ES2701405T3 - Agonistas y antagonistas del receptor tipo I de IL-1 quimérico - Google Patents

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Abstract

Una proteína aislada que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia de la interleucina-1 (IL-1), en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90 % a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05); y en la que la proteína aislada se une al receptor I de IL-1 (IL-1RI) y antagoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI.

Description

DESCRIPCIÓN
Agonistas y antagonistas del receptor tipo I de IL-1 quimérico
Antecedentes
La interleucina-1 alfa (IL-1 a) y beta (IL-1 p) son miembros prototípicos de una familia de citocinas inmunorreguladoras y cumplen varias funciones importantes en la regulación del sistema inmunitario. IL-1 a e IL-1 p se unen al receptor I de interleucina-1 (IL-1RI), lo que produce la activación del receptor secundario, la proteína accesoria del receptor de interleucina-1 (IL-1RAcP). La señalización agonizada por IL-1 a e IL-1 p produce respuestas de células T amplificadas, incluso la proliferación y la supervivencia de células T vírgenes y el desarrollo de células Th 17.
Heidary et al. (Journal of Molecular Biology, vol. 353, n.° 5, 11 de noviembre de 2005, páginas 1187-1198) describe el acoplamiento de largo alcance entre sitios de acoplamiento separados en la interleucina-1 p.
Dinarello et al. (Annual Review of Immunology, vol. 27, n.° 1, 1 de abril de 2009, páginas 519-550) describe las funciones inmunológicas e inflamatorias de la familia de la interleucina-1, incluidas IL-1 a e IL-1 p.
Hoffman et al. (Arthritis and Rheumatism, vol. 58, n.° 8, 30 de julio de 2008, páginas 2443-2452) describe la eficacia y la seguridad del Rilonacept (trampa de interleucina-1) en pacientes con síndromes periódicos asociados a la criopi rina.
Wingren et al. (Cellular Immunology, vol. 169, n.° 2, 1 de mayo de 1996, páginas 226-237) describe la fusión de una secuencia señal al gen de interleucina-1 p para dirigir la proteína de la acumulación citoplásmica a la liberación extracelular.
US 7700318 describe un polipéptido quimérico que comprende un dominio de neutralización de TNF, un dominio antagonista del receptor de IL-1 y dominios de dimerización, en el que los tres dominios están unidos operativamente entre sí.
Chang et al. (Immunology, vol. 112, n.° 4, 1 de agosto de 2004, páginas 643-650) describe las funciones biológicas dobles de una proteína de fusión de antagonista del receptor de interleucina-1 interleucina 10 y sus efectos supresores sobre la inflamación de las articulaciones.
WO 98/47921 describe ácidos nucleicos codificantes de las proteínas IL-15, I L-1 e, I L-15 purificada, I L-1 e y fragmentos de estas de mamífero, por ejemplo, de roedor, así como anticuerpos, y procedimientos para afectar la fisiología de los mamíferos, incluida la morfogénesis o la función del sistema inmunitario.
WO 2010/081091 describe métodos y composiciones para minimizar, prevenir o tratar los nervios de la córnea mediante la administración a un sujeto con dicho daño, o con riesgo de dicho daño, de una composición que bloquee una actividad de una citocina de IL-1 y/o una citocina de IL-17.
Resumen
La invención se define como se establece en las reivindicaciones. Todas las demás realizaciones se describen solamente con fines ilustrativos y cualquier declaración de que también formarían parte de la invención u otras declaraciones similares se deben observar en el contexto de la solicitud según se presenta y no modifica el alcance de las reivindicaciones.
Se presentan en esta memoria dominios de citocinas no naturales que se pueden utilizar, entre otros, para modular la señalización celular que responde al receptor I de interleucina-1 (IL-1 RI), para tratar trastornos y para detectar y/o unirse a receptores celulares, así como otros agentes.
En un aspecto, la invención proporciona una proteína aislada (tal como se define en las reivindicaciones) que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia interleucina-1 (IL-1), en el que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05); y en el que la proteína aislada se une al receptor I de IL-1 (IL-1RI) y antagoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI.
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05).
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05).
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % o el 95 % idéntica a una secuencia seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO: 19 (P03), s Eq ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05) y en la que el dominio de citocinas tiene mayor termoestabilidad que IL-1 p humana e IL-1Ra humano en un tampón fisiológico. Por ejemplo, el dominio de citocinas puede comprender los siguientes pares de residuos: (i) E39 y K64; (ii) R9 y Q149; y (iii) S152 y K40. Por ejemplo, el dominio de citocinas puede tener una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05).
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una Tm al menos 2 °C mayor que la Tm de IL-1 p humana e IL-1Ra humano en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una Tm 5-12 °C mayor que la Tm de IL-1 p humana e IL-1Ra humano en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 91, el 92, el 93, el 94, el 95, el 96, el 97, el 98, el 99 % o el 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 21 (P05). Por ejemplo, la proteína puede tener la secuencia de SEQ ID NO: 21 (P05).
En una realización de la proteína de la invención, la proteína comprende menos de 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones.
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas se une al receptor I de IL-1 con una KD de menos de 100 nM.
En otro aspecto, la invención proporciona una proteína aislada (tal como se define en las reivindicaciones) que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia interleucina-1 (IL-1), en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07) y en la que la proteína aislada se une al receptor I de IL-1 (IL-1RI) y agoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI.
En una realización de la proteína de la invención, el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 95 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07). Por ejemplo, el dominio de citocinas puede tener la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07).
En una realización de la proteína de la invención, la proteína comprende menos de 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones.
En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de la invención (tal como se define en las reivindicaciones).
En una realización de la invención, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica tópica. En otra realización de la invención, la composición farmacéutica es una composición farmacéutica oftálmica.
En una realización de la invención, la composición farmacéutica es acuosa y comprende la proteína en una concentración de 0,001 - 5 %.
En un aspecto definido en las reivindicaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica (tal como se define en las reivindicaciones) para uso como un medicamento.
En un aspecto definido en las reivindicaciones, la invención proporciona una composición farmacéutica (tal como se define en las reivindicaciones) para uso en el tratamiento de la enfermedad o trastorno del ojo seco, conjuntivitis alérgica o artritis reumatoide en un sujeto.
En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificante de la proteína de la invención (tal como se define en las reivindicaciones).
En otro aspecto, la invención proporciona un vector de ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico de la invención (tal como se define en las reivindicaciones), en el que la secuencia está unida operativamente a una secuencia de control de transcripción.
En otro aspecto, la invención proporciona una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante codificante de la proteína de la invención (tal como se define en las reivindicaciones). En una realización, la célula huésped recombinante es una célula huésped de E. coli.
En un aspecto, la presente descripción presenta una proteína aislada que incluye un dominio de citocinas que contiene residuos de aminoácidos de al menos dos dominios de citocinas madre, por ejemplo, características de unión al receptor, características superficiales, cadenas p y bucles de al menos dos dominios de citocinas madre. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas se une a IL-1RI e incluye características de unión al receptor de diferentes dominios de citocinas madre, por ejemplo, de un agonista del receptor y de un antagonista del receptor (por ejemplo, IL-1 p e IL-1Ra o IL-1 a e IL-1 Ra), de iL-1 p e IL-1 a o de los tres IL-1 Ra, IL-1 a e IL-1Ra. Las características de unión al receptor pueden corresponder a residuos, segmentos o regiones en los Sitios A y B. Con respecto a dichos residuos, segmentos y regiones correspondientes a los Sitios A y B, en el contexto de IL-1 (IL-1 p, IL-1 a e IL-1Ra), véanse las definiciones más adelante.
Con respecto al Sitio A, el dominio de citocinas puede tener: (a)(i) residuos del Sitio A que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en un primer dominio de citocinas madre; (a)(ii) residuos del Sitio A extendido que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en un primer dominio de citocinas madre; (a)(iii) segmentos del Sitio A A1 y A2 que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con las regiones correspondientes de un primer dominio de citocinas madre; y/o (a)(iv) una región del Sitio A que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con las regiones correspondientes de un primer dominio de citocinas madre.
Con respecto al Sitio B, el dominio de citocinas puede tener: (b)(i) residuos del Sitio B que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en un segundo dominio de citocinas madre; (b)(ii) residuos del Sitio Bs extendido que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en un segundo dominio de citocinas madre; (b)(iii) segmentos del Sitio B B1, B2 y B3 que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con las regiones correspondientes de un segundo dominio de citocinas madre; y/o (b)(iv) una región del Sitio B que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con las regiones correspondientes de un segundo dominio de citocinas madre.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye las características: (a)(i) y b(i), (a)(ii) y b(ii), (a)(iii) y (b)(iii), o (a)(iv) y (b)(iv), por ejemplo, en el que cada característica se define adicionalmente por el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad. Por ejemplo, el primer dominio de citocinas madre puede ser I L-1 p y el segundo dominio de citocinas madre puede ser I L-1 Ra. Por ejemplo, el primer dominio de citocinas madre puede ser IL-1 a y el segundo dominio de citocinas madre puede ser IL-1Ra.
El dominio de citocinas también puede incluir aminoácidos de un segundo dominio de citocinas madre en una o más posiciones en el dominio que deterioran la interacción con un receptor secundario de citocinas (por ejemplo, IL-1RAcP). Por ejemplo, el segundo dominio de citocinas madre es IL-1Ra. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye uno o más segmentos del Sitio C y/o D (por ejemplo, C1, D1, D2, D3, D4 y/o D5) de IL-1Ra o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con dichos segmentos. Por ejemplo, el dominio de citocinas incluye (i) residuos del Sitio C que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en iL-1 Ra, (ii) residuos del Sitio D que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra, (iii) un segmento C1 que tiene al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra; o (iv) un segmento D2 que tiene identidad en al menos 3, 4 o 5 residuos con los residuos correspondientes en IL-1Ra. El dominio de citocinas puede incluir las características (i) y (ii) o (ii) y (iii), por ejemplo, en el que cada característica se define adicionalmente por el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad, o (iii) y (iv).
El dominio puede incluir regiones de al menos dos dominios de citocinas de la familia IL-1 humana diferentes, en el que las regiones se seleccionan del grupo que consiste en la región A (que tiene los segmentos A1 y A2), la región B (que tiene los segmentos B1, B2 y B3), la región C y la región D (que tiene los segmentos D1, D2, D3, D4 y D5). El dominio de citocinas puede incluir una región del Sitio A y una región del Sitio B de diferentes dominios de citocinas. La región del Sitio A puede ser de un agonista o antagonista natural del receptor; la región del Sitio B puede ser de un agonista natural del receptor. Puede incluir una región del Sitio C de un antagonista natural del receptor y/o una región del Sitio D de un antagonista natural del receptor.
Por ejemplo, el dominio puede ser un dominio quimérico que tiene segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud y que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los segmentos correspondientes de al menos dos dominios de citocinas madre diferentes, tal como un primer y un segundo dominio de citocinas madre. Los dominios de citocinas madre pueden ser citocinas de unión a IL-1RI, por ejemplo, IL-1 p, IL-1a e IL-1Ra. En algunas realizaciones de la descripción, los aminoácidos que no se encuentran en los segmentos del primer dominio de citocinas madre provienen de otros dos o más dominios de citocinas madre.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos dos segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los segmentos correspondientes de un primer dominio de citocinas madre y los aminoácidos que no se encuentran en dichos segmentos son mayoritariamente idénticos (por ejemplo, al menos el 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 %) a los residuos correspondientes en el segundo dominio de citocinas madre.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye (i) al menos dos segmentos de al menos 5, 6, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los segmentos correspondientes de un primer dominio de citocinas madre y (ii) al menos uno, dos o tres segmentos, por ejemplo, de al menos 5, 6, 7, 8, 10 o 15 aminoácidos de longitud, que son idénticos a un segundo dominio de citocinas madre.
Por ejemplo, el dominio de citocinas puede incluir un primer segmento de 20-50, 25-50, 30-45 o 30-40 aminoácidos (por ejemplo, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40) y un segundo segmento de 20-45, 20-40, 25-40 o 25-35 aminoácidos (por ejemplo, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35), cada uno idéntico (o que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, o 98 % de identidad) a un primer dominio de citocinas madre (por ejemplo, IL-1Ra) y un tercer segmento que es idéntico (o que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 98 % de identidad) a un segundo dominio de citocinas madre (por ejemplo, IL-1 p o IL-1 a). Por ejemplo, el tercer segmento puede ser de entre 55 y 90, 60 y 90, 60 y 85 o 70 y 85 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84 u 85 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones de la descripción: el primer segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO: 9, también denominado segmento A1 en esta solicitud, y correspondiente a los residuos 16-40 de SEQ ID NO: 3 y a los residuos 11-36 según la numeración de IL-1 p). El segundo segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos 120-140 o 120-141 de SEQ ID NO: 3 (IL-1Ra), correspondiente a los residuos 121-139 o 121-140 (según la numeración de IL-1 p). El tercer segmento puede tener al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos 45-100 o 42-120 de IL-1 p (SEQ ID NO: 1).
En algunos casos, el primer segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos 14-45 de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los residuos 9-41 según la numeración de I L-1 p). El segundo segmento puede ser un segmento que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos 120-145 de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los residuos 121-145 según la numeración de I L-1 p) o los residuos 120-147 de SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los residuos 121-147 según la numeración de IL-1 p). En algunas realizaciones de la descripción, al menos los residuos 11-41 y 120-147 (según la numeración de I L-1 p) en forma colectiva tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra.
En algunas realizaciones de la descripción, un extremo terminal de uno de los segmentos del primer dominio de citocinas de la familia IL-1 está ubicado dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 41 de SEQ ID NO: 1 y un extremo terminal de uno de los segmentos del primer dominio de citocinas de la familia IL-1 está ubicado dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 121 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio incluye un segmento que tiene un extremo amino terminal en una posición dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 42 de SEQ ID NO: 1 y un extremo carboxilo terminal dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 120 de SEQ ID NO: 1 y/o un segmento que tiene un extremo amino terminal en una posición dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 121 de SEQ ID NO: 1 y un extremo carboxilo terminal dentro de cinco, cuatro, tres, dos o un aminoácido del aminoácido 145 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la descripción, los residuos en el dominio en las posiciones correspondientes a 11-41 y 120-147 (según la numeración IL-1 p) en forma colectiva tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra. El dominio también puede estar basado en las secuencias de los miembros de la familia de citocinas IL-1, por ejemplo, en posiciones análogas a las anteriores.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO: 9); NLEEK (SEQ ID NO: 10);
RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK (SEQ ID NO: 11); AMEADQP (SEQ ID NO: 12);
FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY (SEQ ID NO: 13); y/o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con las anteriores. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: VQGEESNDKI (SEQ ID NO: 14); KKKMEKRF (SEQ ID NO: 15) y FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO: 16); y/o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con las anteriores.
En algunas realizaciones de la descripción, uno o más o todos los bucles p 1 p2, p2p3, p8p9 y p 10p11 tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los bucles correspondientes de un antagonista de IL-1, por ejemplo, IL-1Ra. En algunas realizaciones de la descripción, uno o más o todos los bucles p4p5, p5p6, p6p7 y p7p8 tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los bucles correspondientes de un dominio de citocinas de la familia IL-1 diferente de la citocina madre humana que es muy similar a los bucles p 1 p2, p2p3, p8p9 y p10p11. Por ejemplo, uno o más o todos los bucles p4p5, p5p6, p6p7 y p7p8 tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los bucles de un agonista de IL-1, tal como IL-1 p. En algunas realizaciones de la descripción, el bucle p11p12 tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con el bucle correspondiente de un antagonista de IL-1, por ejemplo, IL-1Ra.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con una, dos, tres o todas las cadenas beta p2, p3, p 10 y p 11 de IL-1Ra. En algunas realizaciones, el dominio de citocinas incluye secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con una, dos, tres o todas las p4, p6, p7 y p8 de IL-1 p, o con p4, p5, p6, p7 y p8 de IL-1 p.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100 % de identidad con los aminoácidos I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110 o I46-G118 de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100 % de identidad con los aminoácidos N7-V41, R11-M36, N102-D145, o Y121-D145 de SEQ ID NO: 1.
Generalmente, el dominio de citocinas no es natural. Difiere de los dominios de citocinas de la familia IL-1 humana.
Por ejemplo, tiene menos del 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60 o 55 % de identidad con IL-1Ra (SEQ ID NO: 3), IL-1p (SEQ ID NO: 1) y/o IL-1 a (SEQ ID NO: 2). El dominio de citocinas también puede tener al menos el 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 % de identidad con dicha citocina. Por ejemplo, el dominio quimérico puede tener entre el 30 y el 95 %, el 40 y el 90 % o el 45 y el 85 % de identidad con IL-1Ra, IL-1 p e IL-1 a. Por ejemplo, el dominio quimérico puede tener entre el 40 y el 90 % de identidad con I L-1 p y entre el 35 y el 85 % de identidad con IL-1Ra; entre el 40 y el 80 % de identidad con IL-1 p y entre el 45 y el 80 % de identidad con IL-1Ra; entre el 45 y el 72 % de identidad con I L-1 p y entre el 45 y el 80 % de identidad con IL-1Ra; entre el 45 y el 72 % de identidad con IL-1 p y entre el 53 y el 80 % de identidad con IL-1Ra; entre el 50 y el 72 % de identidad con IL-1 p y entre el 53 y el 70 % de identidad con IL-1Ra; entre el 60 y el 72 % de identidad con IL-1 p y entre el 53 y el 68 % de identidad con IL-1Ra; entre el 65 y el 72 % de identidad con IL-1 p y entre el 54 y el 60 % de identidad con IL-1Ra o entre el 68 y el 72 % de identidad con IL-1 p y entre el 54 y el 57 % de identidad con IL-1Ra. Por ejemplo, el dominio quimérico puede tener entre el 40 y el 90 % de identidad con I L-1 a y entre el 35 y el 85 % de identidad con IL-1Ra; entre el 40 y el 80 % de identidad IL-1 a y entre el 45 y el 80 % de identidad con IL-1Ra; entre el 45 y el 72 % de identidad con I L-1 a y entre el 45 80 % de identidad con IL-1Ra; entre el 45 y el 72 % de identidad con IL-1 a y entre el 53 y el 80 % de identidad IL-1Ra; entre el 50 y el 72 % de identidad con IL-1 a y entre el 53 y el 70 % de identidad con IL-1Ra; entre el 60 y el 72 % de identidad con I L-1 a y entre el 53 y el 68 % de identidad con IL-1Ra; entre el 65 y el 72 % de identidad con IL-1 a y entre el 54 y el 60 % de identidad con IL-1Ra o entre el 68 y el 72 % de identidad con IL-1 a y entre el 54 y el 57 % de identidad con IL-1Ra.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas difiere de IL-1Ra y se une al receptor mientras que incluye un Sitio C y/o un Sitio D característico de un antagonista del receptor natural (tal como IL-1Ra). Por ejemplo, el dominio tiene menos del 98, 95, 92, 90, 85 y 80 % de identidad con IL-1 p humana e IL-1Ra. Por ejemplo, el dominio tiene entre el 40 y el 95 %, el 40 y el 90 % o el 45 y el 85 % de identidad con IL-1Ra. El dominio también puede tener entre el 40 y el 95 %, el 40 y el 90 % o el 45 y el 85 % de identidad con un antagonista de citocinas de la familia IL-1, tal como IL-1 a o IL-1 p. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye: al menos el 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 u 85 % de aminoácidos de un primer dominio de citocinas madre que es un agonista de la señalización de citocinas.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas tiene una mayor identidad de aminoácidos (por ejemplo, al menos el 5, 10, 15 o 20 % o más) con un agonista del receptor (tal como, IL-1 p o IL-1 a) que con un antagonista del receptor (IL-1Ra), pero funciona como un antagonista de IL-1RI.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas es completamente quimérico, por ejemplo, cada aminoácido en el dominio es de uno de los dominios de citocinas madre, por ejemplo, uno de dos dominios de citocinas madre o uno de tres o más dominios de citocinas madre. Por ejemplo, los dominios de citocinas madre son dominios de citocinas humanos o dominios de citocinas de primates no humanos. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas es parcialmente quimérico, por ejemplo, no todos los aminoácidos en el dominio son de uno de los dominios de citocinas madre.
Por ejemplo, la proteína aislada se une a IL-1RI y modula la señalización a través del receptor, por ejemplo, agoniza o antagoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI. En algunas realizaciones de la descripción, la proteína no induce sustancialmente la producción de IL-6 cuando se pone en contacto con las células humanas que responden a IL-1 p y/o no induce sustancialmente la producción de un gen indicador que responde a IL-1 p, por ejemplo, en concentraciones de 10 pg/ml, 100 pg/ml o 1 mg/ml. Generalmente, la proteína inhibe la señalización de IL-1 p (por ejemplo, en una concentración de 0,1 ng/ml tal como en un ensayo celular descrito en esta memoria) con una CI50 inferior a 100, 50, 20, 10 o 5 nM. La proteína puede inhibir la señalización de IL-1 p con una CI50 menor que la de IL-1Ra, por ejemplo, al menos el 10, el 20 o el 50 % inferior.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas se une, por ejemplo, con la misma afinidad o con una afinidad mejor que uno de los dominios de citocinas madre.
En algunas realizaciones, el dominio de citocinas de la proteína de la invención se une a IL-1RI con una Kd inferior a 100 nM, como se establece en las reivindicaciones.
La constante de asociación de la proteína descrita en esta memoria puede ser superior a 1x104, 3x104, 1x105 o 1x106 M 'V 1, y la de disociación puede ser inferior a 1x10'3, 1x10'4, 6x10'4 o 6x10'5 s-1.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas se une a IL-1RI con una mejor afinidad (por ejemplo, menor Kd ) y/o una velocidad de disociación más lenta que IL-1 p o IL-1Ra. Por ejemplo, el dominio de citocinas se puede unir a IL-1RI con una constante de disociación menor o igual a la de IL-1Ra y/o con una constante de asociación mayor o igual a la de IL-1 p.
El dominio de citocinas puede tener entre aproximadamente 120 y 180, 140 y 170, 148 y 160 o 150 y 156 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio tiene 152 o 153 aminoácidos de longitud. Típicamente, el dominio incluye al menos 10, 11 o 12 cadenas p y se pliega de forma estable. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas tiene una Tm de al menos 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62 o 64 °C, según se describe en esta memoria. Puede tener una Tm de entre 51 y 61, 51 y 66, 56 y 61 o 56 y 66 °C. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no comienza a desplegarse antes de al menos 48, 50, 51, 55, 57, 58 o 59 °C. Por ejemplo, tiene una Tm que se encuentra al menos dentro de 10 °C o 5 °C de la Tm de IL-1Ra y/o IL-1 p en un tampón fisiológico.
En algunas realizaciones, el dominio de citocinas de la proteína de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90 % o el 95 % idéntica a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05) y es más termoestable que IL-1Ra y/o I L-1 p en un tampón fisiológico, como se establece en las reivindicaciones. Por ejemplo, el dominio puede tener una Tm que es al menos 2, 4, 6, 7 u 8 °C mayor que la Tm de IL-1Ra y/o I L-1 p en un tampón fisiológico, por ejemplo, entre aproximadamente 5 y 12, 5 y 10 o 7 y 10 °C mayor que la Tm de IL-1Ra y/o IL-1 p en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
La proteína puede incluir otras características descritas en esta memoria.
En otro aspecto, la descripción presenta una proteína aislada que incluye un dominio de citocinas de la familia IL-1 quimérico. Los ejemplos de miembros de la familia de citocinas IL-1 incluyen IL-1 a, IL-1 p, IL-1Ra, IL-18, IL-1F5, IL-1F6, IL-1F7, IL-1F8, IL-1F9, IL-1F10 e IL-33. El dominio de citocinas puede incluir una región de unión al receptor de una de las citocinas anteriores o una secuencia de proteínas que incluye elementos de una o más de dichas citocinas. Por ejemplo, el dominio de citocinas puede incluir una quimera de dos o más miembros de la familia de citocinas IL-1.
En una realización de la descripción, el dominio quimérico incluye al menos un segmento de una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 aminoácidos y que tiene identidad de aminoácidos (o al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad) con una primera citocina de la familia IL-1, y otro segmento de una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15, 20, 25, 30, 35 o 40 aminoácidos y que tiene identidad de aminoácidos (o al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad) con una segunda citocina de la familia IL-1. El dominio quimérico puede tener menos del 90, 85, 80 o 75 % de identidad con una o ambas de la primera y la segunda citocina de la familia IL-1.
En una realización de la descripción, la primera y la segunda citocinas de la familia IL-1 se seleccionan del grupo que consiste en IL-1 p, IL-1 a e IL-1Ra. En otra realización de la descripción, la primera y la segunda citocinas de la familia IL-1 se seleccionan del grupo que consiste en IL-1F5, I L-1 f6, IL-1F7 e IL-1 f8. En otra realización de la descripción, la primera citocina de la familia IL-1 se selecciona del grupo de agonistas y la segunda se selecciona del grupo de antagonistas. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio quimérico incluye menos de 120, 110, 100, 90 u 80 aminoácidos contiguos del mismo dominio de citocinas madre.
En una realización de la descripción, el dominio quimérico es idéntico a la primera citocina de la familia IL-1 en al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 posiciones y es idéntico a la segunda citocina de la familia IL-1 en al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 o 120 posiciones (incluido posiciones que pueden ser idénticas individualmente a ambas citocinas).
En una realización de la descripción, el dominio quimérico incluye al menos dos, tres o cuatro segmentos discontinuos, cada uno con una longitud de al menos cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, 15 o 20 aminoácidos y que tienen identidad de aminoácidos (o al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad) con los segmentos correspondientes de una primera citocina de la familia IL-1 y que incluyen aminoácidos mayoritariamente de una segunda citocina de la familia IL-1 en las posiciones restantes. En una realización de la descripción, el dominio quimérico incluye 4, 5, 6 o 7 segmentos, en el que los segmentos adyacentes son de dominios de citocinas madre de la familia IL-1 diferentes. Por ejemplo, cada aminoácido en el dominio está ubicado en un péptido de al menos 5 o 6 aminoácidos de longitud de un dominio de citocinas de la familia IL-1 humana natural. En una realización de la descripción, el dominio quimérico incluye al menos uno, dos o tres de: (i) un segmento de al menos 50, 60, 65, 70 o 75 aminoácidos de longitud de IL-1 p, (ii) un segmento de al menos 15, 20, 25 aminoácidos de longitud de IL-1Ra; y (iii) otro segmento de al menos 15, 20, 25 aminoácidos de longitud de IL-1Ra.
En una realización de la descripción, los segmentos discontinuos incluyen los residuos (i) 1-6 y 45-61, (ii) 1-6 y 86­ 95, (iii) 45-61 y 86-95, (iv) 1-6 y 148-153, (v) 45-61 y 148-153 o (vi) 86-95 y 148-153, según la numeración de dichas posiciones en IL-1 p. Los tres segmentos discontinuos de la primera citocina de la familia IL-1 pueden incluir, por ejemplo, los residuos 1-8, 42-120 y 141-153, los residuos 1-10, 37-125 y 131-153 o los residuos 1-6, 45-61, 86-95 y 148-153, según la numeración de dichas posiciones en IL-1 p. El dominio quimérico puede tener al menos el 80, 82, 85, 87, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con la segunda citocina de la familia IL-1 en las posiciones restantes. En una realización de la descripción, uno o más de los bordes de los segmentos discontinuos están ubicados en posiciones en las que la primera citocina y la segunda citocina de la familia IL-1 son idénticas o están conservadas. La proteína puede tener otras características descritas en esta memoria. En otro aspecto, la presente descripción presenta un inhibidor de IL-1 aislado que incluye un dominio de citocinas de la familia IL-1 que se une a IL-1RI. Por ejemplo, el inhibidor de IL-1 incluye una o más características mencionadas anteriormente o en otras partes de la presente memoria. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye: (a) aminoácidos que son idénticos a IL-1Ra en las siguientes posiciones ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 y GLN141 (según la numeración de IL-1 p) y (b) aminoácidos que son idénticos a IL-1 p en las siguientes posiciones: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152. En algunas realizaciones de la descripción, los segmentos del Sitio A A1 y A2 tienen al menos el 80 % de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-1Ra. En algunas realizaciones de la descripción, los segmentos del Sitio B B1, B2 y B3 tienen al menos el 80 % de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-1 p. Por ejemplo, los segmentos del Sitio A A1 y A2 tienen al menos el 90 % de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-1Ra; y los segmentos del Sitio B B1, B2 y B3 tienen al menos el 90 % de identidad (en forma colectiva) con los segmentos correspondientes de IL-1 p. Por ejemplo, los segmentos del Sitio A A1 y A2 son idénticos a los segmentos correspondientes de IL-1Ra; y los segmentos del Sitio B B1, B2 y B3 son idénticos a los segmentos correspondientes de IL-1 p.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye secuencias que tienen al menos el 80 % de identidad (en forma colectiva) con las cadenas beta p2, p3, p10 y p11 de IL-1Ra y secuencias que tienen al menos el 80 % de identidad (en forma colectiva) con las cadenas beta p4, p6, p7 y p8 de I L-1 p. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye secuencias que son idénticas a las cadenas beta p2, p3, p 10 y p 11 de IL-1Ra y secuencias que son idénticas a las cadenas beta p4, p6, p7 y p8 de IL-1 p. En algunas realizaciones de la descripción, los segmentos y las características identificados anteriormente de I L-1 p se derivan de I L-1 a o una combinación de I L-1 p o I L-1 a.
