ES2694683T3 - Inactivación proteolítica de proteínas seleccionadas en extractos bacterianos para mejorar la expresión - Google Patents

Inactivación proteolítica de proteínas seleccionadas en extractos bacterianos para mejorar la expresión Download PDF

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Abstract

Una proteína de factor de liberación 1 (RF1) que puede ser escindida por una proteína de la membrana externa T1 (OmpT1) y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en la que hay un enlace peptídico escindible por OmpT1 situado dentro de la región del bucle de conmutación, y en la que la región del bucle de conmutación comprende los aminoácidos 287-304 de la SEQ ID NO: 1 modificada para incluir tres aminoácidos básicos adyacentes que están cargados positivamente a pH 7,0.

Description

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DESCRIPCION
Inactivación proteolítica de proteínas seleccionadas en extractos bacterianos para mejorar la expresión Campo de la invención
La invención se refiere a la tecnología de síntesis libre de células, y, en particular, a la inactivación proteolítica de proteínas seleccionadas en un extracto bacteriano. Un uso preferido es el aumento del rendimiento de los polipéptidos que tienen un aminoácido no nativo incorporado en un resto de aminoácido definido.
Antecedentes de la invención
El uso de extractos bacterianos libres de células para la síntesis de proteínas in vitro ofrece varias ventajas frente a los métodos convencionales de expresión de proteínas in vivo. Los sistemas libres de células pueden dirigir la mayoría, si no todos, los recursos metabólicos de la célula hacia la producción exclusiva de una proteína. Por otra parte, la falta de componentes de la pared y de la membrana celulares in vitro es ventajosa, ya que permite el control del entorno de la síntesis. Sin embargo, la eficacia de los extractos libres de células puede ser disminuida por las proteínas bacterianas que inhiben la síntesis de proteínas, ya sea directa o indirectamente. Por lo tanto, la inactivación de proteínas no deseadas que disminuyen la eficacia de la síntesis de proteínas debería aumentar el rendimiento de las proteínas deseadas en extractos libres de células. Por ejemplo, la inactivación de proteínas que disminuyen la eficacia de la síntesis de proteínas debería aumentar el rendimiento de los polipéptidos que tienen aminoácidos no nativos incorporados en un resto de aminoácido definido. La introducción de aminoácidos no nativos (aann) en polipéptidos es útil para aumentar la diversidad biológica y la función de las proteínas. Un enfoque para producir polipéptidos que tengan un aann incorporado en un resto de aminoácido definido es el uso de un aann, CUA ortogonal aminoacilado que contiene ARNt para la introducción del aann en el polipéptido naciente en un codón ámbar (parada) durante la traducción de la proteína. Sin embargo, la incorporación del aann en un codón ámbar puede ser inhibida por el complejo de terminación bacteriano nativo, que normalmente reconoce el codón de parada y termina la traducción. El factor de liberación 1 (RF1) es una proteína compleja de terminación que facilita la terminación de la traducción al reconocer el codón ámbar en una secuencia de ARNm. El reconocimiento de RF1 del codón de parada ámbar puede potenciar los productos de truncamiento prematuros en el sitio de incorporación de los aminoácidos no nativos y, por lo tanto, reducir el rendimiento proteico. Por lo tanto, la atenuación de la actividad de RF1 puede aumentar la incorporación de aann a proteínas recombinantes.
Previamente se ha demostrado que la incorporación de aann se puede aumentar mediante la atenuación de la actividad RF1 de 3 modos: 1) neutralizando la inactivación de anticuerpos de RF1; 2) desactivando genómicamente RF1 (en una cepa reforzada con RF2); y 3) retirando de manera específica del sitio la RF1 usando una cepa diseñada para expresar RF1 que contiene un marcador proteico para la eliminación mediante cromatografía de afinidad (Dominio de unión a quitina y marcador de His). La presente divulgación describe un nuevo método para inactivar a RF1 mediante la introducción de sitios de escisión proteolítica en la secuencia de aminoácidos de RF1. Los sitios de escisión no son accesibles a la proteasa durante el crecimiento de las células bacterianas, pero son escindidos por la proteasa cuando las células bacterianas se lisan para producir un extracto libre de células. Por lo tanto, el rendimiento de los polipéptidos de longitud completa que tienen un aann incorporado en un codón ámbar se aumenta en los extractos de células bacterianas que expresan variantes de RF1 modificadas descritas en el presente documento.
Breve sumario de la invención
La presente invención proporciona una proteína funcional de factor de liberación 1 (RF1) que puede ser escindida por una proteína de la membrana externa T1 (OmpT 1) y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en la que hay un enlace peptídico escindible por OmpT 1 situado dentro de la región del bucle de conmutación, y en la que la región del bucle de conmutación comprende los aminoácidos 287-304 de la SEQ ID NO: 1 modificada para incluir tres aminoácidos básicos adyacentes que están cargados positivamente a pH 7,0.
La invención también proporciona una proteína funcional de factor de liberación 1 (RF1) que es escindible por una proteína de la membrana externa T1 (OmpT1), en la que hay un enlace de péptido escindible por OmpT1 situado dentro de la región del bucle de conmutación, y en la que la región del bucle de conmutación comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en:
QARRGSTRRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:26);
QQARRGTRRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:27);
QQAARRGRRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:28);
QQAEARRGRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:29);
QQAEAARRGNLLGSGDRS (SEQ ID NO:30);
QQAEASARRGLLGSGDRS (SEQ ID NO:31);
QQAEASTARRGLGSGDRS (SEQ ID NO:32);
QQAEASTRARRGGSGDRS (SEQ ID NO:33);
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QQAEASTRRARRGSGDRS (SEQ ID NO:34);
QQAEASTRRNARRGGDRS (SEQ ID NO:35);
QQAEASTRRNLARRGDRS (SEQ ID NO:36);
QQAEASTRRNLLARRGRS (SEQ ID NO:37);
QQAEASTRRNLLGARRGS (SEQ ID NO:38);
QQAEASTRRNLLGSARRG (SEQ ID NO:39)
QQAEASTRRNLLGSGARR (SEQ ID NO:40);
QQAWLAARRGRGGSGDRS (SEQ ID NO:41);
QQAEWLAARRGRGSGDRS (SEQ ID NO:42);
QQAEAWLAARRGRGGDRS (SEQ ID NO:43);
QQWGGRWARKKGTIGDRS (SEQ ID NO:44);
QQAWGGRWARKKGTIDRS (SEQ ID NO:45); y QQAEWGGRWARKKGTIRS (SEQ ID NO:46).
La invención proporciona además una célula bacteriana que expresa tanto una proteína de la membrana externa T1 (OmpT1) como una proteína RF de la invención descrita en el presente documento.
En algunos casos, la proteína diana esencial se selecciona de RF1, RF2, RNAsa, tiorredoxina reductasa, glutarodoxina reductasa, glutatión reductasa, enzimas de degradación de aminoácidos, polifosfato quinasa o proteínas de choque en frío.
La invención también proporciona un método para reducir la actividad perjudicial de la proteína aRFI de la invención en un sistema de síntesis libre de células in vitro, comprendiendo el método las etapas de:
i) cultivar una bacteria positiva en OmpT1 que exprese la proteína RF1 de la invención;
ii) lisar las bacterias para crear un extracto de síntesis libre de células;
iii) poner en contacto la proteína RF1 de la invención con OmpT 1 en una cantidad suficiente para reducir la proteína intacta en un 50 %;
iv) añadir un molde de ácido nucleico al extracto en el que el molde codifica una proteína de interés; y
v) dejar que el sistema de síntesis libre de células produzca la proteína de interés.
La invención proporciona además un ácido nucleico que codifica la proteína funcional de factor de liberación 1 (RF1) de la invención.
La invención también proporciona un método para reducir la competencia de RF1 en un codón ámbar en un sistema de síntesis libre de células in vitro, comprendiendo el método las etapas de:
i) cultivar una bacteria positiva en OmpT1 que exprese la proteína RF1 de la invención;
ii) lisar las bacterias para crear un extracto de síntesis libre de células;
iii) poner en contacto la proteína RF1 del extracto con OmpT1 en una cantidad suficiente para reducir la proteína RF1 intacta en un 50 %;
iv) añadir un molde de ácido nucleico al extracto en el que el molde codifica una proteína de interés e incluye un codón de parada; y
v) dejar que el sistema de síntesis libre de células produzca la proteína de interés.
La invención proporciona además un sistema de síntesis libre de células que comprende, en una sola mezcla de reacción:
i) los componentes de un lisado bacteriano suficientes para traducir un molde de ácido nucleico que codifica una proteína;
ii) un molde de ácido nucleico que codifica una proteína de interés y que tiene al menos un codón ámbar;
iii) ARNt complementario al codón ámbar; e
iv) la proteína RF1 de la invención.
La invención proporciona además un método para expresar proteína en un sistema de síntesis libre de células, que comprende:
i. combinar un molde de ácido nucleico con un extracto bacteriano que comprende la proteína RF1 de la invención; e
ii. expresar una proteína a partir del molde de ácido nucleico.
La invención también proporciona una célula bacteriana que comprende un ácido nucleico que codifica la proteína RF1 de la invención incorporado en el genoma de la célula bacteriana.
La invención también proporciona un extracto bacteriano que comprende una proteína RF1 de la invención.
Breve descripción de los dibujos
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La Figura 1 muestra que las variantes de proteína RF1 modificadas que contienen sitios de escisión de OmpT tienen actividad RF1 de tipo silvestre cuando se añaden a extractos libres de células que carecen de actividad OmpT. Se determinó la capacidad de variantes de RF-1 exógenas para reducir la supresión (aumentar la terminación de la cadena) cuando se añade un aminoácido no nativo en un codón ámbar introducido en la posición S378 de la proteína Fc (Fc_S378TAG). La Figura 1(A), Carril 1, es un extracto de control sin RF1 añadida exógenamente. El extracto contiene RF1 de tipo silvestre, lo que produce una reducción de la supresión ámbar, produciendo un Fc truncado (banda inferior del gel). El Carril 2 es un extracto de control que contiene RF1 de tipo silvestre (WT) añadida exógenamente. La adición de RF1 de tipo silvestre produce una reducción adicional en la supresión ámbar, lo que produce un Fc relativamente más truncado. Los Carriles 3-7 muestran extractos libres de células que contienen diferentes variantes de RF1 de la invención. Las cinco variantes poseen actividad RF1. La Figura 1(B) muestra la actividad relativa de las variantes de RF1, en la que la actividad RF1 WT añadida se establece en el 100 por ciento, y ninguna RF1 añadida se establece en cero por ciento.
La Figura 2 muestra que los extractos libres de células de una cepa bacteriana diseñada para expresar una variante de RF1 modificada (A18) producen un aumento sustancial en el rendimiento de IgG de longitud completa al introducirse aann en diversas posiciones de la cadena pesada, en comparación con una cepa bacteriana que expresa una RF1 de tipo silvestre. 2(A) panel izquierdo: extracto de SBJY001, que contiene OmpT intacta y RF1 de tipo silvestre. 2(A) panel derecho: extracto de SBHS016 (cepa 16), que contiene OmpT intacta y variante A18 de RF1. La intensidad de la banda de IgG de longitud completa (intacta) es mayor en el extracto de la cepa 16, lo que indica que la incorporación de aann aumentó sustancialmente, con una disminución en las proteínas truncadas. 2 (B) muestra que el rendimiento soluble de IgG de las proteínas que contienen un aann en las posiciones indicadas de la cadena pesada se aumenta sustancialmente en el extracto de la cepa 16, lo que indica que la escisión por OmpT de la variante A18 de RF1 produce una cadena pesada menos truncada. El extracto de “RF1+” (RF1 positivo) se refiere a la RF1 de la cepa 001 que no es escindida por OmpT. El extracto "RF1-" (RF1 negativo) se refiere a la RF1 de la cepa 16 que se modifica al incluir sitios de escisión de OmpT, y por lo tanto, es degradada por la actividad OmpT.
La Figura 3 muestra que los extractos libres de células de una cepa bacteriana diseñada para expresar una variante de RF1 modificada (A18) producen un aumento sustancial en la supresión ámbar correspondiente a una mayor incorporación de aann en las posiciones indicadas de la cadena pesada. 3(A) panel izquierdo: extracto de SBJY001, que contiene OmpT intacta y RF1 de tipo silvestre. 3(A) panel derecho: extracto de SBHS016 (cepa 16), que contiene OmpT intacta y variante A18 de RF1. La intensidad de la banda de la cadena pesada de longitud completa (intacta) (Hc) es mayor en el extracto de la cepa 16, lo que indica que la incorporación de aann aumentó sustancialmente, con una disminución en las proteínas truncadas. 3(B) muestra que la supresión ámbar de las proteínas que contienen un aann en las posiciones indicadas de la cadena pesada se aumenta sustancialmente en el extracto de la cepa 16, lo que indica que la escisión por OmpT de la variante A18 de RF1 produce un aumento de la supresión ámbar. El extracto de “RF1+” (RF1 positivo) se refiere a la RF1 de la cepa 001 que no es escindida por OmpT. El extracto "RF1-" (RF1 negativo) se refiere a la RF1 de la cepa 16 que se modifica al incluir sitios de escisión de OmpT, y por lo tanto, es degradada por la actividad OmpT.
Definiciones
La "aminoacilación" o el "aminoacilato" se refieren al proceso completo en el que un ARNt se "carga" con su aminoácido correcto, que es el resultado de añadir un grupo aminoacilo a un compuesto. En lo que respecta a la presente invención, un ARNt sometido a una aminoacilación o que ha sido aminoacilado es aquel que se ha cargado con un aminoácido, y un aminoácido sometido a aminoacilación o que ha sido aminoacilado es aquel que se ha cargado en una molécula de ARNt.
"Aminoacil-ARNt sintetasa" o "ARNt sintetasa" o "sintetasa" o "aaRs" o "RS" se refieren a una enzima que cataliza un enlace covalente entre un aminoácido y una molécula de ARNt. Esto da lugar a una molécula de ARNt "cargada", que es una molécula de ARNt que tiene sus respectivos aminoácidos unidos a través de un enlace éster.
"Codón" se refiere a un grupo de 3 nucleótidos consecutivos de un molde de ácido nucleico que especifica una determinada señal de aminoácido natural, aminoácido no nativo o señal de parada de la traducción (terminación de la cadena polipeptídica). Debido a la degeneración del código genético, un aminoácido puede ser especificado por más de un codón.
Un codón ámbar es una secuencia de terminación de cadena polipeptídica (UAG) en el ARN (TAG en el ADN),que actúa para terminar la traducción del polipéptido en la mayoría de los organismos. El codón ámbar también puede codificar el aminoácido proteogénico pirrolisina si el ARNt apropiado es cargado por su aminoacil-ARNt sintetasa afín.
"ARNt de codón ámbar" o "ARNt supresor de ámbar" o "ARNt anticodón de ámbar" se refieren a un ARNt que se une a un codón ámbar.
"Aminoácidos adyacentes" se refiere a los aminoácidos que preceden o siguen inmediatamente en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido. Por ejemplo, el aminoácido de la posición dos de la secuencia de aminoácidos primaria
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de un polipéptido es adyacente a los aminoácidos de las posiciones uno y tres. "Dos aminoácidos básicos adyacentes" se refiere a un aminoácido básico que precede o sigue inmediatamente a otro aminoácido básico en la secuencia de aminoácidos primaria de un polipéptido. Por ejemplo, el aminoácido básico Arg (R) de la posición 295 de la secuencia de aminoácidos de RF1 puede ser adyacente a un aminoácido básico tal como K o R introducido en la posición 296 de la secuencia de aminoácidos de rF1.
"Extracto libre de células derivado de bacterias" se refiere al preparado de mezclas de reacción in vitro capaz de traducir el ARNm en polipéptidos. Las mezclas incluyen ribosomas, ATP, aminoácidos y ARNt. Pueden derivarse directamente de bacterias lisadas, de componentes purificados o combinaciones de ambos.
Los "aminoácidos básicos" son polares y están cargados positivamente a valores de pH por debajo de sus pKa, y son muy hidrófilos. Los ejemplos de aminoácidos básicos a pH neutro incluyen arginina (Arg = R), lisina (Lys = K) e histidina (His = H).
