ES2686336T3 - Procedimiento de detección de al menos un mecanismo de resistencia a los carbapenemos por espectrometría de masa - Google Patents

Abstract

Procedimiento de detección, por espectrometría de masa de tipo MS/MS en modo MRM, para al menos un microorganismo comprendido en una muestra, de al menos un marcador de resistencia a al menos un antimicrobiano, que es un carbapenemo, seleccionándose dichos marcadores de resistencia unos marcadores de tipo KPC, entre los péptidos de secuencia SEQ ID N°20 a SEQ ID N°33, SEQ ID N°1094, SEQ ID N°1096 y SEQ ID N°1097.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de detección de al menos un mecanismo de resistencia a los carbapenemos por espectrometría de masa

La presente invención se refiere al campo de la microbiología. Más precisamente, la invención se refiere a la detección de al menos un mecanismo de resistencia a los carbapenemos de al menos un microorganismo procedente de una muestra utilizando la espectrometría de masa.

Desde el descubrimiento de los microbios por Pasteur, los microorganismos se estudian mediante microscopia y análisis bioquímicos. Estos métodos tradicionales son frecuentemente largos y fastidiosos y unas alternativas han sido muy rápidamente buscadas. Es así que el análisis de bacterias por espectrometría de masa se ha iniciado a partir de 1975 por J. Anhalt y C. Fenselau [1].

Estos trabajos preliminares fueron seguidos por el estudio en cromatografía en fase gaseosa acoplada a la espectrometría de masa (GC-MS) de ácidos grasos de la pared de los microorganismos [2]. Este método se ha popularizado bajo la denominación anglosajona de FAME por “Fatty Acid Methyl Ester”. Constituye actualmente un método de referencia para los estudios taxonómicos. Su utilización sigue estando no obstante limitada a algunos laboratorios especializados que controlan el tratamiento de la muestra por saponificación, hidrólisis y derivación.

En 1996, los trabajos de M. Claydon et al. [3] así como de T. Krishnamurthy y P. Ross [4] han mostrado la posibilidad de identificar diferentes especies bacterianas con un espectrómetro de masa de tipo MALDI-TOF (acrónimo del inglés Matrix Assisted Laser Desorption lonization - Time Of Flight). El análisis asocia la adquisición de un espectro de masa y la interpretación de un programa experto. Es extremadamente simple y se puede efectuar en algunos minutos. Sin embargo, se difunde sólo desde hace poco tiempo en los laboratorios de análisis médicos [5]. Su utilización clínica es actualmente limitada a la identificación de especies bacterianas y de levaduras. No se utiliza rutinariamente para la identificación de las resistencias a los antimicrobianos.

Ahora bien, la identificación de resistencias a los antimicrobianos tales como los antibióticos es un elemento esencial para asegurar un tratamiento óptimo de los pacientes.

Otros procedimientos de espectrometría de masa, en particular en tándem, se han propuesto para responder a estas necesidades. A título de ejemplo, es posible citar los trabajos de C. Fenselau et al. Para la identificación de p- lactamasa con un cuadrípolo-TOF (Q-TOF) [6]-

Sin embargo, estos resultados de búsqueda no son aplicables para una utilización clínica de rutina Se han obtenido con unos instrumentos de búsqueda que necesitan un personal altamente cualificado. Los tiempos de análisis, frecuentemente superiores a una hora por muestra, son incompatibles con la carga de trabajo de un laboratorio de análisis microbiológico.

Más recientemente, S. Hofstalder et al. [7] han propuesto un procedimiento que asocia una amplificación del genoma microbiano por PCR a una detección de los productos de PCR por electrospray-TOF (ESI-TOF). Este procedimiento está ahora totalmente automatizado [8]. Sin embargo, necesita una amplificación por PCR con los defectos inherentes a la biología molecular, a saber un rendimiento de extracción, coste de las sondas, etc.

En este contexto, el objetivo de la presente invención es proponer un procedimiento de detección de mecanismos de resistencia a los carbapenemos, que permite paliar los inconvenientes de los procedimientos de la técnica anterior, a saber proporcionar un procedimiento poco costoso, sin reactivos específicos para cada especie, en particular con respecto a los procedimientos de biología molecular, dando un resultado en un tiempo corto, inferior a una hora, y utilizable en clínica de rutina, sin necesitar un personal altamente cualificado.

Para este fin, la invención propone un nuevo procedimiento de detección, por espectrometría de masa de tipo MS/MS en modo MRM, para al menos un microorganismo comprendido en una muestra, de al menos un marcador de resistencia a al menos un antimicrobiano, que es un carbapenemo, dichos marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo KPC, seleccionados entre los péptidos de secuencia SEQ ID N°20 a SEQ ID N°33, SEQ ID N°1094, SEQ ID N°1096 y SEQ ID N°1097.

Ventajosamente, unos marcadores de resistencia a varios antimicrobianos diferentes pueden detectarse simultáneamente.

Como se indica en la solicitud PCT/FR2010/052181, unos marcadores de tipaje y/o de virulencia de dichos microorganismos pueden detectarse, de la misma manera, por espectrometría de masa, previa o simultáneamente a la detección de los marcadores de mecanismo de resistencia.

Por marcadores de la resistencia a al menos un antimicrobiano de la clase de los carbapenemos, se entiende unas moléculas de origen proteico que son características de dichas propiedades.

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Los carbapenemos son unos antibióticos que pertenecen a la familia de las beta-lactaminas y tienen por principales representantes el imipenemo, el meropenemo, el ertapenemo y el doripenemo. Estas moléculas se degradan por las beta-lactamasas 2df, 2f y 3a de la clasificación de Bush et Jacoby ([9], Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2010; 54 (3): 969-976).

Por determinación de la resistencia a al menos un antimicrobiano, se entiende la determinación de la susceptibilidad de un microorganismo a ser destruido por un antimicrobiano. Las proteínas implicadas en los mecanismos de resistencia diferirán según la familia y la especie.

