ES2707778T3

ES2707778T3 - Inmunógenos polisacáridos conjugados con proteínas portadoras de E. coli

Info

Publication number: ES2707778T3
Application number: ES10818096T
Authority: ES
Inventors: Paolo Costantino; Laura Serino; Maria Rosaria Romano; Marta Tontini; Francesco Berti; Francesca Micoli; Anna Kabanova
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2010-12-30
Publication date: 2019-04-05
Anticipated expiration: 2030-12-30
Also published as: JP2013516401A; JP5781542B2; EP2519265B1; WO2011080595A3; EP2519265A2; US9173954B2; WO2011080595A2; US20120308600A1

Abstract

Un conjugado de polisacárido que comprende un inmunógeno de polisacárido conjugado con un polipéptido portador, en el que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526).

Description

DESCRIPCIÓN

Inmunógenos polisacáridos conjugados con proteínas portadoras de E. coli

Campo técnico

Esta divulgación se refiere a la inmunización usando inmunógenos de polisacáridos conjugados con polipéptidos portadores de E. coli. De particular interés es el uso de dichas composiciones como vacunas contra infecciones y enfermedades bacterianas y fúngicas.

Antecedentes de la técnica

Las proteínas portadoras se usan para mejorar la respuesta inmunitaria a los inmunógenos polisacáridos. Dichas proteínas portadoras pueden ser particularmente ventajosas en la inducción de una respuesta inmunitaria en personas muy jóvenes y, por lo tanto, se encuentran en varias vacunas pediátricas. El calendario recomendado de vacunación pediátrica incluye un número significativo de vacunas, incluida la vacuna contra la hepatitis B al nacer; a partir de las seis semanas, las de difteria/tétanos/tos ferina (DTaP), rotavirus, H. influenzae conjugado tipo b (Hib), poliovirus inactivado y conjugados neumocócicos; a partir de los seis meses, vacunas inactivadas contra la influenza; a partir de los 12 meses, sarampión/paperas/rubéola (MMR), varicela y hepatitis A; y después de dos años, conjugado meningocócico. Entre esta lista, los siguientes son conjugados de polisacáridos: conjugado de Hib (por ejemplo, HbOC - un conjugado de difteria CRM¹⁹⁷); conjugados neumocócidos (por ejemplo, Prevnar - un conjugado de difteria CRM¹⁹⁷y Synflorix - un portador de proteínas procedente de cepas de Haemophilus influenzae no tipificables); y conjugado meningocócico (por ejemplo, Menactra - un conjugado de difteria CRM¹⁹⁷).

Añadir nuevas vacunas al actual calendario de vacunación pediátrica puede encontrar dos problemas potenciales que deben abordarse. En primer lugar, debe abordarse la cuestión de la supresión epitópica inducida por el portador (o "supresión del portador", como se conoce generalmente), en particular la supresión que surge del cebado del portador. La "supresión del portador" es el fenómeno por el cual la inmunización previa de un animal con una proteína portadora evita que luego provoque una respuesta inmunitaria contra un nuevo epítopo antigénico que se presenta en ese portador (Herzenberg y col. (1980) Nature 285:664-667).

Como se indicó en Schutze y col. (1985) J Immunol 135:2319-2322, en el que varios antígenos de la vacuna contienen el mismo componente proteico (que se usa como inmunógeno y/o como proteína portadora en un conjugado), existe entonces la posibilidad de interferencia entre esos antígenos. Schutze y col. observaron que la respuesta inmunitaria contra un antígeno que se conjugaba con un portador de toxoide tetánico (Tt) se suprimía por inmunidad preexistente contra Tt.

Dagan y col. observaron que una combinación de vacunas DTP con una vacuna con conjugado Hib se vio afectada negativamente cuando el portador para el conjugado Hib era el mismo que el antígeno tetánico de la vacuna DTP ((1998) Infect Immun 66:2093-2098). Dagan y col. concluyeron que este fenómeno de "supresión del portador", que surge de la interferencia de un portador de proteína común, debe tenerse en cuenta al introducir vacunas que incluyen múltiples conjugados.

