ES2703150T3 - Procedimiento de detección de por lo menos un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos por espectrometría de masas - Google Patents
Procedimiento de detección de por lo menos un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos por espectrometría de masas Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento de detección, para el menos un microorganismo comprendido en una muestra, de al menos un marcador de resistencia a un glicopéptido que es la vancomicina, que comprende la detección, porespectrometría de masas de tipo MRM, de al menos un péptido de dicho microorganismo, que son unos péptidos de tipo Van seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 5 a 16, 29 a 35, 59 a 71, 80 a 83, 85 a 91, 95 a 102, 104 a 120, 122 a 139 o 141 a 154.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de detección de por lo menos un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos por espectrometría de masas
La presente invención se refiere al campo de la microbiología. Más precisamente, la invención se refiere a la detección, por espectrometría de masas, de al menos un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos de al menos un microorganismo procedente de una muestra.
Desde el descubrimiento de los microbios por Pasteur, los microorganismos se estudian por microscopía y análisis bioquímico. Estos métodos tradicionales son con frecuencia largos y fastidiosos y se han buscado muy pronto alternativas analíticas. Es así que el análisis de bacterias por espectrometría de masas se inició a partir de 1975 por J. Anhalt y C. Fenselau [1].
Estos trabajos preliminares fueron seguidos por el estudio de cromatografía en fase gaseosa acoplada a la espectrometría de masas (GC-MS) de ácidos grasos de la pared de los microorganismos [2]. Este método se popularizó bajo la denominación anglosajona de FAME por “Fatty Acid Methyl Ester”. Constituye actualmente un método de referencia para los estudios taxonómicos. Su utilización sigue estando no obstante limitada a algunos laboratorios especializados que controlan el tratamiento de la muestra por saponificación, hidrólisis y derivación. En 1996, los trabajos de M. Claydon et al. [3] así como de T. Krishnamurthy y P. Ross [4] mostraron la posibilidad de identificar diferentes especies bacterianas con un espectrómetro de masas de tipo MALDI-TOF (acrónimo del inglés Matrix Assisted Laser Desorption lonization - Time Of Flight). El análisis asocia la adquisición de un espectro de masas y la interpretación de un programa experto. Es extremadamente simple y puede efectuarse en pocos minutos. Se difunde actualmente en los laboratorios de análisis médicos [5]. Su utilización clínica está limitada, no obstante, a la identificación de especies bacterianas y de levaduras. No se utiliza rutinariamente para la identificación de las resistencias a los antimicrobianos.
Ahora bien, la identificación de resistencias a los antimicrobianos tales como los antibióticos es un elemento esencial para asegurar un tratamiento óptimo de los pacientes.
Otros procedimientos de espectrometría de masas, en particular en tándem, se propusieron para responder a estas necesidades. A título de ejemplo, es posible citar los trabajos de C. Fenselau et al. para la identificación de p-Lactamasa con un cuadripolo-TOF (Q-TOF) [6].
Sin embargo, estos resultados de investigación no son aplicables a una utilización clínica de rutina. Se obtuvieron con unos instrumentos de investigación que necesitan un personal altamente cualificado. Los tiempos de análisis, frecuentemente superiores a una hora por muestra, son incompatibles con la carga de trabajo de un laboratorio de análisis microbiológico.
Más recientemente, S. Hofstadler et al. [7] han propuesto un procedimiento que asocia una amplificación del genoma microbiano por PCR a una detección de los productos de PCR por electrospray-TOF (ESI-TOF). Este procedimiento está ahora totalmente automatizado [8]. Sin embargo, necesita una amplificación por PCR con los defectos inherentes a la biología molecular, a saber el rendimiento de extracción, coste de las sondas, etc.
En este contexto, el objetivo de la presente invención es proponer un procedimiento de detección de mecanismos de resistencia a los glicopéptidos, que permite paliar los inconvenientes de los procedimientos de la técnica anterior, a saber proporcionar un procedimiento poco costoso, sin reactivo específico para cada especie, en particular con respecto a los procedimientos de biología molecular, dando un resultado en un tiempo corto, inferior a una hora, y utilizable en clínica de rutina, sin necesitar un personal altamente cualificado.
Para este propósito, la invención propone un nuevo procedimiento de detección para al menos un microorganismo comprendido en una muestra, de al menos un marcador de resistencia a un glicopéptido que es la vancomicina, que comprende la detección, por espectrometría de masas, de al menos un péptido de dicho microorganismo, que son unos péptidos de tipo Van seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEC ID n° 5 a 16, 29 a 35, 59 a 71,80 a 83, 85 a 91,95 a 102, 104 a 120, 122 a 139 o 141 a 154.
Ventajosamente, se pueden detectar simultáneamente marcadores de resistencia de varios antimicrobianos diferentes.
De manera sorprendente e inesperada, el procedimiento de la presente invención permite detectar la existencia de mecanismos de resistencia inducibles, en ausencia de inducción.
Como se indica en la solicitud WO201145544, se pueden detectar unos marcadores de tipificación y/o de virulencia de microorganismos, de la misma manera, por espectrometría de masas, preferible o simultáneamente a la detección de los marcadores de mecanismos de resistencia.
Por marcadores de la resistencia a al menos un antimicrobiano de la clase de los glicopéptidos, se entiende unas moléculas de origen proteico que son características de dichas propiedades de resistencia.
Los glicopéptidos son unos antibióticos tales como la vancomicina, la teicoplanina, la telavancina, la bleomicina, la ramoplanina, y la decaplanina. La vancomicina es un glicopéptido propiamente dicho, la tiecoplanina es un lipoglicopéptido. Estas 2 moléculas llegan a inhibir la síntesis de la pared bacteriana por inhibición de la síntesis del peptidoglicano. En efecto, su estructura tridimensional, en forma de bolsa, recubre el dipéptido D-Ala D-Ala precursor de la síntesis del peptidoglicano, impide la acción de las glicotransferasas y de las transpeptidasas y bloquea la elongación del peptidoglicano. La resistencia a los glicopéptidos se debe a la presencia de operones que codifican unas enzimas que catalizan la formación de precursores de baja afinidad y unas enzimas que eliminan los precursores de alta afinidad producidas por la bacteria hospedante. Se conocen diversos tipos de resistencia según las enzimas presentes en el operón. La clasificación de la resistencia a los glicopéptidos se basa en la secuencia primaria de los genes de estructura de las ligasas de resistencia más que sobre los niveles de resistencias a los glicopéptidos, en la medida en la que las concentraciones mínimas inhibidoras (CMI) de los diversos tipos se solapan. Se han individualizado nueve tipos de resistencia. Ocho resultan de una resistencia adquirida (VanA, B, D, E, G, L, M y N) y un (VanC) es una resistencia natural presente en E. gallinarum y E. casseliflavus. (para más información véase [9], Sujatha,S. & Praharaj,I. Glycopéptido Resistance in Gram-Positive Cocci: A Review. Interdiscip. Perspect. Infect. Dis 2012, 781679 (2012)).
El tipo de resistencia VanA se caracteriza por una resistencia inducible de alto nivel a la vancomicina y a la teicoplanina. Cabe señalar que se ha demostrado la transmisión del tipo VanA hacia S. aureus pero es, sin embargo, bastante rara.
El tipo de resistencia VanB se caracteriza por una resistencia inducible de nivel moderado a alto a la vancomicina y es sensible a la teicoplanina.
En general, los fenotipos VanA y VanB son los casos clínicos más importantes y se encuentran frecuentemente en E. faecalis y en E. faecium.
El tipo de resistencia VanD se caracteriza por una resistencia constitutiva de nivel moderado a la vancomicina y a la teicoplanina.
Los tipos de resistencia VanC, E, G, L y N se caracterizan por una resistencia de bajo nivel a la vancomicina y por una sensibilidad a la teicoplanina.
La resistencia puede expresarse en ausencia de antibiótico, se denomina entonces constitutiva. Puede también expresarse en presencia de una cierta concentración de antibiótico, se denomina entonces inducible. El cultivo del microorganismo en presencia de una cierta concentración de antibiótico se denomina entonces cultivo con inducción.
Por determinación de la resistencia a al menos un antimicrobiano, se entiende la imposibilidad de destruir las bacterias o inhibir su multiplicación a una concentración definida en función de los parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos propios de cada antibiótico.
Por determinación de un mecanismo de resistencia a al menos un antibiótico, se entiende la puesta en evidencia de al menos un compuesto sintetizado por la bacteria, que le permite escapar al menos parcialmente a la acción del antibiótico, lo más frecuentemente por modificación de la estructura del antibiótico o bien de su diana metabólica, o también por su disminución de penetración en la bacteria. Preferiblemente, dicho compuesto sintetizado por la bacteria es una proteína.
El procedimiento de la invención se puede utilizar para detectar unos mecanismos de resistencia a los glicopéptidos en bacterias. Así, por ejemplo, a título de bacterias en las que es posible investigar un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos según el procedimiento de la invención, se pueden citar, de manera no exhaustiva: Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarum, Enterococcus casseliflavus, Enterococcus durans, Enterococcus avium, Enterococcus raffinosus o Staphylococcus aureus. Los agentes, mayoritariamente responsables de infecciones son los enterócocos y más particularmente Enterococcus faecalis y Enterococcus faecium.
Así, el procedimiento según la invención permite también detectar un mecanismo de resistencia a dichos antibióticos.
Se entiende por muestra, una pequeña parte o una pequeña cantidad aislada de una entidad para el análisis. La muestra sobre la cual el procedimiento de la invención se puede realizar es cualquier muestra susceptible de contener un microorganismo diana. La muestra puede ser de origen biológico, bien animal, vegetal o humano. Puede entonces corresponder a una extracción de fluido biológico (sangre entera, suero, plasma, orina, líquido
cefalorraquídeo, secreción orgánica, por ejemplo), una extracción tisular o unas células aisladas. Esta extracción se puede utilizar tal cual, es decir que los marcadores de los mecanismos de resistencia de las bacterias a los glicopéptidos son potencialmente detectables directamente en la muestra ensayada, o bien puede sufrir previamente al análisis una preparación de tipo enriquecimiento, extracción, concentración, purificación, cultivo, según unos métodos conocidos por el experto en la materia.
La muestra puede ser de origen industrial o bien, según una lista no exhaustiva, una extracción de aire, una extracción de agua, una extracción efectuada sobre una superficie, una pieza o un producto manufacturado, un producto de origen alimentario. Entre las muestras de origen alimentario se pueden citar, de manera no exhaustiva, una muestra de producto lácteo (yogures, quesos), de carne, de pescado, de huevo, de fruta, de legumbre, de agua, de bebida (leche, zumos de frutas, sodas, etc.). Estas muestras de origen alimentario pueden también proceder de salsas o de platos elaborados. Una muestra alimentaria puede, finalmente, proceder de una alimentación destinada a los animales, tal como en particular harinas animales.
