ES2694425T3 - Uso de derivados de toxina de clostridium para el tratamiento del dolor - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostridial, comprendiendo dicha composición: a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial que escinde una proteína SNARE en condiciones fisiológicas; b) un dominio de translocación derivado de toxina clostridial que facilita el movimiento de dicho primer dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas; c) un dominio de unión derivado de toxina no clostridial que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por una célula diana, siendo seleccionada dicha célula diana del grupo que consiste en i) una neurona sensorial, y ii) una célula que secreta al menos una citoquina inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito, estando dicho receptor de superficie celular sustancialmente ausente de las neuronas motoras o autónomas; d) un dominio HCN funcional derivado de toxina clostridial; y donde dicha proteasa de cadena ligera de dicho derivado de neurotoxina clostridial es asimilada por dicha célula diana tras la unión de dicho TL a la célula diana, y donde un dominio selectivo HCC está ausente o está mutado para impedir la unión del dominio HCC a su receptor de proteína natural.
Description
DESCRIPCIÓN
Uso de derivados de toxina de clostridium para el tratamiento del dolor
5 La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones que implican derivados de neurotoxina clostridial que tienen una capacidad mejorada para interrumpir la exocitosis del dolor y / o mediadores inflamatorios de los nociceptores o inductores de la inflamación, previniendo así el dolor.
La capacidad de las toxinas clostridiales como, por ejemplo, las neurotoxinas botulínicas (BoNT) (incluidos los 10 serotipos BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F y BoNT/G), para inhibir la transmisión neuronal está siendo explotada en una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas y cosméticas, véase, por ejemplo, Ward AB y Barnes MP, 2007, Clinical Users of Botulinum Toxins (Cambridge University Press, Cambridge). Como ejemplo, el agente derivado de BoNT/A BOTOX® está aprobado actualmente en uno o más países para las siguientes indicaciones: acalasia, espasticidad en adultos, fisura anal, dolor de espalda, blefarospasmo, bruxismo, distonía 15 cervical, temblor esencial, líneas glabelares o líneas faciales hipercinéticas, cefalea, espasmo hemifacial, hiperactividad de la vejiga, hiperhidrosis, parálisis cerebral juvenil, esclerosis múltiple, trastornos mioclónicos, líneas labiales nasales, disfonía espasmódica, estrabismo y trastorno nervioso VII.
Existen toxinas clostridiales distintas de las toxinas derivadas de C. botulinum y C. tetanus; estas incluyen, entre 20 otras, las toxinas de C. perfringins, C. septicum, C. difficile, C. spiroforme, C. butyricum y C. barati. Sin embargo, se entenderá que en esta memoria descriptiva una referencia a “toxinas clostridiales” o una referencia similar, se refiere a las neurotoxinas de los subtipos C. botulinum y los subtipos C. tetani, a menos que se indique lo contrario de forma específica o contextual.
25 Además, las terapias de toxina clostridial se utilizan o se proponen para tratar:
a) trastornos neuromusculares, véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Method for Treating Neuromuscular Disorders and Conditions with Botulinum Toxin Types A and B, patente de Estados Unidos N.° 6.872.397 (29 de marzo, 2005); Rhett M. Schiffman, Methods for Treating Uterine Disorders, publicación de patente de Estados 30 Unidos N.° 2004/0175399 (9 de septiembre, 2004); Richard L. Barron, Methods for Treating Ulcers and Gastroesophageal Reflux Disease, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0086531 (7 de mayo , 2004); y Kei Roger Aoki, y col., Method for Treating Dystonia with Botulinum Toxin C to G, patente de Estados Unidos N.° 6.319.505 (20 de noviembre, 2001);
35 b) trastornos oculares, véase, por ejemplo, Eric R. First, Methods and Compositions for Treating Eye Disorders, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0234532 (25 de noviembre, 2004); Kei Roger Aoki y col., Botulinum Toxin Treatment for Blepharospasm, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0151740 (5 de agosto, 2004); y Kei Roger Aoki y col., Botulinum Toxin Treatment for Strabismus, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0126396 (1 de julio, 2004);
40
c) dolor, véase, por ejemplo, Kei Roger Aoki y col., Pain Treatment by Peripheral Administration of a Neurotoxin, patente de Estados Unidos N.° 6.869.610 (22 de marzo, 2005); Stephen Donovan, Clostridial Toxin Derivatives and Methods to Treat Pain, patente de Estados Unidos N.° 6.641.820 (4 de noviembre, 2003); Kei Roger Aoki, y col., Method for Treating Pain by Peripheral Administration of a Neurotoxin, patente de Estados Unidos N.° 6.464.986 (15
45 de octubre, 2002); Kei Roger Aoki y Minglei Cui, Methods for Treating Pain, patente de Estados Unidos N.° 6.113.915 (5 de septiembre, 2000); Martin A. Voet, Methods for Treating Fibromyalgia, patente de Estados Unidos 6.623.742 (23 de septiembre, 2003); Martin A. Voet, Botulinum Toxin Therapy for Fibromyalgia, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0062776 (1 de abril, 2004); y Kei Roger Aoki y col., Botulinum Toxin Therapy for Lower Back Pain, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0037852 (26 de febrero, 2004);
50
d) lesiones musculares, véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks, Methods for Treating Muscle Injuries, patente de Estados Unidos N.° 6.423.319 (23 de julio, 2002);
e) cefalea, véase, por ejemplo, Martin Voet, Methods for Treating Sinus Headache, patente de Estados Unidos N.° 55 6.838.434 (4 de enero, 2005); Kei Roger Aoki y col., Methods for Treating Tension Headache, patente de Estados
Unidos N.° 6.776.992 (17 de agosto, 2004); y Kei Roger Aoki y col., Method for Treating Headache, patente de Estados Unidos N.° 6.458.365 (1 de octubre, 2002); William J. Binder, Method for Reduction of Migraine Headache Pain, patente de Estados Unidos 5.714.469 (3 de febrero, 1998);
60 f) enfermedades cardiovasculares, véase, por ejemplo, Gregory F. Brooks y Stephen Donovan, Methods for
Treating Cardiovascular Diseases with Botulinum Toxin, patente de Estados Unidos N.° 6.767.544 (27 de julio, 2004);
e) trastornos neurológicos, véase, por ejemplo, Stephen Donovan, Parkinson's Disease Treatment, patente de 5 Estados Unidos N.° 6.620.415 (16 de septiembre, 2003); y Stephen Donovan, Method for Treating Parkinson's
Disease with a Botulinum Toxin, patente de Estados Unidos N.° 6.306.403 (23 de octubre, 2001);
g) trastornos neuropsiquiátricos, véase, por ejemplo, Stephen Donovan, Botulinum Toxin Therapy for Neuropsychiatric Disorders, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0180061 (16 de septiembre, 2004); 10 y Steven Donovan, Therapeutic Treatments for Neuropsychiatric Disorders, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2003/0211121 (13 de noviembre, 2003);
f) trastornos endocrinos, véase, por ejemplo, Stephen Donovan, Method for Treating Endocrine Disorders, patente de Estados Unidos N.° 6.827.931 (7 de diciembre, 2004); Stephen Donovan, Method for Treating Thyroid Disorders
15 with a Botulinum Toxin, patente de Estados Unidos N.° 6740321 (25 de mayo, 2004); Kei Roger Aoki y col., Method for Treating a Cholinergic Influenced Sweat Gland, patente de Estados Unidos N.° 6.683.049 (27 de enero, 2004); Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Diabetes, patente de Estados Unidos N.° 6.416.765 (9 de julio, 2002); Stephen Donovan, Methods for Treating Diabetes, patente de Estados Unidos N.° 6.337.075 (8 de enero, 2002); Stephen Donovan, Method for Treating a Pancreatic Disorder with a Neurotoxin, patente de Estados Unidos N.° 20 6.261.572 (17 de julio, 2001); Stephen Donovan, Methods for Treating Pancreatic Disorders, patente de Estados Unidos N.° 6.143.306 (7 de noviembre, 2000);
g) cánceres, véase, por ejemplo, Stephen Donovan, Methods for Treating Bone Tumors, patente de Estados Unidos N.° 6.565.870 (20 de mayo, 2003); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin to Improve
25 Patient Function, patente de Estados Unidos N.° 6.368.605 (9 de abril, 2002); Stephen Donovan, Method for Treating Cancer with a Neurotoxin, patente de Estados Unidos N.° 6.139.845 (31 de octubre, 2000); y Mitchell F. Brin and Stephen Donovan, Methods for Treating Diverse Cancers, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2005/0031648 (10 de febrero, 2005);
30 h) trastornos óticos, véase, por ejemplo, Stephen Donovan, Neurotoxin Therapy for Inner Ear Disorders, patente de Estados Unidos N.° 6358926 (19 de marzo, 2002); y Stephen Donovan, Method for Treating Otic Disorders, patente de Estados Unidos N.° 6265379 (24 de julio, 2001);
i) trastornos autónomos, véase, por ejemplo, Pankai J. Pasricha y Anthony N. Kalloo, Method for Treating 35 Gastrointestinal Muscle Disorders and Other Smooth Muscle Dysfunction, patente de Estados Unidos N.° 5.437.291
(1 de agosto, 1995);
j) así como otros trastornos, véase, por ejemplo, William J. Binder, Method for Treatment of Skin Lesions Associated with Cutaneous Cell-proliferative Disorders, patente de Estados Unidos 5.670.484 (23 de septiembre,
40 1997); Eric R. First, Application of Botulinum Toxin to the Management of Neurogenic Inflammatory Disorders, patente de Estados Unidos 6.063.768 (16 de mayo, 2000); Marvin Schwartz y Brian J. Freund, Method to Reduce Hair Loss and Stimulate Hair Growth, patente de Estados Unidos 6.299.893 (9 de octubre, 2001); Jean D. A. Carruthers y Alastair Carruthers, Cosmetic Use of Botulinum Toxin for Treatment of Downturned Mouth, patente de Estados Unidos 6.358.917 (19 de marzo, 2002); Stephen Donovan, Use of a Clostridial Toxin to Reduce 45 Appetite,publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/40253274 (16 de diciembre, 2004); y Howard I. Katz y Andrew M. Blumenfeld, Botulinum Toxin Dental Therapies and Procedures, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0115139 (17 de junio, 2004); Kei Roger Aoki, y col., Treatment of Neuromuscular Disorders and Conditions with Different Botulinum, publicación de patente de Estados Unidos N.° 2002/0010138 (24 de enero, 2002); y Kei Roger Aoki, y col., Use of Botulinum Toxins for Treating Various Disorders and Conditions and 50 Associated Pain,publicación de patente de Estados Unidos N.° 2004/0013692 (22 de enero, 2004).
La Tabla 2, a continuación, proporciona las secuencias de aminoácidos de los isotipos de varias toxinas clostridiales relacionadas con la toxina botulínica (BoNT y TeTX) conocidas actualmente. Estas toxinas poseen un mínimo de aproximadamente el 35 % de identidad de aminoácidos entre sí y comparten la misma organización del dominio 55 funcional general y la arquitectura estructural general. Estas toxinas clostridiales se traducen cada una de forma natural como un polipéptido monocatenario de aproximadamente 150 kDa que posteriormente se escinde por escisión proteolítica dentro de un bucle de disulfuro mediante una proteasa de origen natural, tal como, por ejemplo, una proteasa endógena de toxina clostridial o una proteasa natural producida en el medio ambiente. Este procesamiento postraduccional produce una molécula di-catenaria madura que comprende una cadena ligera (LC) 60 de aproximadamente 50 kDa y una cadena pesada (HC) de aproximadamente 100 kDa que se mantienen juntas por
un único enlace disulfuro intercatenario e interacciones no covalentes.
Cada molécula de toxina clostridial di-catenaria madura comprende tres dominios funcionalmente distintos: 1) un dominio enzimático ubicado en la LC que incluye una región de metaloproteasa que contiene una actividad 5 endopeptidasa dependiente de zinc que se dirige específicamente a los componentes centrales del aparato de liberación de neurotransmisores (las llamadas proteínas SNARE ("receptores de proteínas de fijación soluble de NSF") que median la fusión de la vesícula sináptica con la membrana celular); 2) un dominio de translocación contenido dentro de la mitad amino terminal de la cadena H (denominada "HN") que facilita la liberación de al menos la cadena LC de la toxina desde un endosoma al citoplasma de la célula diana; y 3) un dominio de unión encontrado 10 dentro de la mitad carboxilo terminal de la cadena H (Hc) que determina la actividad de unión y la especificidad de unión de la toxina. Hc comprende subdominios Hcn y Hcc (las porciones terminales N y C de Hc, respectivamente). Ahora hay pruebas sustanciales de que la mayoría o todas las toxinas BoNT/X se unen a una célula diana mediante un “receptor dual”, donde la porción Hc de la toxina que comprende ambos subdominios Hcn y Hcc se une a ciertos gangliósidos de la superficie celular y un receptor de proteínas (quizás glicosilado); la unión del receptor de 15 proteínas facilita la internalización de la proteína dentro de la célula. Por “X” se entiende cualquier serotipo de toxina botulínica. Aunque el término “BoNT/X” se utiliza generalmente para indicar subtipos de toxina botulínica, el término también puede incluir las regiones TeTX de la misma. Hcc vincula el complejo receptor ubicado en la superficie de la célula diana.
20 Se entenderá que existen cepas de cada una de estas toxinas que pueden variar algo en sus secuencias de aminoácidos en regiones no críticas (denominadas variables) sin un cambio sustancial en la identidad o actividad característica de la toxina o dominio de toxina indicados.
