ES2705537T3 - Producción de piripiropenos a partir de biomasa seca - Google Patents
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Abstract
Un proceso para obtener al menos un piripiropeno, que comprende las etapas de a) cultivar un organismo productor de piripiropeno en un caldo de cultivo en condiciones de cultivo, en el que se produce al menos un piripiropeno, b) producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % de al menos una parte de la biomasa obtenida en la etapa a), c) obtener al menos un piripiropeno a partir de la biomasa seca producida en la etapa b).
Description
DESCRIPCIÓN
Producción de piripiropenos a partir de biomasa seca
Campo de la invención
La invención se refiere a procesos para obtener piripiropenos a partir de biomasa seca, que tienen un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, y al uso de estos procesos para producir compuestos de Fórmula III y/o Fórmula IV y/o Fórmula V, para producir composiciones para el control de plagas, en particular insecticidas, que comprenden dichos compuestos.
Antecedentes de la invención
Los piripiropenos son un grupo de compuestos naturales, que son producidos como metabolitos secundarios por microorganismos y, en particular, por varios hongos filamentosos. Este grupo de compuestos ha llamado la atención porque muestran una inhibición muy potente de la acil-CoA colesterol aciltransferasa (ACAT) en microsomas de hígado de rata (Journal of Antibiotics (1996), 49 (3), 292-298) y tienen actividad insecticida contra varios insectos, por ejemplo, contra la larva de Helicoverpa armígera (Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429 4435), larva de la polilla Diamondback (WO2004/060065), Tenebrio molitor (WO2004/060065) y pulgones (WO2006/129714).
Hasta ahora, la síntesis química de piripiropenos sigue siendo bastante difícil, por lo que una gran proporción de piripiropenos todavía se produce a través de la fermentación de microorganismos. Los microorganismos que tienen la capacidad de producir piripiropenos son, por ejemplo, la cepa PF-1169 de Penicillium coprobium (Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008), la cepa F0-1289 de Aspergillus fumigatus (publicación de patente japonesa abierta a inspección pública No. 360895/1992), la cepa NRRL-3446 de Eupenicillium reticulosporum (Applied and Environmental Microbiology (1995), 61 (12), 4429-4435), la cepa F1959 de Penicillium griseofulvum (WO2004/060065), así como, la cepa FO1289 de Aspergillus fumigatus y su mutante Aspergillus fumigatus FO1289-2501. Muy a menudo, estos microorganismos, por ejemplo, Aspergillus fumigatus FO1289 y su mutante Aspergillus fumigatus FO1289-2501 producen no solo uno, sino varios piripiropenos diferentes que difieren en las estructuras de sus cadenas laterales (Journal of Antibiotics (1996), 49 (3), 292-298). La investigación en el área de los piripiropenos no solo ha permitido la identificación de microorganismos productores de piripiropeno y la identificación de diferentes tipos de piripiropenos naturales, sino que también ha proporcionado una plétora de derivados de piripiropenos producidos por modificación química de los naturales. Ejemplos de estos derivados, así como sus procesos de producción, se describen en los documentos EP1889540, EP2119361, EP2186815 y EP2426124. Los procesos para obtener piripiropenos incluyen procedimientos de extracción, como se describe, por ejemplo, en el Journal of Antibiotics (1995), 48 (8), 751-756, y Biological and Pharmaceutical Bulletin (2009), 32 (7), 1261-1265; ninguno de los cuales sugiere el uso de biomasa seca.
La recolección del potencial completo de este interesante grupo de compuestos naturales y sus derivados requerirá el uso de procedimientos efectivos de producción a gran escala de piripiropenos. Sin embargo, la producción de piripiropenos a través de la fermentación de microorganismos y su recolección a través de la extracción de la biomasa producida sigue sufriendo problemas técnicos y altos costos causados durante el manejo y almacenamiento de la biomasa producida y/o relacionados con el manejo de grandes volúmenes durante y después de la extracción de piripiropenos a partir de la biomasa. Los problemas técnicos de particular importancia son, por ejemplo, la falta de medios para el almacenamiento a largo plazo de la biomasa producida y la ocurrencia de alta resistencia en la filtración durante la extracción de piripiropenos de grandes volúmenes de biomasa.
La presente invención resulta en parte del descubrimiento de que es posible aislar piripiropenos de biomasa seca sin sufrir una influencia negativa sobre el rendimiento de piripiropenos extraídos en comparación con extracciones de material no seco. Mientras que al mismo tiempo la producción de biomasa seca y su uso para la extracción de piripiropenos aumentaron dramáticamente la estabilidad durante el almacenamiento de la biomasa, reduce los volúmenes procesados, dando como resultado una baja resistencia a través del filtro durante la extracción de piripiropenos y conduce a concentraciones más altas de piripiropenos después de la extracción.
Sumario de la invención
La invención incluye un proceso para obtener al menos un piripiropeno que comprende las etapas de
a) cultivar un organismo productor de piripiropeno en un caldo de cultivo en condiciones de cultivo, en el que se produce al menos un piripiropeno,
b) producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % de al menos una parte de la biomasa obtenida en la etapa a),
c) obtener al menos un piripiropeno a partir de la biomasa seca producida en la etapa b).
Este proceso puede comprender una etapa, en la que la biomasa seca producida en la etapa b) se produce
directamente mediante el secado por atomización del caldo de cultivo que comprende la biomasa, o se produce mediante el secado de la biomasa húmeda obtenida del caldo de cultivo.
La biomasa húmeda se puede obtener del caldo de cultivo a través de
a) filtración y/o centrifugación, o
b) filtración y aplicación de presión mecánica, o
c) filtración y/o centrifugación y aplicación de presión mecánica.
La biomasa húmeda puede haber sido adicionalmente
a) resuspendido en un medio de resuspensión, o
b) homogeneizado, que puede tener
c) un contenido de glucosa inferior a 5 g/L, puede tener
d) un contenido de agua entre más del 15 % y menos del 90 %, o puede tener
e) una combinación de al menos dos de estas características a) a d).
El proceso descrito anteriormente puede comprender además una etapa, en la que la biomasa seca, que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, se produce al secar en un deshidratador por aspersión, un secador de pasta molida, un Secador instantáneo, un secador de lecho fluido o un secador rotatorio. Preferiblemente, la biomasa seca, que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 8 %, se produce por secado en un deshidratador por aspersión o un secador de molino de pasta. La biomasa seca, con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, producida y usada en los procesos descritos anteriormente, puede almacenarse desde aproximadamente 5 horas, o hasta varios años, antes de que se obtenga el piripiropeno. En una realización de la invención, la biomasa seca consiste en más del 80 % de partículas que tienen un tamaño de partícula entre 0,01 mm y 5 mm.
Preferiblemente, la materia seca producida y usada en los procesos descritos anteriormente comprende al menos 95 % del piripiropeno producido durante el cultivo del organismo productor de piripiropeno, es decir, la cantidad de piripiropeno comprendido en la biomasa húmeda extraída del caldo de cultivo después de la fermentación del organismo productor de piripiropeno. Preferiblemente, el organismo productor de piripiropeno pertenece al género Penicillium, Eupenicillium o Aspergillus, y aún más preferido, el organismo productor de piripiropeno se encuentra en el grupo que consiste en Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum y Aspergillus fumigatus. Más preferido, el organismo productor de piripiropeno es Penicillium coprobium.
Los procesos descritos anteriormente normalmente comprenden una etapa en la que el piripiropeno se obtiene de la biomasa seca, con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, mediante extracción, preferiblemente mediante extracción con un disolvente seleccionado del grupo de metanol, tolueno y etil benceno, o es una mezcla de al menos dos de ellos. En una realización de la invención, los procesos descritos anteriormente comprenden una etapa de extracción de al menos un piripiropeno de la biomasa seca, que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, y separación del disolvente usado para la extracción a partir de la biomasa extraída por filtración, en donde la resistencia del filtro es preferiblemente inferior a 5 x 1013 mPas/m2
Los procesos descritos anteriormente también pueden comprender una etapa para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, en la que al menos un piripiropeno se obtiene a través de un proceso como se describió anteriormente, y se usa para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V. Estos procesos pueden comprender además la etapa de obtener o purificar el compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, que se puede usar adicionalmente para producir una composición para el control de plagas, que es preferiblemente un insecticida.
Una realización adicional de la invención es un proceso para obtener al menos un compuesto de Fórmula I, o para producir, al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, a partir de biomasa seca de un organismo productor de piripiropeno que comprende al menos un piripiropeno y que tiene un contenido de agua inferior al 8 %, o que tiene un contenido de agua inferior al 8 % y un tamaño de partícula entre 0,01 mm y 5 mm. La biomasa seca es preferiblemente de un organismo productor de piripiropeno seleccionado del grupo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum y Aspergillus fumigatus, aún más preferido, la biomasa seca es de Penicillium coprobium. Preferiblemente, este proceso es un proceso en el que se obtiene un compuesto de Fórmula II. En una realización adicional, el compuesto obtenido de Fórmula II se usa para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, preferiblemente usado para producir un compuesto de Fórmula V. El proceso incluso podría incluir una etapa adicional, en la cual al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, preferiblemente un compuesto de Fórmula V que se produce durante el proceso, se usa además para producir una composición para el control de plagas que comprende al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V. Preferiblemente la composición de control de plagas es un insecticida.
La invención también comprende el uso del uso de biomasa seca de un organismo productor de piripiropeno que comprende al menos un piripiropeno y que tiene un contenido de agua inferior al 8 %, o que tiene un contenido de
agua inferior al 8 % y un tamaño de partícula entre 0,01 mm y 5 mm, en un proceso para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V. La biomasa seca es preferiblemente de un organismo productor de piripiropeno seleccionado del grupo de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum y Aspergillus fumigatus, aún más preferida, la biomasa seca es de Penicillium coprobium.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 representa un dibujo esquemático de un secador de molino de pasta usado en los Ejemplos I y II. El proceso comienza con un suministro de biomasa húmeda (alimentación húmeda) en un contenedor en el lado izquierdo de la Figura 1. El contenedor se suministra con un rotor accionado por un motor (M) en la parte inferior del contenedor, para la homogeneización de la biomasa húmeda antes de ser alimentada al secador de molino de pasta por un tornillo motorizado (M). El secador de molino de pasta representado en el lado central izquierdo de la Figura 1, está provisto nuevamente con una serie de cuchillos rotativos en el tercio inferior del secador de molino de pasta. Los cuchillos rotativos son alimentados por un motor (M) en la parte inferior del secador de molino de pasta. El secador de molino de pasta también cuenta con un suministro de aire caliente en el tercio inferior de su volumen. El flujo de aire se muestra en el centro inferior derecho de la Figura 1 y se caracteriza por un control de flujo (fC), un dispositivo para calentar el aire y un control de temperatura (TC) que regula la potencia del dispositivo de calentamiento para proporcionarle al aire una temperatura de entrada predeterminada. El aire caliente suministrado al tercio inferior del secador de molino de pasta se mezcla con la biomasa húmeda proporcionada por el tornillo y homogeneizado por los cuchillos rotativos que giran cerca de la alimentación de la biomasa húmeda. El resultado de esta combinación es que la biomasa húmeda es absorbida por un vórtice de aire caliente en el tercio medio del volumen del secador de molino de pasta, donde se seca. La biomasa seca producida por este proceso es llevada hacia arriba por el aire caliente hacia el espacio de la cabeza (tercio superior del volumen) del secador de molino de pasta, donde fluye a través de un tubo a un contenedor adicional que comprende un filtro en el interior y está representado en el lado derecho de la Figura 1. La biomasa seca se recoge a través del filtro en la parte inferior del contenedor y se puede vaciar en un contenedor adicional para el almacenamiento o transporte adicional de la biomasa seca (producto seco). El tubo que conecta el secador de molino de pasta y el contenedor que comprende el embudo comprende un sensor adicional para el control de temperatura (TC) que mide la temperatura de la corriente de aire saliente (temperatura de salida) y regula la velocidad del motor (M) que acciona el tornillo de la alimentación de la biomasa húmeda al secador de molino de pasta. El propio secador de molino de pasta está provisto además de un control de presión (PC) que controla un motor (M) ubicado en la salida del contenedor que comprende el embudo y que controla la cantidad de aire (gas residual) que puede escapar del contenedor que comprende el embudo.
