ES2699452T3

ES2699452T3 - Nuevo derivado de triazina

Info

Publication number: ES2699452T3
Application number: ES14828654T
Authority: ES
Inventors: Wataru Kawahata; Tokiko ASAMI; Masaaki Sawa; Yuko ASAMITSU; Takayuki Irie; Takahiro Miyake; Takao Kiyoi
Original assignee: Carna Biosciences Inc
Current assignee: Carna Biosciences Inc
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2014-07-15
Publication date: 2019-02-11
Anticipated expiration: 2034-07-15
Also published as: JP6156953B2; EP3026050A4; JPWO2015012149A1; US9656995B2; WO2015012149A1; PH12016500152A1; CN105683178B; AU2014294225A1; CR20160082A; SG11201600497VA; NO20160292A1; EP3026050B1; CA2919068A1; IL243737A0; IL243737B; DK3026050T3; EP3026050A1; KR101742550B1; AU2014294225B2; CN105683178A

Abstract

Un derivado de triazina representado por la siguiente fórmula (I):**Fórmula** donde R1 es un grupo hidroximetilo, R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido, A es un átomo de nitrógeno o C-R3, R3 es un átomo de hidrógeno, grupo ciano, un grupo acilo sustituido o no sustituido, un grupo sulfonilo sustituido o no sustituido, o un grupo carbamoílo sustituido o no sustituido y R4 es un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido o un grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; donde dicho grupo alquilo inferior es un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 3 átomos de carbono y donde los sustituyentes del grupo alquilo inferior sustituido, el grupo acilo sustituido, el grupo sulfonilo sustituido, el grupo carbamoílo sustituido y el grupo cicloalquilo sustituido son uno o más sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo hidroxi, un grupo alquilamino, un grupo carbamoílo, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo acetilo, un grupo mesilo, un grupo benzoilo, un grupo acilamino y un grupo aciloxi.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo derivado de triazina

Campo técnico

La presente invención se refiere a un fármaco y particularmente a un nuevo derivado de triazina que tiene un efecto inhibidor de BTK, o a un profármaco o una sal farmacéuticamente aceptables del mismo.

Antecedentes de la técnica

La tirosina quinasa de Bruton (BTK) es un miembro de la familia Tec de tirosina quinasas no receptoras, y es una enzima de señalización importante que se expresa en todos los tipos de células hematopoyéticas excepto por los linfocitos T y células asesinas naturales. BTK es un importante factor de control asociado a la supervivencia, la diferenciación, la proliferación y la activación de células B, y toma un papel importante en la señalización de células B

(Documentos 1 y 2 distintos de Patentes). Un receptor de células B (BCR) de la superficie celular señaliza hacia las células a través de la BTK existente en la cadena abajo de BCR y por tanto, se considera que una activación anormal de la vía de señalización de células B, acelera la proliferación y supervivencia de células cancerosas de linfoma de células B, leucemia linfocítica crónica y similares (Documento 3 Distinto de patente). Se sabe que BTK también juega un papel importante en la vía de señalización de un gran número de otras células, y se dice que la BTK está implicada en enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias y similares (Documento 1 distinto de Patente). Por ejemplo, se sabe que la BTK juega un papel importante para la señalización de un receptor IgE de alta afinidad (FceRI) en mastocitos, y la desgranulación disminuye y la producción de citocinas proinflamatorias disminuye en mastocitos deficientes de bTk (Documento 4 distinto de Patente). Se sugiere que BTK está implicado en lupus eritematoso sistemático (SLE) en una prueba en un ratón deficiente de BTK (Documento 5 distinto de patente). Adicionalmente, el ratón BTK mutante exhibe resistencia a la aparición de artritis inducida por colágeno (Documento 6 distinto de patente). Por tanto, el compuesto que tiene una actividad inhibidora BTK es útil para el tratamiento de enfermedades las cuales están implicadas en señalización BTK, por ejemplo, cáncer, linfoma de células B, y leucemia linfocítica crónica, y también es útil para el tratamiento de enfermedades alérgicas, enfermedades autoinmunes y enfermedades inflamatorias.

Los compuestos que tienen un efecto inhibidor de BTK mencionados anteriormente se han informado. (Documento 1 de Patente)

Documentos de la técnica anterior

DOCUMENTOS DE PATENTES

[Documento de Patente 1] WO 2013/133367

JP 2012219200 A y JP 2011 52629 A desvela compuestos que se dice que son inhibidores de la tirosina quinasa de Bruton.

DOCUMENTOS DISTINTOS DE PATENTES

[Documento 1 distinto de Patentes] Satterchwaite, A. B. y Witte, O. N., Immunol. Rev., 2000, 175, 120-127 [Documento 2 distinto de Patentes] Kurosaki T., Curr. Opin. Immunol., 2000, 12, 276-281

[Documento 3 distinto de Patentes] Davis R. E. et al., Nature, 2010, 463, 88-92

[Documento 4 distinto de Patentes] EllmeierW. et al., FEBS J., 2011, 278, 1990-2000

[Documento 5 distinto de Patentes] Halcomb K. E., Mol. Immunol., 2008, 46(2), 233-241

[Documento 6 distinto de Patentes] Jansson L. and Holmdahl R., Clin. Exp. Immunol., 1993, 94, 459-465 Sumario de la invención

Problemas a resolverse por la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar un fármaco, particularmente un nuevo derivado de triazina que tiene un efecto inhibidor BTK, su profármaco o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Maneras de resolver los problemas

La presente invención se logra por el siguiente (1):

(1) Un derivado de triazina representado por la siguiente fórmula (I):

[Fórmula Química 1]

donde

R1 es un grupo hidroximetilo,

R2 representa un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido,

A representa un átomo de nitrógeno o C-R3,

R3 representa un átomo de hidrógeno, grupo ciano, un grupo acilo sustituido o no sustituido, un grupo sulfonilo sustituido o no sustituido, o un grupo carbamoílo sustituido o no sustituido,

R4 representa un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido, un grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

donde dicho grupo alquilo inferior es un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 3 átomos de carbono.

Efecto de la invención

Los presentes inventores han estudiado intensivamente para lograr el objeto anterior y encontraron que un nuevo derivado de triazina representado por la fórmula (I) mostrada anteriormente y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo tienen un excelente efecto inhibidor de la BTK y un excelente efecto inhibidor en un modelo animal de artritis inducida por colágeno, y así, completaron la presente invención. El compuesto proporcionado por la presente invención es útil como un producto farmacéutico preventivo o terapéutico (composición farmacéutica) para enfermedades que se sabe que estén implicadas en una respuesta celular anormal mediante la BTK, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades óseas y cánceres tales como linfoma. El compuesto también es útil, como un inhibidor de la BTK, para los reactivos para su uso en pruebas e investigaciones.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra que el compuesto del Ejemplo 1 inhibe la señal de BCR en las células Ramos de manera dependiente a una concentración e inhibe el flujo de calcio hacia dentro de las células (Ejemplo de Prueba 3). La Figura 2 muestra que el compuesto del Ejemplo 1, en la prueba de reacción de PCA, inhibió la fuga de tinte en la sangre a las aurículas significativamente cuando se compara con el grupo disolvente (Ejemplo de Prueba 4).

La Figura 3 muestra el efecto del compuesto del Ejemplo 1 en el modelo de ratón de artritis inducido por colágeno (Ejemplo de Prueba 5).

La Figura 4 muestra el efecto del compuesto del Ejemplo 1 en el modelo de rata con artritis inducido por colágeno (Ejemplo de Prueba 6).

Descripción de las realizaciones

La presente invención será descrita en detalle más adelante.

Un nuevo derivado de triazina de la presente invención es un compuesto representado por la fórmula (I) mostrada a continuación:

[Fórmula Química 2]

donde

R1 es un grupo hidroximetilo,

A representa un átomo de nitrógeno o C-R3,

R4 representa un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido, un grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido.

En la fórmula (I) mostrada anteriormente,

Una porción del grupo alquilo inferior del grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido puede ser cualquier grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico teniendo 1 a 3 átomos de carbono, y ejemplos específicos del mismo incluyen un grupo metilo y un grupo isopropilo, etc.

Una porción del grupo cicloalquilo de un grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido puede ser grupos alquilo cíclicos teniendo 3 a 6 átomos de carbono, y ejemplos específicos del mismo incluyen un grupo ciclopropilo y un grupo ciclobutilo, etc.

Una porción del grupo acilo del grupo acilo sustituido o no sustituido puede ser un grupo alquilo lineal, ramificado, o cíclico conectado a un grupo carbonilo, y ejemplos específicos de la porción de grupo acilo del grupo acilo sustituido o no sustituido incluye un grupo formilo, un grupo acetilo y un grupo propionilo, un grupo octanoílo, un grupo dodecanoílo, un grupo pivaloílo, un grupo ciclopropilcarbonilo y un grupo benzoílo etc.

Los ejemplos de la porción de grupo sulfonilo del grupo sulfonilo sustituido o no sustituido incluyen un grupo metilsulfonilo, un grupo etilsulfonilo, etc.

Los ejemplos de la porción del grupo carbamoílo del grupo carbamoílo sustituido o no sustituido incluye un grupo metilcarbamoílo, un grupo etilcarbamoílo y un grupo dimetilcarbamoílo, etc.

Un sustituyente del grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido, el grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido, el grupo acilo sustituido o no sustituido, el grupo sulfonilo sustituido o no sustituido, o el grupo carbamoílo sustituido o no sustituido puede ser el mismo o diferente cuando el grupo anterior tiene dos o más sustituyentes, y el grupo puede estar sustituido con una, dos o más de cualquier clase de sustituyente o sustituyentes en cualquier posición que sea químicamente permisible. Los ejemplos del sustituyente incluyen un átomo de halógeno, un grupo alquilo sustituido o no sustituido, un grupo alcoxi sustituido o no sustituido, un grupo amino sustituido o no sustituido, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo hidroxi, un grupo alquilamino sustituido o no sustituido, un grupo carbamoílo sustituido o no sustituido, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo acetilo, un grupo mesilo, un grupo benzoilo, un grupo acilamino sustituido o no sustituido, y un grupo aciloxi sustituido o no sustituido.

Los isómeros pueden existir en el compuesto (I) de la presente invención, dependiendo de la clase del sustituyente. En la presente descripción, los isómeros pueden describirse por una estructura química de solamente una forma del mismo, pero la presente invención incluye todos los isómeros (isómero geométrico, isómero óptico, tautómero, etc.) los cuales pueden ser estructuralmente formados, pero también incluyen isómeros solos o una mezcla del mismo.

