ES2703324T3 - Identificación de mutaciones de canalrodopsina-2 (Chop2) y métodos de uso - Google Patents
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Abstract
Molécula de polipéptido aislado que comprende SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 es cisteína (C) y el aminoácido en posición 159 es cisteína (C) o serina (S).
Description
DESCRIPCIÓN
Identificación de mutaciones de canalrodopsina-2 (Chop2) y métodos de uso
Apoyo del gobierno
Esta invención se realizó con apoyo del gobierno de los EE. UU. con la subvención NIH EY 17130 de los Institutos Nacionales de la Salud/Instituto Nacional del Ojo. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Campo de la invención
Esta invención se refiere generalmente al campo de biología molecular. Se identifican mutaciones en el gen de canalopsina-2 (Chop2). Se usan composiciones que comprenden un gen mutante de Chop2 en métodos terapéuticos para mejorar y restablecer pérdida de visión.
Antecedentes de la invención
La retina se compone de fotorreceptores (o células fotorreceptoras, bastones y conos). Los fotorreceptores son neuronas altamente especializadas que son responsables de la fototransducción, o la conversión de luz (en forma de radiación electromagnética) en señales químicas y eléctricas que propagan una cascada de eventos dentro del sistema visual, generando finalmente una representación de nuestro mundo.
La pérdida o degeneración de fotorreceptores compromete gravemente, si no impide completamente, la fototransducción de información visual dentro de la retina. La pérdida de células fotorreceptoras y/o pérdida de una función de células fotorreceptoras son las causas principales de agudeza visual reducida, sensibilidad lumínica reducida y ceguera. Existe una necesidad desde hace mucho tiempo en la técnica de composiciones y método que restablezcan la fotosensibilidad de la retina de un sujeto que experimenta pérdida de visión. Kleinlogel, S. et al. (2011), Nature Neuroscience; 14: 513-518 describen la sensibilidad lumínica y permeabilidad al Ca2+ de canalrodopsina que transloca calcio (CatCh). Rein, M. L., et al. (2012), Mol Genet Genomics; 287(2): 95-109 describen enfoques optogenéticos.
Sumario de la invención
La invención proporciona una solución para la necesidad desde hace mucho tiempo de un método de restablecer y/o mejorar la sensibilidad lumínica de células fotorreceptoras mediante expresión de mutaciones ventajosas, y/o combinaciones de las mismas, del gen de canalopsina-2 (Chop2), y posteriormente proporcionar métodos para terapia génica basada en canalopsina-2 (Chop2).
La terapia génica basada en canalopsina-2 (Chop2) ofrece una estrategia superior para restablecer fotosensibilidad retiniana después de degeneración de fotorreceptor. El producto de proteína del gen de Chop2, cuando se une al cromóforo isomerizable por luz todo-trans-retinal, forma un canal regulado por luz funcional, llamado canalrodopsina-2 (ChR2). ChR2 nativo muestra baja sensibilidad lumínica. Recientemente, se notificaron que dos mutantes de ChR2s, L132C y T159C, aumentaron notablemente su sensibilidad lumínica (Kleinlogel et al. (2011) Nat Neurosci.
14:513-8; Berndt et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA. 108:7595-600; Prigge et al. (2012) J Biol Chem.
287(38)3104:12). Se examinaron las propiedades de estos dos mutantes de ChR2 (es decir, L132C y T159C) y se compararon con varios mutantes dobles en estos dos sitios para identificar candidatos adecuados para métodos terapéuticos. Se proporcionan composiciones que comprenden uno o más de estas mutaciones a un sujeto que necesita las mismas con el fin de restablecer la visión. Específicamente, se introducen mutaciones deseadas en el gen de Chop2 a una célula y/o se integran dentro del ADN genómico de una célula para mejorar o restablecer la visión. Las mutaciones deseadas en el gen de Chop2 que se introducen a una célula para mejorar o restablecer la visión también pueden permanecer episomales, no habiéndose integradas dentro del ADN genómico.
Las mutaciones en las posiciones de aminoácido L132 o T159 de Chop2 (y por tanto el ChR2 resultante) disminuyen notablemente la intensidad luminosa umbral que se requiere para desencadenar la fotocorriente mediada por ChR2. Los mutantes dobles en las posiciones de aminoácido L132 y T159 aumentan además la fotocorriente a intensidades luminosas bajas, excediendo aquellas de cualquiera de las correspondientes mutaciones individuales. Células ganglionares retinianas que expresan los mutantes dobles en las posiciones L132 y T159 pueden responder a intensidades luminosas que se encuentran dentro del intervalo de condiciones de iluminación exterior normales pero todavía deben mantener una resolución temporal alta y adecuada que es apropiada para restablecer visión útil. Por tanto, la proteína Chop2 mutante de la presente invención que forma ChR2 mutantes que tienen sensibilidad lumínica mejorada se usan sola o en combinación para restablecer o mejorar la visión.
Específicamente, la invención se define según las reivindicaciones adjuntas. También se describe una molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L). En ciertos aspectos de la molécula de polipéptido aislado, el aminoácido en posición 132 es cisteína (C) o alanina (A). Cuando el aminoácido en posición 132 es cisteína (C), la molécula de polipéptido
puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 13. Cuando el aminoácido en posición 132 es alanina (A), la molécula de polipéptido puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 20.
La divulgación proporciona una molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 159 de SEQ ID NO: 26 no es treonina (T). En ciertos aspectos de la molécula de polipéptido aislado, el aminoácido en posición 159 es cisteína (C), serina (S) o alanina (A). Cuando el aminoácido en posición 159 es cisteína (C), la molécula de polipéptido puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 14. Cuando el aminoácido en posición 159 es serina (S), la molécula de polipéptido puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 17. Cuando el aminoácido en posición 159 es alanina (A), la molécula de polipéptido puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 23.
La divulgación proporciona una molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T). En determinadas realizaciones de la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), el aminoácido en posición 132 es cisteína (C) y el aminoácido en posición 159 es cisteína (C). En una realización preferida de esta molécula de polipéptido aislado, la molécula de polipéptido comprende o consiste en SEQ ID NO: 16. La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 16. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 16 es una molécula de ácido nucleico que comprende o consiste en SEQ ID NO: 15.
En determinadas realizaciones de la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), el aminoácido en posición 132 es cisteína (C) y el aminoácido en posición 159 es serina (S). La molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 19. Alternativa o adicionalmente, la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), en la que el aminoácido en posición 132 es cisteína (C) y en la que el aminoácido en posición 159 es serina (S), puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 19. La invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 19. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico comprende o consiste en SEQ ID NO: 18.
En ciertos aspectos de la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), el aminoácido en posición 132 es alanina (A) y el aminoácido en posición 159 es cisteína (C). La molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T) puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 22. Alternativa o adicionalmente, la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID nO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), en la que el aminoácido en posición 132 es alanina (A) y en la que el aminoácido en posición 159 es cisteína (C), puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 22. La divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 22. Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico comprende o consiste en SEQ ID NO: 21.
En ciertos aspectos de la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), el aminoácido en posición 132 es cisteína (C) y el aminoácido en posición 159 es alanina (A). La molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T) puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 25. Alternativa o adicionalmente, la molécula de polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID nO: 26 no es leucina (L) y el aminoácido en posición 159 no es treonina (T), en la que el aminoácido en posición 132 es cisteína (C) y en la que el aminoácido en posición 159 es alanina (A), puede comprender o consistir en SEQ ID NO: 25. La divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado que comprende o consiste en SEQ ID NO: 25. Preferiblemente, esta molécula de ácido nucleico comprende o consiste en SEQ ID NO: 24.
La divulgación proporciona una cualquiera de la moléculas de polipéptido aislado descritas en el presente documento, en las que la molécula de polipéptido codifica una proteína Chop2 mutante que forma un ChR2 mutante que desencadena una corriente en respuesta a una intensidad umbral de luz que es menor que el umbral de una proteína de ChR2 de tipo natural. Además, la corriente conduce cationes. Los cationes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, iones H+, Na+, K+ y Ca2+. Las proteínas de ChR2 de tipo natural y mutantes descritas en el presente documento conducen cationes de manera no específica. Consecuentemente, la corriente conduce uno o más de los siguientes: iones H+, Na+, K+ y Ca2+.
La divulgación proporciona una cualquiera de las moléculas de polipéptido aislado descritas en el presente documento que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable. La divulgación también proporciona una composición que comprende al menos una molécula de polinucleótido aislado descrita en el presente documento. La composición puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable.
La divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de los polipéptidos aislados descritos en el presente documento. Además, la molécula de ácido nucleico aislado puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable. La divulgación también proporciona una composición que comprende al menos una molécula de ácido nucleico aislado descrita en el presente documento. La composición puede comprender además un portador farmacéuticamente aceptable.
La divulgación proporciona una célula, en la que la célula se ha puesto en contacto con o comprende una molécula de polipéptido aislado de la invención. Además, la divulgación proporciona una célula, en la que la célula se ha puesto en contacto con o comprende una molécula de ácido nucleico aislado que codifica una molécula de polipéptido aislado de la invención. La divulgación proporciona una composición que comprende, consiste esencialmente en o consiste en una célula que comprende una molécula de polipéptido aislado de la invención o una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de polipéptido aislado de la invención. Las células de la invención pueden ponerse en contacto con el polipéptido aislado o un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido in vitro, ex vivo, in vivo o in situ. En determinadas realizaciones de la invención, la célula es un fotorreceptor; una célula horizontal; una célula bipolar; una célula amacrina y especialmente una célula amacrina AII; o una célula ganglionar retiniana, incluyendo una célula ganglionar retiniana fotosensible. Preferiblemente, la célula es una célula ganglionar retiniana, una célula ganglionar retiniana fotosensible, una célula bipolar, una célula bipolar de tipo ON, un bastón bipolar o una célula amacrina AII. En ciertos aspectos de la invención, la célula es un fotorreceptor, una célula bipolar, un bastón bipolar, un cono bipolar de tipo ON, una célula ganglionar retiniana, una célula ganglionar retiniana fotosensible, una célula horizontal, una célula amacrina o una célula amacrina AII.
La divulgación proporciona un método de mejora o restablecimiento de la visión que comprende administrar a un sujeto una cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento. La divulgación proporciona además un método profiláctico de conservar la visión que comprende administrar a un sujeto una cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento.
Los métodos descritos en el presente documento también pueden aplicarse a aquellos sujetos que están sanos, ciegos (en parte o totalmente) y/o aquellos sujetos con degeneración retiniana (caracterizada por una pérdida de células fotorreceptoras de bastón y/o cono), pero pueden ser dependientes de la actividad de células ganglionares retinianas fotosensibles para una determinación de niveles lumínicos ambientales. Por ejemplo, los métodos descritos en el presente documento pueden usarse para conservar, mejorar o restablecer la actividad de una célula ganglionar retiniana fotosensible que media en la transducción de información lumínica para sincronizar los ritmos circadianos al ciclo luz/oscuridad de 24 horas, control y reflejos pupilares y regulación luminosa de liberación de melatonina.
En ciertos aspectos de los métodos de la divulgación, el sujeto puede tener visión normal o visión deficiente. Alternativa o adicionalmente, el sujeto puede estar en riesgo de desarrollar una enfermedad ocular que conduce a una deficiencia de visión. Por ejemplo, el sujeto puede tener antecedentes familiares de enfermedad ocular que incluye degeneración macular y retinosis pigmentaria. El sujeto puede estar en riesgo de sufrir una lesión ocular que produce daño de las células fotosensibles en la retina. El sujeto puede tener un marcador genético o una alteración genética/congénita que da como resultado visión deficiente, dificultad para ver, ceguera legal, ceguera parcial o ceguera total. Los sujetos pueden tener un defecto refractivo que da como resultado miopía (cortedad de vista) o hipermetropía (mala visión de cerca).
Pueden administrarse las composiciones de los métodos de la divulgación a un sujeto o bien de manera sistémica o bien de manera local. Una vía preferida de administración local es inyección intravítrea.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de y están abarcadas por las siguientes descripción detallada y reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 muestra registros representativos de las corrientes provocadas por luz de ChR2 de tipo natural (WT), mutantes L132C, L132C/T159C y L132C/159S en células HEK para comparar su sensibilidad lumínica (A). Se generaron los estímulos lumínicos (fotones/cm2.s a 460 nm) mediante una lámpara de arco de xenon y se atenuaron mediante filtros de densidad neutra: ND4,0 (2,8 * 1014), ND3,0 (1,4 * 1015), ND2,5 (4,8 * 1015); ND2,0 (1,6 * 1016), ND1,0 (1,3 * 1017), ND0 (1,2 * 1018). (B) Se muestran los mismos perfiles de corriente a una escala de corriente diferente. Los perfiles indicados por flechas están provocados por la misma intensidad luminosa (ND2,5).
La figura 2 muestra registros representativos de las corrientes provocadas por luz de ChR2 de tipo natural (WT), mutantes T159C, L132C, L132C/T159C y L132C/T159S a un pulso de luz de 10 ms (1,2 * 1018 fotones/cm2/s a
460 nm) en células HEK para comparar su evolución temporal de desactivación (evolución temporal de desintegración después de apagado de luz).
La figura 3 muestra registros de matriz de múltiples canales representativos de actividades de disparo neuronal mediadas por ChR2 de tipo natural, L132C, L132C/T159C y L132C/T159S de células ganglionares retinianas en preparaciones completas retinianas para comparar su sensibilidad lumínica. Se generó estímulo lumínico (fotones/cm2/s) mediante un láser azul a 473 nm y se atenuó mediante filtros de densidad neutra: ND0 (6,3 * 1016), ND1,0 (7,4 * 1015), ND1,5 (2,7 * 1015 ), ND2,0 (7,3 * 1014), ND2,5 (3,2 * 1014), ND3,0 (8,5 * 1013), ND3,5 (3,8 * 1013) y ND4,0 (9,5 * 1012).