Aguas arriba de la detección por espectrometría de masas, la muestra a analizar preferiblemente se trata previamente para generar unos péptidos a partir del conjunto de las proteínas presentes en la muestra para fragmentar estas proteínas en péptidos, por ejemplo por digestión con una enzima proteolítica (proteasa) o por acción de un reactivo químico. En efecto, la escisión de las proteínas se puede realizar mediante un tratamiento fisicoquímico, mediante un tratamiento biológico o mediante una combinación de los dos tratamientos. Entre los tratamientos utilizables, se pueden citar el tratamiento por unos radicales hidroxilo, en particular con H2O2. El tratamiento por los radicales hidroxilo provoca un corte de los enlaces peptídicos que se realiza de manera aleatoria sobre cualquier enlace peptídico de la proteína. La concentración de radicales hidroxilo condiciona el número de escisiones realizadas y, por lo tanto, la longitud de los fragmentos peptídicos obtenidos. También se pueden utilizar otros tratamientos químicos como, por ejemplo, el tratamiento con bromuro de cianógeno (CNBr) que escinde específicamente los enlaces peptídicos a nivel del grupo carboxílico de los restos metionilo. Es también posible realizar una escisión ácida parcial a nivel de los restos aspartilo por calentamiento a 1000°C de una solución de proteínas en ácido trifluoroacético.
Se prefiere, no obstante, el tratamiento de las proteínas por digestión enzimática con respecto al tratamiento fisicoquímico ya que preserva más la estructura de las proteínas y es más fácil de controlar. Por “digestión enzimática” se entiende la acción simple o combinada de una o varias enzimas en condiciones de reacción apropiadas. Las enzimas que efectúan la proteólisis, denominadas proteasas, cortan las proteínas en sitios específicos. Cada proteasa reconoce generalmente una secuencia de aminoácidos dentro de la cual se efectúa siempre el mismo corte. Algunas proteasas reconocen un único aminoácido o una secuencia de dos aminoácidos entre los cuales realizan una escisión, otras proteasas reconocen sólo unas secuencias más largas. Estas proteasas pueden ser unas endoproteasas o unas exoproteasas. Entre las proteasas conocidas, se pueden citar, como se describe en el documento WO2005/098017:
- las enzimas específicas, como la tripsina, que escinde la unión peptídica a nivel del grupo carboxílico de los restos Arg y Lys, la endolisina que escinde el enlace peptídico del grupo -CO de las lisinas, la quimotripsina que hidroliza la unión peptídica a nivel del grupo carboxílico de los restos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), la pepsina que corta a nivel del grupo NH2 de los restos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), la proteasa V8 de la cepa V8 de Staphylococcus aureus que escinde el enlace peptídico a nivel del grupo carboxílico del resto Glu;
- las enzimas no específicas, como la termolisina, que proviene de la bacteria Bacillus tjermoproteolyticus que hidroliza el enlace peptídico del grupo NH2 de los aminoácidos hidrófobos (Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe), la subtilisina y la pronasa, que son unas proteasas bacterianas que hidrolizan prácticamente todos los enlaces y pueden transformar las proteínas en oligopéptidos en condiciones de reacción controladas (concentración en enzima y duración de reacción).
Se pueden utilizar varias proteasas de manera simultánea, si sus modos de acción son compatibles, o pueden utilizarse de manera sucesiva. En el ámbito de la invención, la digestión de la muestra se realiza, preferentemente, por acción de una enzima proteasa, por ejemplo la tripsina.
La generación de péptidos con la ayuda de un reactivo químico o de una proteasa, se puede obtener mediante simple reacción en solución. Puede también llevarse a cabo con un horno microondas [10], o bajo presión [11], o también con un dispositivo de ultrasonidos [12]. En estos tres últimos casos, el protocolo será mucho más rápido. Entre los péptidos así obtenidos, los péptidos específicos de la proteína, se denominan péptidos proteotípicos. Son los que se evaluarán por espectrometría de masas.
Según la invención, los marcadores de los mecanismos de resistencia de las bacterias a los glicopéptidos son unas proteínas de la bacteria en las que se investigan los mecanismos de resistencia a los glicopéptidos. En particular, dichas proteínas se digieren en péptidos, preferentemente por una enzima, más preferentemente por la tripsina. Asimismo, la muestra que contiene unos marcadores proteicos de caracterización de los mecanismos de resistencia
de las bacterias a los glicopéptios puede también tratarse previamente con fines de purificación. Este tratamiento previo de purificación se puede llevar a cabo antes o después de la etapa de generación de péptidos tales como se han descrito anteriormente.
El tratamiento previo de purificación de la muestra es ampliamente conocido por el experto en la materia y podrá utilizar en particular unas técnicas de centrifugación, de filtración, de electroforesis o de cromatografía. Estas técnicas separativas pueden utilizarse solas o combinadas entre sí para obtener una separación multidimensional. Por ejemplo, una cromatografía multridimensional puede utilizarse asociando una separación por cromatografía de intercambio de iones a una cromatografía en fase inversa, como se describe por T. Fortin et al. [13], o H. Keshishian et al. [14]. En estas publicaciones, el medio cromatográfico puede estar en columna o en cartucho (extracción en fase sólida).
La fracción electroforética o cromatográfica (o el tiempo de retención en cromatografía mono o multidimensional) de los péptidos proteotípicos es característica de cada péptido y la utilización de estas técnicas permite, por lo tanto, seleccionar el o los péptidos proteotípicos a determinar. Tal fraccionamiento de los péptidos generados permite incrementar la especificidad de la determinación posterior por espectrometría de masas.
Una alternativa a las técnicas de electroforesis o de cromatografía, para el fraccionamiento de los péptidos, consiste en purificar específicamente los N-glicopéptidos ([15] y solicitud de patente WO 2008/066629). Sin embargo, tal purificación permite solamente la cuantificación de los péptidos que han sufrido una modificación post-traduccional de tipo N-glicosilación. Ahora bien, todas las proteínas no están glicosiladas, lo que limita por lo tanto su utilización. La espectrometría de masas a utilizar en el procedimiento de la invención es ampliamente conocida por el experto en la materia como una herramienta potente para el análisis y la detección de diferentes tipos de moléculas. De manera general, cualquier tipo de molécula que puede ionizarse, se puede detectar en función de su masa molecular con la ayuda de un espectrómetro de masas. Según la naturaleza de la molécula a detectar, de origen proteico o metabólico, algunas tecnologías de espectrometría de masas pueden ser más adecuadas. No obstante, sea cual sea el método de espectrometría de masas utilizado para la detección, esta última comprende una etapa de ionización de la molécula diana en iones denominados moleculares, en el presente caso una etapa de ionización de los marcadores de caracterización, y una etapa de separación de los iones moleculares obtenidos en función de su masa.
Todos los espectrómetros de masas comprenden:
- una fuente de ionización destinada a ionizar los marcadores presentes en la muestra a analizar, es decir a conferir una carga positiva o negativa a estos marcadores;
- un analizador de masas destinado a separar los marcadores ionizados, o iones moleculares, en función de su relación masa sobre carga (m/z);
- un detector destinado a medir la señal producida, o bien directamente por los iones moleculares, o bien por unos iones producidos a partir de iones moleculares, como se detalla a continuación.
La etapa de ionización necesaria para la realización de una espectrometría de masas se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia. La fuente de ionización permite llevar las moléculas a determinar bajo un estado gaseoso e ionizado. Se puede utilizar una fuente de ionización, o bien en modo positivo para estudiar los iones positivos, o bien en modo negativo, para estudiar los iones negativos. Existen varios tipos de fuentes y se utilizarán en función del resultado buscado y de las moléculas analizadas. Se puede citar, en particular:
- la ionización electrónica (EI), la ionización química (CI) y la desorción-ionización química (DCI)
- el bombardeo por átomos rápidos (FAB), átomos metaestables (MAB) o iones (SIMS, LSIMS)
- el plasma de acoplamiento inductivo (ICP)
- la ionización química a presión atmosférica (APCI) y la fotoionización a presión atmosférica (APPI)
- la electronebulización o electrospray (ESI)
- la desorción-ionización láser asistida por matriz (MALDI), activada por una superficie (SELDI) o sobre silicio (DIOS) - la ionización-desorción por interacción con especies metaestables (DART)
En particular, la ionización puede llevarse a cabo de la siguiente manera: la muestra que contiene las moléculas diana se introduce en una fuente de ionización, en la que las moléculas se ionizan en estado gaseoso y se
transforman así en iones moleculares que corresponden a las moléculas iniciales. Una fuente de ionización de tipo electrospray (ESI por ElectroSpray Ionisation) permite ionizar una molécula dejándola pasar al mismo tiempo de un estado líquido a un estado gaseoso. Los iones moleculares obtenidos corresponden entonces a las moléculas presentes en estado líquido con, en modo positivo, uno, dos, incluso tres protones suplementarios o más y son por lo tanto portadores de una, dos, incluso tres cargas o más. Por ejemplo, cuando la molécula diana es una proteína, una ionización de los péptidos proteotípicos obtenidos después del fraccionamiento de la proteína diana, gracias a una fuente de tipo electrospray que funciona en modo positivo, conduce a iones polipeptídicos en estado gaseoso, con uno, dos, incluso tres protones suplementarios o más y que son por lo tanto portadores de una, dos, incluso tres cargas o más, y permite un paso de un estado líquido a un estado gaseoso [16]. Este tipo de fuente es particularmente muy adecuado cuando las moléculas dianas o péptidos proteotípicos obtenidos se separan previamente por cromatografía líquida en fase inversa. Sin embargo, el rendimiento de ionización de las moléculas presentes en la muestra puede variar en función de la concentración y de la naturaleza de las diferentes especies presentes. Este fenómeno se traduce por un efecto matriz bien conocido por el experto en la técnica.
Una fuente de ionización MALDI permitirá ionizar unas moléculas, a partir de una muestra en estado sólido.
El analizador de masas, en el que se realiza la etapa de separación de los marcadores ionizados en función de su relación masa/carga (m/z) es cualquier analizador de masas conocido por el experto en la materia. Se pueden citar los analizadores de baja resolución, de tipo cuadripolo o cuadrupolo (Q), trampa de iones 3D (IT) o lineal (LIT), también denominados trampas iónicas, y los analizadores de alta resolución, que permiten medir la masa exacta de los analitos y que utilizan en particular el sector magnético acoplado con un sector eléctrico, el tiempo de vuelo (TOF), la resonancia ciclotrónica iónica de transformada de Fourier (FT-ICR), el orbitrap.
La separación de los iones moleculares en función de su relación m/z puede realizarse una sola vez (espectrometría de masas simple o MS), o bien se pueden llevar a cabo varias separaciones MS. Cuando se realizan dos separaciones Ms sucesivas, el análisis se denomina MS/MS o MS2. Cuando se realizan tres separaciones MS sucesivas, el análisis se denomina MS/MS/MS o MS3 y más generalmente, cuando se realizan n separaciones MS sucesivas, el análisis se denomina MSn.
Entre las técnicas que utilizan varias separaciones sucesivas, los modos SRM (Selected Reaction Monitoring) en caso de detección o análisis de una sola molécula diana, o bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en caso de detección o análisis de varias moléculas dianas, son utilizaciones particulares de separación MS2. Asimismo, el modo MRM3 es una utilización particular de separación en MS/MS/MS. Se habla entonces de espectrometría de masas diana.