La Figura 2 representa un dibujo esquemático del deshidratador por aspersión usado en el Ejemplo III.
El deshidratador por aspersión consiste básicamente en una estructura en forma de embudo en la parte inferior del deshidratador por aspersión que tiene una altura descrita por H3, un diámetro total en la parte superior descrita por D1 y un diámetro en la parte inferior o abertura, respectivamente, descrita por D2. Encima de esta estructura en forma de embudo hay una sección media en forma de barril y que tiene una altura descrita por H2, y un diámetro superior e inferior idéntico al diámetro superior de la estructura en forma de embudo descrita por D1. La parte superior cerrada del deshidratador por aspersión comprende un espacio de cabeza que tiene una altura descrita por H1. Este espacio de cabeza comprende también un tubo y una boquilla a través de la cual se alimenta la biomasa húmeda y se atomiza en la sección media del deshidratador por aspersión. Todo el deshidratador por aspersión está provisto de un flujo de aire caliente, que recoge la biomasa húmeda finamente distribuida para secarla en el flujo de corriente que también discurre hacia abajo de la secadora. Un flujo mixto de biomasa seca y gas de secado deja la secadora en la parte inferior del cuerpo de la secadora hacia un separador sólido de gas.
Definiciones generales
Los términos "piripiropeno" y "piripiropenos" significan compuesto o compuestos de Fórmula I
en la que R1, R2, R3 y R4 tienen las combinaciones como se muestra en la Tabla 1
Tabla 1: Combinaciones de R1, R2, R3 y R4 de compuestos de Fórmula I y nombres de compuestos que tienen tales combinaciones
Por razones de ilustración, el término "Piripiropeno A" como se describe en la Fórmula I y la Tabla I significa un compuesto de Fórmula II, que también se conoce como 1,7,11-tri-O-acetilpiriropiropeno A
Los piripiropenos preferidos incluyen piripiropeno A hasta piripiropeno O como se describe en la Tabla 1, y son preferiblemente piripiropeno A, E y O, siendo el piripiropeno A el más preferido. También se prefieren los compuestos descritos en la Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV y Fórmula V.
El término "1,7,11-tri-desacetilpiripiropeno A" significa un compuesto de Fórmula III
El término "compuesto de Fórmula IV" significa un compuesto de Fórmula I, en la que:
R1 y R3 representan ciclopropilcarboniloxi, y
R2 representa hidroxilo, ciclopropilcarboniloxi o 2-cianobenzoiloxi
R4 representa hidroxilo,
Preferiblemente, el compuesto de Fórmula IV comprende una combinación, en la que:
R1 representa hidroxilo,
R2 y R3 representan ciclopropilcarboniloxi, y
R4 representa hidroxilo o ciclopropilcarboniloxi.
El término "1,11-di-O-ciclopropanocarboniM,7,11-trideacetilpiripiropeno A" significa un compuesto de Fórmula V:
Los piripiropenos descritos por la Fórmula I, Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV y Fórmula V incluyen también las sales de estos compuestos. Preferiblemente, las sales de los compuestos de Fórmula I, Fórmula IV y Fórmula V. Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido agrícola u hortícolamente aceptables tales como sales de clorhidrato, sales de nitrato, sales de sulfato, sales fosfóricas o sales de acetato.
Descripción detallada de realizaciones preferidas
La invención se refiere a procedimientos para producir piripiropenos y compuestos de Fórmula III y/o Fórmula IV y/o Fórmula V a partir de los piripiropenos obtenidos de la biomasa seca.
La invención se refiere además al uso de la biomasa seca, que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, para obtener piripiropenos o compuestos de Fórmula III y/o Fórmula IV y/o Fórmula V para producir un insecticida.
Por consiguiente, la invención comprende un proceso para obtener al menos un piripiropeno que comprende las etapas de
a) cultivar un organismo productor de piripiropeno en un caldo de cultivo en condiciones de cultivo, en el que se produce al menos un piripiropeno,
b) producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % a partir de al menos parte de la biomasa obtenida en la etapa a),
c) obtener al menos un piripiropeno a partir de la biomasa seca producida en la etapa b).
El piripiropeno obtenido se puede usar para producir derivados de piripiropeno. Los derivados preferidos de piripiropeno son compuestos del Formulario III, compuestos de Fórmula IV y compuestos de Fórmula V.
Por lo tanto, una realización adicional de la invención es un proceso para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, que comprende:
a) obtener piripiropeno a partir de biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % que comprende al menos un piripiropeno,
b) producir al menos un derivado de piripiropeno seleccionado del grupo de compuestos que consiste en el compuesto de Fórmula III, el compuesto de Fórmula IV y el compuesto de Fórmula V a partir del piripiropeno obtenido en la etapa a).
Otra realización de la invención es un proceso para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, preferiblemente un compuesto de Fórmula V, que comprende:
a) cultivar un organismo productor de piripiropeno en un caldo de cultivo en condiciones de cultivo, en las que se produce al menos un piripiropeno,
b) producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % a partir de al menos parte de la biomasa obtenida en la etapa a),
c) obtener al menos un piripiropeno a partir de la biomasa seca producida en la etapa b),
d) producir al menos un derivado de piripiropeno seleccionado del grupo de compuestos que consiste en el compuesto de Fórmula III, el compuesto de Fórmula IV y el compuesto de Fórmula V a partir del piripiropeno obtenido en la etapa c).
El piripiropeno obtenido en los procesos descritos anteriormente se obtiene preferiblemente de la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % mediante extracción de acuerdo con los
procedimientos disponibles en la técnica, por ejemplo, mediante los procedimientos que se describen más adelante.
El piripiropeno obtenido puede purificarse mediante procedimientos disponibles en la técnica, por ejemplo, para producir el piripiropeno respectivo en forma de un compuesto 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o cerca del 100 % puro, o se puede usar, aunque todavía esté incluido en el disolvente o disolventes, para extracción por un proceso para producir un derivado de piripiropeno.
Cultivo de un organismo productor de piripiropeno:
La biomasa que comprende al menos un piripiropeno puede producirse mediante la fermentación de organismos productores de piripiropeno. Los organismos productores de piripiropeno son cualquier tipo de células microbianas que tienen la capacidad de producir piripiropenos, ya sea por su conjunto natural de genes o porque son recombinantes de genes que proporcionan una, varias o todas las etapas de la biosíntesis de al menos un piripiropeno.
Se han descrito ejemplos de organismos productores de piripiropeno adecuados, así como sus respectivas condiciones de cultivo, en Pure Appl. Chem., Vol. 71, No. 6, páginas 1059-1064, 1999; en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters vol. 5, No. 22, páginas 2683-2688, 1995; y en la solicitud de patente japonesa Abierta a inspección pública No. 239385/1996, la solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública No. 184158/1994, el documento WO 2004/060065, la solicitud de patente japonesa abierta a inspección pública No. 259569/1996.
Los organismos productores de piripiropeno preferidos son microorganismos que pertenecen al género Penicillium, el género Eupenicillium o el género Aspergillus. Las especies preferidas de organismos productores de piripiropeno son: Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum o Aspergillus fumigatus y en particular Penicillium coprobium. Las cepas preferidas de estos organismos productores de piripiropeno son la cepa PF-1169 de Penicillium coprobium (Journal of Technical Disclosure No. 500997/2008), la cepa F1959 de Penicillium griseofulvum (WO2004/060065), la cepa NRRL-3446 de Eupenicillium reticulosporum (WO2004/060065) y la cepa FO1289 de Aspergillus fumigatus, incluida su variante Aspergillus fumigatus FO1289-2501 (WO94/09147), siendo entre ellas Penicillium coprobium PF1169 las más preferida.
Por lo general, los organismos productores de piripiropeno producen más de un compuesto de Fórmula I, por ejemplo, el documento WO94/109147 describe que Aspergillus fumigatus FO1289 es capaz de producir piripiropeno A, piripiropeno B, piripiropeno C y piripiropeno D. Por lo tanto, es posible obtener uno o varios piripiropeno a partir de la biomasa seca producida y usada de acuerdo con la invención.
Un organismo productor de piripiropeno también puede ser una célula microbiana, por ejemplo, Aspergillus oryzae, que comprende solo partes de los genes de la ruta biosintética para la producción de piripiropenos, pero que se suministra con precursores de piripiropeno durante las condiciones de fermentación. Tales microorganismos se han descrito, por ejemplo, en los documentos CA2787829 y CA2788058.
Los organismos productores de piripiropeno se fermentan preferiblemente en grandes cantidades en líquido, tal como en cultivos en suspensión. Los procedimientos preferidos son el cultivo con agitación en condiciones aeróbicas, el cultivo con burbujeo con agitación o el cultivo aeróbico en parte profunda, en particular, el cultivo con burbujeo con agitación es en la mayoría de los casos ventajoso.
El proceso de fermentación se realiza usualmente en biorreactores. Los biorreactores suelen permitir el control de las condiciones de cultivo como la temperatura, el pH, la tensión de oxígeno y los niveles de dióxido de carbono. Por ejemplo, los biorreactores son normalmente configurables, por ejemplo, usando puertos unidos a la tubería, para permitir que los componentes gaseosos como el oxígeno o el nitrógeno, se burbujeen a través de un cultivo líquido. El biorreactor puede estar presurizado. También se puede adaptar para permitir el suministro continuo o en forma continua de las fuentes de nitrógeno y/o carbono asimilables. Los biorreactores pueden comprender pequeños volúmenes, por ejemplo, para aplicaciones a escala de laboratorio, de 5 litros, 10 litros o 20 litros, pero también puede acomodar grandes volúmenes tales como 5.000 litros, 10.000 litros, 40.000 litros, 50.000 litros, 100.000 litros, 150.000 litros, 200.000 litros o incluso volúmenes más altos. La fermentación puede ser un proceso continuo, con una recolección o eliminación regular de la biomasa producida o un proceso por lotes, tal como un proceso por lotes de alimentación repetida que incluye una o más adiciones de fuentes de carbono y/o nitrógeno después de que la fermentación haya comenzado.
Por lo tanto, el proceso de fermentación se puede detener o interrumpir, y la biomasa producida se puede retirar del recipiente de cultivo, antes de que comience otro proceso o una nueva fermentación.
Las fuentes de carbono y nitrógeno se pueden proporcionar en composiciones separadas. Esto se debe a que las diferentes fuentes pueden estar sujetas a diferentes condiciones de esterilización, y además permite una variación en las cantidades relativas de carbono y nitrógeno u otros nutrientes durante la fermentación. Las diferentes fuentes de nutrientes pueden suministrarse por separado, o suministrarse simultáneamente, o suministrarse como una preparación combinada y se proporcionan preferiblemente en un líquido.
Las fuentes de nutrientes pueden ser fuentes complejas, medios definidos o compuestos individuales o aislados. Se prefieren las fuentes no complejas y, por lo tanto, los compuestos pueden agregarse en un alto grado de pureza y pueden ser compuestos químicos comunes (o disponibles comercialmente).
Las fuentes de nitrógeno adecuadas incluyen amoniaco o iones de amonio. La ventaja aquí es que el amoníaco puede actuar como un regulador del pH. Este se puede suministrar en forma de una sal de amonio, como nitrato, sulfato o fosfato o en forma de iones de amonio en sí mismos, por ejemplo, una solución acuosa de hidróxido de
amonio. También se pueden usar otras fuentes de nitrógeno inorgánico, tales como nitrato de sodio, urea o un aminoácido tal como asparagina o glutamina. Si el hongo es del género Rhizopus, entonces el nitrato preferiblemente no se usa como fuente de nitrógeno. Las fuentes de nitrógeno complejas incluyen hidrolizados de levadura, levadura primaria, harina de soja, hidrolizados de caseína, levadura, extracto de levadura o salvado de arroz.
La fuente de carbono puede comprender fuentes complejas tales como maltodextrina, harina de avena, melazas, aceite vegetal (por ejemplo, soja), extracto de malta o almidón. Las fuentes de carbono preferidas son fuentes de carbono no complejas tales como azúcares, tal como fructosa, maltosa, sacarosa, xilosa, manitol, glucosa, lactosa, citrato, acetato, glicerol o etanol.
