ES2701064T3 - Novedoso anticuerpo antirreceptor IL-23 humano - Google Patents

Novedoso anticuerpo antirreceptor IL-23 humano Download PDF

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Abstract

Un anticuerpo anti-IL-23R humano seleccionado entre cualquiera una de las siguientes (i) a (iv): (i) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18; (ii) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6; (iii) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6; y (iv) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una region variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una region variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoacidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18, o, un fragmento de anticuerpo anti-IL-23R humano que es un fragmento de region variable de cadena unica (scFv), Fab, Fab' o F(ab')2, que comprende la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera del anticuerpo y una cualquiera de (i) a (iv) y mantiene la actividad de dicho anticuerpo.

Description

DESCRIPCIÓN
Novedoso anticuerpo antirreceptor IL-23 humano
[Campo técnico]
La presente invención se refiere a un novedoso anticuerpo antirreceptor IL-23 humano. Específicamente, el anticuerpo antirreceptor IL-23 humano novedoso de la presente invención tiene una actividad excelente y/o reactividad cruzada a especies en comparación con anticuerpos antirreceptor IL-23 humano convencionales.
[Antecedentes de la técnica]
La interleucina-23 (también denominada como IL-23) es una citocina producida por las células dentríticas y similares, y es una citocina heterodimérica que consiste en dos subunidades, es decir, una subunidad p19 que es un componente específico para la IL-23 y la subunidad p40 que también es un componente de la IL-12 (documento no de patente 1). La IL-23 se une al receptor de la IL-23 (también denominado como IL-23R) para transducir señales en células (documento no de patente 2). La IL-23R es un receptor heterodimérico que consiste en una subunidad de IL-23R y la subunidad de IL-12Rp1 que también es un componente del receptor de IL-12. Asimismo, se conoce que el receptor de IL-12 es un complejo de una subunidad de IL-12Rp1 y una subunidad de IL-12Rp2 y que la IL-23 no se une al receptor de IL-12 (documento de no patente 1).
Se conoce que la IL-23 está profundamente implicada en enfermedades, que incluye psoriasis, enfermedades inflamatorias del intestino (EII) tal como la enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU), lupus eritematoso diseminado (LED), artritis reumatoide (AR), espondilitis anquilosante (EA), enfermedad de Behcet, cáncer y enfermedades oftálmicas tales como uveítis, ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad y manifestación ocular de la enfermedad de Basedow. La psoriasis es un trastorno de queratinización de la piel crónico y se ha observado un aumento en la expresión de IL-23 en la piel de pacientes con psoriasis (documento no de patente 3).
La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) es una enfermedad crónica recurrente, que se representa por la enfermedad de Crohn (EC) o colitis ulcerosa (CU) y causa el deterioro en la función o estructura del tracto digestivo. Se conoce que los macrófagos de la lamina propria en los sitios inflamatorios del tracto intestinal de pacientes con EC producen de forma activa IL-23 (documento no de patente 4) y se considera que los macrófagos de la lamina propria inducen citocinas, que incluyen IL-21, EL-22 y IL-17, a partir de células inmunes y similares, para contribuir en la patología inflamatoria de la EII (documento no de patente 5).
El lupus eritematoso diseminado (LED) hace que aparezcan diversos síntomas en diversos sitios por el cuerpo entero debido a la estimulación del sistema inmune, de este modo, haciendo pensar de forma simultánea o sucesiva que los síntomas estén relacionados con la inflamación, que incluye fiebre y enfermedad sistémica, así como diversos síntomas que aparecen en articulaciones, piel, órganos intestinales, etc. Se hizo saber que existe una correlación positiva entre la patología del LED y el número de linfocitos T positivos de IL-23R (documento no de patente 6). Asimismo, se conoce que la IL-23 en la sangre de pacientes con l Ed es significativamente superior que en personales normales (documento no de patente 7). Esto sugiere que la IL-23 está implicada en el LED.
La espondilitis anquilosante (EA) es una enfermedad inflamatoria crónica que provoca lesiones principalmente en las articulaciones vertebrales y sacroilíacas. Se conoce que la IL-23 en la sangre de pacientes con EA es significativamente superior que en personales normales, sugiriendo que la IL-23 está implicada en la patología de la EA (documento no de patente 8).
La enfermedad de Behcet es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por la inflamación de los vasos sanguíneos de diversos tamaños, es decir, vasculitis, y se piensa que una anormalidad del sistema inmune y la activación de neutrófilos están implicadas en la patología. Esta anormalidad recurrente en los vasos sanguíneos puede durar desde varios días hasta varios meses y puede reaparecer varias veces al año. En pacientes con la enfermedad de Behcet, La IL-23 está significativamente correlacionada con la actividad de la enfermedad y la estimulación de la expresión de IL-23 se observa en el suero de pacientes que tienen uveítis, cuya patología se refiere a la de la enfermedad de Behcet (documento de no patente 9), que sugiere que la IL-23 está implicada en esta patología.
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune crónica que causa la deformación de las articulaciones y dolor intenso. La IL-23 aumenta en la sinovia y el suero de pacientes con AR (documento de no patente 10) y el nivel de IL-23 en el suero de pacientes administrados con bloqueados de TNF que es un fármaco para el tratamiento de la RA se correlaciona con el grado de la patología (documento de no patente 11). Asimismo, un anticuerpo anti-IL-23R en la membrana sinovial de pacientes con RA inhibe la producción de TNF-a y IL-6 (documento no de patente 12), sugiriendo que la IL-23 está implicada en la patología.
La uveítis, ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad y manifestación ocular de la enfermedad de Basedow son enfermedades oftálmicas en las que hay relacionada inflamación. La expresión de la proteína o el gen de la IL-23 aumenta en el suero de pacientes con uveítis, pacientes con epitelio conjuntival de ojo seco, pacientes con humor acuoso de degeneración macular relacionada con la edad y suero de pacientes afectados con manifestación ocular de enfermedad de Basedow (documento de no patente 13, 14, 15, 16), sugiriendo que la IL-23 está implicada en estas patologías.
Con respecto al cáncer, la IL-23 está relacionada con el crecimiento y progresión del cáncer (documento no de patente 17) y en ratones con déficit de IL-23 con cáncer injertado, la progresión del cáncer se suprime (documento no de patente 18). Esto sugiere que la IL-23 está implicada en la patología.
Por tanto, cuando puede desarrollarse un anticuerpo monoclonal que tiene una actividad de unión específicamente a la IL-23R para inhibir diversas acciones de IL-23, se espera que sea útil para el tratamiento, prevención o diagnóstico de diversas enfermedades en las cuales la IL-23 está implicada en la patología de la enfermedad.
Los anticuerpos que se han estudiado hasta la fecha y en los que se ha informado que muestran el efecto de inhibición de la función de la IL-23R humana incluye el anticuerpo monoclonal de ratón m20D7 (documento de patente 1) o su anticuerpo monoclonal humanizado hum20D7 (documento de patente 1), el anticuerpo monoclonal de rata 8B10 (documento de patente 1) o su anticuerpo monoclonal humanizado (documento de patente 2). Entre ellos, se ha revisado hum20D7 con el mayor detalle y el efecto del mismo sobre las respuestas de células reales resulta claro a partir de los resultados de los experimentos basado en la inhibición de la señalización de las células Kit 225 que son células cultivadas establecidas que expresan el receptor de IL-23.