En el caso de una detección en modo MS simple, es la relación masa/carga de los iones moleculares obtenidos la que está correlacionada con la molécula diana a detectar.
En el caso de una detección en modo MS/MS, se añaden esencialmente dos etapas, con respecto a una determinación MS, que son:
- una fragmentación de los iones moleculares, entonces denominados iones precursores, para dar unos iones denominados iones fragmentos de 1a generación, y
- una separación de los iones denominados iones fragmentos de 1a generación en función de su masa (m/z)2, correspondiendo la relación (m/z)1 a la relación (m/z) de los iones precursores.
Es entonces la relación masa/carga de los iones fragmentos de 1a generación así obtenidos la que se correlaciona con la molécula diana a detectar. Por ion fragmento de primera generación, se entiende un ion procedente del ion precursor, tras una etapa de fragmentación y por lo tanto la relación masa sobre carga m/z es diferente del ion precursor.
Las parejas (m/z)1 y (m/z)2 se bautizan transiciones y son representativas de los iones característicos a detectar. La elección de los iones característicos que se detectan para corrrelacionarse a la molécula diana se efectúa por el experto en la materia según los métodos estándar. Su selección conducirá ventajosamente a análisis más sensibles, más específicos y más sólidos posibles, en términos de reproducibilidad y de fiabilidad. En los métodos desarrollados para la selección de péptidos proteotípicos (m/z)1, y de fragmento de primera generación (m/z)2, la elección se basa esencialmente en la intensidad de la respuesta. Para más detalles, se podrá referir a V. Fusaro et al. [17]. Se podrán utilizar por el experto en la materia programas comerciales, tales como los programas MIDAS y MRM Pilote de Applied Biosytems o también MRMaid [18] para permitirle predecir todas las parejas de transiciones posibles. Podrá también utilizar una base de datos denominada PéptidoAtlas, construida por F. Desiere et al. [19] para compilar el conjunto de las transiciones MRM de péptidos descritos por la comunidad científica. Esta base PeptideAtlas está disponible en acceso libre en internet. Para moléculas no proteicas, es también posible utilizar unas bases de datos, tales como, por ejemplo, la accesible a través del programa Cliquid de la compañía Applied Biosytems (Estados Unidos de América).
Un enfoque alternativo para seleccionar los péptidos proteotípicos (m/z)i y (m/z)2, consiste en utilizar los espectros de fragmentación MS/MS obtenidos de otros trabajos. Estos trabajos pueden ser, por ejemplo, las fases de descubrimiento y de identificación de los biomarcadores por análisis proteómico. Este enfoque se ha propuesto por Thermo Scientific durante reuniones de usuarios [18]. Permite generar una lista de transiciones candidatas a partir de los péptidos identificados experimentales por el programa SIEVE (Thermo Scientific). Algunos criterios se detallaron por J. Mead etal. [18] para la elección de los iones (m/z)1 y (m/z)2 y se detallan a continuación:
- los péptidos con unos sitios de escisión interna, es decir con lisina o arginina interna, deben evitarse, salvo si la lisina o la arginina van seguidas de prolina,
- los péptidos con asparagina o glutamina deben evitarse, ya que pueden desaminarse,
- los péptidos con glutamina o ácido glutámico en N-terminal deben ser evitarse ya que pueden ciclarse espontáneamente,
- los péptidos con metionina deben evitarse ya que pueden oxidarse,
- los péptidos con cisteína deben evitarse ya que pueden modificarse de manera no reproducible durante una eventual etapa de desnaturalización, reducción y bloqueo de las funciones tioles,
- los péptidos con prolina pueden considerarse como favorables ya que producen generalmente unos fragmentos intensos en MS/MS con un único pico muy predominante. Sin embargo, un único fragmento muy predominante no permite validar la identidad de la transición en una mezcla compleja. En efecto, sólo la presencia simultánea de varios fragmentos característicos permite verificar que el ion precursor buscado se ha detectado bien.
- los péptidos que tienen una prolina adyacente a C-terminal (posición n-1) o en la segunda posición con respecto a C-terminal (posición n-2) deben evitarse ya que, en este caso, el tamaño del péptido fragmento de primera generación se considera generalmente como demasiado pequeño para ser suficientemente específico,
- debe preferirse la selección de fragmentos que tienen una masa superior al precursor para favorecer la especificidad. Para eso, se necesita seleccionar un ion precursor bicargado y seleccionar el ion fragmento de primera generación más intenso que tenga una masa superior al precursor, es decir un ion fragmento de primera generación monocargado.
La fragmentación de los iones precursores seleccionados se realiza en una célula de fragmentación tal como los modelos de tipo triple cuadripolo [20], o de tipo trampa iónica [21], o también de tipo tiempo de vuelo (TOF) [22], los cuales permiten la separación de los iones. La o las fragmentaciones se realizarán clásicamente por colisión con un gas inerte tal como el argón o el nitrógeno, dentro de un campo eléctrico, por foto-excitación o fotodisociación con la ayuda de una fuente luminosa intensa, colisión con unos electrones o especies radicalarias, por aplicación de una diferencia de potencial, por ejemplo en un tubo de tiempo de vuelo, o mediante cualquier otro modo de activación. Las características del campo eléctrico condicionan la intensidad y la naturaleza de la fragmentación. Así, el campo eléctrico aplicado en presencia de un gas inerte, por ejemplo en un cuadripolo, condiciona la energía de colisión aportada a los iones. Esta energía de colisión será optimizada por el experto en la materia para incrementar la sensibilidad de la transición a analizar. A título de ejemplo, es posible hacer variar la energía de colisión entre 5 y 180 e-V en q2 en un espectrómetro de masas AB SCIEX QTRAP® 5500 de la compañía Applied Biosystems (Foster City, Estados unidos de América). Asimismo, la duración de la etapa de colisión y la energía de excitación dentro, por ejemplo, de una trampa iónica se optimizarán, por el experto en la materia, para conducir al análisis más sensible. A título de ejemplo, es posible hacer variar esta duración, bautizada tiempo de excitación, entre 0,010 y 50 ms y la energía de excitación entre 0 y 1 (unidad arbitraria) en Q3 en un espectrómetro de masas AB SCIEX QTRAP® 5500 de la compañía Applied Biosystems.
Finalmente, la detección de los iones característicos seleccionados se realiza de manera clásica, en particular gracias a un detector y a un sistema de tratamiento. El detector recoge los iones y produce una señal eléctrica cuya intensidad depende de la cantidad de iones recogidos. La señal obtenida se amplifica después para que pueda tratarse informáticamente. Un conjunto informático de tratamiento de datos permite transformar las informaciones recibidas por el detector en espectro de masas.
El principio del modo SRM, o también del modo MRM, es seleccionar específicamente un ion precursor, fragmentarlo, y después seleccionar específicamente uno de sus iones fragmentos. Para tales aplicaciones, se utilizan generalmente unos dispositivos de tipo triple cuadripolo o unos híbridos triple cuadripolo de trampa iónica. En el caso de un dispositivo triple cuadripolo (Q1q2Q3) utilizado en modo MS2, para la determinación o a la detección de una proteína diana, el primer cuadripolo (Q1) permite filtrar los iones moleculares, que corresponden a los péptidos proteotípicos característicos de la proteína a analizar y obtenidos durante una etapa anterior de digestión, en función de su relación masa sobre carga (m/z). Sólo los péptidos que tienen la relación masa/carga del
péptido proteotípico buscado, relación denominada (m/z)i, se transmiten en el segundo cuadripolo (q2) y tienen la función de iones precursores para la fragmentación ulterior. El analizador q2 permite fragmentar los péptidos de relación masa/carga (m/z)1 en iones fragmentos de primera generación. La fragmentación se obtiene generalmente por colisión de los péptidos precursores con un gas inerte, como el nitrógeno o argón en q2. Los iones fragmentos de primera generación se transmiten en un tercer cuadripolo (Q3) que filtra los iones fragmentos de primera generación en función de una relación masa sobre carga específica, relación denominada (m/z)2. Sólo los iones fragmentos de primera generación que tienen la relación masa/carga de un fragmento característico del péptido proteotípico buscado (m/z)2 se transmiten en el detector para detectarse, incluso cuantificarse.
Este modo de funcionamiento presenta una doble selectividad, en relación con la selección del ion precursor, por un lado, y de la selección del ion fragmento de primera generación, por otro lado. La espectrometría de masas en modo SRM o MRM es por lo tanto ventajosa para la cuantificación.
Cuando la espectrometría de masas utilizada en el procedimiento de la invención es una espectrometría de masas en tándem (MS2, MS3, MS4 o MS5), se pueden acoplar entre sí varios analizadores de masas. Por ejemplo, un primer analizador separa los iones, una célula de colisión permite fragmentar los iones, y un segundo analizador separa los iones fragmentos. Algunos analizadores, como las trampas de iones o FT-ICR, constituyen varios analizadores en uno y permiten fragmentar los iones y analizar los fragmentos directamente.
Según unos modos de realización preferidos de la invención, el procedimiento de la invención comprende una o varias de las características siguientes:
- la espectrometría de masas, utilizada para las propiedades de resistencia potencial a al menos un antimicrobiano, es una espectrometría de tipo MS/MS, lo que tiene la ventaja de generar un fragmento específico de la molécula a detectar o a cuantificar, y así aportar una gran especificidad al método de análisis;
- la espectrometría MS/MS es una MRM, lo que tiene la ventaja de utilizar un tiempo de ciclo de análisis en el espectrómetro de masas de algunas decenas de milisegundos, lo que permite detectar o cuantificar con una gran sensibilidad, y de manera multiplexada, un gran número de moléculas diferentes;
- llegado el caso, la determinación de las propiedades de tipificación, y del factor de virulencia se realiza en el mismo aparato de espectrometría de masas que la determinación de los marcadores de resistencia a al menos un antimicrobiano, preferentemente de manera simultánea, lo que tiene la ventaja de reducir el tiempo de análisis y el coste del instrumento, esto facilita también el tratamiento y los resultados.
Además de la determinación de la resistencia a un antibiótico, conviene identificar el o los microorganismos presentes en la muestra a ensayar.
Los procedimientos de identificación de microorganismos son ampliamente conocidos por el experto en la materia, como se describe por ejemplo por Murray P. R. el al. en Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9a edición, y en particular en el Vol. I, Sección III, capítulos 15 y 16 para las bacterias y levaduras, Vol. II, Sección VI, capítulo 82 para los virus, y Vol. II, Sección X, capítulo 135 para los protozoos. A título de ejemplo de procedimientos clásicos de identificación, se puede citar la determinación del perfil biológico, utilizando por ejemplo las tarjetas de identificación de Vitek 2 (bioMérieux™) o también utilizando unas técnicas de biología molecular con unos criterios de identificación basados en el estudio de la presencia de algunos genes, sobre el estudio de su secuencia.
La identificación se puede realizar directamente a partir de la muestra en la que se efectúa la identificación, o bien los microorganismos contenidos en la muestra pueden cultivarse mediante métodos bien conocidos por el experto en la materia, con medios de cultivo y condiciones de cultivo óptimos adaptados en función de las especies de microorganismos a investigar, como se describe por Murray P. R. el al. en Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9a edición, Vol. I, Sección III, capítulo 14, y en particular en el Vol. I, sección IV, capítulo 21 para las bacterias, Vol. II, sección VI, capítulo 81 para los virus, Vol. II, Sección VIII, capítulo 117 para las levaduras, y Vol. II, Sección X, capítulo 134 para los protozoos.