El líquido acuoso puede contener además otras sustancias para ayudar en la fermentación, por ejemplo, un agente quelante (por ejemplo, ácido cítrico), un agente antiespumante (por ejemplo, aceite de soja), una vitamina (por ejemplo, tiamina y/o riboflavina), cualquier metal catalítico necesario (por ejemplo, metales alcalinotérreos tales como magnesio o calcio, o zinc o hierro y/u otros metales como cobalto y cobre), fósforo (por ejemplo, fosfato) y/o azufre (por ejemplo, sulfato). Preferiblemente, el líquido acuoso tendrá un bajo contenido de azufre, por ejemplo, menos de 3,0 g/L, preferiblemente menos de 2,0 g/L, o 1,0 g/L de azufre.
Preferiblemente, se controla el pH, la temperatura y/o el contenido de oxígeno (del líquido acuoso) durante la fermentación. Esto puede ser para mantener el pH, la temperatura y/o el contenido de oxígeno constante o dentro de un intervalo deseado. El pH del líquido acuoso durante la fermentación puede ser de pH 2 a pH 8, tal como de pH 3 a pH 7, óptimamente de pH 4 a pH 6, pero también puede ser por ejemplo de pH 6 a pH 8.
La temperatura del líquido acuoso durante la fermentación puede ser de 15 °C a 40 °C, o de 18 °C a 40 °C, tal como de 20 °C a 35 °C, óptimamente de 25 °C a 33 °C. En muchos casos, el crecimiento se produce alrededor de 26 °C a 37 °C.
Es importante que durante la fermentación se produzca la mezcla. Esto se puede lograr mediante la aireación, por ejemplo, burbujeando aire en el líquido acuoso. Esto puede servir al propósito adicional de proporcionar oxígeno a las células en crecimiento. Otras formas de agitación o mezcla incluyen la agitación, por ejemplo, usando un impulsor. La entrada de energía a través de la agitación generalmente se debe ajustar a un valor entre 1 a 20 W/L y, preferiblemente, a un valor de 2 a 5 W/L.
La agitación puede dar como resultado un flujo axial hidrofílico o puede diseñarse de manera que el medio acuoso se fuerce radialmente hacia afuera del impulsor, por ejemplo, similar a un flujo en una turbina. Una de las ventajas de la aireación y/o la agitación es que el contenido de oxígeno del líquido acuoso se puede mantener relativamente alto. Este puede ser de al menos el 10 %, tal como al menos el 15 %, óptimamente al menos el 20 % (en términos de saturación de aire).
La producción de piripiropenos varía según el medio y las condiciones de cultivo, o el organismo usado. Por consiguiente, la fermentación puede durar de 1 a 40 días, tal como de 5 a 20, o de 10 a 18 días, pero también puede ser opcionalmente más corta, por ejemplo, de 2 a 4 días. Por lo general, las condiciones de fermentación se seleccionan para que sean similares o idénticas a las condiciones de fermentación preferidas por el organismo cultivado durante la producción de piripiropeno. La acumulación de piripiropenos generalmente alcanza su punto máximo en 2 días a 25 días. Una fermentación más corta se presta para un lote, en lugar de un proceso continuo de fermentación.
En una realización preferida, el contenido de azúcar que puede usarse se ajusta a un máximo de 5 g/L, preferiblemente a un máximo de 1 g/L hacia el final de la fermentación, es decir, no se agrega azúcar y la fermentación se detiene solo cuando el contenido de azúcar es igual o inferior a este valor.
En una realización de la invención, la biomasa producida durante la fermentación se transforma directamente en biomasa seca, con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, mediante la secado por aspersión del caldo de cultivo que comprende la biomasa. Preferiblemente, las células de la biomasa se destruyen, por ejemplo, por un procedimiento descrito a continuación, antes de realizar la etapa de secado.
En otras realizaciones de la invención, la biomasa producida durante la fermentación se separa del caldo de cultivo, para producir biomasa húmeda que luego se usa para producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %.
Muerte de las células
La biomasa producida durante la fermentación se destruye preferiblemente antes de su separación del caldo de cultivo, pero también puede destruirse en una etapa posterior de los procesos de la invención. Las células de la biomasa se pueden destruir mediante procesos conocidos en la técnica. Preferiblemente, las células se destruyen mediante un tratamiento térmico directamente después de la fermentación. El tratamiento térmico puede llevarse a cabo en el recipiente de cultivo o en un aparato dedicado. En algunas realizaciones de la invención, la destrucción también se puede llevar a cabo en un aparato de funcionamiento continuo con un tiempo de residencia determinado. Si se usa tratamiento térmico, entonces la congelación es una posibilidad, aunque generalmente se prefiere el calentamiento (por ejemplo, la pasteurización). La destrucción de las células mediante calentamiento generalmente se realiza a una temperatura entre 60 °C y 120 °C, preferiblemente entre 70 °C y 90 °C durante un lapso de tiempo entre 5 y 180 minutos, preferiblemente durante un período entre 30 y 90 minutos.
La entrada de calor en el caldo de fermentación se puede lograr mediante un aparato intercambiador de calor tal como intercambiadores de calor de placas o intercambiadores de calor de tuberías o serpentines de calentamiento,
pero también mezclando sustancias como el agua a temperaturas elevadas. Un ejemplo de tal mezcla de sustancias es la inyección de vapor de agua.
Las temperaturas para destruir la biomasa que contiene piripiropeno pueden variar de 40 °C a 200 °C, pero preferiblemente de 50 a 120 °C e incluso más preferiblemente de 60 a 80 °C. El tiempo de residencia correspondiente a una temperatura elevada en el aparato para destruir la biomasa deberá adaptarse por experimentación rutinaria a las condiciones de cada caso individual, por ejemplo, volumen y diseño del recipiente de cultivo o del aparato dedicado para la destrucción de células, así como al organismo que proporciona la biomasa. Normalmente, el tiempo de residencia se selecciona de 1 a 500 minutos o de 10 a 120 minutos o de 5 a 80 minutos. Alternativamente, las células de la biomasa pueden destruirse mediante tratamientos químicos. Tales tratamientos químicos están fácilmente disponibles en la técnica. Por ejemplo, el ácido benzoico o azida de sodio, generalmente destruyen las células si se agregan al caldo de fermentación en cantidades de 0,1 % a 10 % (volumen/volumen).
Como alternativa, o adicionalmente, los microorganismos pueden destruirse después de la separación de la biomasa del caldo de cultivo, o mientras se resuspenden en un medio de resuspensión orgánico, o después de la separación de la biomasa de un medio de resuspensión orgánico, o durante la homogeneización de la biomasa, o durante el secado de la biomasa, o por una combinación de estas posibilidades.
Separación de la biomasa:
La biomasa producida durante el proceso de fermentación se puede separar del caldo de cultivo mediante procesos conocidos en la técnica. La biomasa se puede separar del volumen total del caldo de cultivo, o se puede separar solo de partes del volumen total, para permitir la fermentación continua. La separación de la biomasa se puede efectuar por procedimientos establecidos, preferiblemente por filtración o centrifugación, por ejemplo, por ultrafiltración, microfiltración, decantación o una combinación de filtración y centrifugación.
La filtración se puede realizar empleando las tecnologías de filtración habituales usadas en la técnica, como un separador vibratorio, un filtro de tamiz vibratorio, un separador vibratorio circular, un filtro de tambor rotatorio, un agitador de movimiento lineal/inclinado, un filtro de presión, filtración por flujo tangencial, a través de filtros de banda, filtros rotativos, filtros prensa, o técnicas similares en las que una barrera que consiste en el filtro separa la biomasa y permite que pase la fase líquida sin biomasa. Dependiendo de la técnica de filtración usada, el proceso de filtración generalmente se realiza a una presión de aproximadamente 0,5 a 15 bar, por ejemplo, en caso de que se utilice una prensa filtrante, o se realice a una presión inferior a la normal, tal como 0,01 a 0,9 bar, por ejemplo, en caso de que se utilice un filtro de tambor rotatorio.
La temperatura usada durante la separación de la biomasa suele ser entre 5 °C y 80 °C, pero también puede ser mayor, en particular si las células de la biomasa se destruyen mediante la aplicación de calor y la biomasa se separa del caldo de cultivo antes de la biomasa y se le había dado al caldo de cultivo para enfriarse.
El separador vibratorio puede incluir al menos un filtro de tamiz vibratorio. La biomasa tampoco debe adherirse significativamente al material de filtro. El material preferido de filtro es: material cerámico poroso o polipropileno. También es posible el uso de otros materiales.
Un ejemplo de filtración que es particularmente adecuado para la presente invención es la filtración de flujo tangencial, también conocida como filtración de flujo cruzado. La filtración de flujo tangencial (TFF) es una técnica de separación que usa sistemas de membrana y fuerza de flujo para purificar los sólidos de los líquidos. Los tamaños de poro preferidos usados en TFF permiten que fluyan solutos y residuos en el caldo de fermentación, pero retienen la biomasa.
Los tamaños de malla adecuados para el procedimiento de filtración incluyen menos de 1000 micrómetros, o más pequeños que 800 micrómetros, o más pequeños que 600 micrómetros, o más pequeños que 500 micrómetros, o más pequeños que 400 micrómetros, o más pequeños que 300 micrómetros, o más pequeños que 200 micrómetros, o menor que 180 micrómetros, o menor que 150 micrómetros, o menor que 120 micrómetros, o menor que 100 micrómetros, o menor que 90 micrómetros, o menor que 80 micrómetros, o menor que 70 micrómetros, o menor que 60 micrómetros, o menor que 50 micrómetros, o menos de 40 micrómetros, o menos de 30 micrómetros, o menos de 20 micrómetros. En algunas realizaciones, se usa un filtro de tamiz vibratorio de 106 micrómetros. También se puede usar un filtro con un tamaño de malla diferente a 106 micrómetros, o filtros que no sean de tipo vibratorio. En ciertas realizaciones, la filtración se realiza a temperatura ambiente y a presión atmosférica. En otras realizaciones, la filtración se realiza a temperaturas y/o presiones elevadas o reducidas.
La centrifugación es un proceso que implica el uso de la fuerza centrífuga para la separación de mezclas. Los componentes más densos de la mezcla migran fuera del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Al aumentar la fuerza gravitatoria efectiva (es decir, al aumentar la velocidad de centrifugación), el material más denso, generalmente sólidos, se separa del material menos denso, generalmente líquidos, según la densidad. Las máquinas preferidas para la centrifugación son las centrífugas decantadoras y las centrífugas de disco de alta velocidad.
Una centrífuga decantadora puede operar bombeando el caldo de cultivo incluyendo la biomasa en un cilindro giratorio. A medida que la fuerza centrífuga empuja la biomasa contra la pared exterior, un rollo giratorio interno puede mover la biomasa contra la pared hacia la descarga en un extremo. El extremo de descarga de la centrífuga decantadora puede tener un radio decreciente junto con el rodillo para coincidir con el tamaño decreciente. A medida que la biomasa sube por la rampa creada por el radio decreciente, la biomasa se puede eliminar continuamente. Una centrífuga de apilamiento de discos de alta velocidad puede empujar el caldo de cultivo hacia el exterior a lo largo de una trayectoria de discos inclinados. La biomasa que comprende el caldo de cultivo será empujada hacia
abajo por la pendiente de los discos y se separará del caldo de cultivo. La biomasa se puede descargar de forma continua o intermitente en el lado descendente de la centrífuga de apilamiento de discos de alta velocidad, mientras que el caldo de cultivo es empujado hacia arriba a lo largo de los discos hacia la salida.
La biomasa que se ha separado del caldo de cultivo (biomasa húmeda) generalmente contiene más del 95 % (peso/peso) de los piripiropenos producidos en la fermentación, preferiblemente más del 97 % y más preferiblemente más del 99 %. El contenido de piripiropenos en el caldo de cultivo separado es, por lo tanto, generalmente inferior al 5 % (peso/peso), preferiblemente inferior al 3 % y más preferiblemente inferior al 1 %.
La biomasa seca, que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, usada para el aislamiento de los piripiropenos puede producirse directamente secando la biomasa húmeda obtenida mediante las técnicas descritas anteriormente. Estas técnicas generalmente producen una biomasa húmeda con un contenido de agua residual (peso/peso) entre más del 15 % y menos del 90 %. Preferiblemente entre más del 30 % y menos del 90 %, incluso más preferido entre más del 40 % y menos del 90 % o entre más del 50 % y menos del 90 %. Sin embargo, no es necesario, pero generalmente es ventajoso reducir aún más el contenido de agua de la biomasa húmeda antes de que la biomasa húmeda se utilice para producir biomasa seca.