El "sistema de síntesis libre de células" se refiere a la síntesis in vitro de polipéptidos en una mezcla de reacción que comprende extractos biológicos y/o reactivos definidos. La mezcla de reacción comprenderá un molde para la producción de la macromolécula, por ejemplo, ADN, ARNm, etc.; monómeros para la macromolécula que se vaya a sintetizar, por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, etc.; y cofactores, enzimas y otros reactivos que son necesarios para la síntesis, por ejemplo, ribosomas, ARNt no cargados, ARNt cargados con aminoácidos no naturales, polimerasas, factores de transcripción, etc.
La expresión "la actividad de escisión es superior al 50 % de la RF1 de tipo silvestre" se refiere a la velocidad de escisión de una proteína modificada descrita en el presente documento que es superior al 50 % de la velocidad de escisión de la proteína de tipo silvestre en condiciones especificadas. Por ejemplo, la velocidad de escisión puede ser superior al 50 % de la velocidad de escisión de la proteína de tipo silvestre tras 30 minutos a 30 °C cuando las proteínas modificadas y de tipo silvestre están presentes a una concentración similar (por ejemplo, una concentración de 0,11,0 micromolar) en un extracto libre de células de bacterias que expresan OmpT1.
La expresión "actividad perjudicial" se refiere a una actividad que disminuye el rendimiento proteico durante la síntesis de proteínas en los extractos libres de células. Por ejemplo, la actividad perjudicial puede inhibir la transcripción y/o traducción celular en sistemas de síntesis libres de células. La actividad perjudicial puede incluir la reducción enzimática de GSSG que se requiere para el plegamiento eficaz de proteínas unidas por disulfuro producidas en una reacción de síntesis libre de células. La actividad perjudicial también puede incluir la terminación prematura de la cadena por un factor de liberación, de modo que la elongación del polipéptido se termina prematuramente en un codón de parada introducido.
Una "proteína diana" es una proteína que ha sido modificada para incluir un sitio de escisión de la proteasa, o una proteína que se modifica para incluir un aann. Una "proteína diana esencial" es una proteína que se requiere para el crecimiento y/o la supervivencia normales de una célula, tal como una célula bacteriana o una célula eucariota.
Una “proteína funcional de factor de liberación 1 (RF1)” se refiere a RF1 que conserva la misma o esencialmente la misma actividad que la proteína RF1 de tipo silvestre o sin modificar. La actividad RF1 funcional se puede ensayar, por ejemplo, midiendo la velocidad de crecimiento de las bacterias que expresan la proteína RF1 modificada, y comparando la velocidad de crecimiento con la de las bacterias que expresan RF1 de tipo silvestre o no modificada. La actividad funcional de otras proteínas modificadas para contener sitios de escisión de OmpT se puede determinar de manera similar, por ejemplo, midiendo la velocidad de crecimiento de las bacterias que expresan la proteína modificada, y comparando la velocidad de crecimiento con la de las bacterias que expresan la proteína de tipo silvestre o no modificada. La actividad RF1 funcional también se puede ensayar, por ejemplo, según la capacidad de la proteína RF1 modificada para reducir la incorporación de ARNn ortogonal de un aann en una posición específica de un ARNm que codifica una proteína diana, aumentando así la cantidad de terminación prematura de la cadena (es decir, aumentando la cantidad de proteína truncada).
La expresión "modificada para incluir", en el contexto de la presente invención, se refiere a sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos en una secuencia de proteína o polipéptido, o a las sustituciones correspondientes, adiciones o eliminaciones en una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína modificada. La proteína modificada puede incluir sustituciones de aminoácidos que reemplazan un número igual de aminoácidos de la secuencia de proteínas de tipo silvestre, aminoácidos añadidos a la secuencia de tipo silvestre o aminoácidos eliminados de la secuencia de tipo silvestre. Por ejemplo, la proteína puede modificarse para incluir aminoácidos básicos que reemplacen al/a los aminoácido/s de tipo silvestre de la posición correspondiente de la secuencia de aminoácidos. La proteína también puede modificarse para incluir secuencias de aminoácidos que sean secuencias conocidas de escisión de proteasas, tales como secuencias de escisión de OmpT.
Aminoácido "no natural" o "no nativo" se refiere a los aminoácidos que no son uno de los veinte aminoácidos naturales que constituyen todas las proteínas que, sin embargo, son capaces de ser modificados biológicamente para incorporarse a las proteínas. Los aminoácidos no nativos pueden incluir enantiómeros D de péptidos o cualquier modificación posterior a la traducción de uno de los veinte aminoácidos naturales. Se puede usar una amplia variedad
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de aminoácidos no nativos en los métodos de la invención. El aminoácido no nativo se puede escoger en función de las características deseadas del aminoácido no nativo, por ejemplo, la función del aminoácido no nativo, tal como la modificación de las propiedades biológicas de las proteínas tales como la toxicidad, la biodistribución o la semivida, propiedades estructurales, propiedades espectroscópicas, propiedades químicas y/o fotoquímicas, propiedades catalíticas, capacidad de reaccionar con otras moléculas (bien covalente o no covalentemente), o similares. Los aminoácidos no nativos que pueden usarse en los métodos de la invención pueden incluir, pero no se limitan a, un análogo no nativo de un aminoácido tirosina; un análogo no nativo de un aminoácido glutamina; un análogo no nativo de un aminoácido fenilalanina; un análogo no nativo de un aminoácido serina; un análogo no nativo de un aminoácido treonina; un grupo alquilo, arilo, acilo, azido, ciano, halo, hidrazina, hidrazida, hidroxilo, alquenilo, alquinilo, éter, tiol, sulfonilo, seleno, éster, tioácido, borato, boronato, fosfo, fosfono, fosfina, heterocíclico, enona, imina, aldehído, hidroxilamina, ceto, o aminoácido sustituido con amino, o cualquier combinación de los mismos; un aminoácido con un agente de reticulación fotoactivable; un aminoácido marcado en el espín; un aminoácido fluorescente; un aminoácido con un nuevo grupo funcional; un aminoácido que interactúa covalente o no covalentemente con otra molécula; un aminoácido de unión a metales; un aminoácido que contiene metal; un aminoácido radiactivo; un aminoácido fotoactivado y/o fotoisomerizable; un aminoácido que contiene biotina o análogo de biotina; un aminoácido glicosilado o modificado con carbohidratos; un aminoácido que contiene ceto; aminoácidos que comprenden polietilenglicol o poliéter; un aminoácido sustituido con un átomo pesado; un aminoácido químicamente escindible o fotoescindible; un aminoácido con una cadena lateral elongada; un aminoácido que contiene un grupo tóxico; un aminoácido sustituido con azúcar, por ejemplo, una serina sustituida con azúcar o similares; un aminoácido que contiene azúcar ligado al carbono, por ejemplo, una serina sustituida con azúcar o similares; un aminoácido que contiene azúcar ligado al carbono; un aminoácido rédox activo; un ácido que contiene alfa-hidroxi; un aminoácido que contiene ácido amino tio; un aminoácido alfa,alfa-disustituido; un beta-aminoácido; un aminoácido cíclico distinto de la pralina, etc.
"Molde de ácido nucleico" incluye un polinucleótido de ADN o ARN a partir del que se traducirá un polipéptido. Los expertos en la materia entenderán que un molde de ácido nucleico de ADN debe transcribirse primero en ARN, y que el ARN se traduce en un polipéptido. El ADN se puede transcribir en ARN in vivo o in vitro. Los métodos de transcripción in vitro de un molde de ADN son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, el molde de ADN se somete a la transcripción y a la traducción in vitro simultáneas.
La "proteína de la membrana externa T1" (OmpT1) es una serina proteasa de la membrana superficial y pertenece a la familia Omptina de bacterias gram-negativas. Se sabe que OmpT1 escinde los péptidos antimicrobianos, activa el plasminógeno humano y degrada algunas proteínas recombinantes heterólogas. OmpT1 y sus homólogos escinden sustratos sintéticos entre restos dibásicos con alta eficacia catalítica. Se ha demostrado que la escisión de secuencias que contienen restos dibásicos es importante para la inactivación de los péptidos antibióticos y las colicinas, la proteólisis de las proteínas de la membrana bacteriana en trans y la degradación de las proteínas recombinantes expresadas en E. coli. En el contexto de la presente invención, OmpT1 tiene ciertas ventajas, ya que se encuentra en la membrana externa de la célula y, por lo tanto, no está en contacto con las posibles proteínas de sustrato que se encuentran dentro de la célula bacteriana intacta.
La expresión "sistema de fosforilación oxidativa de las bacterias permanece activo" se refiere a un lisado bacteriano que presenta la fosforilación oxidativa activa durante la síntesis de proteínas. Por ejemplo, el lisado bacteriano puede generar ATP usando enzimas ATP sintasa y reducción de oxígeno. Se entenderá que otros sistemas de traducción conocidos en la técnica también pueden usar una fosforilación oxidativa activa durante la síntesis de proteínas. La activación de la fosforilación oxidativa se puede demostrar mediante la inhibición de la vía usando inhibidores específicos, tales como los inhibidores de la cadena de transporte de electrones.
"Traducción" se refiere al proceso mediante el que un molde de ARN se convierte en un polipéptido que contiene aminoácidos naturales y/o no nativos, y es bien conocido en la técnica. La traducción implica la etapa de inicio, mediante la que un ribosoma se une al molde de ARN, en general, en el codón FMet (por ejemplo, AUG), y la etapa de elongación, mediante la que el anticodón de una molécula de ARNt cargada se empareja con un codón en el molde de ARN, repitiéndose esta etapa a medida que el ribosoma se desplaza en sentido descendente por el molde de ARN. Como cada anticodón de ARNt se empareja con su codón correspondiente, el grupo amino del aminoácido cargado en cada molécula de ARNt está unido covalentemente al grupo carboxilo del aminoácido anterior a través de enlaces peptídicos. En general, la traducción también implica la etapa de terminación, mediante la que el ribosoma se encuentra con un codón de parada de la traducción, terminando así la elongación de la cadena y la liberación del polipéptido del ribosoma. Sin embargo, en los métodos descritos en el presente documento, el molde de ARN puede comprender un ORF que tenga un codón de parada ámbar UAG, que es reconocido por el anticodón CUA de un ARNt cargado con un aann. Por lo tanto, en los métodos actuales, el codón ámbar no funciona necesariamente para terminar la traducción.
"Sistema de traducción" se refiere a una mezcla de componentes que es capaz de traducir el ARNm a polipéptidos in vitro. Un sistema de traducción puede ser un extracto libre de células, un lisado celular reconstituido o una mezcla purificada de componentes que sea capaz de traducir el ARNm a polipéptidos in vitro. Por ejemplo, el extracto libre de células o el lisado celular usados en los métodos descritos en el presente documento pueden derivarse de Escherichia coli (E. coli). El sistema de traducción también puede comprender un sistema de traducción in vitro purificado y
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reconstituido. Los métodos descritos en el presente documento también pueden utilizar un sistema de traducción que presenta una fosforilación oxidativa activa durante la síntesis de proteínas. Por ejemplo, el sistema de traducción puede generar ATP usando enzimas ATP sintetasa. El sistema de traducción también puede comprender al menos un molde de ácido nucleico. El molde de ácido nucleico se puede transcribir y traducir simultáneamente a proteínas usando el sistema de traducción.
"Sistema de traducción ribosomal reconstituido" se refiere a una mezcla de componentes purificados que es capaz de traducir una molécula de ácido nucleico tal como ARNm in vitro, como se describe en Tan et al., Methods 36, 279-290 (2005), y Forster et al., patente de EE.UU. n.° 6.977.150.
Un "enlace de péptido escindible por OmpTI" es un enlace peptídico que puede ser escindido por OmpT 1.
Un “motivo expuesto en la superficie” es un dominio que está presente en el exterior de una molécula de proteína. Los motivos expuestos en la superficie, en general, son más accesible a la escisión proteolítica, por ejemplo, por una serina proteasa tal como OmpT1. Un experto en la materia entendería que un motivo expuesto en la superficie se puede definir de varias maneras. Por ejemplo, un motivo expuesto en la superficie suele carecer de estructura secundaria, tal como hélice alfa o lámina beta. Además, los motivos expuestos en la superficie no suelen compartir una cantidad significativa de homología de la secuencia de aminoácidos, incluso entre secuencias de proteínas homólogas. Sin embargo, un experto en la materia puede calcular el área de superficie relativa accesible para las regiones de una proteína de interés usando el algoritmo GetArea incorporado en el software de modelización molecular pymol (véase en Internet, en pymolwiki.org/index.php/Get_Area).
Una "motivo expuesto en la superficie que tiene un factor B de al menos 50 A2" se refiere a la movilidad de los átomos individuales en el motivo expuesto en la superficie. Los átomos de los motivos expuestos en la superficie pueden tener más movilidad que los átomos del núcleo de una proteína. En general, los factores B indican el movimiento vibratorio relativo de diferentes partes de una estructura, tal como una proteína. Los átomos con bajos factores B pertenecen a una parte de la proteína que está bien ordenada y, por lo tanto, tienen una movilidad relativamente baja. Los átomos con factores B altos, en general, pertenecen a una parte de la proteína que es relativamente flexible y, por lo tanto, tienen una movilidad relativamente alta. Cuanto mayor sea el factor B, más probable será la observación de errores de posición de un átomo individual en una estructura de proteína. Por ejemplo, un factor B de entre 40 y 60 sugiere que se pueden observar errores de posición de hasta 1,0 Angstrom. Un factor B superior a 60 sugiere que no es probable que el átomo esté dentro de 1,0 Angstrom de su posición observada. (Véase, por ejemplo, en Internet, en wiki.cmbi.ru.nl/index.php/B-factor). El factor B se calcula como:
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en la que Ui2 es la media del desplazamiento al cuadrado del átomo i. Esto produce un factor de ponderación sobre la contribución del átomo i a la transformada de Fourier de:
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A medida que aumenta U, aumenta B, y se reduce la contribución del átomo a la dispersión. Véase, por ejemplo, en Internet, en:
pldserver1.biochem.queensu.ca/~rlc/work/teaching/definitions.shtml. El factor B se mide en unidades de A2.
La expresión "diagrama de Ramachandran" se refiere a un método para la visualización de ángulos diedros de la cadena principal 9 (psi) frente a 9 (Phi) para cada resto de aminoácido de una estructura de proteína. Los métodos para calcular los ángulos Phi y Psi se describen, por ejemplo, en Lovell, S. C. et al., “Proteins: Structure, Function, and Genetics”, 50:437-450 (2003), y Chen, V. B. et al., “MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography”, Acta Crystallographica D66: 12-21 (2010). Es posible determinar los ángulos Phi y Psi en un diagrama de Ramachandran refiriéndose a las referencias anteriores o, por comodidad, se pueden usar programas de software disponibles gratuitamente en Internet. Por ejemplo, se puede cargar un archivo de coordenadas o un archivo PDB en el servidor MOLPROBITY ubicado en kinemage.biochem.duke.edu (véase Chen, V. B. et al., anteriormente citados). Como alternativa, se puede usar Ramachandran Plot Explorer disponible en Internet, en boscoh.com/ramaplot.
La expresión "área de superficie total accesible a un disolvente" (SASA) se refiere al área de superficie de una proteína o un polipéptido que es accesible a un disolvente. El área de superficie accesible al disolvente se puede describir en unidades de angstrom al cuadrado, y se puede calcular usando el algoritmo de "bola rodante" desarrollado por Shrake
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y Rupley (Shrake, A; Rupley, J. A. (1973). "Environment and exposure to solvent of protein atoms. Lysozyme and insulin". J Mol Biol 79 (2): 351-71.). El área de superficie accesible al disolvente también se puede calcular como se describe en Fraczkiewicz, R. y Braun, W., "Exact and efficient analytical calculation of the accessible surface areas and their gradients for macromolecules", J. Comp. Chem., 19:319-333 (1998). Por comodidad, se puede calcular el área de superficie total accesible a un disolvente usando programas de software disponibles gratuitamente en Internet. Por ejemplo, se puede usar el conocido software GETAREA, que se encuentra en la página Web de la sección de Medicina de la Universidad de Texas curie.utmb.edu/getarea.html, para calcular el área de superficie accesible al disolvente (energía de solvatación) de una molécula de proteína, como se describe en Fraczkiewicz, R. y Braun, W. (Id), introduciendo las coordenadas atómicas en formato PDB (base de datos de proteínas) y especificando el radio deseado de la sonda de agua (parámetros: radio de la sonda de agua = 1,4).