La figura 4 muestra registros de matriz de múltiples canales representativos de actividades de disparo neuronal mediadas por ChR2 de tipo natural, L132C, L132C/T159C y L132C/T159S de células ganglionares retinianas en preparaciones completas retinianas para comparar sus dinámicas temporales. En cada panel, se muestran los diagramas de trama de 10 disparos neuronales desencadenados por luz consecutivos originados a partir de una sola neurona (arriba) y los histogramas de tasa de disparos neuronales promediada (abajo). Se generaron pulsos de luz a diferente frecuencia mediante un láser azul a 473 nm con intensidades de aproximadamente de una unidad logarítmica por encima de la intensidad umbral de cada mutante. Se muestran registros de ChR2 de tipo natural y L132C en (A), y se muestran registros de L132C/T159C y L132C/T159S en (B).
Descripción detallada
Sistema visual
El sistema nervioso central media en la visión (también se denomina en el presente documento vista) a través de células especializadas y métodos únicos de transducción de señales presentes en el sistema visual. La principal responsabilidad del sistema visual es transformar la luz, en forma de radiación electromagnética, en una representación o imagen del mundo que nos rodea. Además de la función "visual" de este sistema, el sistema visual también regula el reflejo fotomotor pupilar (PLR), la fotosincronización circadiana a ciclos luz/oscuridad periódicos y la liberación de la hormona melatonina.
Las células de la retina son las primeras células del sistema nervioso o visual en encontrar luz (radiación electromagnética de longitudes de onda e intensidades variables). Los fotones viajan a través de la cornea, pupila y cristalino antes de alcanzar la retina. La retina tiene una estructura única porque las células fotorreceptoras que absorben directamente fotones están situadas en la capa exterior de la retina. Los fotones que atraviesan el cristalino se encuentran primero con una capa interior de células ganglionares retinianas (un minoría de las que son fotosensibles a través de la expresión de la opsina, melanopsina) y una capa intermedia de células bipolares antes de alcanzar la capa exterior de células fotorreceptoras (también conocidas como bastones y conos). Los fotorreceptores de bastón funcionan en condición de iluminación tenue (visión escotópica) mientras que los fotorreceptores de cono funcionan en condiciones de iluminación luminosa (visión fotópica) responsables de la visión en color. Fotorreceptores de cono forman sinapsis directamente sobre conos bipolares de tipo ON y OFF, que a su vez, forman sinapsis directamente sobre células ganglionares retinianas de tipo ON y OFF. Fotorreceptores de bastón forman sinapsis con bastones bipolares (un tipo único de células bipolares de tipo ON) que forman sinapsis con células amacrinas AII. Las células amacrinas AII transmiten entonces las señales visuales a conos bipolares de tipo ON a través de unión comunicante y a conos bipolares de tipo OFF así como células ganglionares OFF a través de sinapsis glicinérgicas inhibidoras. Las células ganglionares retinianas son responsables de relacionar información visual a las neuronas del cerebro.
Fototransducción
Dentro de la retina, las células fotorreceptoras absorben partículas fotónicas y transforman los datos brutos de frecuencia y longitud de onda de luz en señales químicas y posteriormente eléctricas que propagan esta información inicial a través de los sistemas visual y nervioso. Específicamente, una proteína de opsina situada en la superficie de un fotorreceptor (bastón, cono y/o célula ganglionar retiniana fotosensible) absorbe un fotón e inicia una cascada de señalización intracelular, que da como resultado la hiperpolarización del fotorreceptor. En la oscuridad, las proteínas de opsina no absorben fotones, se despolarizan los fotorreceptores. Las señales visuales de fotorreceptores se transmiten entonces a través de células bipolares, células amacrinas y células ganglionares a los centros visuales superiores en el cerebro. Específicamente, cuando los fotorreceptores de cono y bastón se despolarizan (en la oscuridad), producen la despolarización de bastones bipolares y conos bipolares de tipo ON, pero la hiperpolarización de conos bipolares de tipo OFF, que a su vez producen la despolarización de células amacrinas AII y el aumento del disparo neuronal de células ganglionares retinianas de tipo ON y la disminución del disparo neuronal de células ganglionares retinianas de tipo OFF. Ocurre lo contrario (a bastones bipolares ON y OFF, células amacrinas AII y células ganglionares ON y OFF) cuando se hiperpolarizan los fotorreceptores de cono y bastón (en respuesta a la luz).
Mediante las acciones de fotorreceptores, células bipolares, células horizontales, células amacrinas y células ganglionares retinianas se procesa y refina significativamente la información lumínica. Para añadir complejidad a
este sistema, se encuentran fotorreceptores en tres variedades principales, incluyendo bastones, conos (que, de los tres tipos, reaccionan más fuertemente para distinguir longitudes de onda de luz), y células ganglionares retinianas fotosensibles. Por tanto, una primera capa de procesamiento de información se produce al nivel de los fotorreceptores que reaccionan de manera diferencial a ciertas longitudes de onda e intensidades de luz. Las células bipolares de la retina reciben información tanto de células fotorreceptoras como de células horizontales. Las células horizontales de la retina reciben información de múltiples células fotorreceptoras, y, por tanto, integran información entre tipos de célula y a lo largo de distancias en la retina. Las células bipolares integran además información directamente de células fotorreceptoras y células horizontales produciendo principalmente potenciales graduados a células ganglionares retinianas, aunque algunos estudios recientes indican que algunas células bipolares pueden generar potenciales de acción. Los conos bipolares forman sinapsis en células ganglionares retinianas y células amacrinas mientras que los bastones bipolares forman sinapsis solo con células amacrinas AII. De manera similar a las células horizontales, la mayoría de las células amacrinas integran información lateralmente dentro de la retina. A diferencia de las células horizontales, la mayoría de las células amacrinas son interneuronas inhibidoras (GABAérgicas). Las células amacrinas también están más especializadas que las células horizontales, porque cada célula amacrina forma sinapsis específicamente en un tipo particular de célula bipolar (una de las diez variedades de célula bipolar). Particularmente, la célula amacrina AII es una neurona de transmisión crítica en la ruta de bastón (bajo visión escotópica cuando los fotorreceptores de cono no reaccionan). Las células amacrinas AII reciben entradas sinápticas de bastones bipolares y entonces llevan las señales a la ruta de cono a través de conos bipolares ON y OFF a células ganglionares On y OFF tal como se describió anteriormente. Por tanto, la expresión de Chop2, y la formación resultante de ChR2, en bastones bipolares o células amacrinas AII pueden crear respuestas ON y OFF en células ganglionares retinianas. Además, células ganglionares retinianas integran información de células bipolares y de células amacrinas. Aunque las células ganglionares retinianas varían significativamente con respecto a su tamaño, conectividad y respuestas a estimulación visual (por ejemplo campos visuales), todas las células ganglionares retinianas extienden un largo axón en el cerebro. A excepción de una porción insignificante de las células ganglionares retinianas que transducen información no visual referente al reflejo fotomotor pupilar y sincronización circadiana, la totalidad de axones que se extienden de las células ganglionares retinianas forman el nervio óptico, quiasma óptico y cintilla óptica del sistema nervioso central. Consecuentemente, una cantidad significativa de procesamiento de información se produce en la propia retina.
Las células fotorreceptoras expresan proteínas de opsina endógena, tales como rodopsina. Las proteínas Chop2 mutantes de la invención pueden expresarse en cualquier tipo de célula, y formar canales de ChR2 funcionales. Preferiblemente, la célula es una célula retiniana. Las células a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, células fotorreceptoras (por ejemplo, bastones, conos y células ganglionares retinianas fotosensibles), células horizontales, células bipolares, células amacrinas y células ganglionares retinianas.
Canalopsina-2 (Chop2)
Canalopsina-2 (Chop2) se aisló por primera vez a partir de algas verdes, Chlamydomonas reinhardtii. Canalopsina-2 es una proteína con siete dominios transmembrana que puede cambiar con la luz (sensible a la luz) cuando se une al cromóforo todo-trans-retinal. Chop2, cuando se une a una molécula retiniana por medio de un enlace de base de Schiff, forma un canal de cationes regulado por luz, no específico, de rectificación interna llamado canalrodopsina-2 (Chop2 retinalideno, abreviado ChR2).
"Canalopsina-2" o "Chop2", tal como se usa en el presente documento se refiere al gen que codifica canalopsina-2 que forma entonces canalrodopsina-2 (ChR2) una vez unido a la molécula retiniana. Los constructos génicos de la presente divulgación se refieren principalmente a canalopsina-2 (es decir, sin la molécula retiniana), y todas las variantes de Chop2 dadas a conocer en el presente documento forman variantes de canalrodopsina-2 funcionales. Los métodos dados a conocer en el presente documento pueden incluir administrar Chop2 a células sin molécula retiniana exógena. Se entiende que tras la expresión de Chop2 en células (es decir, neuronas retinianas), se une la molécula retiniana disponible de manera endógena a Chop2 de tipo natural o a los mutantes Chop2 de la presente invención para formar canales regulados por luz funcionales, ChR2 de tipo natural o ChR2 mutante. Como tal, proteínas Chop2, tal como se usa en el presente documento, pueden ser también sinónimas de ChR2.
"Canalrodopsina-2" o "ChR2", tal como se usa en el presente documento se refiere al canal sensible a la luz funcional unido a molécula retiniana. En un aspecto, la molécula retiniana unida puede proporcionarse de manera exógena. En un aspecto preferido, la molécula retiniana unida se proporciona a partir de niveles endógenos disponibles en la célula. La presente divulgación también abarca los canales de canalrodopsina-2 funcionales formados por los polipéptidos y polinucleótidos que codifican los mutantes de Chop2 descritos en el presente documento.
Tras iluminación mediante la dosis preferida de radiación luminosa, ChR2 abre el poro del canal, a través del cual los iones H+, Na+, K+ y/o Ca2+ fluyen del espacio extracelular a la célula. La activación del canal de ChR2 produce normalmente una despolarización de la célula que expresa el canal. Las células despolarizadas producen potenciales graduados y/o potenciales de acción para llevar información de la célula que expresa Chop2/ChR2 a otras células de la retina o el cerebro.
La forma de tipo natural de ChR2 o ChR2 mutantes con resolución temporal alta se ha convertido en un foco central de investigación en neurociencia. Cuando se expresa en una neurona de mamífero, ChR2 media en la despolarización controlada por luz de cultivos in vitro o ex vivo. ChR2 de tipo natural o ChR2 mutantes con resolución temporal alta (el último habitualmente muestra baja sensibilidad lumínica) presentan varios desafíos que deben abordarse para permitir su uso con el propósito de restablecer la visión. Con el propósito de restablecer la visión, se desea el ChR2 con sensibilidad lumínica alta antes que resolución temporal alta.
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u a a ra de ac e t s iv te ac t i i ó p n o puede dañar las células.
Las cinéticas de la proteína de ChR2 de tipo natural no son suficientes para maximizar la eficacia del canal. Puede aumentarse la eficacia modificando uno o más aminoácidos de la proteína de ChR2 de tipo natural o bien para prolongar el estado abierto del canal o bien para aumentar la conductancia unitaria del canal, o ambos. La conductancia de canal único de ChR2 de tipo natural es pequeña. Por tanto, la activación neuronal in vivo requeriría o bien expresión alta del canal de tipo natural o activación muy intensa con la longitud de onda preferida de luz azul. Se puede encontrar una solución más sencilla alterando la conductancia de canal o prolongando el tiempo de apertura del canal. Cualquiera de estos mecanismos y, en particular, la combinación de estos mecanismos, permite usar intensidades luminosas menores y más seguras para alcanzar el mismo nivel de despolarización celular.
Por ejemplo, proteínas de ChR2 mutantes de la invención consiguen sensibilidad lumínica mayor a través de la prolongación del estado de apertura del canal. Consecuentemente, cada canal de ChR2 mutante conduce una fotocorriente mayor que un canal de ChR2 de tipo natural cuando se activa mediante las mismas intensidades luminosas. Por tanto, los canales mutantes se activan mediante intensidades luminosas que son menores que las requeridas para la activación de los canales de ChR2 de tipo natural. Cuantitativamente, puede desencadenarse actividad de disparo neuronal detectable de células ganglionares retinianas que expresan proteínas de ChR2 mutantes mediante una intensidad luminosa que es de 1,5-2 unidades logarítmicas menor que la intensidad luminosa requerida para desencadenar actividad de disparo neuronal de células ganglionares retinianas que expresan ChR2 de tipo natural. Por tanto, las intensidades luminosas requeridas para activar las proteínas de ChR2 mutantes se encuentran cerca de o dentro del intervalo de condiciones de iluminación exterior normales.
Las siguientes secuencias proporcionan ejemplos no limitativos de proteínas Chop2 de tipo natural y mutantes, y polinucleótidos que codifican dichas proteínas Chop2 de tipo natural y mutantes de la divulgación, y que forman ChR2 de tipo natural y mutantes de la divulgación.