Los ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable del compuesto (I) de la presente invención incluyen sales ácidas inorgánicas con ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido carbónico y ácido fosfórico; y sales ácidas orgánicas con ácido fumárico, ácido maleico, ácido metansulfónico y ácido p-toluensulfónico. La presente invención también incluye sales de amonio, y además sales de metales alcalinos con sodio y potasio; sales de metales alcalinotérreos con magnesio y calcio; sales de aminas orgánicas con alquilamina inferior y alcoholamina inferior; y sales de aminoácidos básicas con lisina, arginina y ornitina.

El compuesto (I) y una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en la presente invención pueden producirse, por ejemplo, mediante métodos mostrados posteriormente. Cuando un grupo definido puede estar químicamente afectado bajo las condiciones de un método ejemplificado en el método de producción mostrado abajo, o es inadecuado para su uso en la realización del método, es posible producirlos fácilmente mediante un método que se usa habitualmente en química sintética orgánica, por ejemplo, un método para aplicar medios tales como protección o desprotección de un grupo funcional [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3ra Edición, John Wiley&Sons, Inc., 1999]. Si es necesario, el orden de una etapa de reacción tal como la introducción de sustituyentes también puede cambiarse.

Los significados de las abreviaturas y símbolos usados en la siguiente descripción son como sigue.

DCM: diclorometano

THF: tetrahidrofurano

DIEA: N,N-diisopropiletilamina

DM : A/,W-dimetilformamida

DMSO: dimetil sulfóxido

CDCI3: cloroformo deuterado

[Método para la Producción del Compuesto (I) de la Presente Invención]

El compuesto de la presente invención representado por la fórmula (I) puede producirse, por ejemplo, de acuerdo con el Esquema 1 :

[Esquema 1]

[Fórmula Química 3]

donde R1, R2, R4 y A son como se define arriba, y W representa un grupo boronilo o un grupo éster de ácido borónico.

El compuesto (I) de la presente invención puede producirse por una reacción de acoplamiento cruzado tales como la reacción de acoplamiento Suzuki, usando un compuesto (II) y un compuesto (III) (con respecto a las condiciones de la reacción de acoplamiento Suzuki, véase la bibliografía, por ejemplo, N. Miyaura et al., J. Am. Chem. Soc., 107, 972 (1985). N. Miyaura, A. Suzuki, Chem. Rev. 95, 2457 (1995)). Esto es, la reacción puede llevarse a cabo en presencia de un catalizador metálico tal como paladio o níquel, si es necesario, usando una base y aditivos. Los ejemplos de un disolvente usado en la reacción incluyen THF, dioxano, tolueno, dimetoxietano, metanol, etanol y acetonitrilo. También es adecuado utilizar dos o más clases de estos disolventes, o usarlos en combinación con agua. El disolvente es preferentemente un disolvente mezclado de THF y agua, o un disolvente mezclado de tolueno, metanol y agua, o dioxano. El compuesto (II) se usa preferentemente en una cantidad equivalente o en exceso, y más preferentemente en una cantidad de 1 equivalente a 10 equivalentes, basado en el compuesto (III). Si es necesario, puede añadirse una base para acelerar la reacción, y se usan habitualmente carbonato de sodio, carbonato de cesio, y carbonato de potasio como la base. La cantidad de base a usarse es de 1 equivalente a 10 equivalentes, y preferentemente de 1 equivalente a 5 equivalentes basado en el compuesto (III). Es posible utilizar, como un catalizador metálico, un catalizador de paladio disponible en el mercado (por ejemplo, PdCl2 (dppf), Pd2(dba)3, Pd(PPh3)4, etc.) que se usa en acoplamiento cruzado, y el catalizador se usa preferentemente en una cantidad catalítica, esto es, una cantidad de 0,1 equivalentes a 0,5 equivalentes basado en el compuesto (III).

Si es necesario, pueden añadirse aditivos para acelerar la reacción. El aditivo incluye, por ejemplo, rac- BINAP y puede usarse en la cantidad de 0,01 equivalentes a 1 equivalente basado en el compuesto (III). Es posible para sintetizar el producto mediante la reacción a una temperatura que varía de 0 °C a 200 °C durante varios minutos a varios días, y preferentemente de 10 °C a 100 °C durante 1 hora a 36 horas. También es posible sintetizar el producto mediante la reacción bajo la condición de temperatura de 60 °C a 150 °C durante varios minutos a varias horas, utilizando un equipo de síntesis de microondas.

El compuesto (II) usado como el material inicial del Esquema 1 puede producirse, por ejemplo, por el método mostrado en el Esquema 2:

[Esquema 2]

[Fórmula Química 4]

donde R1, R4 y W son como se define anteriormente, y X representa un halógeno.

El compuesto (II) puede producirse mediante la activación del compuesto (IV) con n-butil litio, y luego haciendo reaccionar el compuesto activado con áster de ácido bórico. Esto es, el compuesto (II) puede obtenerse por litiación del compuesto (IV) con 1 a 5 equivalentes molares, y preferentemente 1 a 1,5 equivalentes molares de n-butil litio, y haciendo reaccionar el compuesto litiado con 1 a 5 equivalentes molares, y preferentemente 1 a 1,5 equivalentes molares de un éster de ácido bórico.

Cualquier disolvente puede usarse siempre y cuando esté inerte a la reacción, y THF puede usarse preferentemente aunque no está particularmente limitado.

La temperatura de la reacción es habitualmente de - 100 °C a -30 °C, y preferentemente de -80 °C a -60 °C. El tiempo de reacción no está particularmente limitado, pero se ejemplifica habitualmente por horas de 0,1 horas a 12 horas, preferentemente de 0,2 horas a 6 horas.

El compuesto (II) puede también obtenerse mediante la reacción del compuesto (IV) con 1 a 5 equivalentes molares, y preferentemente 1 a 1,5 equivalentes molares de magnesio metálico y una cantidad catalítica de yodo en un disolvente con base de éter una temperatura de -10 °C a punto de ebullición del disolvente a usarse para obtener un reactivo Grignard, y luego haciendo reaccionar el reactivo Grignard con 1 a 5 equivalentes molares, preferentemente 1 a 1,5 equivalentes molares de éster de ácido bórico. La temperatura de reacción es habitualmente de -30 ° C a -100 °C, preferentemente de -60 °C a -80 °C. El tiempo de reacción no está particularmente limitado, pero se ejemplifica habitualmente en horas de 0,1 horas a 12 horas, preferentemente de 0,2 horas a 6 horas.

Adicionalmente, el compuesto (II) puede obtenerse sometiendo el compuesto (IV) y 1 a 5 equivalentes molares, preferentemente 1 a 3 equivalentes molares de un éster dibórico a una reacción de acoplamiento en la presencia de un catalizador metálico tal como paladio y níquel y una base en un disolvente orgánico.

Es posible utilizar, como catalizador metálico, un catalizador de paladio disponible en el mercado (por ejemplo, PdCl2 (dppf), Pd2 (dba)3, Pd(PPh3)4, etc.) que se usa en el acoplamiento cruzado, y el catalizador se usa preferentemente en una cantidad catalítica, esto es, una cantidad de 0,1 equivalentes a 0,5 equivalentes basado en el compuesto (IV) a usarse en el acoplamiento cruzado. El acetato de potasio se usa habitualmente como la base. La cantidad de la base a usarse es de 1 equivalente a -10 equivalentes, preferentemente de 1 equivalente a 5 equivalentes basado en el compuesto (IV).

Cualquier disolvente puede usarse siempre y cuando sea inerte a la reacción, y puede usarse preferentemente dioxano, aunque no está particularmente limitado.

La temperatura de reacción es habitualmente de 0 °C a 200 °C, preferentemente de 10 °C a 100 °C. El tiempo de reacción no se limita particularmente, pero se ejemplifica como un ejemplo preferible el tiempo de reacción de 0,2 horas a 48 horas, preferentemente de 1 hora a 36 horas.

Se desea que cualquiera de estas reacciones se lleve a cabo en una atmósfera de gas inerte (argón, nitrógeno, etc.), en condiciones anhidras.

El compuesto (IV) a usarse como un material de partida del Esquema 2 puede producirse, por ejemplo, mediante el método mostrado en el Esquema 3:

[Esquema 3]

[Fórmula Química 5]

donde R1, R4 y X son como se define anteriormente.

El compuesto (IV) puede obtenerse por la reacción del compuesto (V) con 1 a 5 equivalentes molares, preferentemente 1,5 a 3 equivalentes molares del compuesto (VI) en un disolvente polar en presencia de un catalizador metálico y una base.

Cualquier disolvente puede usarse siempre y cuando sea inerte a la reacción, puede usarse preferentemente dioxano, aunque no está particularmente limitado.

En la reacción de acoplamiento, el compuesto (IV) puede también producirse mediante opcionalmente protegiendo o desprotegiendo un grupo R1 del compuesto (VI), apropiadamente combinando métodos a usarse habitualmente en la química sintética orgánica. Por ejemplo, es posible utilizar protección o desprotección de un grupo funcional, tal como un grupo hidroxi o amino del compuesto (VI) [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis 3a Edición, John Wiley&Sons, Inc., 1999] y derivado de aldehído que es un grupo precursor hidroxi del compuesto (VI).

La reacción puede llevarse a cabo a una temperatura de 80 °C a 200 °C durante 0,5 horas a 200 horas, preferentemente de 100 °C a 150 °C durante 1 hora a 100 horas. Es posible realizar también la reacción usando un equipo de síntesis de microondas.

Es posible usar, como el catalizador metálico, un catalizador de paladio disponible en el mercado (por ejemplo, PdCl2 (dppf), Pd2(dba)3, Pd(PPh3)4, etc.) o yoduro de cobre (I) que se usa en la reacción de acoplamiento, y el catalizador se usa preferentemente en una cantidad catalítica, esto es, una cantidad de 0,01 equivalentes a 2 equivalentes basados en el compuesto (V) a usarse en el acoplamiento.

Los ejemplos de la base a usarse incluyen carbonato de potasio, carbonato de sodio, carbonato de cesio y carbonato ácido de sodio, y carbonato de cesio y carbonato ácido de sodio puede ser preferentemente utilizado. La cantidad de la base a usarse es de 1 equivalente molar a 10 equivalentes molares, preferentemente de 2 equivalentes molares a 5 equivalentes molares, basados en el compuesto (V) Y si es necesario, xantphos puede usarse como aditivo a la reacción en la cantidad de 0,1 equivalentes a 0,5 equivalentes basado en el compuesto (V).

El compuesto (VI) puede obtenerse como un producto disponible en el mercado, o puede obtenerse por un procedimiento muy conocido o el procedimiento de acuerdo al mismo.