25
En la Tabla 1, a continuación, se proporcionan códigos de aminoácidos de una letra y de tres letras:
Tabla 1
- Aminoácido
- Código de tres letras Código de una letra
- alanina
- Ala A
- arginina
- Arg R
- asparagina
- Asn N
- ácido aspártico
- Asp D
- asparagina o ácido aspártico
- Asx B
- cisteína
- Cys C
- ácido glutámico
- Glu E
- glutamina
- Gln Q
- glutamina o ácido glutámico
- Glx Z
- glicina
- Gly G
- histidina
- His H
- isoleucina
- Ile I
- leucina
- Leu L
- lisina
- Lys K
- metionina
- Met M
- fenilalanina
- Phe F
- prolina
- Pro P
- serina
- Ser S
- treonina
- Thr T
- triptófano
- Try W
- tirosina
- Tyr Y
- valina
- Val V
Tabla 2
Secuencias y regiones de referencia de toxinas clostridiales (identificadas desde la dirección amino a carboxi; número de aminoácidos a número de^ aminoácidos) _______________
- Toxina
- SEQ ID NO: LC Hn Hc
- BoNT/A
- 1 M1-K448 A449-K871 N872-L1296
- BoNT/B
- 2 M1-K441 A442-S858 E859-E1291
- BoNT/C1
- 3 M1-K449 T450-N866 N867-E1291
- BoNT/D
- 4 M1-R445 D446-N862 S863-E1276
- BoNT/E
- 5 M1-R422 K423-K845 R846-K1252
- BoNT/F
- 6 M1-K439 A440-K864 K865-E1274
- BoNT/G
- 7 M1-K446 S447-S863 N864-E1297
- TeNT
- 8 M1-A457 S458-V879 I880-D1315
Los expertos en la materia reconocen que pueden producirse en la naturaleza variantes del dominio clostridial que tienen variaciones naturales en el aminoácido mostrado anteriormente (o en las secuencias de nucleótidos que codifican estas secuencias de aminoácidos). Como se emplea en el presente documento, el término “variante del 5 dominio clostridial” se refiere a cualquier dominio clostridial (endopeptidasa, translocación y / o dominios de unión) producido por un proceso de origen natural, que incluye, entre otros, las isoformas del dominio clostridial producidas a partir de transcripciones empalmadas alternativamente, isoformas de dominio clostridial producidas por mutaciones espontáneas y subtipos de dominio clostridial. Como se emplea en el presente documento, una variante del dominio clostridial de origen natural funciona sustancialmente de la misma manera que el dominio clostridial de referencia en 10 el que se basa la variante del dominio clostridial de origen natural y puede ser sustituida por el dominio clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente invención. Una variante del dominio clostridial de origen natural puede sustituir uno o más aminoácidos, dos o más aminoácidos, tres o más aminoácidos, cuatro o más aminoácidos, cinco o más aminoácidos, diez o más aminoácidos, 20 o más aminoácidos, 30 o más aminoácidos, 40 o más aminoácidos, 50 o más aminoácidos o 100 o más aminoácidos del dominio clostridial de referencia en el que 15 se basa la variante del dominio clostridial de origen natural. Una variante del dominio clostridial de origen natural también puede sustituir al menos 10 aminoácidos contiguos, al menos 15 aminoácidos contiguos, al menos 20 aminoácidos contiguos o al menos 25 aminoácidos contiguos del dominio clostridial de referencia en el cual se basa la variante del dominio clostridial de origen natural que posee al menos un 50 % de identidad de aminoácidos, un 65 % de identidad de aminoácidos, un 75 % de identidad de aminoácidos, un 85 % de identidad de aminoácidos o un 20 95 % de identidad de aminoácidos con el dominio clostridial de referencia en el que se basa la variante del dominio clostridial de origen natural. También se entenderá que las inserciones y supresiones moderadas de aminoácidos también pueden realizarse siempre que la función característica y la identidad del dominio no se alteren sustancialmente.
25 Debido a la degeneración del código genético, un experto en la técnica reconocerá que estas secuencias de aminoácidos pueden codificarse por un conjunto finito de diferentes moléculas de ADN que tienen secuencias de nucleótidos diferentes, pero definidas. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos degeneradas que codifican un péptido o proteína determinados pueden tener diferentes codones adaptados o seleccionados para favorecer la expresión en una célula huésped particular. Mediante esta información, se puede construir un marco de lectura de 30 ácido nucleico abierto expresable para el ensamblaje de una molécula de ácido nucleico que comprende cualquier combinación de estas regiones que codifican el dominio de los aminoácidos, ya sea solo o con secuencias de ácido nucleico adicionales, insertadas en un vector de expresión y expresión subsiguiente adecuados dentro de una célula huésped elegida. Por ejemplo, la publicación de patente internacional WO01/14570 describe procedimientos para fabricar derivados de neurotoxinas clostridiales recombinantes modificables o no modificables escindibles 35 monocatenarios y formas quiméricas e híbridas de los mismos mediante dichos procedimientos. Las publicaciones adicionales que describen procedimientos para fabricar neurotoxinas recombinantes expresables y derivados de las mismas incluyen las patentes de Estados Unidos 5.989.545; 6.203.794; 6.395.513; la publicación de Estados Unidos N.° U.S. 2003/0166238; U.S. 2002/169942; U.S. 2004/176299; U.S. 2004/126397; U.S. 2005/035730; U.S. 2005/068494; U.S. 2006/011966; las solicitudes de patente internacional WO95/32738; WO 99/55359; WO96/33273; 40 WO98/07864; WO99/17806; WO98/07864; WO02/44199; WO02/40506.
El uso de técnicas de ADN recombinante permite la construcción de neurotoxinas clostridiales modificadas que tienen propiedades funcionales diferentes o modificadas de los subtipos de toxinas naturales y las cepas de las mismas. Por ejemplo, la alteración de la secuencia de aminoácidos de origen natural de la cadena ligera de 45 neurotoxina nativa y / o la adición de una fracción terapéutica diferente permite la construcción de proteínas de transporte diseñadas para transportar un agente terapéutico dentro de una neurona. Véase la patente de Estados Unidos N.° 6.203.794. La alteración del dominio selectivo (unión celular) permite que la toxina sea transportada dentro de las células pancreáticas, como las células acinares, evitando así la secreción de enzimas digestivas activadas por dichas células, véase la patente de Estados Unidos N.° 6.843.998 o neuronas aferentes sensoriales, 50 evitando así la liberación del neurotransmisor y por lo tanto, aliviando el dolor; véase la patente de Estados Unidos N.° 6.395.513.
Además, la patente de Estados Unidos N.° 7.422.877 describe la creación de derivados de neurotoxinas quiméricos que comprenden, por ejemplo, el dominio de unión y el dominio de translocación (o versiones modificadas de los 55 mismos) de un subtipo de neurotoxina, por ejemplo, BoNT/A y la región de cadena ligera de otro subtipo de neurotoxina, por ejemplo, BoNT/E. Se verá que, dada la homología estructural general entre los subtipos de
neurotoxinas, cualquier combinación de los tres dominios básicos de neurotoxinas clostridiales puede realizarse en una sola cadena de aminoácidos (o en moléculas dicatenarias escindidas). Por lo tanto, por ejemplo, un dominio de unión de cualquiera de los subtipos de neurotoxina A, B, C1, D, E, F, G, o TeTX puede combinarse independientemente con un dominio de translocación de los subtipos de neurotoxina A, B, C1, D, E, F, G o TeTX y 5 combinarse además de forma independiente con un dominio de endopeptidasa de cualquiera de los subtipos de neurotoxina A, B, C1, D, E, F, G o TeTX. Esto se puede hacer, por ejemplo, mediante la construcción recombinante de una cadena quimérica simple que posteriormente se escinde para producir la toxina dicatenaria o mediante la expresión separada de las cadenas simples H y L, que luego se combinan mediante, por ejemplo, la creación de un enlace disulfuro intercatenario y posteriormente se purifican. Además, al utilizar dichas técnicas, la actividad de
10 varios dominios puede alterarse (por ejemplo, pueden introducirse mutaciones en un dominio de LC para destruir la actividad de proteasa de la LC) o los dominios de origen natural pueden reemplazarse por otras fracciones, como se describe en otra parte del presente documento, donde, por ejemplo, el dominio HC de BoNT/A (o una porción del mismo) se muta o se elimina y se vincula a un ligando selectivo (TL).
15 Con la descripción de los tres dominios de neurotoxinas generales de cada subtipo de neurotoxina clostridial (unión, translocación y endopeptidasa), se entenderá que la investigación de las neurotoxinas clostridiales es un campo avanzado y la correlación de las secuencias de aminoácidos que comprenden cada uno de estos dominios con sus funciones es muy conocida. Además, también se conoce la subdivisión de estos dominios generales en subdominios. Por ejemplo, es también muy conocida la subdivisión del dominio de unión Hc en subdominios Hcn (la
20 porción amino-terminal del dominio que corresponde aproximadamente a los aminoácidos 871-1091 de BoNT/A) y Hcc (la porción carboxi-terminal del dominio Hc que corresponde aproximadamente a los aminoácidos 1092-1296 de BoNT/A). Véase, por ejemplo, Lacy DB y Stevens RC, Sequence Homology and Structural Analysis of the Clostridial Neurotoxins, 1999, J. Mol. Biol. 291:1091-1104. El subdominio Hcn está altamente conservado entre los subtipos de toxina botulínica, sin embargo, se sabe poco sobre su función. El subdominio Hcc está menos conservado.
25
Además, las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de cada uno de estos dominios y subdominios son conocidas y se han descrito en la presente memoria descriptiva y, por lo tanto, mediante esta descripción en combinación con el conocimiento del código genético, se pueden hacer secuencias de nucleótidos que codifican una proteína que debe expresarse. Por supuesto, sería una cuestión de rutina para una persona experta en la técnica imaginar
30 inmediatamente otras secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos indicados. Además, debido a la
redundancia del código genético, es posible un número finito de secuencias de nucleótidos para cada polipéptido.
Además, está claro que se pueden sintetizar ácidos nucleicos que comprenden variantes moderadamente modificadas de estas secuencias de nucleótidos (o porciones únicas de las mismas) en la región de homología que contiene no más del 10 %, 8 % o 5 % de diferencias de pares de bases de una secuencia de referencia.
35
Además, se entenderá que las secuencias de aminoácidos explicadas en la Tabla 2 y en otras partes de la presente memoria descriptiva (SEQ ID NO: 1-8, 10, 12, 14, 16 y 18) proporcionan una descripción completa de cualquiera y todas las secuencias de nucleótidos que codifican estas secuencias de aminoácidos y las regiones indicadas de las mismas. Una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de endopeptidasa, dominio de translocación o
40 dominio de unión (incluido cualquier subdominio) de un subtipo de neurotoxina dado puede tener respectivamente
60 % o más o 65 % o más o 70 % o más o 75 % o más o 80% o más o 85 % o más o 90 % o más o 95 % o más o
100 % de identidad con cualquiera de las regiones de secuencia de aminoácidos de referencia enumeradas en la Tabla 2 y / o SEQ ID NO: 1-8, 10, 12, 14, 16 y 18.
45 ESTADOS DE LA INVENCIÓN
De acuerdo con un aspecto general de la invención, se proporciona una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostridial, comprendiendo dicha composición:
50 a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial eficaz para escindir una proteína SNARE en condiciones fisiológicas;
b) un dominio de translocación derivado de la toxina clostridial eficaz para facilitar el movimiento de dicho primer, y opcionalmente, un segundo dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas; y
55 c) un dominio de unión derivado de toxina no clostridial que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por una célula diana seleccionada del grupo que consiste en una neurona sensorial y una célula que secreta al menos una citoquina inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito, y sustancialmente no indicado por una neurona motora o autónoma;
60 d) un dominio Hcn funcional derivado de toxina clostridial; y
donde al menos una proteasa de cadena ligera de dicho derivado de neurotoxina clostridial es asimilada por dicha célula diana tras la unión de dicho TL a la célula diana, y donde el derivado de neurotoxina posee un dominio Hcn derivado de neurotoxina clostridial funcional y carece de una actividad del dominio selectivo Hcc derivado de neurotoxina clostridial funcional.
5
De acuerdo con otro aspecto general de la invención, se proporciona un derivado de neurotoxina clostridial analgésico que comprende:
a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial eficaz para escindir una proteína SNARE 10 en condiciones fisiológicas y que tiene una vida media enzimática de 10 días o más cuando se inyecta en un
músculo gastrocnemio de ratón en condiciones sustancialmente fisiológicas;
b) un dominio de translocación derivado de toxina clostridial eficaz para facilitar el movimiento de dicho primer dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas;
c) un dominio Hcn funcional derivado de toxina clostridial; y
15 d) un dominio de unión que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por un tipo de célula diana seleccionada del grupo que consiste en neuronas sensoriales y células secretoras de citoquina seleccionadas del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito, con preferencia por un tipo de célula no diana seleccionada del grupo que consiste en neuronas motoras y neuronas autónomas; donde dicho derivado de neurotoxina carece de un dominio 20 HCC de toxina clostridial funcional y donde una célula diana asimila al menos el dominio de endopeptidasa de dicho derivado de neurotoxina clostridial tras la unión de dicho TL a la célula diana.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención como se define en la reivindicación 1, se proporciona una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostridial, comprendiendo dicha composición:
25
a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial que escinde una proteína SNARE en condiciones fisiológicas;
b) un dominio de translocación derivado de toxina clostridial que facilita el movimiento de dicho primer dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas;
30 c) un dominio Hcn funcional derivado de toxina clostridial; y
d) un dominio de unión derivado de toxina no clostridial que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por una célula diana, siendo seleccionada dicha célula diana del grupo que consiste en
35 i) una neurona sensorial, y
ii) una célula que secreta al menos una citoquina inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito;
estando dicho receptor de superficie celular sustancialmente ausente de las neuronas motoras o autónomas;
40 donde dicha proteasa de cadena ligera de dicho derivado de neurotoxina clostridial es asimilada por dicha célula diana tras la unión de dicho TL a la célula diana, y donde un dominio selectivo Hcc está ausente o está mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su receptor de proteína natural.
Opcionalmente, el derivado de neurotoxina carece de un dominio selectivo Hcc derivado de neurotoxina clostridial. 45 Alternativamente, el derivado de neurotoxina contiene un dominio Hcc derivado de neurotoxina clostridial mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su receptor de proteína natural.
De acuerdo con una realización, el dominio Hcc mutado comprende un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente al aminoácido 1192 de BoNT/B. De acuerdo con otra realización, el dominio Hcc mutado 50 comprende un residuo de lisina en una posición correspondiente al aminoácido 1196 de BoNT/B. De acuerdo con otra realización, el dominio Hcc mutado comprende también un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente al aminoácido 1192 de BoNT/B.