La expresión "región del bucle de conmutación" se refiere a un motivo expuesto en la superficie que une los dominios tres y cuatro de RF1 y forma una conexión rígida que coloca el motivo GGQ del dominio 3 en contacto con el enlace éster de peptidil-ARNt en el centro de la peptidil transferasa (PTC) de la subunidad 50S. El reconocimiento del codón de parada por el complejo de terminación estabiliza una configuración reorganizada de la región del bucle de conmutación, que dirige el dominio 3 al PTC. La reorganización del bucle de conmutación produce la reorientación y la extensión de la hélice a7, de modo que los motivos GGQ se acoplen en el PTC. Véase, Korostelev, A. et al., "Recognition of the amber UAG stop codon by release factor RF1", EMBO Journal (2010) 29, 2577-2585. La región del bucle de conmutación de RF1 corresponde a los aminoácidos 287 a 304 de SEQ ID NO: 1, y comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 287-QQAEASTRRNLLGSGDRS-304 (SEQ ID NO:4).
Una proteína "de tipo silvestre" es una proteína no modificada que tiene la secuencia de aminoácidos y/o actividad funcional de una proteína nativa o de origen natural. Por ejemplo, una proteína RF1 de tipo silvestre puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 1. Una "proteína de control" puede ser una proteína de tipo silvestre o una proteína previamente modificada.
"Aminoácido nativo" se refiere a uno o más aminoácidos naturales codificados por el código genético. Un "aminoácido nativo endógeno" se refiere a un aminoácido nativo producido por las células hospedadoras usadas para generar el lisado.
"Aminoácidos no nativos" ("aann") se refiere a estructuras químicas que tienen la fórmula NH3-(CR)-COOH, en la que R no es ninguno de los 20 sustituyentes más comunes que definen los aminoácidos naturales.
Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad", en el contexto de dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son iguales o tienen un porcentaje específico de nucleótidos o restos de aminoácidos que son iguales (por ejemplo, el 60 % de identidad, opcionalmente, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de identidad en una región especificada, cuando se compara y alinea para obtenerse una correspondencia máxima en una ventana de comparación, o región designada, según lo medido usando los algoritmos bLaST y PSI-BLAST, que se describen en Altschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990), y Altschul, et al. (Nucleic Acids Res., 25:3389-3402, 1997), respectivamente. El programa informático para realizar los análisis BLAST está disponible al público a través del National Center for Biotechnology Information (véase,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Este algoritmo implica identificar en primer lugar pares de secuencias de alta valoración (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que coincide o satisface algún valor umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se menciona como el umbral del valor de palabra adyacente (Altschul et al., supra). Estos aciertos de palabra adyacente iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largos que los contengan. Los aciertos de palabra se prolongan en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia todo el tiempo que pueda aumentarse el valor de alineación acumulativo. Los valores acumulativos se calculan usando, para secuencias nucleotídicas, los parámetros M (valor recompensa para un par de restos coincidentes; siempre > 0) y N (valor de penalización para restos no coincidentes; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de valores para calcular el valor acumulativo. La prolongación de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: el valor de alineación acumulativo queda fuera por una cantidad X de su valor conseguido máximo; el valor acumulativo llega a cero o por debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de restos de valoración negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como valor predeterminado una longitud de palabra de 3, y una expectativa (E) de 10, y las alineaciones de la matriz de puntuación BLOSUM62 (Véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915, 1989) (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas hebras.
El "porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de una ventana de comparación, en la que la parte de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las cuales se encuentra la base de ácido nucleico o el resto de aminoácido idénticos en ambas secuencias para producir el número de posiciones emparejadas, dividiendo el número
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de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
Una "ventana de comparación”, como se usa en el presente documento, incluye la referencia a un segmento de una cualquiera del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste en de 20 a 600, por lo general, de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente, de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 en el que se puede comparar una secuencia con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas una vez alineadas las dos secuencias de manera óptima. Los métodos de alineación de secuencias para la comparación son bien conocidos en la técnica.
El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-87, 1993). Una medida de la similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que sucedería una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia so la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo con el ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,2, normalmente, menor de aproximadamente 0,01 y más normalmente menor de aproximadamente 0,001.
Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia en referencia a un polipéptido, se reconoce que una o más posiciones de restos que no son idénticas pueden diferir en una sustitución conservativa de aminoácidos, en la que un primer resto de aminoácido es sustituido por otro resto de aminoácido que tiene propiedades químicas similares tales como una carga similar, o un carácter hidrófobo o hidrófilo similar, y, por lo tanto, no cambia las propiedades funcionales del polipéptido. Cuando las secuencias polipeptídicas difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Dicho ajuste se puede hacer usando métodos bien conocidos, por ejemplo, la puntuación de una sustitución conservativa como un desapareamiento parcial más que completo, aumentando, por tanto, el porcentaje de identidad de secuencia. Por lo tanto, por ejemplo, cuando se asigna a un aminoácido idéntico una puntuación de 1 y se asigna a una sustitución no conservativa una puntuación de cero, se asigna a una sustitución conservativa una puntuación entre cero y 1. La puntuación de las sustituciones conservativas se puede calcular usando el algoritmo descrito en Pearson et al. (Meth. Mol. Biol. 24:307-331, 1994). La alineación también se puede realizar mediante el examen a simple vista y la alineación manual de las secuencias.
La expresión "variante modificada de forma conservativa", cuando se usa en referencia a una secuencia polinucleotídica en particular, se refiere a diferentes secuencias polinucleotídicas que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el polinucleótido no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias prácticamente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de polinucleótidos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG codifican, todos ellos, el aminoácido arginina. Por lo tanto, en cada posición en la que se especifica una arginina mediante un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los correspondientes codones descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de nucleótidos se denominan "variaciones silenciosas", que se pueden considerar un tipo de “variaciones modificadas de forma conservativa”. Por tanto, se reconocerá que cada secuencia de polinucleótido desvelada en el presente documento como que codifica una variante de proteína también describe cada posible variación silenciosa. También se reconocerá que cada codón de un polinucleótido, excepto AUG, que es normalmente el único codón de la metionina, y UUG, que es normalmente el único codón para el triptófano, se puede modificar para producir una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas convencionales. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un polinucleótido que no cambia la secuencia del polipéptido codificado se describe implícitamente en el presente documento.
Además, se reconocerá que las sustituciones, eliminaciones o adiciones individuales que alteran, añaden o eliminan un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos (normalmente inferior al 10 %, y en general inferior al 1 %) en una secuencia codificada pueden considerarse variaciones modificadas de manera conservativa, siempre que la alteración resulte en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Las sustituciones de aminoácidos conservativas de aminoácidos que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica, incluidos los siguientes seis grupos, cada uno de los cuales contiene aminoácidos que se consideran sustitutos conservativos entre sí:
1) Alanina (Ala, A), Serina (Ser, S), T reonina (Thr, T);
2) Ácido aspártico (Asp, D), Ácido glutámico (Glu, E);
3) Asparagina (Asn, N), Glutamina (Gln, Q);
4 ) Arginina (Arg, R), Lisina (Lys, K)
5) Isoleucina (Ile, I), Leucina (Leu, L), Metionina (Met, M), Valina (Val, V); y
6) Fenilalanina (Phe, F), Tirosina (Tyr, Y), Tiptófano (trp, W).
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Dos o más secuencias de aminoácidos, o dos o más secuencias de nucleótidos se consideran "sustancialmente similares" si las secuencias de aminoácidos o las secuencias de nucleótidos comparten al menos el 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia entre sí, o con una secuencia de referencia en una ventana de comparación determinada. Dos o más proteínas también se consideran esencialmente similares si incorporan sustituciones conservativas de aminoácidos que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares a la secuencia de aminoácidos.
"Promotor" se refiere a elementos de secuencia en el molde de ácido nucleico ubicados cadena arriba o cadena abajo desde el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras participan en el reconocimiento y en la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas que inician la transcripción. Los ejemplos de promotores incluyen los promotores de bacteriófagos T7, sP6 y T3.
"La región no traducida 5'" se refiere a la secuencia de ácido nucleico situada cadena arriba o 5' del marco de lectura abierto de un molde de ácido nucleico. En el ARN, la región no traducida 5' precede al codón de inicio de la traducción presente en el molde de ácido nucleico. En el ADN, la región no traducida 5' se refiere a las secuencias de ácido nucleico que se transcriben al ARN y se ubican 5' en el codón de inicio de la traducción. En el ADN, el codón de inicio de la traducción normalmente es ATG, y en el ARN, el codón de inicio de la traducción normalmente es AUG.
La "secuencia primaria de aminoácidos" se refiere el orden de los restos de aminoácidos que están unidos entre sí por enlaces peptídicos en un polipéptido. El orden de los restos de aminoácidos, en general, se menciona comenzando en el extremo amino terminal del polipéptido y procediendo hacia el extremo carboxi terminal del polipéptido. La secuencia de aminoácidos primaria está determinada por la secuencia de nucleótidos de los codones de ARN en el molde de ácido nucleico.
"Marco de lectura abierto" se refiere a la secuencia de nucleótidos de un molde de ácido nucleico que se traduce a un polipéptido de interés. Como se usa en el presente documento, el marco de lectura abierto (ORF) puede incluir al menos un codón correspondiente a un resto de aminoácido definido que se une a un ARNt cargado con un aann. El al menos un codón puede ser un codón ámbar.
"ARNt sentido isoaceptor" se refiere a diferentes especies de ARNt que se unen a codones alternativos para el mismo aminoácido.
"ARNt" o "ARN de transferencia" se refiere a una pequeña molécula de ARN que transfiere un aminoácido específico a una cadena polipeptídica en crecimiento en el sitio ribosomal de la síntesis de proteínas durante la traducción. A causa de la degeneración del código genético, un aminoácido puede asociarse con múltiples ARNt, mientras que cada tipo de molécula de ARNt solo puede asociarse con un tipo de aminoácido.
Los términos "polipéptido" y "proteína" se usan indistintamente, y se refieren a un compuesto que contiene dos o más aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Las proteínas pueden contener una o más cadenas polipeptídicas.
La expresión "cuando la proteína no está complejada" se refiere a la estructura de una proteína en solución, o una parte, una región o un dominio de la estructura de la proteína en solución, y no a la estructura de la proteína, o parte, región o dominio de la estructura de la proteína, cuando forma parte de un complejo con otras moléculas, tales como proteínas, ligandos, sustrato enzimático o complejos inhibidores, ribosomas, anticuerpos unidos o fragmentos de anticuerpos, ARN y ADN. El término también se refiere a la estructura de un dominio de proteína, tal como los aminoácidos que comprenden un motivo expuesto en la superficie, que está en solución.
Como se usa en el presente documento, El término "aproximadamente", cuando modifica cualquier cantidad, se refiere a la variación en la esa cantidad normalmente encontrada por un experto en la materia, por ejemplo, en la síntesis de proteínas o en los experimentos de cristalografía de rayos X. Por ejemplo, el término "aproximadamente" se refiere a la variación normal encontrada en las mediciones para una técnica analítica dada, tanto dentro como entre lotes o muestras. Por lo tanto, el término aproximadamente puede incluir una variación del 1-10 % del valor medido, tal como una variación del 5 % o 10 %. Las cantidades desveladas en el presente documento incluyen equivalentes a esas cantidades, Incluyendo las cantidades modificadas o no modificadas por el término "aproximadamente".
Descripción detallada de la invención
INTRODUCCIÓN
La presente divulgación describe proteínas diana que están modificadas de forma recombinante para incluir sitios de escisión de proteasa OmpT 1 que pueden ser escindidos por OmpT 1. El sitio de escisión por OmpT 1 incluye un enlace peptídico escindible por OmpT1. En un caso, la proteína diana se modifica para incluir dos aminoácidos básicos adyacentes que se cargan positivamente a pH 7,0. En algunos casos, la proteína diana se modifica para introducir el sitio de escisión por OmpT1 en un motivo expuesto en la superficie de la proteína diana. En algunos casos, el enlace peptídico escindible por OmpT1 se sitúa en un motivo expuesto en la superficie que tiene un factor B de al menos
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50 A2 cuando la proteína o el motivo expuesto en la superficie no están complejados (es decir, libres en solución y/o no forman parte de una estructura macromolecular que comprende otras moléculas). En algunos casos, el enlace peptídico escindible por OmpT1 está ubicado en un motivo expuesto en la superficie que tiene un área de superficie accesible al disolvente total (SASA) de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2. En algunos casos, la proteína diana se modifica de manera que el enlace peptídico escindible por OmpTI se ubique en una posición de la proteína que presente un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran.
Como es entendido por un experto en la materia, lo anterior requiere información estructural para el/los dominio/s de proteína de interés. Sin embargo, los bucles de superficie suelen estar desordenados y, por lo tanto, no puede haber estructura cristalina disponible para la proteína diana de interés. Por lo tanto, en algunos casos, se puede crear un modelo de homología usando estructuras similares para predecir un SASA de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2, o un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran, en ausencia de información estructural.
Se describe una célula bacteriana que expresa tanto OmpT1 como la proteína diana modificada de forma recombinante. En algunos casos, la proteína diana modificada de forma recombinante es una proteína esencial, por ejemplo, una proteína que se requiere para el crecimiento y/o la supervivencia celular normal.
Las proteínas diana descritas en el presente documento se seleccionan debido a que tienen actividad perjudicial en un sistema de síntesis libre de células in vitro. Por ejemplo, la proteína diana puede inhibir la transcripción y/o la traducción de moldes de ácido nucleico que codifican proteínas de interés. Por lo tanto, se describen métodos para reducir la actividad perjudicial de una proteína diana esencial modificada en un sistema de síntesis libre de células in vitro mediante la inactivación de la proteína diana con una proteasa OmpT1. En algunos casos, el método comprende cultivar una bacteria positiva en OmpT1 que expresa la proteína diana esencial modificada, en el que la proteína diana se modifica para incluir un sitio de escisión por OmpT 1 que comprende un enlace peptídico escindible por OmpT 1 en un motivo expuesto en la superficie; lisar las bacterias para crear un extracto de síntesis libre de células; poner en contacto la proteína diana esencial modificada con OmpT1 en una cantidad suficiente para reducir la cantidad de proteína diana intacta en un 50 %; añadir un molde de ácido nucleico al extracto, en el que el molde codifica una proteína de interés; y dejar que el sistema de síntesis libre de células produzca la proteína de interés. El método aprovecha la separación espacial de la proteína diana modificada y la proteasa OmpT1 durante el crecimiento celular, cuando la proteína diana puede ser importante para el crecimiento celular y/o la supervivencia, mientras que la proteína diana es escindida por OmpT 1 cuando las células bacterianas se rompen y se lisan para producir un extracto libre de células.
En algunos casos del método, el enlace peptídico escindible por OmptT 1 se encuentra dentro de un motivo expuesto en la superficie que tiene un factor B de al menos 50 A2 cuando la proteína o el motivo expuesto en la superficie no está complejado. Por ejemplo, el motivo expuesto en la superficie puede tener un factor B de 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130,140, 150, 160, 170, 180, 190 o 200 A2 o superior, o puede estar en el intervalo de entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 A2, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 150 A2, entre aproximadamente 50 y aproximadamente 100 A2, entre aproximadamente 60 y aproximadamente 200 A2, entre aproximadamente 60 y aproximadamente 150 A2, o entre aproximadamente 60 y aproximadamente 100 A2. En algunos casos del método, el enlace peptídico escindible por OmptT1 está ubicado dentro de un motivo expuesto en la superficie que tiene un área superficial accesible al disolvente total de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2. Por ejemplo, en algunos casos, el área de superficie accesible al disolvente total es de aproximadamente 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120,130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220 o 225 A2 (cuando el término “aproximadamente” modifica cada uno de los valores precedentes). En un caso del método, el enlace peptídico escindible por OmptT1 se encuentra en una posición de la proteína que muestra un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un gráfico de Ramachadran. Como se ha descrito anteriormente, en ausencia de información estructural, se puede crear un modelo de homología usando estructuras similares para predecir un SASA de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2, o un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran.