El compuesto (III) a usarse como un material inicial del Esquema 1 puede producirse, por ejemplo, mediante el método mostrado en el Esquema 4:

[Esquema 4]

[Fórmula Química 6]

2

donde R y A son como se define previamente.

El compuesto (III) puede obtenerse mediante la reacción de una amina (VII) con 1 a 5 equivalentes molares, preferentemente de 1 a 1,5 equivalentes molares de 2-amino-4,6-dicloro1,3,5-triazina en un disolvente polar y, si es necesario, en presencia de un catalizador base.

Cualquier disolvente puede usarse, siempre y cuando sea inerte a la reacción, pero DMF y THF pueden usarse preferentemente, aunque no está particularmente limitado.

La temperatura de reacción es habitualmente de 0 °C a 200 °C, preferentemente de 10 °C a 100 °C. El tiempo de reacción no se limita particularmente y se ejemplifica habitualmente el tiempo de reacción de 0,2 horas a 48 horas y se ejemplifica el tiempo de reacción de 1 hora a 36 horas como ejemplos preferibles.

2-Amino-4,6-dicloro-1,3,5-triazina, la cual es un material de partida del Esquema 4, puede obtenerse como un producto disponible en el mercado. Una amina (VII) puede obtenerse como un producto disponible en el mercado, o prepararse por un procedimiento bien conocido o el procedimiento de acuerdo con el mismo.

El compuesto (V) a usarse como material de partida del Esquema 3 puede producirse, por ejemplo, mediante el método mostrado en el Esquema 5:

[Esquema 5]

[Fórmula Química 7]

donde R4, X y W son como se define anteriormente, y R' representa un grupo alquilo inferior.

El compuesto (V) puede producirse por una reacción de ciclación del compuesto (X), el cual se obtiene por una reacción de acoplamiento cruzado tal como la reacción de acoplamiento Suzuki para introducir el grupo R4 después de convertir el grupo ácido carboxílico a un grupo carbamoílo, con A/,W-dimetilformamida dimetil acetal.

El compuesto (V) también puede obtenerse por la reacción de acoplamiento cruzado, tal como la reacción de acoplamiento Kumada cuando el grupo R4 es una porción de grupo alquilo terciario (véase la bibliografía de Amruta Joshi-Pangu et al., J. Am. Chem. Soc., 133, 8478-8481 (2011), por ejemplo). Esto es, el compuesto alquilo terciario (XII) puede obtenerse agitando el compuesto (XI), que se obtiene por esterificación de una porción de ácido carboxílico del compuesto (VIII), y el reactivo terciario alquilo de Grignard (R4MgBr) en presencia de un catalizador metálico de níquel(II), tal como cloruro de níquel (II), y un catalizador de carbeno N-heterocíclico, tal como 1,3-diciclohexil-tH-imidazol-3-io, a una temperatura que varía de la temperatura de congelación a temperatura ambiente. El compuesto (X) puede obtenerse por hidrólisis del compuesto (XII) seguido de la conversión del grupo ácido carboxílico al grupo carbamoílo.

El compuesto (VIII) a usarse como un material inicial del Esquema 5 puede obtenerse como un producto disponible en el mercado, o preparado mediante un procedimiento bien conocido o el procedimiento de acuerdo con el mismo.

En el esquema de reacción mostrado anteriormente, un grupo boronilo representado por W puede estar en forma de una sal de álcali metálico o metal alcalinotérreo, y ejemplos específicos del grupo de éster de ácido borónico incluyen grupos éster de ácidos borónicos tales como el grupo éster dimetílico del ácido borónico, un grupo éster dietílico del ácido borónico, un grupo éster dibutílico del ácido borónico, un grupo éster diciclohexílico del ácido borónico, un grupo éster de etilenglicol de ácido borónico, un grupo éster de propilenglicol de ácido borónico (un grupo éster de 1,2-propanodiol de ácido borónico, un grupo éster de 1,3-propanodiol de ácido borónico), un grupo éster de neopentilglicol de ácido borónico, un grupo éster de catecol de ácido borónico, un grupo éster de glicerina de ácido borónico, un grupo éster de trimetiloletano de ácido borónico, un grupo éster de dietanolamina de ácido borónico, y un grupo éster de trietanolamina de ácido borónico; y grupos anhídridos de ácido borónico.

Es posible obtener el compuesto (I) teniendo el grupo funcional deseado en la posición deseada de la invención presente mediante el uso apropiado de los métodos anteriores en combinación, y luego llevar a cabo un método habitualmente utilizado en química sintética orgánica (por ejemplo, una reacción de alquilación de un grupo amino, una reacción oxidante de un grupo alquiltio a un grupo sulfóxido o un grupo sulfona, una reacción de conversión de un grupo alcoxi a un grupo hidroxilo, o una reacción inversa de conversión del grupo).

Es posible obtener el profármaco del compuesto (I) de la presente invención mediante reacción de esterificación del compuesto (I) o su intermedio usando un método habitualmente utilizado en química sintética orgánica incluyendo protección o desprotección de un grupo funcional, si es necesario.

[Aplicaciones del Compuesto (I) de la Presente Invención]

El compuesto (I) o la sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención pueden formularse en una fórmula farmacéutica convencional (composición farmacéutica), que es adecuada para la administración oral, administración parenteral o administración local.

Las formulaciones para administración oral incluyen formulaciones sólidas tales como comprimidos, gránulos, polvos y cápsulas; y formulaciones liquidas tales como jarabes. Estas formulaciones pueden prepararse por un método convencional. Las formulaciones sólidas pueden prepararse mediante el uso de vehículos farmacéuticos convencionales, por ejemplo, lactosa; almidones tales como almidón de maíz; celulosas cristalinas tales como celulosa microcristalina; e hidroxipropilcelulosa, carboximetilcelulosa de calcio, talco, y estearato de magnesio. Las cápsulas pueden prepararse por el encapsulamiento de los gránulos o polvos preparados de esta manera. Los jarabes pueden prepararse mediante la disolución o suspensión del compuesto (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención en una solución acuosa que contenga sacarosa y carboximetilcelulosa.

Las formulaciones para la administración parenteral incluyen, inyecciones tales como la instilación. Las formulaciones de inyecciones pueden también prepararse mediante un método convencional, y pueden incorporarse apropiadamente a agentes isotónicos (por ejemplo, manitol, cloruro de sodio, glucosa, sorbitol, glicerol, xilitol, fructosa, maltosa, mañosa), estabilizantes (por ejemplo, sulfito de sodio, albúmina), y antisépticos (por ejemplo, alcohol bencílico, metil p-oxibenzoato).

La dosificación del compuesto (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención puede variar dependiendo de la gravedad de la enfermedad, la edad y el peso corporal del paciente, y la forma de dosificación, y está habitualmente dentro del intervalo de 1 mg a 1.000 mg al día para adultos. El compuesto o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede ser administrado una vez al día, o administrada separadamente dos o tres veces al día de acuerdo con una vía oral o parenteral.

El compuesto (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo de la presente invención también pueden usarse, como un inhibidor BTK, para reactivos a usarse en las pruebas experimentales y/o investigaciones.

Ejemplos

La presente invención se describirá más específicamente a continuación por medio de Ejemplos y Ejemplos de Prueba, pero la presente invención no se limita a estos Ejemplos.

La identificación del compuesto se llevó a cabo por espectro de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H-RMN) y espectro de masas (MS). La 1H-RMN se mide a 400 MHz, a menos que se especifique lo contrario, y el hidrógeno intercambiado a veces no puede observarse claramente dependiendo del compuesto y las condiciones de medición. a. significa una señal amplia (amplia).

La cromatografía preparativa por HPLC se llevó a cabo por una columna ODS disponible en el mercado en un modo gradiente usando agua/metanol (conteniendo ácido fórmico) como eluyente, a menos que se especifique lo contrario.

Ejemplo de Referencia 1

Acetato de 2-(6-ciclopropil-8-fluoro-l-oxoisoquinolin-2(7H/)-il)-6-(4,4,5,5-tetrameti1-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencilo

[Fórmula Química 8]

(Primera etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se disolvió ácido 4-bromo-2-fluoro-6-metilbenzoico (13,0 g, 55,8 mmol) en THF (100 ml). A esta solución, se añadió 1,1'-carbonildiimidazol (11,8 g, 72,5 mmol) a 0 °C, y luego se agitó a 0 °C durante 2 h. A esta mezcla de reacción, se añadió gota a gota una solución de amoníaco al 28 % (10 ml) durante un periodo de 5 min, y luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 días adicionales. La mezcla de la reacción se concentró a aproximadamente 50 ml a presión reducida, y se añadió solución acuosa de ácido clorhídrico 6 M (30 ml) y después se extrajo con acetato de etilo (2x100 ml). La capa combinada orgánica se lavó con una solución saturada de carbonato de hidrógeno de sodio y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para proporcionar 4-bromo-2-fluoro-6-metilbenzamida (11,0 g).

RMN 1H (400 MHz, CDCla) 57,22 (dt, J = 1,8, 0,8 Hz, 1H), 7,15 (dd, J = 9,0, 1,9 Hz, 1H), 6,06 - 5,60 (m, 2H), 2,44 (s, 3H); CLEM (m/z): 231,9 [M+H]+.

(Segunda etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadieron ácido ciclopropilborónico (6,11 g, 71,1 mmol), triciclohexilfosfina (0,80 g, 2,84 mmol), tris(dibencildenacetona)dipaladio (0) (0,43 g, 0,47 mmol) y carbonato potásico (19,65 g, 142,0 mmol) a una solución mezclada de 4-bromo-2-fluoro-6-metilbenzamida (11,0 g) en tolueno (110 ml) y agua (11 ml), y se mezclaron a 115 °C durante 14 h. Después de refrescarlo a temperatura ambiente, el precipitado se recogió por filtración, se lavó con éter y agua, después se secó para proporcionar 4-ciclopropil-2-fluoro-6-metilbenzamida (3,3 g).

El filtrado se extrajo con acetato de etilo (2x200 ml) y la capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó por cromatografía sobre gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 4-ciclopropil-2-fluoro-6-metilbenzamida (5,3 g).

1H RMN (400 MHz, CDCla) 86,80 - 6,70 (m, 1H), 6,60 (dd, J = 11,3, 1,6 Hz, 1H), 5,99 - 5,59 (m, 2H), 2,43 (s, 3H), 1,89 - 1,80 (m, 1H), 1,03 - 0,98 (m, 2H), 0,73 - 0,65 (m, 2H); CLEM (m/z): 194,0 [M+H]+.