En algunas realizaciones de la descripción, el inhibidor de IL-1 incluye una o más (por ejemplo, al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete) de las siguientes propiedades: (i) residuos del Sitio A o Sitio B (y/o los residuos del Sitio A extendido y Sitio B extendido) que tienen al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1 p, IL-1 a o IL-1Ra; (ii) segmentos A1 y A2 que tienen en forma colectiva al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra; (iii) segmentos B1, B2 y B3 que tienen en forma colectiva al menos el 80 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1 p o IL-1 a; (iv) una región del Sitio A que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en I L-1 Ra; (v) una región del Sitio B que tiene al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1 p o IL-1 a; (vi) residuos del Sitio C y/o Sitio D que tienen al menos el 50, 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra o IL 36Ra, (vii) un segmento C1 que tiene al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con los residuos correspondientes en IL-1Ra; (viii) un segmento D2 que es idéntico en al menos 3, 4 o 5 residuos a los residuos correspondientes en IL-1Ra. El dominio de citocinas difiere de IL-1Ra, por ejemplo, el dominio de citocinas tiene menos del 99, 98, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60 % de identidad con IL-1Ra y/o al menos el 30, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 % de identidad con IL-1Ra, por ejemplo, entre el 40 y el 95 %, el 40 y el 90 % o el 45 y el 85 % de identidad con IL-1Ra. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100 % de identidad con los aminoácidos I46-G59, A55-G59, A55-V83, I60-V83, N84-D95, I46-S110, V49-S110 o I46-G118 de SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no contiene un segmento que tiene más del 80, 85, 90, 95 o 100 % de identidad con los aminoácidos N7-V41, R11-M37, N102-D144 o Y121-D144 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la descripción, el inhibidor se une a IL-1RI con una Kd inferior a 100, 50, 20, 10, 5 o 1 nM. En algunas realizaciones de la descripción, el inhibidor se une a IL-1RI con una mejor afinidad (por ejemplo, menor Kd ) y/o una velocidad de disociación más lenta que I L-1 p o IL-1Ra.
En algunas realizaciones de la descripción, el inhibidor no induce sustancialmente la expresión de IL-6 cuando se pone en contacto con las células humanas que responden a IL-1 p. Generalmente, el inhibidor inhibe la señalización de I L-1 p, por ejemplo, con una CI50 inferior a 100, 50, 20, 10 o 5 nM.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: WDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNV (SEQ ID NO: 9); NLEEK (SEQ ID NO: 10); RIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEK (SEQ ID NO: 11); AMEADQP (SEQ ID NO: 12); FLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFY (SEQ ID NO: 13); y/o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con las anteriores. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye una, dos, tres o más de las siguientes secuencias: VQGEESNDKI (SEQ ID NO: 14); KKKMEKRF (SEQ ID NO: 15) y FSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFES (SEQ ID NO: 16); y/o secuencias que tienen al menos el 80, 85, 88, 90, 92, 95, 98 o 100 % de identidad con las anteriores. El inhibidor puede incluir otras características descritas en esta memoria.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una proteína aislada que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia interleucina-1, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % o 100 % idéntica a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05), en la que la proteína aislada se une al receptor de IL-1 y antagoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI, como se establece en las reivindicaciones. La presente invención también proporciona una proteína aislada que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia interleucina-1, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos el 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % o 100 % idéntica a la secuencia de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07), en la que la proteína aislada se une al receptor de IL-1 y agoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI, como se establece en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos incluye al menos una sustitución, inserción o eliminación. La secuencia de aminoácidos puede incluir menos de 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones. La secuencia de aminoácidos puede incluir al menos 1,2, 3, 4 o 5 sustituciones, por ejemplo, sustituciones conservadoras.
También se describen en esta memoria proteínas aisladas que incluyen una metionina amino terminal para la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, P05, P06, o P07 o una secuencia del ejemplo 1, 5, 6 o en otras partes de la presente memoria, y proteínas aisladas que incluyen la secuencia de aminoácidos de P01, P02, P03, P04, P05, P06 o P07 o una secuencia del ejemplo 1, 5, 6 o en otras partes de la presente memoria en las cuales la alanina en el extremo amino terminal está ausente. Las secuencias anteriores pueden incluir otras características descritas en esta memoria. Por ejemplo, la secuencia además puede incluir una etiqueta, tal como una secuencia de hexahistidina, por ejemplo, en N o C terminal respecto a la secuencia de unión a IL-1RI. La secuencia además puede incluir un grupo que modifica la estabilidad o la farmacocinética de la secuencia de unión a IL-1RI. La secuencia además puede incluir un dominio de albúmina sérica y/o Fc, o uno o más dominios de estos, por ejemplo, uno o más dominios constantes de inmunoglobulina o uno o más dominios de albúmina. La proteína puede tener otras características descritas en esta memoria. En algunas realizaciones de la descripción, la proteína aislada consiste, o consiste esencialmente, en una secuencia o dominio quimérico descrito en esta memoria.
En otro aspecto más, la descripción proporciona una proteína aislada que incluye un dominio que tiene una forma circularmente permutada de un dominio de citocinas descrito en esta memoria, por ejemplo, un dominio de citocinas enumerado en la tabla 4 y/o un dominio que incluye SEQ ID NO: 3. La proteína además puede incluir una secuencia heteróloga (tal como un dominio Fc o de albúmina) en el extremo amino o carboxilo terminal de la forma permutada, opcionalmente separada por un conector. La proteína puede tener otras características descritas en esta memoria. La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína aislada de la invención que incluye un dominio de citocinas quimérico, tal como se define en las reivindicaciones. Las composiciones pueden ser composiciones farmacéuticas oftálmicas, composiciones tópicas o composiciones para administración parenteral.
La descripción presenta un método para modular una respuesta inmune o inflamatoria en un sujeto. El método puede incluir la administración de una composición que incluye un agente de unión al receptor descrito en esta memoria a un sujeto en una cantidad eficaz para modular la respuesta inmune o inflamatoria en el sujeto.
La descripción presenta un método para tratar un trastorno mediado por IL-1 en un sujeto. El método incluye la administración de una composición que incluye una proteína que se puede unir a IL-1RI, por ejemplo, un agente de unión al receptor descrito en esta memoria, al sujeto. Por ejemplo, el trastorno puede ser un trastorno autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoide o artritis crónica juvenil, esclerodermia, síndrome de Sjogren, espondilitis anquilosante, síndrome de Behcet, una enfermedad inflamatoria intestinal, asma, vasculitis o psoriasis. El trastorno puede ser un trastorno asociado con formación de agregados, por ejemplo, hiperuricemia, gota, diabetes (incluyendo diabetes no dependiente de insulina), enfermedad de Alzheimer, amiloidosis secundaria reactiva, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington o enfermedad de Parkinson. El trastorno también puede ser un trastorno tipo CAPS (síndromes periódicos asociados a la CIAS1) u otro trastorno descrito en esta memoria.
La descripción presenta un método para tratar un trastorno ocular mediado por IL-1 en un sujeto. El método puede incluir la administración de una composición que incluye una proteína que se puede unir a IL-1RI, por ejemplo, un agente de unión al receptor descrito en esta memoria, al sujeto. Por ejemplo, la composición es una composición oftálmica que se administra tópicamente a un ojo del sujeto o a la región que lo rodea. En una realización, el trastorno es un trastorno del ojo seco. En algunas realizaciones de la descripción, el sujeto no presenta manifestaciones de enfermedad autoinmune sistémica. En algunas realizaciones, el sujeto tiene el síndrome de Sjogren. En algunas realizaciones de la descripción, el sujeto tiene la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). En otras realizaciones de la descripción, el trastorno es la uveítis.
La descripción presenta un método para inhibir la actividad de IL-1. El método incluye poner en contacto un agente de unión al receptor que se puede unir a IL-1RI con las células que responden a IL-1 o con un sujeto. Generalmente, la proteína se proporciona en una cantidad eficaz para inhibir la actividad de IL-1 asociada con las células o en el sujeto. La proteína se puede poner en contacto con las células de un sujeto ex vivo.
En otro aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia codificante de la proteína aislada de la invención, tal como se define en las reivindicaciones. El ácido nucleico también puede incluir otras características descritas en esta memoria.
La invención también proporciona una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante codificante de la proteína de la invención, tal como se establece en las reivindicaciones. Un agente de unión al receptor se puede producir a través de un método que incluye mantener la célula huésped bajo condiciones que permiten la expresión del agente de unión al receptor y, opcionalmente, recuperar el agente de unión al receptor, por ejemplo, de las células o del medio asociado con la célula huésped. Por ejemplo, se puede purificar el agente de unión al receptor a partir del lisado de las células. El agente de unión al receptor purificado se puede formular, por ejemplo, con uno o más de un excipiente, un estabilizador y un tampón.
También se describe en esta memoria un método para proporcionar un dominio de proteínas quimérico. El método incluye identificar al menos dos proteínas madre que tienen un plegamiento común (por ejemplo, una primera proteína madre y una segunda proteína madre), ubicar al menos dos segmentos dentro de la primera proteína madre y construir un ácido nucleico que tiene una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos quimérica que incluye los dos segmentos de la primera proteína madre y los residuos que son principalmente de la segunda proteína madre en las posiciones restantes. El dominio puede ser un dominio que está mayoritariamente compuesto por láminas p, o un dominio que está mayoritariamente compuesto por hélices a o un dominio que tiene una combinación de dichos elementos. Por ejemplo, el dominio puede tener el plegamiento de una citocina. La primera proteína madre y la segunda proteína madre pueden estar relacionadas por homología, por ejemplo, entre el 10 y el 40 % de identidad de aminoácidos. En algunas realizaciones, los segmentos de la primera proteína están ubicados dentro de un único dominio de proteínas plegado y la secuencia de aminoácidos quimérica incluye una forma del dominio de proteínas plegado que no es idéntico al dominio correspondiente en la primera y en la segunda proteína madre. En algunas realizaciones de la descripción, las dos proteínas madre tienen propiedades funcionales diferentes y el dominio quimérico puede tener propiedades de una o ambas de las proteínas madre. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio quimérico tiene una interfaz de unión de la primera proteína madre y otra interfaz de unión de la segunda proteína madre.
En esta memoria se hace referencia a varias regiones, segmentos y residuos en las citocinas de la familia IL-1 con relación a los Sitios A, B, C y D. La ubicación de dichos residuos, segmentos y regiones en la secuencia de IL-1 p humana (SEQ ID NO: 1) y las posiciones correspondientes se proporcionan a continuación en la Fig. 1:
Sitio A. Los residuos del Sitio A en IL-1 p incluyen: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, SER21, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLU128, ASN129 y MET130, y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en esta memoria «residuos del Sitio A»). En determinados contextos, especialmente con relación a IL-1 p, se hace referencia a los «residuos del Sitio A extendido», término que incluye los residuos del Sitio A, así como GLN149 y PHE150, y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1. Además, es posible definir una «región del Sitio A» como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento A1 (correspondiente en IL-1 p a 11-36 de SEQ ID NO: 1) y un segmento A2 (correspondiente en IL-1 p a 125-131 de SeQ ID NO: 1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Sitio B. Los residuos del Sitio B en IL-1 p incluyen: ALA1, PRO2, ARG4, GLN48, GLU51, ASN53, ILE56, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105 y ASN108, y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en esta memoria «residuos del Sitio B»). En determinados contextos, especialmente con relación a I L-1 p, se hace referencia a los «residuos del Sitio B extendido», que incluyen los residuos del Sitio B, así como PHE46 y SER152 que están fuera de la región del Sitio B en la Fig. 4. Además, es posible definir una «región del Sitio B» como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento B1 (correspondiente en I L-1 p a 1-5 de SEQ ID NO: 1), un segmento B2 (correspondiente en I L-1 p a 48-56 de SEQ ID nO: 1) y un segmento B3 (correspondiente en IL-1 p a 92-98 de SEQ ID NO: 1), y segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Sitio C. Los residuos del Sitio C en IL-1 p incluyen: ILE104, ILE106, ASN107, LYS109, GLU111, THR137, LYS138, GLY139, GLY140, GLN141, THR144 y ASP145 y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en esta memoria «residuos del Sitio C»). Además, es posible definir una «región del Sitio C» como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento C1 (correspondiente en I L-1 p a 136-145 de SEQ ID NO: 1) y los segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Sitio D. Los residuos del Sitio D en I L-1 p incluyen: LEU6, THR9, LYS63, GLU64, LYS65 y ASN66 y los residuos correspondientes de otros miembros de la familia de citocinas IL1 (denominados en esta memoria «residuos del Sitio D»). Además, es posible definir una «región del Sitio D» como se muestra en la Fig. 4, incluyendo por ejemplo un segmento D1 (correspondiente en I L-1 p a 6-9 de SEQ ID NO: 1), un segmento D2 (correspondiente en IL-1 p a 37-41 de SEQ ID NO: 1), un segmento d3 (correspondiente en IL-1 p a 63-66 de SEQ ID NO: 1), un segmento D4 (correspondiente en IL-1 p a 86-91 de SEQ ID NO: 1), un segmento D5 (correspondiente en IL-1 p a 150-153 de SEQ ID NO: 1) y los segmentos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL1.
Se puede obtener una mayor identificación de la ubicación de los residuos y las regiones para los Sitios A, B, C y D mediante el alineamiento de la citocina en cuestión con las secuencias que se muestran en la Fig. 4.
La secuencia de aminoácidos de IL-1 p (humana) mencionada en esta memoria es:
APVRSLNCTLRDSQQKSLVMSGPYELKALHLQGQDMEQQVVFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDD KPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWYISTSQAENMPVFLGGTKGGQDITDFTMQFVSS
(SEQ ID NO: 1).
La secuencia de aminoácidos de IL-1 a (humana) mencionada en esta memoria es:
SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFILNDALNQSIIRANDQYLTAAALHNLDEAVKFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVT AQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSETNLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFIATKQDYWVCLAGGPPSITDFQILENQA
(SEQ ID NO: 2).
La secuencia de aminoácidos de IL-1Ra (humana) mencionada en esta memoria es:
RPSGRKSSKMQAFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKIDVVPIEPHALFLGIHGGKMCLSCVKSGDETR LQLEAVNITDLSENRKQDKRFAFIRSDSGPTTSFESAACPGWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED
(SEQ ID NO: 3). Los términos IL-1 p, IL-1 a e IL-1Ra, según se emplean en esta memoria, se refieren a las proteínas maduras respectivas.
Las láminas p mencionadas en esta memoria, que se muestran en la Fig. 4, se refieren a las siguientes secuencias:
Tabla 1
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Los cálculos de «homología» o «identidad de secuencia» entre dos secuencias (los términos se utilizan indistintamente en esta memoria) se realizan de la siguiente manera. Se alinean las secuencias según los alineamientos proporcionados en esta memoria, o en ausencia de un alineamiento adecuado, se implementa el alineamiento óptimo determinado como la mejor puntuación utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch en el algoritmo de Needle del paquete EMBOSS empleando una matriz de puntuación Blosum 62 con una penalización por huecos de 10 y una penalización por extensión de huecos de 1. Véase Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453; Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, p. 1-44 Addison Wesley, y las herramientas disponibles en el European Bioinformatics Institute (Cambridge, RU) EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000), Rice, P. et al., A., Trends in Genetics 16, (6) pp. 276-­ 277 y disponible en línea en http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/align/index.html y http://emboss.openbio.org/wiki/Appdoc:Needle. A continuación, se comparan los residuos de aminoácidos o de nucleótidos en las posiciones de los aminoácidos o en las posiciones de los nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (tal como se emplea en esta memoria, la «identidad» de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a la «homología» de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias depende del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias. Para determinar la identidad colectiva de una secuencia de interés con un grupo de secuencias de referencia, se considera que una posición es idéntica si es idéntica a al menos un aminoácido en una posición correspondiente en una cualquiera o más de las secuencias del grupo de referencia. Con respecto a las listas de segmentos, características o regiones, la identidad se puede calcular en forma colectiva para todos los miembros de dicha lista para obtener un porcentaje de identidad general.
En esta memoria se describen secuencias que tienen al menos el 80, 82, 85, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad con las secuencias descritas en esta memoria.
Según se emplea en esta memoria, el término «correspondiente a» se utiliza para designar la posición de un residuo de aminoácidos en un polipéptido de interés con respecto a un polipéptido de referencia. En general, la posición es la indicada por un alineamiento proporcionado en esta memoria (por ejemplo, Fig. 4).
Según se emplea en esta memoria, el término «hibrida en condiciones de alta astringencia» describe las condiciones para la hibridación y el lavado. Se puede encontrar orientación para realizar las reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. En esa referencia, se describen métodos acuosos y no acuosos, y se puede utilizar cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación de alta astringencia incluyen hibridación en 6X de SSC a aproximadamente 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,2X de SSC, 0,1 % de SDS a 65 °C o condiciones sustancialmente similares. En esta memoria se proporcionan ácidos nucleicos aislados que contienen secuencias que se hibridan en condiciones de alta astringencia con los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de aminoácidos descritas en esta memoria y con los ácidos nucleicos descritos en esta memoria, por ejemplo, en el ejemplo 1.
Las proteínas naturales a las que se hace referencia en esta memoria incluyen específicamente la forma humana de dicha proteína y también formas de otras especies de mamíferos.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un gráfico de la estructura de P04 determinada a partir de los datos de cristalografía de rayos X. La estructura principal de los residuos de IL-1Ra se muestra en negro y la estructura principal de los residuos de IL-1 p se muestra en gris.
La Fig. 2 presenta tres vistas de un modelo de la proteína P05 unida al dominio extracelular de IL-1RI humana. En P05, los residuos de IL-1Ra se presentan en negro y los residuos de IL-1 p se presentan en blanco.
La Fig. 3 presenta modelos de proteínas quiméricas en el que los residuos de IL-1Ra se ilustran en negro y los residuos de IL-1 p se ilustran en blanco. El modelo presenta las proteínas: P01 (Fig. 3A), P03 (Fig. 3B), P04 (Fig. 3C), P05 (Fig. 3D), P07 (Fig. 3E) y P06 (Fig. 3F).
La Fig. 4 proporciona un alineamiento de varias citocinas de la familia IL-1 humana: IL-1 p (SEQ ID NO: 1), IL-1 a (SEQ ID NO: 2), IL-1Ra (SEQ ID NO: 3), IL-33 (SEQ ID NO: 4), IL-36Ra (SEQ ID NO: 5), IL-36a (SEQ ID NO: 6), IL-36p (SEQ ID NO: 7) e IL-36y (SEQ ID NO: 8). Los segmentos mencionados en esta memoria están identificados debajo del alineamiento. Además, se identifican las láminas p y los bucles entre dichas láminas.
La Fig. 5A es una lista de la secuencia de aminoácidos de P01 (SEQ ID NO: 17). La Fig. 5B es una lista de la secuencia de aminoácidos de P02 (SEQ ID NO: 18). La Fig. 5C es una lista de la secuencia de aminoácidos de P03 (SEQ ID NO: 19). La Fig. 5D es una lista de la secuencia de aminoácidos de P04 (SEQ ID NO: 20). La Fig. 5E es una lista de la secuencia de aminoácidos de P05 (SEQ ID NO: 21). Los segmentos de IL-1 p se muestran en negrita y cursiva. Véase también el ejemplo 1 a continuación.
La Fig. 6 es una imagen de un gel de SDS-PAGE en el que se observan muestras ejemplares de proteína purificada de células de E. coli que expresan agentes de unión al receptor. Los marcadores de 15 y 20 kDa de peso molecular se indican a la izquierda. Los carriles son de la siguiente manera: marcador de peso molecular (carriles 1 y 6), extracto (carriles 2 y 7), material purificado por cromatografía de intercambio catiónico (carriles 3 y 8), material adicionalmente purificado por cromatografía de intercambio aniónico (carriles 4 y 9) y muestras reducidas de dicho material (carriles 5 y 10). Los carriles 2-5 son de purificación de P05 y los carriles 6-10 son de purificación de P04. Véase también el ejemplo 2.
La Fig. 7A es una tabla acompañada por una gráfica de barras que muestra la capacidad de las proteínas P06, P07 y P01 de agonizar la señalización relativa a IL-1 p y un control negativo, proteína p-glucuronidasa (GUS). La Fig. 7B es una gráfica que presenta el antagonismo de IL-1 p en diversas concentraciones de IL-1 p por P01.
La Fig. 8A es una gráfica que presenta el antagonismo de IL-1p por P03 (marcada con hexahistidina), P04 (marcada con hexahistidina), P05 (marcada con hexahistidina) e IL-1Ra en presencia de IL-1 p (humana) 0,1 ng/ml. La Fig. 8B es una gráfica que presenta el antagonismo de IL-1 p por los lisados que contienen las formas no marcadas de P01, P02, P03, P04 y P05 e IL-1Ra en presencia de I L-1 p (humana) 0,1 ng/ml y que utiliza estimaciones de la concentración de proteína en los lisados respectivos.
La Fig. 9 contiene gráficas de datos de SPR que muestran la cinética de unión a IL-1RI soluble inmovilizado para las siguientes proteínas: IL-1 p (Fig. 9A), IL-1Ra (Fig. 9B), P04 (Fig. 9C) y P05 (Fig. 9D).
La Fig. 10A es una gráfica que presenta la desnaturalización térmica de IL-1Ra, IL-1 p, P03, P04 y P05 como se describe en el ejemplo 7. La Fig. 10B presenta la primera derivada negativa de la gráfica en la Fig. 10A.
La Fig. 11A es una gráfica de barras que muestra la puntuación media de tinción corneal ± SEM según lo evaluado por tinción con fluoresceína de la córnea por ojo de dos estudios independientes, en los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron ningún tratamiento (n = 18), P05 10 mg/ml (n=19) o PBS 1,25x, el vehículo (n = 20). Los asteriscos indican la significancia estadística de P05 con relación al vehículo de la siguiente manera: * (P < 0,05) y ** (P < 0,005).
La Fig. 11B es una gráfica de barras que representa los datos de un experimento separado que muestra la puntuación media de tinción corneal ± SEM de la córnea por ojo, en los días 0, 3, 7, 9 y 11 para ratones en un modelo de ojo seco. Los ratones no recibieron ningún tratamiento (n = 8), vehículo PBS 1,25x (n =8), albúmina sérica murina (MSA) 10 mg/ml (n = 8) o P05 10 mg/ml (n=9). Los asteriscos indican la significancia estadística de P05 con relación a la albúmina sérica murina de la siguiente manera: * (P < 0,05) y *** (P < 0,0005).
La Fig. 11C es una gráfica de barras que incluye datos para los ratones que fueron tratados con Restasis® (emulsión de ciclosporina al 0,05 %) (n = 8) en el mismo experimento que en la Fig. 11B. Los asteriscos indican la significancia estadística de P05 con relación al Restasis® de la siguiente manera: ** (P < 0,005) y *** (P < 0,0005).
La Fig. 12A presenta la estructura de la estructura de cristalografía de rayos X (negro) de P04 superpuesta sobre un modelo calculado (gris) de su estructura. La Fig. 12B ilustra las interacciones entre K64 y E39 de P04; la Fig. 12C ilustra las interacciones entre los residuos Q149 y S152 del extremo C con K40 y R9 de P04.
Descripción detallada
La familia IL-1 de citocinas incluye varios miembros, teniendo todos un plegamiento p-trébol que comprende seis cadenas p que forman un barril p cubierto por otras seis cadenas p. Las estructuras primarias de las formas humanas y de otros mamíferos de estas citocinas son conocidas. Un alineamiento estructural ejemplar de varios miembros de la familia IL-1 humana se muestra en la Fig. 1.
Hemos descubierto, entre otras cosas, que el plegamiento IL-1 es altamente plástico. En particular, se pueden combinar elementos de miembros diferentes para proporcionar proteínas que agonizan o antagonizan la señalización de citocinas. Los ejemplos de estas proteínas incluyen dominios de citocinas quiméricos que incluyen, por ejemplo, dos o más segmentos o residuos de la superficie de una citocina en el contexto de otra citocina o una secuencia de consenso de citocinas, creando así combinaciones de origen no natural de sitios de interacción con el receptor de citocinas de la familia IL-1 diferentes.
Las citocinas de la familia IL-1 pueden incluir al menos dos sitios de interacción principales con el receptor, denominados Sitio A y Sitio B. Los Sitios A y B participan en los contactos con el receptor de citocinas principal (por ejemplo, IL-1RI). En el caso de IL-1Ra e IL-1 p, por ejemplo, las dos proteínas difieren sustancialmente con respecto a los sitios A y B de modo que IL-1 Ra tiene menos contactos con el receptor en el Sitio B que en el Sitio A.
Hemos descubierto que es posible construir dominios de citocinas quiméricos funcionales que incluyen un Sitio A derivado de una citocina y un Sitio B derivado de otra citocina. La plasticidad del plegamiento de IL-1 permite la construcción de diversos dominios de citocinas quiméricos para antagonizar la señalización de IL-1.
Además, las citocinas de la familia IL-1 pueden incluir dos sitios de interacción secundarios con el receptor, denominados Sitio C y Sitio D, que participan en el agonismo y/o antagonismo, y pueden ser determinantes de la capacidad de una citocina de interactuar con su receptor de citocinas secundario (por ejemplo, IL-1RAcP). La inclusión de los residuos del Sitio C y/o Sitio D de los antagonistas del receptor naturales (tal como IL-1Ra) puede conferir propiedades antagonistas. Se pueden construir dominios de citocinas quiméricos que incluyen uno o ambos de los Sitios A y B de uno o más agonistas de IL-1 (tal como IL-1p e IL-1 a) y/o un antagonista del receptor de IL-1 (tal como IL-1Ra) y uno o ambos de los Sitios C y D de un antagonista del receptor de IL-1 (tal como IL-1Ra). Por lo tanto, es posible producir un dominio de citocinas quimérico que antagoniza la señalización y que incluye los residuos del Sitio B de un agonista de IL-1.
También se proporcionan combinaciones ejemplares en la tabla 2 a continuación:
Tabla 2
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Las secuencias de origen pueden ser idénticas a las secuencias humanas para los dominios de citocinas identificados o pueden contener mutaciones relativas a las secuencias humanas, por ejemplo, de modo que tienen al menos el 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más de identidad con las secuencias humanas en cada región respectiva, por ejemplo, pueden incluir uno o más segmentos de cada región.
Se pueden seleccionar orígenes para los residuos del Sitio A y los residuos del Sitio B para maximizar la afinidad por el receptor principal. Por ejemplo, para unirse a IL-1RI, los residuos del Sitio A se pueden derivar de IL-1Ra y los residuos del Sitio B se pueden derivar de I L-1 p.
Un dominio de citocinas quimérico puede tener la capacidad de unirse a un receptor de la familia IL-1, por ejemplo, IL-1RI humana con una Kd inferior a 10' 8 , 10' 9 o 10' 10, por ejemplo, una Kd de entre 10 y 100 veces la Kd de un ligando del receptor natural (por ejemplo, I L-1 p, IL-1 a o IL-1 Ra) en las mismas condiciones o menos que la de un ligando natural (por ejemplo, I L-1 p, I L-1 a o IL-1 Ra) en las mismas condiciones. Por otra parte, en determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas quimérico se une con una Kd menor, una Kasoc más rápida o una Kdisoc más lenta que al menos uno de sus dominios de citocinas madre.
Los dominios de citocinas quiméricos que se unen al receptor de la familia IL-1 y que antagonizan la señalización del receptor se pueden utilizar como agentes de unión al receptor, por ejemplo, para tratar trastornos mediados por la señalización de citocinas de la familia IL-1 como se describe a continuación. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de la invención comprende un dominio de citocinas quimérico que se une a IL-1RI y antagoniza la señalización de IL-1, como se establece en las reivindicaciones. Por ejemplo, tiene una CI50 inferior a 100, 10, 1, 0,6 o 0,3 nM.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas puede tener al menos el 40, 45 o 50 % de identidad, pero menos que identidad completa, por ejemplo, menos del 95, 90, 85 u 80 % de identidad con un primer dominio de citocinas de la familia IL-1. Al mismo tiempo, el dominio de citocinas también puede tener al menos el 40, 45 o 50 % de identidad, pero menos que identidad completa, por ejemplo, menos del 95, 90, 85 u 80 % de identidad con un segundo dominio de citocinas de la familia IL-1. El primer y el segundo dominio de citocinas de la familia IL-1 pueden tener menos del 50 % de identidad entre sí. Por ejemplo, el primer dominio de citocinas de la familia IL-1 puede ser un agonista (por ejemplo, I L-1 p o IL-1 a), mientras que el segundo dominio de citocinas de la familia IL-1 puede ser un antagonista del receptor (por ejemplo, IL-1Ra).
En algunas realizaciones de la descripción, al menos el 80, 85, 90, 92, 94, 95, 97, 98, 99 o 100 % de las posiciones dentro del dominio de citocinas tienen la propiedad de que, en cada posición, el aminoácido presente es idéntico al primer dominio de citocinas de la familia IL-1 o al segundo dominio de citocinas de la familia IL-1 (o ambos, si el primer y el segundo dominio de citocinas de la familia IL-1 son idénticos en la posición específica). Cuando el 100 % de las posiciones de los aminoácidos en el dominio de citocinas tienen esta propiedad, el dominio es una quimera completa de dos citocinas. Los dominios de citocinas quiméricos también pueden estar compuestos por más de dos citocinas y también pueden tener mutaciones con respecto a sus citocinas madre (por ejemplo, una o más posiciones específicas en el que el aminoácido presente difiere del aminoácido correspondiente en cada una de sus citocinas madre).