Sin embargo, los anticuerpos convencionales no parecen tener una actividad neutralizante suficiente para la señalización de IL-23 en células desde el punto de vista de eficacia.
Los factores principales que determinan la dosificación eficaz de un fármaco de anticuerpo incluyen la actividad de anticuerpo para inhibir la unión de ligando-receptor y la cantidad de antígeno presente en el cuerpo. Un aumento de la actividad de un anticuerpo para inhibir la unión parece ser una mejora muy beneficiosa que conduce a una disminución en la dosificación del anticuerpo, dando como resultado una disminución de la carga financiera o gastos médicos de los pacientes. Asimismo, incluso si un anticuerpo tiene una alta actividad de unión para un antígeno (un ligando, un receptor, etc.), esto no significa que el anticuerpo puede mostrar altamente la actividad neutralizante deseada. Esto es porque el anticuerpo debe ocupar un sitio adecuado en un antígeno para que el anticuerpo inhiba firmemente la unión de ligando-receptor. En otras palabras, la resistencia de la actividad neutralizante del anticuerpo resulta importante cuando se evalúa el efecto del fármaco de anticuerpo.
Asimismo, la evaluación de seguridad usando animales es muy importante en el desarrollo de fármacos médicos. La directriz internacional ICH-S6 relacionada con el desarrollo de fármacos médicos incluye la siguiente descripción: "Los programas de evaluación de seguridad deben incluir normalmente dos especies relevantes. Sin embargo, en determinados casos justificados puede ser suficiente una especie relevante (por ejemplo, cuando solo puede identificarse una especie relevante o cuando se entiende bien la actividad biológica del biofarmacéutico)". Como se ha descrito anteriormente, en el desarrollo de fármacos médicos, se requiere someter a ensayo uno o más tipos de especies animales distintas a la de los seres humanos; sin embargo, para llevar a cabo un ensayo sobre una especie animal cuando se está desarrollando un fármaco de anticuerpo, se requiere que el anticuerpo tenga una reactividad cruzada con antígenos derivados de especies animales distintas a las de los seres humanos. Sin embargo, generalmente no es fácil obtener un anticuerpo monoclonal que tiene una alta selectividad y mantiene una alta actividad mientras que muestra la reactividad cruzada de especies.
Por lo tanto, se requiere la obtención de un anticuerpo antirreceptor IL-23 que tenga una fuerte actividad neutralizada en comparación con anticuerpo convencionales y muestre una reactividad cruzada de especies para su uso en el tratamiento, prevención o diagnóstico de diversas especies mediante la administración del anticuerpo a humanos.
[Técnica relacionada]
[Documento de patente]
[Documento de patente 1] WO2008/106134
[Documento de patente 2] WO2010/027767
[Documento de no patente]
[Documento de no patente 1] Oppmann B y col, Immunity. noviembre de 2000; 13(5): 715-25
[Documento de no patente 2] Parham C y col, J Immunol. 1 de junio de 2002; 168(11): 5699-708 [Documento de no patente 3] Lee E y col, J Exp Med. 5 de enero de 2004; 199(1): 125-30
[Documento de no patente 4] Kamada N y col, J Clin Invest. 2008; 118: 2269-2280
[Documento de no patente 5] Sarra M y col, Inflamm Bowel Dis. Octubre de 2010; 16(10): 1808-1813 [Documento de no patente 6] Puwipirom H y col, Arthritis Res Ther. 29 nov 2010; 12(6): R215
[Documento de no patente 7] Mok MY y col, J Rheumatol. Octubre de 2010; 37(10): 2046-52
[Documento de no patente 8] Mei Y y col, Clin Rheumatol. febrero de 2011; 30(2): 269-73
[Documento de no patente 9] Habibagahi Z y col, Mod Rheumatol. abril de 2010; 20(2): 154-9
[Documento de no patente 10] Kim HR y col, Rheumatology (Oxford). Enero de 2007; 46(1): 57-6
[Documento de no patente 11] Kageyama Y y col, Rheumatol Int. diciembre de 2007; 28(2): 137-43
[Documento de no patente 12] Hillyer P y col, Rheumatology (Oxford). diciembre de 2009; 48(12): 1581-9
[Documento de no patente 13] Chi W y col, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008 Jul; 49(7): 3058-64.
[Documento de no patente 14] De Paiva CS y col, Mucosal Immunol. mayo de 2009; 2(3): 243-53.
[Documento de no patente 15] Sasaki S y col, Invest Ophthalmol Vis Sci. 5 de junio de 2012; 53(7): 3424-30.
[Documento de no patente 16] Kim SE y col, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. Octubre de 2012; 250(10): 1521­ 6.
[Documento de no patente 17] rivennikov SI y col, Nature. 8 nov 2012; 491(7423): 254-8.
[Documento de no patente 18] Langowski JL y col, Nature. 27 de julio de 2006; 442(7101): 461-5.
[Divulgación de la invención]
[Problema a resolver con la invención]
Un objetivo de la presente invención es proporcionar anticuerpos anti-IL-23R humano que tengan una actividad y/o una reactividad cruzada a especies excelente en comparación con los anticuerpos anti-IL-23R humano convencionales.
[Medios de resolución de los problemas]
En consecuencia, la presente invención incluye las siguientes invenciones como sustancias y métodos medicamente o industrialmente útiles.
(1) Un anticuerpo anti-IL-23R humano seleccionado entre cualquiera una de las siguientes 1) a 4):
1) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18;
2) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6;
3) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6; y
4) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18, o, un fragmento de anticuerpo anti-IL-23R humano que es un fragmento de región variable de cadena única (scFv), Fab, Fab' o F(ab')2, que comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo y una cualquiera de 1) a 4) y mantiene la actividad de dicho anticuerpo.
(2) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (1) anterior, que comprende región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y la región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18.
(3) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (1) anterior, que comprende región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y la región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6.
(4) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (1) anterior, que comprende región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y la región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6.
(5) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (1) anterior, que comprende región variable de la cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y la región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18.
(6) El anticuerpo anti-IL-23R humano de cualquiera una de (1) a (5) anteriores, en el que la región constante de la cadena pesada del anticuerpo es una región constante de IgY1 humano.
(7) El anticuerpo anti-IL-23R humano de cualquiera una de (1) a (5) anteriores, en el que la región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante de IgK humano.
(8) El anticuerpo anti-IL-23R humano de cualquiera una de (1) a (5) anteriores, en el que la región constante de cadena pesada del anticuerpo es una región constante de IgY1 humano y la región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante de IgK humano.
(9) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (2) anterior, que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20.
(10) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (3) anterior, que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
(11) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (4) anterior, que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:16 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
(12) El anticuerpo anti-IL-23R humano de (5) anterior, que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO; 16 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20.
(13) Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de (1) a (12) anteriores y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de (1) a (12) anteriores.
(14) Una célula huésped que se selecciona entre el grupo que consiste en los siguientes (a) y (b):
(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de (9) a (12) anteriores y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de cualquiera una de (9) a (12); y
(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de (9) a (12) anteriores y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de (9) a (12) anteriores.
(15) Un método para producir un anticuerpo anti-IL-23R humano, comprendiendo el método una etapa de cultivo de la célula huésped de (14) y de expresión del anticuerpo anti-IL-23R humano.