De acuerdo con una realización, el dominio Hcc mutado se deriva de BoNT/B De acuerdo con otra realización, el 55 dominio Hcc mutado se deriva de BoNT/B De acuerdo con otra realización, el dominio Hcc mutado se deriva de BoNT/B De acuerdo con otra realización, el dominio Hcc mutado se deriva de BoNT/B
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina comprende un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial diferente. De acuerdo con una realización, el derivado de neurotoxina comprende un 60 segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial activo. De acuerdo con una realización, el derivado
de neurotoxina comprende un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial que contiene una mutación que lo hace sustancialmente proteolíticamente inactivo. De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina comprende un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial derivado de BoNT/A. De acuerdo con otra realización, el primer dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial comprende una 5 endopeptidasa derivada de BoNT/E. De acuerdo con otra realización, el dominio de translocación derivado de toxina clostridial se deriva de un subtipo BoNT/X seleccionado del grupo que consiste en BoNT/A, BoNT/C1, BoNT/D y BoNT/E. De acuerdo con otra realización, el dominio de translocación derivado de toxina clostridial se deriva de un subtipo BoNT/X seleccionado del grupo que consiste en BoNt/A, BoNT/C1, BoNT/D y BoNT/E.
10 De acuerdo con otra realización, el TL comprende un componente selectivo seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de CGRP, un anticuerpo selectivo de CGRP o específico de CGRP o un fragmento selectivo del mismo o un agonista de interleuquina 1 o un antagonista de receptor de interleuquina 1, un anticuerpo selectivo de receptor IL-1 o específico de receptor IL-1 o un fragmento del mismo.
15 De acuerdo con otra realización, la composición de la invención comprende un polipéptido que comprende un dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial activo que comprende una endopeptidasa derivada de BoNT/E, un dominio de translocación derivado de toxina clostridial que se deriva de BoNT/A y un dominio de TL.
De acuerdo con otra realización, el TL comprende un componente selectivo que comprende un antagonista de 20 CGRP.
De acuerdo con otra realización, dicho dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial comprende una endopeptidasa que tiene una vida media enzimática de 10 días o más cuando se inyecta en el músculo gastrocnemio de ratón en condiciones sustancialmente fisiológicas.
25
De acuerdo con otra realización, el primer y segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial comprende una endopeptidasa que tiene una vida media enzimática de 10 días o más cuando se inyecta en el músculo gastrocnemio de ratón en condiciones sustancialmente fisiológicas.
30 De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende una cadena ligera de BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D y un ligando selectivo que comprende CGRPs-37 y que carece de un dominio Hcc funcional.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención contiene un dominio HCC derivado de 35 neurotoxina clostridial mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su receptor de proteína natural.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende BoNT/D(-Hcc)-CGRPb-37.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende una cadena ligera de 40 BoNT/D, un dominio de translocación de BoNT/D y un ligando selectivo que comprende IL-1RA humano y que carece de un dominio Hcc funcional.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención contiene un dominio Hcc derivado de neurotoxina clostridial mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su receptor de proteína natural.
45
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende BoNT/D(-Hcc)- IL-1RA humano.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende una cadena ligera de 50 BoNT/A, un dominio de translocación de BoNT/A y un ligando selectivo que comprende un ligando de receptor purinérgico y que carece de un dominio HCC funcional.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende LC.Hn.Hcn/A-PT-1.
55 De acuerdo con otra realización, el TL se une específicamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por una neurona sensorial, con preferencia por las neuronas motoras o autónomas.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende al menos dos dominios de TL.
De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende un dominio de translocación de neurotoxina clostridial que se selecciona del grupo que consiste en
a) un dominio de translocación BoNT-A;
5 b) un dominio de translocación BoNT-B;
c) un dominio de translocación BoNT-C1;
d) un dominio de translocación BoNT-D;
e) un dominio de translocación BoNT-E;
f) un dominio de translocación BoNT-F;
10 g) un dominio de translocación BoNT-G, y
h) variantes moderadamente modificadas e isoformas de cualquiera de los anteriores.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona un derivado de neurotoxina clostridial analgésico que comprende:
15
a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial que escinde una proteína SNARE en condiciones fisiológicas y que tiene una vida media enzimática de 10 días o más cuando se inyecta en un músculo gastrocnemio de ratón en condiciones sustancialmente fisiológicas;
b) un dominio de translocación derivado de toxina clostridial que facilita el movimiento de dicho primer dominio de 20 endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas;
c) un dominio Hcn funcional derivado de toxina clostridial; y
d) un dominio de unión que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por un tipo de célula diana seleccionada del grupo que consiste en:
25
i) neuronas sensoriales, y
ii) células secretoras de citoquinas
con preferencia por un tipo de célula no diana seleccionada del grupo que consiste en neuronas motoras y neuronas 30 autónomas;
donde dicho derivado de neurotoxina carece de un dominio Hcc funcional de toxina clostridial y
donde una célula diana asimila dicho primer dominio de endopeptidasa de dicho derivado de neurotoxina clostridial tras la unión de dicho TL a la célula diana.
35
Opcionalmente, el derivado de neurotoxina contiene un dominio Hcc derivado de neurotoxina clostridial mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su receptor de proteína natural. De acuerdo con una realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende un dominio Hcn activo.
40 Opcionalmente, dicho primer dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial activo se deriva de un serotipo de toxina seleccionado del grupo que consiste en BoNT/A, BoNT/E, BoNT/C1 y BoNT/D.
De acuerdo con otra realización de la invención, el dominio de translocación de neurotoxina clostridial se selecciona del grupo que consiste en 45
a) un dominio de translocación BoNT-A;
b) un dominio de translocación BoNT-B;
c) un dominio de translocación BoNT-C1;
d) un dominio de translocación BoNT-D;
50 e) un dominio de translocación BoNT-E;
f) un dominio de translocación BoNT-F;
g) un dominio de translocación BoNT-G, y
h) variantes moderadamente modificadas e isoformas de cualquiera de los anteriores.
55 De acuerdo con una realización, el dominio de endopeptidasa y el primer dominio de endopeptidasa activo se derivan del mismo serotipo BoNT.
De acuerdo con una realización, el derivado de neurotoxina de la invención comprende un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial. Opcionalmente, el segundo dominio de endopeptidasa derivado de 60 toxina clostridial retiene la actividad de la proteasa endopeptidasa activa. Opcionalmente, el segundo dominio de
endopeptidasa derivado de toxina clostridial carece de actividad de proteasa endopeptidasa eficaz para escindir sustancialmente una población de proteínas SNARE en condiciones fisiológicas.
De acuerdo con otra realización, el TL comprende un componente selectivo seleccionado del grupo que consiste en 5 un antagonista de CGRP, un anticuerpo selectivo de CGRP o específico de CGRP o un fragmento selectivo del mismo o un agonista de interleuquina 1 o un antagonista de receptor de interleuquina 1, un anticuerpo selectivo de receptor IL-1 o específico de receptor IL-1 o un fragmento del mismo y variantes e isoformas moderadamente modificadas de los anteriores.
10 Opcionalmente, el derivado de neurotoxina comprende al menos dos dominios de TL.
De acuerdo con una realización, dicho primer dominio de endopeptidasa y dicho dominio de translocación se derivan ambos de BoNT/D. De acuerdo con otra realización, el derivado de neurotoxina de la invención, dicho primer dominio de endopeptidasa y dicho dominio de translocación se derivan ambos de BoNT/A. De acuerdo con una 15 realización, dicho primer dominio de endopeptidasa y dicho dominio de translocación se derivan ambos de BoNT/C1. Opcionalmente, el TL comprende un componente selectivo seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de CGRP, un anticuerpo selectivo de CGRP o específico de CGRP o un fragmento selectivo del mismo o un agonista de interleuquina 1 o un antagonista de receptor de interleuquina 1, un anticuerpo selectivo de receptor IL-1 o específico de receptor IL-1 o un fragmento del mismo y variantes e isoformas moderadamente modificadas de 20 cualquiera de los anteriores.
De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende el derivado de neurotoxina clostridial de la invención.
25 De acuerdo con un cuarto aspecto de la invención, se proporciona una célula huésped seleccionada del grupo que consiste en una célula huésped bacteriana, levadura, una célula de mamífero y una célula de insecto, donde la célula huésped contiene un vector de ácido nucleico que comprende el ácido nucleico de la invención.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, idealmente la célula diana es una célula que secreta al menos 30 una citoquina inflamatoria, donde dicha célula se selecciona del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito.
De acuerdo con todos los aspectos de la invención, idealmente el TL comprende un componente selectivo seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de CGRP, un anticuerpo selectivo de receptor de CGRP o 35 específico de receptor de CGRP o un fragmento selectivo del mismo o un agonista de interleuquina 1 o un antagonista de receptor de interleuquina 1, un anticuerpo selectivo de receptor IL-1 o específico de receptor IL-1 o un fragmento del mismo y variantes e isoformas moderadamente modificadas de cualquiera de los anteriores.
De acuerdo con un quinto aspecto de la invención, se proporciona un lisado celular despejado que comprende el 40 derivado de neurotoxina clostridial de la invención.
De acuerdo con un sexto aspecto de la invención, se proporciona un compuesto que comprende el derivado de neurotoxina clostridial de la invención para su uso en el tratamiento del dolor crónico.
45 De acuerdo con un séptimo aspecto de la invención, se proporciona un derivado de neurotoxina clostridial que comprende: a) un primer dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial activo que escinde una proteína SNARE en condiciones fisiológicas y tiene una vida media enzimática de 10 días o más cuando se inyecta en el músculo gastrocnemio de ratón en condiciones sustancialmente fisiológicas; b) un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial activo o inactivo; c) un dominio de translocación derivado de toxina 50 clostridial que facilita el movimiento de dicho primer dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas; y d) un dominio HCN funcional derivado de toxina clostridial.
Breve descripción de los dibujos
55 La Fig. 1 es un diagrama que muestra varias realizaciones generales de la presente invención, comenzando por una toxina dicatenaria BoNT/X (que se puede crear por escisión proteolítica de una toxina monocatenaria (SC) recombinante), y que muestra las vías A o B, respectivamente. Estas implican la escisión de BoNT/X del subdominio Hcc (vía A) o la mutación del subdominio Hcc (vía B) y la adición de un ligando selectivo (TL) dirigido para unirse a las neuronas sensoriales y / o a las células no neuronales para bloquear la liberación de afectores en el dolor crónico 60 y / o vías inflamatorias para formar nuevos géneros de agentes biológicos terapéuticos BoNT/X('Hcc)-TL y
BoNT/X(PrR')-TL. Un miembro de cualquiera de los dos géneros puede modificarse aún más como se muestra en la vía C mediante la adición de un dominio de proteasa de cadena ligera de tipo E activo (LC/E) para extender el periodo de tiempo de la proteólisis de la proteína SNARE; véase LC/E-BoNT/X(- Hcc)-TL y LC/E-BoNT/X(PrR-)-TL. Por ejemplo, en la primera instancia, los residuos clave (Lys y / o Ala en Hcc de BoNT/B) identificados como 5 esenciales para la unión de su receptor de proteína (sinaptotagmina) podrían mutarse a Glu1192 y Lys1196 para interrumpir su interacción, aunque hay datos que han demostrado una caída superior a 300 veces su actividad paralítica neuromuscular tras la mutación de cualquiera de los residuos clave (Rummel y col., Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos, 2007, 104:359-364 y Jin y col., Nature, 2006, 444:1092-1095). Los expertos en la técnica sabrán que puede utilizarse de manera alternativa una segunda proteasa de cadena ligera activa opcional derivada de 10 serotipos clostridiales distintos del tipo E.
La Fig. 2A muestra estructuras esquemáticas representativas de BoNT/A (rA) recombinante y una variante (rA(-HoN)) que carece del subdominio Hcn. Ambas estructuras ilustran un tag de histidina de 6 residuos de C-terminal (H6) (SEQ ID NO: 19), anexado durante la construcción del ácido nucleico recombinante para ayudar en la purificación de 15 la proteína mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC), así como dos sitios de escisión de trombina, también insertados durante la construcción del ácido nucleico recombinante. El primer sitio de escisión de trombina (más a la izquierda) permite la conversión proteolítica posterior a la expresión de una forma monocatenaria a la dicatenaria activa; el segundo sitio de trombina permite la eliminación del “tag” H6 (SEQ ID NO: 19) después de la purificación del polipéptido.
20
La Fig. 2B muestra la purificación de un lisado celular de rA-HoN por IMAC en un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie.
La Fig. 2C muestra un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de proteínas SC y DC purificadas por IMAC 25 en condiciones reductoras y no reductoras.
La Fig. 3A muestra hibridaciones Western de geles de SDS-PAGE. Los carriles de las dos hibridaciones a la derecha son muestras de eluatos en ensayos de unión entre un fragmento inmovilizado expresado de forma recombinante del receptor de proteína BoNT/A (SV2C) y proteínas recombinantes BoNT/A (rA), rA'HoN, y rE (recombinante 30 BoNT/E). Las dos hibridaciones a la izquierda son muestras de rA, rA'HoN y rE (40 ng / carril) para confirmar la especificidad de los anticuerpos utilizados. Las hibridaciones se desarrollaron mediante anticuerpos contra la cadena ligera de BoNT/A (anti-LC/A) o BoNT/E (anti-LC/E).
La Fig. 3B muestra hibridaciones Western de geles de SDS-PAGE en los que se trataron previamente neuronas de gránulos cerebelosos de rata (CGN) con concentraciones variables (expresadas en la leyenda del eje superior en 35 unidades de picomolaridad (pM)) del derivado de toxina rA o rA-HoN. Los geles muestran bandas de proteínas que comprenden las proteínas SNARE sintaxina 1, SNAP-25 o SNAP-25a (un producto de escisión de la digestión con BoNT/A). Los resultados muestran que, como se esperaba, la sintaxina 1 SNARE no diana no es escindida por ninguna proteína de toxina; SNAP-25 solo es digerida por rA (y no por rA-HCN, excepto en concentraciones muy altas (1 nM) de la toxina). Los resultados sugieren la incapacidad de rA-HCN para asimilarse efectivamente en las 40 células CGN.
La Fig. 3C es una tabla que muestra la toxicidad de rA y rA-HCN tras la inyección intraperitoneal de cada toxina en ratones, expresada como mLD50, la dosis más baja de toxina suficiente para matar al 50 % de los ratones inyectados en 4 días. La tabla indica que rA tiene un IT1LD50 6,7 x 104 veces mayor que rA-HCN en este experimento. 45
La Fig. 4 muestra una vista esquemática de varios ligandos selectivos ejemplares (TL) que pueden combinarse con miembros individuales de los géneros terapéuticos derivados de toxinas mostrados en la Fig. 1 para hacer realizaciones terapéuticas de la invención dirigidas a los nervios sensibles al dolor o células no neuronales que secretan mediadores inflamatorios y contribuyen al dolor.