Los dominios de citocinas pueden tener residuos del Sitio A, B, C y D de dominios de citocinas de IL-1 diferentes y, asimismo, pueden tener regiones del Sitio A, B, C y D de dominios de citocinas de IL-1 diferentes.
SITIO A. Por ejemplo, en determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos de un antagonista (por ejemplo, IL-1Ra) o un agonista del receptor en al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17 o 18 de los residuos del Sitio A identificados anteriormente, o en al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 de los residuos del Sitio A extendido identificado anteriormente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100 % de dichos residuos. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye residuos que tienen al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los segmentos A1, A2 o A1+A2 en un antagonista (por ejemplo, IL-1Ra) o un agonista del receptor (por ejemplo, IL-1 p o IL-1 a).
En determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos que son idénticos a un agonista de IL-1 (por ejemplo, residuos de IL-1 p) en al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17 o 18 de los residuos del Sitio A identificados en esta memoria, o al menos 5, 10, 12, 15, 16, 17, o 18 de los residuos del Sitio A extendido identificados anteriormente, o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100 % de dichos residuos.
SITIO B. En determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos que son idénticos a un agonista de IL-1 (por ejemplo, residuos de IL-1 p o IL-1 a) en al menos 2, 3, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 de los residuos del Sitio B identificados en esta memoria, , o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100 % de dichos residuos. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye residuos que tienen al menos el 70, 75, 80, 85, 88, 90, 92, 95 o 100 % de identidad con los segmentos B1, b2, B3, B1+B2, B1+B3, B2+B3 o B1+B2+B3 en un agonista de citocinas IL-1 (por ejemplo, IL-1 p o IL-1 a).
SITIO C. En determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos que son idénticos a un antagonista del receptor (por ejemplo, residuos de IL-1Ra) en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de los residuos del Sitio C identificados en esta memoria, , o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90 o 100 % de dichos residuos. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye residuos que tienen al menos el 50, 65, 75, 80, 90 o 100 % de identidad con el segmento C1 en un antagonista del receptor (por ejemplo, IL-1Ra).
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas puede incluir, por ejemplo, uno o más de: un aminoácido hidrofóbico (por ejemplo, Met o Ile) en la posición correspondiente a THR137 de SEQ ID NO: 1, o un aminoácidos hidrofóbico, por ejemplo, uno alifático (por ejemplo, Val o Ile), en la posición correspondiente a GLN141 de SEQ ID NO: 1, y un aminoácido no ácido, tal como un aminoácido básico (por ejemplo, Lys o Arg) en la posición correspondiente a ASP145 de SEQ ID NO: 1, y los residuos en las posiciones correspondientes a estos en otras citocinas IL-1. Las pruebas indican que Asp145 es importante para el reclutamiento de IL-1RAcP y, por lo tanto, la mutación en un residuo no ácido desestabiliza la actividad agonista y se puede utilizar para lograr propiedades antagonistas. Por lo tanto, en determinadas realizaciones de la descripción, un aminoácido no ácido, tal como un aminoácido básico (por ejemplo, Lys o Arg) o un aminoácido hidrofóbico, está ubicado en la posición correspondiente a ASP145 de SEQ ID NO: 1.
SITIO D. En determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos que son idénticos a un antagonista del receptor (por ejemplo, residuos de IL-1Ra) en al menos uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis de los residuos del Sitio D identificados en esta memoria, , o sustituciones conservadoras de dichos residuos, o al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100 % de dichos residuos. En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye residuos que tienen al menos el 50, 65, 75, 80, 90, 95 o 100 % de identidad con los segmentos D1, D2, D3, D4, D5, D1+D2, D1+D2+D3 y sus combinaciones en un antagonista del receptor (por ejemplo, IL-1Ra).
Diversos residuos en IL-1 p se ponen en contacto o están cercanos a IL-1RI, por ejemplo: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, ALA127, GLU128, ASN129, MET130, GLN141, GLN149, PHE150 y SER152. Además de la designación en los sitios como se describió anteriormente, estos residuos se pueden clasificar en dos conjuntos: Conjunto 1 y Conjunto 2.
Los residuos del Conjunto 1 ejemplares en IL-1 p incluyen: ARG11, SER13, GLN14, GLN15, GLU25, LYS27, LEU29, HIS30, LEU31, GLN32, GLY33, GLN34, ASP35, MET36, GLN38, GLN39, ALA127, GLU128, ASN129, MET130 y GLN141 y los residuos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL-1. Los residuos del Conjunto 1 extendido incluyen los residuos de interacción del Conjunto 1 y los residuos dentro de 4 angstrom de los anteriores en la estructura 1ITB. Los residuos del Conjunto 2 ejemplares en IL-1 p incluyen: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4, LEU6, PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56, PRO57, LYS92, LYS93, LYS94, LYS103, GLU105, ASN108, GLN149, PHE150 y SER152 y los residuos correspondientes en otros miembros de la familia de citocinas IL-1. Los residuos del Conjunto 2 extendido incluyen los residuos de interacción del Conjunto 2 y los residuos dentro de 4 ángstrom de los anteriores en la estructura 1ITB. En determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Conjunto 1 identificados anteriormente. En determinadas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o 22 de los residuos del Conjunto 2 identificados anteriormente. En algunas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Conjunto 1 extendido. En algunas realizaciones de la descripción, un dominio de citocinas incluye residuos de IL-1 p en al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de los residuos del Conjunto 2 extendido.
Otras variantes que se pueden utilizar como un agente de unión al receptor incluyen las proteínas que tienen secuencias derivadas de dos o más miembros de la familia de citocinas IL-1. Los ejemplos de dichas variantes incluyen dominios quiméricos basados en IL-1 p e IL-1Ra. Por ejemplo, las variantes pueden incluir uno o más residuos de aminoácidos del Conjunto 1 de IL-1 Ra (por ejemplo, todos los residuos del Conjunto 1 de IL-1Ra) y uno o más residuos de aminoácidos del Conjunto 2 de I L-1 p (por ejemplo, todos los residuos del Conjunto 2 de IL-1 p). Las proteínas quiméricas ejemplares son mayoritariamente idénticas (por ejemplo, al menos el 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 o 100 %) a IL-1 p en las siguientes posiciones de aminoácidos (es decir, con base en la correspondencia con estas posiciones en IL-1 p): residuos 1-8, 42-120 y 141-153 de SEQ ID NO: 1; residuos 1-6, 45-61, 86-95 y 148-153 de SEQ ID NO: 1 y residuos 1-10, 37-125 y 131-153 de SEQ ID NO: 1.
Los residuos restantes pueden ser mayoritariamente idénticos (por ejemplo, al menos el 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 o 100 %) a IL-1Ra. Por ejemplo, las siguientes posiciones de aminoácidos pueden ser mayoritariamente idénticas a IL-1Ra: residuos 9-41 y 121-140 de SEQ ID nO: 1; residuos 7-44, 62-85 y 96-147 de SEQ ID NO: 1 y residuos 11-36 y 126-130 de SEQ ID NO: 1.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas es idéntico a IL-1 p en al menos 2, 4, 5, 10 o 20 posiciones además de las posiciones de los aminoácidos Gln48 - Asn53 de IL-1 p, y, por ejemplo, el dominio de citocinas es mayoritariamente idéntico, por ejemplo, al menos el 50, 60, 70, 75, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 97, 98, 99 o 100 % de identidad con una citocina diferente de IL-1 p.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos 3, 4, 5, 6, 7 u 8 residuos idénticos con IL-1 p en las posiciones correspondientes a 1-8 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 3, 4 o a los 5 de: ALA1, PRO2, VAL3, ARG4 y LeU6.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 residuos idénticos a I L-1 p en las posiciones correspondientes a 45-61 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 3, 4, 5, 6, 7 u 8 de: PHE46, GLN48, GLU51, SER52, ASN53, LYS55, ILE56 y PRO57.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos 5, 6, 7, 8, 9 o 10 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 86-95 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a uno, dos o los tres de LYS92, LYS93 y LYS94.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos 3, 4, 5 o 6 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 148-153 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, incluye residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a uno, dos o los tres de GLN149, PHE150 y SER152.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no incluye una treonina en la posición correspondiente a THR147 en IL-1 p. Por ejemplo, esta posición puede ser un aromático, por ejemplo, una tirosina. El aromático en la posición correspondiente a THR147 en IL-1 p se puede comprimir contra otro aromático (por ejemplo, triptófano) presente en diversas realizaciones en la posición 11 (según la numeración de IL-1 p).
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas no incluye un aromático en la posición correspondiente a CYS8 en IL-1 p. Por ejemplo, esta posición puede ser un aminoácido diferente de fenilalanina u otro que no sea un aromático. Por ejemplo, puede ser cisteína, valina, serina, treonina o alanina. Esta posición está ubicada cerca de otros residuos voluminosos, especialmente MET44 y MET148 (según la numeración de IL-1 p). Preferentemente, no todas las posiciones 8, 43 y 148 son residuos voluminosos.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos cinco, seis o siete residuos idénticos a IL-1Ra en las posiciones correspondientes a 30-36 de SEQ ID NO: 1, por ejemplo, al menos cinco, seis o siete residuos idénticos a YLQGPNV (SEQ ID NO: 43). Por ejemplo, el dominio de citocinas incluye al menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o 26 residuos idénticos a IL-1Ra en las posiciones correspondientes a 11-36 de SEQ ID NO: 1. El dominio de citocinas también puede incluir un residuo básico en la posición correspondiente a 145 de SEQ ID NO: 1.
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye: (a) un ácido glutámico en la posición correspondiente a Val40 de IL-1 p y lisina en la posición correspondiente a Lys65 de IL-1 p; (b) arginina en la posición correspondiente a Thr9 de IL-1 p y glutamina en la posición correspondiente a Gln149 de IL-1 p; y/o (c) lisina en la posición correspondiente a V41 de IL-1 p y serina en la posición correspondiente a Ser152 de IL-1 p.
El dominio de citocinas también puede incluir al menos cuatro, cinco, seis o siete residuos idénticos a IL-1Ra en las posiciones correspondientes a 126-132, por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis o siete residuos idénticos a MEADQPVS (SEQ ID NO: 44).
En determinadas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye al menos 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 residuos idénticos a IL-1 p en las posiciones correspondientes a 62-85 de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones de la descripción, el dominio de citocinas incluye una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos (por ejemplo, las cuatro de): RSLAFR (SEQ ID NO: 45), IDVSFV (SEQ ID NO: 46), KKMDKR (SEQ ID NO: 47) y KfYmQF (sEq ID NO: 48); una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro de) RSLAFR (SEQ ID NO: 45), IDVSFV (SEQ ID NO: 46), NKLSFE (SEQ ID NO: 49) y KFYMQF (SEQ ID NO: 48); una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro de) RSLAFR (SEQ ID NO: 45), EEKFSM (SEQ ID NO: 50), RFVFIR (SEQ ID NO: 51) y VTKFTM (SeQ ID NO: 52); una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro de) RSLAFR (SEQ ID NO: 45), EEKFSM (SEQ ID NO: 50), FESAAC (SEQ ID NO: 53) y VTKFTM (SEQ ID NO: 54); o una o más de las siguientes (por ejemplo, las cuatro de) LNCRIW (SEQ ID NO: 55), EEKFSM (SEQ ID NO: 50), PNWFLC (SEQ ID NO: 56) y KFYMQF (SEQ ID NO: 48).
Las proteínas quiméricas se pueden utilizar para diversos fines. Por ejemplo, se pueden utilizar para aumentar o disminuir la actividad de señalización del receptor, para detectar células que expresan receptores o para purificar células o proteínas a las cuales se unen.
Los ejemplos específicos de dominios de citocinas quiméricos que se basan en I L-1 p e IL-Ra se proporcionan en el Ejemplo 1 a continuación e incluyen los siguientes dominios de citocinas ejemplares que antagonizan la señalización de IL-1:
P01. El dominio de P01 incluye tres segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Val48, Ile60-Val83 y Asp95-Tyr147 de SEQ ID NO: 3 y los cuatro segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio de P01 tiene 74 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente el 48 % de identidad) y 119 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente el 77 % de identidad). Estos porcentajes suman más del 100 % porque varios aminoácidos en P01 y otras proteínas ejemplares descritas en esta memoria son aminoácidos que se conservan entre I L-1 p e IL-1Ra y, por lo tanto, contribuyen al porcentaje de identidad para IL-1 p e IL-1 Ra.
P02. El dominio de P02 incluye tres segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Val48, Ile60-Val83 y Ser110-Tyr147 de SEQ ID NO: 3 y los cuatro segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio de P02 tiene 85 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente el 55 % de identidad) y 108 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente el 70 % de identidad).
P03. El dominio de P03 incluye dos segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Lys45 y Phe100-Lys145 de SEQ ID NO: 3, y los tres segmentos restantes de I L-1 p. En general, el dominio de P03 tiene 94 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente el 61 % de identidad) y 91 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente el 64 % de identidad).
P04. El dominio de P04 incluye dos segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Ala12-Lys45 y Ala114-Lys145 de SEQ ID NO: 3, y los tres segmentos restantes de IL-1 p. En general, el dominio de P04 tiene 104 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente el 68 % de identidad) y 89 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente el 58 % de identidad).
P05. El dominio de P05 incluye dos segmentos de IL-1Ra correspondientes a los aminoácidos Arg14-Lys45 y Phe120-Tyr147 de SEQ ID NO: 3, y los tres segmentos restantes de I L-1 p. En general, el dominio de P05 tiene 108 de 153 aminoácidos de IL-1 p (aproximadamente el 70 % de identidad) y 85 aminoácidos de IL-1Ra (aproximadamente el 55 % de identidad).
Se pueden construir otras proteínas quiméricas de manera similar. Por ejemplo, las proteínas quiméricas se pueden hacer entre IL-1 a e IL-1Ra, por ejemplo, específicamente dominios que incluyen los segmentos identificados de IL-1Ra en combinación con los residuos correspondientes de IL-1 a en lugar de IL-1 p para cada uno de los ejemplos anteriores.
Sustituciones y modificaciones de proteínas
Las secuencias de proteínas, tales como las descritas en esta memoria, se pueden variar, por ejemplo, realizando una o más sustituciones conservadoras. Se pueden hacer sustituciones conservadoras para retener la función o para realizar cambios moderados en la función. En la siguiente tabla, se describen sustituciones conservadoras ejemplares:
Tabla 3
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Las sustituciones se pueden elegir sobre la base de su efecto potencial sobre (a) la estructura fundamental cercana a la sustitución, por ejemplo, una lámina o conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen y la ramificación de la cadena lateral. Los residuos de aminoácidos se pueden clasificar sobre la base de las propiedades de la cadena lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutrales: cys, ser, thr; asn; gln; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: his, lys, arg; (5) residuos que afectan la conformación de la estructura: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras pueden incluir la sustitución de un miembro de una de estas clases por un miembro de una clase diferente. Las sustituciones conservadoras pueden incluir la sustitución de un miembro de una de estas clases por otro miembro de la misma clase.
La significancia de un residuo determinado también se puede evaluar en el contexto del índice hidropático para el aminoácido. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático basándose en sus características de hidrofobicidad y carga: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5). Para conocer un planteamiento sobre el índice hidropático de los aminoácidos y su significancia véase, por ejemplo, Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-131.
La secuencia de una proteína se puede variar a través de cualquier método, incluyendo mutagénesis mediada por oligonucleótidos (dirigida a sitio), (Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331, 1986; Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487, 1987), mutagénesis por inserción de un casete (Wells et al., Gene, 34:315, 1985), mutagénesis por selección de restricción (Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London, 317:415, 1986) y mutagénesis dirigida por pCr . Véase también "In Vitro Mutagenesis Protocols": tercera edición, Braman (ed.), Humana Press, (2010) ISBN: 1607616513 y "PCR Cloning Protocols: From Molecular Cloning to Genetic Engineering", Chen y Janes (ed.), Humana Press, (2002) ISBN: 0896039730.
Se puede emplear análisis de barrido de aminoácidos para evaluar uno o más aminoácidos a lo largo de una secuencia contigua. El método puede comprender mutar todos o casi todos los aminoácidos en una región a un aminoácido específico, por ejemplo, a un aminoácido neutro relativamente pequeño, tal como alanina, serina o valina. Típicamente, se escoge alanina porque elimina la cadena lateral más allá del carbono beta y es menos probable que altere la conformación de la cadena principal de la variante (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081­ 1085, 1989). Además, es el aminoácido más común y frecuentemente se encuentra en posiciones tanto enterradas como expuestas (Creighton, The Proteins, (W. H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1, 1976). El proceso de barrido también se puede adaptar para realizar cambios más marcados, por ejemplo, los residuos cargados se pueden cambiar por residuos de la carga opuesta, los residuos con cadenas laterales cortas se pueden reemplazar por residuos con cadenas laterales voluminosas. Por ejemplo, el barrido de arginina es un enfoque que se puede utilizar en lugar del barrido de alanina o además de este último. El barrido se puede aplicar a cada residuo en una región o a residuos de una característica específica, por ejemplo, residuos en la superficie, o cerca de esta, de una proteína o que sea probable que estén en la superficie, o cerca de esta, de la proteína.
La estructura de una proteína, uno de sus dominios o un complejo que involucra la proteína se pueden modelar, por ejemplo, realizando modelado basado en homología, minimización de la energía y/u otro tipo de modelado utilizando las estructuras resueltas conocidas. Dichos métodos incluyen: Accelrys Software Inc., Discovery Studio®, Release 3.0, San Diego: Accelrys Software Inc., 2010, software de modelado AMBER™ (Case et al. (2005) J. Computat. Chem. 26, 1668 - 1688 y Case et al. (2010), AMBER 11, University of California, San Francisco, Ca EE. UU.) y software de modelado CHARMM™ (Molecular Simulations Inc.). Véase también en general Baker y Sali, Science 294(5540):93-6, 2001). La estructura también se puede determinar directamente, por ejemplo, utilizando cristalografía de rayos X y/o espectroscopía de RMN.
Las estructuras de PDB ejemplares que describen la estructura de las citocinas de la familia IL-1 incluyen: 1I1B, 1ILR, 1IRA, 1ITB, 2I1B, 2ILA, 2KLL, 4I1B, 5I1B, 6I1B, 7I1B, 8I1B, 9ILB y 1MD6 (disponible en http de www.pdb.org de RCSB-Rutgers, Piscataway NJ, EE. UU. y en la Biblioteca Nacional de Medicina (Bethesda, MD, EE. UU.)). Por ejemplo, se han resuelto las estructuras de IL-1 p sola y en complejo con el receptor IL-1RI. Véase, por ejemplo, Finzel et al. (1989) J. Mol. Biol. 209: 779-791, PDB 1ITB y Vigers et al. (1997) Nature 386: 190-194. La estructura de IL-1Ra con IL-1RI también se ha resuelto. Véase, por ejemplo, PDB 1IRA y Schreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200.
El modelado por homología puede estar asistido por el alineamiento de secuencias, por ejemplo, utilizando un software informático, tal como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), PSI-BLAST, PHI-BlAST, WU-BLAST-2 y/o MEGABLAST. Véase Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410; Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266, 460-480 y Karlin et al., 1993, PNAS USA. 90, 5873-5787. Los algoritmos adicionales para el alineamiento de macromoléculas (secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos) incluyen FASTA (Pearson, 1995, Protein Science 4, 1145-1160), ClustalW (Higgin et al., 1996, Methods Enzymol. 266, 383-402), DbClustal (Thompson et al., 2000, Nucl. Acids Res. 28, 2910-2926) y Molecular Operating Environment (Chemical Computing Group, Montreal, Quebec Canadá H3A 2R7). Además, se puede utilizar el algoritmo de Myers y Miller (Myers y Miller, CABIOS 4, 11-17, 1988) que se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0) del paquete de software de alineamiento de secuencias GCG.
Se puede obtener una secuencia de consenso para IL-1 p e IL-1Ra comparando las dos secuencias e identificando los residuos que son idénticos o que están altamente conservados. Un dominio de citocinas quimérico descrito en esta memoria puede tener al menos el 60, 70, 80, 90, 95 o 100 % de dichos residuos idénticos o residuos altamente conservados. Una secuencia de consenso ejemplar es: DXXQKX{8-9}L-AXXLQGX{18-28}LGX{7}LSCVXXXDXXXLQLEXVX{8-9}KXXKRFXFX{10}FESAXXPXWXXXTXXXXXXPVXLX{5-6}GXXXTXFXXQ (SEQ ID NO: 57), en la que X es independientemente cualquier aminoácido y el número o intervalo de subíndice es el número de apariciones. Un dominio de citocinas quimérico descrito en esta memoria puede tener al menos el 60, 70, 80, 90, 95 o 100 % de identidad con la secuencia de consenso (en el que los residuos X no se cuentan para la identidad). Otras secuencias de consenso se pueden identificar del mismo modo.
Se pueden realizar otras variantes de un miembro de la familia de citocinas IL-1 y evaluarlas utilizando un sistema basado en la exposición u otro cribado basado en bibliotecas. Por ejemplo, se pueden exponer o expresar y evaluar las variantes de la proteína para conocer la capacidad de unirse a un receptor para el miembro de la familia de citocinas IL-1. Por ejemplo, se pueden evaluar las variantes de IL-1 p, IL-1Ra o un dominio de citocinas descrito en esta memoria para conocer la capacidad de unirse al dominio extracelular soluble de IL-1RI. Una descripción general de los sistemas basados en exposición incluye los siguientes: para la exposición en células, Chao et al. Nat Protoc. 2006;1(2):755-68; Colby et al. Methods Enzymol. 2004;388:348-58; Boder et al., Methods Enzymol.
2000;328:430-44), para la exposición en fagos (por ejemplo, Viti et al., Methods Enzymol. 2000;326:480-505 y Smith (1985) Science 228:1315-1317) y para la exposición en ribosomas (por ejemplo, Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022 y Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92; Hanes et al. (2000) Methods Enzymol.
328:404-30; y Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-3.
Aunque muchas de las realizaciones descritas en esta memoria se ejemplifican utilizando secuencias de citocinas IL-1 humana como dominios madre, muchas otras citocinas IL-1, por ejemplo, de otras especies, se conocen y están disponibles y se pueden encontrar en bases de datos públicas, tales como Entrez (Biblioteca Nacional de Medicina, Bethesda MD) y EBI-EMBL (Hinxton, Cambridge, Reino Unido). Los ejemplos de dichas secuencias de la base de datos UNIPrOT (disponible en UniProt.org y véase The UniProt Consortium, Nucleic Acids Res. D142-D148 (2010)), incluyen los siguientes:
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Los dominios de citocinas descritos en esta memoria también pueden incluir sustituciones presentes en los dominios de citocinas variantes que son capaces de unirse a IL-1 Ri. Por ejemplo, la posición 15 de SEQ ID NO: 1 (correspondiente a la posición 20 de SEQ ID NO: 3) puede ser Met o Asn. La posición 30 de SEQ ID NO: 1 (correspondiente a la posición 34 de SEQ ID NO: 3) puede ser Gly, His, Trp o Met.
Las variantes ejemplares adicionales de IL-1 p e IL-1Ra incluyen las descritas en Boraschi et al. (1996) Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library 1, d270-308, Evans et al., J. Biol. Chem., 270:11477 (1995) y Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995). Por ejemplo, las variantes de IL-1 p incluyen R11G, R11A, Q15H, E105G y T147G. Véase, por ejemplo, Evans et al. Las variantes de IL-1Ra incluyen W16Y, Q20M, Q20N, Y34G, Y34H, Y34W, Y34M, Y147G, Y147H, Y147M, K145D, H54P, V18S, T108K, C116F, C122S, C122A, Y147G, H54P, H54I y otras en Evans et al. y Greenfeder et al., J. Biol. Chem., 270:22460 (1995). Un dominio de citocinas puede incluir un residuo idéntico a IL-1Ra en una de las posiciones anteriores. Un dominio de citocinas también puede incluir un residuo diferente de una de las mutaciones anteriores en una posición correspondiente.
Además, las citocinas de la familia IL-1 pueden incluir uno o más residuos de cisteína desparejados. Se pueden mutar uno o más, por ejemplo, dos, tres o todos los residuos de cisteína desparejados a otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido sin carga, tal como alanina o serina. Por ejemplo, P01 incluye cisteínas en las posiciones 67, 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: 17. Se pueden sustituir una, dos, tres o las cuatro de dichas cisteínas por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido sin carga, tal como alanina o serina. P02 incluye cisteínas en las posiciones 67, 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: 18. Se pueden sustituir una, dos, tres o las cuatro de dichas cisteínas por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido sin carga, tal como alanina o serina. P03 incluye cisteínas en las posiciones 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: 19. Se pueden sustituir una, dos o las tres de dichas cisteínas por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido sin carga, tal como alanina o serina. P04 incluye cisteínas en las posiciones 70, 116 y 122 de SEQ ID NO: 20. Se pueden sustituir una, dos o las tres de dichas cisteínas por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido sin carga, tal como alanina o serina. P05 incluye cisteínas en las posiciones 8, 70 y 122 de SEQ ID NO: 21. Se pueden sustituir una, dos o las tres de dichas cisteínas por otro aminoácido, por ejemplo, un aminoácido sin carga, tal como alanina o serina.
Un dominio de citocinas de la familia IL-1, incluyendo los dominios de citocinas quiméricos descritos en esta memoria, también se puede permutar cíclicamente. Por ejemplo, se puede reposicionar un segmento C-terminal del dominio de modo que sea N-terminal para el extremo amino terminal original y un segmento N-terminal (que generalmente comprende el resto de la proteína original después de la escisión del segmento C-terminal). Se pueden separar los dos segmentos reposicionados mediante un conector (por ejemplo, de entre aproximadamente tres y diez aminoácidos). Generalmente, se retienen todos los aminoácidos en el dominio antes de la permutación, excepto por el cambio en el orden. En algunas realizaciones de la descripción, el punto de corte para la permutación puede estar en una región flexible, por ejemplo, un bucle flexible como el p6-p7 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 71-80 de SEQ ID NO: 3) o el bucle p7-p8 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 84­ 99 de SEQ ID NO: 3).
En algunas realizaciones de la descripción, un agente de unión al receptor descrito en esta memoria, por ejemplo, un agente de unión al receptor que incluye un dominio de citocinas de la familia IL-1 tiene un peso molecular inferior a 30, 25, 22, 20, 19, 18 o aproximadamente 17 kDa. En algunas realizaciones de la descripción, el agente de unión al receptor tiene un peso molecular superior a 18, 19, 20, 22, 25, 30, 40, 45 o 50 kDa. Por ejemplo, el agente de unión al receptor puede incluir otros componentes polipeptídicos, poliméricos o no poliméricos, por ejemplo, componentes que modifican la farmacocinética, la estabilidad, la inmunogenicidad y/o el peso molecular de los agentes.
La proteína puede incluir otras modificaciones, por ejemplo, modificaciones posteriores a la traducción o sintéticas. En determinadas realizaciones de la descripción, el agente de unión al receptor no está glicosilado. En otras realizaciones de la descripción, el agente de unión al receptor incluye al menos una glicosilación.
Por ejemplo, los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria pueden incluir dominios y características adicionales. Por ejemplo, un agente de unión al receptor se puede fusionar, directa o indirectamente, con un dominio de una proteína anticuerpo, por ejemplo, con un dominio Fc o con uno o más dominios constantes (por ejemplo, CH1, c H2 o CH3). Por ejemplo, los dominios pueden ser dominios humanos o variantes de dominios humanos. El dominio Fc o uno o más de los dominios constantes pueden estar ubicados en posición N-terminal o C-terminal respecto al agente de unión al receptor.
Los dominios Fc se pueden obtener de cualquier inmunoglobulina adecuada, por ejemplo, de un anticuerpo humano, por ejemplo, tal como un anticuerpo de los subtipos IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4, IgA, IgE, IgD o IgM. En un ejemplo, el dominio Fc incluye una secuencia de un residuo de aminoácido en aproximadamente la posición Cys226 o de aproximadamente la posición Pro230, respecto al extremo carboxilo terminal del dominio Fc. Un dominio Fc generalmente incluye dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3 y, opcionalmente, incluye un dominio CH4. También se describen los anticuerpos con sustituciones en una región Fc de estos y semividas séricas elevadas en WO00/42072, WO 02/060919; Shields et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Hinton, J. Biol. Chem. 279:6213-6216 (2004). La numeración de los residuos en una cadena pesada de IgG es la del índice EU como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NH1, MD (1991) con referencia a la numeración del anticuerpo EU de IgG1 humana.
En una realización de la descripción, un agente de unión al receptor incluye un epítopo de unión al receptor de rescate que aumenta la semivida sérica in vivo, como se describe, por ejemplo, en la Patente US 5.739.277 y en Ghetie et al., Ann. Rev. Immunol. 18:739-766 (2000). En algunas realizaciones, el epítopo se incluye en una región Fc que se fusiona con el agente de unión al receptor.