Así, de manera general, en el caso de una identificación por un método bioquímico de una bacteria en una extracción, se necesita en primer lugar obtenerla en cultivo puro, por ejemplo después de una siembra sobre gelosa. La biología molecular (PCR) puede, en algunos casos, aplicarse directamente a la muestra a analizar.
En lugar de cultivar los microorganismos, estos últimos pueden concentrarse por captura directamente en la muestra mediante superficies activas. Tal procedimiento se ha descrito por W.-J. Chen et al. [10] que han capturado diferentes especies bacterianas con la ayuda de bolas magnéticas con una superficie activada con Fe3O4/TiO2. Una captura mediante otros medios es también posible, tal como una captura por lectinas [23] o por unos anticuerpos [24], o también por vancomicina [25]. La captura permite concentrar los microorganismos y así reducir o incluso suprimir la etapa de cultivo. Dando como resultado un ahorro de tiempo considerable.
La identificación se puede realizar por espectrometría de masas, según las técnicas descritas anteriormente,
preferentemente por MS, por MS/MS, o bien por MS seguida de una espectrometría de tipo MS/MS, lo que constituye un modo de realización de la invención. En este caso también, la muestra puede someterse previamente a una etapa de cultivo tal como una siembra sobre gelosa.
La utilización de un procedimiento de identificación por MS es ventajosa por que se puede realizar en algunos minutos y por que necesita un espectrómetro de masas con un analizador, es decir un instrumento menos complejo que un espectrómetro de masas en tándem utilizado en MS/MS.
La utilización de un procedimiento de identificación por MS seguido de una espectrometría de tipo MS/MS es también ventajosa. Permite asegurarse de la identidad de los iones observados en MS, lo que aumenta la especificidad del análisis.
La utilización de un procedimiento de identificación por MS/MS de tipo MRM presenta la ventaja de ser más sensible y más simple que los enfoques MS después de MS/MS tradicional. Este procedimiento no necesita ni programa eficaz, necesario para tratar la información entre la adquisición del espectro MS y del espectro MS/MS, ni cambio de ajuste de los parámetros de las máquinas, necesarios para encadenar unos espectros MS después de MS/MS.
El procedimiento de identificación por MS se puede realizar con una fuente electrospray sobre muestra bruta, como se describe por S. Vaidyanathan et al. [26] o también por R. Everley et al. [27], después de la separación cromatográfica. Diferentes gamas de m/z permiten identificar los microorganismos. S. Vaidyanathan et al. han utilizado una ventana de entre 200 y 2000 Th, y R. Everley et al. una ventana de entre 620 y 2450 Th. Los espectros de masas pueden también deconvolucionarse para acceder a la masa de las proteínas independientemente de su estado de carga. R. Everley et al. explotaron así las masas entre aproximadamente 5000 y 50000 Da. De manera alternativa, el procedimiento de identificación por MS puede también realizarse con la ayuda de un MALDI-TOF, como se describe por Claydon et al. [3] y T. Krishnamurthy y P. Ross [4]. El análisis asocia la adquisición de un espectro de masas y la interpretación de un programa experto. Es extremadamente simple y puede efectuarse en algunos minutos. Este procedimiento de identificación se extiende actualmente en los laboratorios de análisis médico [5].
La identificación de bacterias por MS y después MS/MS a través de sus proteínas presentes en la muestra se ha aplicado ampliamente por numerosos equipos. A título de ejemplo, es posible citar los trabajos recientes de Manes N. et al. [28] que han estudiado el peptidoma de Salmonella enterica, o los trabajos de R. Nandakumar et al. [29] o de L. Hernychova et al. [30] que han estudiado el proteoma de bacterias después de la digestión con tripsina. El enfoque clásico consiste en i) adquirir un espectro MS, ii) seleccionar sucesivamente cada ion precursor observado sobre el espectro MS con una señal intensa, iii) fragmentar sucesivamente cada ion precursor y adquirir su espectro MS/MS, iv) interrogar bases de datos proteicos tales como SWISS-PROT o NCBI, mediante programas tales como Mascot (Matrix Science, Londres, Reinos unidos) o SEQUEST (Thermo Scientific, Waltham, Estado Unidos de América), para identificar el péptido que tiene una fuerte probabilidad de corresponder con el espectro MS/MS observado. Este método puede conducir a la identificación de un microorganismo si se identifica una proteína o un péptido característico de la especie.
Una de las ventajas de la utilización de la espectrometría de masas se basa en que es particularmente útil para cuantificar unas moléculas, en el presente caso los marcadores de los mecanismos de resistencia de las bacterias a los glicopéptidos. Para ello, se utiliza la intensidad de la corriente detectada, la cual es proporcional a la cantidad de molécula diana. La intensidad de corriente así medida podrá servir de medición cuantitativa que permite determinar la cantidad de molécula diana presente, la cual se caracteriza por su expresión en unidades del sistema internacional (SI) de tipo mol/m3 o kg/m3, o por los múltiplos o sub-múltiplos de estas unidades, o por los derivados habituales de las unidades SI, incluyendo sus múltiplos o sub-múltiplos. A título de ejemplo no limitativo, las unidades tales como ng/ml o fmol/l son unas unidades que caracterizan una medición cuantitativa.
No obstante, es necesaria una calibración para poder correlacionar el área del pico medido, que corresponde a la intensidad de corriente inducida por los iones detectados, a la cantidad de molécula diana a analizar. Para ello, en el ámbito de la invención, se podrán utilizar las calibraciones clásicamente utilizadas en espectrometría de masas. Los análisis de MRM se calibran clásicamente con la ayuda de estándares externos o preferentemente con la ayuda de estándares internos tales como el descrito por Fortin et al. [13]. En el caso en el que la molécula diana es un péptido proteotípico, que permite analizar una proteína de interés, la correlación entre la medición cuantitativa y la cantidad de péptido proteotípico diana, y después de proteína de interés, se obtiene calibrando la señal medida con respecto a una señal estándar para la cual se conoce la cantidad a analizar. El calibrado se puede realizar mediante una curva de calibrado, por ejemplo obtenida por inyecciones sucesivas de péptido proteotípico estándar a diferentes concentraciones (escalonado externo), o de manera preferida, por calibrado interno, utilizando un péptido pesado, como estándar interno, por ejemplo conforme a los métodos AQUA, QconCAT o PSAQ detallados a continuación. Por “péptido pesado” se entiende un péptido que corresponde al péptido proteotípico, pero en el que uno o varios átomos de carbono 12 (12C) están sustituidos por carbono 13 (13C) y/o uno o varios átomos de nitrógeno 14 (14N) están sustituidos por nitrógeno 15 (15N).
La utilización de péptidos pesados, como estándares internos (AQUA), se ha propuesto también en la solicitud de
patente US 2004/0229283. El principio es sintetizar artificialmente unos péptidos proteotípicos con unos aminoácidos que comprenden unos isótopos más pesados que los isótopos naturales habituales. Tales aminoácidos se obtienen, por ejemplo, sustituyendo algunos átomos de carbono 12 (12C) por carbono 13 (13C) o sustituyendo algunos átomos de nitrógeno 14 (14N) por nitrógeno 15 (15N). El péptido artificial (AQUA) así sintetizado tiene rigurosamente las mismas propiedades fisicoquímicas que el péptido natural (con la excepción de una masa más elevada). Se añade generalmente, a una concentración dada, a la muestra, aguas arriba del análisis por espectroscopía de masas, por ejemplo entre el tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas de la muestra de interés y el fraccionamiento de los péptidos obtenidos después de la etapa de tratamiento. Así, el péptido AQUA se co-purifica con el péptido natural a ensayar, durante el fraccionamiento de los péptidos. Los dos péptidos se inyectan, por lo tanto, simultáneamente en el espectrómetro de masas, para el análisis. Sufren entonces los mismos rendimientos de ionización en la fuente. La comparación de las áreas de pico de los péptidos naturales y AQUA, cuya concentración se conoce, permite calcular la concentración del péptido natural y subir así a la concentración de la proteína a ensayar. Se ha propuesto una variante de la técnica AQUA por J.-M. Pratt et al. [31] bajo el nombre de QconCat. Esta variante se describe también en la solicitud de patente WO 2006/128492. Consiste en concatenar diferentes péptidos AQUA y producir el polipéptido artificial en forma de proteína recombinante pesada. La proteína recombinante se sintetiza con unos aminoácidos que comprenden unos isótopos pesados. De esta manera, es posible obtener un estándar para calibrar el análisis simultáneo de varias proteínas a menor coste. El estándar QconCAT se añade a partir del inicio, aguas arriba del tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas y antes de las etapas de fraccionamiento de las proteínas, de desnaturalización, de reducción y después de bloqueo de las funciones tioles de las proteínas, si estas están presentes. El estándar QconCAT sufre por lo tanto el mismo ciclo de tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas que la proteína natural, lo que permite tener en cuenta el rendimiento de la etapa de tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas. En efecto, el tratamiento, en particular por digestión, de la proteína natural puede no estar completo. En este caso, la utilización de un estándar AQUA llevaría a subestimar la cantidad de proteína natural. Para un análisis absoluto, puede ser por lo tanto importante tener en cuenta unos rendimientos de tratamiento que conllevan la escisión de las proteínas. Sin embargo, V. Brun et al. [33] han mostrado que, a veces, los estándares QconCAT no reproducían exactamente el rendimiento de tratamiento, en particular por digestión de la proteína natural, quizás debido a una conformación tridimensional diferente de la proteína QconCAT.
V. Brun et al. [32] han propuesto entonces la utilización de un método bautizado PSAQ y descrito en la solicitud de patente WO 2008/145763. En este caso, el estándar interno es una proteína recombinante, que tiene la misma secuencia que la proteína natural, pero sintetizada con unos aminoácidos pesados. La síntesis se realiza ex vivo con unos aminoácidos pesados. Este estándar tiene rigurosamente las mismas propiedades fisicoquímicas que la proteína natural (con la excepción de una masa más elevada). Se añade a partir del inicio, antes de la etapa de fraccionamiento de las proteínas, cuando esta última está presente. Por lo tanto, se copurifica con la proteína nativa, durante la etapa de fraccionamiento de las proteínas. Presenta el mismo rendimiento de tratamiento, en particular por digestión, que la proteína nativa. El péptido pesado obtenido después de la escisión está también copurificado con el péptido natural, si se realiza una etapa de fraccionamiento de los péptidos. Los dos péptidos se inyectan, por lo tanto, simultáneamente en el espectrómetro de masas, para analizarse cuantitativamente. Sufren entonces los mismos rendimientos de ionización en la fuente. La comparación de las áreas de pico de los péptidos naturales y de los péptidos de referencia en el método PSAQ permite calcular la concentración de la proteína a analizar teniendo en cuenta la totalidad de las etapas del procedimiento de evaluación.