(16) Un anticuerpo anti-IL-23R humano producido mediante un método que comprende una etapa de cultivo de la célula huésped de (14) y de expresión del anticuerpo anti-IL-23R humano.
[Efectos de la invención]
La presente invención proporciona anticuerpos anti-IL-23R humano que tengan una actividad y/o una reactividad cruzada a especies excelente en comparación con los anticuerpos anti-IL-23R humano convencionales. Los anticuerpos anti-IL-23R humano de la presente invención tienen un efecto potente de supresión de células inmunes mediante la inhibición de la función del IL-23R humano y son útiles para prevenir o tratar diversas enfermedades en las cuales la IL-23 humana está implicada en la patología de la enfermedad. Asimismo, tales anticuerpos anti-IL-23R humano de la presente invención proporcionan mejoras superiores en aplicaciones clínicas tales como reducción de la dosificación, de la extensión del intervalo de administración, mejora del modo de administración (por ejemplo, una inyección subcutánea) y similares, y contribuyen en gran medida en el tratamiento de la eficacia y mejora en la conformidad del paciente. Además, los anticuerpos tienen reactividad cruzada con las especies con antígenos derivados de animales (en particular animales que se usan en el desarrollo de fármacos médicos) distintos a humanos y, por lo tanto, permiten que se lleven a cabo ensayos de seguridad usando animales que se requieren para desarrollar el anticuerpo en un fármaco médico. Por tanto, los anticuerpos contribuyen en gran medida para asegurar la seguridad de los humanos a los que se les administran los mismos.
[Realizaciones para llevar a cabo la invención]
En lo sucesivo en este documento, la presente invención se describirá con detalle.
Los presentes inventores han demostrado una ingenuidad y consideración considerable para la producción del anticuerpo anti-IL-23R humano y, como resultado, tuvieron éxito en la producción de un anticuerpo anti-IL-23R humano que tiene una actividad y/o una reactividad cruzada a especies excelente en comparación con los anticuerpos anti-IL-23R humano convencionales.
La estructura básica de una molécula de anticuerpo se comparte entre todas las clases de anticuerpos y está configurada con una cadena pesada que tiene un peso molecular de 50000 a 70000 y una cadena ligera que tiene un peso molecular de 20000 a 30000. La cadena pesada normalmente consiste en una cadena polipeptídica que comprende aproximadamente 440 aminoácidos. Las cadenas pesadas tienen estructuras características de distintas clases y se denominan las cadenas y, M, a, 5 y £ que se corresponden a IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE. Además, IgG aparece como IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4, y las cadenas correspondientes se denominan y1, Y2, y3 y Y4, respectivamente. Una cadena ligera normalmente consiste en una cadena polipeptídica que comprende aproximadamente 220 aminoácidos, dos tipos de los cuales, tipo L y tipo K, son conocidos y se denominan las cadenas A y k, respectivamente. Con respecto a la configuración peptídica de la estructura básica de una molécula de anticuerpo, dos cadenas pesadas homólogas y dos cadenas ligeras homólogos están unidas a través de enlaces disulfuro (enlaces S-S) y enlaces no covalentes y el peso molecular es de 150000 a 190000. Los dos tipos de cadenas ligeras son capaces de emparejarse con cualquier cadena pesada. Cada molécula de anticuerpo siempre consiste en dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas.
Hay cuatro enlaces S-S intracatenarios en cada cadena pesada (cinco enlaces para las cadenas |j y e) y dos en una cadena ligera; se forma un bucle por 100 a 110 restos de aminoácidos y esta estructura estérica es similar entre los bucles y se denomina como una unidad o dominio estructural. Para tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras, la secuencia de aminoácidos del dominio emplazado en el extremo N del mismo no es constante, incluso en un patrón de referencia a partir de la misma clase (subclase) de la misma especie animal y este dominio se denomina la región variable. Cada uno de los dominios se denomina una región variable de cadena pesada (Vh) y una región variable de cadena ligera (Vl), respectivamente. La secuencia de aminoácidos sobre el extremo C-terminal del mismo es casi constante en cada clase o subclase y se denomina una región constante (cada uno de los dominios se denomina Ch1, Ch2, Ch3 y Cl, respectivamente).
El sitio determinante antigénico de un anticuerpo se configura con Vh y Vl, y la especificidad de unión depende de la secuencia de aminoácidos de este sitio. Por otro lado, las actividades biológicas tales como unión a complementos o diversas células refleja las diferencias en la estructura de región constante entre las diversas clases de lg. La variabilidad en las regiones variables de la cadena ligera y cadenas pesadas está mayormente limitada a tres pequeñas regiones hipervariables que existen en ambas cadenas y estas regiones se denominan regiones determinantes de complementariedad (CDR; CDR1, CDR2 y CDR3, empezando desde el extremo N-terminal). La porción restante de la región variable se denomina una región marco conservada (FR) y es relativamente constante.
El anticuerpo anti-IL-23R humano construido de forma exitosa por los presentes inventores es un anticuerpo anti-IL-23R humano que tiene cualquiera una de las siguientes características:
1) Un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18.
2) Un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6.
3) Un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6.
4) Un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18.
Específicamente, los presentes inventores construyeron anticuerpos usando una tecnología de desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos, ratón "VelocImmune " [tecnología de anticuerpos de VelocImmune; Regeneron Inc. (Patente de los EE.UU. n.° 6596541)] y se seleccionaron los anticuerpos usando ensayos para diversas actividades biológicas y para propiedades físicas, teniendo éxito, de este modo, en la identificación del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención. En la tecnología de VelocImmune, se someten a ensayo ratones transgénicos en los cuales las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobulina endógena se reemplazan con las regiones variables humanas correspondientes con el antígeno de interés (por ejemplo, IL-23R humano) y se recuperan las células linfáticas de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas se funden con células de mieloma de ratón para preparar hibridomas. Las células de hibridoma se seleccionan para identificar células de hibridomas que producen esos anticuerpos que se unen específicamente al antígeno de interés. Los anticuerpos que se producen en el presente documento son anticuerpos que tienen regiones variables de anticuerpos humanos y las regiones constantes de anticuerpos de ratón (también denominados como anticuerpos quiméricos). A continuación, si se identifica el anticuerpo que se une específicamente al antígeno de interés, los ADN que codifican las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se aíslan de las células de hibridoma y se enlazan a los ADN que codifican las regiones constantes de la cadena pesada y la cadena ligera de una clase deseada de anticuerpo humano, respectivamente. El ADN resultante que codifica la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo se expresa en las células (por ejemplo, células CHO) para producir una molécula de anticuerpo. La cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo producido por el anterior método son la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo "humano completo" derivado de un gen de inmunoglobulina humano.
El anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención puede prepararse fácilmente por los expertos en la técnica basándose en la información de secuencia sobre la región variable de cadena pesada y región variable de cadena ligera de la misma que se desvela en el presente documento, utilizando un método comúnmente conocido en la técnica. Preferentemente, en anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención puede prepararse como un anticuerpo humano completo enlazando la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del mismo a la región constante de cadena pesada y la región constante de cadena ligera de un anticuerpo humano, respectivamente. Específicamente, se prepara un fragmento de gen de la región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de base que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención (SEQ ID NO:10 o SEQ ID NO:14), y un fragmento de gen de región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de base que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención (SEQ ID NO:6 o SEQ ID NO:18). A continuación, los genes de la región variable se unen a un gen de región constante en una clase apropiada de anticuerpo humano para preparar un gen de anticuerpo humano completo. A continuación, este gen de anticuerpo se une a un vector de expresión apropiado y se introduce en una célula cultivada. Por último, esta célula cultivada se cultiva, mediante la cual se puede obtener un anticuerpo monoclonal a partir del sobrenadante de cultivo.