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de ARNm de canal iónico regulado por luz (COP4) de clamiopsina 4 de Chlamydomonas reinhardtii (n.° de registro de GenBank XM_001701673, y SEQ ID NO: 1):
1 gcagcaccat acttgacatc tgtcgccaag caagcattaa acatggatta tggaggcgcc
61 ctgagtgccg ttgggcgcga gctgctattt gtaacgaacc cagtagtcgt caatggctct
121gtacttgtgc ctgaggacca gtgttactgc gcgggctgga ttgagtcgcg tggcacaaac
181ggtgcccaaa cggcgtcgaa cgtgctgcaa tggcttgctg ctggcttctc catcctactg
241 cttatgtttt acgcctacca aacatggaag tcaacctgcggctgggagga gatctatgtg
301 tgcgctatcg agatggtcaa ggtgattctc gagttcttct tcgagtttaa gaacccgtcc
361atgctgtatc tagccacagg ccaccgcgtc cagtggttgc gttacgccga gtggcttctc
421 acctgcccgg tcattctcat tcacctgtca aacctgacgggcttgtccaa cgactacagc
481 aggcgcacca tgggtctgct tgtgtctgat attggcacaa ttgtgtgggg cgccacttcc
541gccatggcca ccggatacgt caaggtcatc ttcttctgcc tgggtctgtg ttatggtgct
601aacacgttct ttcacgctgc caaggcctac atcgagggtt accacaccgt gccgaagggc
661 cggtgtcgcc aggtggtgac tggcatggct tggctcttct tcgtatcatg gggtatgttc
721 cccatcctgt tcatcctcgg ccccgagggc ttcggcgtcc tgagcgtgta cggctccacc
781 gtcggccaca ccatcattga cctgatgtcg aagaactgct ggggtctgct cggccactac
841 ctgcgcgtgc tgatccacga gcatatcctc atccacggcg acattcgcaa gaccaccaaa
901 ttgaacattg gtggcactga gattgaggtc gagacgctgg tggaggacga ggccgaggct
961 ggcgcggtca acaagggcac cggcaagtac gcctcccgcg agtccttcct ggtcatgcgc
1021 gacaagatga aggagaaggg cattgacgtg cgcgcctctc tggacaacag caaggaggtg
1081 gagcaggagc aggccgccag ggctgccatg atgatgatga acggcaatgg catgggtatg
1141 ggaatgggaa tgaacggcat gaacggaatg ggcggtatga acgggatggc tggcggcgcc
1201 aagcccggcc tggagctcac tccgcagcta cagcccggcc gcgtcatcct ggcggtgccg
1261 gacatcagca tggttgactt cttccgcgag cagtttgctc agctatcggt gacgtacgag
1321 ctggtgccgg ccctgggcgc tgacaacaca ctggcgctgg ttacgcaggc gcagaacctg
1381 ggcggcgtgg actttgtgtt gattcacccc gagttcctgc gcgaccgctc tagcaccagc
1441 atcctgagcc gcctgcgcgg c9c999cca9 cg tg tggctg cgttcggctg ggcgcagctg
1501 gggcccatgc gtgacctgat cgagtccgca aacctggacg gctggctgga gggcccctcg
1561 ttcggacagg gcatcctgcc ggcccacatc gttgccctgg tggccaagat gcagcagatg
1621 cgcaagatgc agcagatgca gcagattggc atgatgaccg gcggcatgaa cggcatgggc
1681 ggcggtatgg gcggcggcat gaacggcatg 99c99c99ca acggcatgaa caacatgggc
1741 aacggcatgg gcggcggcat gggcaacggc atgggcggca atggcatgaa cggaatgggt
1801 ggcggcaacg gcatgaacaa catgggcggc aacggaatgg ccggcaacgg aatgggcggc
1861 ggcatgggcg gcaacggtat gggtggctcc atgaacggca tgagctccgg cgtggtggcc
1921 aacgtgacgc cctccgccgc cggcggcatg ggcggcatga tgaacggcgg catggctgcg
1981 ccccagtcgc ccggcatgaa C99C99CC9C ctgggtacca acccgctctt caacgccgcg
2041 ccctcaccgc tcagctcgca gctcggtgcc gaggcaggca tgggcagcat gggaggcatg
2101 ggcggaatga gcggaatggg aggcatgggt ggaatggggg gcatgggcgg cgccggcgcc
2161 gccacgacgc aggctgcggg cggcaacgcg gaggcggaga tgctgcagaa tctcatgaac
2221 gagatcaatc gcctgaagcg cgagcttggc gagtaaaagg ctggaggccg gtactgcgat
2281 acctgcgagc tcgcgcgcct gactcgtcgt acacacggct caggagcacg cgcgcgtgga
2341 cttctcaacc tgtgtgcaac gtatctagag cggcctgtgc gcgaccgtcc gtgagcattc
2401 cggtgcgatc ttcccgcctt cgcaccgcaa gttcccttcc tggccctgct gcgcctgacg
2461 catcgtccga acggaagggc ggcttgatca gtaaagcatt gaagactgaa gtcgtgcgac
2521 cgtagtgcta tggctctgca cgtaagtggg cgctgccctg cttactacgc attgcccaag
2581 actgcttcct tttggtggcc gaggccctgg tcccacatca ttcatttgca taacgtactg
2641 tttagttaca tacgctttgc ttaacctcga caattgcaac atgggctgag agtccgtacg
2701 gcggctatgg acgaaggtgt tatcggatgt gattaggaat ctcggttgaa aggcttcgag
2761 aaagtgagct tcatctgtgg cttctgttgg ggtcatcaag aagaacgacg gtaaggcaaa
2821 cgaggtaaaa gtggcacgtc tttgtgcaca acgggcccgt ggagagtggg ggagtgcatg
2881 tgtgcggtcc taacacgcga gtgcaaagcg ggcttttctg gagctgggtt acggtctggc
2941 tcggcaactg ctctgtgttt taaccacagc ttcggaagtc tgggtcitgtt ttgttggcag
3001 aaacatttgg gtaacttgag ggtgattcgt ctggagtcgg acaacatggc tgccgtccgt
3061 gtgcagggac ggtaatcaat gagctggagc tgtgatgctc accacacgtt gcatacccct
3121 gcttacaaaa acactttgat gtcgtggcca aactatgcgt gagcaaagag ttaaagaggc
3181 atgagtgcat ggttgcggac gtgcgcaaca attgcatcaa gtatttgacg ccttcaagcc
3241 aacaagtgcg cgcgcggcaa cttgattaac acgccggacg cagtggtggg ggcgtgtaca
3301 gtgtttatga gctgccattc tgcgatccgt agtgttaggt tgcgtgtgac gccgcgcggc
3361 tgtgggccct tacatggaga gttgggtgct tcaccacacg gttggcgccg ctgaagggtg
3421 tgctatgttt tggtaaagcc ggggccctga agaccgcaac cgtagaaccg tactgaaagg
3481 gtgtcagccc ggggtaactg gatgccctgg gacatagcta ttaatgttga agtgaagccg
3541 tcaagccgag tgccgtgcgc cgctgtatca ccaaggcccg tccta
Una ChR2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos de canal iónico regulado por luz (COP4) de clamiopsina 4 de Chlamydomonas reinhardtii (n.° de registro de GenBank XP_001701725, y SEQ ID NO: 2):
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa
61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr
121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffel
181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl
241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv
301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn
361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq
421 lsvtyelvpa lgadntlalv tqaqnlggvd fvlihpefIr drsstsilsr lrgagqrvaa
481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg
541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma
601 gngmgggmgg ngmggsnmgm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn
661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem
721 lqnlmneinr lkrelge
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia génica de proteína de unión a molécula retiniana (cop4) de Chlamydomonas reinhardtii (n.° de registro de GenBank AF461397, y SEQ ID NO: 3):
1 gcatctgtcg ccaagcaagc attaaacatg gattatggag gcgccctgag tgccgttggg
61 cgcgagctgc tatttgtaac gaacccagta gtcgtcaatg gctctgtact tgtgcctgag
121 gaccagtgtt actgcgcggg ctggattgag tcgcgtggca caaacggtgc ccaaacggcg
181 tcgaacgtgc tgcaatggct tgctgctggc ttctccatcc tactgcttat gttttacgcc
241 taccaaacat ggaagtcaac ctgcggctgg gaggagatct atgtgtgcgc tatcgagatg
301 gtcaaggtga ttctcgagtt cttcttcgag tttaagaacc cgtccatgct gtatctagcc
361 acaggccacc gcgtccagtg gttgcgttac gccgagtggc ttctcacctg cccggtcatt
421 ctcattcacc tgtcaaacct gacgggcttg tccaacgact acagcaggcg caccatgggt
481 ctgcttgtgt ctgatattgg cacaattgtg tggggcgcca cttccgccat ggccaccgga
541 tacgtcaagg tcatcttctt ctgcctgggt ctgtgttatg gtgctaacac gttctttcac
601 gctgccaagg cctacatcga gggttaccac accgtgccga agggccggtg tcgccaggtg
661 gtgactggca tggcttggct cttcttcgta tcatggggta tgttccccat cctgttcatc
721 ctcggccccg agggcttcgg cgtcctgagc gtgtacggct ccaccgtcgg ccacaccatc
781 attgacctga tgtcgaagaa ctgctggggt ctgctcggcc actacctgcg cgtgctgatc
841 cacgagcata tcctcatcca cggcgacatt cgcaagacca ccaaattgaa cattggtggc
901 actgagattg aggtcgagac gctggtggag gacgaggccg aggctggcgc ggtcaacaag
961 ggcaccggca agtacgcctc ccgcgagtcc ttcctggtca tgcgcgacaa gatgaaggag
1021 aagggcattg acgtgcgcgc ctctctggac aacagcaagg aggtggagca ggagcaggcc
1081 gccagggctg ccatgatgat gatgaacggc aatggcatgg gtatgggaat gggaatgaac
1141 ggcatgaacg gaatgggcgg tatgaacggg atggctggcg gcgccaagcc cggcctggag
1201 ctcactccgc agctacagcc cggccgcgtc atcctggcgg tgccggacat cagcatggtt
1261 gacttcttcc gcgagcagtt tgctcagcta tcggtgacgt acgagctggt gccggccctg
1321 ggcgctgaca acacactggc gctggttacg caggcgcaga acctgggcgg cgtggacttt
1381 gtgttgattc accccgagtt cctgcgcgac cgctctagca ccagcatcct gagccgcctg
1441 cgcggcgcgg gccagcgtgt ggctgcgttc ggctgggcgc agctggggcc catgcgtgac
1501 ctgatcgagt ccgcaaacct ggacggctgg ctggagggcc cctcgttcgg acagggcatc
1561 ctgccggccc acatcgttgc cctggtggcc aagatgcagc agatgcgcaa gatgcagcag
1621 atgcagcaga ttggcatgat gaccggcggc atgaacggca tgggcggcgg tatgggcggc
1681 ggcatgaacg gcatgggcgg cggcaacggc atgaacaaca tgggcaacgg catgggcggc
1741 ggcatgggca acggcatggg cggcaatggc atgaacggaa tgggtggcgg caacggcatg
1801 aacaacatgg gcggcaacgg aatggccggc aacggaatgg gcggcggcat gggcggcaac
1861 ggtatgggtg gctccatgaa cggcatgagc tccggcgtgg tggccaacgt gacgccctcc
1921 gccgccggcg gcatgggcgg catgatgaac ggcggcatgg ctgcgcccca gtcgcccggc
1981 atgaacggcg gccgcctggg taccaacccg ctcttcaacg ccgcgccctc accgctcagc
2041 tcgcagctcg gtgccgaggc aggcatgggc agcatgggag gcatgggcgg aatgagcgga
2101 atgggaggca tgggtggaat ggggggcatg ggcggcgccg gcgccgccac gacgcaggct
2161 gcgggcggca acgcggaggc ggagatgctg cagaatctca tgaacgagat caatcgcctg
2221 aagcgcgagc ttggcgagta a
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos de proteína de unión a molécula retiniana (cop4) de Chlamydomonas reinhardtii (n.° de registro de GenBank AAM15777, y SEQ ID NO: 4):
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa
61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvileff f efknpsmlyl atghrvqwlr
121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm gllvsdigt i vwgatsamat gyvkviffel
181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlf f vswgmfpilf ilgpegfgvl
241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv
301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvras1 dnskeveqeq aaraammmmn
361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq
421 lsvtyelvpa lgadntlalv tqaqnlggvd fvlihpefIr drsstsilsr lrgagqrvaa
481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg
541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma
601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn
661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem
721 lqnlmneinr lkrelge
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de ARNm de opsina B sensorial (CSOB) de Chlamydomonas reinhardtii (n.° de registro de GenBank AF508966, y SEQ ID NO: 5):
1 ttgacatctg tcgccaagca agcattaaac atggattatg gaggcgccct gagtgccgtt
61 gggcgcgagc tgctatttgt aacgaaccca gtagtcgtca atggctctgt acttgtgcct
121 gaggaccagt gttactgcgc gggctggatt gagtcgcgtg gcacaaacgg tgcccaaacg
181 gcgtcgaacg tgctgcaatg gcttgctgct ggcttctcca tcctactgct tatgttttac
241 gcctaccaaa catggaagtc aacctgcggc tgggaggaga tctatgtgtg cgctatcgag
301 atggtcaagg tgattctcga gttcttcttc gagtttaaga acccgtccat gctgtatcta
361 gccacaggcc accgcgtcca gtggttgcgt tacgccgagt ggcttctcac ctgcccggtc
421 attctcattc acctgtcaaa cctgacgggc ttgtccaacg actacagcag gcgcaccatg
481 ggtctgcttg tgtctgatat tggcacaatt gtgtggggcg ccacttccgc catggccacc
541 ggatacgtca aggtcatctt cttctgcctg ggtctgtgtt atggtgctaa cacgttcttt
601 cacgctgcca aggcctacat cgagggttac cacaccgtgc cgaagggccg gtgtcgccag
661 gtggtgactg gcatggcttg gctcttcttc gtatcatggg gtatgttccc catcctgttc
721 atcctcggcc ccgagggctt cggcgtcctg agcgtgtacg gctccaccgt cggccacacc
781 atcattgacc tgatgtcgaa gaactgctgg ggtctgctcg gccactacct gcgcgtgctg
