtuvo del Centro de Investigacion de la Enfermedad de Alzheimer, Departamento de Patologfa, Universidad del Sur de California (Los Angeles, CA), bajo los protocolos 99491 y 3201 de IRB. Se adquirieron los ojos de donantes sanos del Intercambio Nacional de Investigacion de Enfermedades (NDRI, Filadelfia, PA). El NDRI tiene un protocolo de recoleccion de tejido humano aprobado por un comite de gestion y sujeto a la supervision de los Institutos Nacionales de la Salud. Se fijaron y almacenaron los ojos enfermos y normales en formalina tamponada neutra al 10%. Ademas, se utilizaron dos ojos sanos que se congelaron sin fijacion y se almacenaron a -80oC. Se prepararon las preparaciones completas de la retina a partir de los ojos y se estudiaron posteriormente mediante inmunohistoqmmica.

Ejemplo 12

Inyeccion de la curcuminaen la vena de la cola

Para obtener imagenes in vivo de la placa de Ap, se inyectaron por via intravenosa ratones AD-Tg y tipo silvestre no-Tg en la vena de la cola con curcumina en PBS (7,5 mg/kg/dfa, durante 7 dfas consecutivos) o con PBS. Posteriormente, los cerebros y los ojos se sometieron a crioseccion o se prepararon para la preparacion completa de la retina. En una modalidad alternativa, la curcumina puede administrarse al paciente por via oral.

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Ejemplo 13 Inmunohistoqmmica

Las criosecciones cerebrales (30 pm de espesor), secciones transversales de retina (criosecciones) (7 pm de espesor) y preparaciones completas de la retina se trataron con una solucion de permeabilizacion/bloqueo que contiene 20% de suero de caballo (Invitrogen) y Triton X-100 al 0,01-0,1% (Sigma-Aldrich, San Luis, MO). Las secciones se tineron durante la noche a 4°C con una combinacion especifica de los siguientes Ac primarios en PBS que conteman solucion de bloqueo al 10%: anti-Ap de raton [residuos de aminoacidos humanos 1-17; clon 6E10 (1: 100; Milipore, Temecula, CA)]. Las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con los Ac secundarios, despues se lavaron tres veces con PBS 1 x y se montaron con el uso de un Vectorshield que contema o no diclorhidrato de 4',6-diamidino-2- fenilindol, (DAPI, Vector Laboratories, Peterborough, Reino Unido). La solucion de los Ac secundarios en PBS 1 x contema anticuerpo anti-raton de burro conjugado con Cy-5 (1:200; Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Se proceso un control negativo con el mismo protocolo con la omision del anticuerpo primario para evaluar el marcaje no espedfico. Para el analisis microscopico se utilizo un microscopio fluorescente Zeiss ApoTome.

Ejemplo 14

Tincion con la curcumina

La solucion de curcumina a 0,1 mg/ml se preparo disolviendo la curcumina (Sigma-Aldrich) en NaOH 0,5 M, pH = 7,9, despues de la dilucion inmediata en PBS 1 x. Las criosecciones de tejido de cerebro y retina (30 pm y 7 pm de espesor respectivamente) y las preparaciones competas de la retina se tineron con la solucion de curcumina durante 10 minutos a temperatura ambiente, despues se enjuagaron tres veces con PBS 1 x durante 15 minutos cada uno. Las muestras se cubrieron con el medio de montaje GVA (Zymed).

Se conocen compuestos adicionales en la tecnica que pueden tenir/marcar las placas de amiloide in vivo, incluidas la tioflavina S y T y algunos derivados, rojo Congo y derivados, metoxi-X04, Compuesto B de Pittsburgh (PiB), DDNP, crisamina-G y varios mas. Sin embargo, la curcumina y sus derivados son muy atractivos para las imagenes opticas in vivo de las placas de amiloide en los modelos animales y humanos, debido a la siguiente ventaja. La curcumina genera senales espedficas y muy brillantes en el espectro optico de uso comun, y esta disponible comercialmente, con un costo excepcionalmente bajo. Los problemas de seguridad relacionados con la curcumina son mmimos (incluso en dosis altas) y pueden considerarse beneficiosos para la salud del paciente como antioxidante. La curcumina es un ligando eficaz con muy buenas caractensticas de union in vitro e in vivo al Ap, y ofrece una buena tasa de captacion y lavado inicial del cerebro (propiedades importantes para los agentes de formacion de imagenes in vivo).