El cada fragmento de gen que tiene secuencia de base que codifica la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y la región de variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención puede sintetizarse usando un método de síntesis de gen conocido en la técnica, basándose en, por ejemplo, secuencias de base diseñadas basándose en las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera. Ejemplos de este método de síntesis incluyen diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como el método de síntesis de gen de anticuerpo descrito en el documento WO90/07861. Asimismo, una vez se ha obtenido el fragmento de gen de región variable del anticuerpo de la presente invención, puede introducirse una mutación en el sitio especificado del fragmento de gen, obteniendo, de este modo, los otros anticuerpos de la presente invención. Ejemplos del método para introducir la mutación incluyen diversos métodos conocidos por los expertos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida a sitio (Actuales protocolos en biología molecular edit. Ausubel y col. (1987) Publish. John Wiley & Sons Sección 8.1-8.5).
A continuación, los fragmentos de gen anteriormente descritos se unen a la región constante del anticuerpo humano para preparar un gen de anticuerpo humano completo. Aunque puede escogerse cualquier subclase de la región constante (por ejemplo, la región constante de y1, y2, y3 o y4 para la cadena pesada o la región constante de la cadena A o k para la cadena ligera) como la región constante del anticuerpo humano usado, IgYl humano como la región contante de la cadena pesada y IgK humano como la región constante de la cadena ligera, puede utilizarse preferentemente.
Posteriormente a la preparación de este gen de anticuerpo humano completo, puede realizarse la introducción del gen de anticuerpo en un vector de expresión, la introducción del vector de expresión en células cultivadas, el cultivo de las células cultivadas, purificación del anticuerpo y similares usando diversos métodos conocidos en la técnica.
Ejemplos del vector de expresión que está unido al gen de anticuerpo obtenido de este modo incluyen vector GS pEE6.4 o pEE12.4 (Lonza Biologics), aunque sin limitación específicamente, siempre y cuando puedan expresar un gen de anticuerpo. Asimismo, el fragmento de gen de región variable anterior puede introducirse en un vector de expresión que ya tiene un gen de región contante de lg humano tal como AG-y1 o AG-k (por ejemplo, véase el documento WO94/20632) para expresar el gen de anticuerpo.
El vector de expresión anteriormente descrito se introduce en células cultivadas mediante, por ejemplo, un método de fosfato de calcio o un método de electroporación y similares.
Ejemplos de las células cultivadas en las que se introduce el vector de expresión incluyen células cultivadas tales como células CHO-K1SV, células CHO-DG44 y células 293 y estas células pueden cultivarse mediante un método convencional.
Después del anteriormente descrito, cultivo, el anticuerpo acumulado en el sobrenadante de cultivo puede purificarse mediante diversas cromatografías de columna, por ejemplo, varios procesos cromatográficos de columna usando una columna de proteína A o proteína G.
El anticuerpo anti-IL-23R humano, de la presente invención es un anticuerpo que se une al IL-23R humano. Ejemplos de un método para medir la actividad de unión del anticuerpo anti-IL-23R humano obtenido para IL-23R humano incluyen métodos tales como ELISA (ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) o FACS (separación de células activadas por fluorescencia). Por ejemplo, cuando se usa ELISA, una proteína de fusión del dominio extracelular del IL-23R humano SEQ ID n O:1) y Fc de inmunoglobulina se inmoviliza sobre una placa ELISA y el anticuerpo anti-IL-23R humano se añade a la misma y se deja reaccionar con el mismo. A continuación, la proteína de fusión se deja reaccionar con un anticuerpo secundario tal como un anticuerpo anti-lgG marcado con una enzima tal como peroxidasa de rábano picante (HRP) y se lava. A continuación, se mide la actividad usando un reactivo detector de la actividad [por ejemplo, un sustrato ELISA de quimioluminiscencia BM (POD) (Roche Diagnostics) cuando se usa un marcador de HRP] o similar, confirmando, de este modo, la unión del anticuerpo secundario. Además, la reactividad cruzada de especies del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención puede evaluarse usando IL-23R derivado de otros animales (por ejemplo, IL-23R de mono) para medir la actividad de unión para ellos.
Además, el anticuerpo anti-IL-23R humano, de la presente invención tiene una actividad neutralizante frente al IL-23R humano. Como se usa en el presente documento, la "actividad neutralizante" del anticuerpo significa una actividad para inhibir cualquier actividad biológica resultante del IL-23R mediante la unión a IL-23R y puede evaluarse sobre una o más actividades biológicas del IL-23R como índice. Ejemplos de tal actividad neutralizante incluyen la actividad de inhibición de la proliferación de las células Kit 225 que son células sensibles a IL-23R y la actividad de inhibición de fosforilación de STAT3 estimulado con IL-23 humano y la actividad neutralizante puede evaluarse usando un método tal como se describe en los ejemplos a continuación.
Ejemplos de métodos para diversas estabilidades (por ejemplo, estabilidad térmica, estabilidad de almacenamiento a largo plazo y estabilidad de alta concentración) del anticuerpo anti-IL-23R humano incluyen calorimetría diferencial de barrido o un método de medición de formación de agregados durante el almacenamiento del anticuerpo.
Preferentemente, el anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención puede obtenerse fácilmente sintetizando ADN que comprende una secuencia de base que codifica la región variable de la cadena pesada de la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 o 14 y ADN que comprende una secuencia de base que codifica la región variable de cadena ligera de la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID n O:6 o 18 y uniendo los ADN a una clase adecuada de genes de región constante del anticuerpo humano, preferentemente un gen de región constante de IgYl humano para la cadena pesada y un gen de región constante de IgK humano para la cadena ligera, para construir un gen de anticuerpo humano completo usando un método conocido en la técnica e introduciendo el gen de anticuerpo humano completo en un vector de expresión, introduciendo el vector de expresión en una célula cultivada, cultivando la célula cultivada y purificando un anticuerpo recogido a partir de la célula cultivada usando diversos métodos conocidos en la técnica. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica las secuencias de aminoácidos de región variable de la cadena pesada que se muestran por la SEQ ID NO:10 o 14 comprende las secuencias de base que se muestran por la SEQ ID NO:9 o 13, respectivamente. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica las secuencias de aminoácidos de región variable de la cadena ligera que se muestran por la SEQ ID n O:6 o 18 comprende las secuencias de base que se muestran por la SEQ ID NO:5 o 17, respectivamente.
Una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región constante de IgY1 humano, es una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:12. Una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena ligera que se muestra mediante la SEQ ID NO:18 y una región constante IgK humano, es una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 12 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:11. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:19. Ejemplos del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención, que comprenden una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20, incluyen un anticuerpo 25-3-2 humano completo tal como se describe en los ejemplos a continuación.
Una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región constante de IgY1 humano, es una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:12. Una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena ligera que se muestra mediante la SEQ ID NO:6 y una región constante IgK humano, es una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 12 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:11. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:7. Ejemplos del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención, que comprenden una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8, incluyen un anticuerpo 25-3-1 humano completo tal como se describe en los ejemplos a continuación.