En una realización de la descripción, un agente de unión al receptor puede incluir una secuencia de albúmina sérica o una parte de dicha secuencia que se une al receptor FcRn, o una secuencia que se une a la albúmina sérica, por ejemplo, la albúmina sérica humana. Por ejemplo, se pueden asociar determinados péptidos unidos a la albúmina sérica con el agente de unión al receptor, por ejemplo, la secuencia DICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 22). Véase también, Dennis et al. J. Biol. Chem. 277:35035-35043 (2002).
Se pueden modificar los agentes de unión al receptor para incluir una secuencia que aumenta el tamaño y la estabilidad del agente, por ejemplo, una secuencia descrita en WO2008/155134 o WO2009/023270. Generalmente, dichas secuencias pueden ser biológicamente inactivas, por ejemplo, no modulan la señalización mediada por los miembros de la familia de citocinas IL-1. Se pueden utilizar diversas secuencias de polipéptidos estabilizadoras, por ejemplo, secuencias ricas en glicina y/o serina, así como otros aminoácidos, tales como glutamato, aspartato, alanina o prolina. Por ejemplo, se pueden diseñar las secuencias de modo que tengan al menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 % de residuos de glicina y/o serina. En algunas realizaciones, la longitud combinada de las secuencias de polipéptidos estabilizadoras que están unidas a una proteína puede ser de al menos 20, 25, 35, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700, 800, 900 o más de 1.000 o 2.000 aminoácidos. Por ejemplo, las secuencias estabilizadoras se pueden fusionar con un polipéptido biológicamente activo, por ejemplo, con el extremo amino o carboxilo terminal del agente de unión al receptor. La fusión de las secuencias estabilizadoras puede dar lugar a un aumento significativo en el radio hidrodinámico de la proteína de fusión con respecto a la proteína no modificada, que se puede detectar, por ejemplo, mediante ultracentrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño o dispersión de luz. En algunas realizaciones, las secuencias estabilizadoras contienen pocos o ninguno de los siguientes aminoácidos: cisteína (para evitar la formación de disulfuro y la oxidación), metionina (para evitar la oxidación), asparagina y glutamina (para evitar la desamidación) y aspartato. Se pueden diseñar las secuencias estabilizadoras de modo que contengan residuos de prolina que tienden a reducir la sensibilidad a la degradación proteolítica.
Ensayos de unión
La interacción de un agente de unión al receptor y sus dianas se puede analizar utilizando cualquier enfoque adecuado, incluyendo, por ejemplo, radioinmunoensayos, ensayos de unión celular y resonancia del plasmón superficial (SPR). Un ensayo de unión celular ejemplar que utiliza competencia de proteínas radioyodadas se describe en Boraschi, J. Immunol., 155(10):4719-25 (1995).
La SPR o el análisis de interacción biomolecular (BIA) pueden detectar las interacciones bioespecíficas en tiempo real y sin marcar a ninguno de los elementos de la interacción. Los cambios de masa en la superficie de unión (que indican un evento de unión) del chip de BIA provocan modificaciones del índice de refracción de la luz cerca de la superficie (el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR)). Los cambios en la refractividad generan una señal detectable, que se miden como una indicación de reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas. Los métodos para utilizar SPR se describen, por ejemplo, en Raether, 1988, Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky, 1991, Anal. Chem. 63:2338-2345; Szabo et al., 1995, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705 y los recursos en línea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia). Se puede utilizar un sistema BIACORE® o un Reichert SR7000DC SPR de doble canal para comparar y clasificar las interacciones en tiempo real, en términos de cinética, afinidad o especificidad sin el uso de marcadores. Se pueden medir las afinidades de unión de un agente de unión al receptor para un dominio extracelular del receptor de citocinas (por ejemplo, el dominio extracelular de IL-1RI) utilizando SPR en condiciones aproximadamente fisiológicas, por ejemplo, HEPES 10 mM a pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005 % de Tween-20. Además, se pueden utilizar otros métodos que no se basan en SPR, por ejemplo, para medir la unión y la afinidad.
Se puede utilizar la información de los ensayos de unión para proporcionar una medida exacta y cuantitativa de la constante de disociación en el equilibrio (KD) y los parámetros cinéticos (por ejemplo, Kasoc y Kdisoc) para la unión de un agente de unión al receptor a una diana. Estos datos se pueden utilizar para comparar diferentes proteínas, dianas y condiciones. Esta información también se puede utilizar para desarrollar relaciones estructura-actividad (SAR). Por ejemplo, los parámetros cinéticos y de unión en equilibrio de las proteínas variantes se pueden comparar con los parámetros de una proteína de referencia o madre. Se pueden identificar aminoácidos variantes en determinadas posiciones que se correlacionan con parámetros de unión específicos, por ejemplo, alta afinidad y baja Kdisoc. Se puede combinar esta información con el modelado estructural (por ejemplo, utilizando modelado por homología, minimización de la energía o determinación de la estructura por cristalografía de rayos X o RMN).
Se pueden producir las proteínas utilizadas para evaluar las afinidades en forma recombinante y pueden incluir etiquetas adecuadas para la purificación o inmovilización, por ejemplo, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, una etiqueta hemaglutinina, una etiqueta His o una fusión del dominio Fc. Se pueden producir los dominios extracelulares de las proteínas del receptor (tales como IL-1RI e IL-1RAcP) en forma recombinante por expresión, por ejemplo, en células bacterianas o de insectos, por ejemplo, utilizando expresión del baculovirus en células Sf9. Se pueden inmovilizar las proteínas del receptor solubles en el sistema BIAcore, por ejemplo, utilizando chips que incluyen reactivos que se unen a sus etiquetas, por ejemplo, un chip recubierto con IgG específica para el dominio Fc u otra etiqueta.
Ensayos de actividad celular
Se puede evaluar la capacidad de los agentes de unión al receptor de funcionar como antagonistas del receptor, por ejemplo, en un ensayo basado en células. Por ejemplo, es posible evaluar la inhibición de IL-1RI por un agente de unión al receptor. Diversos ensayos ejemplares para la actividad de IL-1 se describen en Boraschi et al. e incluyen ensayos de proliferación de células T, ensayos de producción de IL-6 e IL-8 e inhibición de la afluencia de calcio.
En un ensayo ejemplar, se evalúa la capacidad de un agente de unión al receptor de inhibir la liberación estimulada por IL-1 p de IL-6 de fibroblastos humanos. La inhibición de la liberación de citocinas estimulada por IL-1 p en células MRC5 se correlaciona con la capacidad del agente de inhibir la actividad mediada por IL-1 in vivo. Los detalles del ensayo se describen en Dinarello et al., Current Protocols in Immunology, Ch. 6.2.1-6.2.7, John Wiley and Sons Inc., 2000. En resumen, los fibroblastos humanos MRC5 humana (N.° de ATCC CCL-171, Manassas VA, EE. UU.) se crecen hasta la confluencia en placas de múltiples pocillos. Se tratan las células con dosis tituladas del agente de unión al receptor y controles. Posteriormente, las células se ponen en contacto con IL-1 p 100 pg/ml en presencia del agente titulado y/o los controles. Las células de control negativo no se estimulan con IL-1 p. Se mide la cantidad de IL-6 liberada en cada grupo de células tratadas utilizando un kit de ELISA para IL-6 (por ejemplo, BD Pharmingen, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.). Los controles que se pueden utilizar incluyen tampón solo, IL-1Ra y anticuerpos frente a IL-1p.
La eficacia de un agente de unión al receptor también se puede evaluar in vivo. Un ensayo ejemplar se describe en Economides et al., Nature Med., 9:47-52 (2003). En resumen, se inyectan a los ratones por vía intraperitoneal dosis tituladas del agente de unión al receptor y controles. Veinticuatro horas después de la inyección, se inyecta a los ratones por vía subcutánea IL-1 p recombinante humana en una dosis de 1 pg/kg. Dos horas después de la inyección de la IL-1 p (tiempo de respuesta máximo de IL-6), se sacrifican los ratones, se recolecta la sangre y se procesa para obtener el suero. Los niveles séricos de IL-6 se analizan por ELISA. Se puede calcular el porcentaje de inhibición basándose en la proporción de IL-6 detectada en el suero animal experimental respecto a la IL-6 detectada en los controles.
Otros ensayos ejemplares para conocer la actividad de IL-1 in vivo se describen en Boraschi et al. e incluyen un ensayo de anorexia, hipoglucemia y neutrofilia.
Producción
Los agentes de unión al receptor se pueden producir por expresión en células huésped recombinantes, pero también a través de otros métodos tales como transcripción y traducción in vitro y síntesis química.
Para la expresión celular, se pueden insertar uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) que codifican un agente de unión al receptor en un vector replicable para la clonación o para la expresión. Diversos vectores se encuentran disponibles al público. Por ejemplo, el vector puede ser un plásmido, un cósmido, un genoma viral, un fagémido, un genoma del fago u otra secuencia de replicación autónoma. Se puede introducir la secuencia de ácido nucleico codificante adecuada en el vector mediante varios procedimientos. Por ejemplo, se pueden preparar por ingeniería sitios de endonucleasa de restricción adecuados (por ejemplo, utilizando PCR). A continuación, se pueden utilizar la digestión de restricción y la ligación para insertar la secuencia de ácido nucleico codificante en una ubicación adecuada. Los componentes del vector generalmente incluyen uno o más de un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción.
El agente de unión al receptor se puede producir por recombinación bien en forma aislada o por fusión con uno o más componentes adicionales, tales como una secuencia señal, un epítopo o un grupo de purificación y un marcador. El agente de unión al receptor puede incluir el prodominio de un miembro de la familia interleucina-1, por ejemplo, que posteriormente se puede eliminar por procesamiento proteolítico.
Para la expresión bacteriana, el agente de unión al receptor se puede producir con o sin una secuencia señal. Por ejemplo, se puede producir dentro de las células de modo que se acumula en los cuerpos de inclusión o en la fracción soluble. También se puede secretar, por ejemplo, mediante la adición de una secuencia señal procariota, por ejemplo, una secuencia líder adecuada, tal como de fosfatasa alcalina, penicilinasa o enterotoxina II termoestable. Las células huésped bacterianas ejemplares para la expresión incluyen cualquier cepa transformable de E. coli K-12 (tal como E. coli BL21, C600, ATCC23724; E. coli HB101 NRRLB-11371, ATCC-33694; E. coli MM294 ATCC-33625; E. coli W3110 ATCC-27325), las cepas de B. subtilis, Pseudomonas y otros bacilos. Las proteínas producidas en sistemas bacterianos típicamente carecerán de glicosilación. Por lo tanto, los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria pueden carecer sustancialmente de glicosilación, por ejemplo, carecen de las modificaciones por glicosilación de una célula de mamífero u otra célula eucariota.
El agente de unión al receptor se puede expresar en una célula huésped de levadura, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Hanseula o Pichia pastoris. Para la expresión en levaduras, el agente de unión al receptor también se puede producir intracelularmente o por secreción, por ejemplo, utilizando el líder de la invertasa de levadura o el líder del factor alfa (incluyendo las formas Saccharomyces y Kluyveromyces), el líder de la fosfatasa ácida o el líder de la glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179 publicada el 4 de abril de 1990). En la expresión en células de mamífero, se pueden utilizar secuencias señal de mamíferos para dirigir la secreción de la proteína, tales como secuencias señal de polipéptidos secretados de la misma especie o de una relacionada, así como líderes secretores virales. Alternativamente, el agente de unión al receptor se puede producir con un prodominio de un miembro de la familia interleucina-1, por ejemplo, un prodominio de IL-1 a o IL-1 p.
Los vectores tanto de expresión como de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Estas secuencias son muy conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas; el origen del plásmido de 2 p es adecuado para levaduras; y diversos orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación típicamente contienen un gen o marcador de selección. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas (tales como el marcador URA3 en Saccharomyces) o (c) suministran nutrientes fundamentales que no están disponibles en medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica D-alanina racemasa para Bacilli. También hay diversos marcadores disponibles para células de mamíferos, por ejemplo, DHFR o timidina cinasa. DHFR se puede utilizar junto con una línea celular (tal como una línea celular CHO) deficiente en la actividad de DHFR, preparada y propagada según lo descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980).
Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de unión al receptor para dirigir la síntesis del ARNm. Los promotores ejemplares adecuados para el uso con huéspedes procariotas incluyen los sistemas de promotores de la plactamasa y de la lactosa (Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)), fosfatasa alcalina, un sistema de promotores de triptófano (trp) (Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776) y promotores híbridos, tales como el promotor tac (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80:21-25 (1983)). Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también pueden contener una secuencia Shine-Dalgarno adecuadamente ubicada. El sistema de la polimerasa T7 también se puede utilizar para dirigir la expresión de una secuencia de ácido nucleico codificante colocada bajo el control del promotor T7. Véase, por ejemplo, los vectores pET (EMD Chemicals, Gibbstown NJ, EE. UU.) y las células huésped, por ejemplo, como se describe en Novagen User Protocol TB053 disponible en EMD Chemicals y en US 5.693.489. Por ejemplo, dichos vectores se pueden utilizar en combinación con células BL21(DE3) y células BL21(DE3) pLysS para producir proteína, por ejemplo, al menos 0,05, 0,1 o 0,3 mg por ml de cultivo celular. Otras líneas celulares que se pueden utilizar incluyen lisógenos DE3 de B834, BLR, HMS174, NovaBlue, incluyendo células que contienen un plásmido pLysS.
Los promotores ejemplares para el uso con células de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa y piruvato cinasa. Otros promotores de levadura ejemplares son inducibles y tienen la ventaja adicional de que la transcripción está controlada por las condiciones del crecimiento. Los ejemplos de promotores inducibles incluyen las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, metalotioneína y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa.
La expresión de ARNm que codifica un agente de unión al receptor a partir de vectores en células huésped de mamíferos se puede controlar, por ejemplo, mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, adenovirus (tal como Adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y virus de simio 40 (SV40), de promotores de mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y de promotores de choque térmico. También se pueden utilizar sistemas de promotores heterólogos, por ejemplo, promotores que responden a tetraciclina. Véase Urlinger, S. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968. La transcripción también puede estar dirigida por una secuencia potenciadora, ubicada en cis o trans. Las secuencias potenciadoras de mamíferos ejemplares incluyen las secuencias potenciadoras para globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína e insulina. Los ejemplos adicionales incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación y los potenciadores de adenovirus. El potenciador se puede cortar y empalmar en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificante para el agente de unión al receptor, pero preferentemente se ubica en un sitio en 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células huésped eucariotas (células de levadura, hongo, insecto, planta, animal, ser humano, o nucleadas de otros organismos multicelulares) también pueden contener secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para la estabilización del ARNm. Dichas secuencias se encuentran disponibles comúnmente a partir de las regiones no traducidas en 5' y, ocasionalmente 3', de ADN o ADNc eucariota o viral. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm que codifica el agente de unión al receptor. El vector de expresión también puede incluir una o más secuencias intrónicas.
El agente de unión al receptor también se puede expresar en células de insectos, por ejemplo, células Sf9 o SF21, por ejemplo, utilizando el sistema pFAST-BAC™. Los vectores de expresión del baculovirus adicionales ejemplares están disponibles en Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad CA, EE. UU. El agente de unión al receptor también se puede expresar en células de mamíferos. Por ejemplo, las líneas celulares de origen mamífero también se pueden emplear. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamíferos incluyen la línea COS-7 de células de riñón de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa y líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) y la línea celular CV1/EBNA derivada de la línea celular CV1 de riñón de mono verde africano (ATCC CCL 70) como se describe en McMahan et al. (EMBO J. 10: 2821, 1991). Los métodos establecidos para introducir ADN en células de mamíferos se han descrito (Kaufman, R. J., Large Scale Mammalian Cell Culture, 1990, p. 1569).
Otros métodos, vectores y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis del agente de unión al receptor en células recombinantes se describen en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, tercera ed., Sambrook y col. (eds.), Cold Spring Harbor Press, (2001) (ISBN: 0879695773).
Una vez expresados en células, los agentes de unión al receptor se pueden recuperar del medio de cultivo, cuerpos de inclusión o lisados de células. Las células se pueden disrumpir mediante varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de congelación-descongelación, sonicación, disrupción mecánica o agentes que lisan las células (por ejemplo, detergentes).
Los agentes de unión al receptor se pueden purificar a partir de otras proteínas o polipéptidos celulares que se pueden encontrar en lisados de células o en el medio celular. Se pueden emplear diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos se conocen en la técnica y se describen por ejemplo en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (2010) (ISBN: 1441928332). Los ejemplos de procedimientos de purificación incluyen: mediante fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación con etanol; HPLC en fase inversa; cromatografía en sílice o en una resina de intercambio catiónico tal como DEAE; cromatoenfoque; SDS-PAGE; precipitación con sulfato de amonio; filtración en gel utilizando por ejemplo Sephadex G-75; columnas de sefarosa de proteína A para eliminar contaminantes tales como IgG; y columnas de afinidad (por ejemplo, columnas de quelante de metales para unir formas marcadas con epítopo de la proteína y columnas con diversos ligandos para unir cualquier grupo de purificación que esté asociado con el agente de unión al receptor). Un método de purificación puede incluir una combinación de dos etapas de cromatografía de intercambio iónico diferentes, por ejemplo, cromatografía de intercambio catiónico seguida de una cromatografía de intercambio aniónico o viceversa. Los agentes de unión al receptor se pueden eluir de una resina de intercambio iónico a través de diversos métodos que incluyen gradientes o etapas de pH y/o sal. El agente de unión al receptor puede incluir un grupo de purificación (por ejemplo, etiquetas de epítopos y asas de afinidad). Dichos grupos se pueden utilizar para la cromatografía de afinidad y se pueden eliminar opcionalmente por escisión proteolítica.
La cromatografía de intercambio iónico también se puede utilizar como una técnica de separación de intercambio iónico. La cromatografía de intercambio iónico separa moléculas sobre la base de las diferencias entre la carga global de las moléculas y se puede utilizar para separar la forma intacta de los agentes de unión al receptor de otras formas de dichas proteínas.
Los sustituyentes aniónicos o catiónicos pueden estar unidos a matrices para formar soportes aniónicos o catiónicos para la cromatografía. Los sustituyentes de intercambio aniónico incluyen grupos dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amina cuaternaria (Q). Los sustituyentes catiónicos incluyen carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonato (S). Las resinas de intercambio iónico de celulosa tales como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 y CM-52 están disponibles en Whatman Ltd. (Maidstone, Kent, RU). SEPHADEX™ y otros intercambiadores de iones reticulados también son conocidos. Por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM- y SP-SEPHADEX™ y DEAE-, Q-, CM- y S-SEPHAROSE™ y SEPHAROSE™ Fast Flow están disponibles en Pharmacia AB. El copolímero de metacrilato-etilenglicol derivatizado DEAE y CM, tal como ToYo PEARL DEAE-650S o M y TOYOPEARL CM-650S o M están disponibles en Toso Haas Co. (Filadelfia, PA, EE. UU.).
Una superficie de intercambio catiónico es una superficie de intercambio iónico con ligandos con carga negativa unidos por enlace covalente y que, por lo tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución en contacto con la superficie. Las superficies ejemplares incluyen resinas de intercambio catiónico, tales como aquellas en las que los grupos unidos por enlace covalente son carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen celulosa CMC, SP-Sephadex™ y Fast S-Sepharose™ (Pharmacia).
Una superficie de intercambio aniónico es una superficie de intercambio iónico con grupos con carga positiva unidos por un enlace covalente, tales como grupos amino cuaternarios. Una superficie de intercambio aniónico ejemplar es una resina de intercambio aniónico, tal como celulosa DEAE, TMAE, QAE Sephadex™ y Fast Q Sepharose™ (Pharmacia).
Un esquema de purificación ejemplar para un agente de unión al receptor incluye el lisado de células de E. coli en tampón de lisis seguido de filtración en profundidad. A continuación, el material se somete a cromatografía de intercambio catiónico (CEX). A continuación, se deja fluir el eluato de CEX sobre un medio de intercambio aniónico en una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (AEX). El AEX FT puede estar sujeto a una etapa de pulido. A continuación, se puede procesar el material por ultrafiltración/diafiltración, por ejemplo, para concentrar o desalar el material. Las membranas de ultrafiltración/diafiltración se pueden seleccionar basándose en el corte de peso molecular nominal («NMWCO») con el fin de retener la proteína en el retenido, mientras se permite que los materiales de peso molecular bajo tales como sales pasen hacia el filtrado. Se puede utilizar cualquier solución tampón o agua estéril durante la etapa de intercambio de tampón final, por ejemplo, dependiendo del pH y la conductividad finales deseados del producto.
Un agente de unión al receptor se puede almacenar en diversas soluciones, incluyendo agua, PBS y soluciones tamponadas. Las soluciones tamponadas ejemplares incluyen acetato de sodio pH 4,5, acetato de sodio pH 4,7, acetato de sodio pH 4,9, acetato de sodio pH 5,1, acetato de sodio pH 5,3, acetato de sodio pH 5,5, succinato pH 5,2, succinato pH 5,4, succinato pH 5,6, succinato pH 5,8, histidina pH 5,7, histidina pH 6,0, histidina pH 6,3, histidina 6,6, fosfato de sodio pH 6,5, fosfato de sodio pH 6,7, fosfato de sodio 7,0, fosfato de sodio pH 7,3, fosfato de sodio pH 7,7, imidazol pH 6,5, imidazol pH 6,8, imidazol pH 7,2, Tris pH 7,0, Tris pH 7,5, Tris pH 7,7. Los agentes tamponantes pueden estar presentes, por ejemplo, en una concentración de aproximadamente 1-100 mM, 5-50 mM, 10-50 mM o 5-25 mM. La solución puede incluir además una sal, tal como NaCl (por ejemplo, 50 mM, 150 mM o 250 mM e intervalos intermedios), arginina (por ejemplo, aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 7,5 % e intervalos intermedios), sacarosa (por ejemplo, aproximadamente el 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 7,5 %, 8,5 %, 10 %, 15 % e intervalos intermedios) y/o glicerol (por ejemplo, aproximadamente el 0,5 %, 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 7,5 %, 8,5 %, 10 %, 15 % e intervalos intermedios).
El agente de unión al receptor puede estar presente en la composición en una cantidad de al menos 50 mg, 100 mg, 500 mg, 1 g, 5 g, 10 g o más.
Métodos analíticos
Proteínas de células huésped (HCP) se refiere a las proteínas en una preparación que difieren de un agente de unión al receptor y, por ejemplo, son proteínas endógenas de la célula huésped a partir de la cual se preparó el agente de unión al receptor, típicamente proteínas de E. coli. Preferentemente, las proteínas de células huésped están presentes en menos de 10.000, 1.000, 900, 800 o 700 ppm (partes por millón). Las HCP se pueden detectar, por ejemplo, por ELISA u otros métodos de detección. Por ejemplo, el ELISA puede utilizar anticuerpos policlonales frente a HCP. Un kit ejemplar está disponible en Cygnus Technologies (CN# F410; Southport NC, EE. UU.). Otro kit ejemplar utiliza tecnología AlphaScreen (Kit de HCP de E. coli AlphaLisa®, Número de producto AL261 C/F, Perkin Elmer, Waltham MA, EE. UU.).
El material que contiene o que potencialmente contiene un agente de unión al receptor se puede evaluar, por ejemplo, utilizando cromatografía líquida de alta presión. Las técnicas analíticas ejemplares incluyen cromatografía líquida de intercambio catiónico débil de alto rendimiento (wCEX-HPLC), cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alto rendimiento (SE-HPLC), cromatografía líquida en fase inversa, ESI-MS, espectrometría de masas por ionización con turbopulverización, espectrometría de masas por ionización con nanopulverización, espectrometría de masas por ionización con termopulverización, espectrometría de masas por ionización con pulverización sónica, SELDI-MS y MALDI-MS.
La región N terminal de un agente de unión al receptor puede incluir secuencias idénticas a los péptidos de la región N terminal de IL-1 p, por ejemplo, el péptido APVRS (SEQ ID NO: 58). Las células recombinantes (especialmente las células de E. coli) que expresan dichas proteínas pueden producir la proteína intacta, así como otras isoformas, incluyendo la isoforma des-Ala y una isoforma con una metionina adicional (por ejemplo, N terminal respecto a Ala1). Los agentes de unión al receptor que incluyen una prolina en la posición 2 de aminoácidos (en el que el residuo N terminal está en la posición 1) pueden ser susceptibles a la escisión por proteasas de E. coli, tales como aminopeptidasa P que tiene especificidad de escisión para X-PRO. Esta escisión puede eliminar el aminoácido N terminal. Por ejemplo, P03, P04 y P05 tienen una prolina en la posición 2. Las formas intactas de P03, P04 y P05 tienen una longitud de 153 aminoácidos y comienzan con alanina, mientras que las especias con des-Ala tienen una longitud de 152 aminoácidos y comienzan con prolina.
Las técnicas analíticas como las anteriores se pueden utilizar para distinguir entre las formas intactas y las otras formas, por ejemplo, una especie con des-Ala. Una técnica analítica ejemplar es wCEX-HPLC. Por ejemplo, se puede evaluar P05 utilizando una columna de 4x250 mm de Dionex ProPac® WCX-10 (Número de producto 054993) como se describe en el Ejemplo 9 a continuación. Los picos de WCX-HPLC se pueden evaluar por (RP)-HPLC de fase inversa de C4 en línea con espectrometría de masas. P05 intacta tiene la masa teórica: 17.700,4 Da y es detectable como 17.700,4 Da. La especie con des-Ala es detectable como 17.629,4 Da, que es 71 Da menor que la masa de P05 intacta. La reducción de 71 Da en la masa corresponde a la eliminación de un solo residuo de alanina.
Composiciones farmacéuticas
La proteína de la invención (tal como se define en las reivindicaciones) se puede formular como una composición farmacéutica, como se establece en las reivindicaciones. Típicamente, la composición es estéril e incluye uno o más de un tampón, una sal farmacéuticamente aceptable y un excipiente o estabilizador. Por ejemplo, la composición puede ser una composición acuosa. La proteína de la invención (tal como se define en las reivindicaciones) se puede formular según los métodos estándar para un producto biológico. Véase por ejemplo, Gennaro (ed.), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20° Dd., Lippincott, Williams & Wilkins (2000) (ISBN: 0683306472); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed., Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1999) (ISBN: 0683305727); Kibbe (ed.), Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed. (2000) (ISBN: 091733096X); Protein formulation and delivery, McNally y Hastedt (eds.), Informa Health Care (ISBN: 0849379490) (2007).
Un agente de unión al receptor para una composición farmacéutica es típicamente al menos el 10, 20, 50, 70, 80, 90, 95, 98, 99 o 99,99 % puro y típicamente carece de proteínas humanas. Puede ser la única proteína en la composición o la única proteína activa en la composición. También se puede combinar con una o más proteínas activas, por ejemplo, una o más proteínas activas purificadas adicionales, por ejemplo, una proteína relacionada o no relacionada. En algunas realizaciones de la descripción, la composición puede contener el agente de unión al receptor en una concentración de entre aproximadamente el 0,001-10 %, por ejemplo, el 0,001-0,1 %, el 0,01-1 % o el 0,1 %-10 %.
Por lo tanto, en esta memoria también se presentan formas purificadas y aisladas de los agentes descritos en esta memoria. El término «aislado» se refiere a un material que se retira de su ambiente original (por ejemplo, las células o los materiales a partir de los cuales se produce el agente de unión al receptor). Las composiciones farmacéuticas pueden carecer sustancialmente de materiales pirogénicos, carecer sustancialmente de ácidos nucleicos y/o carecer sustancialmente de componentes y enzimas celulares, por ejemplo, polimerasas, proteínas ribosomales y proteínas chaperonas.
Una composición farmacéutica puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en esta memoria, un «vehículo farmacéuticamente aceptable» incluye cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Una «sal farmacéuticamente aceptable» se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto base y no confiere ningún efecto toxicológico no deseado (véase, por ejemplo, Berge, S.M. et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19), por ejemplo, sales de adición de ácidos y sales de adición de bases.
En una realización de la descripción, el agente de unión al receptor se formula con uno o más excipientes, tales como cloruro de sodio, y un tampón de fosfato (por ejemplo, fosfato de sodio dibásico heptahidratado, fosfato de sodio monobásico) y polisorbato. Se puede proporcionar, por ejemplo, en una solución tamponada, por ejemplo, en una concentración de aproximadamente 5-100, 5-30, 30-50 o 50-100 mg/ml y se puede almacenar a 2-8 °C. Las composiciones farmacéuticas también pueden estar en muchas otras formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones y liposomas. La forma preferida puede depender de la vía de administración y de la aplicación terapéutica pretendidas. Las composiciones para los agentes descritos en esta memoria están típicamente en forma de soluciones inyectables o infundibles, o son para administración tópica u ocular (véase a continuación).
Las composiciones farmacéuticas típicamente son estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. También se puede evaluar una composición farmacéutica para garantizar que cumpla con los estándares reguladores y de la industria para la administración. La composición se puede formular como una solución, una microemulsión, una dispersión, un liposoma u otra estructura ordenada adecuada para altas concentraciones del fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación de un agente descrito en esta memoria en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes mencionados anteriormente, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación de un agente descrito en esta memoria en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los mencionados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el secado al vacío y el liofilizado que proporcionan un polvo de un agente descrito en esta memoria más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución de este filtrada previamente en condiciones estériles. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como la lecitina, manteniendo el tamaño de las partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de surfactantes. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede diseñar mediante la inclusión de un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.