50
La Fig. 5A muestra estructuras esquemáticas representativas de proteínas recombinantes LC.Hn/A-PT-1 y LC.HN.H cn /A-PT-1; ambas proteínas contienen una porción C-terminal que comprende un tag His6 (SEQ ID NO: 19) para su uso en la purificación por afinidad y un fragmento de purotoxina-1 (PT-1) para su uso como ligando selectivo (TL) de la toxina al receptor P2X purinoceptor 3 de las neuronas purinérgicas. La proteína LC.Hn/A-PT-1 55 comprende BoNT/A recombinante que carece de la totalidad de la región Hc; la proteína LC.Hn.Hcn/A-PT-1 comprende la LC.Hn/A-PT-1 más la región BoNT/A Hcn (pero no la región Hoo) enlazada al C terminal de la misma y por ende, a la porción TL-His6 (“His6” descrita como SEQ ID NO: 19). Un solo sitio de escisión de la trombina separa la LC/A del resto de la cadena, aunque permanece unida por el enlace disulfuro.
60 La Fig. 5B muestra los geles de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie reductores y no reductores de lisado (1),
circulación (2), lavado (3) y las fracciones de eluato (4-8) de cromatografía IMAC de células de E. coli. que expresan LC.Hn.Hcn/A-PT-1.
La Fig. 5C muestra los geles de SDS-PAGE teñidos con azul de Coomassie reductores y no reductores de lisado (1), 5 circulación (2), lavado (3) y las fracciones de eluatos (4-7) de células de E. coli. que expresan LC.Hn/A-PT-1.
La Fig. 6A muestra los resultados de un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie (izquierda) de LC.Hn.Hcn/A-PT-1 purificada en condiciones reductoras y no reductoras e hibridaciones Western de la misma muestra en condiciones reductoras y no reductoras desarrolladas mediante el anticuerpo anti-His6 (medio) (“His6” 10 descrito como SEQ ID NO: 19) o anticuerpo anti-LC/A (derecha). Los geles muestran que, en condiciones no reductoras, la proteína existe como una dicatenaria unida por disulfuro; cuando se reduce, la LC/A disociada se puede visualizar con el anticuerpo anti-LC/A y el resto de la toxina recombinante se puede ver con el anticuerpo anti- His6 (“His6” descrito como SEQ ID NO: 19).
15 La Fig. 6B muestra los resultados de un gel de SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie (izquierda) de LC.Hn/A- PT-1 purificada en condiciones reductoras y no reductoras e hibridaciones Western de la misma muestra desarrolladas mediante el anticuerpo anti-His6 (medio) (“His6” descrito como SEQ ID NO: 19) o anticuerpo anti-LC/A (derecha). Los geles muestran que, en condiciones no reductoras, la proteína existe como una dicatenaria unida por disulfuro; cuando se reduce, la Lc/A disociada se puede visualizar con el anticuerpo anti-LC/A y el resto de la toxina 20 recombinante se puede ver con el anticuerpo anti-His6 (“His6” descrito como SEQ ID NO: 19).
La Fig. 6C muestra hibridaciones Western de geles de SDS-PAGE en las cuales las neuronas ganglionares del trigémino de rata (TGN) se trataron previamente con 1,6 nM de cualquiera de los derivados de toxina LC.Hn/A-PT-1 (izquierda) o LC.Hn.Hcn/A-PT-1, luego fueron lisadas y sometidas a electroforesis. Los geles muestran bandas de 25 proteínas que comprenden las proteínas SNARE SNAp-25 (banda superior) o el producto de escisión LC/A SNAP- 25a (banda inferior en la hibridación Western adecuada). Los resultados muestran que SNAP-25 solo se digiere por LC.Hn.Hcn/A-PT-1, (y no por LC.Hn/A-PT-1). Los resultados son consistentes con la capacidad de LC.Hn.Hcn/A- PT-1 para unirse efectivamente a las células TGN.
30 La Fig. 6D es un gráfico que muestra los resultados del ensayo que se muestran gráficamente en la Fig. 6C. El porcentaje de SNAP-25 escindido por 1,6 nM de LC.Hn.Hcn/A-PT-1 es de aproximadamente el 25 % y el porcentaje de SNAP-25 escindido por LC.Hn/A-PT-1 es de aproximadamente el 0 %.
La Fig. 7 muestra hibridaciones Western de geles de SDS-PAGE a partir de lisados de: línea celular sinovial humana 35 (hSC) (que contiene SNAP-23, VAMP3, sintaxina 2, 3 y 4 como se observa en la línea de células macrofásicas de ratón RAW264.9 (mMC) y células neurales, como las neuronas de los ganglios cerebelosos de la rata (rCGN), que contienen las proteínas SNARE SNAP-25, sintaxina 1 y VAMP 2. Las hibridaciones Western se desarrollaron utilizando anticuerpos dirigidos contra las proteínas SNARE indicadas.
40 La Fig. 8A es una hibridación Western que muestra los resultados de un experimento en el que las células hSC se incubaron durante 7-10 días con lentivirus de shRNA (ARN de horquilla corta) que transportan secuencias de nucleótidos dirigidas específicamente a la SNAP-23. Luego, las células se incubaron durante la noche con IL-Ip (100 ng/ml) en medio de cultivo completo para inducir secreción de TNF-a e IL-6. Después de recoger el sobrenadante, los lisados de estas células se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos 45 dirigidos a SNAP-23 o la proteína de control no dirigido p-tubulina. KD se refiere a “knock down” inducido por shRNA o inhibición de expresión.
La Fig. 8B es una representación gráfica de la inhibición de expresión (expresada como porcentaje “knock down” o KD) de SNAP-23 en el experimento que se muestra en la Fig. 8A. También se muestra el porcentaje de inhibición de 50 secreción de TNF-a e IL-6 de estas células antes de la lisis, en relación con el sobrenadante de un cultivo celular de control no tratado con el vector lentivirus. Se debe tener en cuenta que la cuantificación de TNF-a e IL-6 secretados se realizó mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de acuerdo con un protocolo proporcionado por Mabtech AB (Suecia).
55 La Fig. 8C es una hibridación Western que muestra los resultados de un experimento en el que las células hSC se incubaron durante 7-10 días con lentivirus de shRNA (ARN de horquilla corta) que transportan secuencias de nucleótidos dirigidas específicamente a VAMP 3. Luego, las células se incubaron durante la noche con IL-Ip (100 ng/ml) en medio de cultivo completo para inducir secreción de TNF-a e IL-6. Después de recoger el sobrenadante, los lisados de estas células se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas se detectaron utilizando anticuerpos 60 dirigidos a VAMP 3 o la proteína de control no dirigido p-tubulina. kD se refiere a “knock down” inducido por shRNA
o inhibición de expresión.
La Fig. 8D es una representación gráfica de la inhibición de expresión (expresada como porcentaje “knock down” o KD) de VAMP 3 en el experimento que se muestra en la Fig. 8C. También se muestra el porcentaje de inhibición de 5 secreción de TNF-a e IL-6 (cuatificado por ELISA como se describe en la Fig. 8B) de estas células antes de la lisis, en relación con el sobrenadante de un cultivo celular de control no tratado con el vector lentivirus.
DESCRIPCIÓN DEL CAMPO
10 El dolor crónico es un desafío importante tanto para los pacientes como para los profesionales de la salud. Los pacientes que sufren dolor crónico representan aproximadamente el 20 % de la población adulta.
Hay dos tipos generales de dolor crónico: dolor inflamatorio nociceptivo y dolor neuropático. El dolor nociceptivo inflamatorio generalmente surge de una agresión al tejido y la activación resultante de cascadas inflamatorias y 15 quimiorreceptores. Por otro lado, el dolor neuropático (por ejemplo, entre otros, el dolor crónico, como el dolor por cáncer, dolor postoperatorio, dolor neuropático, dolor por artritis, alodinia, neuralgia posherpética, síndrome del intestino irritable y otros dolores viscerales, dolor óseo, neuropatía periférica, el dolor asociado al sistema circulatorio y algunos tipos de dolor de cabeza) resultan del daño neuronal en el sistema nervioso central o periférico e implica la sensibilización (como la alodinia), es decir, la estimulación incrementada de los nociceptores periféricos que 20 amplifica las señales de dolor transmitidas al cerebro.
Sigue habiendo una necesidad no satisfecha de un tratamiento eficaz del dolor crónico porque los fármacos antiinflamatorios no esteroideos, tradicionalmente utilizados para el dolor nociceptivo inflamatorio, son de acción corta y pueden tener efectos secundarios graves. De manera similar, mientras que el dolor que implica un 25 mecanismo nociceptivo inflamatorio generalmente tiene una duración limitada al periodo de reparación del tejido y generalmente se alivia con los agentes analgésicos u opioides disponibles (Myers, REGIONAL ANESTHESIA 20:173-184 (1995)), se conocen los efectos secundarios y perjudiciales del tratamiento a largo plazo con opioides.
Del mismo modo, a pesar del hecho de que aproximadamente el 3 % de la población sufre dolor neuropático en un 30 momento dado, no existe un tratamiento satisfactorio; las terapias disponibles funcionan mal, no son efectivas para un segmento significativo de pacientes o causan efectos adversos inaceptables.
De manera alentadora, al menos algunos de los pacientes con dolor crónico responden a la neurotoxina botulínica de acción prolongada (BoNT) tipo A (uno de los 7 serotipos de toxina (/A-G) producida por Olostridium botulinum) 35 debido a la inhibición específica y persistente de la liberación de transmisores desde los nervios periféricos. Este bloqueo resulta de la escisión proteolítica de las proteínas SNARE; proteínas esenciales para la exocitosis estimulada por Ca2+ de neurotransmisores y otros agentes mediante la fusión membrana-vesícula.
El único perfil de las actividades proporcionadas por las neurotoxinas clostridiales (que se detalla a continuación) se 40 ha explotado con éxito para tratar numerosos trastornos humanos (~100 condiciones) que surgen de la actividad excesiva de los nervios que inervan los músculos o glándulas esqueléticas / lisas; revisado en Ward, A.B. & Barnes, M.P., CLINICAL USES OF BOTULINUM TOXINS, Cambridge University Press (2007).
In vivo, las bacterias clostridiales producen un complejo de toxinas (el “complejo hemaglutinina”) que comprende la 45 toxina clostridial dicatenaria de aproximadamente 150 kDa junto con otras proteínas. Estas otras proteínas que no son toxinas se denominan colectivamente proteínas asociadas no tóxicas (NAP). Las NAP identificadas incluyen proteínas que poseen actividad de hemaglutinación, tales como, por ejemplo, una hemaglutinina de aproximadamente 17 kDa (HA-17), una hemaglutinina de aproximadamente 33 kDa (HA-33) y una hemaglutinina de aproximadamente 70 kDa (HA-70); así como una no hemaglutinina no tóxica (NTNH), una proteína de 50 aproximadamente 130 kDa, véase, por ejemplo, Eric A. Johnson y Marite Bradshaw, Clostridial botulinum and its Neurotoxins: A Metabolic and Cellular Perspective, 39 TOXICON 1703-1722 (2001); Stephanie Raffestin y col., Organization and Regulation of the Neurotoxin Genes in Clostridium botulinum and Clostridium tetani, 10 Anaerobe 93-100 (2004) y Gu y col., Botulinum Neurotoxin is Shielded by NTNHA in an Interlocked Complex, 335 Science 97781 (2012).
55
En la naturaleza, se cree que el complejo de toxinas es importante para el proceso de intoxicación, al menos en parte porque parece proporcionar protección a la molécula de toxina contra condiciones ambientales adversas y resistencia a la digestión con proteasas. Resulta importante que ciertos dominios de las proteínas HA y NTNH parecen coordinarse con el enlace de toxina y se unen a ubicaciones en la superficie celular (y pueden unirse al 60 receptor de superficie celular de neurotoxina clostridial natural en sitios distintos u otros sitios de enlace de toxina),
facilitando así el enlace, la asimilación y la activación de la toxina.
Los complejos de hemaglutinina de BoNT/A (y, en menor grado, de BoNT/B) se encuentran actualmente en uso clínico para una variedad de afecciones médicas. Los 7 serotipos BoNT contienen un dominio de proteasa de 5 cadena ligera (LC), que está enlazado a un dominio de transporte y unión celular de cadena pesada (HC) a través de un enlace disulfuro simple y enlaces no covalentes. Una fracción C-terminal de HC (Hc) se une a los aceptadores específicos expresados en varios tipos de nervios (incluidas las neuronas motoras, autónomas y sensoriales), mientras que la mitad N-terminal de HC (Hn) forma un canal que permite la translocación de la LC adjunta desde vesículas de membrana 'tipo endosomal' a través del poro Hn al citosol (Dolly y col., CURR. OPIN. PHARMACOL. 10 9:326-35, 2009). Posteriormente, con una selectividad que depende del serotipo de la toxina, la LC escinde un sustrato específico de SNARE y niega su papel en la liberación de neurotransmisores. Por ejemplo, la LC de BONT/A (lC/A) elimina 9 aminoácidos del C-terminal de la proteína SNARE SNAP-25, mientras que la LC/E elimina otros 17 residuos C-terminales de la misma SNARE y, de esta forma, permite un bloqueo más disruptivo de la neuroexocitosis; Meng y col., J. NEUROSCI. 29:4981-4192 (2009) (en lo sucesivo, “Meng y col. 2009”). Otras toxinas 15 clostridiales escinden otras proteínas SNARE: por ejemplo, entre otras, BoNT/C escinde las proteínas SNARE SNAP-25 y sintaxina 1 y TeTx, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F y BoNT/G escinden la proteína SNaRe sinaptobrevina (también conocida como VAMP). Un ejemplo de esta perturbación selectiva es que la inhibición de la liberación del transmisor por LC/A por lo general se puede revertir, al menos de forma transitoria, elevando el flujo de Ca2+, pero no en dicho grado en el caso de LC/E (Dolly y col., FEBS J. 278:4454-66, 2011). Sin embargo, la corta parálisis 20 transitoria inducida por LC/E limita su utilidad en aplicaciones clínicas.