Una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región constante de IgY1 humano, es una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:16. Una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena ligera que se muestra mediante la SEQ ID NO:6 y una región constante IgK humano, es una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 16 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:15. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:7. Ejemplos del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención, que comprenden una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:16 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8, incluyen un anticuerpo 25-3-3 humano completo tal como se describe en los ejemplos a continuación.
Una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena pesada que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región constante de IgY1 humano, es una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:16. Una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano preferente de la presente invención, que comprende la región variable de la cadena ligera que se muestra mediante la SEQ ID NO:18 y una región constante IgK humano, es una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena pesada de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO: 16 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:15. Preferentemente, el ADN que comprende una secuencia de base que codifica una cadena ligera de anticuerpo anti-IL-23R humano que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20 comprende la secuencia de base que se muestra mediante la SEQ ID NO:19. Ejemplos del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención, que comprenden una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:l6 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20, incluyen un anticuerpo 25-3-4 humano completo tal como se describe en los ejemplos a continuación.
La presente invención también comprende fragmentos de anticuerpo anti-IL-23R humano tales como un fragmento de región variable de cadena única (scFv), Fab, Fab' y F(ab')2, que comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo de la presente invención y mantiene la actividad de dicho anticuerpo. Cualquier experto en la técnica puede construir un anticuerpo de fusión del anticuerpo anti-IL-23R humano o fragmento de anticuerpo y otro péptido o proteína y también puede construir un anticuerpo modificado que tiene un agente modificante unido al mismo, basándose en la presente invención. El otro péptido o proteína usada para la fusión no está específicamente limitado, siempre y cuando no reduzca la actividad de unión del anticuerpo; ejemplos del mismo incluyen albúmina de suero humana, diversos péptidos marcadores, péptido de motivo de hélice artificial, proteínas de unión de maltosa, glutatión S transferasa, diversas toxinas, otros péptidos o proteínas capaces de promover la multimerización y similares. El agente modificador utilizado para la modificación no queda específicamente limitado, siempre y cuando no reduzca la actividad de unión del anticuerpo; ejemplos del mismo incluyen polietilenglicol, cadenas de azúcar, fosfolípidos, liposomas, compuestos de bajo peso molecular y similares.
El anticuerpo anti-IL-23R humano obtenido de este modo puede purificarse adicionalmente según se requiera y, a continuación formularse según un método convencional. Puede usarse para el tratamiento de enfermedades, que incluyen psoriasis, artritis reumatoide, lupus eritematoso diseminado (LED), enfermedad inflamatoria del intestino (EII) tal como la enfermedad de Crohn o colitis ulcerosa, espondilitis anquilosante (EA), enfermedad de Behcet, cáncer y enfermedades oftálmicas tales como uveítis, ojo seco, degeneración macular relacionada con la edad y manifestación ocular de la enfermedad de Basedow y similares, en las que el IL-23R está implicado en la patología de la enfermedad.
El anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención puede usarse preferentemente como un agente para tratar una enfermedad oftálmica, una enfermedad inflamatoria del intestino o psoriasis. Ejemplos de la formulación de este agente de tratamiento y similares incluyen formulaciones parenterales tales como agentes inyectables, agentes de infusión y gotas oculares, que se administran preferentemente mediante administración intravenosa, administración subcutánea, administración intraocular, administración de gotas oculares y similares. En el proceso de formulación, pueden usarse portadores o aditivos que encajan con estas formulaciones dentro de un intervalo farmacéuticamente aceptable.
La cantidad del anticuerpo anti-IL-23R humano de la invención añadido en la formulación anteriormente descrita varía dependiendo de la gravedad de los síntomas del paciente o edad, la forma de dosificación de la formulación usada o el título de unión del anticuerpo y similares; por ejemplo, puede usarse aproximadamente de 0,001 mg/kg a 100 mg/kg del anticuerpo.
La presente invención también proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica el anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención y un vector de expresión que comprende el mismo. La presente invención también proporciona un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada el anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención y un vector de expresión que comprende ambas de ellas. El vector de expresión de la presente invención no queda específicamente limitado, siempre y cuando puede expresar un gen que codifique el anticuerpo de la presente invención o su región de variable de cadena pesada y/o región variable de cadena ligera en diversas células huésped de células procariotas y/o células eucariotas y produzca estos polipéptidos. Ejemplos del mismo incluyen vectores plásmidos, vectores virales (por ejemplo, adenovirus, retrovirus) y similares. Preferentemente, el vector de expresión de la presente invención comprende un polinucleótido que comprende o bien una secuencia que codifica la cadena pesada o la cadena ligera del anteriormente descrito anticuerpo de la presente invención o tanto un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención como un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención.
El vector de expresión de la presente invención puede comprender un promotor operativamente unido al gen que codifica el anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención o la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del mismo. Ejemplos de un promotor para expresar un gen que codifique el anticuerpo de la presente invención o la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera del mismo en una bacteria incluyen promotor de Trp, promotor de lac, promotor de recA, promotor de APL, promotor de lpp, un promotor de tac y similares, cuando el huésped es una bacteria del género Escherichia. Ejemplos de un promotor para la expresión en levadura incluyen promotor de PH05, promotor de PGK, promotor de GAP y promotor de ADH y algunos ejemplos de un promotor para la expresión en el género Bacillus incluyen promotor de SL01, un promotor de SP02, un promotor de penP y similares. Cuando el huésped es una célula eucariota tal como una célula de mamífero, ejemplos del promotor incluyen promotor derivado de SV40, promotor de retrovirus, promotor de choque térmico y similares.
Cuando se usa una bacteria, en particular Escherichia coli, como la célula huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender además un codón de iniciación, un codón de terminación, una región terminadora y una unidad replicable. Cuando se usa una levadura, una célula de animal o célula de insecto como huésped, el vector de expresión de la presente invención puede comprender un codón de iniciación y un codón de parada. En este caso, puede comprender una secuencia de control, regiones no codificadoras en el extremo 5' y extremo 3' de un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o la región variable de la cadena pesada o región variable de la cadena ligera del mismo, una secuencia de señal de secreción, una zona de unión de corte y empalme, una región de poliadenilación, una unidad replicable o similar. Asimismo, puede comprender un marcador de selección que es de uso común (por ejemplo, gen resistente a tetraciclina, gen resistente a ampicilina, gen resistente a kanamicina, gen resistente a neomicina, gen de ácido dihidrofólico reductasa) según el uso previsto.
La presente invención también proporcionar un transformante introducido con un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un gen que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención. Tal transformante puede prepararse mediante, por ejemplo, la transformación de una célula huésped con el vector de expresión de la presente invención. Una célula huésped que se utiliza para preparar el transformante no queda específicamente limitada, siempre cuando sea adecuada para el vector de expresión anteriormente mencionada y sea transformable; ejemplos de la misma incluyen diversas células tales como células naturales o líneas de células establecidas artificialmente que se usan en el campo técnico de la presente invención (por ejemplo, bacterias (bacterias del género Escherichia, bacterias del género Bacillus), levaduras (el género Saccharomyces, el género Pichia y similares), células de animal o células de insecto (por ejemplo, Sf9) y similares. La transformación puede realizarse mediante cualquier método conocido per se.
El transformante de la presente invención es una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anteriormente descrito anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención, o una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo anteriormente mencionado de la presente invención y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención.