841 atccacgagc atatcctcat ccacggcgac attcgcaaga ccaccaaatt gaacattggt
901 ggcactgaga ttgaggtcga gacgctggtg gaggacgagg ccgaggctgg cgcggtcaac
961 aagggcaccg gcaagtacgc ctcccgcgag tccttcctgg tcatgcgcga caagatgaag
1021 gagaagggca ttgacgtgcg cgcctctctg gacaacagca aggaggtgga gcaggagcag
1081 gccgccaggg ctgccatgat gatgatgaac ggcaatggca tgggtatggg aatgggaatg
1141 aacggcatga acggaatggg cggtatgaac gggatggctg gcggcgccaa gcccggcctg
1201 gagctcactc cgcagctaca gcccggccgc gtcatcctgg cggtgccgga catcagcatg
1261 gttgacttct tccgcgagca gtttgctcag ctatcggtga cgtacgagct ggtgccggcc
1321 ctgggcgctg acaacacact ggcgctggtt acgcaggcgc agaacctggg cggcgtggac
1381 tttgtgttga ttcaccccga gttcctgcgc gaccgctcta gcaccagcat cctgagccgc
1441 ctgcgcggcg cgggccagcg tgtggctgcg ttcggctggg cgcagctggg gcccatgcgt
1501 gacctgatcg agtccgcaaa cctggacggc tggctggagg gcccctcgtt cggacagggc
1561 atcctgccgg cccacatcgt tgccctggtg gccaagatgc agcagatgcg caagatgcag
1621 cagatgcagc agattggcat gatgaccggc ggcatgaacg gcatgggcgg cggtatgggc
1681 ggcggcatga acggcatggg cggcggcaac ggcatgaaca acatgggcaa cggcatgggc
1741 ggcggcatgg gcaacggcat gggcggcaat ggcatgaacg gaatgggtgg cggcaacggc
1801 atgaacaaca tgggcggcaa cggaatggcc ggcaacggaa tgggcggcgg catgggcggc
1861 aacggtatgg gtggctccat gaacggcatg agctccggcg tggtggccaa cgtgacgccc
1921 tccgccgccg gcggcatggg cggcatgatg aacggcggca tggctgcgcc ccagtcgccc
1981 ggcatgaacg gcggccgcct gggtaccaac ccgctcttca acgccgcgcc ctcaccgctc
2041 agctcgcagc tcggtgccga ggcaggcatg ggcagcatgg gaggcatggg cggaatgagc
2101 ggaatgggag gcatgggtgg aatggggggc atgggcggcg ccggcgccgc cacgacgcag
2161 gctgcgggcg gcaacgcgga ggcggagatg ctgcagaatc tcatgaacga gatcaatcgc
2221 ctgaagcgcg agcttggcga gtaaaaggct ggaggccggt actgcgatac ctgcgagctc
2281 gcgcgcctga ctcgtcgtac acacggctca ggagcacgcg cgcgtggact tctcaacctg
2341 tgtgcaacgt atctagagcg gcctgtgcgc gaccgtccgt gagcattccg gtgcgatctt
2401 cccgccttcg caccgcaagt tcccttcctg gccctgctgc gcctgacgca tcgtccgaac
2461 ggaagggcgg cttgatcagt aaagcattga agactgaagt cgtgcgaccg tagtgctatg
2521 gctctgcacg taagtgggcg ctgccctgct tactacgcat tgcccaagac tgcttccttt
2581 tggtggccga ggccctggtc ccacatcatt catttgcata acgtactgtt tagttacata
2641 cgctttgctt aacctcgaca attgcaacat gggctgagag tccgtacggc ggctatggac
2701 gaaggtgtta tcggatgtga ttaggaatct cggttgaaag gcttcgagaa agtgagcttc
2761 ttctgtggct tctgttgggg tcatcaagaa gaacgacggt aaggcaaacg aggtaaaagt
2821 ggcacgtctt tgtgcacaac gggcccgtgg agagtggggg agtgcatgtg tgcggtccta
2881 acacgcgagt gcaaagcggg cttttctgga gctgggttac ggtctggctc ggcaactgct
2941 ctgtgtttta accacagctt cggaagtctg ggtatgtttt gttggcagaa acatttgggt
3001 aacttgaggg tgattcgtct ggagtcggac aacatggctg ccgtccgtgt gcagggacgg
3061 taatcaatga agctgaagct gtgatgctca ccacacgttg catacccctg cttacaaaaa
3121 cactttgatg tcgtggccaa actatgcgtg agcaaagagt taaagaggca tgagtgcatg
3181 gttgcggacg tgcgcaacaa ttgcatcaag tatttgacgc cttcaagcca acaagtgcgc
3241 gcgcggcaac ttgattaaca cgccggacgc agtggtgggg gcgtgtacag tgtttatgag
3301 ctgccattct gcgatccgta gtgttaggtt gcgtgtgacg ccgcgcggct gtgggccctt
3361 acatggagag ttgggtgctt caccacacgg ttggcgccgc tgaagggtgt gctatgtttt
3421 ggtaaagccg gggccctgaa gaccgcaacc gtagaaccgt actgaaaggg tgtcagcccg
3481 gggtaactgg atgccctggg acatagctat taatgttgaa gtgaagccgt caagccgagt
3541 gccgtgcgcc gctgtatcac caaggcccgt ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos de opsina B sensorial (CSOB) de Chlamydomonas reinhardtii (n.° de registro de GenBank AAM44040, y SEQ ID NO:
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa
61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr
121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffel
181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ügpegfgvi
241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv
301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn
361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq
421 lsvtyelvpa lgadntlalv tqaqnlggvd fvlihpefIr drsstsilsr lrgagqrvaa
481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg
541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma
601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn
661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem
721 lqnlmneinr lkrelge
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante el siguiente ARNm de acop2 de Chlamydomonas reinhardtii para la secuencia de ácido nucleico de opsina 2 de tipo arquea (n.° de registro de GenBank AB058891, y SEQ ID NO: 7):
1 catctgtcgc caagcaagca ttaaacatgg attatggagg cgccctgagt gccgttgggc
61 gcgagctgct atttgtaacg aacccagtag tcgtcaatgg ctctgtactt gtgcctgagg
121 accagtgtta ctgcgcgggc tggattgagt cgcgtggcac aaacggtgcc caaacggcgt
181 cgaacgtgct gcaatggctt gctgctggct tctccatcct actgcttatg ttttacgcct
241 accaaacatg gaagtcaacc tgcggctggg aggagatcta tgtgtgcgct ategagatgg
301 tcaaggtgat tetegagtte ttcttcgagt ttaagaaccc gtccatgctg tatctagcca
361 caggccaccg cgtccagtgg ttgcgttacg ccgagtggct tctcacctgc ccggtcattc
421 tcattcacct gtcaaacctg acgggcttgt ccaacgacta cagcaggcgc accatgggtc
481 tgcttgtgtc tgatattggc acaattgtgt ggggcgccac ttccgccatg gccaccggat
541 acgtcaaggt catcttcttc tgcctgggtc tgtgttatgg tgctaacacg ttctttcacg
601 ctgccaaggc ctacatcgag ggttaccaca ccgtgccgaa gggccggtgt cgccaggtgg
661 tgactggcat ggcttggctc ttcttcgtat catggggtat gttccccatc ctgttcatcc
721 tcggccccga gggcttcggc gtcctgagcg tgtacggctc caccgtcggc cacaccatca
781 ttgacctgat gtcgaagaac tgctggggtc tgctcggcca ctacctgcgc gtgctgatcc
841 aegageatat cctcatccac ggcgacattc gcaagaccac caaattgaac attggtggca
901 ctgagattga ggtcgagacg ctggtggagg acgaggccga ggctggcgcg gtcaacaagg
961 gcaccggcaa gtacgcctcc cgcgagtcct tcctggtcat gcgcgacaag atgaaggaga
1021 agggcattga cgtgcgcgcc tctctggaca acagcaagga ggtggagcag gagcaggccg
1081 ccagggctgc catgatgatg atgaacggca atggcatggg tatgggaatg ggaatgaacg
1141 gcatgaacgg aatgggcggt atgaacggga tggctggcgg cgccaagccc ggcctggagc
1201 tcactccgca gctacagccc ggccgcgtca tcctggcggt gccggacatc agcatggttg
1261 acttcttccg cgagcagttt gctcagctat cggtgacgta cgagctggtg ccggccctgg
1321 gcgctgacaa cacactggcg ctggttacgc aggcgcagaa cctgggcggc gtggactttg
1381 tgttgattca ccccgagttc ctgcgcgacc gctctagcac cagcatcctg agccgcctgc
1441 gcggcgcggg ccagcgtgtg gctgcgttcg gctgggcgca gctggggccc atgcgtgacc
1501 tgatcgagtc cgcaaacctg gacggctggc tggagggccc ctcgttcgga cagggcatcc
1561 tgccggccca catcgttgcc ctggtggcca agatgeagea gatgcgcaag atgeageaga
1621 tgcagcagat tggcatgatg accggcggca tgaacggcat gggcggcggt atgggcggcg
1681 gcatgaacgg catgggcggc ggcaacggca tgaacaacat gggcaacggc atgggcggcg
1741 gcatgggcaa cggcatgggc ggcaatggca tgaacggaat gggtggcggc aacggcatga
1801 acaacatggg cggcaacgga atggccggca acggaatggg cggcggcatg ggcggcaacg
1861 gtatgggtgg ctccatgaac ggcatgagct ccggcgtggt ggccaacgtg acgccctccg
1921 ccgccggcgg catgggcggc atgatgaacg gcggcatggc tgcgccccag tcgcccggca
1981 tgaacggcgg ccgcctgggt accaacccgc tcttcaacgc cgcgccctca ccgctcagct
2041 cgcagctcgg tgccgaggca ggcatgggca gcatgggagg catgggcgga atgagcggaa
2101 tgggaggcat gggtggaatg gggggcatgg gcggcgccgg cgccgccacg acgcaggctg
2161 cgggcggcaa cgcggaggcg gagatgctgc agaatctcat gaaegagate aatcgcctga
2221 agcgcgagct tggcgagtaa aaggctggag gccggtactg cgatacctgc gagctcgcgc
2281 gcctgactcg tcgtacacac ggctcaggag cacgcgcgcg tggacttctc aacctgtgtg
2341 caacgtatct agagcggcct gtgcgcgacc gtccgtgagc attccggtgc gatcttcccg
2401 ccttcgcacc gcaagttccc ttcctggccc tgctgcgcct gaegeate
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante el siguiente ARNm de acop2 de Chlamydomonas reinhardtii para la secuencia de aminoácidos de opsina 2 de tipo arquea (n.° de registro de GenBank BAB68567, y SEQ ID NO: 8):
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa 61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr
121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffel
181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ügpegfgvi
241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv
301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn
361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq
421 lsvtyelvpa lgadntlalv tqaqnlggvd fvlihpefIr drsstsilsr lrgagqrvaa
481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg
541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma
601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn
661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem
721 lqnlmneinr lkrelge
Mutantes de ChR2
La presente divulgación proporciona mutantes de Chop2 en los que se mutan uno o más aminoácidos. En algunos aspectos, el Chop2 es el polipéptido de longitud completa, tal como SEQ ID NO: 2, 4, 6 y 8, con al menos una mutación de aminoácido. En algunos aspectos, la mutación es en el aminoácido 132 y/o aminoácido 159. En algunos aspectos preferidos, el aminoácido en posición 132 se muta de una leucina a una cisteína o una alanina. En algunos aspectos preferidos, el aminoácido en posición 159 se muta de una treonina a una alanina, una cisteína o una serina. En todas las realizaciones, los mutantes de Chop2 forman un canal de ChR2 funcional.
La presente divulgación también abarca proteínas Chop2 y ácidos nucleicos que codifican un fragmento biológicamente activo o una sustitución de aminoácido conservadora u otra variante de mutación de Chop2. Los ejemplos no limitativos de fragmentos útiles incluyen aminoácidos 1-315 de Chop2 de tipo natural que codifican polipéptidos, es decir, SEQ ID NO: 26, en la que al menos se muta o se sustituye de forma conservadora un aminoácido, por ejemplo en las posiciones de aminoácido 132 y/o 159. También pueden ser útiles fragmentos más pequeños de Chop2 de tipo natural, en los que se muta o se sustituye de forma conservadora al menos un aminoácido (es decir, en las posiciones de aminoácido 132 y/o 159). Por consiguiente, ácidos nucleicos y polipéptidos de Chop2 de la presente divulgación incluyen además, pero no se limitan a, fragmentos biológicamente activos que codifican aminoácidos 1-315, 1-310, 1-300, 1-275, 1-250, 1-225, 1-200, 1-175 o 1-160 de Chop2 de tipo natural, en los que se muta o se sustituye de forma conservadora al menos un aminoácido, por ejemplo en las posiciones de aminoácido 132 y/o 159. En otros aspectos, los ácidos nucleicos y polipéptidos de Chop2 de la presente divulgación pueden ser hasta de, o aproximadamente, 315 aminoácidos de largo, 310 aminoácidos de largo, 300 aminoácidos de largo, 275 aminoácidos de largo, 250 aminoácidos de largo, 225 aminoácidos de largo, 200 aminoácidos de largo, 175 aminoácidos de largo o 160 aminoácidos de largo.