Se ha descubierto que el complejo de hemaglutinina de BoNT/A (“complejo BoNT/A”) es efectivo en algunos pacientes con migraña, pero no en todos; véase, por ejemplo, Naumann y col., NEUROLOGY 70:1707-1714 (2008), Jackson y col., JAMA 307:1736-1745 (2012) y Dodick y col., Headache 50:921-936 (2010). Además, BoNT/A no 25 puede bloquear la liberación de péptidos mediadores del dolor (como el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) y la sustancia P) de las neuronas sensoriales cuando se produce mediante la activación de TRPV1 (receptor transitorio potencial vanilloide tipo 1), canales de cationes selectivos que son sensibles a la capsaicina (Meng y col., 2009; Meng y col., J. Cell Sci. 120:2864-2874 (2007)(en lo sucesivo Meng y col., 2007).
30 Un derivado de neurotoxina clostridial quimérico que comprende proteasa LC BoNT/E (LC/E) y dominio de translocación (Hn/E) redirigido sintéticamente a través de la Hc de tipo A (Wang y col., J. BIOL. CHEM. 283:16993- 17002 (2008)(en lo sucesivo, Wang y col, 2008)), bloquea de forma potente la liberación de CGRP de las neuronas nociceptivas y atenúa su activación provocada por la activación de CGRP o TRPV1 (Meng y col. 2009). Además, una variante sintética de la proteasa LC/E diseñada para ser de acción prolongada agregando la proteasa LC/E más 35 robusta a una forma inactiva mutada de la proteasa de larga duración en BoNT/A ha demostrado ser muy eficaz y terapéutica tanto en neuronas sensoriales cultivadas, como en un modelo animal de dolor inflamatorio (Wang y col., J. BIOL. CHEM. 286:6375-85, 2011) (en lo sucesivo, “Wang y col., 2011”).
Además, otro serotipo de toxina de acción prolongada, BoNT/C1, bloquea la liberación de CGRP de las neuronas 40 ganglionares del trigémino sensorial (TGN) y establece su potencial anti-nociceptivo (Meng y col. 2007). Aunque el BoNT/D (que tiene una actividad de proteasa de larga duración) también es eficaz en el bloqueo de la liberación de CGRP, no puede utilizarse como terapia para pacientes humanos en su forma natural porque la BoNT/D no se une al músculo humano ni bloquea la neurotransmisión; Coffield y col., J. PHARMACOL. ExP. THER. 280:1489-1498 (1997) (en lo sucesivo, “Coffield y col., 1997”). Este notable hallazgo resalta alguna diferencia entre la respuesta a la 45 BoNT/D en humanos y roedores, ya que un grupo ha afirmado recientemente que la proteína de la vesícula sináptica del receptor BoNT/A natural 2 (SV2) puede actuar como un receptor de proteína para BoNT/D en ratas y ratones (Peng y col., PLoS PATHOGENS 7:e1002008, (2011)).
Sin embargo, todas estas variantes de BoNT sufren la desventaja de la no selectividad; bloquean la liberación de 50 transmisores y mediadores de los nervios motores y autónomos, así como de las neuronas sensoriales. Esta falta de especificidad podría llevar a efectos secundarios graves en el uso clínico para el tratamiento del dolor.
DESCRIPCIÓN Y EJEMPLOS
55 La presente invención está dirigida a procedimientos y composiciones que tienen varios aspectos y realizaciones que se incluyen en las reivindicaciones. Por lo tanto, y sin limitación, en una realización, la presente invención está dirigida a nuevos agentes bioterapéuticos para el tratamiento del dolor crónico y / o inflamatorio; dichos agentes pueden diseñarse mediante la ablación del tropismo normal de las neurotoxinas clostridiales y sus derivados. Específicamente, los productos biológicos pueden reorientarse eliminando o modificando la Hcc que posee sitios de 60 enlace para los receptores de proteínas y gangliósidos y añadiendo uno de los varios ligandos selectivos posibles
(en lo sucesivo, “TL”) al C terminal de la HC. Los TL se eligen preferentemente para restringir la acción de los derivados de toxina clostridial de forma selectiva en las neuronas sensibles al dolor, por lo que no afectan a otros tipos de neuronas. La retención del segundo subdominio de Hcn es un avance novedoso debido a nuestro descubrimiento de su importancia para la asimilación de la LC de la toxina en las neuronas (o células no neurales), 5 con la posterior escisión de SNAP-25 e inhibición de la exocitosis; véase, por ejemplo, la Fig. 2, la Fig. 3 y el Ejemplo 1.
Como se muestra en la Fig. 1 y se describe en el presente documento, en ciertas realizaciones de la invención se retienen ambos subdominios de Hc (Hcn y Hcc) (incluidas las regiones de unión a gangliósidos de Hcc), pero la 10 capacidad de unirse al receptor de proteínas, por ejemplo, la sinaptotagmina se extirpa mediante residuos mutantes identificados como esenciales para la última interacción. Por ejemplo, la mutación de Lys1192 a Glu o Ala1196 a Lys en Hcc de BoNT/B disminuyó su potencia en > 300 veces en la unión neuromuscular (Rummel y col., PROC. NAT. ACAD. SCI. Estados Unidos 104:359-64, 2007; Jin y col., NATURE 444:1092-95, 2006). Por lo tanto, esta estrategia tiene la ventaja de explotar la capacidad de la neurotoxina para unirse a un "receptor dual" para que el TL se enlace 15 con más efectividad a su objetivo; la unión a los gangliósidos a través de la porción Hcc mutada parece aumentar la concentración local del agente terapéutico en la superficie celular cerca de los receptores de proteínas putativos y, por lo tanto, aumenta la interacción de cada TL con su propio ectoreceptor de proteínas requerido en la superficie celular objetivo. Por lo tanto, la eficacia terapéutica se incrementa mediante esta modalidad de doble enlace.
20 En un tercer conjunto de realizaciones no limitativas que también se muestra en la Fig. 1, se pueden crear nuevas terapias adicionales mediante la creación de proteínas recombinantes en las que una segunda proteasa de cadena ligera activa o inactiva, como la proteasa de cadena ligera activa BoNT/E (un fuerte inhibidor de neuroexocitosis) está unida a BoNT/A o a uno o más constructos descritos anteriormente. Esto puede ejercer una influencia estabilizadora para producir una actividad de proteasa de larga duración en las proteínas SNARE diana. La 25 capacidad de fabricar y utilizar una familia de agentes bioterapéuticos tan selectiva y de larga duración representa un avance importante que debería revolucionar el desarrollo de las futuras generaciones de fármacos eficaces y selectivos para el dolor crónico e inflamatorio.
Como se emplea en el presente documento, el término “específico”, cuando se utiliza con respecto a las 30 interacciones ligando:diana, significa que el ligando se une a y / o cataliza preferentemente la diana con una avidez de al menos 102:1, 103:1, 104:1 o al menos aproximadamente 105:1 o al menos aproximadamente 106:1 sobre sustancias no diana en condiciones sustancialmente fisiológicas. El término “selectivo”, cuando se utiliza con respecto a las interacciones ligando:diana, significa que el ligando une y / o cataliza preferentemente la diana con una avidez de 10:1 o al menos aproximadamente 102:1 o al menos aproximadamente 103:1 o más de 104:1 sobre 35 sustancias no diana en condiciones sustancialmente fisiológicas.
Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere al diseño, preparación y uso de uno o más constructos génicos que codifican polipéptidos que comprenden agentes terapéuticos nucleares analgésicos que inhiben la neurotransmisión (proteasas selectivas SNARE) y poseen una actividad analgésica. Estos pueden incluir, consistir 40 en o consistir esencialmente en, sin limitación, derivados de TeTx o BoNT/X (serotipos A, B, C1, D, E, F o G), pero cualquiera de los dos contiene un Hcc mutado (sustancialmente sin capacidad para unirse al receptor de proteína, pero capaz de interactuar con los gangliósidos, véase más arriba) o están sustancialmente desprovistos de la región Hcc (véase la Fig. 1).
45 En otro enfoque complementario, una segunda región de codificación de LC activa, como la región de codificación de LC/E, que codifica una proteasa que actúa como un inhibidor efectivo de la liberación de CGRP de las neuronas sensoriales (véase, por ejemplo, Want y col., 2011; Meng y col., 2009) puede unirse a uno o más de los candidatos oligonucleótidos mencionados anteriormente, preferentemente antes de la siguiente etapa.
50 En algunas realizaciones, el oligonucleótido puede comprender una LC/X que está mutada de manera que carezca sustancialmente de actividad de proteasa selectiva de SNARE neuronal en comparación con la proteína no mutada expresada. Por ejemplo, el residuo mutante Lys224 en la fracción LC/E a Asp aumentó significativamente su escisión a SNAP-23 humana con una actividad reducida hacia la SNAP-25 neuronal (Chen y Barbierio, Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos, 106:9180-9184, 2009). En este caso, se entenderá que se puede hacer referencia a un 55 oligonucleótido de este tipo utilizando la nomenclatura mLC.BoNT/X (donde “X” es cualquier serotipo de toxina) que generalmente se refiere a un BoNT/X en el que la proteasa de cadena ligera se ha mutado para que no tenga sustancialmente actividad proteolítica hacia las proteínas SNARE neuronales, manteniendo al mismo tiempo sustancialmente la estructura estérica de la toxina BoNT/X original.
60 En cualquier caso, la unión de un gen que codifica el TL requerido para estas moléculas otorgará al polipéptido
traducido la capacidad de dirigirse selectivamente a las neuronas sensoriales o las células liberadoras de citoquinas (que se muestran esquemáticamente en la Fig. 1). Evidentemente, una de las ventajas de la presente invención es que proporciona una serie de constructos génicos diferentes, que pueden diseñarse o elegirse para que se adapten a uno o más constructos que expresan proteínas terapéuticas que poseen la capacidad de inhibir eficazmente la 5 liberación de mediadores del dolor de los nociceptores o inductores de células liberadoras de inflamación.
La invención, por lo tanto, también se refiere a las proteínas clostridiales terapéuticas producidas mediante los oligonucleótidos, los procedimientos de preparación de los oligonucleótidos y proteínas, los procedimientos para la expresión in vivo y / o in vitro de proteínas codificadas por estos constructos, la purificación de dichas proteínas y los 10 ensayos para su actividad y caracterización fisicoquímica, así como los procedimientos para tratar a un paciente que sufre o corre el riesgo de sufrir de dolor crónico o inflamatorio, empleando dichas proteínas.
En una realización preferida, la construcción de constructos génicos de acuerdo con la invención conlleva las etapas de (no necesariamente en este orden) modificar un ácido nucleico que codifica una BoNT/X monocatenaria (por 15 ejemplo, serotipo /A, /B, /C1, /D, /E, /F y /G o toxinas quiméricas que comprenden fragmentos de una pluralidad de subtipos de toxinas), eliminar o mutar la región Hcc de cadena pesada (véase más arriba) y enlazar un ligando selectivo (TL) dirigido a neuronas sensoriales o células mediadoras de la inflamación. Dependiendo de la identidad del serotipo de la toxina, la LC activa de un serotipo BoNT más robusto (como la LC/E) se puede agregar a la LC/A para extender su longevidad. Estos enfoques se muestran de manera esquemática en la Fig. 1.
20
Los ligandos selectivos utilizados en la presente invención actúan para dirigir selectivamente las moléculas biológicas terapéuticas de la presente invención a neuronas sensoriales y / o células capaces de secretar factores mediadores de la inflamación. Así, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un TL está unido al extremo 3' de un ácido nucleico que codifica una toxina clostridial modificada, como uno de los constructos descritos anteriormente, 25 para permitir que las proteínas expresadas se unan selectivamente a los receptores de proteínas de las fibras C nociceptivas, que están implicadas en las vías del dolor crónico.
Como se describe en el Ejemplo 2 de esta solicitud, una realización de este TL se ha preparado por medios recombinantes en forma activa. De esta manera, se puede hacer un analgésico selectivo y de larga duración que 30 carezca de los efectos adversos y las propiedades adictivas de los analgésicos crónicos convencionales. Estos productos terapéuticos también ofrecen la gran ventaja de que no afectan o no afectan sustancialmente la secreción de neurotransmisores colinérgicos en los nervios neuromusculares y autónomos, a diferencia de las BoNT no modificadas.
35 En otras realizaciones de la invención, se puede utilizar un TL basado en el fragmento de proteína CGRP8-37 del CGRP humano (péptido relacionado con el gen de la calcitonina), un antagonista del receptor 1 de CGRP de receptor de superficie celular, como un ligando selectivo para dirigir el tratamiento terapéutico de la presente invención a neuronas sensoriales y / o células no neuronales que secretan mediadores inflamatorios. Tan útiles como un TL para dirigir los agentes bioterapéuticos a las últimas células, los genes que codifican el antagonista del 40 receptor de interleuquina-1 humano (IL-1RA) (o un derivado selectivamente funcional del mismo) también pueden emplearse para construir el ácido nucleico expresable.
De este modo, se dirige la molécula bioterapéutica a las neuronas nociceptivas mediante el aprovechamiento de la presencia de los receptores en estas neuronas (por ejemplo, en las TGN) (Meng y col., 2007) y sus funciones en la 45 señalización del dolor inflamatorio crónico y neuropático (North RA J. PHySiOL. 554, 301-308, 2004). Una característica atractiva del direccionamiento de TRPV1 es que el tráfico de esta proteína del canal de cationes a la membrana plasmática es parcialmente dependiente de las SNARE, implicando una exocitosis controlada por proteína quinasa C y el receptor se aumenta en respuesta al dolor crónico (Morenilla-Palao y col., J BIOL CHEM 279, 25665-72, 2004; Szallasi y col., TRENDS MOL MED 12, 545-54, 2006). Por lo tanto, dirigir selectivamente los 50 derivados de la toxina a las neuronas positivas para TRPV1 puede no solo bloquear la liberación de los neurotransmisores del dolor de estas neuronas, sino también regular a la baja la expresión de TRPV1, disminuyendo así la sensibilidad a la hiperalgesia.
Un antagonista de aCGRP (residuos 8-37), versión truncada de CGRP (37 residuos), es eficaz para antagonizar la 55 acción de CGRP de liberación basal in vitro de neuronas en cortes del tronco encefálico (Meng y col.,2009). Este antagonista también puede aliviar el dolor in vivo (Bird y col., MOL Pain 2, 31, 2006) al unirse al receptor 1 de CGRP presente en los ganglios sensoriales y terminales nerviosos presinápticos nociceptivos (Hay y col., BR J PHARMACOL 140, 477-86, 2003; Sams-Nielsen y col., BR J PHARMACOL 132, 1145-53, 2001; Zhang y col., J NEUROSCI 27, 2693-703, 2007).