(Tercera etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadió W,W-dimetilformamida dimetil acetal (7,0 g, 58,8 mmol) a una solución de 4-ciclopropil-2-fluoro-6-metilbenzamida (8,6 g, 44,5 mmol) en 2-metiltetrahidrofurano (100 ml) y se agitó a 60 °C durante 2 h. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida, y se añadió 2-metiltetrahidrofurano (10 ml) a este material bruto. A esta solución, se añadió gota a gota 1 mol/l de terc-butóxido de potasio en solución THF (68,1 ml, 68,1 mmol), y se mezcló a 65 °C durante 1 día. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se vertió a una solución de ácido clorhídrico 1 M (200 ml). A esta solución, se añadió alcohol isopropílico (300 ml), y luego los disolventes se retiraron a presión reducida. El precipitado se recogió por filtración para proporcionar 6-ciclopropil-8-fluoroisoquinolin-1 (2H)-ona (7,7 g).

1H RMN (400 MHz, DMSO- d6) 811,06 (s, 1H), 7,16 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,11 (dd, J = 7,1, 5,7 Hz, 1H), 6,88 (dd, J = 13,3, 1,7 Hz, 1H), 6,41 (dd, J = 7,1, 2,3 Hz, 1H), 2,07 - 1,95 (m, 1H), 1,08 - 1,01 (m, 2H), 0,86 - 0,79 (m, 2H); CLEM (m/z): 204,1 [M+H]+.

(Cuarta etapa)

En una atmosfera de nitrógeno, se añadieron 2- bromo-6-clorobenzaldehído (3,65 g, 16,63 mmol), carbonato potásico (3,54 g, 25,6 mmol) y yoduro de cobre (I) (0,49 g, 2,56 mmol) a la solución de 6-ciclopropil-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona (2,6 g, 12,8 mmol) en DMF (25 ml), y se agitó a 110 °C durante 1 día. La mezcla de la reacción se diluyó con acetato de etilo (200 ml), se filtró para retirar material insoluble, y después el filtrado se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 2-cloro-6-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoqu¡nol¡n-2(7H)-¡l)benzaldehído (2,7 g).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,18 (s, 1H), 7,84 - 7,78 (m, 1H), 7,75 (dd, J = 8,2, 1,3 Hz, 1H), 7,49 (dd, J = 7,8, I , 2 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,00 (dd, J = 13,3, 1,6 Hz, 1H), 6,64 (dd, J = 7,5, 2,2 Hz, 1H), 2,14-2,01 (m, 1H), 1,14-1,06 (m, 2H), 0,92-0,83 (m, 2H); CLEM (m/z): 342,1 [M+H]+.

(Quinta etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, una solución mezclada de 2-cloro-6-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(7H)-il)benzaldehído (2,5 g, 7,32 mmol) en DCM (26 ml) y alcohol isopropílico (13 ml) se enfrió a 0 °C. A esta solución, se añadió borohidruro de sodio (0,42 g, 11,0 mmol) a 0 °C, y después se agitó a 0 °C durante 2 h. El agua (50 ml) se añadió a la mezcla de la reacción, y se extrajo con acetato de etilo (2x50 ml). La capa orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para proporcionar 2-[3-cloro-2-(hidroximetil)fenil]-6-ciclopropil-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona (2,3 g).1

1H NMR (400 MHz, CDCla) 87,55 (dd, J = 8,1, 1,2 Hz, 1H), 7,40 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 7,15 (dd, J = 8,0, 1,2 Hz, 1H), 7,08 - 7,00 (m, 2H), 6,82 (dd, J = 12,7, 1,7 Hz, 1H), 6,51 (dd, J = 7,4, 2,1 Hz, 1H), 4,71 - 4,61 (m, 1H), 4,46 (d, J = I I , 9 Hz, 1H), 3,43 - 3,29 (m, 1H), 2,03 - 1,97 (m, 1H), 1,18 - 1,10 (m, 2H), 0,88 - 0,81 (m, 2H) ; CLEM (m/z): 343,9 [M+H]+.

(Sexta etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadieron piridina (2,36 ml, 29,3 mmol) y cloruro de acetilo (1,56 ml, 21,95 mmol) a una solución de

2-[3-cloro-2-(hidroximetil)fenil]-6-ciclopropil-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona (2,26 g, 6,59 mmol) en DCM (30 ml), y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. El agua (50 ml) se añadió a la mezcla de reacción, y se extrajo con acetato de etilo (2x50 ml). La capa orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 2-cloro-6-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(7tf)-il)acetato de bencilo (2,3 g).

1H NMR (400 MHz, CDCls) 67,53 (dd, J = 8,2, 1,2 Hz, 1H), 7,46 -7,39 (m, 1H), 7,22 (dd, J =7,9, 1,3 Hz, 1H), 7 ,04 6,98 (m, 2H), 6,80 (dd, J = 12,6, 1,7 Hz, 1H), 6,43 (dd, J = 7,4, 2,1 Hz, 1H), 5,25 (d, J = 12,5 Hz, 1H), 4,98 (d, J = 12,4 Hz, 1H), 2,02 - 1,96 (m, 1H), 1,96 (s, 3H), 1,16- 1,10 (m, 2H), 0,86-0,81 (m, 2H); CLEM (m/z): 386,0 [M+H]+. (Séptima etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadieron bis (pinacolato)diboro (9,48 g, 37,3 mmol), bis(dibencilidenacetona)paladio (0) (0,36 g, 0,62 mmol), 2,4,6-triisopropil-2'-(dicidohexilfosfino)bifenilo (0,59 g, 1,24 mmol) y acetato de potasio (3,66 g, 37,3 mmol) a una solución de 2-cloro-6-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(7HJ-il)acetato de bencilo (4,8 g, 12,44 mmol) en 1,4-dioxano (180 ml), y se agitó a 65 °C durante 16 h. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo (200 ml), se filtró a través de una almohadilla de Celite para retirar el material insoluble. El agua (200 ml) se añadió al filtrado, y se extrajo con acetato de etilo (2x200 ml). La capa orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó por cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo.

Al material oleaginoso, se añadió hexano y después el precipitado se recogió por filtración para proporcionar el compuesto del título (3,05 g).

1H NMR (400 MHz, CDCls) 67,93 (dd, J = 7,4, 1,4 Hz, 1H), 7,47 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,35 (dd, J = 7,8, 1,5 Hz, 1H), 7,02 (d, J =7,4 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,78 (dd, J = 12,7, 1,7 Hz, 1H), 6,40 (dd, J =7,4, 2,1 Hz, 1H), 5,45 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 5,03 (d, J = 11,9 Hz, 1H), 2,03 - 1,93 (m, 1H), 1,92 (s, 3H), 1,34 (s, 12H), 1,15 - 1,08 (m, 2H), 0,87 - 0,80 (m, 2H); CLEM (m/z): 478,2 [M+H]+.

Ejemplo de Referencia 2

Acetato de 2-[6-(terc-Butil)-8-fluoro-l-oxoisoquinolin-2(1HJ-il]-6-(4,4,5,5-tetrameti1-1,3,2-dioxaborolan-2-il)bencilo [Fórmula Química 9]

(Primera etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, 4-bromo-2-fluoro-6-metilbenzoato de metilo (1,0 g, 4,05 mmol), cloruro de níquel (II) (0,13 g, 0,81 mmol) y 1,3-diciclohexil-líí- imidazol-3-io (0,26 g, 0,81 mmol) se disolvieron en THF (10 ml). Esta solución se enfrió a 0 °C, y se añadió bromuro de terc-butilmagnesio 1 M (solución THF, 12,1 ml, 12,1 mmol) gota a gota durante un periodo de 10 min, y después se agitó a temperatura ambiente durante 24 h. La mezcla de la reacción se vertió en agua fría (200 ml), se acidificó a un pH 2 con ácido clorhídrico concentrado (ca. 5 ml), y después se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 4-(terc-butil)-2-fluoro-6-metilbenzoato de metilo (0,45 g).

El 4-(terc-butil)-2-fluoro-6-metilbenzoato de metilo obtenido (0,35 g) se disolvió en una solución mezclada de THF y agua (1:1, 10 ml), y se añadió una solución de hidróxido de litio 4 M en agua (2 ml) y luego se agitó a 60 °C durante 6 h. La mezcla de la reacción se diluyó con agua fría y el disolvente orgánico se retiró a presión reducida. Esta solución acuosa se acidificó a un pH 2 con solución de ácido clorhídrico concentrada y se extrajo con acetato de etilo. La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para proporcionar el material bruto de ácido 4-(terc-butil)-2-fluoro-6-metilbenzoico (0,35 g).

CLEM (m/z): 211,0[M+H]+.

(Segunda etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se disolvió ácido 4-(terc-butil)-2-fluoro-6-metilbenzoico (0,21 g, 0,10 mmol) en THF (10 ml). A esta solución, se añadió 1,1-carbonildiimidazol (0,21 g, 1,30 mmol) a 0 °C y después se agitó a 0 °C durante 2 h. A esta mezcla de la reacción, se añadió gota a gota una solución de amoniaco 28 % (10 ml) y luego se agitó a temperatura ambiente durante 2 días adicionales. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida, y se añadió una solución de ácido clorhídrico 6 M, y luego extraída con acetato de etilo 2 veces. La capa orgánica combinada se lavó con una solución de carbonato ácido de sodio saturado y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró para proporcionar 4-(terc-butil)-2- fluoro-6-metilbenzamida (0,20 g).

1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 87,85 (s, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,10 - 7,07 (m, 1H), 7,05 - 7,00 (m, 1H), 2,29 (s, 3H), 1,26 (s, 9H); CLEM (m/z): 210,1 [M+H]+.

(Tercera etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadió W,A/-dimetilformamida dimetil acetal (113 mg, 0,95 mmol) a una solución de 4-(terc-butil)-2-fluoro-6-metilbenzamida (150 mg, 0,72 mmol) en 2-metiltetrahidrofurano (10 ml) y se agitó a 60 °C durante 2 h. La mezcla de la reacción se concentró a presión reducida, y se añadió 2-metiltetrahidrofurano (10 ml) a este material bruto. A esta solución, se añadió gota a gota terc-butóxido de potasio 1M (solución THF, 1,1 ml, 1,1 mmol), y se agitó a 65 °C durante 1 día. Después de enfriarse a temperatura ambiente, la mezcla de la reacción se vertió a una solución de ácido clorhídrico 1 M (10 ml), y se extrajo con acetato de etilo 2 veces. La capa orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 6-(terc-butil)-8-fluoroisoquinolin-1('2H)-ona (85 mg).

1H RMN (400 MHz, CDCla) 810,84 (s, 1H), 7,28 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,18 (dd, J = 13,8, 1,8 Hz, 1H), 6,51 - 6,43 (m, 2H), 1,37 (s, 9H); CLEM (m/z): 220,1 [M+H]+.