Por lo tanto, la biomasa húmeda se puede someter a una etapa de eliminación de líquido (adicional) que implica el uso de presión mecánica directamente aplicada a la biomasa húmeda. La cantidad de presión mecánica aplicada no debería causar que un porcentaje significativo de las células microbianas de la biomasa se rompan, si eso resultara en la pérdida de piripiropenos a la fase líquida, sino que simplemente debería ser suficiente para deshidratar la biomasa hasta el nivel deseado para el secado posterior. En consecuencia, la biomasa húmeda generalmente todavía contiene más del 95 % (peso/peso) de los piripiropenos producidos en la fermentación, preferiblemente más del 97 % y más preferiblemente más del 99 %. El contenido de piripiropenos en fase líquida separada es, por lo tanto, generalmente inferior al 5 % (peso/peso), preferiblemente inferior al 3 % y más preferiblemente inferior al 1 % de los piripiropenos producidos durante la fermentación.
Se puede emplear presión mecánica para la biomasa húmeda, usando procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, usando una prensa filtrante de banda, una prensa de tornillo, una prensa de acabado, una prensa de filtro, un filtro de presión o cualquier otro medio adecuado para el propósito. Preferiblemente se usa una prensa filtrante de banda para este propósito.
Una prensa filtrante de banda es un dispositivo de deshidratación que aplica presión mecánica a una suspensión o pasta (por ejemplo, la biomasa húmeda) que se pasa entre dos bandas tensadas que generalmente tienen aberturas pequeñas del tamaño de micras. Las correas tensadas pasan por una serpentina de rodillos de diámetro decreciente. La mayoría de los filtros prensa de banda tienen tres zonas diferentes: una zona de gravedad, donde el líquido libre se drena por gravedad a través de una banda porosa; una zona de acuñamiento, en la que los sólidos se preparan para la aplicación de presión; y una zona de presión, en la que se aplica una presión ajustable a los sólidos drenados por gravedad. Luego, las bandas pueden pasar a través de una serie de rodillos que exprimen el jugo a través de las aberturas en la banda. Los sólidos apelmazados pueden ser expulsados donde las dos bandas se separan al final de la operación unitaria. El jugo puede gotear en bandejas en la parte inferior de la unidad en la que, al usar la fuerza gravitatoria, se puede expulsar a través de una abertura común y enviarse hacia abajo para su posterior procesamiento.
Una prensa de tornillo puede funcionar introduciendo material (por ejemplo, la biomasa húmeda) en un dispositivo que se asemeja a un tornillo sinfín. El eje giratorio en la prensa de tornillo puede transportar el material al equipo, en el que, a medida que el material avanza, la trayectoria o la distancia entre las roscas del tornillo se hace más pequeño o el eje se ensancha. A medida que la trayectoria disminuye en distancia, el volumen total entre los hilos disminuye, creando un efecto de compresión. La biomasa húmeda puede comprimirse entre estas trayectorias y el líquido puede ser expulsado. El eje giratorio puede estar recubierto por una malla de tamaño micrométrico que puede contener la biomasa húmeda en el tornillo, pero permite que el líquido sea expulsado.
Una prensa de acabado puede operar de manera similar a la prensa de tornillo, pero en lugar de un tornillo con rosca, hay un eje giratorio con paletas que pueden empujar el material a lo largo de un tamaño de tamiz. La fase sólida restante de la biomasa húmeda se puede expulsar de la prensa de acabado.
Una prensa filtrante, incluidas las prensas filtrantes diseñadas como una prensa filtrante de cámara o una prensa filtrante de membrana, puede funcionar usando una bomba de desplazamiento positivo y bombeando la biomasa húmeda a una serie de cámaras filtrantes. Las cámaras filtrantes pueden tener aberturas pequeñas del tamaño de micras que pueden expulsar el líquido usando la presión de la bomba de desplazamiento positivo. Una vez que se hayan acumulado suficientes sólidos en el interior del filtro y no se pueda extraer más líquido, se puede introducir un "exprimidor" inyectando agua o aire en las cámaras de aire entre las cámaras del filtro, creando una presión adicional en la torta del filtro cuando se usa una prensa filtrante de membrana. A medida que las cámaras de aire empujan hacia afuera, se puede ejercer una presión adicional en las cámaras filtrantes a medida que las paredes empujan hacia adentro. Se puede liberar líquido adicional. Una vez que el líquido se haya eliminado lo suficiente, las cámaras de prensa filtrante se pueden abrir y la biomasa húmeda se puede expulsar.
Una o más de las técnicas anteriores para aplicar presión mecánica pueden usarse sola o en combinación para eliminar el líquido de la biomasa húmeda para usar en la presente invención.
Por lo tanto, los procesos para obtener al menos un piripiropeno y los procesos para producir un derivado de piripiropeno, pueden comprender una etapa de separación de biomasa del caldo de cultivo para obtener biomasa húmeda, que luego se usa para producir biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior
al 8 %.
La etapa para obtener biomasa húmeda se puede realizar mediante filtración, mediante centrifugación, preferiblemente usando una tecnología como la descrita anteriormente, o puede realizarse mediante una combinación de filtración y centrifugación y puede o no comprender una etapa de aplicación de presión mecánica, de nuevo preferiblemente una etapa de aplicación de presión mecánica como se describió anteriormente. En consecuencia, los procesos para obtener al menos un piripiropeno y los procesos para producir un derivado de piripiropeno, pueden comprender una etapa de separación de biomasa del caldo de cultivo usando un separador vibratorio, un filtro de tamiz vibratorio, un separador vibratorio circular, un filtro de tambor rotatorio, un agitador de movimiento lineal/inclinado, un filtro de presión, filtración de flujo tangencial, a través de filtros de banda, filtros rotatorios, filtros prensa, de los cuales se prefiere un separador vibratorio y una filtración de flujo tangencial. Las máquinas preferidas para la centrifugación son las centrífugas decantadoras y las centrífugas de apilamiento de discos de alta velocidad.
En algunas realizaciones, la biomasa húmeda producida como se describió anteriormente se trata adicionalmente para reducir el contenido de agua usando una etapa de aplicación de presión mecánica, usando una prensa filtrante de banda, una prensa de tornillo, una prensa de acabado, una prensa de filtro o un colador de presión. Preferiblemente se usa una prensa filtrante de banda para este propósito.
Reducción de componentes no deseados y/o almacenamiento a corto plazo:
En la mayoría de las realizaciones de la invención, la biomasa húmeda producida mediante la separación del caldo de cultivo o después de la aplicación de presión mecánica se usa directamente para producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, que luego se usa para el almacenamiento o para la purificación de piripiropenos.
Sin embargo, en diversas realizaciones de la invención, la biomasa húmeda se purifica adicionalmente durante el manejo de la biomasa húmeda con el fin de reducir los contenidos del caldo de cultivo que podrían causar problemas de purificación de piripiropenos o la manipulación de la biomasa húmeda en etapas posteriores y/o se somete a un almacenamiento a corto plazo en un tanque de almacenamiento.
Los contenidos del caldo de cultivo que podrían reducirse mediante una purificación adicional de la biomasa húmeda son, por ejemplo, sales, azúcar residual u otros componentes que se han producido durante la fermentación, por ejemplo, componentes lipófilos, como ácidos grasos y aceites.
Por consiguiente, el procesamiento adicional de la biomasa húmeda puede implicar o no una o más etapas de lavado para una purificación adicional, en la cual la biomasa húmeda se resuspende en un medio en el que la solubilidad de los piripiropenos es muy baja (medio de resuspensión). Por consiguiente, el medio usado para una etapa de lavado es preferiblemente hidrofílico, o puede consistir en una mezcla de componentes hidrofílicos o hidrófobos. En una realización, el medio de resuspensión es agua. En otra realización, el medio de resuspensión es una solución acuosa de un regulador de pH, por ejemplo, sal de fosfato o TRIS o sal de amonio, o una solución acuosa de un agente conservante como ácido benzoico, sales de ácido benzoico, ácido sórbico, sales de ácido sórbico u otros conservantes conocidos en la técnica por tener el mismo efecto.
Preferiblemente, la biomasa húmeda se resuspende directamente después de la separación del caldo de cultivo y no después de la aplicación de presión mecánica.
La temperatura del medio de resuspensión puede variar entre el punto de congelación y el de ebullición del medio de resuspensión, preferiblemente la temperatura está entre 5 °C y 50 °C, más preferiblemente la temperatura está entre 10 °C y 30 °C. El medio de resuspensión se puede separar de la biomasa mediante el uso de tecnologías idénticas o similares que se pueden usar para separar la biomasa del caldo de cultivo. La biomasa se puede volver a usar varias veces en el mismo medio o en diferentes medios de resuspensión. Por lo general, el volumen de un medio de resuspensión es inferior al 70 %, 60 %, 50 %, 30 %, 25 %, 10 % o menos del 5 % del volumen del caldo de cultivo usado para producir la cantidad respectiva de biomasa húmeda, pero incluso puede ser mayor, tal como 1 vez, 2 veces, 3 veces o más del volumen de la biomasa húmeda. La biomasa húmeda producida después de la separación del caldo de cultivo, después de una o más etapas de resuspensión o producida después de la aplicación de presión mecánica, puede almacenarse en un tanque de almacenamiento, preferiblemente un tanque de almacenamiento refrigerado. En realizaciones particulares, el tanque de almacenamiento refrigerado se mantiene a una temperatura inferior a 50 °C, o inferior a 40 °C, o inferior a 30 °C, o inferior a 25 °C, o inferior a 20 °C, inferior a 15 °C o inferior a 10 °C, o inferior a 5 °C, o inferior a 2 °C, pero por encima de la temperatura de congelación de la biomasa húmeda. El tanque de almacenamiento refrigerado se mantiene a una temperatura por debajo de la temperatura ambiente, preferiblemente por debajo de 15 °C, o por debajo de 10 °C, o por debajo de 5 °C, o por debajo de 2 °C, pero por encima de la temperatura de congelación de la biomasa húmeda.
La biomasa húmeda se puede almacenar en tales condiciones durante varias horas y hasta varios meses, por ejemplo, durante el envío. Las duraciones preferidas para el almacenamiento a corto plazo son de más de 5 horas a 5 meses, pero preferiblemente no deben exceder de uno o dos meses, en caso de que la biomasa húmeda comprenda células vivas de la biomasa húmeda misma o de otros microorganismos introducidos durante el manejo
de la biomasa húmeda. Otra forma de estabilizar la biomasa húmeda para el almacenamiento es disminuir el pH de la biomasa húmeda para, o durante el almacenamiento, a un pH de 1 a 5. La biomasa estabilizada de esta manera generalmente puede almacenarse durante un período de entre varios días a varias semanas. También es posible combinar ambos procedimientos, es decir, el almacenamiento a un pH más bajo y en un tanque de almacenamiento refrigerado, para prolongar el tiempo de almacenamiento.
Homogeneización:
La biomasa húmeda se usa directamente para un secado adicional, o se puede homogeneizar antes de realizar una etapa adicional ya sea para secar la biomasa húmeda o para mejorar el contenido de materia seca de la biomasa, por ejemplo, aplicando presión mecánica. En particular, en el caso de que la biomasa húmeda tenga un contenido comparativamente bajo de material seco (peso/volumen) inferior al 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 % y/o haya estado almacenado durante algún tiempo, es aconsejable homogeneizar la biomasa antes del secado o antes de aplicar una presión mecánica adicional. La homogeneización puede simplemente tener el objetivo de producir una distribución homogénea de componentes sólidos y líquidos de la biomasa húmeda para facilitar el procesamiento posterior, por ejemplo, para proporcionar un suministro homogéneo de biomasa húmeda a una prensa filtrante de banda, una prensa de tornillo, una prensa de acabado, una prensa filtrante, o cualquier otro medio adecuado para mejorar el contenido de materia seca, o puede tener el objetivo de proporcionar un suministro homogéneo de biomasa húmeda para mayor secado, por ejemplo como alimentación a un secador de molino de pasta, un deshidratador por aspersión, un secador instantáneo, un secador de lecho fluido o un secador rotatorio.