La presente invención también proporciona un método para producir el anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención, comprendiendo el método expresar en una célula huésped un gen que codifica el anticuerpo de la presente invención o un gen que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y un gen que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención, es decir, usando dicho transformante. Preferentemente, la célula huésped que se usa en el anterior método es una célula huésped transformada con el anteriormente descrito vector de expresión de la presente invención y el vector de expresión puede comprender de forma separada o simultánea un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de la presente invención.
Cuando se produce el anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención, el transformante puede cultivarse en un medio nutritivo. El medio nutritivo contiene preferentemente una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno inorgánico o una fuente de nitrógeno orgánico, que se requieren para el crecimiento del transformante. Ejemplos de la fuente de carbono incluyen glucosa, dextrano, almidón soluble, sacarosa y similares; ejemplos de la fuente de nitrógeno inorgánico o fuente de nitrógeno orgánico incluyen sales de amonio, nitratos, aminoácidos, agua de remojo de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja, extracto de patata y similares. Si se desea, otros nutrientes (por ejemplo, sales inorgánicas (por ejemplo, cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio, cloruro de magnesio), vitaminas, antibióticos (por ejemplo, tetraciclina, neomicina, ampicilina, kanamicina y similares) y similares) pueden estar contenidos.
El cultivo del transformante se realiza mediante un conocido per se. Se seleccionan de forma adecuada las condiciones de cultivo, por ejemplo, temperatura, pH del medio y tiempo de cultivo. Por ejemplo, cuando el huésped es una célula de animal, puede usarse como medio un medio MEM (Science, Vol.122, pág.501, 1952), medio DMEM (Virology, Vol.8, pág.396, 1959), medio RPMI1640 (J. Am. Med. Assoc., Vol.199, pág.519, 1967), medio 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Vol.73, pág.1, 1950) medio definido químico (por ejemplo, CD-CHO (Invitrogen)) y similares que contiene aproximadamente del 5 % al 20 % de suero bovino fetal. El pH del medio es preferentemente de aproximadamente 6 a 8, el cultivo se realiza normalmente a aproximadamente de 30 °C a 40 °C durante aproximadamente de 15 a 72 horas y puede realizarse aireación o agitación según sea necesario. Cuando el huésped es una célula de insecto, por ejemplo, puede mencionarse suero de medio de Grace (Proc. Natl. Acad. Sci, EE.UU., Vol.82, pág.8404, 1985) y similares que comprende bovino fetal, y el pH del mismo es preferentemente de aproximadamente 5 a 8. El cultivo se realiza normalmente a aproximadamente de 20 °C a 40 °C durante aproximadamente de 15 a 100 horas y puede realizarse aireación o agitación según sea necesario. Cuando el huésped es una bacteria, actinomyces, levadura o un hongo filamentoso, por ejemplo, un medio líquido que comprende las anteriormente descritas fuentes nutritivas es adecuado. Un medio que tiene un pH de 5 a 8 es preferente. Cuando el huésped es E. coli, ejemplos preferentes del medio incluyen medio LB, medio M9 (Miller y col., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory, pág.431, 1972) y similares. En este caso, el cultivo puede realizarse normalmente de 14 °C a 43 °C durante aproximadamente de 3 a 24 horas, mientras que la aireación o agitación se realiza según sea necesario. Cuando el huésped es una bacteria del género Bacillus, el cultivo puede realizarse normalmente de 30 °C a 40 °C durante aproximadamente de 16 a 96 horas, mientras que la aireación o agitación se realiza según sea necesario. Cuando el huésped es una levadura, ejemplos del medio incluyen medio mínimo de Burkholder (Bostian, Proc. Natl. Acad. Sci. u Sa , Vol.77, pág.4505, 1980), y el pH del medio es de forma deseable de 5 a 8. El cultivo se realiza normalmente a aproximadamente de 20 °C a 35 °C durante aproximadamente de 14 a 144 horas y puede realizarse aireación o agitación según sea necesario.
El anticuerpo anti-IL-23R humano de la presente invención puede recuperarse, preferentemente aislarse y purificarse, a partir de un transformante cultivado tal como se ha descrito anteriormente. Ejemplos del método de aislamiento y purificación incluyen métodos basados en diferencias en solubilidad, tales como precipitación por sales y disolventes; métodos basados en diferencias en peso molecular, tales como diálisis, ultrafiltración, filtración por gel y electroforesis de geles de poliacrilamida-dodecilsulfato sódico; métodos basados en diferencias en carga eléctrica, tal como cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de hidroxilapatita; métodos basados en afinidad específica, tales como la cromatografía de afinidad; métodos basados en diferencias en hidrofobicidad, tales como cromatografía de líquidos de alto rendimiento en fase inversa; métodos basados en diferencias en punto isoeléctrico, tales como enfoque isoeléctrico; y similares.
Aunque la presente invención se ha descrito generalmente anteriormente, se proporcionan ejemplos específicos en el presente documento solo para una mejor compresión de la presente invención. Estos ejemplos son para fines únicamente ilustrativos y no limitan el alcance de la presente invención.
[Ejemplos]
Los procedimientos que implican el uso de un kit o un reactivo y similares se realizaron según el protocolo adjunto a menos que se indique lo contrario.
(Ejemplo 1: Preparación de proteínas de fusión de Fc de IL-23R-ratón de mono)
Los presentes inventores crearon una proteína de fusión de la secuencia de región extracelular de una secuencia de IL-23R humano (documento no de patente 1, aminoácidos en posiciones de 24 a 353 de la SEQ ID NO:21) con la región de Fc de la inmunoglobulina de ratón (proteína de fusión de Fc de IL-23R-ratón humano) para usar la proteína como antígeno y un material de criba para construir un anticuerpo anti-IL-23R. Específicamente, la secuencia de región extracelular del IL-23R humano se amplificó mediante PCR usando los cebadores ED14-1 (SEQ ID NO:22) y ED14-2 (SEQ ID NO.23) y se insertó en los sitios de EcoRI y BglII de pFUSE-mIgG2A-Fc2 (InvivoGen) que es un vector para la expresión de una proteína de fusión de Fc de ratón, obteniendo, de este modo, un vector de expresión de IL-23R de fusión de Fc. En el presente documento, el gen amplificado mediante PCR incluía dos sitios de EcoRI la secuencia del cebador ED14-1 y la secuencia del gen de IL-23R humano, pero se obtuvo un fragmento de gen en el que el sitio de EcoRI en el IL-23R no se digirió mediante digestión parcial y una electroforesis de gel de agarosa y se insertó en el vector de expresión. El vector construido se introdujo en células FreeStyle 293 (Invitrogen) usando fectina 293 (Invitrogen) que es un reactivo de introducción de gen y las células se cultivaron en un sistema de cultivo libre de suero usando un medio de expresión de FreeStyle 293 (Invitrogen), después del cual se recogió un sobrenadante de cultivo que comprendía la proteína de fusión de Fc de IL-23R-ratón humano. La proteína se purificó a partir del sobrenadante de cultivo recogido usando una columna HiTrapA (GE Healthcare Japan) y un sistema AKTA (GE Healthcare Japan) que es un sistema de purificación de proteínas y se usó en el experimento que se describe a continuación. También se obtuvo una proteína de fusión de Fc de IL-23R-ratón mediante el mismo método usando la secuencia de región extracelular de la secuencia de IL-23R de mono.