La nomenclatura de las beta-lactamasas, enzimas bacterianas de resistencia a las beta-lactaminas, no está estandarizada. Se clasifican en cuatro clases moleculares (A a D) en base a su estructura primaria, o bien en grupos funcionales en base a unos sustratos dianas y a su resistencia a los inhibidores (para una revisión, véase [9] Bush and Jacoby, supra). Para la clasificación molecular, las técnicas de secuenciación han permitido una clasificación más precisa: por ejemplo, se han descrito 183 variantes de la proteína TEM (anotados TEM-i, estando i comprendido entre 1 y 183). Para la clasificación funcional, Bush y Jacoby (supra) han propuesto nuevos sub-grupos funcionales:

- las enzimas del grupo 1 son unas cefalosporinasas que pertenecen a la clase molecular C.- CMY y FOX son unas enzimas, portadas por unos plásmidos, que pertenecen a este sub-grupo,

- las enzimas del grupo 2 que pertenecen a las clases moleculares A y D. Este grupo está el mismo subdividido en sub-grupos, 2b, 2be, 2br, 2ber, 2d, 2de, 2df, 2f, etc. CTX-M (2be) y tEm (del cual 2be, 2br) son unas enzimas que pertenecen a este sub-grupo. El sub-grupo 2b corresponde a unas beta-lactamasas de amplio espectro, inhibidas por el ácido clavulánico, el sulfobactamo o el tazobactamo. El sub-grupo 2be corresponde a unas beta-lactamasas de amplio espectro (BLSE), también inhibidas por el ácido clavulánico, el sulfobactamo o el tazobactamo. El subgrupo 2br corresponde a las beta-laxtamasas del sub-grupo 2b que son insensibles a la inhibición por el ácido clavulánico, el sulfobactamo o el tazobactamo. El sub-grupo 2df incluye los OXA que tienen un espectro amplio a los carbapenemos. El grupo 2f corresponde a las beta-lactamasas de tipo carbapenemasas tales como KPC.

- el grupo 3 agrupa las metalo-beta-lactamasas que hidolizan los carbapenemos, tales como IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, AIM, KHM, DIM o NDM.

La beta-lactamasa de tipo NDM-1 se ha descrito en 2010 (Kumarasamy et al., 2010, Lancet Infect. Dis., 10:597-602). Corresponde a una metalo-beta-lactamasa que confiere una resistencia a todas las beta-lactaminas salvo elaztreonam.

Las beta-lactamasas de tipo KPC se han descrito a partir de 2001 en los Estados Unidos de América (Yigit et al., 2001, Antimicrobio. Agents Chemother., 45:1151-1161), después en todo el mundo. Corresponden a unas beta- lactamasas de clase A que confieren una resistencia a las cefalosporinas y a los carbapenemos, en particular al imipenemo y al meropenemo.

Las beta-lactamasas de tipo IMP se describieron a partir de 1994 en Japón (Osano et al., 1994, Antimicrobio. Agents Chemother., 38:71-78) después en todo el mundo. Corresponden a metalo-beta-lactamasas que confieren una resistencia a las cefalosporinas y a los carbapenemos pero no confieren resistencia a la Temocillina y al aztreonam.

Las beta-lactamasas de tipo VIM se describieron a partir de 1999 en Europa (Lauretti et al., 1999, Antimicrobio. Agents Chemother., 43:1584-1590) después en la totalidad del mundo. Corresponden a unas metalo-beta- lactamasas que confieren una resistencia a las cefalosporinas y a los carbapenemos pero no confieren resistencia al aztreonam.

La primera beta-lactamasa de tipo GES se aisló en 1998 en Guyana francesa (Poirel et al., 2000, Antimicrobio. Agents Chemother., 43:622-632). Esta enzima (GES-1) confería una resistencia de tipo BLSE (ESBL). El segundo aislado de una bacteria que tiene una beta lactamasa de tipo GES se ha realizado en 2000 en Sudáfrica (Poirel et al., 2001, Antimicrobio. Agents Chemother., 45:2598-2603). Esta enzima (GES-2) confería una resistencia a las aux cefalosporinas y a los carbapenemos tales como el imipenemo.

Las beta-lactamasas de tipo IND se describieron por primera vez en 1999 (Bellais et al., 1999, FEMS Microbio. Lett., 171:127-132). Corresponden a unas metalo-beta-lactamasas que confieren una resistencia a las cefalosporinas y a los carbapenemos.

Las beta-lactamasas de tipo SME se describieron por primera vez en 1994 (Naas et al., 1994, Antimicrobio. Agents Chemother., 38:1262-1270). Corresponden a unas beta-lactamasas de clase A que confieren una resistencia a las cefalosporinas y a los carbapenemos.

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Las beta-lactamasas de tipo OXA (o oxacilinasas) corresponden a unas beta-lactamasas de clase D. Según su secuencia primeria, pueden conferir unas resistencias a las cefalosporinas o a las cefalosporinas y a los carbapenemos (Poirel et al., 2010, Antimicrobio. Agents Chemother., 54:24-38).

El procedimiento de la invención se puede utilizar para detectar unos mecanismos de resistencia a los carbapenemos en bacterias. Así, por ejemplo, a título de bacterias en las que es posible buscar un mecanismo de resistencia a los carbapenemos según el procedimiento de la invención, se puede citar, de manera no exhaustiva: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Bacillus spp, Stenotrophomonas maltophilia, Aeromonas spp, Bacteroides fragilis, Pseudomonas otitidis y Enterobacter cloacae, y de manera más general, las Enterobacteriaceae, que tienen el gen de resistencia blaNDM-1 o blaKPC. Cabe señalar por otro lado que las cepas conocidas como resistentes a los carbapenemos son también resistentes a las cefalosporinas y a las penicilinas. Así, el procedimiento según la invención permite también detectar un mecanismo de resistencia a dichos antibióticos.

La muestra sobre la cual el procedimiento de la invención se puede utilizar es cualquier muestra susceptible de contener un microorganismo diana. La muestra puede ser de origen biológico, o bien animal, vegetal o humano. Puede entonces corresponder a una extracción de fluido biológico (sangre total, suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, secreción orgánica, por ejemplo), una extracción tisular o unas células aisladas. Esta extracción se puede utilizar tal cual en la medida en la que los marcadores de los mecanismos de resistencia de las bacterias a las beta-lactaminas están disponibles en la muestra ensayada, o bien puede sufrir previamente al análisis una preparación de tipo enriquecimiento, extracción, concentración, purificación, cultivo, según unos métodos conocidos por el experto en la materia.

La muestra puede ser de origen industrial, o bien, según una lista no exhaustiva una extracción de aire, una extracción de agua, una extracción efectuada sobre una superficie, una pieza o un producto manufacturado, un producto de origen alimenticio. Entre las muestras de origen alimenticio, se puede citar de manera no exhaustiva una muestra de producto lácteo (yogures, quesos), carne, pescado, huevo, fruta, vegetales, agua, bebida (leche, zumo de fruta, soda, etc.). Estas muestras de origen alimenticio pueden también proceder de salsas o de platos elaborados. Una muestra alimenticia puede, finalmente proceder de una alimentación destinada a los animales, tales como en particular unas harinas animales.