(Cuarta etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadieron 2-bromo-6-clorobenzaldehido (330 mg, 2,01 mmol), carbonato de potasio (277 mg, 2,01 mmol) y yoduro de cobre (I) (382 mg, 2,01 mmol) a la solución de 6-(terc-butil)-8-fluoroisoquinolin-1 (2H)-ona (220 mg, 1,00 mmol) que se preparó de forma similar de acuerdo a al procedimiento descrito en el Tercera etapa en DMF (10 ml), y se agitó a 110 °C durante 1 día. La mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo, se filtró para retirar el material insoluble, y después el filtrado se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 2-cloro-6- [6-(terc-butil)-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-i1]benzaldehído (223 mg).

1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) 810,20 (s, 1H), 7,87 - 7,79 (m, 1H), 7,76 (dd, J = 8,2, 1,3 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,49 (dd, J = 7,6, 1,2 Hz, 1H), 7,43 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 7,38 - 7,26 (m, 1H), 6,74 (dd, J = 7,5, 2,2 Hz, 1H), 1,35 (s, 9H); CLEM (m/z): 358,1 [M+H]+.

(Quinta etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se enfrió una solución mezclada de 2-cloro-6-[6-(terc-butil)-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2 (■/H/)-il]benzaldehído (200 mg, 0,56 mmol) en DCM (3,7 ml) y alcohol isopropílico (1,9 ml) se enfrió a 0 °C. A esta solución, se le añadió borohidruro de sodio (32 mg, 0,84 mmol) a 0 °C después se agitó a temperatura ambiente durante 2 h. Se añadió agua a la mezcla de la reacción, y se extrajo con acetato de etilo 2 veces. La capa orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar 2-[3-cloro-2-(hidroximetil)fenil]-6-(terc-butil)-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona (160 mg).

1H RMN (400 MHz, CDCla) 87,55 (dd, J = 8,1, 1,2 Hz, 1H), 7,43- 7,36 (m, 1H), 7,32 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,23 (dd, J = 13,5, 1,8 Hz, 1H), 7,17 - 7,11 (m, 1H), 7,05 (d, J = 7,4, 1,7 Hz, 1H), 6,58 (dd, J = 7,4, 2,1 Hz, 1H), 4,75 - 4,61 (m, 1H), 4,54-4,34 (m, 1H), 3,35 (dd, J = 10,8, 2,5 Hz, 1H), 1,39 (s, 9H); CLEM (m/z): 360,2 [M+H]+.

(Sexta etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadieron piridina (180 jl, 2,24 mmol) y cloruro de acetilo cloruro de acetilo (119 |jl, 1,68 mmol) a una solución de 2-[3-cloro-2-(hidroximetil)fenil]-6-(terc-butil)-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona (160 mg, 0,89 mmol) en DCM (5 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 1 día. Se añadió agua a la mezcla de la reacción, se extrajo con acetato de etilo 2 veces. La capa orgánica combinada se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar acetato de 2-cloro-6-[6-(terc-butil)-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-il]bencilo (157 mg).

1H RMN (400 MHz, CDCls) 87,72 - 7,64 (m, 1H), 7,63 - 7,57 (m, 1H), 7,54 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,44 - 7,38 (m, 1H), 7,38 - 7,30 (m, 2H), 6,71 (dd, J = 7,4, 2,1 Hz, 1H), 5,08 (d, J = 12,4, 2,4 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 12,4, 2,5 Hz, 1H), 1,87 (s, 3H), 1,35 (s, 9H); CLEM (m/z): 402,2 [M+H]+.

(Séptima etapa)

En una atmósfera de nitrógeno, se añadió bis (pinacolato)diboro (284 mg, 1,12 mmol), bis(dibenciNidenacetona)paladio (0) (10,7 mg, 19,0 pinol), 2,4,6-triisopropil-2'-(dicidohexilfosfino)bifenilo (17,8 g, 37,0 pinol) y acetato de potasio (110 mg, 1,12 mmol) a la solución de 2-cloro-6-[6-(terc-butil)-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(7H>il]acetato de bencilo (150 mg, 0,37 mmol) en 1,4-dioxano (5,3 ml) y se agitó a 65 °C durante 16 h. La mezcla de la reacción se diluyó con acetato de etilo, se filtró a través de una almohadilla de Celite para retirar el material insoluble. Se añadió agua al filtrado y se extrajo con acetato de etilo 2 veces. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar el compuesto del título (105 mg).

1H RMN (400 MHz, CDCb) 57,97 - 7,87 (m, 1H), 7,48 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 7,34 (dd, J =7,9, 1,4 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,18 (dd, J = 13,5, 1,8 Hz, 1H), 7,04 (d ,J= 7 ,4 H z , 1H ),6 ,46 (dd ,J=7 ,4 , 2,1 Hz, 1H ),5 ,46(d ,J = 11,8 Hz, 1H), 5,02 (d, J = 11,8 Hz, 1H), 1,92 (s, 3H), 1,38 (s, 9H), 1,34 (s, 12H); CLEM (m/z): 494,3[M+H]+.

Ejemplo 1

2-(3-{4-Amino-6-[(1-metil-1H-pirazol-4-il)amino]-1,3,5-triazin-2-il}-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona

[Fórmula Química 10]

(Primera etapa)

A una solución de 2-amino-4,6-dicloro-1,3,5-triazina (513 mg, 3,11 mmol) en THF (10,3 ml), enfriado con baño de hielo, DIEA (1,08 ml, 6,22 mmol) y 1-metil-1H-pirazol-4-amino (332 mg, 3,42 mmol) en Th F solución (5,18 ml) se añadió lentamente, después se agitó a temperatura ambiente durante 2,5 h. El precipitado se recogió por filtración, se lavó con acetato de etilo, agua y etanol, y después se secó para proporcionar 6-cloro-N2-(1-metil-1H-pirazol- 4-il)-1,3,5-triazin-2,4-diamina (420 mg).

1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5 9,89 (s, 1H), 7,91 (s, 1H), 7,56 - 7,49 (m, 3H), 3,79 (s, 3H). ; CLEM (m/z): 225,9 [M+H]+.

(Segunda etapa)

A una solución mezclada de 2-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-il)-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)acetato de bencilo (141 mg, 0,29 mmol) que se proporcionó en el Ejemplo de Referencia 1 y 6-cloro-N2-(1-metil-2H-pirazol-4-il)-1,3,5-triazin-2,4-diamina (66,7 mg, 0,29 mmol) en dimetoxietano (5 ml), tetraquis(trifenilfosfino)paladio (0) (17 mg, 0,015 mmol) y carbonato de potasio (82 mg, 0,59 mmol) en solución de agua (1,67 ml) se añadieron y después se calentaron con el sintetizador de microondas a 110 °C durante 20 min. Se añadió agua a la mezcla de la reacción, se extrajo con acetato de etilo, después la capa orgánica se lavó con solución de bicarbonato ácido de sodio saturado y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con hexano/acetato de etilo para proporcionar una mezcla de 2-(3-{4-amino-6-[(1-metil-1H-pirazol-4-il)amino]-1,3,5-triazin-2-il}-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-8- fluoroisoquinolin-1 (2H)-ona y su producto acetilado. El material mezclado se disolvió en metanol (5 ml), carbonato de potasio (100 mg, 0,724 mmol) fue agregado y mezclado a temperatura ambiente por 2 h. La mezcla de la reacción se diluyó con agua, y el precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua y éter dietílico, y después se secó para proporcionar el compuesto del título (85 mg).

1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 5 9,71 (s, 1H), 8,00 (s, 1H), 7,94 - 7,82 (m, 1H), 7,61 - 7,42 (m, 3H), 7,37 - 7,26 (m, 4H), 7,00 (dd, J = 13,3, 1,7 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 7,5, 2,1 Hz, 1H), 5,25 - 5,13 (m, 1H), 4,55 - 4,44 (m, 1H), 4,16 -4,02 (m, 1H), 3,84 - 3,75 (m, 3H), 2,12 - 2,04 (m, 1H), 1,14 - 1,06 (m, 2H), 0,91 - 0,84 (m, 2H); CLEM (m/z): 499,2 [M+H]+.

Ejemplo 2

4-({4-Am¡no-6-[3-(6-c¡cloprop¡l-8-fluoro-1-oxo¡soqu¡nol¡n-2('7HJ-¡l)-2-(h¡drox¡met¡l)fen¡l]-1,3,5-tr¡az¡n-2-¡l}am¡no)-1-met¡l-1H-pirrol-2-carbonitrilo

[Fórmula Quím¡ca 11]

(Pr¡mera etapa)

A la suspens¡ón de clorh¡drato de 4-am¡no-1-met¡l-1H-p¡rrol-2-carboxam¡da (350 mg, 1,99 mmol) DIEA (0,7 ml, 3,99 mmol) en THF (5 ml), enfr¡ada con baño de h¡elo, DMF (2,5 ml) y 2-am¡no-4,6-d¡cloro-l,3,5-tr¡az¡na (299 mg, 1,81 mmol) se añad¡eron y se ag¡taron a temperatura amb¡ente durante 5 h. El prec¡p¡tado se recog¡ó por f¡ltrac¡ón, se lavó con acetato de et¡lo y agua, y después se secó para propordonar 4-[(4-am¡no-6-cloro-1,3,5-tr¡az¡n-2-¡l)am¡no]-1-met¡l-1H-p¡rrol-2-carboxam¡da (436 mg).

1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 510,00 - 9,43 (m, 1H), 7,46 (s, 1H), 7,40 (s, 1H), 7,29 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,21 - 6,79 (m, 2H), 6,77 - 6,65 (m, 1H), 3,80 (s, 3H). ; CLEM (m/z): 268,1 [M+H]+.

(Segunda etapa)

A una soluc¡ón de 4-[(4-am¡no-6-cloro-1,3,5-tr¡az¡n-2-¡l)am¡no]-1-met¡l-1H-p¡rrol-2-carboxam¡da (130 mg, 0,49 mmol) en DCM (5 ml), enfr¡ada con baño de h¡elo, se añad¡eron TEA (0,1 ml, 0,73 mmol) y anhídr¡do tr¡fluoroacét¡co (0,075 ml, 0,53 mmol) y se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 2 h. A una mezcla de la reacc¡ón, se añad¡ó una cant¡dad suplementar¡a de TEA (0,1 ml, 0,73 mmol) y anhídr¡do tr¡fluoroacét¡co (0,075 ml, 0,53 mmol) y se ag¡tó a temperatura amb¡ente durante 24 h ad¡c¡onales. Se añad¡ó agua a la mezcla de la reacc¡ón y se extrajo con acetato de et¡lo, después la capa orgán¡ca se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sod¡o, se filtró y se concentró. El mater¡al bruto se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en gel de síl¡ce, se eluyó con hexano/acetato de et¡lo para proporc¡onar 4-[(4-am¡no-6-cloro-1,3,5-tr¡az¡n-2-¡l) am¡no]-1-met¡l-1H-p¡rrol-2-carbon¡tr¡lo (100 mg).