(Ejemplo 2: Preparación de células 293 que expresan IL-23R humano)
Los presentes inventores obtuvieron células que expresaban IL-23R de longitud completa humano para usarlas como un antígeno de célula para someter a ensayo la actividad de unión del anticuerpo anti-IL-23R y obtener un anticuerpo. Un gen de IL-23R de longitud completa (documento no de patente 1, la longitud completa de la SEQ ID NO:21) se amplificó mediante PCR usando los cebadores AA26-Fw (SEQ ID NO:24) y AA10-4 (SEQ ID NO:25), y el fragmento de gen se insertó en un vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) que es un vector de clonación. Después de la secuenciación, el fragmento de gen se recombinó con un vector pcDNA3.1 (Invitrogen) que es un vector para la expresión en células mamíferas. El vector se introdujo en células 293, que son células cultivadas establecidas humanas, usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). Las células se cultivaron de forma selectiva con medio RPMI1640 que contenía G418 y, a continuación, se monoclonaron mediante un método de dilución limitante. A continuación, se seleccionó un clon que mostraba una alta expresión de proteína mediante medición de citometría de flujo usando un anticuerpo anti-IL-23R humano marcado con tinción (R&D Systems), obteniendo, de este modo, células que expresan IL-23R humano.
(Ejemplo 3: Construcción de hibridoma que produce anticuerpo anti-IL-23R)
Los presentes inventores inmunizaron ratones de VelocImmune con la proteína de fusión IL-23R-Fc humano o las células que expresan IL-23R humano obtenidas en los Ejemplos 1 y 2, respectivamente, junto con un adyuvante que provocaba una respuesta inmune, para obtener un anticuerpo anti-IL-23R humano. Los ratones se inmunizaron varias veces y finalmente se inmunizaron una vez ha aumentado el título de anticuerpo de sangre. se recogió el ganglio esplénico o linfático y similares de los ratones inmunizados según un método normal y se recogieron de los mismos los linfocitos y se fusionaron con la célula de mieloma de ratón SP2/0, formando, de este modo, un hibridoma. Se prepararon muestras de dilución limitante del hibridoma y se sometieron a monoclonación. Cada uno de los clones se sometió a un cultivo de escalado y, a continuación, el medio se reemplazó con medio de hibridoma CD libre de suero (Invitrogen), seguido de cultivo durante 5 horas. El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante de cultivo obtenido usando una columna de centrifugación de proteína G (Pro-Chem).
(Ejemplo 4: ensayo ELISA)
Los presentes inventores usaron un antígeno ELISA para medir la actividad de unión específica a antígeno del anticuerpo. La proteína de fusión IL-23R-Fc de ser humano o mono se inmovilizó sobre una placa de 384 pocillos de Maxisorp (Nunc, Inc.) a una concentración de 500 ng/ml. Se añadió a la misma un agente bloqueante (Blocking One; Nacalai Tesque, Inc.) y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por lavado dos veces con un tampón de lavado [TPBS: una solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 0,05 % de Tween-20], y las muestras de anticuerpo purificadas se diluyeron en serie de forma adecuada y se añadieron a la misma. La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por lavado de cuatro veces con TPBS y se añadió anticuerpo de lg de HRP-conejo anti-ratón (DAKO) que se diluyó 2.000 veces con un tampón de dilución (Blocking One que se diluyó dos veces con PBS). La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por lavado cuatro veces con un tampón de lavado. Se añadieron 40|jl de sustrato ELISA de quimioluminiscencia BM (POD) (Roche Diagnostics), que es un reactivo para detectar la luminiscencia química, y se midió la cantidad de quimioluminiscencia con un contador de EnVision (Perkin Elmer). Cada anticuerpo se sometió a ensayo por duplicado y el CE50 se analizó mediante ajuste de curva. En este ensayo, se usó como anticuerpo comparativo una proteína de fusión obtenida reemplazando la región de Fc del anticuerpo anti-IL-23R humano hum20D7 (documento de patente 1) con la región de Fc de ratón (en lo sucesivo denominado como hum20D7-mFc). Asimismo, la razón por la cual el hum20D7 se fusionó con la región de Fc de ratón para preparar un anticuerpo de fusión fue para usar el anticuerpo de lg de anti-ratón como anticuerpo secundario y la región de Fc de ratón podría reconocerse por el anticuerpo de lg de anti-ratón, haciendo posible, de este modo, la medición de la actividad.
Como resultado, se encontró que el anticuerpo (anticuerpo quimérico) nombrado 25-3 tenía una alta actividad de unión para el IL-23R humano, como hum20D7-mFc (Tabla 1). Asimismo, respecto la unión al IL-23R de mono, el hum20D7-mFc no mostró actividad de unión para el IL-23R de mono, mientras que 25-3 mostró una alta actividad de unión para el IL-23R de mono (Tabla 2).
Tabla 1: Actividades de unión de anticuerpo anti-IL-23R humano para IL-23R humano
T l 1
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Tabla 2: Actividades de unión de anticuerpo anti-IL-23R humano para IL-23R de mono
T l 21
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(Ejemplo 5: Determinación de secuencias de anticuerpo)
Para el anticuerpo 25-3 identificado mediante el ensayo anteriormente descrito, los presentes inventores clonaron genes que codificaban la cadena pesada y la cadena ligera del anticuerpo a partir de los hibridomas. Se extrajo el ARN de cada uno de los hibridomas y se convirtió en ADNc usando un kit de amplificación de ADNc (SMARTer RACE cDNA Amplification kit; Clontech). A continuación, las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera se extendieron y amplificaron mediante PCR. Los productos de PCR se secuenciaron directamente mediante un secuenciador (ABI PRISM 3100; Applied Biosystems). Asimismo, los productos de PCR se recombinaron con un vector de subclonación del productor de PCR tal como pCR3.1-TOPO (Invitrogen) y, a continuación, se analizaron las secuencias de gen del mismo, determinando, de este modo, las secuencias del mismo.
La secuencia de base determinada de la región variable de cadena pesada de 25-3 se muestra mediante la SEQ ID NO:1, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:2. La secuencia de base de la región variable de la cadena ligera de 25-3 se muestra mediante la SEQ ID NO:5, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:6.
(Ejemplo 6: Construcción de anticuerpo humano completo)
La región variable del anticuerpo anteriormente descrito deriva de seres humanos y la región constante de la misma deriva de ratones. Por tanto, los presentes inventores construyeron vectores de expresión que comprendía tanto genes de cadena pesada como de cadena ligera usando un vector de GS (Lonza Biologics) y construyeron un anticuerpo humano completo. Específicamente, se unió una secuencia de señal al extremo 5' del gen de región variable de la cadena pesada del anticuerpo y el gen de región constante de IgYl humano [Man Sung Co y col., (1992) J Immunol.Vol.148(4): 1149-1154] se unió al extremo 3' del gen de la cadena pesada se insertaron en el vector GS pEE6.4. Asimismo, se unió una secuencia de señal al extremo 5' de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de región constante de una cadena k humana (Man Sung Co y col. tal como se ha mencionado anteriormente) se unió al extremo 3' y los genes de la cadena ligera se insertaron en el vector GS pEE12.4.