El uso de TL que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en aCGRPs-37 (o sus derivados) para lograr una administración dirigida de terapias nucleares derivadas de BoNT en neuronas sensoriales ofrece múltiples ventajas. Por ejemplo, la inhibición resultante de la liberación de CGRP invalida la vasodilatación y la desgranulación de mastocitos asociadas con la actividad de CGRP. En particular, la prevención de la desgranulación de los 5 mastocitos disminuye la liberación de afectores inflamatorios tales como las citoquinas, que incluyen, entre otros, TNFa e IL-Ip, que pueden actuar sobre neuronas sensoriales. Estos factores que inducen la regulación al alza de la síntesis de CGRP a través de MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógenos) (Durham, P. L.; Russo, A. F. J NEUROSCI 23, 807-15, 2003), están implicados, por tanto, en una cascada de señalización regulada por retroalimentación. El uso de inhibidores de la secreción de CGRP en la presente invención interrumpe así esta 10 expresión y libera la cascada.
Se ha demostrado que el CGRP es absorbido por terminales nerviosos nociceptivos perivasculares y esto se reduce eficientemente por CGRP8-37, lo que sugiere que se produce una endocitosis de CGRP mediada por receptores (Sams-Nielsen y col., BR J PHArMaCOL 132, 1145-53, 2001). El uso de los agentes bioterapéuticos de la presente 15 invención, que comprende un TL de enlace a CGRP, por lo tanto, debería administrar con éxito los agentes biológicos analgésicos de la invención a células diana (por ejemplo, nervio presináptico y mastocitos). En el Ejemplo 3 de esta memoria descriptiva, una secuencia de ADN sintético que codifica CGRP8-37 humano se ha ligado al extremo 3' de una realización de una región de codificación abierta expresable para la síntesis de un agente terapéutico biológico analgésico dirigido al receptor de CGRP.
20
El antagonista del receptor de interleuquina 1 (IL-1RA), un antagonista del receptor de origen natural, se une al receptor de la IL-1 expresado en diversas células, por ejemplo, macrófagos, monocitos, sinoviocitos, mastocitos y neutrófilos (Pou J y col., BIOCHIM BIOPHYS ACTA. 1811:556-63, 2011; Chin y col., J CLIN INVEST. 82:420-6, 1988; McColl y col., J EXP MED. 176:593-8, 1992). El antagonista IL-1RA inhibe de forma competitiva la unión de IL- 25 1a y IL-1p al receptor de IL-1 sin inducir ninguna respuesta intracelular detectable (Arend y col., ANNU. REV. IMMUNOL. 16:27-55, 1998).
De acuerdo con la presente invención, se espera que la distribución selectiva de las terapias derivadas de BoNT/X en las células mediadoras de la inflamación a través del enlace IL-1RA a su receptor reduzca la secreción de 30 citoquinas mediante la escisión de los SNARE que son esenciales para la liberación de estas citoquinas. Como se ha señalado anteriormente, se observó que SNAP-23 y VAMP 3 son esenciales para la liberación de TNF-a y 21-6 de las células sinoviales humanas (Fig. 8).
Aunque no es necesariamente limitante para las realizaciones más amplias, todos los constructos que ejemplifican la 35 invención mostrada en el presente documento contienen secuencias cortas que codifican residuos de aminoácidos, tales como una región de “bucle”, situada entre HC y LC de BONT/X (y ubicada dentro de (entre) los residuos de cisteína implicados en el enlace di-sulfuro que une la LC y la HC). La región de bucle se altera para que contenga una secuencia de aminoácidos de reconocimiento de proteasa reconocida selectiva o específicamente por un exógeno, de modo que las proteínas monocatenarias (SC) expresadas se puedan convertir fácilmente in vitro en la 40 forma di-catenaria (DC) activada por reacción con dicha proteasa exógena (por ejemplo, trombina), por ejemplo en solución o mediante una columna o reactivo de lote en el que la proteasa exógena se inmoviliza. Los expertos en la materia son conscientes de que puede utilizarse cualquier proteasa exógena adecuada siempre que no escinda la proteína en posiciones no deseadas dentro de las regiones de cadena pesada o ligera.
45 Los constructos de ácido nucleico de la presente invención se construyen de forma recombinante, para permitir la incorporación de alternancias de las secuencias de BoNT/X de origen natural para proporcionar proteínas terapéuticas para el tratamiento del dolor crónico o la inflamación cuando se expresan en un vector adecuado y en un sistema celular huésped. Los ejemplos de células huésped que se pueden utilizar para la expresión de genes exógenos incluyen, entre otras, células de insectos, células de mamíferos y líneas celulares, células de levadura y 50 células bacterianas, particularmente la bacteria Gram positiva Escherichia coli (E. coli). Actualmente, los solicitantes prefieren usar E. coli como sistema de expresión de la célula huésped.
Las proteínas terapéuticas expresadas y / o elaboradas a partir de los constructos génicos descritos anteriormente ofrecen varias ventajas importantes sobre el uso de agentes descritos previamente para el tratamiento del dolor, 55 incluidas las terapias previas basadas en neurotoxinas clostridiales. Estas ventajas incluyen, (a) direccionamiento dirigido y selectivo a neuronas sensoriales y / o células inflamatorias a través de un TL vinculado; (b) la distribución intracelular y la posterior inhibición de la exocitosis de péptidos o citoquinas estimulantes del dolor, sin afectar sustancialmente a otras células, como las neuronas motoras y autónomas, y (c) el tiempo de vida altamente deseable y muy extendido de los agentes bioterapéuticos (comparable con BoNT/A), que es una gran ventaja al 60 disminuir la frecuencia de tratamiento o la necesidad del tratamiento repetitivo del dolor crónico y las condiciones
inflamatorias.
Aunque se han descrito aspectos de la presente invención con referencia a las realizaciones descritas, un experto en la técnica apreciará fácilmente que los ejemplos específicos descritos son solo ilustrativos de estos aspectos y no 5 limitan de ninguna manera la presente invención.
Descripción detallada de la invención
Ejemplo 1: Construcción de rA-HCN y caracterización de la proteína recombinante purificada
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El ácido nucleico recombinante rA-HCN se creó mediante "rA", un constructo monocatenario de la secuencia de nucleótidos de BoNT/A sintética en la que los codones están optimizados para su expresión en E. coli. La secuencia rA también está diseñada para poseer un sitio de escisión de trombina en la región de bucle entre las regiones putativas de cadena pesada y cadena ligera de la toxina (bucle LC-HC) y aminoácidos adicionales que comprenden 15 un segundo sitio de escisión de trombina diseñado cerca del carboxi terminal de la toxina monocatenaria entre las secuencias de toxinas y un His6 C-terminal (SEQ ID NO: 19) para permitir la escisión de la región His6 (SEQ ID NO: 19) y el corte del bucle inter-disulfuro después de la purificación. La secuencia rA se clona en el vector de expresión de E. coli pET29a(+) para la propagación; pET29a(+) es un vector de plásmido derivado de pBR322 disponible comercialmente que contiene un origen de plásmido pBR322, un origen de replicación viral del bacteriófago f1, el 20 promotor del bacteriófago T7, un tag S N-terminal, un tag His6 C-terminal (SEQ ID NO: 19) para la purificación del producto génico, una secuencia de clonación múltiple (MCS) y el gen represor lac1. El vector se puede obtener de, por ejemplo, EMD4 Biosciences, Inc.
La región de la secuencia de ácido nucleico que codifica la región Hcn (es decir, que codifica los aminoácidos: U74- 25 Q1091) es eliminado del vector pET29a-rA (Wang y col. 2011, J. BIOL. CHEM) por PCR inversa, mediante cebadores adecuados complementarios a cada cadena de ácido nucleico seguido de autoligado del vector de expresión. Como parte de esta porción de la ingeniería del ácido nucleico codificante, se introdujeron dos residuos de aminoácidos adicionales (Gly-Gly) en lugar de la región Hcn entre los dominios Hn y Hcc de la cadena pesada. El constructo de ADN resultante hereda los dos sitios de escisión de trombina de rA. La Fig. 2A muestra diagramas esquemáticos de 30 las proteínas monocatenarias rA y rA'HcN que muestran los sitios de escisión de la trombina y la ubicación del enlace disulfuro intercatenario.
Después de la verificación de las secuencias de ADN del inserto rA'HCN resultante, el vector que contiene el gen monocatenario (SC) se transformó en la cepa BL21(DE3) de E. coli, y la expresión fue obtenida por autoinducción 35 (Wang y col., 2008). Seguidamente, las células se sedimentaron por centrífuga, se lavaron y se lisaron mediante lisozima y varios ciclos de congelación / descongelación. El material insoluble se eliminó por centrifugación y el sobrenadante se usó para las etapas posteriores. El SC se separó del resto del sobrenadante por IMAC en resina TALON y se eluyó con 500 mM de imidazol. La Fig. 2B muestra un gel SDS-PAGE en el que el carril izquierdo muestra marcadores de peso molecular y, de izquierda a derecha, el lisado despejado (1), la circulación de la 40 columna (2), el lavado previo a la elución de la columna (3), las fracciones eluidas (4-9). La proteína rA-HCN eluida se intercambia luego con el tampón de almacenamiento (20 nM de Hepes, 150 mM de NaCl, pH 7,4) y se incuba con trombina (1 unidad / mg de toxina) a 22 °C durante 1 hora para eliminar la toxina. En algunos casos, los eluatos de IMAC se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de intercambio iónico según el protocolo establecido. Por ejemplo, las muestras purificadas por IMAC se intercambian en tampón de 50 mM de Tris-HCl (pH 8,1) y se 45 cargan en una columna Q de recursos, y después del lavado con 30 mM de NaCl se aplica un gradiente progresivo hasta 1 M de NaCl en tampón de 50 mM de Tris-HCl. Las muestras puras se eluyen con 70 mM de NaCl (Wang y col., 2008 y 2011).
La Fig. 2C muestra geles reductores y no reductores de SDS-PAGE de la toxina purificada antes (SC) y después de 50 cortar con trombina (DC). La reducción se realizó utilizando ditiotreitol (DTT) para reducir y romper los enlaces disulfuro que unen la LC y la HC. Los carriles de DC demuestran que sin reducción (-), la molécula de DC migra como una molécula de un solo peso molecular (lo que indica que los enlaces disulfuro están intactos); tras la reducción (+), el gel demuestra que el derivado de toxina está atrapado.
55 La forma SC purificada por IMAC de rA'HcN se convirtió en la forma de doble cadena (DC) mediante incubación con trombina. El derivado de toxina DC mostró la capacidad de unirse a un fragmento recombinante del bucle intra- luminal de SV2C (el receptor de proteína BoNT/A), mediante un ensayo desplegable e hibridación Western (véase la Fig. 3A).
60 Un ejemplo de dicho ensayo se lleva a cabo como sigue: La forma SC purificada por IMAC de rA-HcN se convierte
en la forma de doble cadena (DC) mediante incubación con trombina como anteriormente. Además, las proteínas DC rA y rE también se agregan al ensayo como control. Los fragmentos intra-luminales expresados de forma recombinante y etiquetados con GST de un aceptor para BoNT/A (GST-rata SV2C (454-579)) se expresan y se purifican como se describe en Wang, y col., J. BIOL. CHEM. 283:16993-17002 (2008). Aproximadamente 100 pg de 5 esta proteína se inmovilizan utilizando 100 pl de una suspensión de resina de flujo rápido de sefarosa 4b de glutatión (GE Healthcare) y se incuba con 100 nM de rA, rE o el derivado de toxina rA-HcN en un volumen total de 100 pl de tampón de unión (50 mM deTris, 150 mM de NaCl, Triton X-100 al 0,5 %, pH 7,6). En cada caso, las perlas de resina se recolectan por centrifugación y se lavan cinco veces con > 10 volúmenes de lecho del mismo tampón durante 15 minutos a 4~C.
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Las proteínas unidas se eluyen de las perlas lavadas añadiendo tampón de muestra no reductor SDS-PAGE. Las toxinas se detectan por hibridación Western como se muestra en la Fig. 3A. Las dos hibridaciones Western a la izquierda son muestras de rA, rA (-Hcn) y rE sin realizar el ensayo desplegable para confirmar la especificidad de los anticuerpos utilizados. Este par de hibridaciones Western muestran geles no reductores SDS-PAGE con los carriles, 15 de izquierda a derecha, estándares de peso molecular teñidos previamente, rA, rA'HCN y rE. La hibridación Western de extremo izquierdo se desarrolla utilizando un anticuerpo selectivo para la cadena ligera de BoNT/A (LC/A) y la hibridación Western del lado derecho de este par se desarrolla utilizando un anticuerpo para la cadena ligera de BoNT/E (LC/E). Como se esperaba, el anticuerpo anti-LC/A detectó tanto rA como rA-HcN, pero no detectó rE. De manera similar, el anticuerpo anti-LC/E solo detectó rE y no rA ni rA-HcN.
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El par de hibridaciones Western de la derecha muestra los resultados de los ensayos de unión contra el componente aceptor SV2C inmovilizado y se ejecutan en el eluido de la columna final. Las hibridaciones Western se desarrollan de la misma manera y la SDS-PAGe se ejecuta de la misma manera con el mismo orden de carril que en el par de la izquierda descrito anteriormente. Los resultados muestran que rE no estaba enlazado por el componente aceptor 25 SV2C inmovilizado (véase la hibridación Western del extremo derecho del último carril). Sin embargo, la hibridación Western de la izquierda del par muestra que tanto rA como rA-HcN se enlazaron al componente aceptor y se eluyeron con éxito, siendo los pesos moleculares de estos polipéptidos idénticos a los de las especies detectadas en el control positivo.
30 El derivado de toxina DC mostró la capacidad de unirse a un fragmento recombinante del bucle intra-luminal del componente aceptor SV2C, mediante un ensayo desplegable e hibridación Western. Como control, una forma purificada de rE (toxina recombinante de BoNT/E con forma de doble cadena), que naturalmente se une a las formas glicosiladas de los receptores de proteínas relacionados SV2A y SV2B, se incubó con el fragmento SV2C en condiciones idénticas, y no se unió a este fragmento. Por lo tanto, la interacción de rA-HcN con SV2C es selectiva y 35 no ocurre con rE.