El conjunto de estas técnicas, a saber AQUA, QconCAT o PSAQ o cualquier otra técnica de calibración, utilizada en evaluaciones por espectrometría de masas y en particular en las evaluaciones MRM o MS, podrá utilizarse para efectuar la calibración, en el ámbito de la invención.
De manera preferida, la espectrometría de masas utilizada en el procedimiento de detección según la invención es de tipo MS/MS. Más preferiblemente, la espectrometría de masas es la MRM.
El procedimiento de la invención permite la detección de resistencias a los glicopéptidos, caracterizada por la detección de al menos un péptido como marcador de resistencia.
De manera preferida, el procedimiento según la invención permite detectar al menos un marcador de resistencia a la vancomicina.
Según un primer modo de realización, el procedimiento según la invención permite detectar directamente la resistencia a un glicopéptido, sin poner en contacto el microorganismo potencialmente comprendido en la muestra con dicho glicopéptido, es decir sin etapa de inducción de dicha resistencia.
Según otro modo de realización, el procedimiento de la invención comprende una etapa suplementaria, previa a la etapa de detección, y que consiste en la inducción del mecanismo de resistencia, poniendo contacto dicha muestra con dicho o dichos glicopéptidos.
De manera preferida, dicho marcador de resistencia es un péptido procedente de las proteínas de tipo Van, tales como las variantes respectivas de tipo Van A, Van B, Van C, Van D, Van E, Van G, Van L, Van M y Van N.
Según un modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, relacionado con la expresión de la proteína VanA, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanA y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 4.
seleccionándose dichos péptidos de tipo VanA, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°5 a SEQ ID N°16 tales como se definen a continuación:
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanA seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 5 a SEQ ID N° 16 se detectan después de la inducción del mecanismo de resistencia.
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanA seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15 y SEQ ID N° 16 se detectan sin etapa de inducción.
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, relacionado con la expresión de la proteína VanB, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanB y a sus diferentes variantes de secuencias SEQ ID N° 17 a SEQ ID N° 28.
SEQ ID N°17:
MNKIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPCT EWEADSLPAIFSPDRKTHGLLVMKEREYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGLF ELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIEKGDKPEARTLTYP VFVKPARSGSSFGVTKVNSTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMG NEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMIIVPADIPVEERNRVQETAK KVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMAAAAGITLPA LIDSLITLAIER
SEQ ID N°18:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL PALIDSLITLALKR SEQ ID N°19:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQIIDKGDKPEAGALTYP VFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMG NEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETA KKWRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMVAAAGITLP ALIDSLITLALKR
SEQ ID N°20:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQIIDKGDKPEAGALTYP VFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVMG NEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQETA KKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYTRMVAAAGITLP ALIDSLITLALKR
SEQ ID N°21:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL PALIDSLITLALKR
SEQ ID N°22:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL PALIDSLITLALKR
SEQ ID N°23:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAVCMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMVAAAGITL PALIDSLITLALKR
SEQ ID N°24:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGGGEDGAIQ GLFVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGAL TYPVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAV MGNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQE TAKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGIT LPALIDSLITLALKR
SEQ ID N°25:
MNRIKVAIIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANINTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FELSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGVTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMVAAAGITL PALIDSLITLALKR
SEQ ID N°26:
MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARAGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL PALIDSLITLALKR
SEQ ID N°27:
MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGLTKVNGTEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTLPGFTSYSRYPRMMAAAGITL PAMIDSLITLALKR
SEQ ID N°28:
MNRIKVATIFGGCSEEHDVSVKSAIEIAANIDTEKFDPHYIGITKNGVWKLCKKPC TEWEADSLPAILSPDRKTHGLLVMKESEYETRRIDVAFPVLHGKCGEDGAIQGL FVLSGIPYVGCDIQSSAACMDKSLAYILTKNAGIAVPEFQMIDKGDKPEAGALTY PVFVKPARSGSSFGVTKVNGPEELNAAIEAAGQYDGKILIEQAISGCEVGCAVM GNEDDLIVGEVDQIRLSHGIFRIHQENEPEKGSENAMITVPADIPVEERNRVQET AKKVYRVLGCRGLARVDLFLQEDGGIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMVAAAGITL PALIDSLITLALKR
seleccionándose dichos marcadores de tipo VanB, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°29 a SEQ ID N°35 tales como se definen a continuación:
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanB seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 32 y SEQ ID N° 33 se detectan después de la inducción del mecanismo de resistencia.
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, relacionado con la expresión de la proteína VanC, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanC y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID N° 36 a SEQ ID N° 58. En particular, las variantes VanC1 se caracterizan por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanC1 y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID n°36 a SEQ ID N°43, las variantes VanC2 o VanC3 se caracterizan por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanC2 o Van C3 y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID N°46 a SEQ ID N°51 y SEQ ID N°53 a SEQ ID N°57, las variantes VanC4 se caracterizan por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanC4 y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID n°44, SEQ ID n°45, SEQ ID n°52 y SEQ ID n°58
SEQ ID N°36:
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYLYQGNLA NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE QLIALAEEDKR
SEQ ID N°37:
M KKIAVLFGGN S PE YSVSL AS AAS VIQ Al DPLKYEVMTIGIA PTM D WYWYQG N L ANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGL LELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDR FIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE QLIALAEEDKR
SEQ ID N°38:
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNL ANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGL LELMNLPYVGCHVAATALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDR FIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE QLIALAEEDKR
SEQ ID N°39:
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLA NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE QLIALAEEDKR
SEQ ID N°40:
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLA NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE KLIALAEEDKR
SEQ ID N°41:
MKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAESVIQAINPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGNLA NVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQGLL ELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATIDRF IQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIGC GILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQLL YRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILVE QLIALAEEDKR
SEQ ID N°42:
MMKKIAVLFGGNSPEYSVSLASAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGN LANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQG LLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATID RFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIG CGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQL LYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILV EQLIALAEEDKR
SEQ ID N°43:
MMKKIAVLFGGNSPEYSVSLTSAASVIQAIDPLKYEVMTIGIAPTMDWYWYQGN LANVRNDTWLEDHKNCHQLTFSSQGFILGEKRIVPDVLFPVLHGKYGEDGCIQG LLELMNLPYVGCHVAASALCMNKWLLHQLADTMGIASAPTLLLSRYENDPATID RFIQDHGFPIFIKPNEAGSSKGITKVTDKTALQSALTTAFAYGSTVLIQKAIAGIEIG CGILGNEQLTIGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISATITVPAPLPLALESQIKEQAQL LYRNLGLTGLARIDFFVTNQGAIYLNEINTMPGFTGHSRYPAMMAEVGLSYEILV EQLIALAEEDKR
SEQ ID N°44:
MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSAIEALQSSPDDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QDQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQK NIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIET KVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAA IGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°45:
MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAEAIGVQSAPTILLTNQDNQ QRQIEAFIQTHDFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQK NIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVEGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIET KVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAA IGLSYQELLQKLLVLAKEEGK
SEQ ID N°46:
MKKIAIIFGGNSPEYAVSLASATSALEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°47:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°48:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTERGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°49:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEGIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°50:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVASSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLEDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLILAKEEVK
SEQ ID N°51:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHTQKIKPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDG SIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQQ EQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKNI AGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKV KEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAVG LSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°52:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHTQKIQPLFEGNGFWISEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDG SIQGMFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QRQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQK NIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIET KVKEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAA VGLSYQELLQKLLVLAKEEGK
SEQ ID N°53:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNHANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°54:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVASSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLEDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLILAKEEVK
SEQ ID N°55:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKQKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGMFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTN HAN QQEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQ KNIAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIE TKVKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMA AVGLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°56:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGITPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IAGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°57:
MKKIAIIFGGNSPEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGITPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHKQKIQPLFEGNGFWLSEEQQTLVPDVLFPIMHGKYGED GSIQGLFELMKLPYVGCGVAGSALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQANQ QEQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIASALKEAFTYCSAVLLQKN IVGVEIGCGILGNDSLTVGACDTISLVDGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETK VKEQAQLLYRSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAV GLSYQELLQKLLVLAKEEVK
SEQ ID N°58:
MKKIAIIFGGNSSEYTVSLASATSAIEALQSSPYDYDLSLIGIAPDAMDWYLYTGE LENIRQDTWLLDTKHTQKIQPLFEENGFWLSEAQQTLVPDVLFPIMHGKYGEDG SIQGLFELMKLPYVGCGVAASALCMNKWLLHQAAAAIGVQSAPTILLTNQDNQQ QQIEAFIQTHGFPVFFKPNEAGSSKGITKVTCVEEIAPALKEAFAYCSAVLLQKNI AGVEIGCGILGNDSLTVGACDAISLVEGFFDFEEKYQLISAKITVPAPLPETIETKV KEQAQLLYHSLGLKGLARIDFFVTDQGELYLNEINTMPGFTSHSRYPAMMAAIG LSYQELLGKLLVLAKEEGK
seleccionándose dichos marcadores de tipo VanC, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°59 a SEQ ID N°71 tales como se definen a continuación:
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, relacionado con la expresión de la proteína VanD, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanD y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID N° 72 a SEQ ID N° 79.