Una Chop2 con mutación individual de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia génica del constructo sintético hVChR1-mKate-betahChR2(L132C) (n.° de registro de GenBank JN836746, y SEQ ID NO: 9) con las siguientes anotaciones, la secuencia de GFP está en negrita, la secuencia de Chop2 L132C está subrayada:
1 atggattacc ctgtggcccg gtccctgatt gtaagatacc ccaccgatct gggcaatgga
61 accgtgtgca tgcccagagg acaatgctac tgcgaggggt ggctgaggag ccggggcact
121 agtatcgaaa aaaccatcgc tatcaccctc cagtgggtag tgttcgctct gtccgtagcc
181 tgtctcggct ggtatgcata ccaagcctgg agggctacct gtgggtggga ggaagtatac
241 gtggccctga tcgagatgat gaagtccatc atcgaggctt tccatgagtt cgactcccca
301 gccacactct ggctcagcag tgggaatggc gtagtgtgga tgagatatgg agagtggctg
361 ctgacctgtc ccgtcctgct cattcatctg tccaatctga ccgggctgaa agatgactac
421 tccaagagaa caatgggact gctggtgagt gacgtggggt gtattgtgtg gggagccacc
481 tccgccatgt gcactggatg gaccaagatc ctctttttcc tgatttccct ctcctatggg
541 atgtatacat acttccacgc cgctaaggtg tatattgagg ccttccacac tgtacctaaa
601 ggcatctgta gggagctcgt gcgggtgatg gcatggacct tctttgtggc ctgggggatg
661 ttccccgtgc tgttcctcct cggcactgag ggatttggcc acattagtcc ttacgggtcc
721 gcaattggac actccatcct ggatctgatt gccaagaata tgtggggggt gctgggaaat
781 tatctgcggg taaagatcca cgagcatatc ctgctgtatg gcgatatcag aaagaagcag
841 aaaatcacca ttgctggaca ggaaatggag gtggagacac tggtagcaga ggaggaggac
901 gggaccgcgg tcgccaccat ggtgtctaag ggcgaagagc tgattaagga gaacatgcac
961 atgaagctgt acatggaggg caccgtgaac aaccaccact tcaagtgcac atccgagggc
1021 gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct
1081 ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aaccttcatc
1141 aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg
1201 gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc
1261 caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttccc atccaacggc
1321 cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggcctcca ccgagatgct gtaccccgct
1381 gacggcggcc tggaaggcag agccgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gggccacctg
1441 atctgcaact tgaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc
1501 ggcgtctact atgtggacag aagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac
1561 gtcgagcagc acgaggtggc tgtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac
1621 aaacttaatt gcctgcagga gaagaagtca tgcagccagc gcatggccga attccggcaa
1681 tactgttgga acccggacac tgggcagatg ctgggccgca ccccagcccg gtgggtgtgg
1741 atcagcctgt actatgcagc tttctacgtg gtcatgactg ggctctttgc cttgtgcatc
1801 tatgtgctga tgcagaccat tgatccctac acccccgact accaggacca gttaaagtca
1861 ccgggggtaa ccttgagacc ggatgtgtat ggggaaagag ggctgcagat ttcctacaac
1921 atctctgaaa acagctctag acaggcccag atcaccggac gtccggagac tgagacattg
1981 ccaccggtgg actacggggg ggccctgagc gctgtgggca gagaactcct gttcgtgaca
2041 aatccagtcg tggtgaacgg ctccgtactc gtacccgagg atcagtgcta ttgcgcagga
2101 tggatcgaga gcagaggcac aaacggcgca cagactgcat ccaacgtgct ccagtggttg
2161 gccgcaggct tttccattct cctgctcatg ttttacgcct accagacttg gaagtccaca
2221 tgtggctggg aggaaatcta cgtgtgtgca atcgaaatgg tgaaggtgat cctggagttt
2281 ttcttcgaat ttaaaaaccc aagcatgctg tacctqgcta ctggccacag agtgcagtgg
2341 ctgcggtatg ccgaatggct gctgacttgc ccagtgattt gcatccacct gtccaacctg
2401 actgggctgt ctaacgatta cagtaggaga acaatgggac tgctcgtatc cgacatcggc
2461 actatcgtat ggggcgcaac tagtgccatg gccactggat acgtgaaagt gatcttcttc
2521 tgcctgggac tctgctacgg agcaaacaca ttttttcatg ccgcaaaagc atatatcgag
2581 gggtatcata ccgtcccaaa gggccggtgt agacaagtgg tgactggcat ggcttggctg
2641 ttcttcgtgt cctgggggat gtttcccatc ctctttatcc tgggcccaga aggcttcggg
2701 gtgctgagtg tgtatggcag taccgtagga cacactatca ttgacctgat gagcaaaaac
2761 tgctgggggc tgctcggcca ctacctgaga gtactcatcc acgagcatat cctgattcat
2821 ggcgatatcc ggaaaactac caagctcaat atcgggggca ccgagattga agtggagaca
2881 ctcgtggagg acgaggccga ggccggagca gtgaacaaag gcactggcaa gtatgcctcc
2941 agagaatcct ttctggtgat gcgggacaaa atgaaggaga aaggcattga tgtacggtgc
3001 agtaatgcca aagccgtcga gactgatgtg tag
Un ChR2 con mutación individual de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos del constructo sintético hVChR1-mKate-betahChR2(L132C) (n.° de registro de GenBank AER29839, y SEQ ID NO: 10) con las siguientes anotaciones, la secuencia de GFP está en negrita, la secuencia de Chop2 L132C está subrayada:
1 mdypvarsli vryptdlgng tvcmprgqcy cegwlrsrgt siektiaitl qwwfalsva 61 clgwyayqaw ratcgweevy valiemmksi ieafhefdsp atlwlssgng wwmrygewl
121 ltcpvllihl snltglkddy skrtmgllvs dvgcivwgat samctgwtki lfflislsyg
181 mytyfhaakv yieafhtvpk gicrelvrvm awtffvawgm fpvlfllgte gfghispygs
241 aighsildli aknmwgvlgn ylrvkihehi llygdirkkq kitiagqeme vetlvaeeed
301 gtavatmvsk geelikenmh mklymegtvn nhhfkctseg egkpyegtqt mrikweggp
361 lpfafdilat sfmygsktfi nhtqgipdff kqsfpegftw ervttyedgg vltatqdtsl
421 gdgc1iynvk irgvnfpsng pvmqkktlgw eastemlypa dgglegradm alklvggghl
481 icnlkttyrs kkpaknlkmp gvyyvdrrle rikeadkety veqhevavar ycdlpsklgh
541 klnclqekks csqrmaefrq ycwnpdtgqm lgrtparwvw islyyaafyv vmtglfalci
601 yvlmqtidpy tpdyqdqlks pgvtlrpdvy gerglqisyn isenssrqaq itgrpetetl
661 ppvdyggals avgrellfvt npwvngsvl vpedqcycag wiesrgtnga qtasnvlqwl aagfsilllm fyayqtwkst cgweeiyvca iemvkvilef ffefknpsml ylatghrvqw lryaewlltc pvicihlsnl tglsndysrr tmgllvsdig tivwgatsam atgyvkviff clglcygant ffhaakayie gyhtvpkgrc rqvvtgmawl ffvswgmfpi lfilgpegfg vlsvygstvg htiidlmskn cwgllghylr vlihehilih gdirkttkln iggteievet
961 lvedeaeaga vnkgtgkyas resflvmrdk mkekgidvrc snakavetdv
Una Chop2 con mutación individual de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia génica del constructo sintético hVChR1-mKate-betahChR2(L132C) (n.° de registro de GenBank JN836745, y SEQ ID NO: 11) con las siguientes anotaciones, la secuencia de GFP está en negrita, la secuencia de Chop2 L132C está subrayada:
1 atggattacc ctgtggcccg gtccctgatt gtaagatacc ccaccgatct gggcaatgga
61 accgtgtgca tgcccagagg acaatgctac tgcgaggggt ggctgaggag ccggggcact
121 agtatcgaaa aaaccatcgc tatcaccctc cagtgggtag tgttcgctct gtccgtagcc
181 tgtctcggct ggtatgcata ccaagcctgg agggctacct gtgggtggga ggaagtatac
241 gtggccctga tcgagatgat gaagtccatc atcgaggctt tccatgagtt cgactcccca
Una Chop2 con mutación individual de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos del constructo sintético hVChR1-mKate-betahChR2(L132C) (n.° de registro de GenBank AER29838, y SEQ ID NO: 12) con las siguientes anotaciones, la secuencia de GFP está en negrita, la secuencia de Chop2 L132C está subrayada:
421 qdgcliynvk irgvnfpsng pvmqkktlgw eastemlypa dgglegradm alklvggghl
481 icnlkttyrs kkpaknlkmp gvyyvdrrle rikeadkety veqhevavar ycdlpsklgh
541 klnclqekks csqrmaefrq ycwnpdtgqm lgrtparwvw islyyaafyv vmtglfalci
601 yvlmqtidpy tpdyqdqlks pgvtlrpdvy gerglqisyn isenssrqaq itgrpetetl
661 ppvdyggals avgrellfvt npwvngsvl vpedqcycag wiesrgtnga qtasnvlqwl
721 aagfsilllm fyayqtwkst cgweeiyvca iemvkvilef ffefknpsml ylatghrvqw
781 lryaewlltc pvilihlsnl tglsndysrr tmgllvsdig tivwgatsam atgyvkviff
841 clglcygant ffhaakayie gyhtvpkgrc rqvvtgmawl ffvswgmfpi lfilgpegfg
901 vlsvygstvg htiidlmskn cwgllghylr vlihehilih gdirkttkln iggteievet
961 lvedeaeaga vnkgtgkyas resflvmrdk mkekgidvrc snakavetdv
Una Chop2 con mutación individual L132C de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posiciones 132 subrayadas y en negrita, SEQ ID NO: 13):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNPVVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCGWEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTGLSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGYHTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCWGLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 con mutación individual T159C de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posiciones 159 subrayadas y en negrita, SEQ ID NO: 14):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 con mutación doble L132C/T159C de la invención puede codificarse mediante la siguiente secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 15):
1 atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct
61 gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc
121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct
181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc
241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc
301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga
361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc
421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggctgcatt
481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg
541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat
601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc
661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg
721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg
781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat
841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg
901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa
Una Chop2 con mutación doble L132C/T159C de la invención puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posiciones 132 y 159 subrayadas y en negrita, s Eq ID NO: 16):
1 MDYGGALSAVGRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFYAYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPVICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFFHAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHTIIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 con mutación individual T159S de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posición 159 subrayada y en negrita, SEQ ID NO: 17):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGSI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 con mutación doble L132C/T159S de la invención puede codificarse mediante la siguiente secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 18):
1 atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct
61 gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc
121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct
181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc
241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc
301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga
361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc
421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggcagcatt
481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg
541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat
601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc
661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg
721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg
781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat
841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg
901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa
Una Chop2 con mutación doble L132C/T159S de la invención puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posiciones 132 y 159 subrayadas y en negrita, s Eq ID NO: 19):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGSI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 con mutación individual L132A de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posición 132 subrayada y en negrita, SEQ ID NO: 20):
1 MDYGGALSAVGRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCGWEEIYVCAIE MVKVILEFFFEFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV IAIHLSNLTGLSNDYSRRTM GLLVSDIGTIVWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGYHTVPKGRCRQ VVTGMAWLFFVSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCWGLLGHYLRVL IHEHILIHGDIRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 con mutación doble L132A/T159C de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 21):
1 ATGGACTACG GGGGGGCTCT GTCTGCTGTC GGGAGGGAAC TGCTGTTTGT GACTAACCCT
61 GTCGTCGTGA ACGGGAGTGT GCTGGTCCCT GAGGACCAGT GCTACTGTGC CGGCTGGATC
121 GAATCACGCG GAACCAACGG GGCCCAGACA GCTAGCAATG TGCTGCAGTG GCTGGCCGCT
181 GGGTTTAGTA TCCTGCTGCT GATGTTCTAC GCCTATCAGA CTTGGAAGTC AACCTGCGGC
241 TGGGAGGAAA TCTACGTGTG CGCTATTGAG ATGGTGAAAG TGATCCTGGA GTTCTTCTTC
3 01 GAGTTCAAGA ACCCAAGCAT GCTGTACCTG GCTACTGGAC ACCGAGTGCA GTGGCTGAGA
361 TATGCAGAAT GGCTGCTGAC ATGCCCCGTC ATCGCCATTC ACCTGTCCAA CCTGACAGGC
421 CTGAGCAATG ACTACTCCAG GAGAACTATG GGACTGCTGG TGTCCGACAT CGGCTGCATT
481 GTCTGGGGAG CAACTTCTGC TATGGCAACC GGATACGTGA AGGTCATCTT TTTCTGCCTG
541 GGGCTGTGCT ATGGCGCAAA TACCTTTTTC CACGCAGCCA AGGCCTACAT TGAGGGGTAT
601 CATACCGTGC CAAAAGGCCG GTGCCGACAG GTGGTCACAG GAATGGCTTG GCTGTTTTTC
661 GTCTCTTGGG GAATGTTTCC CATCCTGTTC ATTCTGGGGC CTGAAGGGTT CGGCGTGCTG
721 TCTGTCTACG GAAGTACAGT GGGGCATACT ATCATTGACC TGATGTCCAA AAACTGTTGG
781 GGCCTGCTGG GACACTATCT GAGAGTGCTG ATCCACGAGC ATATCCTGAT TCATGGCGAT
841 ATTCGGAAGA CCACAAAACT GAATATCGGC GGAACCGAGA TTGAAGTGGA AACACTGGTG
901 GAAGACGAGG CTGAGGCTGG GGCTGTGAAC AAGGGGACTG GCAAA
Una Chop2 con mutación doble L132A/T159C de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posiciones 132 y 159 subrayadas y en negrita, SEQ ID NO: 22):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV IAIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Un Chop2 con mutación individual T159A de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posición 159 subrayada y en negrita, SEQ ID NO: 23):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VVVNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGAI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ VVTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Un Chop2 con mutación doble L132C/T159A de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 24):
1 atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct
61 gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc
121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct
181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc
241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc
301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga
361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc
421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggcgccatt
481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg
541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat
601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc
661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg
721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg
781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat
841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg
901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa
Un Chop2 con mutación doble L132C/T159A de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (posiciones 132 y 159 subrayadas y en negrita, s Eq ID NO: 25):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGAIVWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Una Chop2 de tipo natural (WT) de la divulgación puede codificarse mediante la siguiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 26):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNPVVVNGSVLVPEDQCYCAGWIESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCGWEEIYVCAIEMVKVILEFFFEFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTGLSNDYSRRTMGLLVSDIGTIVWGATSAMAT GYVKVIFFCL
181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGYHTVPKGRCRQVVTGMAWLFFVSWGMFPILF ILGPEGFGVL
241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCWGLLGHYLRVLIHEHILIHGDIRKTTKLNIG GTEIEVETLV
301 EDEAEAGAVN KGTGK
Proteínas de ChR2 mutantes de la invención también demuestran cinéticas de canal más lentas. Se encontró que una sensibilidad lumínica más alta se correlaciona con cinéticas de canal más lenta, indicando una compensación entre sensibilidad lumínica y cinéticas de canal. Las proteínas Chop2 que forman las proteínas de ChR2 de la presente invención también pueden comprender mutaciones o modificaciones adicionales que pueden mejorar las cinéticas de canal, o aumentar la tasa de desactivación, de ChR2. Mutantes de ChR2 particularmente preferidos equilibran el umbral de sensibilidad lumínica con las cinéticas de canal.