En una fase temprana de la detección por espectrometría de masa, la muestra a analizar está preferiblemente tratada previamente para generar unos péptidos a partir del conjunto de las proteínas presentes en la muestra para fragmentar estas proteínas en péptidos, por ejemplo por digestión con una enzima proteolítica (proteasa), o por acción de un reactivo químico. En efecto, la escisión de las proteínas puede llevarse a cabo por un tratamiento físico-químico, por un tratamiento biológico o por una combinación de los dos tratamientos. Entre los tratamientos utilizables, se puede citar el tratamiento por unos radicales hidroxilo, en particular con H2O2. El tratamiento por los radicales hidroxilo provoca un corte de las uniones peptídicas que se realiza de manera aleatoria sobre cualquier enlace peptídico de la proteína. La concentración en radicales hidroxilo condiciona el número de escisiones realizadas y, por lo tanto, la longitud de los fragmentos peptídicos obtenidos. Otros tratamientos químicos pueden también utilizarse como, por ejemplo, el tratamiento con bromuro de cianógeno (CNBr) que escinde específicamente los enlaces peptídicos a nivel del grupo carboxílico de los restos de metionilo. Es también posible realizar una escisión ácida parcial a nivel de los restos aspartilo por calentamiento a 1000°C de una solución de proteínas en el ácido trifluoroacético.

El tratamiento de las proteínas por digestión enzimática es no obstante preferido con respecto al tratamiento físico- químico, ya que preserva más la estructura de las proteínas, y es más fácil de controlar. Por “digestión enzimática” se entiende la acción simple o combinada de una o varias enzimas en condiciones de reacción apropiadas. Las enzimas que efectúan la proteólisis, denominadas proteasas, cortan las proteínas en sitios específicos. Cada proteasa reconoce generalmente una secuencia de aminoácidos dentro de la cual se efectúa siempre el mismo corte. Algunas proteasas reconocen un solo aminoácido o una secuencia de dos aminoácidos entre los cuales realizan una escisión, otras proteasas reconocen solo unas secuencias más largas. Estas proteasas pueden ser unas endoproteasas o unas exoproteasas. Entre las proteasas conocidas, se pueden citar, como se describe en el documento WO2005/098071:

- las enzimas específicas como la tripsina que escinde el enlace peptídico a nivel de grupo carboxílico de los restos Arg y Lys, la endolisina que escinde la unión peptídica del grupo -CO de las lisinas, la quimotripsina que hidrolisa la unión peptídica a nivel del grupo carboxílico de los restos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), la pepsina que corta a nivel del grupo NH2 unos restos aromáticos (Phe, Tyr y Trp), la proteasa V8 de la cepa V8 de Staphylocossus aureus que escinde el enlace peptídico a nivel del grupo carboxílico del resto Glu;

- las enzimas no específicas como la termolisina que proviene de la bacteria Bacillus thermoproteolyticus que hidroliza el enlace peptídico del grupo NH2 de los aminoácidos hidrófobos (Xaa-Leu, Xaa-Ile, Xaa-Phe), la subtilisina y la pronasa que son unas proteasas bacterianas que hidrolizan prácticamente todos los enlaces y pueden transformar las proteínas en oligopéptidos en condiciones de reacción controladas (concentración en enzima y duración de reacción).

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Varias proteasas pueden utilizarse de manera simultánea, si sus modos de acción son compatibles, o pueden utilizarse de manera sucesiva. En el ámbito de la invención, la digestión de la muestra se realiza, preferiblemente, por acción de una enzima proteasa, por ejemplo la tripsina.

La generación de péptidos con la ayuda de un reactivo químico o de una proteasa se puede obtener por simple reacción en solución. Puede también realizarse con un horno microondas [10], o bajo presión [11], o también con un dispositivo de ultrasonidos [12]. En estos tres últimos casos, el protocolo será mucho más rápido.

Entre los péptidos así obtenidos, los péptidos específicos de la proteína se denominan péptidos proteotípicos. Son ellos que se dosificarán por espectrometría de masa.

Según la invención, los marcadores de los mecanismos de resistencia de las bacterias a los carbapenemos son unas proteínas de la bacteria en la que deben buscarse los mecanismos de resistencia a los carbapenemos. En particular, dichas proteínas se digieren en péptidos, preferiblemente por una enzima, más preferentemente por la tripsina.

Asimismo, la muestra que contiene unos marcadores proteicos de caracterización de los mecanismos de resistencia de las bacterias con carbapenemos puede también tratare previamente con fines de purificación. Este tratamiento previo de purificación se puede llevar a cabo antes o después de la etapa de generación de péptidos tal como se ha descrito anteriormente.

El tratamiento previo de purificación de muestra es ampliamente conocido por el experto en la materia y podrá en particular utilizar unas técnicas de centrifugación, filtración, electroforesis o cromatografía. Estas técnicas separativas pueden utilizarse solas o combinadas entre sí para obtener una separación multidimensional. Por ejemplo, una cromatografía multidimensional puede utilizarse asociando una separación por cromatografía de intercambio de iones a una cromatografía en fase inversa, como se describe por T. Fortin et al. [13], o H. Keshishian et al. [14]. En estas publicaciones, el medio cromatográfico puede estar en columna o en cartucho (extracción en fase sólida).

La fracción electroforética o cromatográfica (o el tiempo de retención en cromatografía mono o multidimensional) de los péptidos proteotípicos es característico de cada péptido y la utilización de estas técnicas permite por lo tanto seleccionar el o los péptidos proteotípicos a determinar. Tal fraccionamiento de los péptidos generados permite incrementar la especificidad de la determinación ulterior por espectrometría de masa.

Una alternativa a las técnicas de electroforesis o de cromatografía, para el fraccionamiento de los péptidos, consiste en purificar específicamente los N-glicopéptidos ([15] y solicitud de patente WO 2008/066629). Sin embargo, tal purificación permite sólo la cuantificación de los péptidos que han sufrido una modificación post-traduccional de tipo N-glicosilación. Ahora bien, todas las proteínas no son glicosiladas, lo que limita por lo tanto su utilización.

La espectrometría de masas a utilizar en el procedimiento de la invención es ampliamente conocida por el experto en la materia como una herramienta potente para el análisis y la detección de diferentes tipos de moléculas. De manera general, cualquier tipo de molécula que puede ionizarse puede detectarse en función de su masa molecular con la ayuda de un espectrómetro de masa. Según la naturaleza de la molécula a detectar, de origen proteico o metabólico, algunas tecnologías de espectrometría de masa pueden ser más adecuadas. Sin embargo, sea cual sea el método de espectrometría de masa utilizado para la detección, este último comprende una etapa de ionización de la molécula diana en iones denominados moleculares, en el presente caso, una etapa de ionización de los marcadores de caracterización, y una etapa de separación de los iones moleculares obtenidos en función de su masa.