Las proteínas de interés mencionadas anteriormente incluyen proteínas que se han diseñado para incorporar aminoácidos no nativos (aann) en una ubicación definida de la secuencia de aminoácidos. La introducción de aann en proteínas puede dar lugar a proteínas con propiedades preferidas. Un método para introducir aann en proteínas o polipéptidos de interés usa ARNt ortogonales aminoacilados que reconocen un codón ámbar (parada) para introducir el aann en la cadena polipeptídica naciente durante la traducción de la proteína. Sin embargo, el rendimiento de las proteínas que tienen aann introducidos en las mismas puede ser reducido por las proteínas del complejo de terminación de la traducción que facilitan la terminación de la traducción al reconocer la terminación o los codones de parada en una secuencia de ARNm. El factor de liberación 1 (RF1) forma parte del complejo de terminación, y reconoce el codón de parada UAG (ámbar). El reconocimiento de RF1 del codón ámbar puede potenciar la terminación prematura de la cadena en el sitio de incorporación del aann, lo que reduce el rendimiento de las proteínas deseadas. Los métodos descritos en el presente documento resuelven este problema al disminuir la actividad funcional de RF1 en lisados de células bacterianas. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la proteína diana esencial es RF1. La actividad funcional de RF1 disminuye al introducir sitios de escisión de la proteasa OmpT1 en RF1. OmpT1 es una enzima ubicada en la membrana celular externa de las bacterias intactas. Por lo tanto, la RF1 modificada no está
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disponible como un sustrato para OmpTI en las células intactas. Cuando la membrana bacteriana se rompe, por ejemplo, como en un lisado bacteriano, la enzima OmpT 1 es capaz de entrar en contacto y escindir la RF1 modificada en el sitio de escisión introducido, disminuyendo así la actividad funcional de RF1. Los métodos son aplicables a otros factores de liberación encontrados en el complejo de terminación de la traducción, tales como RF2, que reconoce el codón de parada UGA. Los métodos también son aplicables a proteínas que degradan el ARNm durante la traducción in vitro, tales como las enzimas RNasa. Además, los métodos son en general aplicables a cualquier proteína de un extracto bacteriano que inhiba la transcripción y/o la traducción de una proteína de interés.
MÉTODOS GENERALE'S
Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Los expertos se dirigen en particular a Green, M. R. y Sambrook, J., eds., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2012), y Ausubel, F. M., et al., “Current Protocols in Molecular Biology” (Suplemento 99), John Wiley & Sons, Nueva York (2012) para las definiciones y los términos de la técnica. También aparecen métodos convencionales en Bindereif, Schón, y Westhof (2005) “Handbook of RNA Biochemistry”, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, que describe métodos detallados para la manipulación y el análisis del ARN. Los ejemplos de técnicas moleculares apropiadas para generar ácidos nucleicos recombinantes y las instrucciones suficientes para dirigir a los expertos a través de numerosos ejercicios de clonación se encuentran en Green, M. R. y Sambrook, J., (Id.); Ausubel, F. M., et al., (Id.); Berger y Kimmel, “Guide to Molecular Cloning Techniques”, Methods in Enzymology (Volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif. 1987); y “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications” (Academic Press, San Diego, Calif. 1990).
Los métodos para la purificación de proteínas, cromatografía, electroforesis, centrifugación y cristalización se describen en Coligan et al. (2000) “Current Protocols in Protein Science”, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. Los métodos para la síntesis libre de células se describen en Spirin y Swartz (2008) “Cell-free Protein Synthesis”, Wiley-VCH, Weinheim, Alemania. Los métodos para la incorporación de aminoácidos no nativos a proteínas usando síntesis libre de células se describen en Shimizu et al (2006) FEBS Journal, 273, 4133-4140.
Los métodos de amplificación por PCR son bien conocidos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Innis et al., “PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”, Academic Press Inc. San Diego, Calif., 1990. Una reacción de amplificación normalmente incluye el ADN que se va a amplificar, una ADN polimerasa termoestable, dos cebadores oligonucleótidos, trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP), tampón de reacción y magnesio. Por lo general, un número deseable de ciclos térmicos está entre 1 y 25. Los métodos para el diseño de cebadores y la optimización de las condiciones de PCR son bien conocidos en la técnica y se pueden encontrar en textos de Biología molecular convencionales, tales como Ausubel et al., “Short Protocols in Molecular Biology”, 5a edición, Wiley, 2002 e Innis et al., “PCR Protocols”, Academic Press, 1990. Los programas informáticos son útiles en el diseño de cebadores con la especificidad requerida y las propiedades de amplificación óptimas (por ejemplo, Oligo Versión 5.0 (National Biosciences)). En algunas realizaciones, los cebadores de PCR pueden contener además sitios de reconocimiento para endonucleasas de restricción, para facilitar la inserción del fragmento de ADN amplificado en sitios de enzimas de restricción específicos en un vector. Si se añaden sitios de restricción al extremo 5' de los cebadores de PCR, es preferible incluir unas cuantas bases 5' adicionales (por ejemplo, dos o tres) para permitir una escisión más eficaz por parte de la enzima. En algunas realizaciones, los cebadores de PCR también pueden contener un sitio promotor de ARN polimerasa, tal como T7 o SP6, para permitir la posterior transcripción in vitro. Los expertos en la materia conocen bien los métodos para la transcripción in vitro (véase, por ejemplo, Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 87:1663-1667, 1990; Eberwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EEUU 89:3010-3014, 1992).
PROTEÍNAS ESCINDIBLES POR OMPT1
La presente divulgación describe proteínas diana que pueden ser escindidas e inactivadas por enzimas proteolíticas tales como OmpT1. Para ser escindidas por la proteasa, las proteínas se modifican para introducir sitios de escisión proteolítica en la proteína. En algunos casos, el sitio de escisión introducido en la proteína diana modificada es un enlace peptídico escindible por OmpT1, y el enlace escindible por OmpT1 se introduce en un motivo expuesto en la superficie de la proteína diana. El sitio de escisión reconocido por OmpT1 comprende dos restos básicos adyacentes. Por lo tanto, las proteínas diana descritas en el presente documento se modifican para comprender dos restos básicos adyacentes que se carguen positivamente a pH 7,0.
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Modificación de proteínas para introducir un sitio de escisión por OmpTI en un motivo expuesto en la superficie que tiene un factor B de al menos 50 A2
En algunos casos, la proteína diana se modifica para introducir el enlace peptídico escindible por OmpTI en un motivo expuesto en la superficie que tenga un factor B de al menos 50 A2 cuando la secuencia de aminoácidos de la proteína diana o de la región del motivo no esta complejada. La ubicación de un motivo expuesto en la superficie con un factor B de al menos 50 A2 se puede determinar de varias maneras. Los factores B se dan para cada átomo en archivos cristalográficos del banco de datos de proteínas (PDB). El factor B de un motivo expuesto en la superficie se puede calcular usando el algoritmo GetArea incorporado en el software de modelización molecular pymol (véase en Internet, en pymolwiki.org/index.php/Get_Area). Como alternativa, si no hay disponible una estructura cristalográfica de rayos X de la proteína, pero hay disponible una estructura de RMN de la proteína, se puede usar el índice de superenrollamiento aleatorio (RCI) en lugar de un factor B alto (véase Berjanskii, M. V., et al., “Application of the random coil index to studying protein flexibility”, J Biomol NMR. enero de 2008; 40(1):31-48. Epub 6 de noviembre de 2007).
Con el fin de modificar una proteína diana para introducir un sitio de escisión por OmpT1 en un motivo expuesto en la superficie que tenga un factor B de al menos 50 A2, se pueden cartografiar los factores B desde las estructuras cristalográficas de rayos X de la proteína hasta la secuencia de aminoácidos,y la secuencia modificada de forma recombinante para incluir un enlace peptídico escindible por OmptT1 en el/los sitio/s con factores B altos. A continuación, se puede analizar la proteína diana modificada de forma recombinante para determinar la degradación de la proteína en un extracto celular que contenga OmpT1. En algunos casos, el factor B es de al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100 A2. En algunos casos, el factor B está entre aproximadamente 50 y aproximadamente 200 A2, o entre aproximadamente 50 y aproximadamente 150 A2, o entre aproximadamente 50 y 120 A2. Se entiende que los intervalos descritos en el presente documento incluyen todos los valores entre los puntos finales.
Modificación de proteínas para introducir un sitio de escisión por OmpTI en un motivo expuesto en la superficie que tiene un área de superficie accesible al disolvente total de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2
En algunos casos, la proteína diana se modifica para introducir el enlace peptídico escindible por OmpT1 en un motivo expuesto en la superficie que tenga un área superficial accesible al disolvente total de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2. La ubicación de un motivo expuesto en la superficie que tiene un área de superficie accesible al disolvente total de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2 se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede usar el conocido software GETAREA para ubicar vértices expuestos a disolventes de átomos que interseccionan entre sí, como se describe en Fraczkiewicz, R. y Braun, W., "Exact and efficient analytical calculation of the accessible surface areas and their gradients for macromolecules", J. Comp. Chem., 19, 319-333 (1998). Por lo tanto, se puede calcular el área de superficie accesible al disolvente (energía de solvatación) de una molécula de proteína usando el software GETAREA, mediante la introducción de las coordenadas atómicas en formato PDB (base de datos de proteínas), especificando el radio deseado de la sonda de agua y especificando el nivel deseado de salida usando un formulario proporcionado en Internet, en el sitio web curie.utmb.edu/getarea.html de la Universidad de Texas (parámetros: radio de la sonda de agua = 1,4). Otros métodos para determinar el área de superficie accesible al disolvente total se describen en Eisenberg, D. y McLachlan, A. D. (1986) Nature, 319, 199; Markley, J. L.; et al. (1998) Pure & Appl. Chem., 70, 117; y Wesson, L. yEisenberg, D. (1992) Protein Sci., 1, 227.
Modificación de proteínas para introducir un sitio de escisión por OmpTI una posición de la proteína que muestra un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran
En algunos casos, la proteína diana se modifica para introducir el enlace peptídico escindible por OmpT1 en una posición de la proteína que presente un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran. La ubicación de la posición en una proteína que muestra un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran se puede determinar usando métodos conocidos en la técnica. Los métodos para calcular los ángulos Phi y Psi se describen, por ejemplo, en Lovell, S. C. et al., “Proteins: Structure, Function, and Genetics”, 50:437-450 (2003). Se pueden determinar los ángulos Phi y Psi en un diagrama de Ramachandran cargando un archivo de coordenadas o un archivo PDB en el servidor MOLPROBITY en Internet, en kinemage.biochem.duke.edu (véase Chen, V. B., et al., (2010) “MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography”. Acta Crystallographica D66: 12-21.). Como alternativa, se puede usar Ramachandran Plot Explorer disponible en Internet, en boscoh.com/ramaplot.
Las proteínas diana descritas en el presente documento se seleccionan debido a que pueden inhibir la producción de proteínas en un sistema de síntesis libre de células. Por lo tanto, en algunos casos, las proteínas modificadas descritas en el presente documento disminuyen la producción de proteínas de longitud completa en extractos bacterianos libres de células. Por ejemplo, las proteínas RF1 y RF2 forman parte del complejo de terminación que reconoce un codón de parada en el ARNm y termina la traducción de la cadena polipeptídica. La terminación prematura de la traducción es indeseable cuando se incorporan aminoácidos no nativos a una proteína usando sistemas de traducción libres de células como los descritos en el presente documento. La reducción del reconocimiento del codón de parada por el
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complejo de terminación puede aumentar el rendimiento de las proteínas que incorporan aann. Por lo tanto, en algunos casos, la proteína RF1 y/o RF2, o un homólogo funcional de la misma, se modifica para contener sitios de escisión por OmpT 1 en un motivo expuesto en la superficie que tenga un factor B de al menos 50 A2 cuando la proteína RF1 y/o RF2, u homólogo funcional de las mismas, está sin complejar. En algunos casos, la proteína RF1 y/o RF2, o un homólogo funcional de la misma, se modifican para contener sitios de escisión por OmpT 1 en un motivo expuesto en la superficie que tiene un área de superficie accesible al disolvente total de entre aproximadamente 25 A2 y aproximadamente 225 A2. En algunos casos, la proteína RF1 y/o RF2, o un homólogo funcional de la misma, se modifican para contener sitios de escisión por OmpT1 en una posición de la proteína que muestra un ángulo Phi de 0 ° a -180 ° o un ángulo Psi de 0 ° a +180 ° en un diagrama de Ramachadran. En algunos casos, la proteína funcional modificada es esencialmente similar a RF1 (SEQ ID NO: 1) o RF2 (SEQ ID NO: 2).
La proteína RF1 incluye la proteína RF1 de tipo silvestre prototipo (SEQ ID NO: 1) de E. coli, así como las variaciones polimórficas y las muteínas creadas de forma recombinante. Las proteínas RF1 se definen como aquellas que tienen esencialmente la misma actividad biológica o capacidad funcional que el tipo silvestre (por ejemplo, al menos el 80 % de cualquiera de ellas), tienen al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia con la proteína RF1 prototipo y/o se unen a anticuerpos policlonales generados contra la proteína prototipo SEQ ID NO: 1.
Con respecto a la unión de una proteína RF1 a anticuerpos policlonales, la proteína RF1 se unirá en condiciones de inmunoensayo designadas a los anticuerpos especificados con una especificidad al menos del doble que la del fondo, donde los anticuerpos no se unen esencialmente en una cantidad significativa a otras proteínas presentes en la muestra. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales generados contra RF1 (SEQ ID NO: 1), o isoformas o partes de la misma, se pueden seleccionar para obtener solamente aquellos anticuerpos que sean específicamente inmunorreactivos con RF1 y no con otras proteínas, excepto las variantes polimórficas de RF1. Se puede usar una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína en particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase sólida se utilizan de forma rutinaria para seleccionar anticuerpos que son específicamente inmunorreactivos con una proteína (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual” (1988) para una descripción de formatos de inmunoensayo y de las condiciones que se pueden usar para determinar la inmunorreactividad específica). Normalmente, una reacción específica o selectiva será al menos el doble de la señal o ruido de fondo y, más normalmente, de más de 10 a 100 veces superior a la de fondo.
Como se describe en los ejemplos, RF1 se modificó satisfactoriamente introduciendo sitios de escisión por OmpT1 funcionales en un motivo expuesto en la superficie. Sin embargo, la introducción de sitios putativos de escisión por OmpT 1 dibásicos en RF1 no siempre dio lugar a una proteína que pudiera ser escindida eficazmente por OmpT 1. Por ejemplo, se introdujeron sustituciones de aminoácidos simples M74R, E76K, E84K, A85R, E87R, E108R, T293R y S304K en las regiones de bucle de RF1 junto a una Arg o Lys existente, creando así sitios de escisión dibásicos. Sin embargo, estas variantes no se escindieron de manera eficaz cuando las variantes de RF1 se expresaron en extractos de células positivos en OmpT. Por lo tanto, la presente invención proporciona el resultado inesperado de que proteínas tales como RF1 pueden modificarse de manera que la proteína pueda ser escindida por una proteasa tal como OmpT1.
Como entenderán los expertos en la materia, el sitio de escisión introducido puede ser escindido por una enzima con actividad enzimática de tipo OmpT1, de manera que la actividad enzimática proceda de un homólogo funcional o fragmento de OmpT 1, o de una proteína modificada para tener actividad de tipo OmpT 1.
Escisión de proteínas no modificadas por OmpTI
Las proteínas descritas en el presente documento también pueden contener sitios de escisión de la proteasa OmpT1 endógenos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína no modificada o de tipo silvestre contiene una secuencia de aminoácidos dibásica que comprende un enlace peptídico escindible por OmpT 1 que es escindible por OmpT 1. La escisión de la proteína por OmpT 1 se puede ensayar incubando la proteína purificada con extractos bacterianos libres de células que expresan OmpT1, y comparando la cantidad de escisión con la cantidad de escisión detectada en extractos libres de células que no expresan OmpT1. En algunos casos, las proteínas no modificadas que contienen sitios de escisión por OmpT1 endógenos son necesarias o se requieren para el crecimiento o la función normal de la célula, pero inhiben la traducción de las proteínas en extractos sin células. Por lo tanto, la divulgación describe métodos para inactivar selectivamente proteínas no modificadas mediante la escisión con OmpT1, en los que el momento de inactivación puede controlarse de manera que las proteínas sean funcionales durante el crecimiento celular, pero se inactiven en extractos celulares que expresen OmpT1.