Composiciones y kits
Las Composiciones y kits de la divulgación comprenden al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que codifica una proteína Chop2 mutante, y el ChR2 resultante, de la invención. La al menos una molécula de ácido nucleico o molécula de polipéptido que codifica una proteína Chop2 mutante de la divulgación puede incluir además un portador farmacéuticamente aceptable. Los kits de la divulgación incluyen además instrucciones para administrar una composición de la invención a un sujeto.
Usos terapéuticos
Se realizaron mutaciones en una proteína de fusión de Chop2-GFP con codones optimizados para crear mutaciones individuales y dobles en los sitios L132 (leucina 132) y T159 (treonina 159). Se examinaron en primer lugar las propiedades funcionales de cada ChR2 mutante, o una combinación de las mismas, en células HEK. Se obtuvieron vectores de virus VAA2 que portaban constructos de Chop2 mutante-GFP impulsados por el promotor de CAG y se inyectaron por vía intravítrea en los ojos de ratones adultos. Se examinaron las respuestas a la luz mediadas por Chop2 mutante usando registros de matriz de múltiples electrodos de retinas de preparación completa.
El ChR2 con mutación individual, es decir, L132 y T159C, disminuye notablemente la intensidad luminosa umbral que se requiere para provocar una fotocorriente mediada por ChR2. Además, se encontró que varias variantes de ChR2 con mutación doble, incluyendo L132C/T159C, L132A/T159C y L132C/T159S, aumentaban adicionalmente la fotocorriente por encima de los resultados de cualquier ChR2 con mutación individual a intensidades luminosas bajas. Los mutantes dobles mostraron una disociación más lenta, que es probable que contribuya a la fotocorriente aumentada a las intensidades luminosas bajas. Se observó la actividad de disparo neuronal3de las qélulas ganglionares retinianas mediada por el mutante doble L132C/T159C a la intensidad luminosa de 10 fotón/cm /s ya la longitud de onda de 473 nm. Este nivel de luz es aproximadamente de 1,5 a 2 unidades logarítmicas por debajo del nivel de luz que se requiere para desencadenar la actividad de disparo neuronal con ChR2 de tipo natural. El disparo neuronal de las células ganglionares retinianas que expresan L132C/T159C podría seguir una frecuencia de parpadeo de luz de hasta 15 Hz. Estudios en curso están evaluando la expresión y seguridad a largo plazo de ChR2 mutantes de la invención en neuronas retinianas.
Además, no se encontró que la expresión de las proteínas Chop2 mutantes, y las proteínas de ChR2 resultantes, de la presente invención causaran neurotoxicidad de hasta dos meses después de la inyección viral en ratones, demostrando la seguridad de la presente invención para uso terapéutico.
Vectores para su uso en la presente invención pueden incluir diversos vectores virales, tales como virus recombinantes y plásmidos, es decir, virus adenoasociados recombinantes (VAAr), adenovirus recombinantes, retrovirus recombinantes, lentivirus recombinantes y otros virus conocidos en la técnica.
En algunos aspectos, la expresión de las proteínas de Chop2 de la presente invención se impulsa por un promotor constitutivo, es decir, promotor de CAG, promotor de CMV, LTR. En otros aspectos, el promotor es un promotor específico de células o inducible. Pueden preferirse los promotores de tipo específico de células que permiten la expresión de proteínas Chop2 en subpoblaciones de células específicas, es decir, células neuronales retinianas o
células degeneradoras. Estas células pueden incluir, pero no se limitan a, una célula ganglionar retiniana, una célula fotorreceptora, una célula bipolar, un bastón bipolar, un cono bipolar de tipo ON, una célula ganglionar retiniana, una célula ganglionar retiniana fotosensible, una célula horizontal, una célula amacrina o una célula amacrina AII. Son bien conocidos en la técnica promotores de tipo específico de células. Los promotores de tipo específico de células particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a, mGluR6, NK-3 y Pcp2(L7).
En algunos aspectos, el uso de diferentes genes de opsina además de las proteínas Chop2 mutantes de la presente invención y la expresión génica dirigida pueden aumentar adicionalmente la sensibilidad lumínica o mejorar la visión. La información visual se procesa a través de la retina por medio de dos rutas: una ruta ON que señaliza el aumento de luz, y una ruta OFF que señaliza la disminución de luz. La existencia de la ruta ON y OFF es importante para la potenciación de la sensibilidad al contraste. La señal visual en la ruta ON se transmite desde los conos bipolares ON hasta las células ganglionares ON. Tanto los conos bipolares ON como las células ganglionares ON se despolarizan en respuesta a la luz. Por otra parte, la señal visual en la ruta OFF se lleva a cabo desde los conos bipolares OFF hasta las células ganglionares OFF. Tanto los conos bipolares OFF como las células ganglionares OFF se hipopolarizan en respuesta a la luz. Los bastones bipolares, que son responsables de la capacidad para ver en luz tenue (visión escotópica), son células bipolares ON (se despolarizan en respuesta a la luz). Los bastones bipolares transmiten la señal de visión a través de células amacrinas AII (unas células retinianas de tipo ON) hasta los conos bipolares ON y OFF.
Por consiguiente, puede usarse un sistema de rodopsina doble para recapitular las rutas ON y OFF esenciales para el procesamiento y la agudeza visuales. En resumen, una proteína Chop2 de la presente invención puede dirigirse específicamente a neuronas retinianas de tipo ON (es decir, células ganglionares de tipo ON y/o células bipolares de tipo ON), mientras que un sensor de luz de hipopolarizacion (es decir, halorrodopsina u otra bomba de cloro conocida en la técnica) pueden dirigirse a neuronas retinianas de tipo OFF (es decir, células ganglionares de tipo OFF y/o células bipolares de tipo OFF) para crear rutas ON y OFF. El direccionamiento específico hacia supoblaciones de células preferidas puede lograrse a través del uso de diferentes promotores específicos de célula. Por ejemplo, la expresión de Chop2 puede impulsarse por el promotor de mGluR6 para la expresión dirigida en neuronas retinianas de tipo ON (es decir, células ganglionares de tipo ON y/o células bipolares de tipo ON) mientras que una expresión de canal de hipopolarización, tal como halorrodopsina, se impulsa por el promotor de NK-3 para la expresión dirigida en neuronas retinianas de tipo OFF (es decir, células ganglionares de tipo OFF y/o células bipolares de tipo OFF).
Un enfoque alternativo para restablecer las rutas ON y OFF en la retina se logra mediante la expresión de un sensor de luz de despolarización, tal como ChR2, en bastones bipolares o amacrina AII. En este enfoque, la despolarización de bastones bipolares o células amacrinas AII puede conducir a las respuestas ON y OFF a los niveles de los conos bipolares y las células ganglionares retinianas posteriores. Por tanto, se mantienen las rutas ON y OFF que son inherentes en la retina.
La presente invención puede formularse en una composición farmacéutica o medicamento adecuado para su administración a un sujeto o paciente. Las vías de administración adecuadas incluyen, por ejemplo, inyección intravítrea, intraocular o subretiniana.
Tales formulaciones comprenden un vehículo, diluyente, portador o excipiente farmacéutica y/o fisiológicamente aceptable, tal como solución salina tamponada u otros tampones, por ejemplo, HEPES, para mantener el pH fisiológico. Para una descripción de tales componentes y su formulación, véase, en general, Gennaro, AE., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 2003 o la última edición). Véase también el documento WO00/15822. Si la preparación va a almacenarse durante periodos prolongados, puede congelarse, por ejemplo, en presencia de glicerol.
La composición farmacéutica descrita anteriormente se administra a un sujeto que tiene una enfermedad visual o que produce ceguera mediante cualquier vía apropiada, preferiblemente mediante inyección intravítrea o subretiniana, dependiendo de la capa retiniana que se seleccione como diana.
Las divulgaciones de Bennett y colaboradores (citadas en el presente documento) se refieren a la selección como diana del epitelio pigmentario retiniano (la capa más distal del espacio vítreo). Según la presente invención, el polipéptido o constructo de Chop2 se dirige a las células retinianas, es decir, las células bipolares o células ganglionares retinianas. Se sabe que puede accederse a tales células de manera razonablemente bien mediante inyección intravítrea, tal como se da a conocer en el presente documento. La inyección intravítrea y/o subretiniana puede proporcionar el acceso necesario a las células bipolares, especialmente en circunstancias en que la capa de células fotorreceptoras está ausente debido a degeneración (lo que es el caso en determinadas formas de degeneración que la presente invención intenta superar).
Para someter a prueba la capacidad del vector para expresar los mutantes de Chop2 de la presente invención, específicamente en neuronas retinianas de mamífero, mediante administración mediada por VAA, puede insertarse una combinación de una secuencia promotora preferida unida a un gen indicador tal como LacZ o GFP unida a una secuencia de poli A de SV40 en un plásmido y empaquetarse en partículas virales de VAAr, concentrarse,
someterse a prueba para determinar adenovirus contaminantes y titularse para determinar VAAr usando un ensayo de centro infeccioso. Puede inyectarse en los ojos derechos de varios sujetos de prueba, preferiblemente ratones consanguíneos, por vía subretiniana aproximadamente 1 |il de la preparación de VAAr (por ejemplo, más de aproximadamente 1010 unidades infecciosas ml). Dos semanas después, los ojos derecho (de prueba) e izquierdo (de control) de la mitad de los animales pueden extraerse, fijarse y teñirse con un sustrato o anticuerpo apropiado u otra sustancia para revelar la presencia del gen indicador. La mayoría de las retinas de prueba en los ojos con inyección mostrarán una región teñida focal, por ejemplo, azul para LacZ/Xgal, o verde para GFP de acuerdo con una ampolla subretiniana del virus inyectado creando un desprendimiento de retina localizado. Todos los ojos de control pueden ser negativos para el producto del gen indicador. Se detecta la expresión del gen indicador examinada en ratones sacrificados en periodos posteriores durante al menos 10 semanas tras la inyección, lo que sugiere la expresión persistente del transgén indicador.
En un aspecto, los constructos de Chop2 se empaquetan en vectores de adenovirus para la administración del transgén. Una cantidad eficaz de viriones de VAAr que portan una secuencia de ácido nucleico que codifica el ADN de Chop2 bajo el control del promotor de elección, preferiblemente un promotor de CMV constitutivo o un promotor específico de célula, tal como mGluR6, está preferiblemente en el intervalo de entre aproximadamente 1010 y aproximadamente 1013 unidades infecciosas de VAAr en un volumen de entre aproximadamente 150 y aproximadamente 800 |il por inyección. Las unidades infecciosas de VAAr pueden medirse según McLaughlin, SK et al., 1988, J Virol 62:1963. Más preferiblemente, la cantidad eficaz es de entre aproximadamente 1010 y aproximadamente 1012 unidades infecciosas de VAAr y el volumen de inyección es preferiblemente de entre aproximadamente 250 y aproximadamente 500 |il. El profesional sanitario puede seleccionar otras dosificaciones y volúmenes, preferiblemente dentro de estos intervalos, pero posiblemente fuera de ellos, teniendo en cuenta el estado físico del sujeto (preferiblemente un humano), que está tratándose, incluyendo la edad, el peso, la salud general y la naturaleza y la gravedad del trastorno ocular particular.
También puede ser deseable administrar dosis adicionales (“administraciones de refuerzo”) del/de los presentes ácido(s) nucleico(s) o composiciones de VAAr. Por ejemplo, dependiendo de la duración de la expresión transgénica dentro de la célula diana ocular, puede administrarse un segundo tratamiento tras 6 meses o al año, y puede repetirse de manera similar. No se espera que se generen anticuerpos neutralizantes frente a VAA en vista de las vías y dosis usadas, permitiendo de ese modo rondas de tratamiento repetidas.
El profesional sanitario puede monitorizarse la necesidad de tales dosis adicionales usando, por ejemplo, pruebas electrofisiológicas bien conocidas y otras pruebas de la función retiniana y visual y pruebas del comportamiento visual. El profesional sanitario podrá seleccionar las pruebas apropiadas aplicando las capacidades de rutina en la técnica. Puede ser deseable inyectar volúmenes mayores de la composición en dosis tanto individuales como múltiples para mejorar adicionalmente los parámetros de salida relevantes.