Todos los espectrómetros de masa comprenden por lo tanto:

- una fuente de ionización destinada a ionizar los marcadores presentes en la muestra a analizar, es decir a conferir una carga positiva o negativa a estos marcadores;

- un analizador de masa destinado a separar los marcadores ionizados, o iones moleculares, en función de su relación masa sobre carga (m/z);

- un detector destinado a medir la señal producida o bien directamente por los iones moleculares, o bien por unos iones producidos a partir de iones moleculares, como se detallan a continuación.

La etapa de ionización necesaria para la realización de una espectrometría de masa se puede realizar mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia. La fuente de ionización permite llevar las moléculas a determinar bajo un estado gaseoso e ionizado. Una fuente de ionización puede utilizarse o bien en modo positivo para estudiar los iones positivos, o bien en modo negativo para estudiar los iones negativos. Varios tipos de fuentes existen y se utilizaran en función del resultado buscado y de las moléculas analizadas. Se puede citar, en particular:

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- la ionización electrónica (EI), la ionización química (CI) y la desorción-ionización química (DCI)

- el bombardeo por átomos rápidos (FAB), átomos metastables (MAB) o iones (SMS, LSMIS)

- el acoplamiento plasma inductivo (ICP)

- la ionización química a presión atmosférica (APCI) y la fotoionización a presión atmosférica (APPI)

- la electronebulización o electrosray (ESI)

- la desorción-ionización láser asistida por matriz (MALDI), activada por una superficie (SELDI) o sobre silicio (DIOS)

- la ionización-desorción por interacción con especies metastables (DART)

En particular, la ionización se puede llevar a cabo de la siguiente manera: la muestra que contiene las moléculas dianas se introduce en una fuente de ionización, en la que las moléculas se ionizan en estado gaseoso y se transforman así en iones moleculares que corresponden a las moléculas iniciales. Una fuente de ionización de tipo electrospray (ESI por ElectroSpray Ionisation) permite ionizar una molécula haciéndola pasar al mismo tiempo de un estado líquido a un estado gaseoso. Los iones moleculares obtenidos corresponden entonces a las moléculas presentes en estado líquido con, en modo positivo, uno, dos, incluso tres protones suplementarios o más y son por lo tanto portadores de una, dos, incluso tres cargas o más. Por ejemplo, cuando la molécula diana es una proteína, una ionización de los péptidos proteotípicos obtenidos después del fraccionamiento de la proteína diana, gracias a una fuente de tipo electrospray que funciona en modo positivo, conduce a unos iones polipeptídicos en estado gaseoso, con uno, dos, incluso tres protones suplementarios o más y que son por lo tanto portadores de una, dos, incluso tres cargas o más, y permite un paso de un estado líquido a un estado gaseoso [16]. Este tipo de fuente es particularmente muy adecuada cuando las moléculas dianas o péptidos proteotípicos obtenidos se separan previamente por cromatografía líquida en fase inversa. No obstante, el rendimiento de ionización de las moléculas presentes en la muestra puede variar en función de la concentración y de la naturaleza de las diferentes especies en presencia. Este fenómeno se traduce por un efecto matriz bien conocido por el experto en la técnica.

Una fuente de ionización MALDI permitirá ionizar unas moléculas, a partir de una muestra en estado sólido.

El analizador de masa en el que se realiza la etapa de separación de los marcadores ionizados en función de su relación masa/carga (m/z) es cualquier analizador de masa conocido por el experto en la materia. Se pueden citar los analizadores de baja resolución, del tipo cuadripolo o cuadrupolo (Q), trampa de iones 3D (IT) o lineal (LIT), también denominados trampa iónica, y los analizadores de alta resolución, que permiten medir la masa exacta de los analitos y que utilizan en particular el sector magnético acoplado a un sector eléctrico, el tiempo de vuelo (TOF), la resonancia ciclotrónica iónica por transformada de Fourier (FT-ICR), la orbitrampa.

La separación de los iones moleculares en función de su relación m/z se puede llevar a cabo una sola vez (espectrometría de masa simple o MS), o bien varias separaciones MS pueden ser llevadas a cabo. Cuando se realizan dos separaciones Ms sucesivas, el análisis se denomina MS/MS o MS2. Cuando se realizan tres separaciones MS sucesivas, el análisis se denomina MS/MS/MS o MS3 y más generalmente, y cuando se realizan n separaciones MS sucesivas, el análisis se denomina MSn.

Entre las técnicas que utilizan varias separaciones sucesivas, los modos SRM (Selected Reaction Monitoring) en caso de detección o determinación de una única molécula diana, o bien MRM (Multiple Reaction Monitoring) en caso de detección o determinación de varias moléculas dianas, son unas utilizaciones particulares de separación MS2. Así como el modo MRM3 es una utilización particular de separación en MS/MS/MS. Se habla entonces de espectrometría de masa diana.

En el caso de una detección en modo MS simple, es la relación masa/carga de los iones moleculares obtenidos que se correlaciona con la molécula diana a detectar.

En el caso de una detección en modo MS/MS, se añaden esencialmente dos etapas con respecto a una determinación MS, que son:

- una fragmentación de los iones moleculares, entonces denominados iones precursores, para dar unos iones denominados fragmentos de 1a generación, y

- una separación de los iones denominados iones fragmentos de ia generación en función de su masa (m/z)2, correspondiente la relación (m/z)i a la relación (m/z) de los iones precursores.

Es entonces la relación masa/carga de los iones fragmentos de ia generación así obtenidos que se correlaciona con la molécula diana a detectar. Por ion fragmento de primera generación, se entiende un ion procedente del ion

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precursor, tras una etapa de fragmentación y cuya relación masa sobre carga m/z es diferente del ion precursor.