A diferencia de Schutze y col. y Dagan y col., Barington y col. indicaron que el cebado con toxoide tetánico no tuvo un impacto negativo en la respuesta inmunitaria contra un conjugado de Hib-Tt administrado posteriormente, pero se observó supresión en pacientes con anticuerpos anti-Tt adquiridos por la madre ((1994) Infect Immun 62:9-14). Di John y col., sin embargo, observaron un efecto de "supresión epitópica" para un conjugado de péptido basado en Tt en pacientes que tienen anticuerpos anti-Tt existentes resultantes de la vacunación contra el tétanos ((1989) Lancet 2 (8677):1415-8).

Granoff y col. sugirieron que un conjugado que tiene CRM¹⁹⁷(un mutante desintoxicado de toxina diftérica) como portador puede ser ineficaz en niños que no habían recibido previamente toxina diftérica como parte de una vacuna (por ejemplo, como parte de una vacuna DTP o DTP) ((1993). Vaccine Suppl 1: S46-51). Este trabajo se desarrolló aún más en Granoff y col. (1994) JAMA 272:1116-1121, en el que se observó que persiste un efecto de cebado del portador por inmunización con DT para la inmunización posterior con conjugados de Hib.

En Barington y col. (1993) Infect Immun 61:432-438, los autores descubrieron que la inmunización previa con una proteína portadora del toxoide diftérico o tetánico redujo el aumento en los niveles de anticuerpos anti-Hib después de una inmunización posterior con el sacárido capsular Hib conjugado con esos portadores, estando IgG1 e IgG2 igualmente afectados. También se suprimieron las respuestas a las porciones portadoras de los conjugados. Además, se observó una supresión más general no específica de epítopos, ya que se observó que la inmunización previa con un conjugado afecta las respuestas inmunitarias contra las porciones de portador y sacárido de un segundo conjugado que se administró cuatro semanas después.

Por lo tanto, dada la confusión sobre el impacto de la "supresión del portador", tener proteínas portadoras adicionales disponibles para la conjugación será beneficioso para reducir dichas interacciones adversas.

En segundo lugar, dado el calendario de vacunación ya abarrotado, la adición de nuevas vacunas al calendario de vacunación será cada vez más difícil debido a las posibles interacciones adversas, pero también debido simplemente al número de inyecciones por separado requeridas. Por lo tanto, es ventajoso poder combinar vacunas en una sola inyección, como las vacunas DTaP o MMR. Tener proteínas portadoras adicionales que pueden mejorar una respuesta inmunitaria a un inmunógeno polisacárido así como inducir una respuesta inmunitaria a sí mismo será beneficioso, ya que puede permitir la combinación de vacunas contra diferentes patógenos en una única composición inyectable.

El documento US-A-4356170 desvela conjugados inmunogénicos de polisacárido-proteína en los que el objetivo es mejorar la antigenicidad del polisacárido por conjugación con un componente de proteína de una bacteria como E. coli. Es un objeto de la divulgación proporcionar polipéptidos transportadores adicionales y/o mejores para la conjugación con inmunógenos de polisacáridos. También es un objeto de la divulgación proporcionar polipéptidos portadores para la conjugación con inmunógenos de polisacáridos en los que los polipéptidos portadores pueden usarse en la inmunización contra cepas patógenas de E. coli, y más particularmente contra patotipos intestinales (por ejemplo, cepas EAEC, EIEC, EPEC y ETEC), así como los patotipos ExPEC. También es un objeto de la divulgación proporcionar conjugados con dichos polipéptidos portadores adicionales y/o mejores en los que el inmunógeno polisacárido es un polisacárido de glucano, que en algunas realizaciones se puede usar en la inmunización contra patógenos fúngicos.