1H NMR (400 MHz, DMSO-da) 5 10,05 - 9,71 (m, 1H), 7,55 (s, 2H), 7,46 - 7,23 (m, 1H), 7,03 - 6,76 (m, 1H), 3,72 (s, 3H); CLEM (m/z): 250,1 [M+H]+.

(Tercera etapa)

A una soluc¡ón mezclada de 2-(6-c¡cloprop¡l-8-fluoro-1-oxo¡soqu¡nol¡n-2(1H)-¡l)-6-(4,4,5,5-tetramet¡l-1,3,2-d¡oxaborolan-2-¡l)acetato de benc¡lo (45 mg, 0,094 mmol) que se proporc¡onó en el Ejemplo de Referenc¡a 1 y 4-[(4-am¡no-6-cloro-1, 3,5-tr¡az¡n-2-¡l)am¡no]-1-met¡l-1H-p¡rrol-2-carbon¡tr¡lo (23,5 mg, 0,094 mmol) en d¡metox¡etano (2 ml), tetraqu¡s(tr¡fen¡lfosf¡na)palad¡o (0) (5,4 mg, 0,0047 mmol) y carbonato de potas¡o (26 mg, 0,19 mmol) en soluc¡ón de agua (0,67 ml) se añad¡eron y se calentaron con el s¡ntet¡zador de m¡croondas a 110 °C durante 20 m¡n. Se añad¡ó agua a la mezcla de la reacc¡ón, y se extrajo con acetato de et¡lo, después la capa orgán¡ca se lavó con agua y salmuera, se secó sobre sulfato de sod¡o, se filtró y se concentró. El mater¡al bruto se pur¡f¡có med¡ante cromatografía en gel de síl¡ce, se eluyó con hexano/acetato de et¡lo para proporc¡onar una mezcla de 4-({4-am¡no-6-[3-(6-c¡cloprop¡l-8-fluoro-1-oxo¡soqu¡nol¡n-2(1HHl)-2-(h¡drox¡met¡l)fen¡l]-1,3,5-tr¡az¡n-2-¡l}am¡no)-1-met¡l-1H-p¡rrol-2-carbon¡tr¡lo y su producto acet¡lado. El mater¡al mezclado se d¡solv¡ó en metanol (5 ml), se añad¡ó carbonato de potas¡o (100 mg, 0,724 mmol) y se mezcló a 60 °C durante 1 h. Se añad¡ó agua a la mezcla de la reacc¡ón, y el prec¡p¡tado se recog¡ó med¡ante f¡ltrac¡ón, se lavó con agua y hexano, y después se secó para proporc¡onar el compuesto del título (18 mg).

1H RMN (400 MHz, DMSO-da) 5 10,15 - 9,19 (m, 1H), 7,87 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,65 - 7,50 (m, 2H), 7,49 - 7,41 (m, 1H), 7,40-7,30 (m, 3H), 7,28 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,04 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,00 (dd, J = 13,3, 1,6 Hz, 1H), 6,62 (dd, J = 7,5, 2,1 Hz, 1H), 5,23-4,91 (m, 1H), 4,50 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 4 ,19-3,94 (m, 1H), 3,74 (s, 3H), 2 ,16-2,00 (m, 1H), 1,15 -1,03 (m, 2H), 0,95 - 0,77 (m, 2 H ); CLEM (m/z): 523,2 [M+H]+.

Ejemplo 3-33

Cada uno de los Ejemplos, que ¡ncluyen tanto compuestos de acuerdo con la ¡nvenc¡ón como compuestos de referenc¡a, mostrados en las s¡gu¡entes [Tabla 1-1] a [Tabla 1-3] se preparó de acuerdo con el proced¡m¡ento descr¡to en los Ejemplos anter¡ores o proced¡m¡ento mod¡f¡cado b¡en conoc¡do en la técn¡ca de la quím¡ca orgán¡ca de ser necesario, usando materiales de partida apropiados (esos materiales se obtienen de fuentes comerciales, o se preparan mediante procedimientos documentados o modificaciones de procedimientos documentados conocidos por personas expertas en la materia).

Los datos fisicoquímicos de cada compuesto se mostraron en las siguientes [Tabla 2-1] a [Tabla 2-2].

T l 1-1

T l 1-21

T l 1-

T l 2-11

[T l 2-21 (DMSO-d6) 89,71 (s, 1H), 8,28 (s, 1H), 8,03

7,45 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,38 - 7,25 (m, 3H),

5,24 -4,98 (m, 1H), 4,60 -4,44 (m, 1H), 4,16

2H), 1,14 -1,06 (m, 2H), 0,91 - 0,84 (m, 2H)._

Ejemplo de Referencia 34

[Método para la producción del compuesto (I) correspondiente al profármaco del compuesto de Ejemplo 1]

Octato de 2-{4-amino-6-[(1-metil-1H-pirazol-4-il)amino]-1,3,5-triazin-2-il}-6-(6-ciclopropil-8-fluoro-1-oxoisoquinolin-2(1H)-il)bencilo

[Fórmula Química 12]

A una solución de 2-(3-{4-amino-6-[(1-metil-1H-pirazol-4-il)amino]-1,3,5-triazin-2-il}-2-(hidroximetil)fenil)-6-ciclopropil-8-fluoroisoquinolin-1(2H)-ona (0.2 g, 0,4 mmol) que se proporcionó en el Ejemplo 1 en DMF (8 ml), se añadieron gota a gota piridina (0,13 ml, 1,6 mmol) y cloruro de n-octanoílo (0,14 ml, 0,8 mmol) y se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas. Se añadió agua (50 ml) a la mezcla de la reacción, y se extrajo con acetato de etilo (3x50 ml). La capa orgánica combinada se lavó con agua, solución de ácido clorhídrico 1 M, solución de carbonato ácido de sodio saturado y salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, se filtró y se concentró. El material bruto se purificó mediante cromatografía en gel de sílice, se eluyó con cloroformo/metanol para proporcionar el compuesto del título (201 mg).

1H RMN (400 MHz, DMSO-de) 59,58 (s, 1H), 7,99 (s, 1H), 7,88 - 7,73 (m, 1H), 7,69 - 7,55 (m, 2H), 7,52 - 7,42 (m, 1H), 7,37 (dd, J = 20,5, 7,4 Hz, 1H), 7,26 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 7,20 - 7,10 (m, 2H), 6,99 (dd, J = 13,2, 1,6 Hz, 1H), 6,60 (dd, J = 7,5, 2,0 Hz, 1H), 5,51 - 5,37 (m, 1H), 5,17 - 5,04 (m, 1H), 3,79 (s, 3H), 2,12 - 2,02 (m, 1H), 1,94 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,27- 1,00 (m, 10H), 1,02- 0,90 (m, 2H), 0,91 -0,76 (m, 5H) ;CLEM (m/z): 625,15 [M+H]+.

Ejemplos de Referencia 35-84

Cada uno de los correspondientes compuestos del Ejemplo (I) como un profármaco del compuesto de Ejemplo 1 mostrado en las siguientes [Tabla 3-1] a [Tabla 3-6] se preparó de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 34 anterior o procedimiento modificado bien conocido en la técnica de la química orgánica, de ser necesario, usando materiales de partida apropiados (esos materiales se obtienen de fuentes comerciales, o se preparan mediante procedimientos documentados o modificaciones de procedimientos documentados conocidos por personas expertas en la materia).

Los datos fisicoquímicos de cada compuesto se mostraron en las siguientes [Tabla 4-1] a [Tabla 4-4].

T l -1

T l -2

irazol-

T l -1

T l -4

T l -

T l -

T l 4-11

T l 4-21

T l 4-1

T l 4-4

Ejemplo de Prueba 1

Prueba de inhibición de la actividad de BTK

(Preparación del BTK defosforilado)

El BTK defosforilado se obtuvo añadiendo A proteína fosfatasa (fabricada por New England BioLabs Inc., Código N.° P0753S) y MnCl2 en 10 U/pg y 2 mM, respectivamente a una solución enzimática de proteína BTK biotinilada BTN-BTK (Fabricado por Cama Biosciences, Inc.), reaccionando la mezcla a 4 °C durante la noche, y retirando la A proteína fosfatasa mediante cromatografía en gel de agarosa de anticuerpo anti DYKDDDDK-etiqueta, seguido de un intercambio de tampón usando una Columna de Desalación 10DG.

(Método de medición de la actividad de la Quinasa)

La actividad de la quinasa se midió utilizando QuickScout Screening Assist (marca comercial) MSA (kit disponible en el mercado fabricado por Cama Biosciences, Inc.) por el método de ensayo de desplazamiento de movilidad (MSA). El sustrato de la reacción de la quinasa fue un péptido SRCtido marcado con FITC incluido en el kit. Se usó un tampón de ensayo [HEPES 20 mM, 0,01 % Triton X-100 (Marca Registrada), ditiotreitol 2 mM, pH 7,5] y se ajustó a sustrato 4 pM, MgCh 20 mM y ATP 200 pm para obtener una solución de mezcla de sustrato. La solución de enzima también se preparó diluyendo la BTK desfosforilada a 0,6 nM usando un tampón de ensayo. La solución de 10 mM del compuesto de prueba en DMSO se diluyó adicionalmente con DMSO a 10 niveles de la concentración (0,00003 mM, 0,0001 mM, 0,0003 mM, 0,001 mM, 0,003 mM, 0,01 mM, 0,03 mM, 0,1 mM, 0,3 mM, 1 mM), cada uno de los cuales se sometió a una dilución 25 veces con el tampón de ensayo para obtener las soluciones de fármacos (soluciones al 4 % de DMSO). 5 pl de la solución de fármaco o una solución control (tampón de ensayo- DMSO al 4), 5 pl de la solución de mezcla de sustrato y 10 pl de la solución de enzima se mezclaron en los pocillos de una placa de polipropileno de 384 pocillos y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se inactivaron añadiendo 60 pl del tampón de terminación incluido en el kit. Posteriormente, las cantidades de los sustratos (S) y el sustrato fosforilado (P) en la solución de la reacción se midieron usando el sistema LabChip EZ Reader II (fabricado por Caliper Life Sciences) de acuerdo con el protocolo del kit de ensayo.

(Método de evaluación de la actividad inhibidora de BTK)

Las alturas de los picos del sustrato aislado y el sustrato fosforilado se representaron como S y P, respectivamente, y también se midió el blanco que contenía el tampón de ensayo en lugar de la solución enzimática.