Trastornos oculares
Los trastornos oculares para los que se desean las presentes proteínas Chop2, y las proteínas de ChR2 resultantes, y que pueden usarse para mejorar uno o más parámetros de visión incluyen, pero no se limitan a, anomalías del desarrollo que afectan a los segmentos tanto anterior como posterior del ojo. Los trastornos del segmento anterior incluyen glaucoma, cataratas, distrofia corneal, queratocono. Los trastornos del segmento posterior incluyen trastornos de ceguera producidos por el mal funcionamiento de fotorreceptores y/o muerta producida por distrofias y degeneraciones de la retina. Los trastornos de la retina incluye ceguera nocturna estacionaria congénita, degeneración macular asociada a la edad, distrofias de conos congénitas y un gran grupo de trastornos relacionados con retinitis pigmentaria (RP). Estos trastornos incluyen muerte predispuesta genéticamente de células fotorreceptoras, bastones y conos en la retina, que se produce a diversas edades. Entre estas están retinopatías graves, tales como subtipos de la propia RP que avanzan con la edad y producen ceguera en la niños y adultos jóvenes, y enfermedades asociadas con RP, tales como subtipos genéticos de LCA, que con frecuencia dan como resultado pérdida de visión durante la infancia, ya en el primer año de vida. Estos últimos trastornos generalmente se caracterizan por reducción grave, y a menudo pérdida completa de células fotorreceptoras, bastones y conos. (Trabulsi, EI, ed., Genetic Diseases of the Eye, Oxford University Press, NY, 1998).
En particular, las proteínas Chop2 y de ChR2 de la presente invención son útiles para el tratamiento y/o el restablecimiento de al menos la visión parcial en sujetos que han perdido la visión debido a trastornos oculares, tales como retinopatías asociadas con RPE, que se caracterizan por una conservación a largo plazo de la estructura del tejido ocular pese a la pérdida de función y por la asociación entre la pérdida de función y el defecto o ausencia de un gen normal en las células oculares del sujeto. Se conoce una variedad de tales trastornos oculares, tales como enfermedades que producen ceguera que comienzan en la infancia, retinosis pigmentaria, degeneración macular y retinopatía diabética, así como enfermedades que producen ceguera ocular conocidas en la técnica. Se prevé que estos otros trastornos, así como los trastornos que producen ceguera de causas desconocidas en la actualidad que se caractericen más tarde por la misma descripción anterior, puedan tratarse también satisfactoriamente mediante las proteínas Chop2 y de ChR2 de la presente invención. Por tanto, el trastorno ocular particular tratado por la presente invención puede incluir los trastornos mencionados anteriormente y varias enfermedades que todavía no se han caracterizado.
Optogenética
El campo emergente de la optogenética implica la combinación de métodos genéticos y ópticos para controlar acontecimientos específicos en células seleccionadas como diana de un tejido vivo. La optogenética puede usarse en mamíferos y otros animales que se mueven libremente. Además, la precisión temporal (escala de tiempo de milisegundos) de los métodos optogenéticos es suficiente para funcionar en sistemas biológicos intactos.
La presente divulgación proporciona terapia génica de Chop2 para tejidos retinianos del ojo, introduciendo en células retinianas un polipéptido o ácido nucleico que codifica al menos una forma mutante de Chop2. Las proteínas Chop2/ChR2 mutantes de la invención están adaptadas específicamente para activarse por luz a umbrales inferiores de intensidades luminosas que sus homólogas de tipo natural. Por consiguiente, las proteínas Chop2/de ChR2 mutantes de la invención pueden usarse para activar células de la retina y el sistema visual usando fuentes de iluminación menos dañinas. Las proteínas Chop2/de ChR2 mutantes también conducen fotocorrientes mayores tras la activación, dando como resultado una respuesta más robusta o eficaz de las células que expresan Chop2/ChR2 mutantes.
Por ejemplo, las proteínas Chop2 mutantes de la invención se administran a un sujeto a través de la inyección local, intravítrea o subretiniana de una molécula de ácido nucleico que codifica Chop2 mutante, una molécula de polipéptido de Chop2 mutante o una célula que expresa Chop2/ChR2 mutante. Las células retinianas del sujeto expresan las proteínas Chop2 mutantes dentro de la membrana plasmática. Cuando las células retinianas transfectadas o transformadas encuentran radiación luminosa, las células retinianas transfectadas o transformadas transducen una señal mejorada o restablecida.
Estos métodos pueden usarse en sujetos de visión normal y/o deficiente. Los mutantes de Chop2/ChR2 de la invención pueden conservar, mejorar o restablecer la visión. Además, los mutantes de Chop2/ChR2 de la invención se usan para conservar, mejorar o restablecer la transducción de información no visual desde las células ganglionares retinianas fotosensibles hasta el cerebro.
El término “visión”, tal como se usa en el presente documento se define como la capacidad de un organismo para detectar la luz de manera útil como un estímulo para diferenciación o acción. Se pretende que visión englobe lo siguiente:
1. Detección o percepción de luz: la capacidad para distinguir si la luz está presente o no;
2. Proyección de luz: la capacidad para distinguir la dirección de la que procede un estímulo luminoso;
3. Resolución: la capacidad para detectar diferentes niveles de brillo (es decir, contraste) en un objetivo de letra o retícula; y
4. Reconocimiento: la capacidad para reconocer la forma de un objetivo visual con referencia a los diversos niveles de contraste dentro del objetivo.
Por tanto, “visión” incluye la capacidad para detectar simplemente la presencia de luz. Los polipéptidos y polinucleótidos que codifican Chop2 mutante de la presente invención pueden usarse para mejorar o restablecer la visión, incluyendo la mejora o el restablecimiento de la visión, por ejemplo, aumentos en la detección o percepción de luz, aumento en la sensibilidad lumínica o fotosensibilidad en respuesta a un estímulo luminoso, aumento en la capacidad para distinguir la dirección de la que procede un estímulo luminoso, aumento en la capacidad para detectar diferentes niveles de brillo, aumento en la capacidad para reconocer la forma de un objetivo visual, y aumentos en el potencial provocado visual o en la transmisión desde la retina hasta la corteza. Como tal, la mejora o el restablecimiento de la visión puede incluir o no el restablecimiento completo de la vista, es decir, en el que la visión del paciente tratado con la presente invención se restablece hasta el grado de visión de un individuo no afectado. La recuperación visual descrita en los estudios con animales descritos a continuación puede colocar, en lo que se refiere a los humanos, a la persona en el límite inferior de la función de visión aumentando un aspecto de visión (es decir, la sensibilidad lumínica o el potencial provocado visual) sin restablecer la vista completa. No obstante, la colocación en un nivel de este tipo constituiría un beneficio significativo, porque estos individuos podrían entrenarse en movilidad y potencialmente en tareas de resolución de orden bajo lo que les proporcionarían un nivel de independencia visual mejorado enormemente en comparación con la ceguera total. Incluso la percepción de luz básica puede usarse por individuos afectados visualmente, cuya visión se mejora usando las presentes composiciones y métodos, para llevar a cabo tareas diarias específicas y mejorar la movilidad, capacidad y calidad de vida general.
El grado de restablecimiento de la visión puede determinarse a través de la medición de la visión antes, y preferiblemente después de, administrar un vector que comprende, por ejemplo, ADN que codifica Chop2. La visión puede medirse usando cualquiera de varios métodos bien conocidos en la técnica o métodos todavía no establecidos. La visión, ya sea mejorada o restablecida por la presente invención, puede medirse mediante
cualquiera de las siguientes respuestas visuales:
1. una respuesta de detección de luz por parte del sujeto tras la exposición a un estímulo luminoso, en que se busca evidencia para una respuesta fiable de una indicación o movimiento en la dirección general de la luz por parte del individuo cuando la luz está apagada;
2. una respuesta de proyección de luz por parte del sujeto tras la exposición a un estímulo luminoso, en que se busca evidencia para una respuesta fiable de una indicación o movimiento en la dirección específica de la luz por parte del individuo cuando la luz está apagada;
3. resolución de luz por parte del sujeto de un estímulo visual con patrón de luz frente a oscuridad, que mide la capacidad del sujeto para resolver estímulos visuales con patrón de luz frente a oscuridad tal como se pone de manifiesto por:
a. la presencia de movimientos oculares de nistagmo producidos de manera optocinética fiables demostrables y/o movimientos relacionados de la cabeza o el cuerpo que demuestran el seguimiento del objetivo (véase anteriormente), y/o
b. la presencia de una capacidad fiable para distinguir un estímulo visual con patrón y para indicar tal distinción mediante medios verbales o no verbales incluyendo, por ejemplo, señalización, o presión de una barra o botón; o 4. registro eléctrico de una respuesta de la corteza visual a un estímulo de destello luminoso o un estimulo visual con patrón, que es un punto final de transmisión eléctrica desde una retina restablecida hasta la corteza visual, también denominado potencial provocado visual (VEP). La medición puede ser mediante registro eléctrico sobre la superficie del cuero cabelludo en la región de la corteza visual, sobre la superficie cortical y/o registro dentro de células de la corteza visual.
Por tanto, la mejora o el restablecimiento de la visión, según la presente invención, puede incluir, pero no se limita a: aumentos en la amplitud o la cinética de fotocorrientes o respuesta eléctrica en respuesta al estímulo luminoso en las célula retinianas, aumentos en la sensibilidad lumínica (es decir, disminución de la intensidad luminosa umbral requerida para iniciar una fotocorriente o respuesta eléctrica en respuesta al estímulo luminoso, requiriendo de ese modo menos luz o luz más baja para provocar una fotocorriente) de las célula retinianas, aumentos en el número o la amplitud de disparos neuronales o actividad neuronal provocados por luz, aumentos en respuestas a la luz en la corteza visual, lo que incluye aumentar el potencial provocado visual transmitido desde la retina o las células retinianas hasta la corteza visual o el cerebro.
Pueden usarse tanto estudios in vitro como in vivo para evaluar los diversos parámetros de la presente invención, incluyendo modelos animales reconocidos de trastornos oculares humanos que producen ceguera. Son útiles los modelos animales grandes de retinopatía humana, por ejemplo, ceguera en la infancia. Los ejemplos proporcionados en el presente documento permiten que un experto en la técnica prevea fácilmente que este método puede usarse de manera similar en el tratamiento de una variedad de enfermedades retinianas.
Aunque los estudios anteriores realizados por terceros han demostrado que la degeneración retiniana puede retardarse mediante técnicas de terapia génica, la presente invención demuestra una recuperación fisiológica definitiva de la función, que se espera que genere o mejore diversos parámetros de visión, incluyendo parámetros del comportamiento.
Pueden obtenerse mediciones del comportamiento usando pruebas y modelos animales conocidos, por ejemplo actuación en un laberinto acuático, en el que un sujeto en que se ha conservado o restablecido la visión en diversos grados nada hacia la luz (Hayes, JM et al., 1993, Behav Genet 23:395-403).
En modelos en que se induce ceguera durante la vida adulta o se desarrolla ceguera congénita de manera suficientemente lenta como para que el individuo experimente visión antes de perderla, puede realizarse el entrenamiento del sujeto en diversas pruebas. De este modo, cuando estas pruebas vuelven a administrarse tras la pérdida visual para someter a prueba la eficacia de las presentes composiciones y métodos para determinar sus efectos de restablecimiento de la visión, los animales no tienen que aprender las tareas de novo aunque estén en un estado de ceguera. Otras pruebas de comportamiento no requieren aprendizaje y se basan en el instinto de determinados comportamientos. Un ejemplo es la prueba de nistagmo optocinético (Balquema GW et al., 1984, Invest Ophthalmol Vis Sci. 25:795-800; Mitchiner JC et al., 1976, Visión Res. 16:1169-71).
La presente invención también puede usarse en combinación con otras formas de terapia de visión conocidas en la técnica para mejorar o restablecer la visión. Por ejemplo, el uso de prótesis visuales, que incluyen implantes retinianos, implantes corticales, implantes de núcleo geniculado lateral o implantes de nervio óptico. Por tanto, además de la modificación genética de las neuronas retinianas supervivientes usando los presentes métodos, puede dotarse al sujeto que está tratándose de una prótesis visual antes, al mismo tiempo que o después de emplear el método molecular. La eficacia de las prótesis visuales puede mejorarse con el entrenamiento del individuo,
potenciando así el impacto potencial de la transformación de Chop2 de células del paciente tal como se contempla en el presente documento. Los métodos de entrenamiento, tales como entrenamiento de habituación caracterizado por entrenar al sujeto para reconocer (i) diversos niveles de estimulación con patrón y/o luz, y/o (ii) estimulación ambiental a partir de un objeto o una fuente de luz común tal como entendería un experto en la técnica; y entrenamiento de orientación y movilidad caracterizado por entrenar al sujeto para detectar visualmente objetos locales y moverse entre dichos objetos más eficazmente que sin el entrenamiento. De hecho, puede aplicarse aquí cualquier técnica de estimulación visual que se usa normalmente en el campo de la rehabilitación por dificultad para ver.
Ejemplos
Ejemplo 1: Generación de constructos de Chop2 mutantes marcados
Se realizaron mutaciones en una proteína de fusión Chop2-GFP con codones optimizados para crear mutaciones individuales y dobles en los sitios L132 (leucina 132) y T159 (treonina 159). Se generaron varios mutantes, por ejemplo, mutantes individuales tales como L132A, L132C, T159A, T159C y T159S, y mutantes dobles tales como L132C/T159C, L132C/T159S, L132A/T159C y L132C/T159A. Se clonaron transgenes de Chop2-GFP en un vector de VAAr bajo el control de un promotor de CAG usando métodos conocidos en la técnica.
Ejemplo 2: Análisis in vitro de constructos de Chop2 mutantes
Se examinaron en primer lugar las propiedades funcionales de cada Chop2 mutante, o una combinación de las mismas, en células HEK. Se administraron constructos de Chop2 a células HEK mediante infección adenoviral, por ejemplo. Tras la expresión de Chop2 de tipo natural o mutante, se formaron canales ChR2 de tipo natural y mutante. Se evaluaron las mediciones de la sensibilidad lumínica y otras propiedades de los canales ChR2 tal como se describe en el presente documento. Se generaron los estímulos lumínicos (fotones/cm2s a 460 nm) mediante una lámpara de arco de xenón y se atenuaron mediante filtros de densidad neutra: ND4,0 (2,8 * 1014), ND3,0 (1,4 * 1015), ND2,5 (4,8 * 1015); ND2,0 (1,6 * 1016), ND1,0 (1,3 * 1017), ND0 (1,2 * 1018). Se midieron corrientes provocadas por luz a partir de ChR2 de tipo natural, T159C, L132C, L132C/T159C y L132C/T159S. Se realizaron registros de pinzamiento zonal usando métodos conocidos en la técnica.