Molde
Para producir las proteínas, se necesita un molde de ácido nucleico. Los moldes se usan para producir las proteínas modificadas para comprender un sitio de escisión escindible por OmpT1. Los moldes también se usan para producir proteínas de interés que se expresan en sistemas libres de células. Los moldes para la síntesis de proteínas libres de células pueden ser ARNm o ADN. El molde puede comprender secuencias para cualquier gen particular de interés, y puede codificar un polipéptido de longitud completa o un fragmento de cualquier longitud del mismo. Los ácidos nucleicos que sirven como moldes de síntesis de proteínas se derivan opcionalmente de una fuente natural, o pueden
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ser sintéticos o recombinantes. Por ejemplo, los ADN pueden ser ADN recombinantes, por ejemplo, plásmidos, virus
0 similares.
En un caso, el molde de ADN comprende un ORF que codifica una proteína diana que comprende un sitio de escisión por OmpT 1. Por ejemplo, el ORF puede codificar una proteína diana modificada que se requiere para el crecimiento y la supervivencia celulares normales, pero cuya actividad disminuye el rendimiento de las proteínas en extractos libres de células, ya sea directa o indirectamente. Por lo tanto, el ORF puede codificar un componente proteico del complejo de terminación, tal como RF1 o RF2, o variantes modificadas de las mismas. El ORF también puede codificar una RNasa que degrade los moldes de ARN.
En otro caso, el molde de ADN comprende un ORF que codifica una proteína de interés que se ha modificado para incorporar un aminoácido no nativo. Por lo tanto, el ORF puede codificar cualquier proteína que tenga importancia biológica que lleve incorporado un aann en una posición definida de la secuencia de aminoácidos. Los ejemplos no limitantes de dichas proteínas de interés incluyen anticuerpos, hormonas, citocinas y proteínas víricas. La divulgación usa codones sentido para la incorporación de aminoácidos no nativos, y elude el requisito de componentes ortogonales como se encuentra comúnmente en la técnica. En estos casos, el ORF comprende al menos un codón sentido isoaceptor. El ORF comprende además un codón correspondiente a un resto de aminoácido definido que reconoce un ARNt cargado con un aminoácido no nativo. En algunos casos, el ORF comprende un codón ámbar (UAG) que se une a un ARNt cargado con un aminoácido no nativo. En otros casos, el molde es capaz de traducir una proteína completa y funcional independientemente de si se escogen aminoácidos no nativos para incorporarlos a la proteína de interés.
Un molde de ADN que comprende el ORF de interés se unirá operativamente a al menos un promotor y a una o más otras secuencias reguladoras incluyendo, sin limitación, represores, activadores, potenciadores de la transcripción y la traducción, proteínas de unión al ADN, etc. Se pueden producir cantidades adecuadas del molde de ADN para su uso en el presente documento amplificando el ADN en vectores de clonación y huéspedes conocidos, o mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
El molde de ADN puede comprender además el ORF de interés unido en fase a secuencias de ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos que son útiles para aislar y purificar la proteína expresada, tales como, por ejemplo, marcadores de poli-aminoácido que se unen con alta afinidad a los medios cromatográficos. El marcador de poli-aminoácido se puede ubicar en el extremo 5' o en el extremo 3' del ORF, dando lugar a un marcador amino- terminal o carboxilo-terminal en la proteína expresada, respectivamente. En un caso, el ORF se une en fase a las secuencias que codifican un marcador de poli-histidina.
Se describen usos de un lisado bacteriano. Se puede construir un molde de ADN para la expresión bacteriana uniendo operativamente un ADN codificante de la proteína deseada tanto a una secuencia promotora como a un sitio de unión
1 ribosoma bacteriano (secuencia de Shine-Delgarno). Los promotores adecuados para su uso con el molde de ADN en los métodos de traducción-transcripción libres de células descritos incluyen cualquier secuencia de ADN capaz de potenciar la transcripción in vivo en las bacterias de las que se deriva el extracto bacteriano. Se prefieren los promotores que son capaces de iniciar eficazmente la transcripción dentro de la célula hospedadora. El ADN que codifica la proteína deseada y el ADN que contiene el promotor deseado y las secuencias de Shine-Dalgarno (SD) se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como alternativa, las secuencias de ADN deseadas se pueden obtener a partir de clones existentes o, si no hay ninguno disponible, mediante la selección en genotecas de ADN y la construcción de las secuencias de ADN deseadas a partir de los clones de las genotecas.
Se pueden producir convenientemente moldes de ARN que codifiquen la proteína de interés a partir de una célula hospedadora recombinante transformada con un vector construido para expresar un ARNm con un sitio de unión al ribosoma bacteriano (secuencia SD) unido operativamente a la secuencia codificante del gen deseado, de manera que los ribosomas en la mezcla de reacción puedan unirse y traducir dicho ARNm. Por lo tanto, el vector porta cualquier promotor capaz de potenciar la transcripción del ADN en la célula hospedadora particular usada para la síntesis del molde de ARN.
Debido a que es difícil extraer el ARN no degradado de las bacterias, se prefiere el cultivo de células eucariotas superiores para la producción del molde de ARN. En principio, cualquier cultivo de células eucariotas superiores es viable, incluyendo los cultivos de células de vertebrados e invertebrados. El molde de ARN puede aislarse convenientemente en una fracción de ARN celular total extraída del cultivo de la célula hospedadora. El ARN celular total se puede aislar del cultivo de la célula hospedadora mediante cualquier método conocido en la técnica. El molde de ARN deseado puede aislarse junto con la mayoría del ARNm celular si el molde de ARN está diseñado para contener en su extremo 3' una señal de poliadenilación reconocida por la célula hospedadora eucariota. Por lo tanto, la célula hospedadora producirá el molde de ARN con una cola de poliadenilato (poli (A)). Los ARNm poliadenilados se pueden separar del grueso del ARN celular mediante cromatografía de afinidad en columnas de oligodesoxitimidilato (oligo(dT))-celulosa usando cualquier método conocido en la técnica. Si se conoce el tamaño del ARNm que codifica la proteína deseada, el preparado del ARNm puede purificarse más para moléculas de ARNm del tamaño particular mediante la electroforesis en gel de agarosa del ARN.
Expresión de proteínas modificadas que tienen sitios de escisión por OmpTI
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Una vez producido el molde de ácido nucleico, el molde se usa para expresar la proteína diana recombinante que comprende un sitio de escisión por OmpT 1 en una célula, o para sintetizar una proteína diana recombinante modificada en un sistema de traducción libre de células. Por ejemplo, el molde se puede añadir a un lisado celular en condiciones suficientes para traducir el molde en proteína. El lisado celular puede ser de células bacterianas o de células eucariotas. La proteína expresada se puede purificar luego usando métodos conocidos en la técnica, como se describe más adelante.
Purificación de proteínas para ensayar la actividad
Las proteínas que contienen sitios de escisión por OmpT1 se pueden purificar como es convencional en la técnica. Las proteínas se pueden recuperar y purificar mediante métodos que incluyen, pero sin limitación, precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción con ácido o base, cromatografía en columna, cromatografía en columna de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de hidroxilapatita, cromatografía de lectina, electroforesis en gel, etc. Por ejemplo, las proteínas que comprenden marcadores de histidina N-terminal pueden purificarse usando medios de afinidad que contienen iones metálicos tales como el níquel y el cobalto. El medio de afinidad se lava luego para eliminar la proteína no unida, y las proteínas unidas se eluyen y se recuperan. En algunos casos, las proteínas marcadas con poli-histidina se purifican usando cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC). Las proteínas modificadas también pueden purificarse usando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), u otros métodos adecuados cuando se desee una alta pureza. En el Ejemplo 1, se proporciona un método de purificación preferido.
Tras la purificación, las proteínas que contienen sitios de escisión por OmpT1 pueden poseer una configuración diferente de las configuraciones deseadas de los polipéptidos relevantes. Por lo tanto, las proteínas purificadas pueden someterse a condiciones que den lugar a la configuración de proteína preferida. Se conoce una diversidad de métodos de purificación/plegamiento de proteínas en la técnica, por ejemplo, Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: “Guide to Protein Purification” (Academic Press, Inc. N.Y. 1990); Bollag et al., “Protein Methods”, 2.a edición, (Wiley- Liss, N. Y. 1996). En general, es en ocasiones deseable desnaturalizar y reducir los polipéptidos expresados y después hacer que los polipéptidos se replieguen en su configuración preferida. Por ejemplo, guanidina, urea, DTT, DTE y/o una chaperona pueden añadirse a un producto de traducción de interés. Los métodos de reducción, desnaturalización y renaturalización de proteínas son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Debinski et al., J. Biol. Chem. 268:14065-70 (1993); Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263-70 (1992).
Confirmación de la actividad biológica funcional de proteínas modificadas que tienen sitios de escisión por OmpTI
Dependiendo del uso deseado de las proteínas modificadas descritas en el presente documento, puede ser importante para las proteínas modificadas tener actividad biológica comparable a una proteína no modificada de tipo silvestre. Por ejemplo, si la proteína que se va a modificar es importante para el crecimiento normal de las bacterias, es deseable mantener los niveles de actividad normales de la proteína hasta que las células se lisen para producir el lisado libre de células para la traducción. Por lo tanto, los métodos de la divulgación proporcionan proteínas modificadas que contienen sitios de escisión por OmpT1 que tienen una actividad biológica comparable a la proteína nativa o de tipo silvestre. Las proteínas modificadas que conservan los niveles de actividad de tipo silvestre, o niveles de actividad que son comparables a los del tipo silvestre, se denominan en el presente documento proteínas funcionales. Se puede determinar la actividad específica de una proteína al determinar el nivel de actividad en un ensayo funcional. Como alternativa, se puede determinar la actividad específica de una proteína mediante la cuantificación de la cantidad de proteína presente en un ensayo no funcional, por ejemplo, inmunotinción, ELISA, cuantificación en gel teñido con coomasie o plata, etc., y determinando la proporción de proteína biológicamente activa con respecto a la proteína total. En general, una proteína modificada es comparable a una proteína de tipo silvestre si la actividad específica definida de este modo es al menos aproximadamente el 50 % de la proteína de tipo silvestre, o al menos aproximadamente el 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente el 90 % o superior de la de la proteína de tipo silvestre. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. 1989).
La actividad funcional de proteínas modificadas se puede ensayar en una variedad de maneras. Por ejemplo, se puede comparar la velocidad de crecimiento de las bacterias que expresan la proteína modificada con la velocidad de crecimiento de las bacterias que expresan una proteína de tipo silvestre, de control o no modificada. La actividad funcional de las proteínas modificadas también se puede ensayar determinando la capacidad de la proteína modificada para terminar la traducción en un codón de parada en el molde de ARNm. La terminación de la traducción da lugar a proteínas truncadas y, por lo tanto, las actividades relativas de las proteínas modificadas pueden cuantificarse midiendo la cantidad de proteína truncada y de longitud completa, y comparando la proporción de proteína truncada con respecto a la de longitud completa con la resultante de la proteína de tipo silvestre, como se describe en los ejemplos y se muestra en la Figura 1. Una proteína modificada tiene una actividad comparable a una proteína de tipo silvestre si la proporción de proteína truncada con respecto a la de longitud completa es al menos aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, o mayor de la proporción de proteína truncada con respecto a la de longitud completa usando una proteína de tipo silvestre.
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Confirmación de que las proteínas modificadas son escindibles por OmpTI
Una vez determinado que las proteínas modificadas tienen una actividad biológica comparable a la de la proteína de tipo silvestre o no modificada, las proteínas modificadas se ensayan para determinar que son escindidas por OmpT1. Un método para ensayar que las proteínas modificadas son escindidas por OmpT1 es la adición de proteínas recombinantes que contienen sitios de escisión por OmpT1 a un extracto libre de células que contiene OmpT1 funcional. Si la proteína modificada es escindida por OmpT1, migrará a un peso molecular aparentemente más bajo que la proteína intacta durante la electroforesis en gel (por ejemplo, SDS-PAGE). La proteína modificada puede detectarse incluyendo un marcador radiactivo tal como 14C en la reacción de traducción en condiciones adecuadas para la incorporación del marcador radiactivo a la proteína modificada. La migración de la proteína marcada radiactivamente se puede visualizar, por ejemplo, en una autorradiografía del gel. La escisión de la proteína modificada por OmpT1 también se puede detectar mediante análisis de transferencia Western, por ejemplo, transfiriendo las proteínas desde el gel a un soporte sólido, poniendo en contacto el soporte con anticuerpos que se unen a la proteína intacta y escindida, y visualizando los anticuerpos unidos usando un marcador detectable.
La actividad de escisión por OmpT1 se puede determinar mediante la comparación de la cantidad o velocidad de escisión de una proteína modificada por OmpT1 con la de una proteína no modificada. Por ejemplo, la velocidad de escisión de la proteína modificada por OmpT1 puede ser superior al 50 % de la velocidad de escisión de la proteína de tipo silvestre en condiciones específicas. En algunos casos, la velocidad de escisión de una proteína modificada descrita en el presente documento es superior al 50 % de la velocidad de escisión de la proteína de tipo silvestre tras 30 minutos a 30 °C cuando las proteínas modificadas y de tipo silvestre están presentes a una concentración similar (por ejemplo, una concentración de 0,1-1,0 micromolar) en un extracto libre de células de bacterias que expresan OmpT1. En algunos casos, más del 90 % de la proteína modificada es escindida por OmpT1 tras 60 minutos a 30 °C cuando la proteína modificada está presente a una concentración de 0,1-1,0 micromolar en un extracto libre de células de bacterias que expresan OmpT1.
Se entenderá que los sitios de escisión de OmpT introducidos en las proteínas modificadas descritas en el presente documento son escindibles por cualquier proteína o polipéptido que posea actividad enzimática de tipo OmpT. Todo lo que se requiere es que la enzima de tipo OmpT1 sea capaz de escindir una proteína modificada para contener los sitios de escisión por OmpT. Por ejemplo, la actividad proteolítica de tipo OmpT puede ser proporcionada por OmpT1 de tipo silvestre o nativa, o un homólogo funcional o fragmento de la misma. La actividad de tipo OmpT también puede ser proporcionada por una proteína que sea esencialmente idéntica o esencialmente similar a OmpT1. Por ejemplo, la proteína con actividad de tipo OmpT puede tener al menos el 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad de secuencia con OmpT 1. En algunos casos, la proteína que tiene actividad de tipo OmpT es al menos un 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o 99 % idéntica a SEQ ID NO: 3. En algunos casos, la proteína que tiene actividad OmpT1 está unida específicamente por un anticuerpo policlonal que se une a OmpT 1 y sus variantes. La selección de anticuerpos policlonales que se unen a OmpT1 y a sus variantes funcionales se puede realizar como se describe en el presente documento para seleccionar anticuerpos policlonales que se unen a RF1.
Transformación de las bacterias con las proteínas escindibles por OmpT1
Una vez determinado que las proteínas diana esenciales modificadas conservan la función de tipo silvestre y son susceptibles a la escisión por OmpT1, tal como se han descrito anteriormente, los ácidos nucleicos que codifican las proteínas modificadas se transforman en bacterias. Las bacterias pueden transformarse con el ácido nucleico en condiciones adecuadas para la incorporación del ácido nucleico al genoma de las bacterias. Por ejemplo, las bacterias pueden transformarse con oligonucleótidos que tengan secuencias que codifiquen los sitios de escisión por OmpT1 descritos en el presente documento usando el reemplazo alélico mediado por oligonucleótidos, como se describe en los ejemplos. La incorporación de las mutaciones deseadas al genoma bacteriano se puede determinar, por ejemplo, mediante la selección de colonias transformadas usando la PCR del ensayo de mutación de amplificación de desapareamientos (MAMA), como se describe en los ejemplos.
Uso de proteínas escindibles por OmpT1 para aumentar el rendimiento proteico en sistemas de traducción libres de células
Las proteínas diana modificadas que tienen sitios de escisión por OmpT1 se degradan eficazmente cuando se expresan en un extracto de células bacterianas que contiene la proteasa OmpT1 activa. La selección cuidadosa de proteínas inhibidoras que se modifican para ser escindibles por OmpT1 puede mejorar la productividad de los sistemas de síntesis libres de células. Por ejemplo, Por ejemplo, en un uso preferido, la escisión de proteínas diana seleccionadas por OmpT1 puede mejorar la eficacia de traducción de proteínas de longitud completa que tienen incorporados aminoácidos no nativos en extractos libres de células. En ciertos casos, el aminoácido no nativo se incorpora en un codón ámbar introducido en el molde de ARNm. Como se ha descrito anteriormente, la incorporación de aminoácidos no nativos en un codón ámbar puede ser inhibida por proteínas complejas de terminación tales como RF1 y RF2. Por lo tanto, en una realización particularmente deseable, la escisión e inactivación de RF1 y/o RF2 por OmpT1 puede aumentar el rendimiento de las proteínas diseñadas para incorporar un aminoácido no nativo en un codón ámbar.