Por ejemplo, un agente de unión al receptor puede estar asociado con un polímero, por ejemplo, un polímero sustancialmente no antigénico, tal como un óxido de polialquileno o un óxido de polietileno. En algunas realizaciones, el polímero está unido por enlace covalente al agente de unión al receptor, por ejemplo, directa o indirectamente. Los polímeros adecuados varían sustancialmente según el peso. Se pueden utilizar polímeros que tienen pesos moleculares promedios en número que oscilan entre aproximadamente 200 y aproximadamente 35.000 daltones (o entre aproximadamente 1.000 y 15.000 y entre 2.000 y aproximadamente 12.500). Por ejemplo, un agente de unión al receptor se puede conjugar con un polímero soluble en agua, por ejemplo, un polímero de polivinilo hidrofílico, por ejemplo, alcohol polivinílico o polivinilpirrolidona. Una lista no exhaustiva de dichos polímeros incluye los homopolímeros de óxido de polialquileno, tales como polietilenglicol (PEG) o polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, sus copolímeros y sus copolímeros de bloque, siempre y cuando la solubilidad en agua de los copolímeros de bloque se mantenga. Otros polímeros útiles incluyen polioxialquilenos, tales como polioxietileno, polioxipropileno y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno (Plurónicos); polimetacrilatos; carbómeros; polisacáridos ramificados o sin ramificar que incluyen los monómeros de sacáridos D-manosa, D- y L-galactosa, fucosa, fructosa, D-xilosa, L-arabinosa, ácido D-glucurónico, ácido siálico, ácido D-galacturónico, ácido D-manurónico (por ejemplo, ácido polimanurónico o ácido algínico), D-glucosamina, D-galactosamina, D- glucosa y ácido neuramínico incluyendo homopolisacáridos y heteropolisacáridos tales como lactosa, amilopectina, almidón, hidroxietil almidón, amilosa, sulfato de dextrano, dextrano, dextrinas, glucógeno, o la subunidad de polisacárido de mucopolisacáridos ácidos, por ejemplo, el ácido hialurónico; polímeros de alcoholes de azúcar, tales como polisorbitol y polimanitol; heparina o heparán.
En determinas realizaciones de la descripción, el agente de unión al receptor se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto de la liberación rápida. Se puede administrar como una formulación de liberación controlada, administrada por un implante o un sistema de administración microencapsulado. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como el acetato de etilenvinilo, los polianhídridos, el ácido poliglicólico, el colágeno, los poliortoésteres y el ácido poliláctico. Véase, en general, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
Administración
Un agente de unión al receptor se puede administrar a un sujeto, por ejemplo, un sujeto humano, a través de diversos métodos, tales como administración intravenosa, como un bolo o por infusión continua durante un período de tiempo, por inyección intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intrasinovial, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intrarraquídea, epidural e inyección e infusión intraesternal. Otros modos de administración adicionales incluyen las vías tópicas (por ejemplo, dérmica o mucosal) o de inhalación (por ejemplo, intranasal o intrapulmonar). Para muchas aplicaciones, la vía de administración se selecciona de: inyección o infusión intravenosa, inyección subcutánea o inyección intramuscular.
Un agente de unión al receptor se puede administrar como una dosis fija o en una dosis de mg/kg. Se puede administrar por vía intravenosa (IV) o por vía subcutánea (SC). El agente de unión al receptor se puede administrar, por ejemplo, todos los días, en días alternos, cada tres, cuatro o cinco días, cada semana, cada tres a cinco semanas, por ejemplo, cada cuatro semanas o mensualmente.
Una composición farmacéutica puede incluir una «cantidad terapéuticamente eficaz» de un agente descrito en esta memoria. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente puede variar según factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo y la capacidad del compuesto de provocar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, mejora de al menos un parámetro del trastorno o mejora de al menos un síntoma del trastorno (y, opcionalmente, el efecto de cualquier agente adicional que se administra). Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una cantidad con la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve compensado por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Un agente de unión al receptor típicamente se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar utilizando dispositivos médicos, por ejemplo, implantes, bombas de infusión, agujas hipodérmicas y dispositivos de inyección hipodérmica sin aguja. El dispositivo puede incluir, por ejemplo, una o más cubiertas para el almacenamiento de las composiciones farmacéuticas y puede estar configurado para administrar dosis unitarias del agente de unión al receptor y, opcionalmente, un segundo agente. Las dosis pueden ser dosis fijas, es decir, unidades separadas físicamente dispuestas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se tratarán; cada unidad puede contener una cantidad predeterminada de agente de unión al receptor calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con un vehículo farmacéutico y, opcionalmente, en asociación con otro agente.
En algunas realizaciones de la descripción, para tratar un trastorno descrito en esta memoria, se puede administrar un agente de unión al receptor al sujeto que sufre el trastorno en una cantidad y durante un tiempo suficiente como para inducir una mejoría sostenida en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno. Se considera que una mejoría es «sostenida» si el sujeto manifiesta la mejoría en al menos dos ocasiones separadas durante una a cuatro semanas. El grado de mejoría se puede determinar en función de los signos o de los síntomas y también se pueden utilizar cuestionarios que se administran al sujeto, tales como cuestionarios de calidad de vida.
Se pueden evaluar varios indicadores que reflejan el grado de la enfermedad para determinar si las cantidades utilizadas y el tiempo del tratamiento son suficientes. El valor de la línea base para el indicador o los indicadores elegidos se establece mediante el examen del sujeto antes de la administración de la primera dosis del agente de unión al receptor. Preferentemente, el examen de la línea base se realiza en un plazo de aproximadamente 60 días antes de la administración de la primera dosis.
La mejoría puede ser inducida mediante la administración repetida de una dosis del agente de unión al receptor hasta que el sujeto manifiesta una mejoría con respecto a la línea base para el indicador o los indicadores elegidos. En el tratamiento de afecciones crónicas, el grado de mejoría se puede obtener mediante la administración repetida durante un período de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o más, o por tiempo indefinido. En el tratamiento de una enfermedad aguda, el agente se puede administrar durante un período de una a seis semanas o incluso en una dosis única.
Aunque la medida de la enfermedad después del tratamiento pueda parecer mejorada según uno o más indicadores, se puede continuar el tratamiento por tiempo indefinido en el mismo nivel o en una dosis o frecuencia reducidas. También se puede interrumpir el tratamiento, por ejemplo, tras la mejoría o desaparición de los síntomas. Una vez que se ha reducido o interrumpido el tratamiento, se puede retomar si los síntomas reaparecieran.
Tratamientos
Se puede utilizar un agente de unión al receptor, tal como un agente que se une a IL-1RI y que antagoniza la señalización de IL-1, para tratar un «trastorno mediado por IL-1», que incluye cualquier enfermedad o afección médica que (i) está causada al menos en parte por un agonismo de IL-1, (ii) está asociada con niveles o actividad elevados de un componente de la señalización de IL-1 (tal como IL-1 a, IL-1 p o IL-1RI) o señalización de IL-1 elevada y/o (iii) se mejora mediante la disminución de la actividad de IL-1. Los trastornos mediados por IL-1 incluyen trastornos agudos y crónicos, incluyendo trastornos autoinmunes y trastornos inflamatorios. Los trastornos mediados por IL-1 incluyen trastornos sistémicos y no sistémicos. Está bien establecido que IL-1 a e IL-1 p son citocinas proinflamatorias potentes implicadas en las respuestas infecciosas, así como en enfermedades inflamatorias, incluyendo la artritis reumatoide. Se ha observado un aumento en la producción de IL-1 en pacientes con diversos trastornos autoinmunes, isquemia y varios cánceres, implicando, por lo tanto, a IL-1 en estas enfermedades y en otras enfermedades relacionadas.
Véase también en general Sims y Smith, The IL-1 family: regulators of immunity, Nature Reviews Immunology, doi: 10.1038/nri2691 (2010).
El término «tratar» se refiere a la administración de un agente descrito en esta memoria a un sujeto, por ejemplo, un paciente, en una cantidad, manera y/o modo eficaces para mejorar una afección, síntoma o parámetro asociado con un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en esta memoria, o para prevenir la progresión de un trastorno, ya sea en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable para un experto en la técnica. El tratamiento puede ser para curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, paliar, mejorar o influir en el trastorno, los síntomas del trastorno o la predisposición a sufrir el trastorno. Una cantidad, manera o modo eficaz puede variar dependiendo del sujeto y se puede personalizar para el sujeto. Los sujetos ejemplares incluyen los seres humanos, los primates y otros mamíferos no humanos. Un agente de unión al receptor también se puede administrar profilácticamente para reducir el riesgo de aparición de un trastorno o síntoma de este.
El trastorno mediado por IL-1 puede ser un trastorno autoinmune. Los ejemplos de trastornos autoinmunes mediados por IL-1 incluyen: artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, síndrome de Behcet, enfermedades intestinales inflamatorias (incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa), asma, psoriasis, diabetes tipo I y otros trastornos identificados en esta memoria. Un agente de unión al receptor descrito en esta memoria se puede administrar a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener dichos trastornos autoinmunes mediados por IL-1. El trastorno mediado por IL-1 puede ser un trastorno inflamatorio tal como se describe a continuación. Un agente de unión al receptor descrito en esta memoria se puede administrar a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener dichos trastornos inflamatorios mediados por IL-1.
Los trastornos mediados por IL-1 ejemplares incluyen:
Artritis reumatoide y artritis relacionada. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener artritis reumatoide. La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad inflamatoria autoinmune sistémica crónica que afecta a la membrana sinovial en las articulaciones y que daña el cartílago articular. La patogénesis de AR es dependiente del linfocito T y puede incluir la producción de autoanticuerpos conocidos como factores reumatoides. Los complejos de factor reumatoide y antígeno se pueden formar y acumular en el líquido articular y en la sangre, induciendo la infiltración de linfocitos, neutrófilos y monocitos en el sinovio. Las articulaciones se afectan típicamente en un patrón simétrico, pero también se puede presentar una enfermedad extraarticular, por ejemplo, que provoca fibrosis pulmonar, vasculitis y úlceras cutáneas o síndrome de Felty, que se manifiesta como neutropenia, trombocitopenia y esplenomegalia. Los pacientes también pueden presentar nódulos reumatoides en el área de las articulaciones afectadas, pericarditis, pleuritis, arteritis coronaria y neumonitis intersticial con fibrosis pulmonar. Una forma de IL-1Ra está indicada para AR de moderada a gravemente activa. Véase, por ejemplo, Cohen, S. et al. Arthritis & Rheumatism 46, 614-24 (2002); Fleischmann, R.M. et al. Arthritis & Rheumatism 48, 927-34 (2003); Nuki, G. et al. Arthritis & Rheumatism 46, 2838-46 (2002); Schiff, M.H. et al. Arthritis & Rheumatism 50, 1752-60 (2004).
Los síntomas de la AR activa incluyen fatiga, falta de apetito, fiebre baja, dolor muscular y en las articulaciones y rigidez. La rigidez muscular y de las articulaciones suelen ser más notables por la mañana y después de períodos de inactividad. Durante los brotes, las articulaciones frecuentemente se enrojecen, se inflaman, presentan dolor y sensibilidad, generalmente como consecuencia de la sinovitis. Las escalas útiles para evaluar la AR y los síntomas de la AR incluyen: Escala de Gravedad de la Artritis Reumatoide (RASS; Bardwell et al., (2002) Rheumatology 41(1):38-45), Índice de Salud Específico de la Artritis SF-36 (ASHI; Ware et al., (1999) Med. Care. 37(5 Supl):MS40-50), Escalas de Medición del Impacto de la Artritis o Escalas de Medición del Impacto de la Artritis 2 (AIMS o AIMS2; Meenan et al. (1992) Arthritis Rheum. 35(1): 1-10); Cuestionario de Valoración de la Salud de Stanford (HAQ), HAQII o HAQ modificado (véase, por ejemplo, Pincus et al. (1983) Arthritis Rheum. 26(11):1346-53).
Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener AR para retardar el inicio y/o mejorar uno o más de los signos y síntomas anteriores. El sujeto puede tener AR activa de moderada a grave. El sujeto puede no responder a la terapia con inhibidores del TNF (por ejemplo, terapia con ENBREL® (etanercept), Hu MiRA® (adalimumab) o REMiCa DE® (infliximab)); se le puede haber administrado previamente un inhibidor del TNF al sujeto; o el sujeto también puede continuar recibiendo un inhibidor del TNF (y responder o no responder).
También se le puede administrar metotrexato al sujeto. Se le puede administrar al sujeto uno o más DMARDS adicionales (fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad), un corticosteroide y/o un antiinflamatorio no esteroideo. Otros fármacos adicionales que se pueden coadministrar con un agente de unión al receptor incluyen los inhibidores de CD28 (por ejemplo, CTLA4-Ig), inhibidores de RANKL, IFNy, IL-6, IL-8 e IL-17. Los inhibidores incluyen anticuerpos frente a dichos mediadores, receptores solubles específicos para dichos mediadores y/o anticuerpos frente a receptores para dichos mediadores.
Artritis crónica juvenil. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar la artritis crónica juvenil, por ejemplo, en un sujeto que tiene menos de 21, 18, 17, 16, 15 o 14 años. La artritis crónica juvenil se asemeja a la AR en varios aspectos. Los sujetos pueden ser positivos para el factor reumatoide. Los sujetos pueden tener las formas pauciarticular, poliarticular o sistémica de la enfermedad. La artritis puede provocar anquilosis de las articulaciones y retraso en el crecimiento, y también puede producir uveítis anterior crónica y amiloidosis sistémica. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para retardar el inicio o mejorar uno o más de dichos síntomas.
Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar la artritis idiopática juvenil, incluyendo la artritis idiopática juvenil de inicio sistémico (SO-JIA). Es posible que los sujetos no hayan respondido a un tratamiento anterior con corticosteroides o que requieran un tratamiento con corticosteroides en una dosis diaria igual o superior a 0,3 mg/kg.
Véase, por ejemplo, Quartier et al. (2011) Ann Rheum Dis. 70(5):747-54.
Otros trastornos reumáticos. Un agente de unión al receptor descrito en esta memoria también se puede utilizar para tratar otros trastornos reumáticos que incluyen la esclerodermia, lupus eritematoso sistémico, gota, osteoartritis, polimialgia reumática, artritis psoriásica y artritis de Lyme crónica, inflamación del músculo voluntario y de otros músculos, incluyendo dermatomiositis, miositis por cuerpos de inclusión, polimiositis y linfangioleiomiomatosis, síndrome de artritis pirogénica, artritis granulomatosa pediátrica (PGA)/síndrome de Blau, y otros trastornos reumáticos planteados en esta memoria.
Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar trastornos reumáticos metabólicos, por ejemplo, trastornos asociados con la hiperuricemia, por ejemplo, la gota que incluye la gota aguda crónica y otras artropatías mediadas por cristales. Se puede utilizar el agente para tratar brotes inducidos por fármacos asociados con la gota, incluyendo, por ejemplo, brotes inducidos por inhibidores de xantina oxidasa, urato oxidasa o agentes uricosúricos. En la gota, los cristales de ácido úrico pueden activar el inflamasoma y desencadenar la liberación de IL-1 p.
Espondiloartropatías. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar espondiloartropatías, que incluyen trastornos tales como la espondilitis anquilosante, síndrome de Reiter, artritis asociada con la enfermedad inflamatoria intestinal, espondilitis asociada con la psoriasis, espondiloartropatía de inicio juvenil y espondiloartropatía indiferenciada. Las espondiloartropatías suelen estar asociadas con el gen HLA-B27. Los sujetos pueden carecer de factor reumatoide y pueden presentar sacroileitis con o sin espondilitis y artritis inflamatoria asimétrica. Los sujetos también pueden tener inflamación ocular (véase a continuación).
Esclerodermia. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar la esclerodermia o la esclerosis sistémica. La esclerodermia se caracteriza por la induración de la piel, que puede ser localizada o sistémica. También puede haber lesiones vasculares y lesión celular endotelial en la microvasculatura. Los sujetos pueden presentar infiltrados de células mononucleares en las lesiones cutáneas y tener anticuerpos antinucleares. Otros órganos que muestran patogénesis pueden incluir: el tracto gastrointestinal que puede tener atrofia del músculo liso y fibrosis que provocan peristalsis/motilidad anormal; el riñón que puede tener proliferación de la íntima subendotelial concéntrica que afecta las arterias interlobulares arqueadas pequeñas con reducción del flujo sanguíneo renal cortical resultante y que puede provocar proteinuria, azotemia e hipertensión; el músculo esquelético que puede comprender atrofia, fibrosis intersticial, inflamación; pulmón, neumonitis intersticial y fibrosis intersticial; y corazón que puede presentar, por ejemplo, necrosis de las bandas de contracción y cicatrices/fibrosis. Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener escleroderma para mejorar uno o más de los signos y síntomas anteriores.
Síndrome de Sjogren. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar el síndrome de Sjogren. El síndrome de Sjogren se caracteriza por la inflamación inmunomediada y la posterior destrucción funcional de las glándulas lagrimales y las glándulas salivales. La enfermedad puede estar asociada o acompañada por enfermedades inflamatorias del tejido conectivo. La enfermedad está asociada con la producción de autoanticuerpos frente a antígenos de Ro y La, los cuales son complejos de proteínas-ARN pequeños. Las lesiones pueden provocar queratoconjuntivitis seca, xerostomía, con otras manifestaciones o asociaciones que incluyen cirrosis biliar, neuropatía sensorial y periférica y púrpura palpable. También se plantea a continuación el tratamiento de los trastornos oculares asociados con el síndrome de Sjogren.
Trastornos de tiroides. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar los trastornos de tiroides. Los trastornos de tiroides ejemplares incluyen la enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocítica juvenil y la tiroiditis atrófica, y son el resultado de una respuesta autoinmune frente a los antígenos tiroideos con producción de anticuerpos que reaccionan con las proteínas presentes en y, a menudo específicas de, la glándula tiroides. Hay modelos experimentales disponibles que incluyen modelos espontáneos: ratas (ratas BUF y BB) y pollos (cepa de pollos obesos) y modelos inducibles creados mediante la inmunización de animales con tiroglobulina, antígeno microsomal tiroideo (peroxidasa tiroidea).
Trastornos diabéticos y metabólicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno diabético tal como diabetes de inicio juvenil (incluyendo la diabetes mellitus autoinmune y los tipos de diabetes dependientes de insulina) y diabetes de inicio en la madurez (incluyendo la diabetes no dependiente de insulina y la diabetes mediada por obesidad), diabetes tipo I y diabetes tipo II. Por ejemplo, la diabetes mellitus tipo I o diabetes dependiente de insulina está asociada con la destrucción autoinmune de las células de los islotes pancreáticos provocada por autoanticuerpos y las células T autorreactivas. Además, la reducción de la actividad de IL-1 p puede mejorar el control de la glucosa y la función de las células beta, y se puede utilizar para tratar la diabetes tipo II. Véase, por ejemplo, Owyang et al. Endocrinology. 2010;151(6):2515-27. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la descripción, se puede administrar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria a un sujeto al que no se está administrando insulina, por ejemplo, el sujeto no es dependiente de insulina. Por ejemplo, el sujeto puede ser prediabético. El sujeto puede tener tolerancia alterada a la glucosa o glucosa en ayunas alterada. El sujeto puede ser obeso o tener un índice de masa corporal que es superior a 23, 25, 30, 35 o 40 kg/m2. El sujeto puede ser resistente a la insulina y/o se puede caracterizar por hiperglucemia o hiperinsulinemia. El sujeto puede tener riesgo de progresión a diabetes tipo II. Véase también Larsen et al. (2007) NEJM 356:1517-26 y Larsen et al. (2009). Diabetes Care 32:1663-8. En algunas realizaciones, el sujeto tiene una glucosa en plasma en ayunas superior a 6,1, 6,5, 7 u 8 mmoles/L. En algunas realizaciones de la descripción, el sujeto tiene un nivel de A1C mayor del 5,5, 5,7, 6, 6,4, 7, 7,5 u 8 %.
En algunas realizaciones de la descripción, al sujeto también se le administra un secretagogo de insulina, por ejemplo, tal como una sulfonilurea (por ejemplo, clorpropamida, tolazamida, acetohexamida, tolbutamida, gliburida, glimepirida, glipizida) y/o meglitinidas (por ejemplo, repaglinida, nateglinida) que estimulan la secreción de insulina. Al sujeto también se le puede administrar una biguanida (por ejemplo, metformina). Se puede administrar el agente de unión al receptor para reducir la pérdida y/o el daño a las células beta pancreáticas.
En algunas realizaciones de la descripción, el sujeto es heterocigoto u homocigoto para el alelo C de rs4251961, ubicado cerca del 5' del gen IL1RN.
El tratamiento con un agente de unión al receptor incluye la mejora o la prevención del deterioro de afecciones secundarias asociadas con la diabetes, tales como la retinopatía diabética, rechazo al trasplante renal en pacientes diabéticos, resistencia a la insulina mediada por la obesidad e insuficiencia renal, que a su vez puede estar asociada con la proteinuria e hipertensión.
Trastornos gastrointestinales. Se pueden utilizar los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria para tratar un trastorno gastrointestinal inflamatorio, incluyendo, por ejemplo, la enfermedad celíaca, la enfermedad de Crohn; la colitis ulcerativa; la gastroparesia idiopática; la pancreatitis, incluyendo la pancreatitis crónica, la pancreatitis aguda, enfermedades inflamatorias intestinales y úlceras, incluyendo úlceras gástricas y duodenales.
Trastornos pulmonares. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar una enfermedad pulmonar mediada por IL-1. Las enfermedades pulmonares ejemplares que se pueden tratar incluyen la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (por ejemplo, enfisema y bronquitis crónica), proteinosis alveolar pulmonar, neumopatía inducida por bleomicina y fibrosis, fibrosis pulmonar, incluyendo fibrosis pulmonar idiopática y fibrosis pulmonar inducida por radiación, sarcoidosis pulmonar, fibrosis quística, acumulación de colágeno en los pulmones, SDRA, displasia broncopulmonar (DBP), enfermedades pulmonares obstructivas crónicas y enfermedad pulmonar crónica fibrótica de los bebés prematuros. Además, se pueden utilizar los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria para tratar enfermedades pulmonares ocupacionales, incluyendo asbestosis, neumoconiosis del minero, silicosis o afecciones similares asociadas con la exposición a largo plazo a partículas finas. La enfermedad pulmonar fibrótica e inflamatoria, incluyendo la neumonía eosinofílica, fibrosis pulmonar idiopática y neumonitis por hipersensibilidad, pueden implicar una respuesta inmunoinflamatoria mal regulada que se puede tratar utilizando un agente de unión al receptor.
La sarcoidosis es una afección de etiología desconocida que se caracteriza por la presencia de granulomas epitelioides en casi cualquier tejido del cuerpo; lo más común es que afecte a los pulmones. La patogénesis implica la persistencia de células linfoides y macrófagos activados en los sitios de la enfermedad con posterior secuela crónica resultante de la liberación de productos local y sistemáticamente activos liberados por estos tipos de células.
Trastornos cardiovasculares. Se puede utilizar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria para tratar una lesión o trastorno cardiovascular, tal como aneurismas aórticos, síndrome coronario agudo, arteritis, oclusión vascular, incluyendo oclusión de la arteria cerebral, complicaciones de la cirugía de derivación coronaria, lesión por reperfusión/isquemia, enfermedad cardíaca, incluyendo enfermedad cardíaca aterosclerótica, miocarditis, incluyendo miocarditis autoinmune crónica y miocarditis viral, insuficiencia cardíaca, incluyendo insuficiencia cardiaca crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, restenosis y/o ateroesclerosis después de cirugía cardíaca o después de procedimientos de angioplastia con balón de la arteria carótida, isquemia miocárdica silente, disfunción de la bomba ventricular izquierda, complicaciones posteriores al implante de dispositivos de asistencia ventricular izquierda, fenómeno de Raynaud, tromboflebitis, vasculitis, incluyendo vasculitis de Kawasaki, enfermedad venooclusiva, arteritis de células gigantes, granulomatosis de Wegener y púrpura de Schoenlein-Henoch. El agente de unión al receptor también se puede proporcionar profilácticamente, por ejemplo, para reducir el riesgo de dicho trastorno cardiovascular. En algunas realizaciones de la descripción, el agente de unión al receptor se administra a un paciente para tratar la ateroesclerosis o para reducir el riesgo de esta.
La señalización mediada por IL-1 se activa por el infarto de miocardio agudo y puede iniciar la muerte celular apoptótica en las células miocárdicas periinfarto, extendiendo el tamaño de la zona del infarto. Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria para reducir el daño provocado por el infarto de miocardio. Por ejemplo, se puede administrar el agente de unión al receptor a un sujeto que corre riesgo de un infarto de miocardio o a un sujeto que ha sufrido un infarto de miocardio, especialmente un infarto de miocardio agudo, por ejemplo, en las últimas 2, 4, 6, 12, 24 o 48 horas. Se puede administrar el agente en combinación con otros agentes, incluyendo, por ejemplo, heparina y aspirina.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un accidente cerebrovascular, hemorragia subaracnoidea, traumatismo de cráneo o lesión cerebral y/o inflamación asociada con un trastorno cardiovascular. Por ejemplo, los niveles elevados de IL-1 p se han implicado en la neuroinflamación asociada con accidentes cerebrovasculares y lesiones cerebrales (Rothwell, N. J. et al., TINS 23(12): 618-625, 2000). Se puede administrar el agente de unión al receptor para reducir dicha inflamación y otra inflamación asociada con isquemia y/o hipoxia. Además, el agente de unión al receptor también se puede proporcionar profilácticamente, por ejemplo, para reducir el riesgo de dichos trastornos y/o la inflamación asociada con dichos trastornos. Por ejemplo, el agente de unión al receptor se puede administrar a un sujeto que corre riesgo de un accidente cerebrovascular, un evento isquémico, otro evento cardiovascular o un evento hemorrágico (tal como una hemorragia subaracnoidea) o a un sujeto que ha tenido un accidente cerebrovascular, un evento isquémico, otro evento cardiovascular o un evento hemorrágico (tal como una hemorragia subaracnoidea), por ejemplo, en las últimas 2, 4, 6, 12, 24 o 48 horas.
Trastornos genitourinarios y renales. Los trastornos del sistema genitourinario también se pueden tratar con un agente de unión al receptor descrito en esta memoria. Dichos trastornos incluyen la glomerulonefritis, incluyendo glomerulonefritis autoinmune, glomerulonefritis debida a la exposición a toxinas o glomerulonefritis secundaria de infecciones con estreptococos hemolíticos u otros agentes infecciosos. Las enfermedades renales inmunomediadas, incluyendo la glomerulonefritis y la nefritis tubulointersticial, son el resultado de la lesión mediada por anticuerpos o linfocitos T del tejido renal, ya sea directamente como resultado de la producción de anticuerpos autorreactivos o células T frente a antígenos renales o indirectamente como resultado de la deposición de anticuerpos y/o complejos inmunes en el riñón que son reactivos frente a otros antígenos no renales. Por lo tanto, otras enfermedades inmunomediadas que provocan la formación de complejos inmunes también pueden inducir una enfermedad renal inmunomediada como una secuela indirecta. Los mecanismos inmunes tanto directos como indirectos producen una respuesta inflamatoria que provoca/induce el desarrollo de lesiones en los tejidos renales con el resultante deterioro de la función de los órganos y, en algunos casos, la progresión de la insuficiencia renal. Los mecanismos inmunes tanto humorales como celulares pueden estar implicados en la patogénesis de las lesiones.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar el síndrome urémico y sus complicaciones clínicas (por ejemplo, insuficiencia renal, anemia y cardiomiopatía hipertrófica), incluyendo el síndrome urémico asociado con la exposición a las toxinas ambientales, fármacos u otras causas. También se pueden tratar las complicaciones que surgen de la inflamación de la pared vesicular que produce la alteración de la función de absorción. En dichas complicaciones se incluyen la colelitiasis (cálculos biliares) y la coliedocolitiasis (piedras del conducto biliar) y la recurrencia de la colelitiasis y la coliedocolitiasis. Otras afecciones que se pueden tratar son las complicaciones de la hemodiálisis; afecciones de la próstata, incluyendo hipertrofia prostática benigna, prostatitis no bacteriana y prostatitis crónica; y las complicaciones de la hemodiálisis. También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar afecciones de dolor crónico, tales como dolor pélvico crónico, incluyendo prostatitis crónica/síndrome del dolor pélvico y dolor postherpético.
Trastornos hematológicos y oncológicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria para tratar diversas formas de cáncer, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, carcinoma nasofaríngeo positivo para el virus de Epstein-Barr, glioma, cánceres de colon, estómago, próstata, células renales, de cuello uterino y de ovarios, cáncer de pulmón (SCLC y NSCLC), incluyendo la caquexia asociada al cáncer, fatiga, astenia, síndrome paraneoplásico de caquexia e hipercalcemia. Véase, por ejemplo, Voronov et al. (2003) PNAS 100:2645-2650. También se pueden tratar tumores sólidos, incluyendo el sarcoma, osteosarcoma y carcinoma, tal como el adenocarcinoma (por ejemplo, cáncer de mama) y carcinoma de células escamosas. Con referencia a la función de IL-1 p en determinados tumores, véase, por ejemplo, Krelin et al. (2007) Cancer Res.