Cuando se añadió rA-HcN en diluciones en serie a cultivos de neuronas de gránulos cerebelosos de rata (CGN), el derivado de toxina no logró sustancialmente escindir la SNAP-25. La Fig. 3B muestra un experimento en el que se incubaron CGN de rata con diluciones en serie de diez veces rA o rA-HcN (de 1000 pM a 0,01 pM y con un control 40 negativo que contiene 0 pM) en medio de cultivo a 37 °C durante 24 horas. Las células se recogieron y se lavaron, luego se lisaron en tampón de muestra de SDS-PAGE; las hibridaciones Western se desarrollaron mediante un anticuerpo selectivo para la SNAP-25 intacta y un reactivo con el producto de escisión SNAP-25 de digestión con BoNT/A. Los resultados mostraron que tras el tratamiento de CGN de rata con la toxina rA, la SNAP-25 intracelular se escinde a concentraciones de toxina a y por encima de aproximadamente 0,01 pM de la toxina, mientras que la 45 SNAP-25 permanece en gran parte intacta después del tratamiento de las células CGN con rA-HcN de menos de aproximadamente 1000 pM. Dado que ambas proteínas contienen proteasa LC/A con actividad similar hacia sustratos recombinantes, los datos sugieren que la eliminación de Hcn del derivado rA-HcN priva y / o atenúa el derivado de toxina de la capacidad de someterse a la asimilación y / o translocación de LC dentro de las células CGN. Además, como se muestra en la Fig. 3B, ni rA ni rA-HcN escindieron la sintaxina-1 de la proteína SNARE, que 50 se agregó a los geles de SDS-PAGE como control negativo.
De acuerdo con esta hipótesis, la inyección intraperitoneal de cada toxina en ratones, en un ensayo de letalidad en ratones, también mostró la toxicidad desproporcionada de las toxinas. Como se muestra en la Fig. 3C, al calcular el mLD50/mg (el mLD50 se define como la dosis más baja de toxina efectiva para matar al 50 % de un grupo de 4 55 ratones en 4 días), la variante rA-HcN eliminada muestra aproximadamente una disminución de 6,7 x 104 veces la toxicidad en relación con rA.
Estos nuevos hallazgos sugirieron que la presencia de la porción de Hcn de la cadena pesada puede ser importante para la intoxicación celular por BoNT/A (incluyendo rA) y sus derivados. Además, este experimento parece 60 diseccionar uno o más elementos del mecanismo de intoxicación multifásico de la neurotoxina clostridial (unión
selectiva de la superficie celular, asimilación y translocación de la LC al citosol y escisión de la SNARE). Ejemplo 2: Construcción de derivados de toxinas LC.Hn.Hcn/A-PT-1 y LC.Hn/A-PT-1
5 Los datos descritos en el Ejemplo 1 muestran que es posible alterar la especificidad de BoNT/A (y, por lo tanto, de muchas o todas las otras neurotoxinas clostridiales) sin alterar la endopeptidasa de LC eliminando la región Hcc de la región de unión de la cadena pesada. Además, los solicitantes suponen que se producirían resultados similares si la región Hcc se mutara en lugar de retirarse para eliminar la capacidad de la toxina para unirse al receptor de proteína.
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Los solicitantes deseaban investigar si la toxina alterada puede redireccionarse para unirse selectivamente a otro tipo de célula. Como se muestra en la Fig. 4, los solicitantes consideraron que dichas variantes de neurotoxinas Hcc faltantes o Hcc inactivas pueden vincularse a ligandos selectivos (TL) cuidadosamente seleccionados, por ejemplo dirigidos a receptores purinérgicos.
15
Para generar LC.Hn.Hcn/A-PT-1 (Fig. 5A), se obtuvo un producto de PCR que codifica un gen sintético LC.Hn.Hcn/A, utilizando el constructo pET29a-BoNT/A como plantilla y un par de cebadores (cebador de avance T7 y un cebador inverso específico con un sitio de restricción Sac I diseñado). Esto se procesó utilizando las endonucleasas Xba I y Sac I y se clonó en el vector pET29a(+) mediante estos dos sitios de restricción. El 20 constructo resultante se procesó con Sac I y Xho I antes de la ligadura con un ácido nucleico que comprende un fragmento génico de purotoxina-1 sintético procesado con Sac I y Sal I endonucleasa (abreviado "PT-1": mostrado como secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 11) y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 12) para generar un constructo selectivo LC.Hn.Hcn/A-PT-1. De manera similar, se creó LC.Hn/A-PT-1 excepto que la secuencia de nucleótidos que codifica LC.Hn de BoNT/A se fusionó directamente con PT-1 sin las secuencias de nucleótidos Hcn 25 intermedias (Fig. 5A).
La secuencia de nucleótidos del constructo resultante se verificó mediante análisis de secuencia, luego cada uno de los constructos de vectores de expresión anteriores se transformó en la cepa huésped de E. coli Origami™ 2(DE3); esta cepa es un derivado K-12 que tiene mutaciones en ambos genes de la tiorredoxina reductasa (trxB) y la 30 glutatión reductasa (gor), que aumentan considerablemente la formación de enlaces disulfuro en el citoplasma de E. coli. La expresión de la proteína plasmídica se indujo mediante un medio de autoinducción (Wang y col., JBC, 2008).
Las proteínas expresadas se purificaron por IMAC como anteriormente, seguido por un análisis SDS-PAGE de LC.Hn.Hcn/A-PT-1 (Fig. 5B) y LC.Hn/A-PT-1 (Fig. 5C) en geles reductores y no reductores, sustancialmente como 35 se describe en el Ejemplo 1. Las células se sedimentaron, se lavaron y se lisaron utilizando lisozima y varios ciclos de congelación / descongelación; el material insoluble se eliminó por centrifugación. Las proteínas fueron atrapadas por IMAC en resina TALON, eluidas con 500 mM de imidazol. En cada una de las Fig. 5B y 5C, el carril 1 corresponde al lisado despejado, 2 a la fracción de circulación, 3 a la fracción de lavado y las fracciones 4-8 a las fracciones de eluatos. El carril no marcado en cada gel comprende estándares de peso molecular.
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Como se puede ver, a diferencia de los experimentos que utilizan rAHcN expresado, ambas LC.Hn.Hcn /A-PT-1 y LC.Hn/A-PT-1 se expresaron en gran parte en forma de DC, como se refleja por el aspecto en condiciones reductoras de LC y Hn.Hcn/A-PT-1 o Hn/A-PT-1 en SDS-PAGE (Fig. 5B y Fig. 5C). Este hecho sugiere que en este experimento el sitio de trombina intra-bucle en cada constructo se escindió después de la expresión o durante la 45 purificación sin la necesidad de una etapa de escisión in vitro. Se confirmó la presencia de especies discretas de LC y "HC" mediante hibridación Western; la Fig. 6A muestra que el anticuerpo anti-LC/A detecta la doble cadena unida por disulfuro LC.Hn.Hcn/A-PT-1 en geles no reductores, pero solo la LC en geles reductores. De manera similar, el anticuerpo anti-His6 ("His6" descrito como SEQ ID NO: 19) detecta la cadena doble unida por disulfuro LC.Hn.Hcn/A-PT-1 en geles no reductores, pero solo la Hn.Hcn/A -PT-1 en condiciones reductoras. La tinción con 50 azul de Coomassie del gel muestra que ambas cadenas están presentes en condiciones reductoras. La Fig. 6B muestra el mismo experimento utilizando la LC.Hn/A-PT-1 purificada, con resultados similares.
Se realizó la incubación de 1,6 nM de LC.Hn.Hcn/A-PT-1 o LC.Hn/A-PT-1 con neuronas sensoriales de ganglios trigeminales de rata como se ha descrito anteriormente. Como se muestra en la Fig. 6C, solo las células incubadas 55 con LC.Hn.Hcn/A-PT-1 mostraron escisión detectable de SNAP-25 mediante esta concentración de proteína. En cambio, LC.Hn/A-PT-1 no pudo escindir SNAP-25 dentro de las células de los ganglios trigeminales de rata a pesar de transportar la misma LC. El resultado se muestra cuantitativamente en la Fig. 6D. Estos hallazgos sugieren que Hcn desempeña un papel importante al permitir que el polipéptido LC.Hn.Hcn/A-PT-1 entre en las neuronas sensoriales y escienda su objetivo intracelular; la carencia de resultados de Hcn trae consigo una capacidad 60 considerablemente atenuada o ausente de que la proteína penetre la célula. Por lo tanto, los solicitantes han
descubierto que la presencia de Hcn es muy importante para permitir que los agentes terapéuticos basados en toxina clostridial (incluso aquellos como LC.Hn/A-PT-1 que producen un TL selectivo para un receptor de proteína indicado por la célula diana) entren en la célula madre.
5 En la presente memoria descriptiva (a menos que se indique lo contrario), todas las secuencias de aminoácidos se muestran en la dirección del amino terminal al carboxi terminal, y las secuencias de nucleótidos se muestran en la dirección 5' a 3'.
Fragmento de ácido nucleico de purotoxina-1 sintético (con codones de parada) y sus aminoácidos 10 codificados.
SEQ ID NO: 9 y 10 son la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente, del fragmento de ácido nucleico de purotoxina-1 sintético y sus aminoácidos codificados, incluidas las regiones enlazadoras adicionales. A continuación se muestra una alineación de estas secuencias con los sitios de endonucleasas de 15 restricción relevantes que se muestran como sigue: Los nucleótidos 1-18 comprenden sitios de restricción para Sal I, Sac I y EcoRV; nucleótidos 19-63: tres iteraciones de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos Gly4Ser (SEQ ID NO: 20) (un enlazador no estructurado); nucleótidos 64-171 (se muestran subrayados y en negrita): el fragmento de purotoxina-1, que incluye un codón de parada (*); nucleótidos 172-177: el sitio de restricción para la endonucleasa Xho I.
20
V , L .1 G G G G S G G G G S G G G GSGYCAEK
| GTCGAC GflGCTC 1ATATC GG" 4GI' - 4 1' - r'.l'-GG'-" GG GG -4" 'I GAG'-" GG"GGI' - -r.'G - GGTTATTGTGCAGAAAA 80
Salí Sac 1 EcoRV
GIRCDD IHCCTGLKCKCNASGYNCVC 81 AGGTATTCGCTGTGATGATATTCATTGTTGCACCGGTCrGAAATGTAAATGTAATGCCAGCGGTTATAATTGCGTGTGCC 1 60
r k k * l i (SEQ ID NO: 10)
161 GCAAAAAGTAA GTCGAG 17G (SEQ ID NO :9) Xliol
Fragmento de ácido nucleico de purotoxina-1 sintético (sin codones de parada) y sus aminoácidos codificados.
25
SEQ ID NO: 11 y 12 son la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos, respectivamente, del fragmento de ácido nucleico de purotoxina-1 sintético y sus aminoácidos codificados, incluidas las regiones enlazadoras adicionales. A continuación se muestra una alineación de estas secuencias con los sitios de endonucleasas de restricción relevantes que se muestran como sigue: Los nucleótidos 1-18 comprenden sitios de restricción para Sal I,
30 Sac I y EcoRV; nucleótidos 19-63: tres iteraciones de nucleótidos que codifican la secuencia de aminoácidos Gly4Ser (SEQ ID NO: 20) (un enlazador no estructurado); nucleótidos 64-168 (se muestran subrayados y en negrita): el fragmento de purotoxina-1( sin un codón de parada); nucleótidos 169-174: el sitio de restricción para la endonucleasa Sal I.
V . L .1 G G G G S G G G G S G G G G Y C A K K
I GTCGAC GAGCTC 3A1ATC GGTGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGCGGTTCAGGTGG GG 'GG 'GG GGTTATTGTGCAGAAAA 80
Sal _ Sacl ECORV
GIRCDDIHCCTGLKCKCNASGYNCVC 81 AGGTAITCGCTGTGAIGATATTCATTGTTGCACCGGTCTGAAATGTAAATGTAATGCCAGCGGITATAATIGCGrGTGCC 1 60
R K K V D (SEQ ID NO: 12)
161 GCAAAAAC G CGAC 174 (SEQ IDNOrll)
Sa
Ejemplo 3: Inhibidores selectivos de derivados de BoNT de exocitosis para células que secretan los 5 afectores inflamatorios
La liberación de citoquinas y otros mediadores de la inflamación se asocia con varios tipos de dolor crónico. La liberación de muchos de estos mediadores implica la exocitosis dependiente de SNARE (Stow y col., NATURE REVIEWS Immunol. 6, 919-29, 2006). En otra realización de la presente invención, los agentes terapéuticos 10 derivados de toxina clostridial pueden dirigirse a las células implicadas en la liberación de estos actores al unir TL que tienen una afinidad selectiva por dichas células, como los péptidos IL-1RA o antagonista de CGRP (véase más arriba), que se unen a sus receptores requeridos en la superficie de células no neuronales que secretan dolor y / o mediadores inflamatorios. Dichas células pueden ser neuronas o no neuronas.
15 Con este fin, se analizó una línea celular sinovial humana (hSC) para las especies de proteínas SNARE y se descubrió que contenía predominantemente SNAP-23, VAMP 3 y sintaxina 2, 3 y 4. Como se muestra en la Fig. 7, las SNARE SNAP-25, la sintaxina 1 y la VAMP 2 no se detectaron en un grado apreciable en las células hSC. De manera similar, en una línea celular de macrófagos RAW264.9 (mMC) se detectan SNAP-23, VAMP 3, sintaxina 2, sintaxina 3 y sintaxina 4.
20
Los tipos celulares adicionales analizados para las proteínas SNARE incluyeron neuronas de gránulos cerebelosos de rata (rCGN). Como se muestra en la Fig. 7, estos contenían SNAP-25, VAMP 2 y sintaxina 1.