Se puede lograr una distribución homogénea de componentes sólidos y líquidos, así como una ruptura de las paredes celulares de la biomasa húmeda, usando una máquina dispersadora de estator de rotor u otro aparato de homogeneización. Una máquina dispersadora de estator de rotor es un medio preferido para homogeneizar la biomasa húmeda que tiene un contenido comparativamente bajo de materia seca, tal como un contenido de materia seca inferior al 30 %, 25 %, 20 %, 15 %, 10 % o 5 %. .
Se puede usar un expansor o extrusora para dar forma y/o homogeneizar la biomasa húmeda. Se prefiere una extrusora porque las condiciones de extrusión se pueden ajustar para minimizar la ruptura de las paredes celulares. La extrusión se puede usar para formar estructuras alargadas similares a cilindros (estas pueden tener una sección transversal cilíndrica y/o circular) si se pasa a través de una placa troqueladora adecuada (por ejemplo, con orificios circulares o cuadrados). Estas estructuras alargadas se pueden formar además en gránulos, mediante el uso de un cortador, tal como una cuchilla giratoria, para cortar los filamentos largos de estructuras similares a cilindros. Después de la extrusión, el "espagueti" y los gránulos tienen preferiblemente un contenido de agua inferior al 15 %, tal como inferior al 10 %, y óptimamente del 3 al 7 %. Los gránulos pueden tener un diámetro de 0,3 a 10 mm, tal como de 0,7 a 5 mm, óptimamente de 1 a 3 mm. La extrusión también se puede usar para formar láminas o capas de biomasa húmeda. Esto se puede lograr al pasar por una o más ranuras. Estas formas también pueden prepararse mediante el uso de una o más superficies móviles, tales como un rodillo o rodillos y/o un cilindro o cilindros. Estas pueden moverse en la misma dirección o girar en sentido contrario y puede haber una, dos o hasta cinco superficies. Las láminas o capas pueden tener un espesor de 0,3 a 10 mm, tal como de 0,7 a 5 mm, óptimamente de 1 a 3 mm.
La biomasa húmeda tratada por extrusión se seca preferiblemente en un secador de lecho fluido para producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %.
En algunas realizaciones de la invención, puede ser ventajoso usar la etapa de homogeneización para romper las paredes celulares de la biomasa húmeda. Como se usa en este documento, la ruptura de las paredes celulares abarca procedimientos mecánicos o químicos que perturban la organización del organismo a el nivel de células individuales o estructuras multicelulares. La ruptura de las paredes celulares puede incluir, por ejemplo, molienda, picado, trituración, aplastamiento, prensado, rotura, lisis por presión osmótica o tratamientos químicos que degradan las estructuras biológicas. Simplemente a modo de ejemplo, la ruptura de las paredes celulares se puede lograr usando una etapa de molienda, por ejemplo, aplicando un molino de cuchillas, un molino de bolas, y similares, o una combinación de ellos.
Los procesos para obtener al menos un piripiropeno y los procesos para producir un derivado de piripiropeno, pueden comprender una etapa adicional en la que la biomasa húmeda se trata para reducir componentes no deseados, por ejemplo, mediante resuspensión en un medio de resuspensión, y/o una de almacenamiento a corto plazo y/o una etapa de homogeneización, antes de usar la biomasa húmeda para producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %.
Por consiguiente, los procesos descritos anteriormente pueden comprender una etapa en la cual la biomasa húmeda se resuspendió en un medio de resuspensión y/o se homogeneizó y/o tiene un contenido de glucosa de menos de 5 g/L, y/o tiene un contenido de agua entre más del 15 % y menos del 90 %.
Producción de biomasa seca:
La biomasa seca usada para aislar piripiropenos tiene un contenido de agua residual inferior al 8 %. Más preferido, la biomasa seca tiene, en orden de preferencia, un contenido de agua residual de menos del 7 %, 6 %, 5 %, 4 % o 3 %.
El contenido de agua residual se mide según el procedimiento, nuevamente en orden de preferencia el procedimiento Aufhauser, el procedimiento de básculas de secado de halógeno (IR) y/o el procedimiento de KarlFischer, como se describe en los Ejemplos.
La producción de biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % se puede realizar mediante el uso de un deshidratador por aspersión, un secador de molino de pasta, un secador instantáneo, un secador de lecho fluido o un secador rotatorio, o por cualquier otro medio adecuado para secar la biomasa húmeda hasta el contenido de agua residual descrito anteriormente, como la liofilización o mediante el uso de secadores de bandejas simples. Los procedimientos preferidos para producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % son mediante secado en un deshidratador por aspersión o en un secador de molino de pasta.
La biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % se puede producir a partir de la biomasa húmeda producida por cualquier tipo de proceso para la separación de la biomasa del caldo de cultivo descrito anteriormente, incluidos las etapas adicionales para reducir el contenido de agua de la biomasa húmeda, como la aplicación de presión mecánica. Sin embargo, la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % también puede producirse secando biomasa que no se haya separado del caldo de cultivo usado en la fermentación, por ejemplo, mediante el uso de un deshidratador por aspersión.
El secado por aspersión es un procedimiento comúnmente usado para secar una alimentación líquida usando un gas caliente. Un deshidratador por aspersión toma una corriente de líquido, por ejemplo, la biomasa húmeda y separa el soluto como un sólido y el líquido en vapor. La corriente de entrada se pulveriza a través de una boquilla en una corriente de vapor caliente y se vaporiza. La boquilla del deshidratador por aspersión generalmente es ajustable y, por lo general, se ajusta para hacer que las gotas sean lo más pequeñas posible para maximizar la transferencia de calor y la velocidad de vaporización del agua. Sin embargo, la boquilla debe ajustarse para evitar el bloqueo de partes de la biomasa comprendida por el flujo de entrada. Preferiblemente, la biomasa de la corriente de entrada se homogeneiza para producir partículas más pequeñas y para romper las paredes celulares antes de que se use como corriente de entrada para la secado por aspersión. Los sólidos secos resultantes pueden tener una consistencia fina y pulverulenta, dependiendo del tamaño de la boquilla usada.
No es posible proporcionar aquí valores precisos para cada parámetro involucrado en el ajuste de las condiciones para la secado por aspersión, ya que estos parámetros y sus valores asociados dependen del tipo de dispositivo de secado por aspersión usado. Como guía, el proceso de secado por aspersión se usa mejor con biomasa húmeda que tiene un contenido de agua residual de 80 % a 99.5 %, preferiblemente de 88 % a 92 % (peso/peso), pero también se puede usar para producir biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 8 % directamente de la biomasa que todavía se encuentra en el caldo de cultivo de la fermentación.
La boquilla debe tener una abertura de 0,5 a 10 mm. La presión aplicada en el extremo de las boquillas para atomizar la biomasa húmeda puede estar entre aproximadamente 2 y 250 bar, y la presión de aire caliente en la entrada del dispositivo puede estar entre aproximadamente 100 y 2000 mbar por sobrepresión.
La temperatura del aire de entrada está preferiblemente entre 80 °C y 350 °C, preferiblemente 120 °C a 180 °C. La temperatura de salida está preferiblemente entre 20 °C y 200 °C, preferiblemente entre 60 °C y 100 °C.
Los secadores instantáneos se usan normalmente para secar sólidos que han sido desecados o tienen un bajo contenido de humedad. Los secadores instantáneos, también conocidos como "secadores neumáticos", se usan generalmente para secar biomasa húmeda con un contenido de agua residual de 20 % a 90 % (peso/peso). Estos secadores normalmente dispersan material húmedo en una corriente de aire caliente que lo transporta a un conducto de secado. El calor de la corriente de aire seca el material a medida que se transporta a través del conducto de secado. Se pueden encontrar descripciones más detalladas de secadores instantáneos y secadores neumáticos en la patente de Estados Unidos No. 4.214.375, que describe un secador instantáneo, y en las patentes de Estados Unidos números 3.789.513 y 4.101.264, que describen secadores neumáticos.
Un secador instantáneo puede colocar la biomasa húmeda en un sistema de circuito cerrado con aire caliente inyectado tangencialmente hacia el exterior del circuito. El aire caliente puede transportar la biomasa húmeda a lo largo del borde exterior del bucle, secándose continuamente.
Al hacer que el material ruede a lo largo de la pared impulsado por el flujo de aire, se puede crear un efecto reductor del tamaño de partícula una vez que el tamaño de las partículas es lo suficientemente pequeño como para que puedan fluir libremente del aire. Una vez que el tamaño de partícula y el contenido de agua se reducen a los niveles deseables, las partículas pueden transportarse a lo largo de un tubo de escape ubicado en la parte interior del bucle hasta un aparato de recolección.
Los secadores de pasta molida se usan para secar la torta húmeda, la suspensión o la pasta que normalmente es difícil de secar en otros secadores. Preferiblemente, se usan para secar biomasa húmeda con un contenido de agua residual de 5 % a 80 % (peso/peso).
Un secador de pasta molida puede secar biomasa húmeda en una cuba agitada que hace que el material se suspenda debido a la presión del aire que crea un efecto de suspensión. El material se alimenta mediante un alimentador de tornillo a través de un variador de velocidad en la cámara de secado vertical, donde se calienta con aire y, al mismo tiempo, se desintegra mediante un desintegrador especialmente diseñado, que generalmente es una estructura similar a un ventilador que gira en la cámara de secado, cumpliendo así una función similar a la de un mezclador giratorio. El calentamiento del aire puede ser directo o indirecto dependiendo de la aplicación. La biomasa seca que se produce en partículas de tamaño reducido puede luego transportarse a través de un clasificador en la parte superior de la cámara de secado transportada por el flujo de aire a un aparato de recolección como un ciclón, una bolsa recolectora o similar, en el que se recolecta luego el material.
Los secadores rotatorios funcionan alimentando continuamente material húmedo, por ejemplo, la biomasa húmeda, que se seca por contacto con aire caliente, mientras se transporta a lo largo del interior de un cilindro giratorio, con la carcasa giratoria actuando como dispositivo de transporte y agitador. Preferiblemente, se usan para
secar biomasa húmeda que tiene un contenido de agua residual de 5 a 80 % (peso/peso).
Los secadores de lecho fluido se usan generalmente para el secado y la desintegración simultánea de un material en forma de una pasta. Los secadores de lecho fluido pueden comprender una cámara de secado cilíndrica, que está provista de un fondo cónico hacia arriba. La biomasa húmeda se suministra a la cámara a través de una ranura que se extiende sustancialmente en forma circular entre el fondo cónico y la pared de la cámara de secado desde un distribuidor anular para la fluidización y secado del medio. Un agitador se coloca coaxialmente en la cámara, las cuchillas de dicho agitador son paralelas al fondo cónico. Preferiblemente, las cuchillas del agitador se colocan a una pequeña distancia del fondo cónico. Un ejemplo de un secador de lecho fluido se describe en el documento US 4581830. Un diseño diferente de un secador de lecho fluido puede funcionar y secar material (por ejemplo, biomasa húmeda) al introducirlo en un lecho vibratorio con aire caliente que pasa directa o indirectamente al material. La vibración y el aire pueden crear una suspensión fluida del material que puede aumentar el área superficial a secar. Preferiblemente, se usan para secar biomasa húmeda con un contenido de agua residual de 5 % a 80 % (peso/peso).
El procedimiento de secado, en particular los procedimientos de secado que usan un secador instantáneo, un secador de molino de pasta, un secador rotatorio, un secador de lecho fluido o un secador de bandejas o similar, o una combinación de los mismos, usa una corriente de aire para el secado que tiene una temperatura de entrada (la temperatura en la entrada al secador) por encima de 25 °C, o por encima de 50 °C, o por encima de 75 °C, o por encima de 100 °C, o por encima de 125 °C, o por encima de 150 °C, o por encima de 175 °C, o por encima de 200 °C, o por encima de 225 °C, o por encima de 250 °C, o por encima de 275 °C, o por encima de 300 °C, o por encima de 325 °C, o por encima de 350 °C, o por encima de 375 °C, o por encima de 400 °C, o por encima de 425 °C, o por encima de 450 °C, o por encima de 475 °C, o por encima de 500 °C.