67:1062-1071. Otros cánceres incluyen el cáncer de esófago, cáncer gástrico, carcinoma de vesícula biliar, leucemia, incluyendo leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide, leucemia linfoblástica crónica o aguda y leucemia de células pilosas. Otras neoplasias con potencial metastásico invasivo, incluyendo el mieloma múltiple, se pueden tratar con los agentes de unión al receptor. Véase, por ejemplo, Lust et al. (2009) Mayo Clin Proc 84(2):114-122.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar anemias y trastornos hematológicos, incluyendo neutropenia idiopática crónica, anemia de las enfermedades crónicas, anemia aplásica, incluyendo anemia aplásica de Fanconi; púrpura trombocitopénica idiopática (PTI); púrpura trombocitopénica trombótica, síndromes mielodisplásicos (incluyendo anemia refractaria, anemia refractaria con sideroblastos en anillo, anemia refractaria con exceso de blastos, anemia refractaria con exceso de blastos en transformación); mielofibrosis/metaplasia mieloide; y crisis de células falciformes vasooclusiva.
La anemia hemolítica autoinmune, la pancitopenia inmune y la hemoglobinuria paroxística nocturna pueden resultar de la producción de anticuerpos que reaccionan con antígenos expresados en la superficie de los glóbulos rojos (y en algunos casos también otras células sanguíneas incluyendo las plaquetas) y es una consecuencia de la eliminación de estas células recubiertas con anticuerpos mediante lisis mediada por complemento y/o mecanismos mediados por el receptor de Fc/ADCC. En la trombocitopenia autoinmune, incluyendo la púrpura trombocitopénica, y la trombocitopenia inmunomediada en otros entornos clínicos, la eliminación/destrucción de las plaquetas se produce como resultado de la unión del anticuerpo o complemento a las plaquetas y la posterior eliminación por lisis por complemento, mecanismos mediados por el receptor de FC o ADCC.
También se puede administrar el agente de unión al receptor a sujetos que tienen o presentan riesgo de tener diversos trastornos linfoproliferativos, incluyendo el síndrome linfoproliferativo autoinmune (SLPA), leucemia linfoblástica crónica, leucemia de células pilosas, leucemia linfática crónica, linfoma de células T periféricas, linfoma linfocítico de células pequeñas, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma de Burkitt, linfoma de células T positivo para el virus de Epstein-Barr, linfoma histiocítico, enfermedad de Hodgkin, linfoma difuso agresivo, leucemias linfáticas agudas, enfermedad linfoproliferativa T-gamma, linfoma cutáneo de células B, linfoma cutáneo de células T (es decir, micosis fungoide) y síndrome de Sezary.
Trastornos hepáticos. El agente de unión al receptor descrito en esta memoria también es útil para tratar afecciones del hígado, tales como hepatitis, incluyendo hepatitis alcohólica aguda, hepatitis viral o aguda inducida por fármacos, hepatitis A, B y C, colangitis esclerosante, epitelio sinusoide hepático e inflamación del hígado debida a causas desconocidas.
Trastornos de la audición. También se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar trastornos que implican la pérdida de la audición y que están asociados con la expresión anormal de IL-1. Dichos trastornos incluyen la pérdida de la audición asociada con el nervio coclear, que se cree que resulta de un proceso autoinmune, por ejemplo, pérdida de la audición autoinmune, síndrome de Méniére y colesteatoma, un trastorno del oído medio que se suele asociar con la pérdida de la audición.
Trastornos óseos. Los trastornos no artríticos de los huesos y las articulaciones también se pueden tratar con los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria. Esto abarca los trastornos inflamatorios del hueso o la articulación, trastornos de los osteoclastos que provocan la pérdida ósea, tales como, entre otros, osteoporosis, incluyendo osteoporosis postmenopáusica, osteoartritis, periodontitis que provoca la pérdida o el aflojamiento de dientes, y el aflojamiento de prótesis después del reemplazo de la articulación (generalmente asociado con una respuesta inflamatoria a las partículas de desgaste), por ejemplo, osteolisis de implante ortopédico.
Trastornos amiloides. Además, se pueden utilizar los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria para tratar la amiloidosis primaria y la amiloidosis secundaria que es característica de diversas afecciones, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, la amiloidosis secundaria reactiva; el síndrome de Down; y la amiloidosis asociada a la diálisis. Además, se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la enfermedad de Huntington y la enfermedad de Parkinson. Estas enfermedades también pueden implicar la formación de agregados y amiloides que pueden desencadenar las respuestas inflamatorias.
Trastornos neurológicos. También se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar la neuroinflamación y las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, incluyendo la esclerosis múltiple; la polineuropatía desmielinizante idiopática o el síndrome de Guillain-Barre; y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica. Se cree que estos trastornos tienen una base autoinmune y provocan desmielinización del nervio como resultado del daño causado a los oligodendrocitos o a la mielina directamente. En la inducción de la enfermedad de esclerosis múltiple y los linfocitos T involucrados. La esclerosis múltiple tiene un curso recurrente-remitente o un curso progresivo crónico. Las lesiones contienen infiltrados de células microgliales mediadas principalmente por linfocitos T y macrófagos de infiltración; los linfocitos T CD4+ son el tipo de células predominante en las lesiones. El mecanismo de la muerte celular de los oligodendrocitos y la posterior desmielinización no se conoce, pero es probable que sea activado por los linfocitos T.
Miopatías. Se pueden utilizar los agentes de unión al receptor para tratar las miopatías asociadas con la inflamación y la autoinmunidad. Las miopatías inflamatorias idiopáticas, incluyendo la dermatomiositis, la polimiositis y otros son trastornos de inflamación muscular crónica de etiología desconocida que provocan debilidad muscular. La lesión/inflamación muscular suele ser simétrica y progresiva. Los autoanticuerpos están asociados con la mayoría de las formas. Estos autoanticuerpos específicos de la miositis se dirigen e inhiben la función de los componentes, las proteínas y el ARN, implicados en la síntesis de proteínas.
Trastornos de vasculitis. Se puede utilizar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria para tratar un trastorno de vasculitis, por ejemplo, una vasculitis sistémica. La vasculitis sistémica incluye enfermedades en las cuales la principal lesión es la inflamación y posterior daño a los vasos sanguíneos que provocan isquemia/necrosis/degeneración de los tejidos alimentados por los vasos afectados y la eventual disfunción de los órganos diana en algunos casos. Las vasculitis también se pueden presentar como una lesión o secuela secundaria de otras enfermedades mediadas inmunoinflamatorias, tales como la artritis reumatoide, la esclerosis sistémica, etc., especialmente en enfermedades también asociadas con la formación de complejos inmunes.
Las enfermedades en el principal grupo de vasculitis sistémica incluyen: vasculitis necrotizante sistémica: poliarteritis nodosa, angeitis alérgica y granulomatosis, poliangeítis; granulomatosis de Wegener; granulomatosis linfomatoide y arteritis de células gigantes. Diversas vasculitis incluyen: el síndrome de nodo linfático mucocutáneo (MLNS o enfermedad de Kawasaki), vasculitis del SNC aislada, enfermedad de Behcet, tromboangeítis obliterante (enfermedad de Buerger) y venulitis necrotizante cutánea. Se cree que el mecanismo patogénico de estos trastornos de vasculitis se debe principalmente a la deposición de complejos de inmunoglobulina en la pared de los vasos y la posterior inducción de una respuesta inflamatoria ya sea mediante ADCC, activación del complemento o ambas.
CAPS. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno CAPS, es decir, síndromes periódicos asociados a la CIAS1. Los CAPS incluyen tres síndromes genéticos: el trastorno inflamatorio sistémico de inicio neonatal (NOMID), el síndrome de Muckle-Wells (MWS) y el síndrome autoinflamatorio familiar inducido por el frío (FCAS). (Hoffman et al. 2001 Naure 29:301-305; Feldmann et al. 2002 Am J Hum Genet 71:198-203; Aksentijevich et al. 2002 Arthritis Rheum 46:3340-3348). Los CAPS se heredan de forma autosómica dominante con un patrón esporádico o familiar. CIAS1 codifica NALP3, un componente de proteínas del «inflamasoma», un complejo enzimático subcelular que regula la actividad de la caspasa 1. Las mutaciones en CIAS1 provocan un aumento en la producción de IL-1 y muchas consecuencias patológicas (Aksentijevich et al. 2002, mencionado anteriormente). IL-1 induce fuertemente la producción de reactantes de fase aguda en el hígado, tales como la proteína C reactiva (PCR) y el amiloide A sérico (AAS).
Los trastornos CAPS comparten características clínicas comunes y se presentan como un espectro de gravedad clínica. NOMID es la enfermedad más grave, MWS es menos grave y FCAS es la menos grave. Los trastornos CAPS tienen diversas características superpuestas y los individuos pueden tener constelaciones únicas de signos y síntomas. Las características comunes a todas estas afecciones incluyen: fiebre, erupción tipo urticaria, artritis o artralgia, mialgia, malestar y conjuntivitis.
En NOMID, la meningitis aséptica crónica puede provocar retraso mental y estos pacientes también pueden sufrir sobrecrecimiento óseo desfigurante e incapacitante en la epífisis y en las rótulas. Estos pacientes también pueden sufrir ceguera debido a la atrofia del nervio óptico que resulta del aumento de la presión intracraneal. MWS y NOMID se asocian comúnmente con inflamación grave que puede incluir el sistema auditivo, las meninges y las articulaciones. Estos pacientes pueden sufrir picos de fiebre altos diarios y una erupción crónica que cambia con frecuencia en cuanto a la distribución e intensidad. Los pacientes pueden sufrir pérdida de la audición o sordera. Frecuentemente, se observan la conjuntivitis y el papiledema. La amiloidosis puede desarrollarse y producir una insuficiencia renal debido a la inflamación crónica y el exceso de producción de reactantes de fase aguda (especialmente SM). Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre NOMID, MWS o FCAS o que se ha diagnosticado que tiene un genotipo asociado con NOMID, MWS o FCAS. Además, se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre TRAPS (síndrome periódico asociado al receptor de TNF).
Trastornos dermatológicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno dermatológico, tal como un trastorno dermatológico inflamatorio o una enfermedad de la piel autoinmune o inmunomediada. Un trastorno ejemplar es la psoriasis. Otras enfermedades de la piel autoinmunes o inmunomediadas, incluyendo las enfermedades ampollosas de la piel, el eritema multiforme y la dermatitis de contacto están mediadas por autoanticuerpos, cuyo origen es dependiente del linfocito T. La psoriasis es una enfermedad inflamatoria mediada por el linfocito T. Las lesiones contienen infiltrados de linfocitos T, células procesadoras de antígenos y macrófagos, y algunos neutrófilos.
Otros trastornos de la piel o de las membranas mucosas que se pueden tratar incluyen las enfermedades acantolíticas, incluyendo la enfermedad de Darier, la queratosis folicular y el pénfigo vulgar. Otros trastornos adicionales incluyen: acné, acné rosácea, alopecia areata, estomatitis aftosa, penfigoide ampolloso, quemaduras, eccema, eritema, incluyendo eritema multiforme y eritema multiforme ampolloso (síndrome de Stevens-Johnson), enfermedad de la piel inflamatoria, liquen plano, enfermedad ampollosa de IgA lineal (dermatosis ampollosa crónica de la infancia), pérdida de elasticidad de la piel, úlceras de la superficie mucosal, incluyendo úlceras gástricas, dermatitis neutrofílica (síndrome de Sweet), dermatomiositis, pitiriasis rubra pilaris, psoriasis, pioderma gangrenoso, reticulohistiocitosis multicéntrica y necrólisis epidérmica tóxica. Otras afecciones relacionadas con la piel que se pueden tratar con los agentes de unión al receptor incluyen la dermatitis herpetiforme (enfermedad de Duhring), la dermatitis atópica, la dermatitis de contacto y la urticaria (incluyendo urticaria crónica idiopática).
Trastornos alérgicos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar un trastorno alérgico, tal como el asma, la rinitis alérgica, la dermatitis atópica, la hipersensibilidad a los alimentos, la conjuntivitis alérgica (véase también a continuación) y la urticaria. Estas enfermedades frecuentemente están mediadas por inflamación inducida por linfocitos T, inflamación mediada por IgE o ambas.
El asma es una afección crónica que involucra al sistema respiratorio en el cual las vías respiratorias ocasionalmente se contraen, se inflaman y están revestidas con cantidades excesivas de mucosidad, a menudo en respuesta a uno o más desencadenantes. Los episodios se pueden desencadenar por factores tales como la exposición a un estimulante ambiental (o alérgeno), tal como aire frío, aire cálido, aire húmedo, ejercicio o esfuerzo, estrés emocional y enfermedad viral. El estrechamiento de las vías respiratorias provoca síntomas tales como sibilancias, falta de aire, presión en el pecho y tos. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar el asma y se puede formular para la administración tópica o pulmonar para dicho tratamiento o se puede administrar por vía parenteral.
Trasplante. Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que se va a someter, se está sometiendo o se está recuperando de un trasplante. Las enfermedades asociadas con el trasplante, incluyendo el rechazo del injerto y la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), son dependientes de los linfocitos T; la inhibición de la función de los linfocitos T produce una mejora. El trasplante de córnea puede estar asociado con neovascularización que se puede mejorar mediante tratamiento con un agente de unión al receptor. También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar complicaciones provocadas por el trasplante de órganos sólidos, tal como de corazón, hígado, piel, riñón, pulmón (obliteración de las vías respiratorias por trasplante de pulmón) u otros trasplantes, incluyendo trasplantes de médula ósea.
Enfermedades infecciosas. Los agentes de unión al receptor descritos en esta memoria son útiles para tratar enfermedades causadas por protozoos, incluyendo malaria y esquistosomiasis y para tratar eritema nodoso leproso; meningitis bacteriana o viral; tuberculosis, incluyendo tuberculosis pulmonar; y neumonitis secundaria a una infección bacteriana o viral, incluyendo infección de gripe y mononucleosis infecciosa.
También se pueden tratar con un agente de unión al receptor síndromes hereditarios de fiebre periódica, incluyendo fiebre mediterránea familiar, hiperinmunoglobulinemia Dy síndrome de fiebre periódica y síndromes periódicos asociados al receptor de TNF (TRAPS), enfermedad de Still de inicio adulto, síndrome de Schnitzler y alveolitis fibrosante.
En algunas realizaciones de la descripción, se administra un agente de unión al receptor a un sujeto para reducir la actividad o expresión de IL-6 en el sujeto. Por ejemplo, el sujeto puede tener un trastorno que está asociado o mediado al menos en parte por IL-6.
Trastornos oculares y administración ocular
Se puede utilizar el agente de unión al receptor descrito en esta memoria para tratar trastornos oculares, incluyendo trastornos oculares que afectan la superficie del ojo, trastornos oculares inflamatorios y trastornos oculares mediados al menos en parte por una reacción autoinmune.
En algunas realizaciones de la descripción, el trastorno ocular es un trastorno del ojo seco que afecta a la superficie del ojo. El trastorno incluye afecciones también conocidas como queratoconjuntivitis seca, queratitis seca, síndrome seco, xeroftalmia, trastorno de la película lagrimal, disminución de la producción lagrimal, deficiencia de lágrima acuosa y disfunción de las glándulas de Meibomio. El ojo seco puede incluir formas que están asociadas con el síndrome de Sjogren (SS), por ejemplo, queratoconjuntivitis seca asociada con el síndrome de Sjogren, pero también formas que no están asociadas con este, por ejemplo, queratoconjuntivitis seca no asociada con el síndrome de Sjogren. El paciente puede presentar o no otras manifestaciones de un trastorno sistémico autoinmune. Se ha implicado a IL-1 en la patogénesis de los trastornos del ojo seco. Véase, por ejemplo, Enriquez de Salamanca et al. (2010), Mol. Vis. 16:862-873.
Los sujetos que sufren un síndrome del ojo seco pueden presentar inflamación en el ojo seco y pueden experimentar sensaciones de comezón, pinchazo, picor, ardor o presión, irritación, dolor y enrojecimiento. El ojo seco puede estar asociado con lagrimeo excesivo y, contrariamente, con producción lagrimal insuficiente. Se puede administrar un agente de unión al receptor a dichos sujetos para mejorar o evitar el inicio o el empeoramiento de uno o más de dichos síntomas. También se puede utilizar un agente de unión al receptor para mitigar el dolor, por ejemplo, el dolor ocular, tal como el debido a la neuroinflamación, en un sujeto que está experimentando dicho dolor. El trastorno ocular puede ser un trastorno ocular asociado con un trastorno sistémico autoinmune (tal como el síndrome de Sjogren y la artritis reumatoide) o con un trastorno asociado con IL-1 u otro miembro de la familia de citocinas IL-1. El paciente puede tener o no un trastorno sistémico autoinmune u otras manifestaciones de un trastorno sistémico autoinmune.
También se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar otros trastornos que afectan a la superficie del ojo, tal como la córnea. Dichos trastornos incluyen las afecciones inflamatorias de la superficie ocular corneal, neovascularización corneal, queratitis, incluyendo queratitis ulcerativa periférica y queratitis microbiana. También se puede utilizar el agente de unión al receptor para tratar a un sujeto que está experimentando cicatrización de la herida corneal (por ejemplo, un sujeto que sufre una herida corneal). Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que va a recibir, que está experimentando o que se está recuperando de un procedimiento que involucra al ojo, por ejemplo, trasplante de córnea/queratoplastia, cirugía de queratoprótesis, trasplante lamelar, trasplante endotelial selectivo. Véase, por ejemplo, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43; Dekaris et al. (1999) Curr Eye Res 19(5): 456-9; y Dana et al. (1997) Transplantation 63:1501-7. Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar trastornos que afectan a la conjuntiva, incluyendo trastornos de cicatrización conjuntival y conjuntivitis. Se puede utilizar el agente de unión al receptor para tratar otros trastornos, tales como el síndrome penfigoide y el síndrome de Stevens-Johnson. Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria a un sujeto para modular la neovascularización en el ojo o alrededor de este. Véase, por ejemplo, Dana (2007) Trans Am Ophthalmol Soc 105: 330-43.
Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre una reacción alérgica que afecta al ojo, por ejemplo, a un sujeto que está experimentando una enfermedad ocular alérgica grave (atópica), tal como conjuntivitis alérgica. Por ejemplo, el agente de unión al receptor se puede administrar tópicamente. Véase también, por ejemplo, Keane-Myers AM et al. (1999) Invest Ophthalmol Vis Sci, 40(12): 3041-6.
Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que sufre un trastorno autoinmune que afecta al ojo. Los trastornos oculares autoinmunes ejemplares incluyen la oftalmía simpática, el síndrome de Vogt-Koyanagi Harada (VKH), la retinocoriodopatía de perdigonada, el penfigoide cicatricial ocular, la iridoclitis heterocrómica de Fuchs y diversas formas de uveítis. Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto para tratar cualquiera de los trastornos anteriores.
Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener retinopatía diabética. Véase, por ejemplo, Demircan et al. (2006) Eye 20:1366-1369 y Doganay et al. (2006) Eye, 16:163-170. La uveítis incluye las formas agudas y crónicas e incluye la inflamación de uno o más del iris, el cuerpo ciliar y la coroides. Las formas crónicas pueden estar asociadas con una enfermedad sistémica autoinmune, por ejemplo, síndrome de Behcet, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide juvenil, síndrome de Reiter y enfermedades inflamatorias intestinales. En la uveítis anterior, la inflamación está principalmente en el iris (también iritis). La uveítis anterior puede afectar a sujetos que tienen una enfermedad sistémica autoinmune, pero también a sujetos que no tienen una enfermedad sistémica autoinmune. La uveítis intermedia implica la inflamación del vítreo anterior, la retina periférica y el cuerpo ciliar, a menudo con poca inflamación anterior o coriorretiniana. La pars planitis resulta de la inflamación de la pars plana entre el iris y la coroides. La uveítis posterior implica el tracto uveal y principalmente la coroides y también se denomina coroiditis. La uveítis posterior puede estar asociada con una infección sistémica o una enfermedad autoinmune. Puede persistir durante meses e incluso años. Se puede administrar un agente de unión al receptor a un sujeto para tratar cualquiera de las formas de uveítis anteriores. Véase también, por ejemplo, Tsai et al. (2009) Mol Vis 15:1542-1552 y Trittibach P et al. (2008) Gene Ther. 15(22): 1478-88.
Se puede utilizar un agente de unión al receptor para tratar a un sujeto que tiene o presenta riesgo de tener degeneración macular relacionada con la edad (AMD). El agente de unión al receptor se puede aplicar tópicamente en el ojo, inyectar (por ejemplo, intravítreamente) o proporcionar sistémicamente. Véase, por ejemplo, Olson et al. (2009) Ocul Immunol Inflamm 17(3):195-200.
Se puede administrar un agente de unión al receptor descrito en esta memoria de cualquier modo para tratar una enfermedad ocular. El agente se puede administrar por vía parenteral. Alternativamente, o además, el agente se puede administrar directamente en el ojo o cerca del ojo. Por ejemplo, la proteína se puede administrar tópicamente o intraocularmente, por ejemplo, como se describe a continuación.
Formulaciones y métodos para la administración ocular
Las formulaciones oftálmicas que contienen un agente de unión al receptor se pueden administrar por administración tópica, por ejemplo, para la administración como una gota líquida o un ungüento, o para el implante, por ejemplo, en una cámara anterior del ojo o el saco conjuntival. Las gotas líquidas se pueden administrar utilizando un gotero ocular. Cuando se formula para la administración ocular, el agente de unión al receptor puede estar presente en una concentración de 0,0001-0,1 %, 0,001-5 %, por ejemplo, 0,005-0,5 %, 0,05- 0,5 %, 0,01-5 %, 0,1-2 % o 1-5 %. Frecuentemente, la formulación oftálmica se aplica directamente en el ojo, incluyendo la aplicación tópica en los párpados o la instilación en el espacio (cul-de-sac) entre el globo ocular y los párpados. La formulación oftálmica se puede diseñar para mezclarse fácilmente con los fluidos lacrimales y para dispersarse sobre las superficies de la córnea y la conjuntiva. Con la técnica de administración habitual, la mayor parte del fármaco se deposita en el fórnix inferior. La capilaridad, las fuerzas difusionales y el reflejo de parpadeo conducen a la incorporación del fármaco en la película precorneal desde la cual penetra en la córnea y a través de esta.
Las formulaciones oftálmicas también pueden incluir uno o más de otros agentes, por ejemplo, un esteroide antiinflamatorio tal como rimexolona, loteprednol, medrisona e hidrocortisona, o un antiinflamatorio no esteroideo. Por ejemplo, el esteroide puede estar presente en una concentración del 0,001 al 1 % o puede no haber esteroide presente. Por ejemplo, el agente de unión al receptor es el único agente activo en la formulación.
La formulación también puede incluir uno o más de los siguientes componentes: surfactantes, agentes de tonicidad, tampones, conservantes, codisolventes y agentes potenciadores de la viscosidad. Los agentes de tonicidad se pueden utilizar para ajustar la tonicidad de la composición, por ejemplo, a la tonicidad de las lágrimas naturales. Por ejemplo, se pueden añadir cloruro de potasio, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, dextrosa y/o manitol para lograr una tonicidad adecuada, por ejemplo, la tonicidad fisiológica. Los agentes de tonicidad se pueden añadir en una cantidad suficiente para proporcionar una osmolalidad de aproximadamente 150-450 mOsm o 250-350 mOsm.
La formulación también puede incluir tamponamiento adecuado para la administración oftálmica. El tampón puede incluir uno o más componentes de tamponamiento (por ejemplo, fosfato de sodio, acetato de sodio, citrato de sodio, borato de sodio o ácido bórico) para los cambios en el pH especialmente en condiciones de almacenamiento. Por ejemplo, se puede seleccionar el tampón para proporcionar un pH diana dentro del intervalo de pH 6,0-7,5, por ejemplo, 6,5-7,5.
La formulación puede incluir un vehículo acuoso o de fosfolípidos. Especialmente para tratar trastornos del ojo seco, la formulación puede incluir agentes para proporcionar alivio a corto plazo, por ejemplo, compuestos que lubrican el ojo y ayudan a la formación de lágrimas. Por ejemplo, los vehículos de fosfolípidos (que incluyen uno o más fosfolípidos) se pueden utilizar para proporcionar alivio a corto plazo. Los ejemplos o composiciones de lágrimas artificiales útiles como vehículos de lágrimas artificiales incluyen los productos comerciales tales como Tears Naturale™ (Alcon Labs, Inc., TX EE. UU.). Por ejemplo, por ml, la formulación puede incluir: 1 mg de dextrano, 70 y 3 mg de hidroxipropilmetilcelulosa y, opcionalmente, un conservante como POLYQUAD® (policuaternio-1) al 0,001 % (m/v). Los ejemplos de formulaciones de vehículos de fosfolípidos incluyen las descritas en US 4.804.539, US 4.883.658, US 5.075.104, US 5.278.151 y US 5.578.586.
La formulación también puede incluir otros compuestos que actúan como lubricantes o agentes humectantes. Estos incluyen los agentes de viscosidad tales como: polioles monoméricos, tales como, glicerol, propilenglicol, etilenglicol; polioles poliméricos, tales como polietilenglicol, varios polímeros de la familia de celulosa: hidroxipropilmetilcelulosa («HPMC»), carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilcelulosa («HPC»), dextranos, tales como dextrano 70; proteínas hidrosolubles, tales como gelatina; y polímeros de vinilo, tales como alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, povidona y carbómeros, tales como carbómero 934P, carbómero 941; carbómero 940, carbómero 974P. Otros ejemplos adicionales incluyen los polisacáridos, tales como el ácido hialurónico y sus sales y sulfato de condroitina y sus sales, y polímeros de ácido acrílico. La formulación puede tener una viscosidad de entre 1 y 400 cP.
La formulación se puede envasar para el uso de dosis única o múltiple, por ejemplo, en una botella con un gotero asociado o como un conjunto de goteros para un solo uso. La formulación puede incluir uno o más conservantes, por ejemplo, para evitar la contaminación microbiana y micótica durante el uso. Los conservantes ejemplares incluyen: cloruro de benzalconio, clorobutanol, bromuro de benzododecinio, metilparabeno, propilparabeno, feniletil alcohol, edetato disódico, ácido sórbico y policuaternio-1, y se pueden incluir en una concentración del 0,001 al 1,0 % p/v. También es posible proporcionar una formulación que contiene un agente de unión al receptor que es estéril, pero sin conservantes. La formulación se puede preparar para una aplicación de uso único.
Se pueden utilizar envases oftálmicos para proporcionar un contacto prolongado de una formulación oftálmica con el ojo. Se satura un trozo de algodón con la formulación y a continuación se inserta en el fórnix superior o inferior. También se puede administrar un agente de unión al receptor mediante iontoforesis. Este procedimiento mantiene la solución en contacto con la córnea en una copa ocular que contiene un electrodo. La difusión del fármaco se produce por la diferencia de potencial eléctrico.
Un agente de unión al receptor también se puede administrar por inyección, por ejemplo, inyección subconjuntival. La formulación se puede inyectar debajo de la conjuntiva facilitando el paso a través de la esclerótica y dentro del ojo por difusión simple. La formulación también se puede inyectar debajo de la conjuntiva y la cápsula de Tenon subyacente en la parte más posterior del ojo para administrar el agente al cuerpo ciliar, la coroides y la retina. La formulación también se puede administrar por inyección retrobulbar.
Con respecto al ojo seco y a otros trastornos superficiales, se puede evaluar a los sujetos utilizando uno o más de los siguientes enfoques: el índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI), tinción corneal y conjuntival y la prueba de Schirmer.
El índice de enfermedad de la superficie ocular (OSDI) es un cuestionario de 12 ítems que proporciona una rápida evaluación de los síntomas de la irritación ocular consistente con los trastornos inflamatorios de la superficie ocular, incluyendo DES, y su impacto en el funcionamiento relacionado con la visión. Véase, por ejemplo, Ocul Immunol Inflamm. sept.-oct. de 2007;15(5):389-93. Los 12 ítems del cuestionario OSDI se califican en una escala de 0 a 4. Las puntuaciones se derivan sobre la base de las respuestas para proporcionar una puntuación de OSDI en una escala de 0 a 100, representando las puntuaciones más altas una mayor discapacidad. Un cambio negativo con respecto a la línea base indica una mejoría en la función relacionada con la visión y los trastornos oculares inflamatorios.
Tinción corneal y conjuntival: la tinción corneal es una medida de enfermedad epitelial o ruptura de la barrera epitelial de la superficie ocular, que típicamente se observa en los trastornos inflamatorios de la superficie ocular tales como el ojo seco. La tinción corneal puede existir incluso sin la manifestación clínica del ojo seco, si hay una enfermedad de los párpados significativa, tal como blefaritis posterior. La tinción corneal está altamente correlacionada con el malestar ocular en muchos pacientes, aunque no en todos; en general, la tinción corneal está asociada con puntuaciones altas en el OSDI, como se ha descrito anteriormente. Para la tinción con fluoresceína de la córnea, se utilizan tiras de fluoresceína humectadas con solución salina o solución de fluoresceína de sodio al 1 % para teñir la película lagrimal. A continuación, se examina toda la córnea utilizando evaluación con lámpara de hendidura con un filtro de barrera amarillo (N.° 12 Wratten) e iluminación azul cobalto. La tinción se califica según el esquema de Oxford. La tinción conjuntival también es una medida de enfermedad epitelial o ruptura en la barrera epitelial de la superficie ocular. La tinción conjuntival se realiza bajo la lámpara de hendidura utilizando verde lisamina. Se utiliza una tira humectada con solución salina o solución con verde lisamina al 1 % para teñir la película lagrimal y se evalúa la tinción conjuntival interpalpebral más de 30 segundos, pero menos de 2 minutos a continuación. Utilizando luz blanca de intensidad moderada, se califica solamente la región interpalpebral de la conjuntival nasal y temporal utilizando el esquema de Oxford.