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Aminoácidos no nativos
Como se ha descrito anteriormente, Por ejemplo, en un uso preferido, la degradación de la proteína diana modificada por OmpT1 aumenta el rendimiento de proteínas que incorporan aminoácidos no nativos en los sistemas de síntesis libres de células. Los aminoácidos no nativos usados normalmente comprenden uno o más derivados o análogos de aminoácidos modificados químicamente, en los que las estructuras químicas tienen la fórmula NH3-(CR)-COOH, en la que R no es ninguno de los 20 sustituyentes canónicos que definen los aminoácidos naturales. Los derivados de aminoácidos no nativos adecuados están disponibles en el mercado de proveedores tales como, por ejemplo, Bachem Inc., (Torrance, CA); Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA); Senn Chemicals (Dielsdorf, Suiza); Sigma-Aldrich (St. Louis, MO); Synthetec, Inc (Albany, OR). Preferentemente, los aminoácidos no nativos incluyen, pero sin limitación, derivados y/o análogos de glicina, tirosina, glutamina, fenilalanina, serina, treonina, prolina, triptófano, leucina, metionina, lisina, alanina, arginina, asparagina, valina, isoleucina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, histidina, así como beta-aminoácidos y homólogos, aminoácidos protegidos con BOC y aminoácidos protegidos con FMOC.
La generación de derivados de aminoácidos no nativos, análogos y miméticos que ya no están disponibles en el mercado se puede lograr de varias maneras. Por ejemplo, una forma es sintetizar un aminoácido no nativo de interés usando métodos de Química orgánica conocidos en la técnica, mientras que otra forma es usar métodos de síntesis quimioenzimática conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kamphuis et al., Ann. N. Y. Acad. Sci., 672:510-527, 1992; Ager D. J. y Fotheringham I. G., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 4:800-807, 2001; y Weiner et al., Chem. Soc. Rev, 39:1656-1691,2010; “Asymmetric Syntheses of Unnatural Amino Acids and Hydroxyethylene Peptide Isosteres”, Wieslaw M. Kazmierski, ed., Peptidomimetics Protocols, Vol. 23, 1998; “Unnatural Amino Acids”, Kumar G. Gadamasetti y Tamim Braish, ed., Process Chemistry in the Pharmaceutical Industry, Vol. 2, 2008.
Un experto en la materia reconocerá que hay muchos procedimientos y protocolos disponibles para la síntesis de aminoácidos no nativos, por ejemplo, según lo descrito en Wieslaw M. Kazmierski, ed., Peptidomimetics Protocols, Vol. 23, 1998; Wang L et al., “Chemistry and Biology”, 16:323-336, 2009; y Wang F., Robbins S., Guo J., Shen W. y Schultz P. G., PLoS One, 5:e9354, 2010.
Los aminoácidos no nativos pueden incluir aminoácidos L- y D-alfa no nativos. Los aminoácidos L-alfa pueden sintetizarse químicamente mediante métodos conocidos en la técnica, tales como, pero sin limitación, el acoplamiento reductor mediado por hidrógeno a través de la formación de enlaces C-C catalizada por rodio de conjugaciones hidrogenadas de alquinos con iminoacetatos de etilo (Kong et al., J Am. Chem. Soc., 127:11269-11276, 2005). Como alternativa, se puede utilizar la producción semisintética por ingeniería metabólica. Por ejemplo, se pueden usar procedimientos de fermentación para sintetizar aminoácidos no nativos de E. coli que albergan una vía biosintética de cisteína rediseñada. (Véase, Maier T. H., Nature, 21:422-427, 2003). Se pueden producir mezclas racémicas de alfa- aminoácidos usando síntesis asimétrica de Strecker (como se describe en Zuend et al., Nature, 461; 968-970 (2009)) o usando enzimas transaminasas para la síntesis a gran escala (tal como se encuentra en Taylor et al., Trends Biotechnol., 16:412-419, 1998. Los alfa-aminoácidos terciarios bicíclicos pueden producirse mediante la alquilación de bases de Schiff derivadas de glicina o nitroacetatos con electrófilos de éter cíclico, seguida de la apertura dl anillo inducida por ácido y la ciclación en NH4OH (véase Strachan et al., J. Org. Chem., 71:9909-9911 (2006)).
Los aminoácidos no nativos pueden comprender además beta-aminoácidos, que son notablemente estables al metabolismo, presentan una degradación microbiana lenta, y son inherentemente estables a las proteasas y peptidasas. Un ejemplo de la síntesis de los beta-aminoácidos se describe en Tan C. Y. K. y Weaver D. F., Tetrahedron, 58:7449-7461,2002.
En algunos casos, los aminoácidos no nativos comprenden aminoácidos modificados químicamente comúnmente usados en la síntesis de péptidos en fase sólida, incluyendo, pero sin limitación, aminoácidos protegidos con terc- butoxicarbonil-(Boc) o (9H-fluoren-9-ilmetox)carbonil (Fmoc). Por ejemplo, los derivados de Boc de leucina, metionina, treonina, triptófano y prolina pueden producirse por oxidación selectiva de la cadena lateral del 3,3-dimetildioxirano, como se describe en Saladino et al., J. Org. Chem., 64:8468-8474, 1999. Los derivados de Fmoc de alfa-aminoácidos se pueden sintetizar mediante la alquilación de nitroacetato de etilo y la transformación en derivados (véase Fu et al., J. Org Chem., 66:7118-7124, 2001).
Los aminoácidos no nativos que pueden usarse pueden incluir, pero no se limitan a, análogos no nativos o derivados de los 20 sustituyentes de aminoácidos canónicos. Un experto en la materia apreciará que la síntesis de diversos aminoácidos no nativos puede implicar una serie de métodos químicos y quimioenzimáticos conocidos en la técnica. Los aminoácidos no nativos pueden sintetizarse de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica específicos para un derivado en particular de cada aminoácido no nativo. Sycheva et al., Microbiology, 76: 712-718, 2007 describe un procedimiento para sintetizar los aminoácidos no nativos norvalina y norleucina. Los derivados de prolina dializados pueden producirse mediante síntesis estereoselectiva práctica (véase Belvisi et al., Tetrahedron, 57:6463-6473, 2001). Por ejemplo, los derivados de triptófano se pueden sintetizar mediante la sustitución electrófila de indo catalizada con triflato de iterbio como se describe en Janczuk et al., Tetrahedron Lett., 43: 4271-4274, 2002, y la síntesis de derivados de 5-aril-triptófano se detalla en Wang et al., Tetrahedron, 58:3101-3110, 2002. Los análogos de serina no nativos se pueden producir mediante la fragmentación beta de los radicales alcoxilo primarios (véase Boto et al., J. Org. Chem.,
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72:7260-7269, 2007). Como alternativa, se describe un procedimiento para la síntesis de fenilserina en Koskinen et al., Tetrahedron Lett., 36:5619-5622, 1995. El procedimiento para la síntesis de L-fenilglicina se describe en Cho et al., Biotechnol. Bioprocess. Eng., 11;299-305, 2006. Y se describe un método quimioenzimático para sintetizar D-4- hidroxifenilglicina en Yu et al., Folia Microbiol (Praha), 54:509-15; 2009. Un ejemplo no limitante de la producción de 2-naftilalanina o 2-naftilalanina protegida con Boc se detalla en Boaz et al., Org. Process Res. Dev., 9:472-478; 2005. La síntesis de yodo-L-tirosina y p-benzoil-L-fenilalanina se describe en Hino N., Nat. Protoc., 1:2957-2962, 2007.
ARNt cargado
Para incorporar los aminoácidos no nativos descritos en el presente documento al polipéptido deseado, el aann descrito anteriormente necesita cargarse a ARNt de codones ámbar o sentido isoaceptores. La reacción de carga del ARNt, como se usa en el presente documento, se refiere a la reacción de aminoacilación del ARNt in vitro, en la que se aminoacilan los ARNt de codones sentido isoaceptores o codones ámbar deseados con sus respectivos aminoácidos de interés. La reacción de carga del ARNt comprende la mezcla de reacción de carga, un ARNt sentido isoaceptor, y como se usa en la presente invención, puede incluir aminoácidos naturales o no nativos. La reacción de carga del ARNt puede ocurrir in situ en la misma reacción que la reacción de traducción libre de células, o puede ocurrir en una reacción separada, en la que el ARNt cargado se añade luego a la reacción de traducción libre de células.
Las moléculas de ARNt para su uso en la reacción de carga de ARNt pueden sintetizarse a partir de un molde de ADN sintético para cualquier ARNt de elección tras la amplificación por PCR en presencia de los cebadores 5' y 3' apropiados. El molde de ADN bicatenario resultante, que contiene una secuencia de promotor T7, puede transcribirse luego in vitro usando la ARN polimerasa de T7 para producir la molécula de ARNt, que posteriormente se añade a la reacción de carga del ARNt.
La reacción de carga del ARNt puede ser cualquier reacción que aminoacile una molécula de ARNt de codón sentido o ámbar con un aminoácido deseado separado de la reacción de síntesis de proteínas. Esta reacción puede tener lugar en un extracto, una mezcla de reacción artificial o una combinación de ambos. Las condiciones de reacción de aminoacilación del ARNt adecuadas son bien conocidas por los expertos en la materia. Por lo general, la aminoacilación del ARNt se lleva a cabo en un tampón fisiológico con un valor de pH que varía de 6,5 a 8,5, fosfato de alta energía 0,5-10 mM (tal como ATP), MgCb 5-200 mM, KCl 20-200 mM. Preferentemente, la reacción se realiza en presencia de un agente reductor (tal como ditiotreitol 0-10 mM). Cuando la aminoacil-ARNt sintetasa se añade exógenamente, la concentración de la sintetasa normalmente es de 1-100 nM. Un experto en la materia reconocerá fácilmente que estas condiciones se pueden variar para optimizar la aminoacilación del ARNt, tal como una alta especificidad para los aminoácidos preseleccionados, altos rendimientos y menor reactividad cruzada.
En otros casos, los ARNt isoaceptores o ámbar son cargados por aminoacil-ARNt sintetasas. Las reacciones de carga del ARNt pueden utilizar la aminoacil-ARNt sintetasa nativa específica para los ARNt sentido isoaceptores que se vayan a cargar, una aminoacil-ARNt sintetasa modificada por ingeniería genética o una aminoacil ARNt sintetasa "promiscua" capaz de cargar una molécula de ARNt con más de un tipo de aminoácidos. Las propias aminoacil-ARNt sintetasas promiscuas pueden ser modificadas por ingeniería genética, o pueden incluir aminoacil-ARNt sintetasas producidas de manera endógena que a veces se encuentran en la naturaleza. En el documento WO2010/081110, se describen métodos para cargar los ARNt isoaceptores con aminoácidos nativos y no nativos usando aminoacil-ARNt sintetasas.
Sistemas de traducción
Los ARNt sentido isoaceptores o ámbar cargados descritos anteriormente se combinan ahora con un sistema de traducción que puede comprender un extracto libre de células, un lisado de células o un sistema de traducción reconstituido, junto con el molde de ácido nucleico para la síntesis del polipéptido o la proteína que se desee que tenga aminoácidos no nativos en posiciones preseleccionadas (definidas). La mezcla de reacción comprenderá además monómeros para la macromolécula que se vaya a sintetizar, por ejemplo, aminoácidos, nucleótidos, etc., y dichos cofactores, enzimas y otros reactivos que son necesarios para la síntesis, por ejemplo, ribosomas, ARNt, polimerasas, factores de transcripción, etc. Además de los componentes anteriores, tales como un extracto libre de células, un molde de ácido nucleico y aminoácidos, se pueden añadir a la reacción materiales específicamente requeridos para la síntesis de proteínas. Los materiales incluyen sales, ácido folínico, AMP cíclico, inhibidores de enzimas degradantes de proteínas o de ácido nucleico, inhibidores o reguladores de la síntesis de proteínas, ajustadores de los potenciales de oxidación/reducción, tensioactivos no desnaturalizantes, componentes tampón, espermina, espermidina, putrescina, etc. En la técnica, se conocen diversos sistemas de reacción de síntesis libres de células. Véase, por ejemplo, Kim, D M. y Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng. 66:180-8 (1999); Kim, D. M. y Swartz, J. R. Biotechnol. Prog. 16:385-90 (2000); Kim, D. M. y Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng. 74:309-16 (2001); Swartz et al, Methods MoL Biol. 267:169-82 (2004); Kim, D. M. y Swartz, J. R. Biotechnol. Bioeng. 85:122-29 (2004); Jewett, M. C. y Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 86:19-26 (2004); Yin, G. y Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 86:188-95 (2004); Jewett, M. C. y Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 87:465-72 (2004); Voloshin, A.M. y Swartz, J. R., Biotechnol. Bioeng. 91:516-21 (2005). Las condiciones adicionales para la síntesis libre de células de los polipéptidos deseados se describen en el documento WO2010/081110.
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En algunos casos, se usa un molde de ADN para conducir la síntesis de proteínas in vitro, y se añade la ARN polimerasa a la mezcla de reacción para potenciar la transcripción del molde de ADN. Las ARN polimerasas adecuadas para su uso en el presente documento incluyen cualquier aRn polimerasa que funcione en las bacterias de las que se derive el extracto bacteriano. En otros casos, se usa un molde de ARN para dirigir la síntesis de proteínas in vitro, y los componentes de la mezcla de reacción se pueden mezclar entre sí en cualquier orden conveniente, pero preferentemente se mezclan en un orden en el que se añade el molde de ARN en último lugar, reduciendo así al mínimo la posible degradación del molde de ARN por parte de las nucleasas.
Sistemas de traducción libres de células
La síntesis de proteínas libres de células pueden aprovechar el poder catalítico de la maquinaria celular. La obtención de rendimientos máximos de proteínas in vitro requiere un suministro adecuado de sustratos, por ejemplo, trifosfatos de nucleósidos y aminoácidos, un entorno homeostático, la estabilidad del catalizador y la eliminación o evitación de subproductos inhibidores. La optimización de las reacciones sintéticas in vitro se beneficia de la recreación del estado in vivo de un organismo en rápido crecimiento. En algunos casos, la síntesis libre de células se realiza en una reacción en la que se activa la fosforilación oxidativa, es decir, el sistema CYTOMIM™. El sistema CYTOMIM™ se define usando una condición de reacción en ausencia de polietilenglicol con una concentración de magnesio optimizada. El sistema CYTOMIM™ no acumula fosfato, que se sabe que inhibe la síntesis de proteínas, mientras que las fuentes de energía secundarias convencionales producen una acumulación de fosfato. Otras diversas características del sistema CYTOMIM™ se describen en la patente de EE.UU. n.° 7.338.789.
La presencia de una vía de la fosforilación oxidativa activa se puede demostrar por la falta de necesidad de fuentes de energía secundarias, tales como fosfoenolpiruvato, fosfato de creatina, fosfato de acetilo o productos intermedios glicolíticos tales como glucosa, glucosa-6-fosfato y piruvato. La presencia de una vía de fosforilación oxidativa activa también se puede determinar por la sensibilidad de la vía hacia inhibidores, tales como los inhibidores de la cadena de transporte de electrones. Los ejemplos de inhibidores de la cadena de transporte de electrones incluyen 2-heptil- 4-hidroxiquinolina-N-óxido (HQNO), 2,4-dinitrofenol, cianuro, azida, tenoiltrifluoroacetona y carbonil-cianuro-m- clorofenilhidrazona. Como alternativa, en una realización, el sistema de traducción libre de células no comprende una vía de fosforilación oxidativa activa.