Las parejas (m/z)1 y (m/z)2 son bautizadas transiciones y son representativas de los iones característicos a detectar,

La elección de los iones característicos que se detectan para correlacionarse con la molécula diana se efectúa por el experto en la materia según los métodos estándar. Su selección conducirá ventajosamente a determinaciones lo más sensibles, lo más específicas y lo más fuerte posibles, en términos de reproducibilidad y fiabilidad. En los métodos desarrollados para la selección de péptidos proteotípicos (m/z)1, y de fragmento de primera generación (m/z)2, la elección se basa esencialmente en la intensidad de la respuesta. Para más detalles, se podrá hacer referencia a V. Fusaro et al. [17]. Programas comerciales, tales como los programas MIDAS y MRM Pilote de Applied Biosystems o también MRMaid [18] se podrán utilizar por el experto en la técnica para permitirle predecir todas las parejas de transiciones posibles. Podrá también utilizar una base de datos denominada PeptideAtlas, construida por F. Desiere et al. [19] para compilar el conjunto de las transiciones MRM de péptidos descritas por la comunidad científica. Esta base PeptideAtlas está disponible en acceso libre en Internet. Para unas moléculas no proteicas, es también posible utilizar unas bases de datos, tales como por ejemplo la accesible a través del programa Cliquid de la compañía Applied Biosystems (Estado Unidos de América).

Un enfoque alternativo para seleccionar los péptidos proteotípicos, (m/z)1, y (m/z)2 consiste en utilizar los espectros de fragmentación MS/MS obtenidos para la ocasión de otros trabajos. Estos trabajos pueden, por ejemplo, ser las fases de descubrimiento y de identificación de los biomarcadores por análisis proteómico. Este enfoque se ha propuesto por Thermo Scientific durante reuniones de usuarios [18]. Permite generar una lista de transiciones candidatas a partir de los péptidos identificados experimentalmente por el programa SIEVE (Thermo Scientific). Algunos criterios se detallaron por J. Mead et al. [18] para la elección de los iones (m/z)1 y (m/z)2 y se detallan a continuación:

- se deben evitar los péptidos con unos sitios de escisión interna, es decir con lisina o arginina interna, salvo si la lisina o la arginina va seguida por prolina,

- deben evitarse los péptidos con asparagina o glutamina, ya que no se pueden desaminar,

- deben evitarse los péptidos con glutamina o ácido glutámico en N-terminal, ya que pueden ciclizarse espontáneamente,

- deben evitarse los péptidos con la metionina, ya que pueden oxidarse,

- deben evitarse los péptidos con cisteína, ya que pueden modificarse de manera no reproducible durante una eventual etapa de desnaturación, reducción y bloqueo de las funciones tioles,

- pueden considerarse como favorables los péptidos con prolina ya que producen generalmente unos fragmentos intensos en MS/MS con un único pico muy mayoritario. Sin embargo, un único fragmento muy mayoritario no permite validar la identidad de la transición en una mezcla compleja. En efecto, sólo la presencia simultánea de varios fragmentos característicos permite verificar que el ion precursor buscado se detecta bien,

- los péptidos que tienen una prolina adyacente a C-terminal (posición n-1) o segunda posición con respecto a C- terminal (posición n-2) son a evitar ya que, en este caso, el tamaño del péptido fragmento de primera generación está generalmente considerado como demasiado pequeño para ser suficientemente específico,

- debe favorecerse la selección de fragmentos que tienen una masa superior al precursor para favorecer la especificidad. Para eso, se necesita seleccionar un ion precursor bicargado y seleccionar el ion fragmento de primera generación más intensa que tiene una masa superior al precursor, es decir un ion fragmento de primera generación monocargado.

La fragmentación de los iones precursores seleccionados se utiliza en una célula de fragmentación tal como los modelos de tipo triple cuadrípolo [20] o de tipo trampa iónica [21], o también de tipo tiempo de vuelo (TOF) [22], los cuales permiten también la separación de los iones. La o las fragmentaciones se realizarán clásicamente por colisión con un gas inerte tal como el argón o el nitrógeno, dentro de un campo eléctrico, por foto-excitación o fotodisociación con la ayuda de una fuente luminosa intensa, colisión con electrones o especies radicalarias, por aplicación de una diferencia de potencial, por ejemplo en un tubo de tiempo de vuelo, o por cualquier otro modo de activación. Las características del campo eléctrico condicionan la intensidad y la naturaleza de la fragmentación. Así, el campo eléctrico aplicado en presencia de un gas inerte, por ejemplo en un cuadrípolo, condiciona la energía de colisión aportada a los iones. Esta energía de colisión se optimizará por el experto en la materia, para incrementar la sensibilidad de la transición a dosificar. A título de ejemplo, es posible hacer variar la energía de colisión entre 5 y 180 a'V en q2 en un espectrómetro de masa AB SCIEX QTRAP® 5500 de la compañía Applied Biosystems (Foster City, Estados Unidos de América). Asimismo, la duración de la etapa de colisión y la energía de excitación dentro, por ejemplo, de una trampa iónica se optimizarán por el experto en la materia, para conducir a la determinación más sensible. A título de ejemplo, es posible hacer variar esta duración, bautizada tiempo de excitación, entre 0,010 y 50

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ms y la energía de excitación entre 0 y 1 (unidad arbitraria) en Q3 en un espectrómetro de masa AB SCIEX QTRAP® 5500 de la compañía Applied Biosystems.

Finalmente, la detección de los iones característicos seleccionados se realiza de manera clásica, en particular gracias a un detector y a un sistema de tratamiento. L detector recoge los iones y produce una señal eléctrica cuya intensidad depende de la cantidad de iones recogidos. La señal obtenida se amplifica después para que pueda tratarse informáticamente. Un conjunto informático de tratamiento de datos permite transformar las informaciones recibidas por el detector en espectro de masa.

El principio del modo SRM, o también del modo MRM, es seleccionar específicamente un ión precursor, fragmentarlo, y después seleccionar específicamente uno de sus fragmentos. Para tales aplicaciones, se utilizan generalmente unos dispositivos de tipo triple cuadripolo o unos híbridos triple cuadripolo con trampa iónica.

En el caso de un dispositivo triple cuadrípolo (Q1q2Q3) utilizado en modo MS2, para la determinación o la detección de una proteína diana, el primer cuadrípolo (Q1) permite filtrar los iones moleculares que corresponden a los péptidos proteotípicos característicos de la proteína a determinar y obtenido durante una etapa anterior de digestión, en función de su relación masa sobre carga (m/z). Sólo los péptidos que tienen la relación masa/carga del péptido proteotípico buscado, relación denominada (m/z)1, se transmiten en el segundo cuadrípolo (q2) y tienen el papel de iones precursores para la fragmentación ulterior. El analizador q2 permite fragmentar los péptidos de relación masa/carga (m/z)1 en iones fragmentos de primera generación. La fragmentación se obtiene en general por colisión de los péptidos precursores con un gas inerte, como nitrógeno o argón en q2. Los iones fragmentos de primera generación se transmiten en un tercer cuadrípolo (Q3) que filtra los iones fragmentos de primera generación en función de una relación masa sobre carga específica, relación denominada (m/z)2. Sólo los iones fragmentos de primera generación que tienen la relación masa/carga de un fragmento característico del péptido proteotípico buscado (m/z)2 se transmiten en el detector para detectarse, incluso cuantificarse. Este modo de funcionamiento presenta una doble selectividad, en relación con la selección del ion precursor por un lado y de la selección del ion fragmento de primera generación por otro lado. La espectrometría de masa en modo SRM o MRM es por lo tanto ventajosa para la cuantificación.