Registros representativos para este experimento que compara la sensibilidad lumínica entre los constructos de Chop2 demostraron que las mutaciones en L132 solas o en combinación con la mutación en T159 muestran una fotocorriente aumentada en comparación con el tipo natural (figuras 1A y 1B). La figura 1B muestra los mismos perfiles de corriente a una escala diferente para ilustrar la diferencia en amplitud de las fotocorrientes entre ChR2 de tipo natural y mutantes de ChR2 más claramente. La figura 1B compara específicamente los perfiles de corriente que resultan de la estimulación con luz usando el filtro de densidad neutra (ND2,5), equivalente a 4,8 * 1015 fotos/cm2/s; los perfiles se designan mediante las flechas. La amplitud de la fotocorriente del mutante L132C es mayor que la del tipo natural; la amplitud de la fotocorriente del mutante doble L132C/T159C es mayor que la de L132C; y la amplitud de la fotocorriente del mutante L132C/T159S es mayor que la de L132/T159C. Los perfiles de corriente de los mutantes de ChR2, particularmente de los mutantes dobles L132C/T159C y L132C/T159S, también muestran cinéticas de desactivación más lentas cuando se compran con el tipo natural y L132C.
La figura 2 muestra los registros representativos de las corrientes provocadas por luz de ChR2 de tipo natural, L132C, L132C/T159C y L132C/T159S tras la estimulación mediante un pulso de luz de 10 ms (1,2 * 1018 fotones/cm2/s a una longitud de onda de 460 nm) para comparar su evolución temporal de desactivación, o evolución temporal de desintegración después de apagado de luz. ChR2 mutantes muestran evoluciones temporales de desactivación más prolongadas, teniendo el mutante doble L132C/T159S la más prolongada. La sensibilidad lumínica superior, tal como se demuestra mediante L132C/T159C y L132C/T159S, puede estar correlacionada con cinéticas de canal más lentas.
Ejemplo 3: Administración ocular in vivo y análisis de constructos de Chop2 mutantes
Se obtuvieron vectores de virus VAA2 que portaban constructos de Chop2 mutante-GFP impulsados por el promotor de CAG y se inyectaron por vía intravítrea en los ojos de ratones adultos C57BL/6J. Se anestesió a los ratones adultos mediante inyección i.p. de ketamina (100 mg/kg) y xilazina (10 mg/kg). Bajo un microscopio de disección, se practicó una incisión mediante tijeras a través del párpado para exponer la esclerótica. Se realizó una pequeña perforación en la región de la escleróticas posterior al cristalino con una aguja y se inyectó una suspensión de vectores virales de 0,8-1,5 |il a la concentración de aproximadamente 1011 partículas genómicas/ml en el espacio intravítreo a través del orifico con una jeringa Hamilton con una aguja de punta roma de calibre 32. Para cada animal, habitualmente solo se inyectaron en un ojo vectores virales que portaban un constructo de Chop2, y el otro ojo se dejó sin inyectar o se le inyectaron vectores virales de control que portaban GFP solo. Tras la expresión de Chop2 de tipo natural o mutante de la presente invención, se formaron canales ChR2 mutantes o de tipo natural funcionales utilizando moléculas retinianas endógenas, y se evaluaron las propiedades de estas proteínas ChR2 tal como se describe en el presente documento.
Se examinaron las respuestas a la luz mediadas por ChR2 usando registros de matriz de múltiples electrodos de retinas de preparación completa. Se generaron estímulos lumínicos (fotones/cm2/s) mediante un láser azul de 473 nm y se atenuaron mediante filtros de densidad neutra: ND0 (6,3 * 101®), ND1,0 (7,4 * 1015) ND1,5 (2,7 * 1015), ND2,0 (7,3 * 1014), ND2,5 (3,2 * 1014), ND3,0 (8,5 * 1013), ND3,5 (3,8 * 1013) y ND4,0 (9,5 * 1012).
La matriz de múltiples electrodos se basó en los procedimientos notificados por Tian y Copenhagen (2003). En resumen, se diseccionó la retina y se colocó con los fotorreceptores hacia abajo sobre una tira de papel de filtro de nitrocelulosa (Millipore Corp., Bedford, MA). La preparación de retina se colocó en la cámara de registro de matriz de múltiples electrodos MEA-60 con electrodos de 30 |im de diámetro separados 200 |im (Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Alemania), con la capa de células ganglionares orientada hacia los electrodos de registro. Se perfundió la retina de manera continua en disolución extracelular oxigenada a 34 °C durante todos los experimentos. La disolución extracelular contenía (en mM): NaCl, 124; KCl, 2,5; CaCl2 , 2; MgCh, 2; NaH2PO4 , 1,25; NaHcO3, 26; y glucosa, 22 (pH 7,35 con 95 % de O2 y 5 % de CO2). Los registros se iniciaron habitualmente 60 min después de que la retina se colocara en la cámara de registro. El intervalo entre comienzos de cada estímulo luminoso fue de 10-15 s. Las señales se filtraron entre 200 Hz (punto de corte bajo) y 20 kHz (punto de corte alto). Se analizaron las respuestas de neuronas individuales usando el software Offline Sorter (Plexon, Inc., Dallas, TX).
Los mutantes de Chop2/ChR2 con mutaciones individuales, es decir, L132 y T159C, disminuyeron notablemente la intensidad luminosa umbral que se requiere para provocar una fotocorriente mediada por ChR2. Además, se encontró que varios mutantes dobles, incluyendo L132C/T159C, L132A/T159C y L132c /T159S, aumentaban adicionalmente la fotocorriente a intensidades luminosas bajas. Se usaron diferentes filtros de densidad neutra para atenuar los estímulos lumínicos para diferenciar las respuestas provocadas por luz de los constructos de Chop2 con luz baja. Se observó la actividad de disparo neuronal de las células ganglionares retinianas mediada por los mutantes de la presente invención a las intensidades luminosas de aproximadamente 1,5 a 2 unidades logarítmicas por debajo del nivel de luz que se requiere para desencadenar la actividad de disparo neuronal con ChR2 de tipo natural (figura 3). Específicamente, ChR2 de tipo natural no mostró ninguna actividad de disparo neuronal en respuesta a estímulos lumínicos con filtro de densidad neutra 2,5 (3,2 * 1014 fotones/cm2/s) mientras que los mutantes de ChR2 (L132C, L132C/T159C y L132C/T159S) demostraron actividad de disparo neuronal. De hecho, los mutantes de ChR2 todavía mostraron actividad de disparo neuronal en respuesta a la luz con filtros de densidad neutra 3,0 y 3,5. Por tanto, los mutantes de ChR2 de la presente invención poseen sensibilidad lumínica superior y, por tanto, una intensidad luminosa umbral notablemente inferior que se requiere para desencadenar una fotocorriente mediada por ChR2. Además, los mutantes dobles de ChR2 poseen una sensibilidad lumínica superior a la de los mutantes individuales, es decir L132C. Además, los disparos neuronales de las células ganglionares retinianas que expresan L132C/T159C y L132/T159S podían seguir una frecuencia de parpadeo de luz de hasta 15 Hz y 5 Hz, respectivamente (figura 4).
El mutante L132C/T159A muestra alta sensibilidad lumínica, probablemente el más sensible a la luz de entre estos mutantes, pero todavía muestra disociación extremadamente lenta (el canal continua abierto durante muchos envíos después de apagarse la luz). Resulta interesante que puede desconectarse más rápidamente usando una luz con longitudes de onda largas, tales como luz amarilla. El mutante L132C/T159A (codificado por las SEQ ID NO: 24 y 25) demuestra potencial significativo.
Dada la compensación entre sensibilidad lumínica y cinéticas de canal, los mutantes de Chop2/ChR2 que demuestran un equilibrio entre la sensibilidad lumínica y la cinética de canal, tales como L132C/T159C o L132C/T159S, pueden ser adecuados para la aplicación del restablecimiento de la visión.
Ejemplo 4: Análisis de constructos de Chop2 mutantes en modelos de enfermedad de ratón
Se conocen en la técnica modelos de ratón de enfermedades oculares degenerativas. Por ejemplo, los ratones homocigotos rd1 (rd1/rd1) son un modelo de degeneración de fotorreceptores usado comúnmente. Los ratones Rd1 portan una mutación nula en la GMP fosfodiesterasa cíclica, PDE6, similar a algunas formas de retinosis pigmentaria en humanos. Otros modelos de ratón de enfermedad ocular bien establecidos que pueden ser de interés particular para demostrar la seguridad y la eficacia del mutante de ChR2 incluyen los ratones rds (también conocido como PrphRd2), rd3, rd4, rd5, rd6, rd7, rd8, rd9, Pde6brd1° o cpfll.
Los constructos de Chop2-GFP de la presente invención pueden inyectarse por vía intravítrea en los ojos de ratones recién nacidos (P1) o adultos a los 2-12 meses de edad. La señal de GFP puede observarse en las retinas en las que se ha inyectado Chop2-GFP, para determinar los niveles de expresión de ChR2 o expresión en poblaciones de células particulares, tales como las células ganglionares retinianas. La expresión de Chop2 mutante-GFP puede monitorizarse durante una cantidad de tiempo predeterminada, es decir 3-6 meses, o 1 año tras la inyección viral. Pueden realizarse registros de pinzamiento zonal y matriz de múltiples canales usando los métodos conocidos en la técnica y descritos en el presente documento para medir las respuestas provocadas por luz de células que expresan Chop2 mutante-GFP in vivo.
Técnicas y pruebas adicionales están bien establecidas en la técnica para someter a prueba el restablecimiento de
la sensibilidad lumínica o la visión. Pueden examinarse los potenciales provocados visuales procedentes de la corteza visual o células que expresan Chop2-GFP, tal como se describe en la publicación PCT WO 2007/131180. Otras pruebas incluyen la evaluación del comportamiento de la agudeza visual en los ratones, es decir, prueba optomotriz virtual y laberinto acuático visual.
Ejemplo 5: Análisis de la expresión y la seguridad a largo plazo de la administración de constructos de Chop2 mutantes a neuronas retinianas
Se evaluó la neurotoxicidad en ratones adultos C57BL/6J a los que se inyectaron constructos de Chop2 de la presente invención. La seguridad de expresión de los mutantes de Chop2 en la retina se evaluó mediante inmunotinción y recuento de células tras la exposición a luz azul fuerte durante dos semanas. No se encontró que ninguno de los ratones mostrara síntomas de neurotoxicidad durante hasta dos meses tras la inyección.
Estudios en curso adicionales están evaluando la expresión y seguridad a largo plazo de mutantes de Chop2/ChR2 de la invención en neuronas retinianas.
Otras realizaciones
Aunque la invención se ha descrito conjuntamente con la descripción detallada de la misma, se pretende que la descripción anterior ilustre y no limite el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.
La bibliografía de patente y científica a la que se hace referencia en el presente documento establece el conocimiento que está disponible para los expertos en la técnica.
Claims (19)
1. Molécula de polipéptido aislado que comprende SEQ ID NO: 26 en la que el aminoácido en posición 132 de SEQ ID NO: 26 es cisteína (C) y el aminoácido en posición 159 es cisteína (C) o serina (S).
2. Molécula de polipéptido según la reivindicación 1, en la que el aminoácido en posición 159 es cisteína (C).
3. Molécula de polipéptido según la reivindicación 2, en la que la molécula de polipéptido comprende SEQ ID NO: 16.
4. Molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado según la reivindicación 3, que comprende SEQ ID NO: 15.
5. Molécula de polipéptido según la reivindicación 1, en la que el aminoácido en posición 159 es serina (S).
6. Molécula de polipéptido según la reivindicación 5, en la que la molécula de polipéptido comprende SEQ ID NO: 19.
7. Molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado según la reivindicación 6, que comprende SEQ ID NO: 18.
8. Molécula de ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 o 6.
9. Polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 o 6 o molécula de ácido nucleico aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 7 u 8, que comprende además un portador farmacéuticamente aceptable.
10. Célula que comprende la molécula de polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5 o 6 o molécula de ácido nucleico aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 7 u 8.
11. Célula según la reivindicación 10, en la que la célula se pone en contacto con el polipéptido aislado o el ácido nucleico aislado in vitro.
12. Célula según la reivindicación 11, en la que la célula es un fotorreceptor, una célula bipolar, un bastón bipolar, un cono bipolar de tipo ON, una célula ganglionar retiniana, una célula ganglionar retiniana fotosensible, una célula horizontal, una célula amacrina o una célula amacrina AII.
13. Célula según la reivindicación 12, en la que la célula es una célula ganglionar retiniana o una célula ganglionar retiniana fotosensible.
14. Composición que comprende la molécula de polipéptido aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 5, 6 o 9 o molécula de ácido nucleico aislado según una cualquiera de las reivindicaciones 4, 7, 8 o 9 o célula según una cualquiera de las reivindicaciones 10-13.
15. Composición según la reivindicación 14, para su uso en un método de mejora o restablecimiento de la visión en un sujeto.
16. Composición para su uso según la reivindicación 15, en la que el sujeto tiene visión deficiente, o el sujeto padece una enfermedad ocular.
17. Composición para su uso según la reivindicación 16, en la que la enfermedad ocular es degeneración macular o retinosis pigmentaria.
18. Composición para su uso según la reivindicación 15, en la que la composición es para administración mediante inyección intravítrea o subretiniana.
19. Composición para su uso según la reivindicación 15, en la que dicha mejora o restablecimiento de la visión comprende cualquiera de lo siguiente: aumentar la sensibilidad lumínica; disminuir la intensidad luminosa umbral requerida para desencadenar una fotocorriente; y aumentar el potencial provocado visual en la corteza visual.
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