Ejemplo 15

Cuantificacion

Se obtuvieron micrograffas de tejidos tenidos en un microscopio equipado con ApoTome Axio Imager Z1 (con unidad Z motorizada) con la camara monocromatica AxioCam MRm version. 3.0 (a una resolucion de 1388 x 1040 pfxeles, tamano de pixel de 6,45 pm x 6,45 pm, rango dinamico de> 1:2200, que suministra imagenes de bajo ruido debido al sensor de enfriamiento por Peltier). El analisis cuantitativo del numero de placas Ap y el area (pm2) se realizo a partir de dos preparaciones completas de retinas por raton (n=4 ratones por grupo). Cada imagen, capturada con un objetivo de 40x y una resolucion de 0,28 pm, inclma un area de 0,04 mm2 y un total de 12 areas rectangulares alrededor del disco optico dentro de una profundidad de escaneo de 60 pm (multiples imagenes de secciones virtuales en planos focales consecutivos con el uso de una etapa de escaneo motorizado). Se completaron mediciones del radio de la placa promedio (despues de la tincion con la curcumina) para cada grupo de animales, seguido de un calculo del area de la placa promedio en cada grupo de animales. Para la adquisicion, se utilizaron tiempos de exposicion similares (aproximadamente 75 ms) y los mismos valores de ganancia (0) para todas las imagenes. No se realizo postprocesamiento de las imagenes. Las senales de emision de las placas de Ap^ tenidas con curcumina se compararon con las senales de fondo en el tejido retiniano, para determinar la relacion entre senal y fondo. La relacion del ruido de senal-fondo calculada para las imagenes fue alta y dentro del intervalo de 3:1 a 10:1. El analisis cuantitativo del numero de placa Ap y el area (pm2) en el cerebro se determino a partir de tres secciones coronales (dos hemisferios cada una) por raton con intervalos de 450 pm, en un area que cubre las regiones de hipocampo y cortical. Se importaron secciones opticas de cada campo de la muestra al programa NIH Image J (Institutes Nacionales de la Salud). La conversion a escala de grises se realizo para distinguir entre las areas de inmunorreactividad y las referencias. El area total y los niveles cuantitativos de inmunorreactividad se determinaron mediante el uso de una tecnica de umbral basada en histogramas personalizada y estandarizada, y despues se sometieron al analisis de las partteulas.

Ejemplo 16

Imagenes espectrales y multiespectrales.

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Las imagenes espectrales proporcionan imagenes digitales de un objeto en un gran numero secuencial de longitudes de onda que generan firmas opticas precisas en cada p^xel. Nuestro sistema de imagenes espectrales capturo la firma espectral de fluorescencia de las placas de Ap, marcadas in vivo con curcumina, mediante el uso del siguiente equipo: Los microscopios de fluorescencia Nikon (E800 y TE2000), lamparas de arco de mercurio y xenon, una camara CCD, un sistema de adquisicion de imagenes espectrales basado en AOTF (filtros de ajuste acustico-optico) (ChromoDynamics, Inc) [29] y el programa de analisis de imagen desarrollado por nuestro Instituto de Tecnologfas Quirurgicas Mmimamente Invasivas [30]. Las imagenes finales proporcionaron una representacion visual en pseudocolor de la firma espectral extrafda de las imagenes sin procesar, que representan el tamano y la ubicacion de los objetos analizados. En las imagenes multiespectrales, la imagen de tiempo de vida fluorescente, realizada con un laser pulsado y una camara cerrada LaVision PicoStar HR, complementaba la adquisicion espectral.

La Figura 6 representa un diagrama de flujo de un sistema de imagenes espectrales 100 para diagnosticar, pronosticar y analizar las placas de Ap in vivo de acuerdo con una modalidad de la presente invencion. La materia retina 110 se tine con un marcador fluorescente para marcar las placas de Ap. Poco despues, la retina tenida 110 recibe imagenes de un dispositivo de imagenes 120 que se ajusta para visualizar las senales de fluorescencia y dispersion a resoluciones mas altas. El dispositivo de imagenes 120 puede equiparse con una fuente de luz espectral variable Policromatica V 130. En modalidades adicionales, el sistema de imagenes espectrales 100 puede incorporar una camara digital de color 140 (por ejemplo, MicroFire) y uno o mas lentes de aumento para mejorar la ampliacion y el detalle de la imagen. La adquisicion de imagenes 170 se logra mediante la segmentacion y clasificacion de imagenes posteriores al analisis mediane el uso del programa de imagenes 160.

La Figura 7 representa un diagrama de flujo de un sistema de imagenes espectrales 200 para diagnosticar, pronosticar y analizar placas de Ap de acuerdo con una modalidad de la presente invencion. La materia retina 210 se tine con un marcador fluorescente para marcar las placas de Ap. Poco despues, se toma una imagen de la retina tenida 210 mediante el uso de un dispositivo de imagenes 220. El dispositivo de imagenes 220 puede equiparse con tecnologfa de imagenes multiespectrales, que comprende imagenes espectrales con filtros ajustables acustico-opticos (AOTF) 230 e imagenes de tiempo de vida fluorescente mediante el uso de una camara digital 240. La adquisicion de imagenes 260 se logra mediante la segmentacion y clasificacion de imagenes posteriores al analisis mediante el uso del programa de imagenes 250.

Ejemplo 17

Imagenes in vivo de la retina del raton.