Preferiblemente, la temperatura de entrada es de 25 °C a 50 °C, o de 50 °C a 75 °C, o de 75 °C a 100 °C, o de 100 °C a 125 °C, o de 125 °C a 150 °C, o de 150 °C a 175 °C, o de 175 °C a 200 °C, o de 200 °C a 225 °C, o de 225 °C a 250 °C, o de 250 °C a 275 °C, o de 275 °C a 300 °C, o de 300 °C a 325 °C, o de 325 °C a 350 °C, o de 350 °C a 375 °C, o de 375 °C a 400 °C, o de 400 °C a 425 °C, o de 425 °C a 450 °C, o de 450 °C a 475 °C, o de 475 °C a 500 °C, o superior a 500 °C.
En algunas realizaciones, la temperatura de entrada es de 50 °C a 100 °C, o de 100 °C a 150 °C, o de 150 °C a 200 °C, o de 200 °C a 250 °C, o de 250 °C a 300 °C, o de 300 °C a 350 °C, o de 350 °C a 400 °C, o de 400 °C a 450 °C, o de 450 °C a 500 °C, o superior a 500 °C.
En algunas realizaciones, la temperatura de salida (la temperatura a la salida del secador) es inferior a 300 °C, o inferior a 275 °C, o inferior a 250 °C, inferior a 225 °C, inferior a 200 °C o inferior a 175 °C °C, o inferior a 150 °C, o inferior a 125 °C, o inferior a 100 °C, o inferior a 75 °C, o inferior a 50 °C, o inferior a 25 °C.
En algunas realizaciones, la temperatura de salida es de 300 °C a 275 °C, o de 275 °C a 250 °C, o de 250 °C a 225 °C, o de 225 °C a 200 °C, o de 200 °C a 175 °C, o de 175 °C a 150 °C, o de 150 °C a 125 °C, o de 125 °C a 100 °C, de 100 °C a 75 °C, o de 75 °C C a 50 °C, o de 50 °C a 25 °C, o por debajo de 25 °C.
En algunas realizaciones, la temperatura de salida es de 300 °C a 250 °C o de 250 °C a 200 °C, o de 200 °Ca 150 °C, o de 150 °C a 100 °C, de 100 °C a 50 °C, o de 50 °C a 25 °C, o por debajo de 25 °C.
En algunas realizaciones, el aire usado para el secado se reemplaza por gas no inflamable, por ejemplo nitrógeno (N2). Esto es de particular importancia, si la biomasa seca producida a través del proceso de secado tiene una alta proporción de tamaños de partícula pequeños.
Los secadores de bandejas se usan normalmente para trabajos de laboratorio y operaciones de secado a pequeña escala piloto. Los secadores de bandejas se basan en el calentamiento por convección y la evaporación. La biomasa húmeda se puede secar de manera efectiva usando calor y una salida de aire para eliminar el agua evaporada. El aire caliente circula para secar. Los secadores de bandejas también pueden emplear una presión reducida o un vacío para secar a temperatura ambiente cuando los productos son sensibles a la temperatura y son similares a un liofilizador, pero su uso es menos costoso y se pueden escalar fácilmente.
Como alternativa a las técnicas de secado descritas anteriormente, la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % también puede producirse por liofilización, también conocida como secado por congelación o criodesecación. El proceso de liofilización consiste en congelar el material y luego reducir la presión circundante y agregar suficiente calor para permitir que el agua congelada en el material se sublime de la fase sólida a gas. De manera similar al uso de secadores de bandejas, la liofilización se usa principalmente para operaciones a pequeña escala piloto, que son realizaciones menos preferidas de la invención.
Se pueden agregar a la biomasa diversos agentes de flujo (incluidos productos derivados de sílice, como sílice precipitada, sílice pirógena, silicato de calcio y silicatos de sodio y aluminio) antes o después del secado. La aplicación de estos materiales a polvos de alto contenido de grasa, higroscópicos o adhesivos previene el apelmazamiento o la formación de grumos durante y después del secado, y promueve el flujo libre de polvos secos. Esto no solo reduce la adherencia, sino que también reduce la acumulación y la oxidación de los materiales en las superficies del secador.
Biomasa seca:
Como se mencionó anteriormente, la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 8 % usado para aislar piripiropenos tiene, preferiblemente, un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, o 3 %.
Preferiblemente, el tamaño de partícula de más del 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o más del 98 % de la biomasa seca está entre 0,01 mm y 5 mm, o menos de 3 mm, preferiblemente menos de 1 mm y más preferiblemente menos de 0,5 mm.
El tamaño promedio de las partículas medidas inmediatamente después de la homogeneización o tan pronto como sea práctico después de eso es preferiblemente no más de 10 pm, no más de 25 pm, o no más de 100 pm. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula promedio es de 1 pm a 10 pm, 1 pm a 15 pm, 10 pm a 100 pm o 1 pm a 40 pm. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula promedio es superior a 10 pm y hasta 100 pm. En algunas realizaciones, el tamaño de partícula promedio está entre 10 pm y 100 pm.
La molienda se puede llevar a cabo en la biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % para producir un tamaño de partícula particular, por medio de sistemas mecánicos con piezas giratorias o fijas. Dichas piezas pueden ser martillos, tamices o cilindros giratorios que se presionan entre sí.
Los ejemplos de técnicas para la separación de biomasa húmeda del caldo de cultivo, para aplicar presión mecánica, para secar la biomasa húmeda o para moler se describen solo con fines ilustrativos, y no pretenden limitar el alcance de la solicitud. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica, leyendo la descripción, entendería que se pueden emplear otras técnicas para lograr los mismos resultados.
Almacenamiento de biomasa seca:
La biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 8 % producido por cualquiera de las técnicas descritas anteriormente o producidas por técnicas similares puede almacenarse en un tanque de almacenamiento. El tanque de almacenamiento generalmente se mantiene a una temperatura por debajo de 50 °C, o por debajo de 40 °C, o por debajo de 30 °C, o por debajo de 25 °C, o por debajo de 20 °C, o por debajo de 15 °C, o por debajo de 10 °C, o por debajo de 5 °C, o por debajo de 2 °C, pero preferiblemente por encima de la temperatura de congelación.
La biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % se puede almacenar bajo tales condiciones durante varias horas o se puede almacenar para un almacenamiento a largo plazo. La biomasa seca almacenada tiene preferiblemente un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 7 %, 6 %, 5 %, 4 % o 3 %. Las duraciones preferidas para el almacenamiento son de aproximadamente 5 horas o hasta varios años. Las duraciones aún más preferidas para el almacenamiento son de más de aproximadamente 5 horas a menos de aproximadamente un año, pero también es posible elegir otras duraciones, por ejemplo, desde aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 12 meses, desde aproximadamente 2 semanas hasta aproximadamente 24 meses, por ejemplo, desde aproximadamente 1 mes hasta aproximadamente 18 meses, desde aproximadamente 4 horas hasta aproximadamente 6 meses.
Por lo tanto, los procesos para obtener al menos un piripiropeno y los procesos para producir un derivado de piripiropeno, usan biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, 7 %, 6 %, 5 % , 4 %, o 3 %, y puede haber sido almacenado desde aproximadamente 5 horas o hasta varios años, antes de que se obtenga el piripiropeno comprendido.
Si bien cada manejo de la biomasa húmeda antes de la extracción de los piripiropenos producidos, incluidas las etapas para producir biomasa seca, incluye el riesgo de perder cantidades valiosas de la biomasa, es posible obtener un rendimiento de al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o incluso más de los piripiropenos producidos en la fermentación mediante extracción, de acuerdo con la cantidad de biomasa seca recuperada.
Extracción y purificación de piripiropenos:
La extracción de piripiropenos de biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % se puede realizar de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en los documentos W02004/060065, WO94/09147 o WO2011/108155.
Los disolventes adecuados para la extracción incluyen:
- alcoholes que tienen de 1 a 6 átomos de carbono tales como metanol, etanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, terc-butanol, n-hexanol y alcoholes tales como 2-etil-hexanol, hexafluoroisopropanol, etilenglicol;
- hidrocarburos aromáticos tales como benceno, tolueno, etilbenceno, clorobenceno, cimeno, xilenos, mesitileno, benzotrifluoruro;
- ésteres tales como acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de n-butilo, acetato de isobutilo;
- éteres tales como dietil éter, diisopropil éter, di-n-butil éter, terc-butil metil éter (TBME), tetrahidrofurano (THF), 2
metil tetrahidrofurano, 1,4-dioxano, 1,2-dimetoxietano;
- disolventes apróticos dipolares tales como N,N-dimetilformamida (DMF), N,N-dibutilformamida, N,N-dimetilacetamida (DMAC), 1 -metil-2-pirrolidinona (NMP), 1,3-dimetil-2-imidazolidinona (DMI), N,N'-dimetilpropilenurea (DMPU), dimetilsulfóxido (DMSO), sulfolano; acetonitrilo;
- disolventes orgánicos polares tales como piridina, disolventes hidrocarbonados halogenados tales como diclorometano y cloroformo;
- cetonas tales como acetona, metil etil cetona, dietil cetona, ciclohexanona
- nitrilos tales como acetonitrilo e isobutironitrilo.
El término disolvente como se usa en este documento también incluye mezclas de dos o más de los disolventes anteriores. Los disolventes se aplican generalmente a una temperatura en el intervalo de 0 °C hasta el punto de ebullición del disolvente, preferiblemente los disolventes se aplican a una temperatura en el intervalo de 20 °C a 60 °C.
En una realización de la invención, los disolventes usados para la extracción son disolventes orgánicos seleccionados del grupo que consiste en metanol, acetato de metilo, acetato de etilo, acetato de butilo, tolueno, etilbenceno, clorobenceno, cloroformo, diclorometano, éter dietílico, éter diisopropílico, tetrahidrofurano y dioxano o una mezcla de al menos dos de estos disolventes. En una realización adicional, los disolventes incluyen metanol, tolueno y etilbenceno o son una mezcla de al menos dos de ellos, en particular mezclas de metanol/tolueno o mezclas de metanol/etilbenceno.
Normalmente, la extracción se realiza varias veces en la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %, para extraer los piripiropenos lo más completamente posible. El disolvente que comprende los piripiropenos extraídos se separa de la biomasa mediante filtración.
La resistencia del filtro depende del disolvente particular usado y del contenido de agua residual de la biomasa seca usada.
En algunas realizaciones de la invención, la resistencia del filtro está en un grado creciente de preferencia: por debajo de 5 x 10 mPas/m2, por debajo de 4 x 10 mPas/m2, por debajo de 3 x 10 mPas/m2, debajo de 2 x 10 mPas/m2
Los procedimientos para purificar los piripiropenos comprendidos en el disolvente usado para la extracción están fácilmente disponibles en la técnica. Algunos ejemplos de procedimientos se han descrito en los documentos WO94/09147, WO2004/060065 y WO2011/108155.
Los piripiropenos obtenidos a través de los procesos descritos anteriormente se pueden usar para crear compuestos de Fórmula III, Fórmula IV y Fórmula V.
Un procedimiento para la producción del compuesto de Fórmula III se describe en la publicación de patente japonesa abierta a inspección pública No. 259569/1996.
Los procedimientos para la producción de compuestos de Fórmula IV y Fórmula V se describen en el documento WO2006/129714.
Los procedimientos preferidos particulares para la producción de un compuesto de Fórmula V se describen en el documento EP 13151492.9. La invención también abarca procesos para obtener al menos un compuesto de Fórmula I o para producir, al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, a partir de biomasa seca con un contenido de agua inferior al 8 % y un tamaño de partícula entre 0,01 mm y 5 mm. Preferiblemente, la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 8 % que tiene esas características es de un organismo productor de piripiropeno que pertenece al género Penicillium, Eupenicillium o Aspergillus, incluso más preferido, que proviene de Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum o Aspergillus fumigatus, en particular de una de sus cepas mencionadas anteriormente. En una realización, la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % es de Penicillium coprobium, por ejemplo de Penicillium coprobium PF1169.
La biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % comprende preferiblemente al menos piripiropeno A, pero también puede comprender una combinación de uno o más piripiropenos, por ejemplo la biomasa seca que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) de menos del 8 % puede comprender piripiropeno A, piripiropeno B, piripiropeno C y piripiropeno D.
Preferiblemente, los procesos implican obtener un compuesto de Fórmula II, que puede o no ser usado para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, preferiblemente usado para producir al menos un compuesto de Fórmula IV o Fórmula V y aún más preferido para producir un compuesto de Fórmula V. Los procesos también pueden comprender la etapa de usar al menos un compuesto de Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, preferiblemente un compuesto de Fórmula V para producir una composición para control de plagas, que comprende al menos un compuesto de Fórmula II, Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V. La composición para el control de plagas es preferiblemente un insecticida.