La síntesis de proteínas in vitro o libre de células ofrece varias ventajas frente a los métodos convencionales de expresión de proteínas in vivo. Los sistemas libres de células pueden dirigir la mayoría, si no todos, los recursos metabólicos de la célula hacia la producción exclusiva de una proteína. Por otra parte, la falta de componentes de la pared y de la membrana celulares in vitro es ventajosa, ya que permite el control del entorno de la síntesis. Por ejemplo, los niveles de ARNt pueden cambiarse para reflejar el uso del codón de los genes que se expresan. El potencial rédox, el pH o la fuerza iónica también se pueden modificar con mayor flexibilidad que con la síntesis de proteínas in vivo debido a que no existen problemas de crecimiento ni viabilidad celular. Además, puede lograrse fácilmente la recuperación directa de productos de proteínas purificadas y correctamente plegadas.
La productividad de los sistemas libres de células ha mejorado en 2 órdenes de magnitud en los últimos años, de aproximadamente 5 pg/ml-h a aproximadamente 500 pg/ml-h. Dichas mejoras han hecho de la síntesis de proteínas in vitro una técnica práctica para la investigación a escala de laboratorio y que proporciona una tecnología de plataforma para la expresión de proteínas de alto rendimiento. Indica además la viabilidad de usar tecnologías libres de células como un medio alternativo a la producción comercial de proteínas farmacéuticas a gran escala in vivo.
Generación de un lisado
Se usa y se describe un lisado celular para la traducción in vitro de una proteína diana. Por comodidad, el organismo usado como fuente del lisado puede denominarse organismo de origen o célula hospedadora. Las células hospedadoras pueden ser bacterias, levaduras, células de mamíferos o plantas, o cualquier otro tipo de célula capaz de sintetizar proteínas. Un lisado comprende componentes que son capaces de traducir ácido ribonucleico mensajero (ARNm) que codifica una proteína deseada, y opcionalmente, comprende componentes que son capaces de transcribir ADN que codifica una proteína deseada. Dichos componentes incluyen, por ejemplo, ARN polimerasa dirigida por ADN (ARN polimerasa), cualquier activador de la transcripción que sea necesario para el inicio de la transcripción del ADN que codifica la proteína deseada, ácidos ribonucleicos de transferencia (ARNt), aminoacil-ARNt sintetasas, ribosomas 70S, N10-formiltetrahidrofolato, formilmetionina-ARNtfMet sintetasa, peptidil transferasa, factores de inicio tales como IF-1, IF-2 e IF-3, factores de elongación tales como EF-Tu, EF-Ts y EF-G, factores de liberación tales como RF-1, RF- 2 e RF-3, y similares.
Se describe el uso de una célula bacteriana de la que se deriva un lisado. En los métodos descritos, se puede usar un lisado bacteriano derivado de cualquier cepa de bacterias. El lisado bacteriano se puede obtener de la siguiente manera. Las bacterias de elección crecen durante la noche en cualquiera de una serie de medios de crecimiento y en condiciones de crecimiento que son bien conocidas en la técnica y que un profesional puede optimizar fácilmente para el crecimiento de las bacterias particulares. Por ejemplo, un entorno natural para la síntesis utiliza lisados celulares derivados de células bacterianas cultivadas en un medio que contiene glucosa y fosfato, en el que la glucosa está
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presente a una concentración de al menos aproximadamente el 0,25 % (peso/volumen), más normalmente de al menos aproximadamente el 1 %; y habitualmente no más de aproximadamente el 4 %, más normalmente no más de aproximadamente el 2 %. Un ejemplo de dichos medios es el medio 2YTPG, sin embargo, un experto en la materia apreciará que muchos medios de cultivo pueden adaptarse para este fin, ya que existen muchos medios publicados adecuados para el crecimiento de bacterias tales como E. coli, usando tanto fuentes definidas como indefinidas de nutrientes. Las células que se han recogido durante la noche pueden lisarse suspendiendo el sedimento celular en un tampón de suspensión celular adecuado, y rompiendo las células suspendidas por ultrasonidos, rompiendo las células suspendidas en una prensa francesa, mediante homogenización de flujo continuo de alta presión o cualquier otro método conocido en la técnica es útil para una lisis celular eficaz. El lisado celular se centrifuga o se filtra para retirar los fragmentos de ADN grandes.
Ejemplos
Ejemplo 1
El presente ejemplo describe la modificación de la proteína RF1 para introducir secuencias de aminoácidos que son escindibles por la proteasa OmpT1.
Métodos:
Construcción de un molde para introducir sitios de escisión por OMPT1 en RF1
Se usó una estrategia basada en PCR para introducir los cambios de la secuencia de nucleótidos deseada en moldes de ácido nucleico codificantes de las proteínas RF1 modificadas descritas en el presente documento. La reacción de PCR se llevó a cabo usando la mezcla maestra Hot Start Flex 2X (NEB) de Phusion de acuerdo con los protocolos sugeridos por el fabricante. En general, se llevó a cabo una PCR solapante de dos etapas para introducir mutaciones de escisión por OmpT en el gen codificante de RF1, como se describe con mayor detalle a continuación. Las moldes de ADN generados por PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN) para la aplicación en la expresión libre de células. Tras la purificación por pCr, se secuenciaron las variantes mediante Mclab (South San Francisco, CA) para confirmar la presencia de las mutaciones esperadas.
Preparación de la proteína GamS para prevenir la degradación de los moldes de ADN en reacciones sin células
La eficacia de la transcripción a partir de un molde de ADN puede disminuir debido a la degradación del molde por exonucleasas bacterianas endógenas presentes en los extractos libres de células. Se sabe que la forma corta de la proteína Gam del fago A (GamS) protege los moldes de ADN de la degradación al inhibir la actividad de RecBCD (Exonucleasa V) (véase Sitararman, K., Esposito, D., Klarmann, G., Grice, S. F. L., Hartley, J. L. y Chatterjee, D. K. 2004, “A Novel Cell-free Protein Synthesis System”. J Biotechnol. 110: 257-263. Por lo tanto, en este ejemplo, se usó la proteína GamS para estabilizar los moldes de PCR durante las reacciones de transcripción libres de células. Para producir la proteína GamS recombinante, se amplificó el gen GamS para incluir un marcador de poli-histidina C- terminal, GGSHHHHHH (SEQ ID NO:50), mediante cebadores, 5'-
AT AT AT CAT AT GAACGCTT ATT ACATT CAGGATCGT CTT GAG-3' (SEQ ID NO:51) y 5'-
ATATATGTCGACTTAATGATGATGATGATGATGAGAACCCCCTACCTCTGAATCA ATATCAACCTGGTGGTG-3' (SEQ ID NO:52) usando pKD46 (Datsenko, K. A. y Wanner, B. 2000, “One-step Inactivation of Chromosomal Genes in Escherichia coli K-12 Using PCR Products”. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 97: 6640-6645) como molde. Se subclonó el gen GamS en el plásmido de expresión libre de células pYD317 en los sitios de restricción NdeI/SalI. Se expresó GamS in vitro y se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) con una pureza superior al 90 % (datos no mostrados). La proteína GamS se almacenó a -70 °C antes de la aplicación en un tampón de Tris-acetato 100 mM (pH 8,2), que también contenía acetato de potasio 160 mM, cloruro de sodio 200 mM y sacarosa al 10 %.
Cepas y plásmidos bacterianos
SBJY001 es un derivado de K12 de E.coli optimizado para la producción abierta de proteínas libres de células. Se transformó SBJY001 con el plásmido pKD46 (Coli Genetic Stock Center) que contenía genes de Red recombinasa del fago A bajo un promotor de arabinosa inducible.
Construcción de SBHS002
SBHS002 es una cepa de E. coli con eliminación de ompT creada usando la transducción de P1. El lisado P1 se creó a partir de JW0554-1 (CGSC n.° 8680), una cepa de la colección Keio que contiene la mutación ompT::KanR flanqueada por sitios FRT. Luego se usó el lisado JW0554-1 P1 para introducir la mutación en SBJY001 mediante la transducción de P1. Se cultivaron colonias en LB con 30 pg/ml de kanamicina para seleccionar la resistencia a la kanamicina. SBJY001ompT::KanR se transformó con plásmido de expresión 708-FLPe CmR (Gene Bridges). Se indujo la síntesis de FLP y se examinaron las colonias para determinar la pérdida de resistencia a la kanamicina. Las colonias resistentes a la kanamicina se secuenciaron para confirmar la eliminación de ompT. La cepa con eliminación de ompT
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se conoce como SBHS002.
Clonación y expresión de RF1 marcada con His N-terminal
Se amplificó RF1 a partir de ADN genómico de la cepa A19 de E. coli usando los cebadores 5His-RF1: CATATGCATCACCATCACCATCACGGTGGTGGCTCTAAGCCTTCTATCGTTGCCA AACTGGAAGCC (SEQ ID NO: 138) y 3RF1: GTCGACTTATTCCTGCTCGGACAACGCCGCCAG (SEQ ID NO: 139) que introdujeron un marcador de His N-terminal y los sitios de restricción NdeI/SalI. Se ligó la inserción en el vector de expresión pYD317 y se confirmó mediante secuenciación. RF1 se expresó en una reacción libre de células de 25 ml usando el plásmido, se purificó mediante IMAC, y el tampón se intercambió a PBS.
Escisión de variantes de RF1 recombinantes usando extractos sin células
Para ensayar si las proteínas RF1 modificadas descritas en el presente documento eran escindibles por OmpT, se incubaron variantes de RF1 recombinantes con extractos celulares con o sin OmpT. Se cultivaron células SBJY001, que tenían una proteasa ompT intacta en la membrana externa, y SBHS002, de la que se eliminó ompT, en 5 ml de LB durante una noche a 37 °C. Se centrifugaron 50 pl de cada cultivo a 8.000 rpm durante 2 minutos y se lavaron dos veces con Tris 10 mM, cloruro de amonio 20 mM y cloruro de magnesio 10 mM. A continuación, se volvieron a suspender los sedimentos celulares en 50 ul del tampón, y se añadieron 10 pg de proteína RF1 de E. coli recombinante purificada. Se incubaron las muestras a 37 °C. Se centrifugaron las muestras a 8.000 rpm durante 2 minutos. Se retiró el sobrenadante que contenía la proteína RF1, y se procesó en un gel SDS-PAGE.
Expresión libre de células de las variantes de RF1
Las reacciones de transcripción/traducción libres de células se llevaron a cabo en un volumen de 60 pl a 30 °C en placas de 24 pocillos profundos (n.° de cat. 95040470, Thermo Scientific) durante 4,5 horas. La concentración del molde de PCR para la expresión de la variante de RF1 era de 10 pg/ml. La composición de la reacción también incluía glutamato de magnesio 8 mM, glutamato de potasio 130 mM, piruvato sódico 35 mM, AMP 1,2 mM, 0,86 mM de cada uno de GMP, UMP y CMP, oxalato de sodio 4 mM, putrescina 1 mM, espermidina 1,5 mM, fosfato de potasio 15 mM, tirosina 1 mM, 2 mM de cada uno de los otros 19 aminoácidos, ARN polimerasa T7 100 nM, extracto de células S30 al 30 % (v/v). Para facilitar la formación de disulfuro, se trató el extracto de células S30 con IAM 50 pM a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la reacción sin células. También se añadió una mezcla de glutatión oxidado (GSSG) 2 mM y glutatión reducido (GSH) 1 mM con disulfuro isomerasa DsbC de E. coli 4,3 pM. Para analizar las variantes de RF1 expresadas libres de células con SDS-PAGE y autorradiograma, se realizaron reacciones en presencia de cantidades traza de [14C]-leucina (300 pCi/mol; GE Life Sciences, NJ). Las variantes de RF1 se expresaron bien en un extracto celular OmpT positivo (OmpT +), que se preparó a partir de la cepa bacteriana SBJY001, o un extracto celular OmpT negativo (OmpT-), que se preparó a partir de la cepa bacteriana SBHS002 (SBJY001 AompT).). Para estabilizar los moldes de PCR en la reacción libre de células, también se añadió proteína GamS 1,4 pM para inhibir la actividad de RecBCD.
SDS-PAGE y autorradiografía
Para determinar si las proteínas RF1 modificadas eran escindibles por OmpT, se analizaron las proteínas RF1 traducidas en las reacciones libres de células descritas anteriormente mediante SDS-PAGE y autorradiografía. Las muestras de reacción libres de células marcadas con 14C se centrifugaron a la velocidad máxima en una centrífuga de sobremesa y se mezclaron 4 pl de sobrenadante con tampón de carga de muestras SDS-PAGE de Invitrogen y agua. Las muestras se cargaron en geles SDS-PAGE de Bis-Tris al 4~12 % y se procesaron con tampón de ejecución MES durante aproximadamente 45 minutos. Después, los geles se secaron y se expusieron a un tamiz de fósforo (63-003486, GE healthcare, EE. UU.) durante una noche, y luego se escanearon usando Storm 460 (GE healthcare, EE. UU.).
Introducción de los sitios de escisión por OmpT en RF1
Para identificar los posibles sitios de escisión por OmpT en la secuencia RF1, se introdujeron mutaciones únicas de Arg o Lys en diferentes regiones del bucle de RF1 junto a una Arg o Lys existente. Las regiones de bucle se predijeron en función de la alineación de secuencias de los factores de liberación de clase I procariotas (véase Graille M., Heurgue-Hamard, V., Champ, S., Mora, L., Scrima, N., Ulryck, N., Tilbeurgh, H. y Buckingham, R. H. 2005, “Molecular Basis for Bacterial Class I Release Factor Methylation by PrmC”. Molecular Cell. 20: 917-927.) Para generar las variantes deseadas, se diseñaron las secuencias de mutación en mitad de los cebadores oligo directos e inversos (Tabla 1). En la PCR de la primera etapa, el fragmento 5' se amplificó mediante PCR usando 5chiT2PT7, 5'- GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGAC AGG-3' (SEQ ID NO:53) y los cebadores inversos (Tabla 1). El fragmento 5' incluía el promotor T7, la región constante de la secuencia N-terminal y el sitio de mutación. El fragmento 3' también se amplificó en la primera etapa usando cebadores directos (Tabla 1) y 3chiT2TT7, 5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGGCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAA ACGGC-3' (SEQ ID NO:54). El fragmento 3' incluía el sitio de mutación, la región C-terminal constante y las secuencias del terminador T7. En la PCR de la segunda etapa, se ensamblaron los ADN del fragmento 5' y del fragmento 3' mediante una PCR solapada usando un cebador único 5chiT2,5'-GCGTACTAGCGTACCACGTGGCTGGTGG-3' (SEQ ID
NO:55).
En primer lugar, se introdujeron 9 mutaciones individuales, M74R, E76R, E84R, A85R, E87R, E108R, T293R, N296K y S304R, en las regiones de bucle junto a una Arg o Lys existente (Tabla 2). Estas variantes de RF1 y RF1 WT se 5 expresaron usando moldes de PCR en extractos libres de células con o sin OmpT. Las proteínas RF1 se analizaron mediante SDS-PAGE y autorradiografía. Cuando se expresaron en un extracto de células OmpT negativo, las 10 variantes de RF1 mostraron una proteína entera de longitud completa en SDS-PAGE. Sin embargo, cuando se expresaron en extractos celulares que contenían OmpT, la variante N296R se digirió parcialmente, mientras que las otras variantes migraron como se esperaba para las proteínas no digeridas de longitud completa. N296 se encuentra 10 en la región de bucle de conmutación de RF1, que es flexible y de fácil acceso mediante la digestión con proteasas.
En la primera serie de selección, se seleccionó N296K para la digestión parcial por OmpT en el extracto celular. En la segunda serie de selección, se generaron moldes de PCR de variantes mutantes dobles y mutantes triples usando el mismo método descrito anteriormente con los cebadores enumerados en la Tabla 1. Seis mutantes dobles, 15 N296K/l297V, N296K/l297K, N296K/l297R, N296R/l297V, N296R/l297K, N296R/l297R, y 2 mutantes triples,
N296K/l297R/l298K and N296K/l297R/l298R (Tabla 2), se ensayaron en expresión libre de células con o sin OmpT. Las ocho variantes mutantes de RF1 dobles y triples se escindieron con OmpT1 (datos no mostrados). Entre estas variantes, N296K/L297R/L298R fue la más sensible a la digestión por OmpT.

Claims (15)

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    1. Una proteína de factor de liberación 1 (RF1) que puede ser escindida por una proteína de la membrana externa T1 (OmpTl) y tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 1, en la que hay un enlace peptídico escindible por OmpT1 situado dentro de la región del bucle de conmutación, y en la que la región del bucle de conmutación comprende los aminoácidos 287-304 de la SEQ ID NO: 1 modificada para incluir tres aminoácidos básicos adyacentes que están cargados positivamente a pH 7,0.