Prueba de Schirmer: la prueba de Schirmer se realiza con y sin anestesia, colocando una tira de papel de filtro estrecha (tira de 5 x 35 mm de papel de filtro Whatman N.° 41) en el cul-de-sac inferior. Esta prueba se realiza en una habitación con poca luz. El paciente cierra suavemente los ojos, se dejan transcurrir cinco minutos y se retiran las tiras. Como el frente de la lágrima continuará avanzando unos pocos milímetros después de que se haya retirado de los ojos, se marca el frente de la lágrima con un bolígrafo precisamente a los cinco minutos. Se mide la producción lagrimal acuosa mediante la longitud que se humedece la tira en milímetros, durante 5 minutos. Los resultados de 10 mm o menos en la prueba de Schirmer sin anestesia y de 5 mm o menos en la prueba de Schirmer con anestesia se consideran anormales. Un cambio positivo con respecto a la línea base indica una mejoría de uno o más síntomas de un trastorno ocular inflamatorio descrito en esta memoria.
Formulaciones y métodos para la administración pulmonar
Se puede formular un agente de unión al receptor para la administración inhalatoria u otra vía de administración pulmonar, por ejemplo, para administrar el agente a un tejido del tracto respiratorio, por ejemplo, el tracto respiratorio superior e inferior. Los tres sistemas comunes que se pueden utilizar para administrar agentes localmente a los conductos de aire pulmonares incluyen inhaladores de polvo seco (Dpi), inhaladores de dosis medidas (MDI) y nebulizadores. Los MDI se pueden utilizar para administrar agentes de unión al receptor en una forma solubilizada o como una dispersión. Típicamente, los m Di incluyen un freón u otro propelente de presión de vapor relativamente alta que fuerza el medicamento aerosolizado al tracto respiratorio tras la activación del dispositivo. En cambio, los DPI generalmente se basan en el esfuerzo inspiratorio del paciente para introducir un medicamento en forma de polvo seco a los pulmones. Los nebulizadores forman un aerosol del medicamento para ser inhalado proporcionando energía a una solución líquida. El agente se puede almacenar en forma liofilizada (por ejemplo, a temperatura ambiente) y reconstituir en solución antes de la inhalación.
La administración pulmonar directa de fármacos durante la ventilación líquida o el lavado pulmonar utilizando un medio fluoroquímico también son posibles modos de administración. Se pueden utilizar estos y otros métodos para administrar un agente de unión al receptor. Por ejemplo, el agente se administra en una forma de dosificación unitaria de al menos aproximadamente 0,02, 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 20, 40 o 50 mg/disparo o más.
El agente de unión al receptor se puede administrar de forma conveniente en la forma de una presentación de pulverización en aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dielilorotetrafluoroctliano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y los cartuchos para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular de forma que contengan una mezcla en polvo del agente de unión al receptor y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón, si la partícula es una partícula formulada. Además del agente de unión al receptor formulado o no formulado, se pueden mezclar otros materiales, tales como DPPC al 100 % u otros surfactantes para promover la administración y la dispersión del agente de unión al receptor formulado o no formulado. El tamaño de partícula también se puede variar para controlar si la administración es en el tracto respiratorio superior o inferior. Por ejemplo, las partículas en el intervalo de tamaño de 1-5 micrómetros o de 10-50 micrómetros se pueden utilizar para los tractos respiratorios superior e inferior, respectivamente.
Se pueden utilizar potenciadores de la administración tales como surfactantes para potenciar aún más la administración pulmonar. Un surfactante generalmente es un compuesto que tiene un resto hidrofílico y lipofílico, que promueve la absorción de un fármaco interactuando con una interfase entre dos fases inmiscibles. Los surfactantes son útiles en las partículas secas por varios motivos, por ejemplo, la reducción de la aglomeración de partículas y la reducción de la fagocitosis de macrófagos. Los surfactantes son muy conocidos en la técnica e incluyen los fosfoglicéridos, por ejemplo, fosfatidilcolinas, L-alfa-dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) y difosfatidilglicerol (DPPG); hexadecanol; ácidos grasos; polietilenglicol (PEG); polioxietileno-9-; lauril éter; ácido palmítico; ácido oleico; trioleato de sorbitán (Span 85); glicocolato; surfactina; poloxómero; éster de ácido graso de sorbitán; trioleato de sorbitán; tiloxapol; y fosfolípidos.
También se presentan en esta memoria anticuerpos que reconocen específicamente un dominio de citocinas quimérico descrito en esta memoria. Por ejemplo, dichos anticuerpos se unen preferentemente a un dominio quimérico respecto a cualquier dominio de citocinas madre. Por ejemplo, un anticuerpo específico se puede unir a un epítopo que incluye una unión entre un segmento de una primera citocina madre y una segunda citocina madre.
Administración de ácidos nucleicos
Un agente de unión al receptor se puede proporcionar a un sujeto administrando un ácido nucleico que codifica y que puede expresar el agente de unión al receptor. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica el agente de unión al receptor se puede colocar bajo el control de las secuencias de control de la transcripción y posicionarse en un vector de ácido nucleico para la administración del gen, por ejemplo, un vector viral. Los vectores virales ejemplares incluyen los vectores adenovirales, retrovirales o virales adeno-asociados. Los vectores pueden estar en la forma de un plásmido o molécula lineal, por ejemplo, un ADN de doble cadena lineal. El ácido nucleico administrado se puede diseñar para ser incorporado en el genoma de la célula diana, por ejemplo, para integrarse en el genoma de la célula diana. Alternativamente, el ácido nucleico administrado se puede diseñar de modo que después de la administración esté presente de forma autónoma en la célula.
Las secuencias de control transcripcional se pueden preparar por ingeniería para proporcionar una expresión transitoria o constitutiva. El control transitorio puede incluir control regulado por un agente exógeno, por ejemplo, utilizando elementos de respuesta transcripcional para los factores de transcripción que responden a los agentes exógenos (por ejemplo, una hormona esteroide o FK506) o señales ambientales.
Se puede evaluar la expresión de genes proporcionados en el ácido nucleico administrado, por ejemplo, detectando la proteína codificada por el gen (por ejemplo, utilizando anticuerpos) o detectando el ARNm, por ejemplo, utilizando PCR o hibridación Northern. El ácido nucleico administrado generalmente se preparar por ingeniería de modo que el ADN regulador de la transcripción y la traducción se posicione adecuadamente con respecto a la secuencia codificante para el agente de unión al receptor, de modo que se inicie la transcripción y se traduzca la proteína a partir del mensaje resultante. El ácido nucleico puede incluir secuencias de ácido nucleico reguladoras de la transcripción y la traducción de células de mamíferos, especialmente humanas. Dichas secuencias incluyen, por ejemplo, secuencias promotoras, sitios de unión al ribosoma, secuencias de inicio y parada de la transcripción, secuencias de inicio y parada de la traducción y secuencias potenciadoras o activadoras.
Además, el vector de expresión puede incluir elementos adicionales. Por ejemplo, para los vectores de expresión de integración, el vector de expresión puede contener al menos una o dos secuencias homólogas al genoma de la célula huésped, por ejemplo, flanqueando la construcción de expresión. El vector de integración se puede dirigir a un locus específico en la célula huésped mediante la selección de la secuencia homóloga adecuada para la inclusión en el vector. Las construcciones para los vectores de integración se conocen en la técnica.
Los vectores adenovirales ejemplares incluyen versiones modificadas de adenovirus humanos, tales como Ad2 o Ad5, en los cuales se han eliminado los elementos genéticos necesarios para que el virus se replique in vivo. Por ejemplo, se puede eliminar la región E1 y se puede modificar adicionalmente el genoma para aceptar un casete de expresión que codifica el agente de unión al receptor.
Los vectores retrovirales ejemplares incluyen los vectores LNL6, LXSN, LNCX y lentivirales. Los vectores lentivirales específicos han sido descritos por Pawliuk et al. (2001) Science 294:2368 e Imren et al. (2002) PNAS 99:14380 e incluyen limitado a, virus de la inmunodeficiencia humana (por ejemplo, VIH-1, VIH-2), virus de la inmunodeficiencia felina (VIF), virus de la inmunodeficiencia de los simios (VIS), virus de la inmunodeficiencia bovina (VIB) y virus de la anemia infecciosa equina (VAIE). Estos vectores se pueden construir y preparar por ingeniería de modo que sean seguros, por ejemplo, separando los genes esenciales (por ejemplo, gag y pol) en vectores separados y proporcionando retrovirus con la replicación defectuosa. Los retrovirus con la replicación defectuosa se empaquetan entonces en viriones a través del uso de un virus auxiliar o una línea celular de empaquetamiento mediante las técnicas convencionales. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células in vitro o in vivo con dichos virus se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), secciones 9.10-9.14 y otros manuales de laboratorio estándar. El vector retroviral puede incluir, además de las secuencias para expresar un agente de unión al receptor, un LTR retroviral izquierdo (5'); un elemento de exportación retroviral, opcionalmente un elemento de respuesta inverso (RRE); un promotor y una región de control del locus (LCR) u otra secuencia aislante transcripcional y un LTR retroviral derecho (3'). Los vectores retrovirales pueden contener además un tracto de polipurina central (cPPT) o un fragmento de ADN para aumentar las titulaciones virales y la eficacia de transducción.
El ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica un agente de unión al receptor se puede administrar a cualquier célula diana adecuada, por ejemplo, ex vivo o in vivo. Las células diana ejemplares incluyen células sinoviales, células hematopoyéticas, células dérmicas y similares. El ácido nucleico se puede administrar a las células diana asociadas con el ojo, por ejemplo, las células epiteliales de la córnea. La administración puede incluir desbridamiento o raspado del epitelio de la córnea para exponer una capa basal de epitelio. A continuación, se añade el ácido nucleico para la administración. Se puede administrar el ácido nucleico a las células endoteliales de la córnea, las células de la malla trabecular debajo de la periferia de la córnea, las células de la capa coroide del ojo, las células de la retina, la esclerótica o el cuerpo ciliar, las células de la vasculatura retinal u ocular o las células del cuerpo vítreo o las células del cristalino, por ejemplo, el epitelio del cristalino.
Los métodos de administración incluyen, por ejemplo, infección retroviral, infección adenoviral, transformación con plásmidos, transformación con liposomas que contienen ácido nucleico exógeno, administración biolística del ácido nucleico (por ejemplo, cargando el ácido nucleico en partículas de oro u otro metal y disparándolas o inyectándolas en las células), infección con virus adeno-asociado e infección con virus de Epstein-Barr. La administración puede ser en las células o el tejido a través de cualquier método incluyendo inyección de aguja, hipopulverización, electroporación o una pistola de genes.
Otros métodos para la administración de genes se pueden encontrar, por ejemplo, en Kay, M. A. (1997) Chest 111(6 Sup.):138S-142S; Ferry, N. y Heard, J. M. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1975-81; Shiratory, Y. et al. (1999) Liver 19:265-74; Oka, K. et al. (2000) Curr. Opin. Lipidol. 11:179-86; Thule, P. M. y Liu, J. M. (2000) Gene Ther. 7:1744-52; Yang, N. S. (1992) Crit. Rev. Biotechnol. 12:335-56; Alt, M. (1995) J. Hepatol. 23:746-58; Brody, S. L. y Crystal, R. G. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sci. 716:90-101; Strayer, D. S. (1999) Expert Opin. Investig. Drugs 8:2159-2172; Smith-Arica, J. R. y Bartlett, J. S. (2001) Curr. Cardiol. Rep. 3:43-49; y Lee, H. C. et al. (2000) Nature 408:483-8.
Segundos agentes ejemplares
Un agente de unión al receptor descrito en esta memoria se puede administrar con un segundo agente. Los dos agentes se pueden coadministrar o administrar por separado, por ejemplo, utilizando regímenes diferentes. Los segundos agentes ejemplares incluyen un agente antiinflamatorio. En una realización de la descripción, el segundo agente es un antagonista de IL-17 (abarca los antagonistas de todos los miembros de la familia iL-17, por ejemplo, antagonistas de IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E). Los antagonistas de IL-17 ejemplares incluyen: agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-17 (incluyendo IL-17A, IL-17F, IL-17B, IL-17C, IL-17D e IL-17E) y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-17, tales como IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene IL-17 y al menos una subunidad del receptor, por ejemplo, IL-17 e Il-17RA, o IL-17, IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17; y agentes tales como los receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-17RA e IL-17RC y que antagonizan la señalización mediada por IL-17.
En otra realización de la descripción, el segundo agente es un antagonista de IL-12. Los antagonistas de IL-12 ejemplares incluyen: agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-12 (incluyendo p35 y p40) y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-12, tales como IL-12Rp1 o IL-12Rp2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene p35, p40 y al menos una subunidad del receptor, por ejemplo, IL-12Rp1 o IL-12Rp2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12; y agentes tales como los receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-12Rp1 o IL-12Rp2 y que antagonizan la señalización mediada por IL-12.
En otra realización de la descripción, el segundo agente es un antagonista de IL-23. Los antagonistas de IL-23 ejemplares incluyen: agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a IL-23 (incluyendo p19 y p40) y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a uno o más receptores de IL-23, tales como IL-12Rp1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; agentes (tales como anticuerpos y otras proteínas de unión) que se unen a un complejo que contiene p19, p40 y al menos una subunidad del receptor, por ejemplo, IL-12Rp1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23; y agentes tales como los receptores solubles que incluyen uno o más de los dominios extracelulares solubles de IL-12Rp1 o IL-23R y que antagonizan la señalización mediada por IL-23.
Se han descrito anticuerpos ejemplares para IL-23. Véase, por ejemplo, Beyer et al., J. Mol. Biol. (2008), doi:10.1016/j.jmb.2008.08.001.
Modelos animales
Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo animal para una enfermedad humana, por ejemplo, una enfermedad humana autoinmune y/o una enfermedad humana inflamatoria. El agente puede tener especificidad para la proteína diana correspondiente en el animal.
Modelos de artritis reumatoide. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo animal de artritis reumatoide, por ejemplo, el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA). Véase, por ejemplo, McIndoe et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:2210-2214; Issekutz, A. C. et al., Immunology (1996) 88:569; y Current Protocols in Immunology, unidad 15.5, Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. El modelo se produce mediante la inmunización de cepas susceptibles de ratas/ratones con colágeno nativo tipo II. Se emulsiona el colágeno en adyuvante completo de Freund (CFA) y se inyecta por vía intradérmica (100 pg de colágeno:100 pg de CFA/ratón) en la base de la cola. A Los ratones de control se les inyectan por vía intradérmica 0,05 ml de emulsión de agua destilada/CFA. Se administra una inyección de refuerzo de colágeno en adyuvante incompleto 21 días después de la inmunización inicial. La enfermedad está causada por una respuesta autoinmune inducida tras la inmunización con colágeno.
Las articulaciones se pueden puntuar en cuanto a la artritis, inflamación, pannus, daño en el cartílago y resorción ósea utilizando una escala definida. Por ejemplo, la gravedad de la artritis se puede puntuar del siguiente modo: 0=sin efectos visibles de artritis; 1= edema y eritema de un dedo o articulación; 2=edema y eritema de dos articulaciones; 3=edema y eritema de más de dos articulaciones; 4=artritis grave de toda la pata y los dedos, acompañada por anquilosis del tobillo y deformidad de la extremidad. Se suma la puntuación de cada extremidad y se registra como el índice artrítico (AI) para cada animal individual. También se pueden utilizar otros esquemas de puntuación para estos y otros criterios.
Esclerosis múltiple. La encefalomielitis alérgica experimental (EAE) es un modelo murino útil para la esclerosis múltiple. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en el modelo de EAE. EAE es un trastorno autoinmune mediado por células T, caracterizado por la inflamación de las células T y de las células mononucleares y la posterior desmielinización de los axones en el sistema nervioso central. (Véase, por ejemplo, Bolton, C., 1995, Multiple Sclerosis, 143.). Se pueden encontrar protocolos ejemplares en Current Protocols in Immunology, unidad 15.1 y 15.2; Coligan et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc. También hay modelos disponibles para la enfermedad de la mielina en los que se injertan oligodendrocitos o células de Schwann en el sistema nervioso central, por ejemplo, como se describe en Duncan et al., 1997, Molec. Med. Today, 554-561.
Aloinjerto. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo animal para el rechazo de aloinjertos de piel, por ejemplo, utilizando injertos murinos de piel de cola. El rechazo de aloinjertos de piel está mediado por las células T, las células T auxiliares y las células T asesinas-efectoras. Véase, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, unidad 4.4; Coligan et al. (eds.), 1995, John Wiley & Sons, Inc. También se pueden utilizar otros modelos de rechazo de trasplantes. Véase, por ejemplo, Tinubu et al., 1994, J. Immunol., 4330-4338.
Modelos de IBD y colitis. Un modelo ejemplar para la enfermedad inflamatoria intestinal es el uso de células CD4+ con CD45Rb alto transferidas a ratones SCID. Véase, por ejemplo, Hirano et al., J Pharmacol Sci. 2009 Jun;110(2):169-81 y el uso de ratones transgénicos con deficiencia de IL-10. Véase, por ejemplo, Inaba et al., Inflamm Bowel Dis., DOI: 10.1002/ibd.21253 (2010). Otro modelo ejemplar más de colitis emplea dextrano sulfato de sodio (DSS) para inducir la colitis aguda. Por ejemplo, se puede inducir la colitis en ratones mediante la administración de DSS al 5 % (p/v) (masa molecular 30-40 kDa; ICN Biomedicals, Aurora, OH) en el agua de bebida a voluntad. Los síntomas resultantes de este tratamiento incluyen diarrea con sangre, pérdida de peso, acortamiento del colon y ulceración de la mucosa con infiltración de neutrófilos. La colitis inducida por DSS se caracteriza histológicamente por infiltración de las células inflamatorias en la lámina propia, con hiperplasia linfoide, daño focal de las criptas y ulceración del epitelio. Se cree que estos cambios se desarrollan debido a un efecto tóxico del DSS sobre el epitelio y por la fagocitosis de las células de la lámina propia y la producción de TNF-alfa e IFN-gamma. Véase, por ejemplo, Hassan et al. PLoS One. 25 de enero de 2010;5(1):e8868.
Modelos de enfermedad del ojo seco. Se puede evaluar un agente de unión al receptor en un modelo de ratón para la enfermedad del ojo seco. Se puede inducir el ojo seco en ratones mediante inyección subcutánea de escopolamina y colocación de los ratones en cámaras de ambiente controlado. Como ejemplo específico, se pueden inducir ratones C57BL/6 hembra de 6 a 10 semanas de edad sanos y normales para que sufran ojo seco mediante exposición continua a un ambiente seco en una cámara de ambiente controlado. La cámara tiene una humedad relativa baja inferior al 30 % (generalmente el 19 % aproximadamente), flujo de aire alto (15 litros/minuto) y temperatura constante (aproximadamente 22 °C). Los ratones colocados en la cámara también reciben tratamiento con escopolamina para inhibir la secreción de lágrimas. Se pueden obtener parches transdérmicos de escopolamina de liberación sostenida de Novartis (Summit, N.J.). Se aplica un cuarto de un parche en la mitad de la cola depilada de los ratones cada 48 horas. La combinación de la cámara de ambiente controlado y la escopolamina produce ojo seco grave en un período de tiempo relativamente corto (aproximadamente de 2 a 4 días). Se puede preparar la cámara de ambiente controlado como se describe en Barbino et al., Invest. Ophthal. Vis. Sci., 46: 2766-2711 (2005) y permite el control del flujo de aire, la humedad y la temperatura.
Se puede monitorizar a los ratones para detectar signos de ojo seco, por ejemplo, mediante la realización de: a) prueba del hilo de algodón para medir la producción lagrimal acuosa, que generalmente disminuye en los pacientes con ojo seco; b) tinción de la córnea con fluoresceína que es un marcador del daño de la superficie de la córnea; y examen oftálmico general.
Prueba del hilo de algodón: se puede medir la producción lagrimal con la prueba del hilo de algodón, impregnado con rojo de fenol (Zone-Quick, Lacrimedics, Eastsound, Wash.). Bajo una lámpara fluorescente con lupa, se sostiene el hilo con fórceps de joyería y se coloca en el canto lateral del fórnix conjuntival del ojo derecho durante 30 o 60 segundos. Se lee la distancia lagrimal en mm bajo un microscopio utilizando la escala de un hemocitómetro.
Tinción de la córnea con fluoresceína: se puede evaluar la tinción de la córnea con fluoresceína mediante la aplicación de 1,0 pl de fluoresceína al 5 % utilizando una micropipeta en el saco conjuntival inferior del ojo. Se examina la córnea con un biomicroscopio con lámpara de hendidura utilizando luz azul de cobalto 3 minutos a continuación de la instilación de fluoresceína. La tinción puntuada se registra de forma enmascarada utilizando un sistema de calificación estandarizado del Instituto Nacional del Ojo (National Eye Institute, NEI) de 0-3 para cada una de las cinco áreas en las cuales se ha dividido la superficie de la córnea.
Diagnóstico y otros usos
Un agente de unión al receptor descrito en esta memoria se puede utilizar para detectar IL-1R1 en una muestra o en células que expresan dicho receptor. Por ejemplo, el agente se puede marcar directa o indirectamente con un grupo que es un marcador o que produce una señal, por ejemplo, una enzima, un radiomarcador, un epítopo o una proteína fluorescente (tal como una proteína verde fluorescente). El agente se puede poner en contacto con una muestra o con células para determinar si el receptor está presente en la muestra o en las células, por ejemplo, utilizando inmunotransferencia estándar, inmunofluorescencia, inmunoensayo enzimático (EIA), radioinmunoensayo (RIA), transferencia de energía de fluorescencia, transferencia Western y otras técnicas de diagnóstico y detección. El agente de unión al receptor también puede marcarse para la detección in vivo y administrarse a un sujeto. Se pueden obtener imágenes del sujeto, por ejemplo, por RMN u otros medios de tomografía. Por ejemplo, se puede marcar el agente de unión con un radiomarcador tal como 131I, 111In, 123I, 99mTc, 32P, 125I, 3H, 14C y 188Rh, con marcadores fluorescentes tales como la fluoresceína y la rodamina, con marcadores activos de resonancia magnética nuclear, isótopos emisores de positrones detectables utilizando un escáner de tomografía por emisión de positrones («PET»), quimioluminiscentes como la luciferina y marcadores enzimáticos como la peroxidasa o la fosfatasa. Se puede marcar el agente con un agente de contraste como los agentes paramagnéticos y ferromagnéticos o superparamagnéticos (que modifican principalmente la respuesta de T2).
Un agente de unión al receptor también se puede utilizar para purificar las células que expresan el receptor al cual se une. Por ejemplo, el agente de unión al receptor se puede acoplar a un soporte inmovilizado (por ejemplo, esferas magnéticas o una matriz de columna) y se puede poner en contacto con células que pueden expresar el receptor. Se puede lavar el soporte, por ejemplo, con un tampón fisiológico y se pueden recuperar las células del soporte.
Un agente de unión al receptor también se puede utilizar para purificar las formas solubles del receptor al cual se une. Por ejemplo, se pueden poner en contacto muestras que contienen el receptor soluble con el agente de unión al receptor inmovilizado y a continuación, por ejemplo, después del lavado, se pueden recuperar del agente inmovilizado.
Los siguientes ejemplos no limitantes ilustran más las realizaciones de las invenciones descritas en esta memoria.
Ejemplos
Ejemplo 1
Se construyeron ácidos nucleicos que codifican las proteínas con las secuencias de aminoácidos enumeradas en la tabla 4 (a continuación) en un vector pET que contiene un promotor T7 y genes de resistencia a la ampicilina (serie pET31) o a la kanamicina (serie pET28) (e Md Chemicals, Gibbstown NJ, EE. UU.) y se expresaron. En la tabla 5, se proporcionan ejemplos de las secuencias codificantes que se pueden utilizar para la expresión.
Tabla 4
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En la tabla 5, se enumeran secuencias de ácidos nucleicos ejemplares que codifican las proteínas anteriores. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye además un ATG antes del primer nucleótido enumerado a continuación. En algunas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico incluye además un codón de parada (tal como TAA, TAG o TGA) a continuación del último nucleótido enumerado a continuación.
Tabla 5
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Las proteínas pueden incluir un rango de diversos residuos de IL-1p e IL-1Ra como se lustra a continuación. Entre los ejemplos P01, P02, P03, P04 y P05, los dominios de citocinas pueden tener entre el 48 y el 70 % de residuos de IL-1 p y entre el 55 y el 78 % de residuos de IL-1Ra. (Como algunos residuos de aminoácidos se conservan entre las dos proteínas, la suma del porcentaje de identidad con IL-1 p y con IL-1Ra puede ser superior al 100 %).
Tabla 6
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Ejemplo 2
Se expresaron proteínas que contienen una etiqueta de hexahistidina en células de E. coli de la cepa BL21(DES) mediante inducción con IPTG 1 mM a 37 °C durante 3 horas en medio de caldo LB. Se lisaron las células en Tris 20­ 50 mM, NaCl 0,5 M, EDTA 2,5 mM, Tritón X-100 al 0,1%, pH 8,0. Se sometieron los lisados a cromatografía IMAC utilizando una columna preempaquetada HiTrap® (GE Healthcare, Piscataway NJ, EE. UU.). Se cargó la proteína en tampón de fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, imidazol 10 mM, pH 7,4. Se eluyó con tampón de imidazol 200 mM, fosfato de sodio 20 mM, NaCl 0,5 M, pH 7,4. Se dializó la proteína eluida extensamente frente a PBS, polisorbato 80 al 0,1%, pH 7,4, se concentró utilizando un filtro Amicon Ultra® (10K) y se almacenó a 4° o -80 °C.
Se purificaron las proteínas que no tenían una etiqueta de hexahistidina mediante cromatografía de intercambio iónico. Se purificó la proteína P05 mediante cromatografía de intercambio iónico. Se aplicó el lisado de las células de expresión en una columna GigaCapS™ (Tosoh Bioscience LLC, King of Prussia, PA, EE. UU.) a pH bajo (aproximadamente pH 5,5) en ausencia de sal (conductividad de aproximadamente 1 mS/cm). Se eluyó la columna mediante un gradiente de pH (tampón A = ácido acético 10 mM, pH 5,5; tampón B = Tris 20 mM, pH 8). Se diluyó una fracción de 5 ml que contenía la proteína eluida con 5 ml de H2O y 5 ml de Tris 20 mM, pH 8 y se aplicó en una resina CaptoQ™ (GE Healthcare, Piscataway NJ, EE. UU.) y se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 mM a 250 mM en Tris 20 mM, pH 8,0. Se dializó la proteína eluida extensamente frente a 1,25 X PBS TWEEN® 80 al 0,1 % o 1,25X PBS sin TWEEN® y se almacenó. Véase la Fig. 6. Se purificaron las proteínas P03 y P04 utilizando métodos similares.
También se crecieron células que expresaban P05 en Caldo TEKNOVA™ Terrific con Soytone no animal (N.° T7660) suplementado con 10 g/L de glucosa, MgSO410 mM, elementos traza (1 mg/ml de 1.000X Elementos Traza TEKNOVA™, N.° T1001) y antibiótico en un Sartorius BIOSTAT™ A+ de 2L y se indujeron a DO de 35-40 con IPTG 1 mM durante aproximadamente 6 horas. Se crecieron las células a 37 °C con oxígeno disuelto al 30 % a pH 7,0, y agitación a 200-800 rpm con purga de oxígeno a 2 L/min. Se alimentan las células con 9 g de glucosa/L/h cuando se agota la glucosa según se detecta por un aumento del pH. Se reduce la alimentación a 6 g de glucosa/L/h cuando el pH disminuye (aproximadamente 2,5 horas después de la inducción).
Las células se recogieron y se lisaron en tampón de lisis (Tris 20 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0,1 %, pH 8,0; Tris 20 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0,1%, pH 7,0; MOPS 50 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0,1 %, pH 6,5; o MOPS 50 mM, EDTA 10 mM, Tritón al 0,1 %, pH 6,0). Se cargó el lisado en un medio de intercambio iónico de cationes Poros XS® (Life Technologies Corp., Carlsbad CA EE. UU.) a pH 5,3 y 3 mS/cm (35 mg de producto por ml de resina de la columna).
En un procedimiento ejemplar, se eluye la proteína P05 en una etapa a pH 7,0 utilizando tampón que contiene MOPS 100 mM, NaCl 25 mM, pH 7,0. Se desechó el primer pico de elución y se recogió el segundo pico de elución en combinados y contenían la proteína P05. Los primeros combinados se enriquecen en la proteína P05 intacta con respecto a una especie des-Ala. Este material eluido a continuación se deja fluir sobre una resina de intercambio aniónico CaptoQ™. Se recoge el flujo saliente, que contiene la proteína P05 intacta.