Cuando la espectrometría de masa utilizada en el procedimiento de la invención es una espectrometría de masas en tándem (MS2, MS3, MS4 o MS5), se pueden acoplar entre sí varios analizadores de masa. Por ejemplo, un primer analizador separa los iones, una célula de colisión permite fragmentar los iones, y un segundo analizador separa los iones fragmentos. Algunos analizadores, como las trampas de iones o el FT-ICR, constituyen varios analizadores en uno y permiten fragmentar los iones y analizar los fragmentos directamente.

Según unos modos de realización preferidos de la invención, el procedimiento de la invención comprende una o varias de las características siguientes:

- la espectrometría de masa, utilizada para las propiedades de resistencia potencial a al menos un antimicrobiano, es una espectrometría de tipo MS/MS, lo que tiene por ventaja generar un fragmento específico de la molécula a detectar o a cuantificar, y así aportar una gran especificidad al método de determinación;

- la espectrometría MS/MS es MRM, lo que tiene por ventaja utilizar un tiempo de ciclo de análisis en el espectrómetro de masa de algunas decenas de milisegundos, lo que permite detectar o cuantificar con una gran sensibilidad, y de manera multiplexada, un gran número de moléculas diferentes;

- llegado el caso, la determinación de las propiedades de tipaje, y del factor de virulencia se utiliza en el mismo aparato de espectrometría de masa que la determinación de los marcadores de resistencia a al menos un antimicrobiano, preferentemente de manera simultánea, lo que tiene por ventaja reducir el tiempo de análisis y el coste del instrumento, esto facilita también el tratamiento y el acabado de los resultados.

Además de la determinación de la resistencia a un antibiótico, conviene identificar el o los microorganismos presentes en la muestra a ensayar.

Los procedimientos de identificación de microorganismos se conocen ampliamente por el experto en la materia, como se describe por ejemplo por Murray P. R. el al. En Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9° edición, y en particular en el Vol. I, sección III, capítulos 15 y 16 para las bacterias y levaduras, Vol. II, sección VI, capítulo 82 para los virus, y Vol. II, sección X, capítulo 135 para los protozoos. A título de ejemplo de procedimientos clásicos de identificación, se puede citar la determinación del perfil biológico, utilizando por ejemplo las tarjetas de identificación de Vitek 2 (BioMérieux), o también utilizando unas técnicas de biología molecular con unos criterios de identificación basados en el estudio de la presencia de algunos genes, sobre el estudio de su secuencia.

La identificación se puede llevar a cabo directamente a partir de la muestra en la que se efectúa la identificación, o bien los microorganismos contenidos en la muestra pueden cultivarse por métodos bien conocidos por el experto en la materia con unos medios de cultivo y unas condiciones de cultivo óptimas adaptadas en función de las especies de microorganismos a buscar, como se describe por Murray P.R. et al. en Manuel of Clinical Microbiology, 2007, 9°

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edición, Vol. I, Sección III, capítulo 14, y en particular en el Vol. I, Sección IV, capítulo 21 para las bacterias, Vol. II, Sección VI, capítulo 81 para los virus, Vol. II, Sección VIII, capítulo 117 para las levaduras, y Vol. II, Sección X, capítulo 134 para los protozoos.

Así, de manera general, en el caso de una identificación mediante un método bioquímico de una bacteria en una muestra, se debe obtener primero en cultivo puro, por ejemplo después de una siembra sobre gelosa. La biología molecular (PCR) puede, en algunos casos, aplicarse directamente a la muestra a analizar.

En lugar de cultivar los microorganismos, estos últimos pueden concentrarse por captura directamente en la muestra mediante superficies activas. Tal procedimiento se ha descrito por W.-J. Chen et al. [10] que han capturado diferentes especies bacterianas con la ayuda de bolas magnéticas con una superficie activada con Fe3O4/TO2. Una captura mediante otros medios es también posible, tal como una captura por lectinas [23] o por anticuerpos [24], o también por Vancomicina [25]. La captura permite concentrar los microorganismos y así reducir o incluso suprimir la etapa de cultivo. Da como resultado una ganancia de tiempo considerable.

La identificación se puede realizar también por espectrometría de masa, según las técnicas descritas anteriormente, preferiblemente por MS, por MS/MS o por MS seguida de una espectrometría de tipo MS/MS, lo que constituye un modo de realización de la invención. En este caso también la muestra puede someterse previamente a una etapa de cultivo tal como una siembra sobre gelosa.

La utilización de un procedimiento de identificación por MS es ventajosa por que se puede realizar en algunos minutos y por que necesita un espectrómetro de masa con un solo analizador, es decir un instrumento menos complejo que un espectrómetro de masa en tándem utilizado en MS/MS.

La utilización de un procedimiento de identificación por MS seguido de una espectrometría de tipo MS/MS es también ventajosa. Permite asegurarse de la identidad de los iones observada en MS, lo que aumenta la especificidad del análisis.

La utilización de un procedimiento de identificación por MS/MS de tipo MRM presenta la ventaja de ser más sensible y más simple que los enfoques MS y después MS/Ms tradicional. Este procedimiento no necesita ni programa eficaz para tratar la información entre la adquisición del espectro MS y del espectro MS/MS, ni cambio del ajuste de los parámetros de las máquinas para encadenar unos espectros MS y después MS/MS.

El procedimiento de identificación por MS se puede llevar a cabo con una fuente electrospray sobre muestra bruta, como se describe por S. Vaidyanathan et al. [26] o también por R. Everley et al. [27] después de la separación cromatográfica. Diferentes gamas de m/z permiten identificar los microorganismos. S. Vaidyanathan et al. han utilizado una ventana entre 200 y 2000 Th, y R. Everley et al. una ventana entre 620 y 2450 Th. Los espectros de masa pueden también deconvolucionarse para acceder a la masa de las proteínas independientemente de su estado de carga. R. Everley et al. han explotado así las masas entre aproximadamente 5 000 y 50 000 Da. De manera alternativa, el procedimiento de identificación por MS puede también utilizarse con la ayuda de un MALDI- TOF, como se describe por Claydon et al. [3] y T. Krishnamurthy y P. Ross [4]. El análisis asocia la adquisición de un espectro de masa y la interpretación de un programa experto. Es extremadamente simple y puede efectuarse en algunos minutos. Este procedimiento de identificación se difunde actualmente en los laboratorios de análisis médico [28].