Los procesos para obtener los compuestos de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V a partir de los compuestos de Fórmula I o Fórmula II, así como los procesos para producir composiciones para el control de plagas, incluidos los insecticidas que usan estos compuestos como ingredientes activos, se divulgan, por ejemplo, en los documentos EP2223599. EP2119361 yEP1889540.
Ejemplo I: Producción de biomasa seca con un 7 % de contenido de agua residual mediante secado en un secador de molino de pasta y extracción de piripiropeno A con etilbenceno
Para el secado en un secador de molino de pasta y la extracción adicional de piripiropeno A se aplicó biomasa suspendida de Penicillium coprobium de fermentación alimentada por lotes. El microorganismo P. coprobium se cultivó en un fermentador de 16,5 m3 con un volumen de trabajo de 10 m3
El caldo de cultivo recogido comprendía un volumen de 10 m3 y contenía del 6 al 8 % (peso/volumen) de biomasa, que comprendía del 1,8 % al 2 % (peso/volumen) de piripiropenos, situados dentro de la biomasa (para análisis de HPLC de piripiropeno A y determinación del contenido de biomasa, véase a continuación)
El caldo de cultivo recogido se trató con un procedimiento de inactivación térmica y se deshidrató filtrando en un dispositivo de prensa filtrante que contenía 26 placas con un tamaño de 760x760 mm para producir biomasa húmeda. Todas las placas se cubrieron con material de tela filtrante del fabricante Nakao Filter Corp., tipo TR 2600. La torta del filtro obtenida (biomasa húmeda) tenía un contenido de agua de ~ 75 % a 78 % (para determinar el contenido de agua, véase a continuación). No se detectó glucosa residual en la torta del filtro.
Esta torta de filtrante deshidratada se sometió luego a secado en un secador de molino de pasta de construcción similar al dibujo esquemático de un secador de molino de pasta mostrado en la Figura 1.
El secador de molino de pasta usado en el Ejemplo I tenía las siguientes especificaciones:
Diámetro: 140 mm.
Altura: 1300 mm.
No. de cuchillos rotativos: 5
No. máx. de giros 2800 RPM
Caudal máx. de gas: 300 kg/h
Se alimentaron 7,5 a 7,9 kg/h de la torta del filtro descrita dentro del secador de molino de pasta a través de un tornillo de alimentación. La cantidad de nitrógeno usado como gas de secado se fijó en 119 a 121 m3/h o una velocidad de gas hidrólico de 3 m/s, respectivamente. El rotor comprendido en la cámara de secado del secador de molino de pasta se ajustó a un número de giros de 900 RPM para lograr un tiempo de residencia suficiente en el aparato correspondiente al nivel de secado suficiente del producto. La temperatura de entrada del gas de secado se ajustó a 221 a 224 °C.
Se determinó que el contenido de agua obtenido de la biomasa seca era del 7 % y el contenido de piripiropeno A era del 28,9 % en peso.
La biomasa seca producida mostró una estabilidad de almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente: después de 213 días se observó una pérdida de piripiropeno A del 4 %, y después de 242 días en total, se había descompuesto un total de 6 % del piripiropeno A. Después de 242 días, se observó una degradación continua de piripiropeno A hasta un total de 54 % de piripiropeno A a 60 °C.
Molienda y extracción con etilbenceno:
La biomasa obtenida secando con el molino de pasta como se describió anteriormente y que contiene un 7 % de agua residual se sometió a molienda usando un aparato Microthron MB550, ajustado en la etapa 7 durante 45 segundos. Se sometieron 100 g de la biomasa seca molida a un reactor de 0,75 L agitado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de etilbenceno y la suspensión se agitó durante 18 horas a 60 °C con 250 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 L (tamaño de poro 3, diámetro 9,5 cm) usando un vacío de 200 mbar. La torta del filtro se lavó dos veces con 200 mL de etilbenceno, cada vez a una temperatura de 60 °C (lavados por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se lavó dos veces con 150 mL de etilbenceno, cada vez a una temperatura de 60 °C (lavados por desplazamiento). El piripiropeno se obtuvo con un rendimiento del 93,9 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
Ejemplo para el procedimiento de determinación de la resistencia del filtro de biomasa seca usando diferentes solventes de extracción:
Se agitaron 50 g de biomasa secada en molino de pasta con un contenido de agua residual del 7 % (véase el Ejemplo I anterior) y 100 mL de disolvente a una cierta temperatura durante 18 horas. Los disolventes usados fueron a) metanol a temperatura ambiente; b) tolueno a temperatura ambiente, c) etilbenceno a temperatura ambiente y d) etilbenceno a 60 °C. La suspensión obtenida se filtró usando un filtro de presión y una tela de filtro PP25130F (PP = polipropileno, compañía: Verseidag) a 1 bar. Se midieron los siguientes parámetros para determinar la resistencia del filtro: a) área de filtración, b) tiempo de filtración, c) presión de filtración, d) volumen del filtrado obtenido, e) altura de la torta del filtro. Las resistencias de los filtros y las concentraciones de piripiropeno A en solución después de la extracción determinada para biomasas que tienen diferentes contenidos de agua residual se enumeran en la Tabla 2).
Tabla 2: Resumen de las extracciones de piripiropeno (PPA) de biomasa húmeda y seca.
continuación
Ejemplo II: Producción de biomasa seca con un contenido de agua residual del 5 % mediante secado en un secador de molino de pasta y extracción de piripiropeno A con tolueno y etil benceno
El mismo material y aparato que se describe en el Ejemplo 1 se usaron para secar en un secador de molino de pasta. La velocidad de alimentación se ajustó esta vez entre 4 a 5,8 kg/h y la velocidad del rotor se ajustó en 1000 RPM. Se aplicaron 113 a 117 m3/h de gas de secado (nitrógeno) a 219 - 224 °C para secar la biomasa húmeda. La biomasa seca generada en el proceso de secado descrito tenía un contenido de agua residual del 5 %, un contenido de piripiropeno A del 28 % y mostró estabilidad de almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente. Se observó una pérdida de piripiropeno A del 4 % después de 183 días, y después de 242 días se había descompuesto un total de 11 % de piripiropeno A. El almacenamiento del mismo material a 60 °C durante la misma cantidad de tiempo (242 días) produjo una pérdida del 11 % de piripiropeno A.
Molienda y extracción con tolueno:
La biomasa obtenida por secado de molino de pasta, como se describió anteriormente, que contiene un 5 % de agua residual se sometió a molienda usando un aparato Microthron MB550, ajustado en la etapa 7 durante 45 segundos. Se sometieron 100 g de la biomasa seca molida a un reactor de 0,75 litros agitado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de tolueno y la suspensión se agitó durante 18 horas a 60 °C con 250 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9,5 cm) usando vacío a 200 mbar.
La torta del filtro se lavó con 200 mL de tolueno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 200 mL de tolueno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente.
Luego, la torta del filtro se lavó con 150 mL de tolueno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 150 mL de tolueno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente.
Luego, la torta del filtro se lavó con 150 mL de tolueno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 150 mL de tolueno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente. El piripiropeno se obtuvo con un rendimiento del 96,4 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
Molienda y extracción con etilbenceno: ejemplo 1
La biomasa seca obtenida por secado con molino de pasta, como se describió anteriormente, que contiene un 5 % de agua residual se sometió a molienda usando un aparato Microthron MB550, ajustado en la etapa 7 durante 45 segundos. Se sometieron 100 g de la biomasa seca molida a un reactor de 0,75 litros agitado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de etilbenceno y la suspensión se agitó durante 18 horas a 60 °C con 250 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9,5 cm) usando vacío a 200 mbar.
La torta del filtro se lavó de nuevo con 200 mL de etilbenceno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 200 mL de etilbenceno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente.
Luego, la torta del filtro se lavó con 150 mL de etilbenceno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 150 mL de etilbenceno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente.
Luego, la torta del filtro se lavó con 150 mL de etilbenceno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 150 mL de etilbenceno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente. El piripiropeno se obtuvo con un rendimiento del 95,3 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
Molienda y extracción con etilbenceno:
La biomasa seca obtenida por secado con molino de pasta, como se describió anteriormente, que contiene un 5 % de agua residual se sometió a molienda usando un aparato Microthron MB550 ajustado en la etapa 7 durante 45 segundos. Se enviaron 200 g de la biomasa seca molida a un reactor de 0,75 litros equipado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 400 mL de etilbenceno y la suspensión se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente con 350 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9,5 cm) usando vacío a 200 mbar.
La torta del filtro se lavó de nuevo con 400 mL de etilbenceno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 minutos más con 400 mL de etilbenceno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente.
Luego, la torta del filtro se lavó con 300 mL de etilbenceno (lavado por desplazamiento). Posteriormente, la torta del filtro se transfirió al reactor de 0,75 litros y se agitó durante 60 min más con 300 mL de tolueno. La suspensión se filtró nuevamente usando las mismas condiciones que se describieron anteriormente. El piripiropeno se obtuvo con un rendimiento del 91,5 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
Extracción con metanol:
Se sometieron 100 g de biomasa seca obtenida por secado con molino de pasta, como se describió anteriormente, que contiene un 5 % de agua residual a un reactor de 0,75 litros equipado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de metanol y la suspensión se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente con 250 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9,5 cm) usando vacío a 200 mbar.
La torta del filtro se lavó dos veces con 200 mL de metanol cada vez (lavados por desplazamiento). Posteriormente, la torta de filtración se lavó dos veces con 150 mL de metanol cada vez (lavados por desplazamiento). Se obtuvo piripiropeno con un rendimiento del 96,9 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa
seca antes de la extracción.
Molienda y extracción con metanol:
La biomasa obtenida mediante el secado con molino de pasta, como se describió anteriormente, que contiene un 5 % de agua residual se sometió a molienda usando un aparato Microthron MB550 ajustado en la etapa 7 durante 45 segundos. Se enviaron 100 g de la biomasa seca molida a un reactor de 0,75 litros equipado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de metanol y la suspensión se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente con 250 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9,5 cm) usando vacío a 200 mbar.
La torta del filtro se lavó dos veces con 200 mL de metanol cada vez (lavados por desplazamiento). Posteriormente, la torta de filtración se lavó dos veces con 150 mL de metanol cada vez (lavados por desplazamiento). El piripiropeno se obtuvo con un rendimiento del 98,7 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
Ejemplo III: Producción de biomasa seca con un contenido de agua residual del 3 % mediante secado por aspersión y extracción de piripiropeno A con etilbenceno y metanol
Se usó biomasa de P. coprobium producida en fermentación discontinua alimentada y suspendida en caldo de cultivo para el secado por aspersión. El microorganismo P. coprobium se cultivó en un fermentador de 0,3 m3 con un volumen de trabajo de 0,2 m3. El caldo de fermentación (caldo de cultivo) contenía del 6 al 8 % de biomasa y del 2 al 2,1 % de piripiropeno A en la biomasa y menos de 0,1 g/L de glucosa. Este caldo se sometió a inactivación térmica durante 60 minutos a 70 °C antes de recogerlo del recipiente de fermentación. Posteriormente, el caldo de cultivo se homogeneizó usando un aparato de cavitron ajustado a una temperatura de 70 °C. Luego, el caldo de fermentación se mantuvo a 70 °C durante 30 minutos más en un tanque de almacenamiento intermedio antes de secarse por aspersión.
Para el secado, se ha usado una torre de secado por aspersión similar en construcción a la descrita en el dibujo esquemático de la Figura 2, con las características técnicas que se describen a continuación:
Flujo máximo de gas 250 m3/h
Placa de abertura de diámetro de agujero 2 mm
Número de agujeros de abertura 1,255
D 1 1,25 m
H 1 0,31 m
H 2 1,22 m
H 3 1,36 m
D 2 66 mm
Tipo de boquilla: Compuesto de Nubilosa 2, 2 mm
Profundidad de la boquilla bajo la placa de abertura 200 mm
Potencia de calentamiento 20 KW
Separación primaria Ciclón (diámetro = 0,203 m, alto = 0,5 m)
Filtro (Torre de filtración) Recubrimiento de poliéster PTFE
Área del filtro 3,40 m2
Número de tubos 6
Longitud de los tubos 1,10 m
Diámetro del tubo 0,16 m
El caldo de cultivo que comprende la biomasa producida se alimentó en el secador por aspersión a una velocidad de alimentación de 7,5 a 8,5 kg/h. Se usó nitrógeno como gas de secado y se aplicó con 250 m3/h y una temperatura de entrada de 160 °C. La temperatura correspondiente de salida del gas fue de 77 a 80 °C en el ciclón.