En otro procedimiento ejemplar, se lava el medio con MOPS 100 mM, NaCl 20 mM, pH 6,0. Se eluye la proteína P05 en una etapa a pH 6,0 utilizando tampón que contiene MOPS 100 mM, NaCl 50-58 mM, pH 6,0. Se separó el primer pico de elución de los picos posteriores y contenía la proteína P05 intacta. El material eluido a continuación se deja fluir sobre una resina de intercambio aniónico CaptoQ™. Se recoge el flujo saliente que contiene la proteína P05 intacta.
Ejemplo 3
Se evaluaron las proteínas o los sobrenadantes que contenían las proteínas en un ensayo basado en células para detectar la actividad de IL-1. Se utilizaron células que responden a IL-1 p HEK-Blue™ para monitorizar la actividad de IL-1 p (disponibles en InvivoGen Inc., San Diego CA, e E. UU.). Estas células incluyen un gen indicador de SEAP bajo el control del promotor mínimo de IFN-p fusionado a cinco sitios de unión a NF-kB y a cinco sitios de unión a AP-1. La unión de IL-1 p a los receptores de IL-1 sobre la superficie celular produce la activación de NF-kB y la producción de SEAP. El informe de SEAP se puede detectar, por ejemplo, utilizando QUANTI-Blue™ (InvivoGen Inc., San Diego CA, EE. UU.) y análisis espectrofotométrico. Se preparó una suspensión de células IL-1 p HEK-Blue a partir de células cultivadas hasta el 70-80 % de confluencia. Se ajustaron las células resuspendidas a ~330.000 células/ml en medio de cultivo nuevo (DMEM, 4,5 g/l de glucosa, L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal inactivado por calor al 10 % (v/v) (30 min a 56 °C), 50 U/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, 100 pg/ml de NormocinaT).
Se añadieron los reactivos a los pocillos de una placa de cultivo celular de 96 pocillos de fondo plano: 10 pl de IL-1 p a 20 ng/ml, 1 pl del agente de interés y 30 pl del medio de cultivo celular hasta un volumen final de 50 pl. Se prepararon muestras de control positivo y negativo en paralelo. Se añadieron 150 pl de la suspensión de células IL-1 p HEK-Blue (~50.000 células) a cada pocillo y se cultivó la placa durante la noche a 37 °C en una incubadora de cultivo de tejidos con CO2 al 5 %. En general, la concentración de IL-1 p final (en el volumen final de 200 pl) fue 0,1 ng/ml. Se evaluó la actividad de IL-1 p al día siguiente (12-15 horas más tarde). Antes de la cuantificación, se preparó el reactivo QUANTI-BlueTM según las instrucciones del fabricante. Se preparó una placa de ensayo de 96 pocillos de fondo plano en la cual se añadieron 150 pl de solución QUANTI-Blue™ a cada pocillo. Se añadieron 50 pl de medio condicionado de los pocillos de la placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a cada pocillo de la placa de ensayo. Se incubó la placa a 37 °C durante aproximadamente 15 a 20 minutos. Se midieron los niveles de SEAP utilizando un espectrofotómetro a 620-655 nM.
Resultados. Como se muestra en la Fig. 7A, en este ensayo, la proteína P06 se comportó como un agonista de IL-1RI, la proteína P07 se comportó como un agonista parcial y la proteína P01 no produjo agonismo. De hecho, la proteína P01 se comportó como un antagonista cuando se evaluó en presencia de IL-1 p. La Fig. 7B muestra el antagonismo de la actividad de IL-1 p por P01 en un intervalo de concentraciones de la proteína de IL-1 p utilizando el ensayo de células HEKBlue™ anterior. El antagonismo aumentó con cantidades crecientes de P01 (el eje de las x refleja los microlitros de sobrenadante que contenía P01).
Las proteínas P01, P02, P03, P04 y P05 antagonizaron cada una la actividad de I L-1 p. Véase, por ejemplo, la Fig. 8A y 8B. La CI50 de P05 fue inferior a aproximadamente 5 ng/ml. Se evaluó la capacidad de P05 de agonizar IL-1RI en este ensayo y se observó que no presentaba ninguna actividad agonista detectable, incluso a las mayores concentraciones evaluadas, 1 mg/ml. P01, P02, P03, P04 y P05 también inhibieron la expresión de IL-6 inducida por IL-1 p en células MG-63, una línea celular de osteosarcoma humano que responde a I L-1 p. En un modelo murino de enfermedad del ojo seco, se observó que P05 marcada con hexahistidina presentaba actividad biológica. Véase también el ejemplo 8 a continuación respecto a la P05 no marcada.
Ejemplo 4
Se evaluaron las propiedades de unión de las proteínas para IL-1RI humano recombinante soluble (correspondiente al dominio extracelular de IL-1RI) utilizando resonancia de plasmón superficial con un sistema SPR de doble canal Reichert SR7000DC. Se evaluó la unión en solución salina con tampón de fosfato con Tween 20 al 0,005 %. Se observó que IL-1 p tenía una Kd de entre 8-9 nM y una constante de disociación (Kd) de entre 2-3 x 10-3 s-1, y en otro experimento una Kd de aproximadamente 2 nM, una constante de asociación de 1,3-1,5 x 106 M-1s-1, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 2,9-3,0 x 10-3 s-1. Véase la Fig. 9A. La proteína P01 se unió con cinética de asociación similar a IL-1 p, pero no se disoció durante la fase de disociación del experimento de unión (aproximadamente 180 segundos). Por lo tanto, la proteína P01 se unió a IL-1RI con una mayor afinidad que IL-1 p en condiciones similares.
Se observó que la unión de IL-1Ra tenía una Kd de aproximadamente 0,33 nM, una constante de asociación (Ka) de aproximadamente 2 x 105 M' V 1, y una constante de disociación (Kd) de aproximadamente 6,6 x 10'5 s-1. Véase la Fig. 9B. Se observó que los dominios de citocinas quiméricos P01, P02, P03, P04 y P05 tenían una Kd en el intervalo de aproximadamente 12-1.700 pM, una constante de asociación (Ka) en el intervalo de aproximadamente 3 x 104 M-1s-1 a 3 x 106 M-1s-1 y una constante de disociación (Kd) en el intervalo de aproximadamente 2 x 10-5 y 1 x 10-3 s-1. Véanse, por ejemplo, las Fig. 9C y 9D y la tabla 7 a continuación.
Tabla 7
Figure imgf000050_0001
Ejemplo 5
Las proteínas ejemplares adicionales de la familia IL-1 quiméricas también incluyen las siguientes:
P08 a p v r s la f r iw d v n q k t f y lr n n q lv a g y lq g p n v n le e k f s m s f v q g e e s SEQ ID
NDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEI N0:32
n n k l e f e s a q f p n w f l c t a m e a d q p v s l tn m p d e g v m v t k f y m q fv s s
P09 a p v r s q a f r iw d v n q k t f y lr n n q lv a g y l q g p n v n le e k f s m s f v q g e e s SEQ ID
NDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEI N0:33
n n k l e f e s a q f p n w f l c t a m e a d q p v s l tn m p d e g v m v t k f y m q fv s s
P10 a p v r s la f r iw d v n q k t f y lr n n q lv a g y lq g p n v n le e k id v s f v q g e e s n SEQ ID
DKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN N0:34
n k l e f e s a q f p n w f l c t a m e a d q p v s l tn m p d e g v m v t k f y m q f v s s
P11 a p v r s ln c r iw d v n q k t f y lr n n q lv a g y lq g p n v n le e k id v s f v q g e e s n SEQ ID
DKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEIN N0:35
n k l e f e s a q f p n w f l c t a m e a d q p v s l tn m p d e g v m v t k f y m q f v s s
P12 a p v r s ln c r iw d v n q k t f y lr n n q lv a g y lq g p n v n le e k f s m s f v q g e e s SEQ ID NDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEI NO:36 n n k l e f e s a q f p n w f l c t a m e a d q p v s l tn m p d e g v m v t k f tm q f v s s
P13 a p v r s la f r iw d v n q k t f y lr n n q lv a g y lq g p n v n le e k f s m s f v q g e e s SEQ ID
n d k ip v a lg lk e k n l y ls c v lk d d k p t lq le s v d p k n y p k k k m e k r f v f n k ie i NO: 37 n n k l e f e s a q f p n w f l c t a m e a d q p v s l tn m p d e g v m v t k f y f q e d
P14 APVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEES SEQ ID
NDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEI NO:38
NNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYFQED
El polipéptido siguiente es un dominio quimérico que incluye al menos dos segmentos de IL-1 a y al menos dos segmentos de IL-1Ra.
SAPFSFLSNVKYNFMRIIKYEFRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEE SEQ ID KFDMGAYKSSKDDAKITVILRISKTQLYVTAQDEDQPVLLKEMPEIPKTITGSET NO: 39 NLLFFWETHGTKNYFTSVAHPNLFLCTAMEADQPVSLTNMPD EGVMVTKFYILENQA
Ejemplo 6
Se puede construir un dominio quimérico de IL-1 circularmente permutado mediante la unión del extremo amino terminal con el extremo carboxilo terminal de la molécula utilizando una secuencia conectora y seleccionando una nueva ubicación para cada uno de los extremos. Para las proteínas que tienen extremos derivados de IL-1 p, la longitud del conector puede ser de entre cinco a diez, por ejemplo, aproximadamente siete aminoácidos. Las ubicaciones preferidas para los nuevos extremos están en los bucles orientados en dirección opuesta a los receptores, tales como el bucle p6-p7 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 71-80 de SEQ ID NO: 1) o el bucle p7-p8 (por ejemplo, los aminoácidos correspondientes a 84-99 de SEQ ID NO: 1).
Los ejemplos de dichos dominios quiméricos de IL-1 circularmente permutados incluyen:
DKPTLQLESVDPKNYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFV SSGGSGGGSAPVRSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLY LSCVLKD (SEQ ID NO: 40)
y
NYPKKKMEKRFVFNKIEINNKLEFESAQFPNWFLCTAMEADQPVSLTNMPDEGVMVTKFYMQFVSSGGSGGGSAPV RSLNCRIWDVNQKTFYLRNNQLVAGYLQGPNVNLEEKFSMSFVQGEESNDKIPVALGLKEKNLYLSCVLKDDKPTLQ LESVDPK (SEQ ID NO: 41)
Ejemplo 7
Se prepararon las proteínas P03, P04, P05, mIL-1Ra (metionil IL-1Ra) e IL-1 p en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 a 0,5 mg/ml. Se combinaron las proteínas con colorante naranja SYPRO (Invitrogen, CA) a una dilución 1:500 de la concentración madre y se sometieron a fluorimetría de barrido diferencial. Véase, por ejemplo, He et al. (2010) J. Pharm. Sciences, 99 1707-1720. Se monitorizaron las mediciones de fluorescencia utilizando una máquina de QPCR Agilent Mx3005 a medida que se aumentó la temperatura de 25 °C a 95 °C a una tasa de 1 °C por minuto. Se derivaron los valores de la temperatura de fusión (Tm) a partir del valor del máximo de la primera derivada de la transición de fluorescencia. Se observó que las proteínas P03, P04 y P05 tenían un comienzo de despliegue de más de 50 °C y tan alto como 59 °C, y una Tm de más de 59, 60, 62 y 64 °C. Los resultados se muestran en la tabla 8 a continuación y en las Fig. 10A y 10B:
Tabla 8
Proteína Tm (°C) Comienzo de despliegue
____________________________________ (!C ___________________
mIL-1Ra 56 48
IL-1 p 56 41
P03 65 59
P04 60 51
P05 65 59
P04 tiene una Tm que es aproximadamente 4 grados superior a la de mIL-1Ra e IL-1 p, y presenta un comienzo de despliegue aproximadamente 3 grados superior al de mIL-1Ra y aproximadamente 10 grados superior al de IL-1 p. P03 y P05 tienen una Tm que es aproximadamente 9 grados superior a la de mIL-1Ra e IL-1 p, y presentan un comienzo de despliegue aproximadamente 11 grados superior al de mIL-1Ra y aproximadamente 18 grados superior al de IL-1 p.
Ejemplo 8
Se preparó P05 purificada (sin una etiqueta de hexahistidina) en 1,25x PBS y se evaluó en un modelo murino de enfermedad del ojo seco. En este modelo, se preseleccionaron ratones C57BL/6 hembra de 6 a 10 semanas de edad de Jackson Laboratories (aclimatados durante 1 a 2 semanas en una sala de alojamiento de animales con <30 % de humedad relativa, complemento alimenticio hidrogel y enriquecimiento ambiental Envirodry) para tinción con fluoresceína el día 0. Para la tinción con fluoresceína, se administró fluoresceína diluida en WF1H2O a 10 mg/mL recién preparada en una cantidad de 0,4 pL en cada ojo. Aproximadamente 8-13 minutos después de la administración, se puntuaron los ojos utilizando un microscopio de disección fluorescente Olympus. Se registró la tinción puntuada utilizando el sistema de calificación estandarizado del Instituto Nacional del Ojo (NEI) de 0-3 para cada una de las cinco áreas en las cuales se ha dividido la superficie de la córnea (intervalo de puntuación 0-15/ojo). Utilizando un puente de enseñanza, dos evaluadores enmascarados evaluaron a los ratones al mismo tiempo para dar una única puntuación colectiva para cada ojo.
Se colocaron los ratones con puntuaciones >7 para cada ojo (de una puntuación máxima de 15) en una cámara de ojo seco (20 % ± 2 % de humedad y flujo de aire constante ~21 L/min/jaula) el día 1 y se mantuvieron en esta cámara durante el transcurso del experimento (excepto para el examen). El día 3, se puntuaron nuevamente los ratones y se aleatorizaron en grupos de tratamiento con 8 a 10 ratones/grupo. Se aleatorizaron los ratones de modo que cada jaula de 4 a 5 ratones tuviera aproximadamente la misma puntuación de enfermedad promedio. A partir del día 3 y después de la aleatorización, se administró a los ratones por vía tópica P05 o vehículo (1,25X PBS) en una gota ocular de 3 pL/ojo con una frecuencia de dos veces al día. Los ratones fueron examinados y puntuados los días 7, 9 y 11 en cuanto a la tinción de la córnea con fluoresceína como se describió anteriormente. Los evaluadores se mantuvieron ciegos sobre los grupos de tratamiento durante el transcurso del experimento.
La Fig. 11A es un gráfico de barras de la puntuación media de tinción corneal ± SEM los días 0, 3, 7, 9 y 11 para los ratones de dos experimentos idénticos con los siguientes tratamientos dos veces al día: ningún tratamiento, vehículo (1,25X PBS) y P05 a 10 mg/ml (1 %). P05 a 10 mg/ml redujo significativamente la tinción corneal los días 7, 9 y 11 del experimento. La eficacia evaluada mediante una reducción en la tinción corneal también se observó con dosis tan bajas como P05 a 0,1 mg/ml. IL-1Ra recombinante producido en E. coli también redujo moderadamente la tinción corneal en el modelo animal.
Como se muestra en la Fig. 11B, el efecto de P05 a 10 mg/ml fue específico sobre la base de una comparación con albúmina sérica murina a 10 mg/ml en el mismo vehículo. No se observó ningún efecto con albúmina sérica murina (MSA) a 10 mg/ml con relación al vehículo, y el efecto de P05 a 10 mg/ml fue estadísticamente significativo con relación a la albúmina sérica murina a 10 mg/ml. Como se muestra en la Fig. 11C, P05 a 10 mg/ml también se comparó con ciclosporina al 0,05 % en una emulsión oftálmica (Restasis®). Mientras P05 redujo la tinción corneal, no se observó ningún efecto para la emulsión oftálmica de ciclosporina al 0,05 % después de ~1 semana de dosificación dos veces al día.
Ejemplo 9
Se desarrolló una etapa de captura para la purificación de P05 producida por fermentación en células de E. coli BLR(DE3). Se definieron las condiciones de elución a través de una estrategia estadística de diseño experimental (DOE) en una columna de 1 mL. Se realizaron las condiciones optimizadas en una escala intermedia (columna de 10 mL).
Se extrae el producto mediante microfluidización en un tampón de lisis que consiste en Tris 20 mM a pH 7,0 con adición de EDTA 10 mM. Se ajusta el lisado aclarado a un pH de 5,3 y a una conductividad de 3 mS/cm. Se carga el lisado acondicionado en un PorosXS (resina de intercambio catiónico fuerte) con un tiempo de residencia de 2 min para una capacidad de 25-30 mg de P05/mL de columna. Se lava la columna con tampón de equilibrado para extraer las especies no unidas. Se implementa un segundo lavado a pH 6,0 y 3 mS/cm para eliminar una población de impurezas. Se eluye el producto a pH 6,0 y 6,6 mS/cm. Se eluye una especie relacionada con el producto a pH 6,0 y 12,4 mS/cm. Se lava la columna con un tampón de alta salinidad y NaOH.
P05 es una proteína de 17 kDa con un pl de 6,58. El pl de la especie des-ALA es 6,8 y se resuelve fácilmente a través de cromatografía analítica de intercambio catiónico débil. Es probable que esta especie sea un producto de la actividad de la aminopeptidasa P que se encuentra en E. coli. Se puede identificar la especie a través de los métodos de espectroscopía de masas, mapeo peptídico y HPLC.
Materiales cromatográficos. PorosXS se basa en un lecho de poli(estireno-divinilbenceno) reticulado con un tamaño de partícula nominal de 50 pm. La matriz cromatográfica tiene una química superficial de sulfopropilo y fue diseñada para tolerar niveles elevados de sal durante la unión. Se obtuvo el material PorosXS (CN 4404339, Life Technologies) como una suspensión de sólidos a granel y se empaquetó en una columna Tricorn de 5*50 mm (CN 28-4064-09, GE Healthcare) con un volumen de columna final de 1 mL (altura del lecho de 5 cm) o en una columna de 10*150 mm Tricorn (CN 28-4064-16, GE Healthcare) empaquetada hasta un volumen final de 10,5 mL (altura del lecho de 13,4 cm).
Tampones. Se prepararon todos los tampones con agua MilliQ en forma volumétrica. Para alcanzar el pH deseado, se añadió HCl 10 N o NaOH 1 M (hecho a partir de una solución madre de NaOH 10 M) para titular el tampón. Después de la preparación, se filtraron todos los tampones a través de filtros de cuello de botella de PES de 0,2 pm. Se realizaron todas las mediciones de pH y de conductividad a temperatura ambiente (~ 20-25 °C).
Tampones PorosXS: tampón de equilibrado de CEX - ácido acético 10 mM (HoAC) con NaCl 21 mM preparado mediante la adición de 0,57 mL de ácido acético glacial y 2,44 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5,3 y la conductividad final era 3 mS/cm.
Tampón de lavado de CEX - MOPS 100 mM con NaCl 22 mM preparado mediante la adición de 19,5 g de ácido libre MOPS, 1,5 g de sal sódica MOPS y 1,28 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5,7-6,6 (según lo deseado) y la conductividad final era 3 mS/cm.
Tampón de elución de CEX - MOPS 100 mM con NaCl 118 mM preparado mediante la adición de 19,5 g de ácido libre MOPS, 1,5 g de sal sódica MOPS y 6,93 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5,7-6,6 (según lo deseado) y la conductividad final era 12,4 mS/cm.
Tampón de tiras de CEX - ácido acético 10 mM con NaCl 3 mM preparado mediante la adición de 0,57 mL de ácido acético glacial y 175 g de NaCl por L de tampón. El pH final era 5,3 y la conductividad final era 188 mS/cm.
Preparación del lisado. Se ajustó el pH del lisado utilizando ácido acético 200 mM a pH 4,5 preparado mezclando 11,5 mL de ácido acético glacial por L de tampón. Se tituló la solución para un pH final de 4,5 utilizando NaOH 1 M. Esta solución se utilizó para evitar la precipitación localizada debida al pH bajo de ácidos fuertes o concentrados.
El material cargado para estos experimentos fue un extracto de una operación de biorreactor discontinua de 2 L. La extracción del producto del sedimento celular se realizó utilizando Tris 20 mM a pH 7,0 con adición de EDTA 10 mM. El extracto fresco se diluyó hasta una conductividad de 3 mS/cm con agua MilliQ (típicamente dilución 1:1-1,5). Se congeló el extracto diluido en -20° C en alícuotas de 41 mL. Para preparar la carga, se descongeló una alícuota a temperatura ambiente y se tituló a pH 5,3 utilizando ácido acético 200 mM a pH 4,5. Se realizaron pequeños ajustes en la conductividad mediante la adición de agua MilliQ cuando fue necesario después de la titulación. Finalmente, se diluyó la carga 2,5* hasta una concentración de ~1,7 g/L utilizando tampón de equilibrado de CEX. La carga se filtró en condiciones estériles a través de un filtro de 0,8/0,2 pm. La carga acondicionada se utilizó el mismo día que se preparó.
Determinación de las proteínas de las células huésped. Los niveles de proteínas de las células huésped (HCP) se determinaron mediante un kit de ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) específico para un sistema de expresión de E. coli (CN F410, Cygnus Technologies). Se siguió exactamente el protocolo proporcionado con el kit. Las muestras que se iban a evaluar para conocer los niveles de HCP se diluyeron utilizando un diluyente de muestra (CN I028, Cygnus Technologies) con una dilución mínima de 10*. Las muestras se realizaron típicamente en dos diluciones y se colocaron en placas en duplicado para cada dilución. El nivel de HCP se representa en términos de partes por millón (ppm) o ng-HCP/mg-producto.
Análisis por SDS-PAGE. Para el análisis de pureza mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), se utilizan geles BisTris NuPAGE 4-12 % ya sea en 10 pocillos de 1 mm o en 15 pocillos de 1 mm (CN NP0322Box y NP0323Box, respectivamente, Invitrogen). El tampón de operación es 1* tampón de proceso MES de SDS preparado a partir de una concentración de 20* (CN NP0002, Invitrogen). Se utilizan estándares de proteínas preteñidos agudos Novex (CN 57318, Invitrogen) como indicadores del peso molecular. Se prepararon las muestras para el análisis mediante dilución con agua MilliQ hasta un volumen final de 30 pL y se añadieron 10 pL de 4* Dodecil sulfato de litio (LDS) (CN NP0008, Invitrogen) hasta una concentración final de 1*. Se mezclaron las muestras por vórtex durante 5 s. Sobre la base de la concentración de proteína calculada a partir de la medición de A280/A320, se cargó una diana de 3 pg por pocillo.
wCEX. Se evaluó P05 mediante cromatografía de intercambio catiónico débil (wCEX) utilizando una columna de 4x250 mm de Dionex ProPac® WCX-10 (Número de producto 054993), con una velocidad de flujo de 1,2 mL/min utilizando soluciones de fase móvil de acetato de sodio 10 mM pH 5,5 (tampón A) y acetato de sodio 10 mM pH 5,5, NaCl 250 mM (tampón B). Se realiza un gradiente de 10 %B a 25 %B durante 20 minutos. La P05 intacta eluye aproximadamente de 1,5 a 2,5 minutos antes que la especie con des-Ala en la parte posterior del gradiente.
Cromatografía de captura de intercambio catiónico. Se realizó la cromatografía en un sistema de cromatografía AKTA Explorer 100. Se empaquetó una columna de 10 mL PorosXS. Se cargó el material a 40 mg de P05/ml, o se puede cargar a 25-30 mg de P05/ml. En la tabla 9 se resume el método de la cromatografía. El tiempo de residencia se mantuvo constante durante las etapas de carga y elución en 2 min. Se prepararon combinaciones de elución simuladas y se evaluaron en cuanto a la recuperación del producto, el nivel de HCP y el % de proteína intacta. Se completaron un total de 2 operaciones en la columna de 10 mL con %B de 30 % y 35 % a pH 6,0.
Tabla 9
Figure imgf000054_0001
El lavado N.° 2 provoca un pico compuesto principalmente de impurezas. Las eluciones N.° 1 con el 30 % y el 35 % de B dan como resultado >95 % de producto puro mediante análisis de SDS-PAGE. La concentración de sal del lavado N.° 2 se puede aumentar en una pequeña cantidad para eliminar el hombro del pico de elución.
Ejemplo 10
Se purificó P04 y se crecieron los cristales de calidad de difracción en PEG1500 al 25 %, PCB 0,1 M (pH 4,0) a 20 °C. Se cristalizó la proteína en el grupo espacial P212121, con dimensiones de la celda unitaria típicas de a = 44,5, b = 46,4, c = 64,8. Los cristales difractaron a alta resolución y se recogió un conjunto de datos que se extiende a 1,47 Á en el Advanced Photon Source, línea de haz LS-CAT 21ID-F (Chicago IL, Ee . UU.). Se resolvió la estructura de rayos X de P04 por reemplazo molecular utilizando un modelo que incorporaba las partes relevantes de las estructuras conocidas de IL-1 p e IL-1Ra de las estructuras de PDB 1 It B y 1IRA (Vigers et al., (1997) Nature 386: 190-194 y Schreuder et al., (1997) Nature 386: 194-200). El modelo final se refinó a un Rtrabajo/Rlibre del 17,6 %/20,4 % y contiene una molécula de P04 (140 residuos) y 98 moléculas de agua (tabla 10). Los residuos de P041-2, 48-49 y 85-93 no fueron visibles en la densidad de los electrones y no están presentes en el modelo final.
Tabla 10
Recogida de datos cristalográficos y estadísticas de refinamiento Estadísticas de recogida de datos
Grupo espacial P212121
Dimensiones de celda
a, b, c (Á) 44,5, 46,4, 64,8
a, P, Y (°) 90, 90, 90
Longitud de onda (Á) 0,9787
Resolución (Á) 50,0 - 1,47 (1,52 - 1,47)
Rfusión 0,039 (0,56)
I/oI 37.7 (2,9)
Integridad (%) 99.8 (100)
Redundancia 6 (5,9)
Estadísticas de refinamiento
Resolución (Á) 28,64 - 1,47 (1,53 - 1,47)
N.° de reflexiones 22.926

Claims (30)

REIVINDICACIONES
1. Una proteína aislada que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia de la interleucina-1 (IL-1), en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90 % a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05);
y en la que la proteína aislada se une al receptor I de IL-1 (IL-1RI) y antagoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI.
2. La proteína aislada de la reivindicación 1, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 95 % a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05).
3. La proteína aislada de la reivindicación 2, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 17 (P01), SEQ ID NO: 18 (P02), SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05).
4. La proteína aislada de la reivindicación 1, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90 % o el 95 % a una secuencia seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05) y en la que el dominio de citocinas tiene mayor termoestabilidad que I L-1 p humana e IL-1Ra humano en un tampón fisiológico.
5. La proteína aislada de la reivindicación 4, en la que el dominio de citocinas comprende los siguientes pares de residuos:
(i) E39 y K64;
(ii) R9 y Q149; y
(iii) S152 y K40.
6. La proteína aislada de la reivindicación 5, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de una cualquiera de SEQ ID NO: 19 (P03), SEQ ID NO: 20 (P04) y SEQ ID NO: 21 (P05).
7. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en la que el dominio de citocinas tiene una Tm al menos 2 °C mayor que la Tm de I L-1 p humana e IL-1Ra humano en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
8. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en la que el dominio de citocinas tiene una Tm entre 5-12 °C mayor que la Tm de IL-1 p humana e IL-1Ra humano en una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml.
9. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 % o 100 % a la secuencia de SEQ ID NO: 21 (P05).
10. La proteína aislada de la reivindicación 9, en la que la proteína tiene la secuencia de SEQ ID NO: 21 (P05). 11. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que la proteína comprende menos de 15, 12,
11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones.
12. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que el dominio de citocinas se une al receptor I de IL-1 con una Kd de menos de 100 nM.
13. Una proteína aislada que comprende un dominio quimérico de citocinas de la familia de la interleucina-1 (IL-1), en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 90 % a la secuencia de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07) y en la que la proteína aislada se une al receptor I de IL-1 (IL-1RI) y agoniza la actividad de señalización del receptor IL-1RI.
14. La proteína aislada de la reivindicación 13, en la que el dominio de citocinas tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica en al menos el 95 % a la secuencia de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07).
15. La proteína aislada de la reivindicación 14, en la que el dominio de citocinas tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23 (P06) o SEQ ID NO: 24 (P07).
16. La proteína aislada de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en la que la proteína comprende menos de 15, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 o 2 sustituciones.
17. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
18. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, en la que la composición farmacéutica es una composición farmacéutica tópica.
19. La composición farmacéutica de la reivindicación 17, en la que la composición farmacéutica es una composición farmacéutica oftálmica.
20. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en la que la composición farmacéutica es acuosa y comprende la proteína en una concentración de entre el 0,001-5 %.
21. Una composición farmacéutica que comprende una proteína de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16.
22. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, en la que la composición farmacéutica es una composición farmacéutica tópica.
23. La composición farmacéutica de la reivindicación 21, en la que la composición farmacéutica es una composición farmacéutica oftálmica.
24. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 23, en la que la composición farmacéutica es acuosa y comprende la proteína en una concentración de entre el 0,001-5 %.
25. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 para uso como un medicamento.
26. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 para uso en el tratamiento de la enfermedad o trastorno del ojo seco, conjuntivitis alérgica o artritis reumatoide en un sujeto.
27. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
28. Un vector de ácido nucleico aislado que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 27, en el que la secuencia está unida operativamente a una secuencia de control de la transcripción.
29. Una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
30. La célula huésped recombinante de la reivindicación 29, en la que la célula huésped es una célula huésped de E. coli.
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