La identificación de bacterias por MS y después MS/MS a través de sus proteínas presentes en la muestra, se ha aplicado ampliamente por numerosos equipos. A título de ejemplo, es posible citar los trabajos recientes de Manes N. et al. [29] que han estudiado el peptídomo de Salmonella entérica, o los trabajos de R. Nandakumar et al. [30] o de L. Hernychova et al. [31] que han estudiado el proteoma de bacterias después de la digestión de las proteínas con tripsina. El enfoque clásico consiste en i) adquirir un espectro MS, ii) seleccionar sucesivamente cada ion precursor observado sobre el espectro MS con una señal intensa, iii) fragmentar sucesivamente cada ion precursor y adquirir su espectro MS/MS, iv) examinar unas bases de datos proteicos tales como SWISS-PROT o NCBI, a través de programas tales como Mascot (MAtrix Science, Londres, Reino Unidos), o SEQUEST (Thermo Scientific, Waltham, Estados Unidos de Am'rica), para identificar el péptido que tiene una fuerte probabilidad de corresponder al espectro MS/MS observado. Este método puede conducir a la identificación de un microorganismo si se identifica una proteína o un péptido característico de la especie.

Una de las ventajas de la utilización de la espectrometría de masa reside en que es particularmente útil para cuantificar unas moléculas, en el presente caso los marcadores de los mecanismos de resistencia de las bacterias a las beta-lactaminas. Para hacer esto, se utiliza la intensidad de corriente detectada, la cual es proporcionar a la cantidad de molécula diana. La intensidad de corriente así medida podrá servir de medida cuantitativa que permite determinar la cantidad de molécula diana presente, la cual se caracteriza por su expresión en unidades del Sistema Internacional (SI) de tipo mol/m3 o kg/m3, o por los múltiples o sub-múltiples de estas unidades, o por las derivadas habituales de las unidades SI, incluyendo sus múltiplos o sub-múltiplos. A título de ejemplo no limitativo, las unidades tales como ng/ml o fmol/l son unas unidades que caracterizan una medición cuantitativa.

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Una calibración es no obstante necesaria para poder correlacionar el área del pico medido, que corresponde a la intensidad de corriente inducida por los iones detectados, a la cantidad de molécula diana a determinar. Para ello, las calibraciones clásicamente utilizadas en espectrometría de masa podrán utilizarse, en el ámbito de la invención. Las determinaciones MRM se calibran clásicamente con la ayuda de estándares externos o, preferentemente, con la ayuda de estándares internos tales como se describe por T- Fortin et al. [13]. En el caso en el que la molécula diana es un péptido proteotípico, que permite determinar una proteína de interés, la correlación entre la medición cuantitativa y la cantidad de péptido proteotípico diana, y a continuación de proteína de interés, se obtiene calibrando la señal medida con respecto a una señal patrón para la cual la cantidad a determinar es conocida. La calibración se puede realizar mediante una curva de calibración, por ejemplo obtenida por inyecciones sucesivas de péptido proteotípico patrón a diferentes concentraciones (graduación externa), o de manera preferida, por calibración interna utilizando un péptido pesado, como estándar interno, por ejemplo conforme a los métodos AQUA, QconCAT o PSAQ detallados a continuación. Por “péptido pesado” se entiende un péptido que corresponde al péptido proteotípico, pero en el que uno o varios átomos de carbono 12 (12C) está(n) sustituido(s) por carbono 13 (13c), y/o uno o varios átomos de nitrógeno 14 (14N) está(n) sustituido(s) por nitrógeno 15 (15N).

La utilización de péptidos pesados, como estándares internos (AQUA) también se ha propuesto en la solicitud de patente US 2004/0229283. El principio es sintetizar artificialmente unos péptidos proteotípicos con unos aminoácidos que comprenden unos isotopos más pesados que los isotopos naturales habituales. Tales aminoácidos se obtienen, por ejemplo, sustituyendo algunos de los átomos de carbono 12 (12C) por carbono 13 (13C), o sustituyendo algunos de los átomos de nitrógeno 14 (14N) por nitrógeno 15 (15N). El péptido artificial (AQUA) así sintetizado tiene rigurosamente las mismas propiedades fisicoquímicas que el péptido natural (con la excepción de una masa más elevada). Se añade generalmente, a una concentración dada, a la muestra, antes de la determinación por espectroscopía de masa, por ejemplo entre el tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas de la muestra de interés y el fraccionamiento de los péptidos obtenidos después de la etapa de tratamiento. Así, el péptido AQUA se co-purifica con el péptido natural a determinar, durante el fraccionamiento de los péptidos. Los dos péptidos se inyectan, por lo tanto, simultáneamente en el espectrómetro de masas, para la determinación. Sufren entonces los mismos rendimientos de ionización en la fuente. La comparación de las áreas de pico de los péptidos naturales y AQUA, cuya concentración es conocida, permite calcular la concentración del péptido natural y subir así a la concentración de la proteína a determinar. Una variante de la técnica AQUA se ha propuesto por J.-M. Pratt et al. [32] bajo el nombre de QconCat. Esta variante se describe también en la solicitud de patente WO 2006/128492. Consiste en concatenar diferentes péptidos AQUA y producir el polipéptido artificial en forma de proteína recombinante pesada. La proteína recombinante se sintetiza con unos aminoácidos que comprenden unos isótopos pesados. De esta manera, es posible obtener un estándar para calibrar la determinación simultánea de varias proteínas a menor coste. El estándar QconCAT se añade al principio, antes del tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas y antes de las etapas de fraccionamiento de las proteínas, de desnaturalización, de reducción y después de bloqueo de las funciones tioles de las proteínas, si estas están presentes. El estándar QconCAT sufre por lo tanto el mismo ciclo de tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas que la proteína natural, lo que permite tener en cuenta el rendimiento de la etapa de tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas. En efecto, el tratamiento, en particular por digestión, de la proteína natural, puede no ser completo. En este caso, la utilización de un estándar AQUA conduciría a sub-estimar la cantidad de proteína natural. Para una determinación absoluta, puede por lo tanto ser importante tener en cuenta unos rendimientos de tratamiento que conlleva la escisión de las proteínas. Sin embargo, V. Brun et al. [33] han mostrado que, a veces, los estándares QconCAT no reproducían exactamente el rendimiento de tratamiento, en particular por digestión de la proteína natural, sin duda debido a una conformación tridimensional diferente de la proteína QconCAT.