La biomasa seca tenía un contenido de agua residual del 3 % y un contenido de piripiropeno A del 24 %.
Esta biomasa seca producida de esta manera mostró una estabilidad de almacenamiento a largo plazo, debido a que solo se observó una ligera disminución del 4 % de piripiropeno A después del almacenamiento durante 213 días a temperatura ambiente, así como después del almacenamiento durante 242 días a 60 °C.
Extracción con etilbenceno:
Se sometieron 100 g de biomasa secada por atomización que contenía un 3 % de agua residual a un matraz de 0,5 litros con 4 bocas agitado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de etilbenceno y la suspensión se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente con 530 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9 cm).
La torta del filtro se lavó cuatro veces con 150 mL de etilbenceno cada vez (lavados por desplazamiento). Se obtuvo piripiropeno con un rendimiento del 95,6 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
Extracción con metanol:
Se sometieron 100 g de biomasa secada por atomización que contenía un 3 % de agua residual a un matraz de 0,5 litros con 4 bocas agitado con un impulsor de cuchillas. Se añadieron 200 mL de metanol y la suspensión se agitó durante 18 horas a temperatura ambiente con 530 rpm. Posteriormente, la suspensión se filtró usando un filtro de vidrio de 0,5 litros (tamaño de poro 3, diámetro 9 cm).
La torta del filtro se lavó cuatro veces con 150 mL de metanol cada vez (lavados por desplazamiento). El piripiropeno se obtuvo con un rendimiento del 98 % (peso/peso) en comparación con la cantidad presente en la biomasa seca antes de la extracción.
IV: Datos analíticos y procedimientos
Hasta que no se indique lo contrario, los siguientes procedimientos se han usado para determinar los valores presentados en los Ejemplos:
Datos analíticos por HPLC de PIRIPIROPENO
Instrumento: AGILENT
Columna: Zorbax Eclipse XDB-C18, 1,8 pm, 50 x 4,6 mm (N° 922975.902) Presión: aproximadamente 230 bar
Longitud de onda del detector UV: 230 nm o 320 nm
Temperatura: 40 °C
Preparación de soluciones:
Solución A: Agua (Sigma-Aldrich) con 0,1Vol % de ácido fosfórico
Disolvente orgánico B: Acetonitrilo (grado de gradiente de Sigma-Aldrich)
Gradiente: 0,0 min 1,5 mL/min 90 % A 10 % B
4,0 min 1,5 mL/min 70 % A 30 % B 11,0 min 1,5 mL/min 55 % A 45 % B 13,0 min 1,5 mL/min 45 % A 55 % B 17,0 min 1,5 mL/min 20 % A 80 % B 19,0 min 1,5 mL/min 0 % A 100 % B 20,0 min 1,5 mL/min 0 % A 100 % B 20,1 min 1,5 mL/min 90 % A 10 % B
La fase móvil se desgasifica automáticamente en el aparato de HPLC.
Tiempo posterior 3 min
Cuantificación: Estándar externo para piripiropeno A
Área pico en % para cualquier impureza desconocida
Volumen de inyección: 1 pL (piripiropeno)
Disolvente diluyente: Acetonitrilo para piripiropeno
Preparación de la muestra para piripiropeno A:
Pesar con precisión aproximadamente 100 mg de muestra en un matraz volumétrico de 100,0 mL, disolver en 40,0 mL de acetonitrilo (someter a ultrasonido durante 1 minuto). Si la muestra no se disuelve en acetonitrilo puro, agregar agua y repetir la sonicación. Completar a volumen con acetonitrilo.
Preparación del estándar:
Una calibración típica contiene 5 soluciones estándar:
Piripiropeno: 1. 30 mg del estándar en 100 mL
2. 60 mg del estándar en 100 mL
3. 90 mg del estándar en 100 mL
4. 120 mg del estándar en 100 mL
5. 150 mg del estándar en 100 mL
Disolver cada solución estándar en acetonitrilo (piripiropeno A) (véase la preparación de la muestra para obtener más detalles). El tipo de curva de calibración es lineal. Las concentraciones dependen de la sensibilidad del
detector, pueden ser necesarios ajustes.
Formato de inyección
4 x blanco/1 x estándar 1 a 5/preparación de la muestra.
Tiempos de retención
El tiempo de retención del piripiropeno A es: 7,7 min.
Determinación del contenido de biomasa.
Filtración de aproximadamente 15 g de caldo de fermentación; lavar dos veces la torta del filtro con agua destilada; secado de la torta del filtro: básculas de secado de halógeno (IR) (Mettler Toledo), temperatura de secado de 180 °C hasta peso constante.
Determinación del contenido de agua
1) El contenido de agua residual de la torta del filtro (biomasa húmeda) se determinó mediante el cálculo del contenido de biomasa del caldo de fermentación (véase más arriba) y el peso real de la torta del filtro.
2) Para contenidos de agua residual por debajo de 30 %: pérdida en el procedimiento de secado. Se secan aproximadamente 5 - 10 g de biomasa en un secador de vacío a 80 °C y 50 mbar (corriente de nitrógeno 20 L/h) durante 18 h (peso constante).
3) Para contenidos de agua residual por debajo de ~ 10 %:
a) Básculas halógenas (IR) (Mettler Toledo) a 102 °C, 4 h (peso constante).
b) Karl Fischer: para 0,1 g - 0,5 g de biomasa seca se agregan ~ 45 mL de metanol. Esta suspensión se agita por un corto tiempo (~ 10 seg). Posteriormente se realiza la titulación Karl Fischer. Este procedimiento es bueno para la biomasa de partículas de tamaño relativamente pequeño debido a la posibilidad de alcanzar toda el agua que está unida dentro de las células. Escala superior, agitador magnético con calefacción, aparatos de vidrio según c) Procedimiento Aufhauser: se pesa una muestra de 50 g de biomasa en un matraz de 500 mL que luego se llena hasta aproximadamente la mitad del volumen con tolueno. El agua se elimina por destilación azeotrópica y se recolecta en una trampa graduada Dean-Stark hasta que no se retire más agua de la muestra.
Se supone que la densidad es de 1 g/mL:
Contenido de agua (%) = Agua mL x 100
Peso de la muestra g
Determinación de glucosa por cromatografía líquida de alto rendimiento:
Columna: Aminex HPX-87 H 300*7,8 mm (Biorad)
Pre-columna: Catión H
Temperatura: 30 °C
Velocidad de flujo: 0,50 mL/min.
Volumen de inyección: 5.0 |j L.
Detección: Detector IR
Duración: 30.0 minutos
Presión máx.: 140 bar
Eluyente: H2SO45 mM
Matriz: Caldo de fermentación
Preparación: La muestra debe filtrarse con un corte de 0,22 jm.
Calibración: Glucosa 50g/L en agua.
Tiempo de retención: 10,93 min (glucosa)
Claims (28)
1. Un proceso para obtener al menos un piripiropeno, que comprende las etapas de
a) cultivar un organismo productor de piripiropeno en un caldo de cultivo en condiciones de cultivo, en el que se produce al menos un piripiropeno,
b) producir biomasa seca con un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 % de al menos una parte de la biomasa obtenida en la etapa a),
c) obtener al menos un piripiropeno a partir de la biomasa seca producida en la etapa b).
2. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la biomasa seca producida en la etapa b) se produce directamente mediante secado por atomización del caldo de cultivo que comprende la biomasa, o se produce a través del secado de la biomasa húmeda obtenida a partir del caldo de cultivo.
3. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la biomasa húmeda se obtiene a partir del caldo de cultivo a través de
a) filtración y/o centrifugación, o
b) filtración y aplicación de presión mecánica, o
c) filtración y/o centrifugación y aplicación de presión mecánica.
4. Un proceso de acuerdo con las reivindicaciones 2 o 3, en el que la biomasa húmeda
a) ha sido resuspendida en un medio de resuspensión, o
b) ha sido homogeneizada, o
c) tiene un contenido de glucosa inferior a 5 g/L, o
d) tiene un contenido de agua entre más del 15 % y menos del 90 %, o
e) tiene una combinación de al menos dos de a) a d).
5. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la biomasa seca producida en la etapa b) se produce por secado en un secador por atomización, un secador de molino de pasta, un secador instantáneo, un secador de lecho fluido o un secador rotatorio.
6. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la biomasa seca producida en la etapa b) se produce por secado en un secador por atomización o un secador de molino de pasta.
7. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la biomasa seca producida en la etapa b) se almacena desde aproximadamente 5 horas hasta varios años, antes de que se obtenga el piripiropeno en la etapa c).
8. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la biomasa seca producida en la etapa b) tiene un contenido de agua residual inferior al 5 %.
9. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que más del 80 % de la biomasa seca producida en la etapa b) tiene un tamaño de partícula de entre 0,01 mm y 5 mm.
10. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la biomasa seca producida en la etapa b) y usada para obtener el piripiropeno en la etapa c), comprende al menos el 95 % del piripiropeno producido durante el cultivo de la etapa a).
11. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el organismo productor de piripiropeno pertenece a los géneros Penicillium, Eupenicillium o Aspergillus.
12. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el organismo productor de piripiropeno se selecciona del grupo formado por Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum y Aspergillus fumigatus.
13. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el organismo productor de piripiropeno es Penicillium coprobium.
14. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el piripiropeno se obtiene a partir de la biomasa seca a través de la extracción con un disolvente seleccionado del grupo de metanol, tolueno y etilbenceno, o es una mezcla de al menos dos de ellos.
15. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el piripiropeno se obtiene a partir de la biomasa seca a través de la extracción con un disolvente y el disolvente se separa de la biomasa a través de la etapa de filtración que tiene una resistencia de filtro por debajo de 5 x 1013 mPas/m2
16. Un proceso para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V
en las que,
R1 y R3 representan ciclopropilcarboniloxi, y
R2 representa hidroxilo, ciclopropilcarboniloxi o 2-cianobenzoiloxi
R4 representa hidroxilo
que comprende:
a) obtener piripiropeno a través de un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, b) producir el compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V a partir del piripiropeno obtenido en la etapa a).
17. Un proceso para obtener al menos un compuesto de Fórmula I o Fórmula II o para producir al menos un compuesto de Fórmula III o Fórmula IV
Fórmula (I), en la que R1, R2, R3 y R4 tienen las combinaciones
Fórmula (IV), en las que
R1 y R3 representan ciclopropilcarboniloxi, y
R2 representa hidroxilo, ciclopropilcarboniloxi o 2-cianobenzoiloxi
R4 representa hidroxilo
a partir de biomasa seca de un organismo productor de piripiropeno que comprende al menos un piripiropeno y que tiene un contenido de agua residual (peso/peso) inferior al 8 %.
18. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que los organismos productores de piripiropeno se seleccionan del grupo que consiste en Penicillium coprobium, Penicillium griseofulvum, Eupenicillium reticulosporum y Aspergillus fumigatus.
19. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el organismo productor de piripiropeno es Penicillium coprobium.
20. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en el que al menos un compuesto de Fórmula I o Fórmula II es obtenido por extracción de biomasa seca.
21. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V, se produce a partir de al menos un compuesto de Fórmula I o Fórmula II obtenido a través de la extracción de biomasa seca.
22. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que se obtiene un compuesto de Fórmula II mediante la extracción de biomasa seca.
23. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 22, en el que se obtiene un compuesto de Fórmula II y se usa para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V.
24. Un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23, en el que al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V se usa para producir una composición para el control de plagas.
25. Uso de biomasa seca como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 o 19 para obtener al menos un compuesto de Fórmula I.
26. Uso de biomasa seca como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 o 19 para obtener un compuesto de Fórmula II.
27. Uso de biomasa seca como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 o 19 en un proceso para producir al menos un compuesto de Fórmula III, Fórmula IV o Fórmula V.
28. Uso de biomasa seca como se define en cualquiera de las reivindicaciones 17, 18 o 19 en un proceso como el reivindicado en una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 24.
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