Sumario

El ámbito de la invención está definido por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico). La materia objeto que no está abarcada por el ámbito de las reivindicaciones no forma parte de la presente invención reivindicada. En consecuencia, un aspecto de la divulgación proporciona un conjugado de polisacárido de gluano que comprende un polisacárido de glucano conjugado con un polipéptido portador seleccionado de entre el grupo que consiste en una proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), una proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), y una proteína de venta de Escherichia que contiene repeticiones (polipéptido upec-5211). Cuando el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), el polipéptido portador puede: (a) tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 50; (b) tener una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 alteraciones de un solo aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 50; (c) tener al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 50; (d) comprender un fragmento de al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, o al menos 150 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:50; y/o (e) cuando se alinea con la SEQ ID NO:50 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que x es 30 e y es 0,75. Cuando el polipéptido portador es la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), el polipéptido portador puede: (a) tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 44; (b) tener una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 alteraciones de un solo aminoácido en comparación con la SEQ ID NO:44; (c) tener al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:44; (d) comprender un fragmento de al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, o al menos 150 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:44; y/o (e) cuando se alinea con la SEQ ID NO:44 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que x es 30 e y es 0,75. Cuando el polipéptido portador es la proteína de venta de Escherichia que contienen repeticiones (polipéptido upec-5211), el polipéptido portador puede: (a) tener la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO 48; (b) tener una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 alteraciones de un solo aminoácido en comparación con la SEQ ID NO:48; (c) tener al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:48; (d) comprender un fragmento de al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, o al menos 150 aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO:48; y/o (e) cuando se alinea con la SEQ ID NO:48 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que x es 30 e y es 0,75. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano contiene enlaces p-1,3 y/o enlaces p-1,6. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano es una especie molecular única. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano se conjuga con la proteína portadora directamente o se conjuga con la proteína portadora a través de un engarce. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano tiene un peso molecular de menos de 100 kDa (por ejemplo, inferior a 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20 o 15 kDa). En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano tiene 60 o menos (por ejemplo, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4) unidades de monosacáridos de glucosa. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano es un polisacárido de (3-1,3 glucano con alguna ramificación 3-1,6. en determinadas realizaciones, en las que el polisacárido de glucano es un polisacárido de p-1,3 glucano con alguna ramificación 3-1,6, el polisacárido de glucano es una laminarina. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano comprende tanto restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,3 como restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,6, con una relación de restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,3 a restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,6 de al menos 8:1, y/o hay una o más secuencias de al menos cinco restos adyacentes no terminales unidos a otros restos solo por enlaces 3-1,3. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano comprende tanto restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,3 como restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,6, con una relación de restos de glucosa unidos a enlaces 3-1,3 a restos de glucosa unidos a enlaces 3 1,6 de al menos 8:1. En determinadas realizaciones que pueden combinare con cualquiera de las realizaciones anteriores que excluyen aquellas que tienen restos unidos a enlaces 3-1,6, el polisacárido de glucano tiene exclusivamente enlaces 3-1,3. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano es una curdlana. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el conjugado de polisacárido de glucano comprende además un adyuvante.

Otro aspecto de la divulgación proporciona componentes de vacuna que comprenden el conjugado de polisacárido de glucano de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones.

Otro aspecto más de la divulgación proporciona vacunas que comprenden el componente de vacuna del aspecto anterior. En determinadas realizaciones, la vacuna comprende además un adyuvante. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con la realización anterior, la vacuna comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado de entre: un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno de E. coli adicional, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, un antígeno de Shigella y un antígeno de Klebsiella. En determinadas realizaciones preferentes que pueden combinarse con la realización anterior, la vacuna comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado de una bacteria asociada con infecciones nosocomiales, que puede incluir: un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Candida albicans, un antígeno de Clostridium difficile, o un antígeno de Pseudomonas aeruginosa.

Otro aspecto más de la divulgación proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria mejorada en un sujeto mamífero a un polisacárido de glucano que comprende administrar al sujeto mamífero el conjugado de polisacárido de glucano de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones, el componente de vacuna de acuerdo con el aspecto anterior, o la vacuna de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones.

Otro aspecto de la divulgación proporciona usos del conjugado de polisacárido de glucano de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones, el componente de vacuna de acuerdo con el aspecto anterior, o la vacuna de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones para inducir una respuesta inmunitaria mejorada en un sujeto mamífero al polisacárido.