V. Brun et al. [33] han propuesto entonces utilizar un método bautizado PSAQ y descrito en la solicitud de patente WO 2008/145763. En este caso, el estándar interno es una proteína recombinante, que tiene la misma secuencia que la proteína natural pero sintetizada con unos aminoácidos pesados. La síntesis se realiza ex vivo con unos aminoácidos pesados. Este estándar tiene rigurosamente las mismas propiedades fisicoquímicas que la proteína natural con la excepción de una masa más elevada). Se añade al principio, antes de la etapa de fraccionamiento de las proteínas, cuando esta última está presente. Por lo tanto, está co-purificado con la proteína nativa, durante la etapa de fraccionamiento de las proteínas. Presenta el mismo rendimiento de tratamiento, en particular por digestión, que la proteína nativa. El péptido pesado obtenido después de la escisión también se co-purifica con el péptido natural, si se realiza una etapa de fraccionamiento de los péptidos. Los dos péptidos se inyectan, por lo tanto, simultáneamente en el espectrómetro de masas, para determinarse cuantitativamente. Sufren entonces los mismos rendimientos de ionización en la fuente. La comparación de las áreas de pico de los péptidos naturales y de los péptidos de referencia en el método PSAQ permite calcular la concentración de la proteína a determinar teniendo en cuenta la totalidad de las etapas del procedimiento de determinación.

En el ámbito de la invención, se podrá utilizar el conjunto de estas técnicas, a saber AQUA, QconCAT o PSAQ o cualquier otra técnica de calibración, utilizada en determinaciones por espectrometría de masa y en particular en las determinaciones MRM o MS, para efectuar la calibración.

De manera preferida, la espectrometría de masa utilizada en el procedimiento de detección según la invención es de tipo MS/MS. Más preferiblemente, la espectrometría de masa es la MRM.

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El procedimiento de la invención permite la detección de resistencias a los carbapenemos, caracterizada por la detección de al menos un péptido como marcador de resistencia. De manera preferida, dicho péptido marcador de resistencia pertenece a las proteínas NDM, KPC, GES, IMP, IND, SME, VIM u OXA.

En particular, la detección de un mecanismo de resistencia a los carbapenemos, inducida por la expresión de una proteína NDM, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a una proteína NDM y a sus diferentes variantes de secuencias SEQ ID N° 1 y SEQ ID N° 1078 a SeQ ID N°1080.

SEQ ID N° 1 :

MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGDLVFRQLAP

NVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLWDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLP

VALAWTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANG

WVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDA

DTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR

SEQ ID N°1078

MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMAGEIRPTIGQQMETGDQRFGDLVFRQLAP

NVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLWDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLP

VALAWTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANG

WVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDA

DTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR

SEQ ID N°1079

MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGDLVFRQLAP

NVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLLVDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLP

VALAWTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGLVAAQHSLTFAANG

WVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDA

DTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR

SEQ ID N°1080

MELPNIMHPVAKLSTALAAALMLSGCMPGEIRPTIGQQMETGDQRFGDLVFRQLAP

NVWQHTSYLDMPGFGAVASNGLIVRDGGRVLWDTAWTDDQTAQILNWIKQEINLP

VALAWTHAHQDKMGGMDALHAAGIATYANALSNQLAPQEGMVAAQHSLTFAANG

WVEPATAPNFGPLKVFYPGPGHTSDNITVGIDGTDIAFGGCLIKDSKAKSLGNLGDA

DTEHYAASARAFGAAFPKASMIVMSHSAPDSRAAITHTARMADKLR

seleccionándose dichos péptidos, preferentemente, entre los péptidos de secuencia SEQ ID N°2 a SEQ ID N°9 y SEQ ID N°1083 tales como se definen a continuación:

Péptido SEQ ID N°

Secuencia de aminoácidos Posición del péptido en la o las proteínas NDM

SEQ ID N°2

AAIYHTAR 257-264 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°3

AFGAAFPK 235-242 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°4

ASMIVMSHSAPDSR 243-256 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°5

FGDLVFR 46-52 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°6

MELPNIMHPVAK 1-12 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°7

QEINLPVALAVVTHAHQDK 107-125 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°8

SLGNLGDADTEHYAASAR 217-234 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1079, 1080

SEQ ID N°9

VLVVDTAWTDDQTAQILNWIK 86-106 para las proteínas de SEQ N°1, 1078, 1080

SEQ ID N°1081

LSTALAAALMLSGCMAGEIR 13-32 para la proteína de SEQ N°1078

SEQ ID N°1082

LSTALAAALMLSGCMPGEIR 13-32 para la proteína de SEQ N°1, 1079, 1080

SEQ ID N°1083

VLLVDTAWTDDQTAQILNWIK 86-106 para la proteína de SEQ N°1079

De manera preferida, los marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo NDM, seleccionados entre los péptidos de secuencia SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, SEQ ID N°5, o SEQ ID N°7.

La detección de un mecanismo de resistencia a los carbapenemos, inducido por la expresión de una proteína KPC, se caracteriza por la detección de al menos un péptido que pertenece a una proteína KPC y a sus diferentes variantes de secuencias SEQ ID N° 10 a SEQ ID N°19 y SEQ ID N°1084 a SEQ ID N°1093.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de detección, por espectrometría de masa de tipo MS/MS en modo MRM, para al menos un microorganismo comprendido en una muestra, de al menos un marcador de resistencia a al menos un

   5 antimicrobiano, que es un carbapenemo, seleccionándose dichos marcadores de resistencia unos marcadores de tipo KPC, entre los péptidos de secuencia SEQ ID N°20 a SEQ ID N°33, SEQ ID N°1094, SEQ ID N°1096 y SEQ ID N°1097.
2. 2. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que los péptidos se obtienen por digestión de 10 proteínas de dichos microorganismos.
3. 3. Procedimiento de detección según la reivindicación 2, en el que la digestión se realiza por una enzima.
4. 4. Procedimiento de detección según la reivindicación 3, en el que la enzima es la tripsina.

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5. 5. Procedimiento de detección según la reivindicación 1, en el que los marcadores de resistencia son unos marcadores de tipo KPC, seleccionados entre los péptidos de secuencia SEQ ID N°20, SEQ ID N°21, SEQ ID N°23, SEQ ID N°25, SEQ ID N°28, SEQ ID N°29, SEQ ID N°31, o SEQ ID N°32.

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