SEQ ID N°72:
MFKIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP CLEWEQYAGDPWFSPDRSTHGLLIQKDKGYEIQPVDWLPMIHGKFGEDGSIQ GLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDF VYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEEARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAI LGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVRERIQ KTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFT LTEILDRLIELSLRR
SEQ ID N°73:
MFKIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP CLGWEQYAGDPWFSPDRSTHGLUQKDTGYEIQPVDWFPMIHGKFGEDGSIQ GLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKALAYTWKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDLV YPVFVKPARSGSS FG VN KVCKAEE LQAAI RE ARKYDSKILIE E AVTGSE VGCAIL GNENDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVRERIRK TAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTL SEILDRLIEFSLRR SEQ ID N°74:
MFRIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP CLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIQKDKGYEIQPVDVVFPMIHGKFGEDGSIQ GLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKALAYTVVKNAGITVPGFRILQEGDRLETEDFV YPVFVKPARSGSS FG VN KVCKAEELQAAIEE ARKYDSKI Ll E E AVTGS EVGC Al L GNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQIQE TAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTL SEILDRLIELSLRR
SEQ ID N°75:
MFRIKVAVLFGGCSEEHNVSIKSAMEIAANIDTKKYQPYYIGITKSGVWKMCEKP CLEWEQYAGDPVVFSPDRSTHGLLIGKDTGYEIQPVDVGLPMIHGKFGEDGSIQ GLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKALAYTVVKNAGIAVPGFRILQEGDRLETEDF VYPVFVKPARSGSSFGVNKVCKAEELQAAIEDARKYDSKILIEEAVTGSEVGCAI LGNGNDLMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVIERIGK TAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAGFTL TEILDRLIELSLRR
SEQ ID N°76:
MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDK PCRDWENYAGYPAVISPDRRIHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTI QGLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKSLAYMWKNAGIEVPGFRVLQKGDSLEAE TLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDSKILVEEAVSGSEVG CAILGNGNDLITGEVDQIELKHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQI QETAKKIYRVLGCRGLARIDLFLREDGSIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAG FTLSEILDRLIGLSLRR
SEQ ID N°77:
MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDK PCRDWENYAGYPAVISPDRRIHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGTI QGLLELSGIPYVVCDIQSSVICMDKSLAYMWKNAGIEVPGFRVLQKGDSLEAET LSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDSKILVEEAVSGSEVG CAILGNGNDLITGEVDQIELKHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAALPDEVREQI QETAKKIYRVLGCRGLARIDLFLREDGSIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTAAG FTLSEILDRLIGLSLRR
SEQ ID N°78:
MYKLKIAVLFGGCSEEHDVSVKSAMEVAANINKEKYQPFYIGITKSGAWKLCDK PCRDWENYAGYPAVISPDRRTHGLLIQKDGGYESQPVDVVLPMIHGKFGEDGT IQGLLELSGIPYVGCDIQSSVTCMDKSLAYMWKNAGIEVPGFRVLQKGDSLKA ETLSYPVFVKPARSGSSFGVNKVCRAEELQAAVTEAGKYDCKILVEEAVSGSEV GCAILGNENALMAGEVDQIELRHGFFKIHQEAQPEKGSENAVIRVPAVLPDEVR ERIQKTAMKIYRILGCRGLARIDLFLREDGCIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMTA AGFTLTEILDRLIELSLRR
SEQ ID N°79:
MYRINVAVLFGGCSEEHTVSIKSAMELAANIDTEKYQPFYIGITKSGVWKLCEKP CLDWEQYAKYPVVFSPGRNTHGFLIQKEDRYEIQPVDVVFPIIHGKFGEDGSIQ GLLELSGIPYVGCDIQSSVICMDKSLAYTTVKNAGIEVPDFQIIQDGDSPKTECFS FPLFVKPARSGSSFGVNKVDKAEDLCAAINEARQYDRKVLIEQAVSGSEVGCAV LGTGTDLIVGEVDQISLKHGFFKIHQEAQPEKGSENATIEVPADLPAKVRERIQK TAKKIYQVLGCRGLARIDLFLREDGHIVLNEVNTMPGFTSYSRYPCMMTAAGFT LSELIDRLIELALRR
seleccionándose dichos péptidos de tipo VanD, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°80 a SEQ ID N°83 tales como se definen a continuación:
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanD seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81 y SEQ ID N° 83 se detectan después de la inducción del mecanismo de resistencia.
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanD seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81 y SEQ ID N° 83 se detectan sin etapa de inducción.
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, inducido por la expresión de la proteína VanE, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanE de la secuencia SEQ ID N° 84.
SEQ ID N°84:
MKTVAIIFGGVSSEYEVSLKSAVAIIKNMESIDYNVMKIGITEEGHWYLFEGTTDKI KKDRWFLDESCEEIVVDFAKKSFVLKNSKKIIKPDILFPVLHGGYGENGAMQGVF ELLDIPYVGCGIGAAAISMNKIMLHQFAEAIGVKSTPSMIIEKGQDLQKVDAFAKI HGFPLYIKPNEAGSSKGISKVERKSDLYKAIDEASKYDSRILIQKEVKGVEIGCGIL GNEQLWGECDQISLVDGFFDYEEKYNLVTAEILLPAKLSIDKKEDIQMKAKKLY RLLGCKGLARIDFFLTDDGEILLNEINTMPGFTEHSRFPMMMNEIGMDYKEIIENL L VL AVE N H E KKLSTID
seleccionándose dichos marcadores de tipo VanE, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°85 a SEQ ID N°91 tales como se definen a continuación:
Ventajosamente, el marcador de tipo VanE que corresponde al péptido de la secuencia SEQ ID N° 89 se detecta después de la inducción del mecanismo de resistencia.
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, relacionado con. la expresión de la proteína VanG, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanG y a sus diferentes variantes de las secuencias SEQ ID N° 92 a SEQ ID N° 94.
SEQ ID N°92:
MIKKRIAIIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTKKFDIVPIGITRNGDWYHYTGKKE KIANNTWFEDNENLYSVAVSQNRSVKGFIEFKEEKFYIIKVDLIFPVLHGKNGED GTLQGLFELAGIPVVGCDTLSSALCMDKDKAHKLVSLAGISVPKSVTFKFSGKK AALKKIEKELSYPLFVKPVRAGSSFGITKVTKQQELENAIQLAFEHDAEVIVEETIN GFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRI QETAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIG LSFAQMLDKLIGLYVE
SEQ ID N°93:
MQNKKIAVIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTNKFDIIPIGITRSGEWYHYTGEK EKILNNTWFEDSKNLCPVVVSQNRSVKGFLEIASDKYRIIKVDLVFPVLHGKNGE DGTLQGIFELAGIPWGCDTLSSALCMDKDRAHKLVSLAGISVPKSVTFKRFNEE AAMKEIEANLTYPLFIKPVRAGSSFGITKVIEKQELDAAIELAFEHDTEVIVEETIN GFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRI QEAAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIG LSFSQMLDKLIGLYVE SEQ ID N°94:
MQNKKIAVIFGGNSTEYEVSLQSASAVFENINTNKFDIIPIGITRSGEWYHYTGEK EKILNNTWFEDSKNLCPVVVSQNRSVKGFLEIASDKYRIIKVDLVFPVLHGKNGE NGTLQGIFELAGIPWGCDTLSSALCMDKDRAHKLVSLAGISVPKSVTFKRFNEE AAMKEIEANLTYPLFIKPVRAGSSFGITKVIEKQELDAAIELAFEHDTEVIVEETIN GFEVGCAVLGIDELIVGRVDEIELSSGFFDYTEKYTLKSSKIYMPARIDAEAEKRI QEAAVTIYKALGCSGFSRVDMFYTPSGEIVFNEVNTIPGFTSHSRYPNMMKGIG LSFSQMLDKLIGLYVE
seleccionándose dichos marcadores de tipo VanG, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°95 a SEQ ID N°102 tales como se definen a continuación:
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanG seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96, SEQ ID N° 97, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 100 y SEQ ID N° 102 se detectan después de la inducción del mecanismo de resistencia.
Ventajosamente, los marcadores de tipo VanG seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 97 y SEQ ID N° 100 se detectan sin etapa de inducción.
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, inducido por la expresión de la proteína VanL, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanL de la secuencia SEQ ID N° 103.
SEQ ID N°103:
MMKLKKIAIIFGGQSSEYEVSLKSTVSVLETLSTCNFEIIKIGIDLGGKWYLTTSNN KDIEYDVWQTDPSLQEIIPCFNNRGFYNKTTNKYFRPDVLFPILHGGTGEDGTL QGVFELMNIPYVGCGVTPSAICMDKYLLHEFAQSVGVKSAPTLIIRTRNCKDEID KFIEKNDFPIFVKPNEAGSSKGINKVNEPDKLEDALTEAFKYSKSVIIQKAIIGREI GCAVLGNEKLLVGECDEVSLNSDFFDYTEKYQMISAKVNIPASISVEFSNEMKK QAQLLYRLLGCSGLARIDFFLSDNNEILLNEINTLPGFTEHSRYPKMMEAVGVTY KEIITKLINLAEEKYYG
seleccionándose dichos péptidos de tipo VanL, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°104 a SEQ ID N°120 tales como se definen a continuación:
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, inducido por la expresión de la proteína VanM, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanM de la secuencia SEQ ID N° 121.
SEQ ID N°121:
MNRLKIAILFGGCSEEHNVSVKSAAEIANNIDIGKYEPIYIGITQSGVWKTCEKPCI DWDNEHCRSAVLSPDKKMHGLLIMQDKGYQIQRIDWFSVLHGKSGEDGAIQG LFELSGIPYVGCDIQSSAVCMDKSLAYIIAKNAGIATPEFQVIYKDDKPAADSFTY PVFVKPARSGSSYGVNKVNSADELDSAIDLARQYDSKILIEQGVLGYEVGCAVL GNSFDLIVGEVDQIRLGHGIFRIHQEAEPEKGSENATITVPAELSAEERERIKEAA KNIYKALGCRGLSRVDMFLQDNGRIVLNEVNTMPGFTSYSRYPRMMVSAGITIP ELIDHLIVLAVKE
seleccionándose dichos péptidos de tipo VanM, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°122 a SEQ ID N°139 tales como se definen a continuación:
Según otro modo de realización de la invención, la detección de un mecanismo de resistencia a los glicopéptidos, inducido por la expresión de la proteína VanN, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a la proteína VanN de la secuencia SEQ ID N° 140.
SEQ ID N°140:
MKKIALIFGGTSAEYEVSLKSAASVLSVLENLNVEIYRIGIASNGKWYLTFSDNETI ANDLWLQDKKLNEITPSFDGRGFYDQAEKVYFKPDVLFPMLHGGTGENGTLQG VFECMQIPYVGCGVASSAICMNKYLLHQFAKSVGVMSTPTQLISSTDEQQVIKN FTELYGFPIFIKPNEAGSSKGISKVHTEAELTKALTEAFQFSQTVILQKAVSGVEI GCAILGNDQLLVGECDEVSLATDFFDYTEKYQMTTAKLTVPAKIPVATSREIKRQ AQLLYQLLGCQGLARIDFFLTEAGEILLNEINTMPGFTNHSRFPAMMAATGITYQ ELISTLITLAEDK
seleccionándose dichos péptidos de tipo VanN, preferentemente, entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N°141 a SEQ ID N°154 tales como se definen a continuación:
El procedimiento de la invención y sus ventajas destacarán en la continuación de la presente descripción, que presenta varios ejemplos, no limitativos, de realización de dicho procedimiento.
Ejemplo 1: Preparación de una muestra primaria urinaria por enriquecimiento de microorganismos:
El protocolo siguiente se realiza en 16 etapas (las etapas 5 a 12 son opcionales y podrían omitirse si la muestra enriquecida se trata posteriormente según los ejemplos 6 y siguientes):
1. Centrifugación de 5 ml de orina contaminada, a 2000g durante 30 segundos
2. Recuperación del sobrenadante
3. Centrifugación a 15000g durante 5 minutos
4. Eliminación del sobrenadante
5. Lavado del residuo con 3 ml de agua destilada por resuspensión
6. Centrifugación a 15000g durante 5 minutos
7. Eliminación del sobrenadante
8. Poner el residuo en presencia de disolvente (8 volúmenes acetona para 1 volumen de metanol) en dilución al 1/10 9. Dejar 1 hora a -20°C
10. Centrifugación a 15000g durante 5 minutos
11. Eliminación del sobrenadante
12. Poner el residuo en presencia de disolvente (8 volúmenes acetona para 1 volumen de metanol) en dilución al 1/10
13. Dejar 1 hora a -20°C
14. Centrifugación a 15000g durante 5 minutos
15. Eliminación del sobrenadante
El residuo constituye la muestra enriquecida con microorganismos
Ejemplo 2: Cultivo de la muestra sobre medio de cultivo en ausencia de antibiótico:
Los medios de cultivo óptimos y las condiciones de cultivo óptimas son diferentes según las especies de microorganismos. Por defecto, la muestra se siembra sobre diferentes medios:
° gelosa Columbia con sangre de oveja (referencia bioMérieux 43041) durante 18 a 24h a 35°C, en atmósfera aerobia o anaerobia;
° gelosa TSA (referencia bioMérieux 43011) durante 18 a 24h a 37°C.