La tasa de inhibición (%) del compuesto de prueba se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación;

Tasa de Inhibición (%) = (1-(C-A)/(B-A)) * 100

donde, A, B y C representan P/(P+S) de del pocillo del blanco, P/(P+S) de del pocillo control y P/(P+S) del pocillo que contiene el compuesto, respectivamente.

El valor IC50 se calculó a través de un análisis de regresión de la tasa de inhibición (%) y la concentración del compuesto de prueba (valor logarítmico).

(Resultados de la Evaluación)

Ya que el grupo de compuestos de los Ejemplos mostraron los valores IC50 de 10 nM o menos contra BTK defosforilado, se reveló que el Compuesto (I) de la invención tiene un potente efecto inhibidor de BTK.

Ejemplo de Prueba 2

Prueba de Inhibición de actividad auto-fosforilación intracelular de BTK

(Cultivo de células a usarse)

Se cultivaron células Ramos (2G6.4C10, ATCC N.1° CRL-1923) en un matraz T75 que contiene medio RPMI-1640 (GIBCO, n.° A10491-01) complementado con 10 % FBS (AusGene) y 5 % penicilina-estreptomicina (Nacalai Tesque, Inc.) (en lo sucesivo en el presente documento denominado medio de crecimiento) en una incubadora al 5 % CO2.

(Adición del compuesto a probarse)

Las células Ramos cultivadas se diluyeron a una densidad celular de 7,5*106 células/ml con un RPMI-1640 libre de suero (en lo sucesivo en el presente documento denominado medio) y se mantuvo a 37 °C durante 45 minutos. La suspensión celular se dispensó en alícuotas de 1 ml en tubos de 2,0 ml. La solución de 0,3 mM de la sustancia de prueba en DMSO se diluyó con el medio para hacer una solución de compuesto de prueba de 0,9 pM, 500 pl de los que después se añadió a los tubos y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 1 hora en presencia del compuesto de prueba en la concentración final de 0,3 pM. A partir de ahí, el anticuerpo anti-IgM (Invitrogen, H15100) el cual ha sido diluido con el medio se añadió a una concentración final de 10 ug/ml, y la incubación se llevó a cabo a 37 °C durante 10 minutos.

(Extracción de proteínas)

A los gránulos obtenidos recuperando las células a través de centrifugación, se añadieron 100 pl del tampón de lisis [RIPA Buffer(*1) (Cell Signaling Technology, Inc.) suplementado con 1 % Phosphatase inhibitor Cacktail 3 (Sigma Corporation, N.° P0044), 1 % Cóctel de inhibidor de fosfatasa (Nacalai Tesque, Inc., N.° 07575) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF)] y se agitó suavemente y después se permitió que reposara durante 10 minutos. El sobrenadante se recuperó por centrifugación (15.000 rpm, 15 minutos) y el nivel de proteína se cuantificó. La porción se mezcló con el tampón de muestra-SDS, se dejó reaccionar durante 5 minutos a 95 °C para desnaturalizar la proteína, de este modo se obtiene una solución de muestra. Cada 5 pl de las soluciones de muestra se aplicó a cada pocillo que contiene un gradiente del 4 al 20 % de gel de acrilamida (COSMO BIO Co., Ltd., N.° 414879) y se llevó a cabo una electroforesis. De este modo, el Sistema de transferencia de gel de iBlot (Life Technologies Corporation) se usó para transferir las proteínas en el gel a la membrana PVDF.

(Detección de BTK o BTK fosforilada)

La membrana PVDF después de la transferencia se bloqueó con un Reactivo bloqueador óptimo ECL 2 % (GE Healthcare) y a partir de ahí, la reacción se llevó a cabo durante la noche a 4 °C usando anticuerpo de anti-BTK de ratón (laboratorio de transducción BD, N.° 611116) o anticuerpo de anti- BTK fosforilado de ratón (pY223, EPITOMICS, N.° 2207-1) como un anticuerpo primario. El anticuerpo primario sin reaccionar se lavó con un tampón TBST (Tris-HCl 10 mM (pH7,5), NaCl 150 mM, 0,1 % Tween 20) y luego la reacción se llevó a cabo durante 1 hora a temperatura ambiente en un tampón TBST suplementado con Reactivo bloqueador óptimo ECL de 2 % utilizando un anticuerpo de cabra IgG anti ratón marcado con HRP (Life Technologies Corporation, N.° 62-6520) o anticuerpo de cabra IgG anti-conejo (Life Technologies Corporation, N.° 65-6120) como un anticuerpo secundario. Después de lavar el anticuerpo secundario que sin reaccionar con el tampón TBST, ECL Prime Western Blotting Detection System (GE Healthcare) se usó para llevar a cabo una reacción de acuerdo con el protocolo adjunto, y luego las bandas respectivas como quimioluminiscencias se detectaron con una cámara CCD (ATTO, Light-Capture II). Las bandas detectadas se sometieron a densitometría (ATTO CS Analyzer ver3.0) a ser representadas como valores numéricos, y la tasa de inhibición (%) se calculó basándose en la intensidad de la banda en cada grupo, mientras se toma la luminiscencia de la banda BTK fosforilada en el grupo sin compuesto añadido con estímulo IgM en 100 % y la luminiscencia de la banda BTK fosforilada en el grupo sin compuesto añadido sin estímulo IgM en 0 %. Cada banda BTK fosforilada se corrigió basándose en el BTK total.

Las combinaciones de anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios empleados en esta prueba y las magnitudes de dilución de los mismos se muestran a continuación.

T l 1

Los resultados obtenidos en una concentración de compuesto de prueba de 0,3 pM se muestran en la Tabla 6. La actividad inhibidora de auto-fosforilación intracelular BTK se indicó con la marca "***" cuando el 70 % o más, con una marca "**" cuando el 50 % o más y menos del 70 %, y con la marca “*” cuando el 30 % o más y menos del 50 %.

En esta prueba, los compuestos de la presente invención inhibieron la actividad de auto-fosforilación intracelular BTK potentemente en una concentración de 0,3 pM como se muestra en la Tabla 6.

T l 1

Los resultados del Ejemplo de Prueba 2 indican que los compuestos de la invención tienen efectos inhibidores potentes también en "la actividad de autofosforilación intracelular de BTK".

Ejemplo de Prueba 3

Prueba de inhibición en el cambio del ion calcio intracelular

La inhibición intracelular de BTK mediante los compuestos de la invención se verificó mediante la medición de los efectos de los compuestos de la invención en "influjo de calcio intracelular de anticuerpo anti IgM por estimulación inducida de BCR".

(Adición de una suspensión de células e indicador de calcio)

Un día antes de la medición, las células Ramos se cultivaron después de suspenderse nuevamente a una densidad celular de 1,0 * 106 células/ml en un medio de crecimiento fresco (medio de crecimiento como el utilizado en Ejemplo de Prueba 2) y las células se recuperaron al día siguiente mediante centrifugación y se lavaron con un medio RPMI- 1640 complementado con penicilina-estreptomicina al 5 % (Nacalai Tesque, Inc.) (Medio 1). Estas células se suspendieron nuevamente a una densidad celular de 2,0 * 106 células/ml en medio RPMI-1640 suplementado con 1 % Ultra Low IgG FBS (GIBCO, n.° 16250) y penicilina-estreptomicina al 5 % (Nacalai Tesque, Inc.) (Medio 2), y en lo sucesivo cada 100 pl de la suspensión de células se añadió a cada cavidad de una microplaca recubierta de polilisina (BD BioCoat™, n.° 356692), se centrifugó (700 rpm, 3 minutos) y después se incubó durante 1 hora en una incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C. Cada 100 pl de un indicador de calcio de solución cargadora de tinte Fluo-8NW (AAT Bioquest, n.° 36315) se añadió a cada pocillo, y la incubación se continuó posteriormente durante 30 minutos en la incubadora con CO2 al 5 % a 37 °C.

(Adición al compuesto a ser probado)

Una solución madre de 10 mM de un compuesto de prueba en DMSO se diluyó adicionalmente con DMSO a 6 concentraciones (1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 mM), y una solución libre del compuesto de prueba se empleó como un control. Después cada una se sometió a una dilución de 47,6 veces con Medio 2 y cada 10 pl se añadió a cada pocillo de la placa anteriormente mencionada, la cual se incubó a 37 °C durante 10 minutos (concentraciones finales del compuesto de prueba: 1, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01, 0,003, y 0 pM).

(Medición de la concentración de ion de calcio)

La concentración del ion de calcio intracelular de las células Ramos se midió como una intensidad fluorescente del indicador de calcio Fluo-8NW usando un lector de microplaca (SynergyHl) (Ex/Em = 490/525 nm). Después de medir el punto de referencia por 15 segundos, se añadieron 5o pl del anticuerpo anti-IgM (Invitrogen, n.° H15100) diluido con Medio 2 a 10,4 pg/ml a cada cavidad descrita previamente (concentración final de 2,0 pg/ml) para dar efecto a la estimulación BCR, y luego se continuó la medición posteriormente durante 150 segundos.

La Figura 1 muestra los resultados del compuesto del Ejemplo 1 como representativo. Como se muestra en la Figura 1, el compuesto de la invención inhibió "un cambio en el ion de calcio intracelular inducido por estimulación BCR" en una manera dependiente de la concentración desde una concentración baja, indicando que la señal BCR se inhibió eficazmente.

Ejemplo de Prueba 4

Prueba de la reacción de anafilaxia cutánea pasiva en un ratón

Ya que BTK juega un papel importante en la transmisión de la señal FcsRI en un mastocito, se investigó si un mastocito implicado en una reacción alérgica inmediata, a saber, reacción de anafilaxia cutánea pasiva (reacción PCA), que es una reacción alérgica inmediata que implica mastocitos, se inhibió por la administración del compuesto.

(Preparación de la solución del compuesto de prueba)

DMSO, polietilenglicol 400 (PEGn.°400, Nacalai Tesque, Inc. n.° 28215-95), y 30 % (p/v) de solución acuosa de hidroxipropil-(p-ciclodextrina (HP-p-CD, Sigma Corporation, n.° 332607-500) se añadieron exitosamente al compuesto de prueba en este orden, y se mezclaron minuciosamente para preparar una solución del compuesto de prueba (composición del disolvente: 5 % de solución del compuesto de prueba en DMSO, 30 % PEGn.°400, 65 % HP-(3-CD [30 % (p/v) de solución acuosa]). En el grupo de control del disolvente, se usó una solución DMSO en lugar de una solución del compuesto de prueba en DMSo .