La secuencia de base de la cadena ligera pesada del anticuerpo humano completamente construido de 25-3 (25-3 humano completo) se muestra mediante la SEQ ID NO:3, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:4. La secuencia de base de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:7, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
(Ejemplo 7: Construcción de variantes del anticuerpo humano completo)
Además, los presentes inventores introdujeron mutaciones de aminoácidos en la región variable de la cadena pesada y/o región variable de cadena ligera del 25-3 humano completo anteriormente descrito para realizar cuatro variantes del anticuerpo (cada una se denominó 25-3-1 humano completo), 25-3-2 humano completo, 25-3-3 humano completo, 25-3-4 humano completo).
La secuencia de base de la región variable de la cadena pesada del 25-3-1 completo humano construido se muestra mediante la SEQ ID NO:9, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:10. La secuencia de base de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:5, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:6. La secuencia de base de la cadena pesada de 25-3-1 humano completo se muestra mediante la SEQ ID NO:11, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:12. La secuencia de base de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:7, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
La secuencia de base de la región variable de la cadena pesada del 25-3-2 completo humano construido se muestra mediante la SEQ ID NO:9, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:10. La secuencia de base de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:17, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:18. La secuencia de base de la cadena pesada de 25-3-2 humano completo se muestra mediante la SEQ ID NO:11, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:12. La secuencia de base de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:19, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:20.
La secuencia de base de la región variable de la cadena pesada del 25-3-3 completo humano construido se muestra mediante la SEQ ID NO:13, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:14. La secuencia de base de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:5, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:6. La secuencia de base de la cadena pesada de 25-3-3 humano completo se muestra mediante la SEQ ID NO:15, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:16. La secuencia de base de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:7, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
La secuencia de base de la región variable de la cadena pesada del 25-3-4 completo humano construido se muestra mediante la SEQ ID NO:13, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:14. La secuencia de base de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:17, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:18. La secuencia de base de la cadena pesada de 25-3-4 humano completo se muestra mediante la SEQ ID NO:15, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:16. La secuencia de base de la cadena ligera del anticuerpo se muestra mediante la SEQ ID NO:19, y la secuencia de aminoácidos de la misma se muestra mediante la SEQ ID NO:20.
(Ejemplo 8: Expresión y purificación del anticuerpo humano completo)
Usando los vectores GS anteriormente descritos insertados con los genes de la cadena pesada y la cadena ligera de cada uno de los anticuerpos, respectivamente, se llevó a cabo la expresión se los anticuerpos mediante expresión constitutiva. Para la expresión constitutiva, los vectores GS anteriormente descritos insertados con los genes de la cadena pesada y la cadena ligera de cada uno de los anticuerpos, respectivamente, se digirieron con las enzimas de restricción NotI y PvuI y se ligaron entre sí usando el Kit de Ligación-Conveniencia (NIPPONGENE) o alta ligación (TOYOBO), construyendo, de este modo, vectores GS en los que se insertaron genes tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera. Los vectores de expresión codifican la cadena pesada de longitud completa y cadena ligera y sintetasa de glutamina, y los anticuerpos se expresaron mediante transfección en células CHO-K1SV. Los sobrenadantes de cultivo se purificaron usando una columna de proteína A o proteína G (GE Healthcare Japan), obteniendo, de este modo, un anticuerpo purificado para cada uno de los anticuerpos humanos completos.
(Ejemplo 9: ensayo ELISA de los anticuerpos humanos completos)
Los presentes inventores usaron un antígeno ELISA para medir las actividades de unión específicas a antígeno de los anticuerpos humanos completos construidos en el Ejemplo anteriormente descrito. Una proteína de fusión IL-23R-Fc de ser humano o mono se inmovilizó sobre una placa de 384 pocillos de Maxisorp (Nunc, Inc.) a una concentración de 500 ng/ml. Se añadió a la misma un agente bloqueante (Blocking One; Nacalai Tesque, Inc.) y se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por lavado dos veces con un tampón de lavado [TPBS: 0,05 % de solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene Tween 20] y cada una de las muestras de anticuerpo purificadas se diluyó en serie de forma adecuada y se añadieron a la misma. La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por lavado de cuatro veces con TPBS y se añadió como anticuerpo secundario anticuerpo de lgG anti-humano marcado con HRP (DAKO) que se diluyó 2.000 veces con tampón de dilución (Blocking One que se diluyó dos veces con PBS). La incubación se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por lavado cuatro veces con un tampón de lavado. Se añadieron al mismo 40|jl de sustrato ELISA de quimioluminiscencia BM (POD) (Roche Diagnostics) que es un reactivo para detectar quimioluminiscencia y la cantidad de quimioluminiscencia se midió con un contador de EnVision (Perkin Elmer). Cada uno de los anticuerpos se sometió a ensayo por duplicado y el CE 50 se analizó mediante ajuste de curva.
Como resultado, se encontró que el anticuerpo humano completo de la presente invención realizado en el Ejemplo anteriormente descrito tenía una alta actividad de unión para el IL-23R humano (Tabla 3). Asimismo, respecto la unión al IL-23R de mono, se encontró que el hum20D7 no mostró actividad de unión para el IL-23R de mono, mientras que los anticuerpo humanos completos de la presente invención todos tenían una alta actividad de unión para el IL-23R de mono (Tabla 4).
Tabla 3: Actividades de unión de anticuerpos anti-IL-23R humano completo para IL-23R humano
T l
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Tabla 4: Actividades de unión de anticuerpos anti-IL-23R humano completo para IL-23R de humano

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-IL-23R humano seleccionado entre cualquiera una de las siguientes (i) a (iv):
(i) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18;
(ii) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:10 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6;
(iii) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:6; y
(iv) un anticuerpo anti-IL-23R humano que comprende una región variable de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:14 y una región variable de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:18, o,
un fragmento de anticuerpo anti-IL-23R humano que es un fragmento de región variable de cadena única (scFv), Fab, Fab' o F(ab')2, que comprende la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera del anticuerpo y una cualquiera de (i) a (iv) y mantiene la actividad de dicho anticuerpo.
2. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1, en el que la región constante de la cadena pesada del anticuerpo es una región constante de IgYl humano.
3. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1, en el que la región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante de IgK humano.
4. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1, en el que la región constante de cadena pesada del anticuerpo es una región constante de IgY1 humano y la región constante de cadena ligera del anticuerpo es una región constante de IgK humano.
5. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1(i), que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la Se Q ID n O:12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20.
6. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1(ii), que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la Se Q ID n O:12 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
7. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1(iii), que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la Se Q ID NO:16 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:8.
8. El anticuerpo anti-IL-23R humano de la reivindicación 1 (iv), que comprende una cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la Se Q ID NO:16 y una cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos que se muestra mediante la SEQ ID NO:20.
9. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada del anticuerpo de la reivindicación 1 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera del anticuerpo de la reivindicación 1.
10. Una célula huésped que se selecciona entre el grupo que consiste en los siguientes (a) y (b):
(a) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de cualquiera una de las reivindicaciones 5 a 8; y
(b) una célula huésped transformada con un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena pesada del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8 y un vector de expresión que comprende un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica la cadena ligera del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8.
11. Un método para producir un anticuerpo anti-IL-23R humano, comprendiendo el método una etapa de cultivo de la célula huésped de la reivindicación 10 y de expresión del anticuerpo anti-IL-23R humano.
12. Un anticuerpo anti-IL-23R humano producido mediante un método que comprende una etapa de cultivo de la célula huésped de la reivindicación 10 y de expresión del anticuerpo anti-IL-23R humano.
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