Como se muestra en la Fig. 8A-8D, las células hSC se incubaron durante 7-10 días con lentivirus de shARN (ARN 25 de horquilla corta) que transportan secuencias de nucleótidos dirigidas específicamente a la regulación negativa de la expresión de SNAP-23. Luego, las células se incubaron durante la noche con IL-Ip (100 ng/ml) en medio de cultivo para inducir secreción de TNF-a e IL-6. Después de recoger el sobrenadante, los lisados de estas células se sometieron a SDS-PAGE y las proteínas se detectaron por análisis de hibridación Western mediante anticuerpos dirigidos a SNAP-23, VAMP 3 o la proteína de control no dirigido p-tubulina. KD se refiere a “knock down” inducido 30 por shARN o inhibición de expresión. Los resultados del gel (Fig. 8A y 8C) muestran que la expresión de SNAP-23 y VAMP 3 disminuye sustancialmente en las células tratadas con el shRNA en comparación con las células no tratadas (control). Además, en las Fig. 8B y 8D, los niveles de factor de necrosis tisular alfa (TNF-a) e interleuquina-6 (IL-6) cuantificados por ELISA en células tratadas con shRNA se comparan con los niveles en células no tratadas, y la reducción se expresa como porcentaje de inhibición relativa al control; la Fig. 8B también muestra el porcentaje de 35 knock-down) de SNAP-23 y la Fig. 8D el porcentaje de knock-down de VAMP 3, en relación con las células no tratadas. Estas observaciones proporcionan evidencia de que se requieren VAMP 3 y SNAP-23 en la exocitosis de ambas citoquinas analizadas. Los niveles de SNAP-23 o VAMP 3 en células tratadas con shRNA en relación con una proteína de referencia interna (p-tubulina) se compararon con los de las células no tratadas y se expresó la reducción como porcentaje de KD en relación con el control.
40
Por lo tanto, como lo ilustran estos hallazgos, ciertas realizaciones de la presente invención implican composiciones y procedimientos para inhibir la liberación de citoquinas mediante un agente analgésico derivado de BoNT dirigido a estas células a través de un TL unido, tal como IL-1RA o un antagonista de CGRP; véase la Fig. 4.
45 Por ejemplo, la escisión de VAMP 3 en células que secretan factores inflamatorios puede lograrse ligando un segmento de ácido nucleico sintético preparado que codifica la proteasa LC/D de escisión de VAMP 3 en un constructo terapéutico como BoNT/D('Hcc), a un ácido nucleico sintético que codifica un polipéptido capaz de unirse
(IL-1RA) que tiene afinidad selectiva por el receptor de IL-1 humano (la secuencia completa se muestra en el presente documento como SEQ ID NO: 13 con la secuencia de aminoácidos traducida mostrada como SEQ ID NO: 14).
5 Como un TL alternativo para prevenir la secreción de factores inflamatorios de las células, el uso de un antagonista para el receptor 1 de cGrP proporciona un medio similar para dirigirse a las células no neuronales y las neuronas sensoriales. En el presente documento, se describe un ácido nucleico sintético que codifica una porción de unión de la secuencia codificante del antagonista de CGRP humano (CGRP8-37); esta secuencia se muestra como SEQ ID NO: 15, y su secuencia de aminoácidos traducida se proporciona como SEQ ID NO: 16. El fragmento de ácido 10 nucleico se fusionó mediante digestión con endonucleasas de restricción y ligación a BoNT/D("Hcc) para generar un gen de fusión, BoNT/D(-Hcc) -CGRP8-37. La secuencia de la (SEQ ID NO: 17, y su secuencia de aminoácidos traducida se proporciona como SEQ ID NO: 18).
Estos dos ácidos nucleicos híbridos se clonan por separado en el vector de expresión pET29a(+) y se expresan en 15 cepa de E. coli BL21(DE3). Una estrategia adicional o alternativa para inhibir la liberación de citoquinas puede depender de la inactivación de SNAP-23; en este enfoque, una fracción LC/E, capaz de escindir SNAP-23, puede unirse a BoNT/A-Hcc-IL-1RA o BoNT/X (PrR')-IL-1RA. Por ejemplo, el residuo mutante de Lys224 en la fracción LC/E a Asp aumentó significativamente su escisión de SNAP-23 humana (Chen y Barbieri, Proc. Nat. Acad. Sci. Estados Unidos, 106:9180-9184, 2009). Esta LC/E mutante puede unirse a BoNT/B (Lys1192 ^ Glu y / o Ala1196 ^ 20 Lys:PrR')-IL-1RA (véase el texto anterior sobre PrP-). Estos constructos se pueden utilizar junto con agentes bioterapéuticos que tienen la capacidad de escindir otras proteínas SNARE para proporcionar un efecto terapéutico más fuerte. Además, como el receptor de IL-1 también reside en macrófagos que también poseen SNARE susceptibles a BoNT (véase la Fig. 7), se puede adoptar un enfoque similar al descrito anteriormente para la hSC para dirigirse a estas células.
25
Todos estos constructos comprenden híbridos BoNT/X-TL (o ácidos nucleicos que codifican dichos híbridos) que carecen de la región Hcc o que tienen una región Hcc inactiva. Los polipéptidos se construyen preferentemente para contener secuencias inter-catenarias de bucle corto que poseen un sitio de escisión selectivo y susceptible a la proteasa situado entre HC y LC de BoNT, de modo que las proteínas monocatenarias expresadas se pueden 30 convertir in vitro en la forma di-catenaria activada según sea necesario .
En las siguientes secuencias de nucleótidos, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17 y su respectiva secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 y SEQ ID NO: 18), los aminoácidos se identifican utilizando las designaciones de aminoácidos de una sola letra, con la secuencia de aminoácidos mostrada en la 35 dirección del amino terminal al carboxi terminal y la secuencia de nucleótidos mostrada en la dirección 5' a 3'.
Secuencia génica de BoNT/D ('Hcc) -humana IL-1RA y sus aminoácidos codificados (SEQ ID NO: 13 Y 14)
Claims (16)
1. Una composición que comprende un derivado de neurotoxina clostridial, comprendiendo dicha
composición:
a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial que escinde una proteína SNARE en condiciones fisiológicas;
b) un dominio de translocación derivado de toxina clostridial que facilita el movimiento de dicho primer dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas;
10 c) un dominio de unión derivado de toxina no clostridial que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por una célula diana, siendo seleccionada dicha célula diana del grupo que consiste en
i) una neurona sensorial, y
15 ii) una célula que secreta al menos una citoquina inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito, estando dicho receptor de superficie celular sustancialmente ausente de las neuronas motoras o autónomas;
d) un dominio Hcn funcional derivado de toxina clostridial; y
20
donde dicha proteasa de cadena ligera de dicho derivado de neurotoxina clostridial es asimilada por dicha célula diana tras la unión de dicho TL a la célula diana, y donde un dominio selectivo Hcc está ausente o está mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su receptor de proteína natural.
25 2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde dicho dominio selectivo Hcc está presente
como un dominio Hcc mutado e inactivo.
3. La composición de acuerdo con la reivindicación 2, donde dicho dominio selectivo Hcc está mutado para comprender uno o ambos de: un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente al aminoácido
30 1192 de BoNT/B y un residuo de lisina en una posición correspondiente al aminoácido 1196 de BoNT/B.
4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, donde dicho dominio Hcc mutado se deriva de BoNT/B.
35 5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho derivado de
neurotoxina comprende un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial.
6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicho segundo dominio de endopeptidasa está proteolíticamente activo o donde dicho segundo dominio de endopeptidasa está
40 sustancialmente proteolíticamente inactivo.
7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde cada uno del primer dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial y el dominio de translocación se deriva individualmente de un subtipo BoNT/X seleccionado del grupo que consiste en BoNT/A, Bo/NT/B, BoNT/C1,
45 BoNT/D, BoNT/E, BoNT/G y BoNT/F.
8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el TL comprende un componente selectivo seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de cGRP, un anticuerpo selectivo receptor de cGRP o específico receptor de cGRP o un fragmento selectivo del mismo o un
50 agonista de interleuquina 1 o un antagonista de receptor de interleuquina 1, un anticuerpo selectivo de receptor IL-1 o específico de receptor IL-1 o un fragmento del mismo y variantes e isoformas moderadamente modificadas de cualquiera de los anteriores.
9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende BoNT/D 55 (-Hcc)-CGRPb-37.
10. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende BoNT/D (-HCC)-IL-1 RA humano.
60 11. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende
LC.HN.HCN/A-PT-1.
12. Un derivado de neurotoxina clostridial analgésico que comprende:
5 a) un primer dominio activo de endopeptidasa derivado de toxina clostridial que escinde una proteína SNARE en condiciones fisiológicas y que tiene una vida media enzimática de 10 días o más cuando se inyecta en un músculo gastrocnemio de ratón en condiciones sustancialmente fisiológicas;
b) un dominio de translocación derivado de toxina clostridial que facilita el movimiento de dicho primer dominio de endopeptidasa a través de una membrana celular en el citosol en condiciones fisiológicas;
10 d) un dominio Hcn funcional derivado de toxina clostridial; y
c) un dominio de unión que comprende un primer ligando selectivo (TL) que se une selectivamente, en condiciones fisiológicas, a un primer receptor de superficie celular indicado por un tipo de célula diana seleccionada del grupo que consiste en:
15 i) neuronas sensoriales, y
ii) células secretoras de citoquinas seleccionadas del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito
con preferencia por un tipo de célula no diana seleccionada del grupo que consiste en neuronas motoras y neuronas 20 autónomas;
donde dicho derivado de neurotoxina carece de un dominio Hcc funcional de toxina clostridial y
donde una célula diana asimila dicho primer dominio de endopeptidasa de dicho derivado de neurotoxina clostridial 25 tras la unión de dicho TL a la célula diana.
13. El derivado de neurotoxina de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende un segundo dominio de endopeptidasa derivado de toxina clostridial.
30 14. El derivado de neurotoxina de acuerdo con la reivindicación 12, donde dicha célula diana es una célula
que secreta al menos una citoquina inflamatoria seleccionada del grupo que consiste en un macrófago, un sinoviocito y un mastocito.
15. La composición de acuerdo con la reivindicación 12, 13 o 14, donde el derivado de neurotoxina 35 contiene un dominio Hcc derivado de neurotoxina clostridial mutado para impedir la unión del dominio Hcc a su
receptor de proteína natural.
16. La composición de acuerdo con la reivindicación 15, donde dicho dominio selectivo Hcc está mutado para comprender uno o ambos de: un residuo de ácido glutámico en una posición correspondiente al aminoácido
40 1192 de BoNT/B y un residuo de lisina en una posición correspondiente al aminoácido 1196 de BoNT/B.
17. El derivado de neurotoxina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que el TL comprende un componente selectivo seleccionado del grupo que consiste en un antagonista de CGRP, un anticuerpo selectivo receptor de CGRP o específico receptor de CGRP o un fragmento selectivo del mismo o un
45 agonista de interleuquina 1 o un antagonista de receptor de interleuquina 1, un anticuerpo selectivo de receptor IL-1 o específico de receptor IL-1 o un fragmento del mismo y variantes e isoformas moderadamente modificadas de cualquiera de los anteriores.
18. El derivado de neurotoxina de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que 50 dicho primer dominio de endopeptidasa y dicho dominio de translocación se derivan ambos de BoNT/D; o en el que
dicho primer dominio de endopeptidasa y dicho dominio de translocación se derivan ambos de BoNT/A; o en el que dicho primer dominio de endopeptidasa y dicho dominio de translocación se derivan ambos de BoNT/C1.
19. Un compuesto o composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 para su uso en 55 el tratamiento del dolor crónico, donde dicho dolor crónico se selecciona del grupo que consiste en dolor por cáncer,
dolor postoperatorio, dolor neuropático, alodinia, neuralgia posherpética, síndrome del intestino irritable y otros dolores viscerales, dolor por artritis, dolor óseo, neuropatía periférica, dolor asociado al sistema circulatorio y cefalea.
20. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 19 para el tratamiento de la artritis.
113
BoNT/X("Hcc)—TL
LC/E-BoNT/X("Hcc)-TL
LC/E—BoNTA(PrR" )-TL
114
s-s
FIG. 2B F/G. 2C
115
Solo toxina
+SV2C
rA(HCN): [pM] o i—- 0 ^
O O *-*■ o
O O O i—*■ i—*■ o
Sintaxina 1 *•****•*«* *
FIG. 3B SNAP-25a
rA:
Sintaxina 1 mm mm m ■■ <■ •#*
SNAP-25 i ««»«i#^
SNAP-25a jfjíjpjfc. á&jfá JÜÜfc ■^siss»# •
FIG.
- Toxina
- Neurotoxicidad
- específica
- (mLD50/mg)
- rA
- 2x 108
- rACHCN)
- ~ 3 x 103
116
Ligando selectivo (TL)
Agente terapéutico nuclear
Dominios de BoNT como en la realización A, B o C
FIG.
A
Dirigido a neuronas sensoriales
J
Dirigido a células que secretan citoquinas
4
s-s
- LC.HN/A-PT-1
- LC/A hn/a i pt-1 ► H¡s6 ¡
- i Trorr i ibina Enlazador
- LC.Hn.Hcn/A-PT-1
- LC/A hn/a hcn/a - -í PT-l \\ His6 {
- i t
Trombina Enlazador
FIG. 5A
FIG. 5B
-DTT
+DTT
FIG. 5C
-DTT +DTT
12345678 ■■■■■■■ ÉÉ
kDa
12345678
^J<iSC/DC (g -<Hn.Hcn/A-PT-1 100 <LC
1234567 kDa *ffig I
i ¿u
“ 1 i§
Jl 2 34 5 6 7 |
■MMM
*»■»*«• <3
SC/DC
!ÍIb «#»-<hn/a"pt"1
I ■ *fü ■VlC
I ■
1
• i
f **
* -S-
118
Teñido en Coomassie
wb FIG. 6A
CN'
PT-1
kDa
250
150
100
75
50
37
25
Anti-
- • ¡ 1
- mm <— ■sÉ DC
- Hn-PT-1
- LC
Hís6 LC/A
FIG. 6B
o
r-f-
o>_
rt>
3
so
cN
LT)
Z
>
“O
i
NJ
Ln
rD
l/>
o
3’
Q.
Ql
QJ
FIG. 6D
>
I
“O
o
>
I
~U
hSCs mMCs
SNAP-23
VAMP-3
Sintaxina-2
Sintaxina-3
Sintaxina-4
FIG.
rCGNs
hSCs
SNAP-25
S¡ntax¡na-1
VAMP-2
FIG. 73
% de inhibición de TNF-a([]) e IL-6
KD SNAP-23 (□) (% de control)
KD VAMP-3 (O) Q (% de control)
cá
C
FIG. 8C
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