(Reacción de PCA)

Un anticuerpo monoclonal anti DNP-IgE (50 pg/ml, Santa Cruz Biotechnology, Inc., n.° sc-69695) fue intradérmicamente administrada a ambos aurículas en un ratón ICR bajo anestesia sistémica (10 pl/sitio). Después de 46 horas, el disolvente o la solución del compuesto de prueba disuelto en un disolvente para lograr la dosis de prueba (3,0 mg/ml) se proporcionó oralmente (10 ml/peso corporal del ratón (kg)). Después de 2 horas, se dio un 0,5 % de tinte azul de Evans (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., n.° 054-04062) - que contiene DNP-BSA (1 mg/ml, LSL, n.°LG-3017) por vía intravenosa (0,25 ml/ratón) para inducir una reacción alérgica. Después de 30 minutos, el animal se sacrificó bajo anestesia sistémica mediante dislocación cervical y ambas aurículas se recolectaron. El par de aurículas recogidas estaban impregnados con una solución 1M KOH (0,7 ml) y se permitió que reposara durante la noche a 37 °C para disolver las aurículas. Por consiguiente, a la suspensión obtenida, se añadió 9,3 ml de acetona-0,2 M solución de mezcla de ácido fosfórico (13:5) y los insolubles restantes se retiraron por centrifugación (3000 rpm, 10 minutos) y 0,2 pm filtración. Se midió la absorción del filtrado resultante a 620 nm y se usó como un índice de nivel de derrame del tinte. El experimento previamente mencionado se llevó a cabo usando 5 ratones en cada grupo, del cual el valor de la media luego sirvió como base para la evaluación del nivel de derrame del tinte.

Los resultados se muestran en la Figura 2. Como se muestra en la Figura 2, el compuesto del Ejemplo 1 inhibió significativamente el derrame del tinte hacia dentro de las aurículas al compararse con el grupo del disolvente. Por consiguiente, se confirmó el efecto inhibidor sobre una reacción de anafilaxia cutánea pasiva (reacción PCA).

Ejemplo de Prueba 5

Efecto en ratón con artritis inducida por colágeno

Se mezclaron adyuvante de Freund Incompleto (Chondrex, Inc., n.° 7002) suplementado con M.Tuberculosis H37 Ra, Desiccated (Beckton Dickinson and Company, n.° 231141) a 2,5 mg/ml y Colágeno Bovino Tipo II, solución 2 mg/ml (Chondrex, Inc., n.°20022) se mezclaron en una relación 1:1 para formar una emulsión.

Tres grupos de DBA/1J ratones (10 animales/grupo) (6-semanas de nacidos, machos) recibieron 0,1 ml por animal de la emulsión que se proporcionó en pequeñas porciones al Día 0 y Día 21 mediante inyección intradérmica en la base de la cola, de este modo logrando la inmunización. El disolvente o la solución de compuesto de prueba fue proporcionada dos veces al día oralmente todos los días desde el Día 18 hasta el Día 36 (dosis de compuesto de prueba en los grupos respectivos: 0 mg/kg, 30 mg/kg, 60 mg/kg). La solución de tratamiento se preparó con el disolvente similar de manera similar al Ejemplo de Prueba 4.

Después del estímulo en el Día 21, el estado de la aparición de la artritis en cada extremidad fue anotada visualmente una vez en 2 o 3 días de acuerdo al criterio mostrado en la Tabla 7. Las anotaciones de las cuatro extremidades fueron totalizadas en cada base del ratón, y el valor de la media de 10 animales en cada grupo se representó como una puntuación de artritis (normal "0" hasta máximo "16").

T l 71

El compuesto del Ejemplo 1 el cual es un compuesto de la invención inhibió la aparición de artritis de una manera de una dependiente de dosis como se muestra en la Figura 3. Al mismo tiempo, fue capaz de eludir cualquier signo tóxico tales como pérdida de peso. Basado en estos resultados, se probó que el compuesto de la invención tiene un excelente efecto anti-inflamatorio y también es altamente posible que tenga excelente seguridad.

Ejemplo de Prueba 6

Efecto en rata con artritis inducida por colágeno

Adyuvante de Freund Incompleto (Sigma-Aldrich, n.° F5506) y Colágeno Bovino Tipo II, Solución de 4 mg/ml (Sichuan University, Lot.08H0497) se mezclaron a una relación 1:1 para formar una emulsión. Tres grupos de ratas Lewis (10 animales/grupo) (5-6 semanas, hembras) recibieron 0,5 ml de la emulsión por animal, emulsión que fue proporcionada en pequeñas porciones en el Día 0 y Día 7 mediante inyección intradérmica en 3 sitios, uno en la base de la cola (0,1 ml), y el resto de los dos lugares (0,2 ml/sitio) fueron en la espalda de la rata cerca de la base de la cola, de esta manera logrando la inmunización. El disolvente o la solución del compuesto de prueba fue proporcionada dos veces al día oralmente todos los días desde el Día 0 hasta el Día 20 (dosis del compuesto de prueba en los respectivos grupos: 0 mg/kg, 30 mg/kg, 60 mg/kg). La solución de tratamiento se preparó con un disolvente similar de una manera similar al Ejemplo de Prueba 4.

Después del estímulo del Día 7, el estado de la aparición de la artritis en cada extremidad fue anotado visualmente dos veces a la semana de acuerdo a los criterios mostrados en la Tabla 8. Las anotaciones de las cuatro extremidades fueron totalizadas en cada fundamento de la rata, y el valor de la media de 10 animales en cada grupo se representó como una puntuación de artritis (normal "0" hasta un máximo "16").

T l 1

El compuesto del Ejemplo 1 que es un compuesto de la invención inhibió la aparición de artritis de una manera dependiente de la dosis como se muestra en la Figura 4. Al mismo tiempo, fue capaz de eludir cualquier signo tóxico tal como la pérdida de peso. Basado en estos resultados, se probó que el compuesto de la invención tiene un excelente efecto anti-inflamatorio y también es altamente posible que tenga una seguridad excelente.

Ejemplo de Prueba 7

Concentración de plasma sanguíneo después de la administración oral al ratón (prueba de verificación de metabolito de la profármaco)

Generalmente, es preferible que los profármacos se metabolicen a fármacos activos rápidamente después de la administración oral, seguido de la absorción desde el tracto gastrointestinal. Por tanto, se investiga si el compuesto (I) de la presente invención, el cual corresponde al profármaco, se metabolizó a la forma activa rápidamente en el cuerpo.

Un ratón ICR (3 animales / grupo) (6 semanas, machos) recibió la suspensión del compuesto de prueba suspendido en un disolvente (solución acuosa metilcelulosa 0,5 %) para lograr la dosis de prueba (30 mg/kg) por administración oral. Después de 1 hora, bajo anestesia sistémica, se recogieron muestras de sangre a través de punción cardiaca usando una jeringa recubierta de heparina, después las muestras se centrifugaron (4 °C, 10000 rpm, 10 min.) para recoger las muestras de plasma. Las muestras de plasma (5 j l ) y la solución de metanol que contiene patrón interno (495 j l) se transfirieron a una placa de pocillos con filtro y se mezclaron. Después se centrifugaron (4 °C, 3000 rpm, 3 min.) para retirar la proteína desnaturalizada y después los filtrados (extractos) se recogieron. Para la curva de calibración, se preparó la solución de metanol de metabolitos que contiene patrón interno, luego se mezcló con muestras de plasma del ratón no tratado, y después se trató de manera similar a la placa de pocillos con filtro. Para la curva de calibración del profármaco (fármaco sin cambio), se usó la solución de calibración convencional, que mezcló una solución de metanol del profármaco y solución de metanol de patrón interno.

Las concentraciones del profármaco y su metabolito, Compuesto de Ejemplo 1, del extracto se determinaron por CL/EM (cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas), utilizando curvas patrón la relación del área pico del patrón interno.

T l

ND: No Detectado

Como se muestra en la Tabla 9, los compuestos del profármaco de la presente invención no se observaron en sangre después de la administración oral, pero el compuesto de Ejemplo 1, se observó su metabolito correspondiente. Basado en estos resultados, los compuestos del profármaco de la presente invención fueron verificados que esos compuestos se metabolizaron rápidamente en el cuerpo a una forma activa.

Aplicabilidad industrial

El compuesto proporcionado por la presente invención es útil como un fármaco preventivo o terapéutico (composición farmacéutica) o su profármaco para enfermedades que se sabe que están implicadas en respuestas celulares anormales a través de BTK, por ejemplo, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades óseas y cánceres tales como linfoma. El compuesto también es útil, como inhibidor de BTK, para que los reactivos se usen en pruebas e investigaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un derivado de triazina representado por la siguiente fórmula (I):

donde

R1 es un grupo hidroximetilo,

R2 es un átomo de hidrógeno o un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido,

A es un átomo de nitrógeno o C-R3,

R3 es un átomo de hidrógeno, grupo ciano, un grupo acilo sustituido o no sustituido, un grupo sulfonilo sustituido o no sustituido, o un grupo carbamoílo sustituido o no sustituido y

R4 es un grupo alquilo inferior sustituido o no sustituido o un grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

donde dicho grupo alquilo inferior es un grupo alquilo lineal, ramificado o cíclico que tiene 1 a 3 átomos de carbono

y donde los sustituyentes del grupo alquilo inferior sustituido, el grupo acilo sustituido, el grupo sulfonilo sustituido, el grupo carbamoílo sustituido y el grupo cicloalquilo sustituido son uno o más sustituyentes seleccionados de un átomo de halógeno, un grupo alquilo, un grupo alcoxi, un grupo amino, un grupo nitro, un grupo ciano, un grupo hidroxi, un grupo alquilamino, un grupo carbamoílo, un grupo carboxilo, un grupo formilo, un grupo acetilo, un grupo mesilo, un grupo benzoilo, un grupo acilamino y un grupo aciloxi.

2. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 1, donde R4 es un grupo cicloalquilo sustituido o no sustituido,

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

3. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 2, donde R4 es un grupo ciclopropilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

4. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 1, donde R2 es un grupo metilo o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

5. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 1, donde R2 es un átomo de hidrógeno o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

6. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 1, donde A es un átomo de nitrógeno o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 1, donde A es C-R3 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8. El derivado de triazina de acuerdo con la reivindicación 1, donde el derivado de triazina se selecciona del grupo que consiste en:

Ċ

y

o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos.

9. Una composición farmacéutica que comprende el derivado de triazina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10. El derivado de triazina de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en terapia.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9 para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad relacionada con una respuesta celular anormal a través de una tirosina quinasa de Bruton en un sujeto en necesidad del mismo.

12. La composición farmacéutica para su uso como se reivindica en la reivindicación 11, donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, enfermedades óseas, cáncer, linfoma y artritis.