Se tomaron imagenes de las retinas de ratones AD-Tg y silvestres dos horas despues de la inyeccion intravenosa de la curcumina. Los ratones se anestesiaron con ketamina 100mg/ml/kg y Xilazina 20mg/ml/kg. Las pupilas de raton se dilataron hasta aproximadamente 2 mm de diametro con una solucion oftalmica de clorhidrato de fenilefrina al 0,5% (Bausch & Lomb) combinada con una solucion oftalmica de tropicamida al 0,5% (Mydral; Bausch & Lomb). Durante el proceso de obtencion de imagenes, los ratones se colocaron en una fase del estereomicroscopio y el ojo se cubrio con una gota de PBS suplementado con calcio y magnesio, que sirvio como medio de acoplamiento optico entre la superficie del ojo y la lente de obtencion de imagenes. Se uso un estereomicroscopio modificado (Leica S6E) que se ajusto para visualizar las senales de fluorescencia y dispersion a una resolucion mas alta para capturar imagenes (tiempo de exposicion 750 ms con ganancia 4). El estereomicroscopio modificado se monto para incluir una fuente de luz de longitud de onda variable Policromatica V (Till Photonics), una camara digital en color MicroFire (Optronics) y una lente de aumento adicional 6x (doble convexa), con una longitud focal de 10 cm. Las imagenes se capturaron repetidamente en varios angulos diferentes, para visualizar un campo mas grande y eliminar las senales de reflexion no espedficas.

Ejemplo 18

Analisis estadfstico

Los resultados se analizaron mediante una prueba t de Student no pareada para los valores de p de la comparacion de dos grupos. Los resultados se expresan como la media ± SD.

Se entendera por aquellos dentro del estado de la tecnica que, en general, los terminos usados en la presente descripcion deben entenderse generalmente como terminos "abiertos" (por ejemplo, el termino "que incluye" debe interpretarse como "que incluye, pero no se limita a", el termino "que tiene" debe interpretarse como "que tiene al menos", el termino "incluye" debe interpretarse como "incluye pero no se limita a", etc.).

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Claims (12)

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   Reivindicaciones

   1. La curcumina para su uso en un metodo para diagnosticar o pronosticar la enfermedad de Alzheimer en un mairnfero, dicho metodo que comprende:

   administrar sistemicamente curcumina al mam^fero;

   formar imagenes de la retina del mam^fero con un sistema optico de imagenes; examinar las imagenes para los peptidos Ap tenidos; y ya sea

   (i) diagnosticar que el marnffero tiene la enfermedad de Alzheimer si estan presentes los peptidos Ap tenidos; o

   (ii) cuantificar el aumento/disminucion de peptidos de Ap tenidos en la retina del sujeto, en comparacion con un diagnostico previo; y

   generar un pronostico basado en el nivel de peptidos de Ap tenidos en la retina del sujeto.
2. 2. La curcumina para su uso en un metodo para evaluar la efectividad del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer en un mamnfero que comprende:

   administrar sistemicamente curcumina al mamffero;

   formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; examinar las imagenes para peptidos de Ap tenidos; y

   evaluar la efectividad del tratamiento de la enfermedad de Alzheimer basado en el nivel de peptidos de Ap tenidos en la retina del mamffero.
3. 3. La curcumina para su uso en un metodo para evaluar la efectividad del tratamiento para una dolencia retiniana asociada al peptido Ap en un mamffero, dicho metodo que comprende:

   administrar sistemicamente curcumina al mamffero;

   formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; examinar las imagenes para peptidos de Ap tenidos; y

   evaluar la efectividad del tratamiento para el peptido de asociado a la dolencia de la retina en funcion del nivel de peptidos de Ap tenidos en la retina del mamffero.
4. 4. La curcumina para su uso en un metodo para identificar los peptidos de Ap en la retina de un mamffero, dicho metodo que comprende:

   administrar sistemicamente curcumina al mamffero;

   formar imagenes de la retina del mamffero con un sistema optico de imagenes; y examinar las imagenes para peptidos de Ap tenidos.
5. 5. La curcumina para su uso como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el metodo comprende ademas:

   proporcionar una representacion visual de las imagenes en pseudocolor, extraer una firma espectral de imagenes sin procesar, que representa el tamano y la ubicacion de las placas de Ap en la retina del mamffero.
6. 6. La curcumina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los peptidos de Ap estan en forma de placas de Ap.
7. 7. La curcumina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la imagen optica se realiza in vivo.
8. 8. La curcumina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el sistema de imagen optico se selecciona del grupo que consiste en un espectrometro, un microscopio de fluorescencia, un estereomicroscopio, una lampara de arco de mercurio, una fuente de luz de longitud de onda variable, una lampara de arco de xenon, una camara cerrada CCD, una camara digital en color, un sistema de adquisicion de imagenes espectrales basadas en filtros ajustables acusticos opticos, opticas adaptativas, programa de imagenes y combinaciones de estos.
9. 9. La curcumina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la cantidad de curcumina administrada es inferior a 12,0 gramos y mayor de 7,5 mg.
10. 10. La curcumina para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la curcumina se administra sistemicamente por inyeccion sistemica.
11. 11. La curcumina para su uso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde la curcumina se administra sistemicamente por inyeccion intravenosa sistemica.
12. 12. La curcumina para su su uso de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde la dolencia retiniana se selecciona de un grupo que consiste en perdida de vision, cataratas, glaucoma, degeneracion macular relacionada con la edad, afecciones neurodegenerativas en las que se acumulan las placas amiloides en la retina y combinaciones de estas.