Ejemplo 3: Cultivo de la muestra sobre medio de cultivo en presencia de antibiótico:
La muestra se siembra sobre medio:
° gelosa VRE (referencia bioMérieux 43002) durante 18 a 24h a 35°C, en atmósfera aerobia o anaerobia. Este medio contiene vancomicina.
Ejemplo 4: Identificación de microorganismos por perfil bioquímico:
La identificación se realiza de la siguiente manera:
1. Selección de colonias aisladas obtenidas según el ejemplo 2 o el ejemplo 3, o por enriquecimiento de microorganismos presentes en una muestra primaria según el ejemplo 1.
2. Respetando las condiciones de asepsia, transferencia de 3,0 ml de solución salina estéril acuosa (a 0,45-0,50% de NaCl, de pH 4,5 a 7,0) en un tubo de ensayo de plástico transparente (poliestireno)
3. Con la ayuda de un bastoncillo o de un hisopo estéril, se transfiere un número suficiente de colonias idénticas en el tubo de solución salina preparada en la etapa 2 y se ajusta la suspensión bacteriana entre 0,50 y 0,63 McFarland con un DENSICHEK calibrado del VITEK®
4. Posicionamiento del tubo de suspensión bacteriana y de una tarjeta de identificación VITEK® sobre un casete VITEK®
5. Cargamento del casete en el instrumento VITEK®
6. Las operaciones de llenado, sellado, incubación y lectura son automáticas
7. Adquisición de un perfil bioquímico
Identificación con el sistema VITEK® realizada por comparación con perfiles bioquímicos de cepas conocidas Ejemplo 5: Identificación de microorganismos a partir de una muestra por MALDI-TOF
La identificación se realiza de la siguiente manera:
1. Transferencia, con la ayuda de una oesa de 1pl, de una porción de colonia de microorganismo obtenida según el ejemplo 2 o 3, o de una muestra enriquecida según el ejemplo 1, y depósito uniforme sobre una placa para espectrometría de masas por MALDI-TOF
2. Recubrimiento del depósito con 1 pl de matriz. La matriz utilizada es una solución saturada de HCCA (ácido alfaciano-4-hidroxicinámico) en disolvente orgánico (50% de acetonitrilo y 2,5% de ácido trifluoroacético)
3. Secado a temperatura ambiente
4. introducción de la placa en el espectrómetro de masa
5. Adquisición de un espectro de masa
6. Comparación del espectro obtenido con los espectros contenidos en una base de datos
7. Identificación du microorganismo por comparación de los picos obtenidos con los de la base de datos
Ejemplo 6: Identificación de microorganismos a partir de una muestra por ESI-MS
La identificación se realiza de la siguiente manera:
1. Extracción de una colonia de microorganismo, obtenida según el ejemplo 2 o 3, o de una muestra enriquecida según el ejemplo 1, y puesta en suspensión en 100 pl de agua desmineralizada.
2. Centrifugación a 3000g durante 5 minutos.
3. Eliminación del sobrenadante.
4. Repuesta en suspensión en 100pl de agua desmineralizada.
5. Centrifugación a 3000g durante 5 minutos.
6. Eliminación del sobrenadante.
7. Repuesta en suspensión en 100 pl de una mezcla acetonitrilo, agua desmineralizada, ácido fórmico (50/50/0,1%).
8. Filtración con un filtro de porosidad de 0,45 pm.
9. inyección en un espectrómetro de masas en modo MS simple.
10. Adquisición de un espectro de masas.
11. Comparación del espectro obtenido con los espectros contenidos en una base de datos.
12. identificación del microorganismo por referencia con espectros de referencia.
Ejemplo 7: Obtención de proteínas digeridas a partir de microorganismos
El protocolo siguiente se realiza en 17 etapas:
1. Extracción de una colonia de microorganismo, obtenida según el ejemplo 2 o 3, o de una muestra enriquecida según el ejemplo 1, y puesta en suspensión en 10 a 100 pl de una solución de hidrocloruro de guanidina 6M, 50 mM Tris-HCl, pH=8,0.
2. Adición de dithiotreitol (DTT) para obtener una concentración final de 5 mM.
3. Reducción durante 20 minutos a 95°C en un baño maría.
4. Enfriamiento de los tubos a temperatura ambiente.
5. Adición de yodoacetamida para obtener una concentración final de 12,5 mM.
6. Alquilación durante 40 minutos a temperatura ambiente y en la oscuridad.
7. Dilución de un factor 6 con una solución de NH4HCO350 mM, pH=8,0 para obtener una concentración final en hidrocloruro de guanidina de 1M.
8. Adición de 1 pg de tripsina.
9. Digestión a 37°C durante 6 horas hasta una noche.
10. Adición de ácido fórmico hasta un pH inferior a 4 para detener la reacción.
11. El volumen de muestra se complementa a 1 ml con agua/ácido fórmico 0,5% (v/v)
12. Equilibrado de las columnas HLB Oasis Waters con 1 ml de metanol y después 1 ml HbO/ácido fórmico 0,1% (v/v)
13. Depósito de la muestra que fluye por gravedad
14. Lavado con 1 ml H2O/ácido fórmico al 0,1% (v/v)
15. Elución con 1 ml de una mezcla de un 80% de metanol y un 20% de agua/ácido fórmico al 0,1% (v/v)
16. El eluato se evapora con una evaporadora de tipo SpeedVac® SPD2010 (Thermo Electron Corporation, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos de América), durante 2 horas, a fin de obtener un volumen de aproximadamente 100 pl.
El eluato se recoge después en una solución agua/ácido fórmico al 0,5% (v/v) cuantificado suficiente para (QSP) 200 pl
Ejemplo 8: Identificación de resistencia a los alicopéptidos. sin inducción, de tipo VanA, VanB, VanC1, VanD, VanE y VanG:
Las muestras Ech1 a Ech13 se identifican según uno de los métodos descritos en los ejemplos 1 a 6. La identificación de las especies se detalla en la TABLA 1.
TABLA 1:
Las muestras Ech1 a Ech11 corresponden a una especie que puede comprender un mecanismo de resistencia de tipo Van. Se utiliza entonces método siguiente para investigar tal mecanismo.
La colonia de microorganismos se obtiene según el ejemplo 2, se trata según el ejemplo 7, y después se inyecta un volumen de 50 pl de proteínas digeridas y se analiza según las condiciones siguientes:
* Cadena cromatográfica Dionex Ultimate 3000 de la compañía Dionex Corporation (Sunnyvale, Estados Unidos de América).
* Columna Waters BEH130 C18, 2,1 mm de diámetro interno, 100 mm de largo, tamaño de partícula de 3,5 pm (Waters, Saint-Quentin en Yvelines, Francia).
* Disolvente A: H2O 0,1% ácido fórmico.
* Disolvente B: ACN 0,1% ácido fórmico.
Gradiente HPLC definido en la TABLA 2 siguiente.
TABLA 2:
* El eluato en la salida de la columna cromatográfica se inyecta directamente en la fuente de ionización del espectrómetro de masas de tipo QTRAP® 5500 de la compañía Applied Biosystems (Foster City, Estados Unidos de América).
* Los péptidos, procedentes de la digestión de las proteínas del microorganismo, se analizan mediante el espectrómetro de masas en modo MRM. Sólo se detectan los péptidos indicados en la TABLA 3. Para ello, se detectan el o los fragmentos indicados en la TABLA 3.
TABLA 3 :
Las transiciones mencionadas en la TABLA 3 se detectan utilizando los parámetros que figuran en las TABLA 4 y 5. TABLA 4 :
TABLA 5:
• los otros parámetros de la máquina utilizados son los siguientes:
Se han medido las áreas obtenidas para cada una de las transiciones y para cada uno de los microorganismos estudiados. Cuando el área de una transición es superior o igual al umbral de positividad descrito en la TABLA 5, la detección de la transición se considera como positiva y se designa “1” en la TABLA 6. Cuando el área de una transición es inferior al umbral de positividad descrito en la TABLA 5, la detección de la transición se considera como negativa y se designa “0” en la TABLA 6. Cuando las 3 transiciones de un mismo péptido se designan “1”, la detección del péptido se considera como positiva. Un caso particular hace la excepción de esta regla. El péptido que corresponde a las transiciones números 49, 50 y 51 tiene una transición de muy baja intensidad. En este caso preciso, cuando las transiciones 49 y 50 se designan “1”, la detección de este péptido se considerará como positiva.
TABLA 6:
Las muestras Ech1, Ech2, Ech4, Ech5, Ech7 y Ech9 no presentan ningún péptido característico de resistencia de tipo Van. Las bacterias presentes en las muestras Ech1, Ech2, Ech4, Ech5, Ech7 y Ech9 pueden ser sensibles a los glicopéptidos de tipo Vancomicina o Teicoplanina.
Las muestras Ech3, Ech10 y Ech11 comprenden al menos un péptido característico de VanA. Las bacterias presentes en las muestras Ech3, Ech10 y Ech11 expresan por lo tanto la ligasa VanA que les confiere una resistencia a la Vancomicina y a la Teicoplanina.
La muestra Ech6 comprende al menos un péptido característico de VanG. La bacteria presente en la muestra Ech6 expresa por lo tanto la ligasa VanG que le confiere una resistencia a la Vancomicina.
La muestra Ech8 comprende al menos un péptido característico de VanD. La bacteria presente en la muestra Ech8 expresa por lo tanto la ligasa VanD que le confiere una resistencia a la Vancomicina y a la Teicoplanina.
Así, de manera ventajosa, se investigan simultáneamente varios mecanismos de resistencia a los glicopéptidos. De manera particularmente ventajosa, un mecanismo de resistencia inducible, tal como el mecanismo de resistencia relacionado con la expresión de VanA, se detecta sin fase de inducción durante el cultivo del microorganismo. Este procedimiento permite por lo tanto investigar los mecanismos de resistencia a los glicopéptidos sin a priori sobre su eventual existencia.
Ejemplo 9: Identificación de resistencia a los glicopéptidos. con inducción, de tipo VanA, VanB, VanD, VanE y VanG:
Las muestras Ech1 a Ech11 se identifican según uno de los métodos descritos en los ejemplos 1 a 6. La identificación de las especies se detalla en la TABLA 7.
TABLA 7:
Las muestras Ech12 a Ech20 corresponden a una especie que puede comprender un mecanismo de resistencia de tipo Van. El método siguiente está entonces utilizado para investigar tal mecanismo.
La colonia de microorganismos se obtiene según el ejemplo 3 y después se trata según el ejemplo 7 y se analiza según el ejemplo 8.