  2. 2. La proteína RF1 de la reivindicación 1, en la que:
    (a) Los tres aminoácidos básicos adyacentes se seleccionan independientemente del grupo que consiste en arginina y lisina;
    (b) la región del bucle de conmutación se modifica para tener cuatro o cinco aminoácidos básicos adyacentes;
    (c) La asparagina nativa en la posición 296 se sustituye por uno de los tres aminoácidos básicos adyacentes; o
    (d) la región del bucle de conmutación comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en:
    QQAEASTRRKLLGSGDRS (SEQ ID NO:5),
    QQAEASTRRRLLGSGDRS (SEQ ID NO:6),
    QQAEASTRRKKLGSGDRS (SEQ ID NO:12),
    QQAEASTRRKRLGSGDRS (SEQ ID NO:13),
    QQAEASTRRKVLGSGDRS (SEQ ID NO:14),
    QQAEASTRRRKLGSGDRS (SEQ ID NO:15),
    QQAEASTRRRRLGSGDRS (SEQ ID NO:16),
    QQAEASTRRRVLGSGDRS (SEQ ID NO:17),
    QQAEASTRRKKKGSGDRS (SEQ ID NO:18),
    QQAEASTRRKKRGSGDRS (SEQ ID NO:19),
    QQAEASTRRKRKGSGDRS (SEQ ID NO:20),
    QQAEASTRRKRRGSGDRS (SEQ ID NO:21),
    QQAEASTRRRRRGSGDRS (SEQ ID NO:22),
    QQAEASTRRRKRGSGDRS (SEQ ID NO:23),
    QQAEASTRRRRKGSGDRS (SEQ ID NO:24), and QQAEASTRRRKKGSGDRS (SEQ ID NO:25).
  3. 3. Una proteína de factor de liberación 1 (RF1) que es escindible por una proteína de la membrana externa T1 (OmpT1), en la que hay un enlace de péptido escindible por OmpT1 situado dentro de la región del bucle de conmutación, y en la que la región del bucle de conmutación comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de secuencias que consiste en:
    QARRGSTRRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:26);
    QQARRGTRRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:27);
    QQAARRGRRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:28);
    QQAEARRGRNLLGSGDRS (SEQ ID NO:29);
    QQAEAARRGNLLGSGDRS (SEQ ID NO:30);
    QQAEASARRGLLGSGDRS (SEQ ID NO:31);
    QQAEASTARRGLGSGDRS (SEQ ID NO:32);
    QQAEASTRARRGGSGDRS (SEQ ID NO:33);
    QQAEASTRRARRGSGDRS (SEQ ID NO:34);
    QQAEASTRRNARRGGDRS (SEQ ID NO:35);
    QQAEASTRRNLARRGDRS (SEQ ID NO:36);
    QQAEASTRRNLLARRGRS (SEQ ID NO:37);
    QQAEASTRRNLLGARRGS (SEQ ID NO:38);
    QQAEASTRRNLLGSARRG (SEQ ID NO:39) QQAEASTRRNLLGSGARR (SEQ ID NO:40); QQAWLAARRGRGGSGDRS (SEQ ID NO:41);
    QQAEWLAARRGRGSGDRS (SEQ ID NO:42);
    QQAEAWLAARRGRGGDRS (SEQ ID NO:43);
    QQWGGRWARKKGTIGDRS (SEQ ID NO:44);
    QQAWGGRWARKKGTIDRS (SEQ ID NO:45); y QQAEWGGRWARKKGTIRS (SEQ ID NO:46).
  4. 4. Una célula bacteriana que expresa tanto una proteína de la membrana externa T1 (OmpT1) como una proteína RF1 de la reivindicación 1, 2 o 3.
  5. 5. La célula bacteriana de la reivindicación 4, en la que: la célula bacteriana es una E. coli.
  6. 6. Un método para reducir la actividad perjudicial de una proteína RF1 de las reivindicaciones 1, 2 o 3 en un sistema
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    de síntesis libre de células in vitro, comprendiendo el método las etapas de:
    i) cultivar una bacteria positiva en OmpT1 que expresa la proteína RF1 de la reivindicación 1, 2 o 3;
    ii) lisar las bacterias para crear un extracto de síntesis libre de células;
    iii) poner en contacto la proteína RF1 de la de la reivindicación 1, 2 o 3 con OmpT1 en una cantidad suficiente para reducir la proteína intacta en un 50 %;
    iv) añadir un molde de ácido nucleico al extracto en el que el molde codifica una proteína de interés; y
    v) dejar que el sistema de síntesis libre de células produzca la proteína de interés.
  7. 7. El método de la reivindicación 6, en el que:
    (a) la bacteria positiva en OmpT 1 es E. coli;
    (b) el sistema de fosforilación oxidativa de las bacterias permanece activo después de la lisis celular y durante la síntesis de una proteína de interés; o
    (c) el extracto de síntesis libre de células coloca un aminoácido no nativo en un codón ámbar de una proteína de interés.
  8. 8. Un ácido nucleico que codifica la proteína RF1 de la reivindicación 1, 2 o 3.
  9. 9. Un método para reducir la competencia de RF1 en un codón ámbar en un sistema de síntesis libre de células in vitro, comprendiendo el método las etapas de:
    i) cultivar una bacteria positiva en OmpT1 que expresa la proteína RF1 de la reivindicación 1, 2 o 3; y
    ii) lisar las bacterias para crear un extracto de síntesis libre de células;
    iii) poner en contacto la proteína RF1 del extracto con OmpT1 en una cantidad suficiente para reducir la proteína RF1 intacta en un 50 %;
    iv) añadir un molde de ácido nucleico al extracto en el que el molde codifica una proteína de interés e incluye un codón de parada; y
    v) dejar que el sistema de síntesis libre de células produzca la proteína de interés.
  10. 10. El método de la reivindicación 9, en el que:
    (a) la bacteria positiva en OmpT 1 es de E. coli;
    (b) el sistema de fosforilación oxidativa de las bacterias permanece activo después de la lisis celular y durante la síntesis de una proteína de interés; o
    (c) el extracto de síntesis libre de células coloca un aminoácido no nativo en el codón ámbar de una proteína de interés.
  11. 11. Un sistema de síntesis libre de células que comprende en una sola mezcla de reacción:
    i) los componentes de un lisado bacteriano suficientes para traducir un molde de ácido nucleico que codifica una proteína;
    ii) un molde de ácido nucleico que codifica una proteína de interés y que tiene al menos un codón ámbar;
    iii) ARNt complementario al codón ámbar; e
    iv) la proteína RF1 de la reivindicación 1, 2 o 3.
  12. 12. El sistema de síntesis libre de células de la reivindicación 11, en el que:
    (a) la mezcla de reacción comprende además un aminoácido no natural y el aminoácido sintetasa correspondiente, la sintetasa capaz de cargar el ARNt complementario al codón ámbar con el aminoácido no natural; o
    (b) el sistema genera ATP a través de un sistema activo de fosforilación oxidativa.
  13. 13. Un método para expresar proteína en un sistema de síntesis libre de células, que comprende:
    i) combinar un molde de ácido nucleico con un extracto bacteriano que comprende la proteína RF1 de la reivindicación 1, 2 o 3 en condiciones que permiten la síntesis de proteínas; y
    ii) expresar una proteína a partir del molde de ácido nucleico.
  14. 14. Una célula bacteriana que comprende ácido nucleico que codifica la RF1 funcional de la reivindicación 1, 2 o 3 incorporada en el genoma de la célula bacteriana.
  15. 15. Un extracto bacteriano que comprende una proteína RF1 de la reivindicación 1 2 o 3.
    Figura 1
    imagen1
    Fe de longitud
    Carril 1-Sin RF1 añadida, Fc378 Carril 2- RF1 WT Fc378 Carril 3- AIS RF1, Fc378 Carril 4- 817 RF1, Fc378 Carril 5- gg RF1, Fc37g Carril 6- A17 RF1, Fc378
    Carril 7- A18 RF1, Fc378
    !_______________________________________________
    Actividad relativa de las variantes de RF1 recombinantes
    imagen2
    WT A13 817 B9 Al7 A18 No RF1
    Variantes de RF1 recombinantes
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    60
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    Figura 1A
    Figura 1B
    ro
    >
    imagen3
    SI 36 IN297 1299 K320 G34I Q342 P343 Y373 F404 F405 S415 Q418 V422 WT
    SI 36 N297 1299 K320 G34! Q342 P343 Y373 F404 F405 S415 Q418 V422 WT
    n
    imagen4
    Figura 2
    Z7*A 8Itn SI*S SOfrJ HiH £¿Uftfd ítíO TtES 07£>l &&71Í&ZN 9ítS
    S
    Supresión de codón ámbar
    •P
    -p P P p p p P p
    H-A vV ** un «y* ce
    o
    c o O c? O o ■o
    o
    o
    C=1
    imagen5
    S
    !U
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    f-1"
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    VI Vp 1Q
    &
    -W
    imagen7
    r =r x
    n § n
    O
    03
    O.
    03
    Sí 36 N297 T299 K320 G341 Q342 P343 Y373 F404 F405 S415 Q418 V422 WT
    Sí 36
    N297
    T299
    K320
    G34Í
    Q342
    P343
    Y373
    F404
    F40S
    S415
    Q418
    V422
    WT
    Figura 3
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2906592T3 (pl) * 2012-10-12 2019-07-31 Sutro Biopharma, Inc. Proteolityczna inaktywacja wybranych białek w ekstraktach bakteryjnych dla ulepszonej ekspresji
SG11201508642WA (en) * 2013-04-19 2015-11-27 Sutro Biopharma Inc Expression of biologically active proteins in a bacterial cell-free synthesis system using cell extracts with elevated levels of exogenous chaperones
US10316322B2 (en) * 2014-07-02 2019-06-11 Sutro Biopharma, Inc. High growth capacity auxotrophic Escherichia coli and methods of use
CN116144626A (zh) * 2016-01-13 2023-05-23 新英格兰生物实验室公司 T7 rna聚合酶的热稳定变体
CN110366428B (zh) 2016-12-30 2024-05-17 Vaxcyte公司 具有非天然氨基酸的多肽-抗原缀合物
US11951165B2 (en) 2016-12-30 2024-04-09 Vaxcyte, Inc. Conjugated vaccine carrier proteins
CN106801047A (zh) * 2016-12-30 2017-06-06 武汉金开瑞生物工程有限公司 一种通过无细胞蛋白合成系统制备半胱氨酸蛋白酶的方法
JP7325341B2 (ja) 2017-07-11 2023-08-14 シンソークス，インク． 非天然ヌクレオチドの組み込み及びその方法
KR20240141853A (ko) 2017-08-03 2024-09-27 신톡스, 인크. 자가면역 질환의 치료를 위한 사이토카인 접합체
SG11202003147XA (en) 2017-10-12 2020-05-28 Vaxcyte Inc Periodontitis vaccine and related compositions and method of use
CN112004547A (zh) 2018-02-26 2020-11-27 新索思股份有限公司 Il-15缀合物及其用途
JP7340591B2 (ja) 2018-07-11 2023-09-07 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用
CN108949796A (zh) * 2018-07-27 2018-12-07 张家港市华天药业有限公司 一种用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法
CN109055291A (zh) * 2018-07-31 2018-12-21 张家港市华天药业有限公司 用于合成谷胱甘肽的重组菌及谷胱甘肽的合成方法
SG11202102930YA (en) 2018-11-08 2021-04-29 Synthorx Inc Interleukin 10 conjugates and uses thereof
EP3923974A4 (en) 2019-02-06 2023-02-08 Synthorx, Inc. IL-2 CONJUGATES AND METHODS OF USE THEREOF
KR20210146392A (ko) 2019-04-02 2021-12-03 박사이트, 인코포레이티드 침습 플라스미드 항원 b의 최적화된 무세포 합성 및 관련 조성물 및 사용 방법
CN114555128A (zh) 2019-08-15 2022-05-27 新索思股份有限公司 采用il-2缀合物的免疫肿瘤学组合疗法
US12234271B2 (en) 2019-09-10 2025-02-25 Synthorx, Inc. Il-2 conjugates and methods of use to treat autoimmune diseases
WO2021091986A1 (en) 2019-11-04 2021-05-14 Synthorx, Inc. Interleukin 10 conjugates and uses thereof
US12351850B2 (en) * 2020-04-30 2025-07-08 Sutro Biopharma, Inc. Methods of producing full-length antibodies using E. coli
IL299074A (en) 2020-06-25 2023-02-01 Synthorx Inc Immuno-oncology therapeutic combination with IL-2 and anti-AGFR antibody conjugates
US20220089690A1 (en) * 2020-09-14 2022-03-24 Sutro Biopharma, Inc. Method for large scale production of antibodies using a cell-free protein synthesis system
JP2023546010A (ja) 2020-10-09 2023-11-01 シンソークス， インコーポレイテッド Ｉｌ－２コンジュゲートを用いた免疫腫瘍療法
IL301611A (en) 2020-10-09 2023-05-01 Synthorx Inc Immuno oncology combination therapy with il-2 conjugates and pembrolizumab
TW202245843A (zh) 2021-02-12 2022-12-01 美商欣爍克斯公司 Ｉｌ－２接合物及西米普利單抗（ｃｅｍｉｐｌｉｍａｂ）之皮膚癌組合療法
WO2022174102A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Synthorx, Inc. Lung cancer combination therapy with il-2 conjugates and an anti-pd-1 antibody or antigen-binding fragment thereof
CN113322267B (zh) * 2021-03-15 2024-01-05 天津大学 系统在提高非天然氨基酸的插入效率中的应用
EP4346904A1 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Synthorx, Inc. Head and neck cancer combination therapy comprising an il-2 conjugate and cetuximab
EP4452327A1 (en) 2021-12-20 2024-10-30 Synthorx, Inc. Head and neck cancer combination therapy comprising an il-2 conjugate and pembrolizumab
WO2023122750A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Synthorx, Inc. Cancer combination therapy with il-2 conjugates and cetuximab
WO2024136899A1 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Synthorx, Inc. Cancer therapy with il-2 conjugates and chimeric antigen receptor therapies
CN121263208A (zh) 2023-03-20 2026-01-02 新索思股份有限公司 使用il-2 peg缀合物的癌症疗法
WO2025015041A1 (en) * 2023-07-12 2025-01-16 University Of Washington Rna-only, positive control target for clinical diagnostic testing
WO2025158385A1 (en) 2024-01-25 2025-07-31 Genzyme Corporation Pegylated il-2 for suppressing adaptive immune response to gene therapy

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000052193A1 (fr) * 1999-03-04 2000-09-08 Suntory Limited Procede de controle de clivage par la protease de l'ompt
DE60226411D1 (de) 2001-01-25 2008-06-19 Anthony C Forster Verfahren und zusammensetzungen für peptid-, protein- und peptidomimetische synthese
JP5259046B2 (ja) 2002-08-19 2013-08-07 ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ 改良されたインビトロ・タンパク質合成の方法
DE10336705A1 (de) * 2003-08-06 2005-03-10 Rina Netzwerk Rna Technologien Verfahren zur Herstellung eines Lysats zur zellfreien Proteinbiosynthese
US9657323B2 (en) 2003-09-30 2017-05-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Polypeptide cleavage method using OmpT protease variant
WO2006082059A1 (en) * 2005-02-02 2006-08-10 Universität Bayreuth Esterases for monitoring protein biosynthesis in vitro
BRPI0617191A2 (pt) * 2005-10-12 2011-07-19 Scripps Research Inst modificação pós-traducional de polipeptìdeos expressos em fagos
WO2007109035A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-27 The Scripps Research Institute Genetically programmed expression of proteins containing the unnatural amino acid phenylselenocysteine
JP5798489B2 (ja) 2009-01-12 2015-10-21 ストロ バイオファーマ， インコーポレイテッド インビトロタンパク質合成システムを用いて非天然アミノ酸をタンパク質に選択的に導入するためのモノチャージシステム
PL2906592T3 (pl) 2012-10-12 2019-07-31 Sutro Biopharma, Inc. Proteolityczna inaktywacja wybranych białek w ekstraktach bakteryjnych dla ulepszonej ekspresji

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