Se han medido las áreas obtenidas para cada una de las transiciones y para cada uno de los microorganismos estudiados. Cuando el área de una transición es superior o igual al umbral de positividad descrito en la TABLA 5, la detección de la transición se considera como positiva y se designa “1” en la TABLA 8. Cuando el área de una transición es inferior al umbral de positividad descrito en la TABLA 5, la detección de la transición se considera como negativa y se designa “0” en la TABLA 8. Cuando las 3 transiciones de un mismo péptido se designan “1”, la detección del péptido se considera como positiva. Un caso particular hace la excepción de esta regla. El péptido que corresponde a las transiciones números 49, 50 y 51 tiene una transición de muy baja intensidad. En este preciso caso, cuando las transiciones 49 y 50 se designan “1 ”, la detección de este péptido se considerará como positiva. TABLA 8:
La muestra Ech12 no presenta ningún péptido característico de resistencia de tipo Van. La bacteria presente en la muestra Ech12 puede ser sensible a los glicopéptidos de tipo Vancomicina o Teicoplanina.
Las muestras Ech19 y Ech20 comprenden al menos un péptido característico de VanA. Las bacterias presentes en las muestras Ech19 y Ech20 expresan por lo tanto la ligasa VanA que le confiere una resistencia a la Vancomicina y a la Teicoplanina.
Las muestras Ech13, Ech14 y Ech18 comprenden al menos un péptido característico de VanB. Las bacterias presentes en las muestras Ech13, Ech14 y Ech18 expresan por lo tanto la ligasa VanB que le confiere una resistencia a la Vancomicina.
La muestra Ech15 comprende al menos un péptido característico de VanG. La bacteria presente en la muestra Ech15 expresa la ligasa VanG que le confiere una resistencia a la Vancomicina.
La muestra Ech16 comprende al menos un péptido característico de VanE. La bacteria presente en la muestra Ech16 expresa la ligasa VanE que le confiere una resistencia a la Vancomicina.
La muestra Ech17 comprende al menos un péptido característico de VanD. La bacteria presente en la muestra Ech17 expresa la ligasa VanD que le confiere una resistencia a la Vancomicina y a la Teicoplanina.
Así, de manera ventajosa se pueden investigar simultáneamente varios mecanismos de resistencia a los glicopéptidos.
Ejemplo 10: Obtención de proteínas digeridas a partir de microorganismos
El protocolo siguiente se realiza en 16 etapas:
1. Extracción de una colonia de microorganismos, obtenida según el ejemplo 8 y puesta en suspensión en 100 pl de una solución de bicarbonato de amonio, 50 mM, pH=8,0 en un tubo que contiene unas bolas de vidrio de 0,05 mm a 2 mm de diámetro
2. Adición de dithiotreitol (DTT) para obtener una concentración final de 5mM.
3. Reducción durante 5 minutos a 95°C sobre una sonda Hielscher (ajuste instrumento: amplitud:100, ciclo: 1) 4. Enfriamiento de los tubos a temperatura ambiente.
5. Adición de yodoacetamida para obtener una concentración final de 12,5 mM.
6. Alquilación durante 5 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz.
7. Adición de 1 pg de tripsina.
8. Digestión a 50°C durante 15 minutos
9. Adición de ácido fórmico hasta un pH inferior a 4 para detener la reacción.
10. Centrifugación durante 5 minutos a 15000 g, el sobrenadante se recupera y complementa a 1 ml con agua/ácido fórmico al 0,5% (v/v)
11. Equilibrado de las columnas HLB Oasis Waters con 1 ml de metanol y después 1 ml H2Ü/ácido fórmico al 0,1% (v/v)
12. Depósito de la muestra que fluye por gravedad
13. Lavado con 1 ml H2O/ácido fórmico al 0,1% (v/v)
14. Elución con 1 ml de una mezcla de un 80% de metanol y un 20% de agua/ácido fórmico al 0,1% (v/v)
15. El eluato se evapora con una evaporadora de tipo SpeedVac® SPD2010 (Thermo Electron Corporation, Waltham, Massachusetts, Estados Unidos de América), durante 2 horas, a fin de obtener un volumen de aproximadamente 100 pl.
16. El eluato se recoge después en una solución agua/ácido fórmico al 0,5% (v/v) en cantidad suficiente para (QSP) 150 pl
Ejemplo 11: Identificación de resistencia a los glicopéptidos, sin inducción, de tipo VanA:
Las muestras Ech21 y Ech22 se identifican según uno de los métodos descritos en los ejemplos 1 a 6. La identificación de las especies se detalla en la TABLA 9.
TABLA 9:
Las muestras Ech21 y Ech22 corresponden a la especie Enterococcus faecalis, que puede comprender un mecanismo de resistencia de tipo Van. Se utiliza entonces el método siguiente para investigar tal mecanismo. Cada muestra se trata según el ejemplo 10 y se analiza según el ejemplo 8 salvo los elementos mencionados a continuación.
Las transiciones mencionadas en la TABLA 3 se detectan utilizando los parámetros que figuran en las TABLAS 10 y 11.
TABLA 10:
TABLA 11:
• Los otros parámetros máquina utilizados son los siguientes:
Se han medido las áreas obtenidas para cada una de las transiciones y para cada uno de los microorganismos estudiados. Cuando el área de una transición es superior o igual al umbral de positividad descrito en la TABLA 11, la detección de la transición se considera como positiva y se designa “1” en la TABLA 12. Cuando el área de una transición es inferior al umbral de positividad descrito en la TABLA 11, la detección de la transición se considera como negativa y se designa “0” en la TABLA 12. Cuando las 3 transiciones de un mismo péptido se designan “1”, la detección del péptido se considera como positiva. Un caso particular hace la excepción de esta regla. El péptido que corresponde a las transiciones números 49, 50 y 51 tiene una transición de muy baja intensidad. En este preciso caso, cuando las transiciones 49 y 50 se designan “1”, la detección de este péptido se considerará como positiva. TABLA 12:
Las muestras Ech21 y Ech22 comprenden al menos un péptido característico de VanA. Las bacterias presentes en las muestras Ech21 y Ech22 expresan la ligasa VanA que le confiere una resistencia a la Vancomicina y a la Teicoplanina.
Así, de manera particularmente ventajosa, un mecanismo de resistencia inducible, tal como el mecanismo de resistencia relacionado con la expresión de VanA, se detecta sin fase de inducción durante el cultivo del microorganismo, después de una fase de preparación de la muestra realizada en al menos 3 horas. Este procedimiento permite por lo tanto investigar rápidamente los mecanismos de resistencia a los glicopéptidos sin a priori sobre su eventual existencia.
Ejemplo 12: Identificación de resistencia a los glicopéptidos, sin inducción:
Las muestras Ech23 y Ech24 se identifican según uno de los métodos descritos en los ejemplos 1 a 6. La identificación de las especies se detalla en la TABLA 13.
TABLA 13:
Las muestras Ech23, Ech24 y Ech25 corresponden a la especie Enterococcus Faecalis o Enterococcus faecium, que pueden comprender un mecanismo de resistencia de tipo Van.
Se utiliza entonces el método siguiente para investigar tal mecanismo. Cada muestra se trata según el ejemplo 10 con las modificaciones siguientes:
* Etapa 1: se extrae una línea de colonia de 3 cm con una oesa de 10 pl (frente a una colonia anteriormente).
* Etapa 7: adición de 2 pg de tripsina.
Cada muestra se analiza según el ejemplo 8 salvo los elementos mencionados a continuación.
Las transiciones mencionadas en la TABLA 3 se detectan utilizando los parámetros que figuran en las TABLAS 4 y 11.
Como en el ejemplo 8 las áreas positivas se designan “1” en la TABLA 14. Los péptidos positivos se detectan según las reglas del ejemplo 8.
TABLA 14:
La muestra Ech23 comprende al menos un péptido característico de VanB. La bacteria presente en la muestra Ech23 expresa la ligasa VanB que le confiere una resistencia a la Vancomicina.
La muestra Ech25 comprende al menos un péptido característico de VanA. La bacteria presente en la muestra Ech25 expresa la ligasa VanA que le confiere una resistencia a la Vancomicina y a la Teicoplanina.
A la inversa, la muestra Ech24 no presenta ningún péptido característico de resistencia de tipo Van. La bacteria presente en la muestra Ech24 puede ser sensible a los glicopéptidos de tipo Vancomicina o Teicoplanina.
Así, de manera particularmente ventajosa, un mecanismo de resistencia inducible, tal como el mecanismo de resistencia relacionado con la expresión de VanB, se detecta sin fase de inducción durante el cultivo del microorganismo, después de una fase de preparación de la muestra realizada en menos de 3 horas. De manera también muy ventajosa, todos los mecanismos de resistencia a los glicopéptidos pueden investigarse y detectarse simultáneamente. Así, se detectan respectivamente 2 mecanismos de resistencia, VanB y VanA, en las muestras Ech23 y Ech25 utilizando el mismo método.
Este procedimiento permite, por lo tanto, investigar rápidamente los mecanismos de resistencia a los glicopéptidos sin a priori sobre su eventual existencia.
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Claims (19)
1. Procedimiento de detección, para el menos un microorganismo comprendido en una muestra, de al menos un marcador de resistencia a un glicopéptido que es la vancomicina, que comprende la detección, porespectrometría de masas de tipo MRM, de al menos un péptido de dicho microorganismo, que son unos péptidos de tipo Van seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 5 a 16, 29 a 35, 59 a 71, 80 a 83, 85 a 91, 95 a 102, 104 a 120,122 a 139 o 141 a 154.
2. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, que comprende una etapa previa a la etapa de detección que consiste en la inducción del mecanismo de resistencia por puesta en contacto previo de dicha muestra con dicho glicopéptido.
3. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unas proteínas de tipo VanA seleccionadas entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 5 a SEQ ID N° 16.
4. Procedimiento de detección según la reivindicación 3, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanA seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 12, SEQ ID N° 13, SEQ ID N° 15, SEQ ID N° 16.
5. Procedimiento de detección según la reivindicación 2, en el que dichos marcadores de resistencia son unos péptidos de tipo VanA seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 5 a SEQ ID N° 16.
6. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanB seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 29 a SEQ ID N° 35.
7. Procedimiento de detección según la reivindicación 2, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanB seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 29, SEQ ID N° 30, SEQ ID N° 32 y SEQ ID N° 33.
8. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanC seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 59 a SEQ ID N° 71.
9. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanD seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 80 a SEQ ID N° 83.
10. Procedimiento de detección según la reivindicación 9, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanD seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81 y SEQ ID N° 83.
11. Procedimiento de detección según la reivindicación 2, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanD seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 81 y SEQ ID N° 83
12. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanE seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 85 a SEQ ID N° 91.
13. Procedimiento de detección según la reivindicación 2, en el que dicho marcador de resistencia es un marcador de tipo VanE que corresponde al péptido de la secuencia SEQ ID N° 89.
14. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanG seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 95 a SEQ ID N° 102.
15. Procedimiento de detección según la reivindicación 14, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanG seleccionados entre los péptidos de SEQ ID N° 97 y SEQ ID N° 100.
16. Procedimiento de detección según la reivindicación 2, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanG seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 95, SEQ ID N° 96, SEQ ID N° 97, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 100 y SEQ ID N° 102.
17. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanL seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 104 a SEQ ID N° 120.
18. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanM seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 122 a SEQ ID N° 139.
19. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo VanN seleccionados entre los péptidos de las secuencias SEQ ID N° 141 a SEQ ID N° 154.
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