Otro aspecto más de la divulgación proporciona conjugados de polisacáridos que comprenden un polisacárido conjugado con un polipéptido portador seleccionado de entre el grupo que consiste en una proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), una proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), y una proteína de venta de Escherichia que contiene repeticiones (polipéptido upec-5211). En realizaciones en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), el polipéptido portador puede comprender una mutación que reduce la toxicidad y/o una eliminación que mejora la purificación en comparación con la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) de la SEQ ID NO: 39. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) con una mutación que reduce la toxicidad, la mutación puede seleccionarse de una eliminación de todo o una parte del dominio de metaloproteasa de cincina y una mutación puntual en el dominio de metaloproteasa de cincina que reduce la actividad de la proteasa. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) con una mutación que reduce la toxicidad, la mutación puntual es una mutación de un resto de unión a cinc o una mutación de un resto catalítico, que en algunos casos puede ser el número de aminoácido 1305 basado en la alineación con la SEQ ID NO:39. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) con una mutación que reduce la toxicidad, el polipéptido portador no comprende al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína precursora AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 400 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 500 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 600 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 700 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 750 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los últimos 758 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o no comprende al menos los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 200 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 300 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 400 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 500 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 600 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 700 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 750 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 760 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526). En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526),el polipéptido portador no comprende al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína precursora AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), y opcionalmente no comprende al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526). En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), el polipéptido portador puede: (a) tener la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:26-40; (b) tener una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 alteraciones de un solo aminoácido en comparación con las SEQ ID NO:26-40; (c) tener al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:26-40; (d) comprender un fragmento de al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, o al menos 150 aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NO:26-40; y/o (e) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NO: 26-40 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que x es 30 e y es 0,75. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), el polipéptido portador contiene además una eliminación relativa a la proteína AcfD de E. coli (orf3526) que aumenta la solubilidad del polipéptido portador en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526). En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) con una eliminación que aumenta la solubilidad, la eliminación es la eliminación de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta a la región gly-ser, la eliminación de todo o parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambas. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) con una eliminación que aumenta la solubilidad, la eliminación es la eliminación de al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526). En realizaciones en las que el polipéptido portador es la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), el polipéptido portador puede ser un fragmento de la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364) en la que el fragmento contiene una eliminación relativa a la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli de longitud completa (polipéptido orf1364) cuya eliminación aumenta la solubilidad del fragmento en comparación con la proteína de longitud completa. En determinadas realizaciones en las que el polipéptido portador es la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364) tiene una eliminación que aumenta la solubilidad, la eliminación comprende el dominio carboxil-terminal p-barril o el polipéptido portador corresponde a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364) tiene una eliminación que aumenta la solubilidad, el fragmento comprende menos de 950 aminoácidos, menos de 900 aminoácidos, menos de 850 aminoácidos, menos de 800 aminoácidos, menos de 750 aminoácidos, menos de 700 aminoácidos, menos de 650 aminoácidos, menos de 600 aminoácidos, menos de 550 aminoácidos, menos de 500 aminoácidos, menos de 450 aminoácidos, menos de 440 aminoácidos o menos de 430 aminoácidos de la proteína antígeno 43 de la gripe (orf1364). En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptidoportador es la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), el polipéptido portador puede: (a) tener la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:1-22; (b) tener una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 alteraciones de un solo aminoácido en comparación con las SEQ ID NO:1-22; (c) tener al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:1-22; (d) comprender un fragmento de al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, o al menos 150 aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NO:1-22; y/o (e) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NO:1-22 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que x es 30 e y es 0,75. En otra realización que puede combinarse con las realizaciones anteriores en las que el polipéptido portador es la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), el fragmento no comprende al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), o al menos los primeros 52 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), y/o el fragmento no comprende al menos los últimos 50 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 250 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 325 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), o al menos los últimos 328 aminoácidos C-terminales en compración con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364). En realizaciones en las que el polipéptido portador es la proteína de venta de Escherichia que contiene repeticiones (polipéptido upec-5211), el polipéptido portador puede: (a) tener la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID NO:23-25; (b) tener una secuencia de aminoácidos que tiene de 1 a 10 alteraciones de un solo aminoácido en comparación con las SEQ ID NO:23-25; (c) tener al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 97 %, al menos un 98 %, o al menos un 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO:23-25; (d) comprender un fragmento de al menos 10, al menos 12, al menos 14, al menos 16, al menos 18, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 125, o al menos 150 aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NO:23-25; y/o (e) cuando se alinea con cualquiera de las SEQ ID NO: 23 25 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que x es 30 e y es 0,75. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido puede ser: (a) un glucano, (b) un sacárido capsular de al menos uno de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis, (c) un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae, (d) un polisacárido capsular de Staphylococcus aureus, (e) un polisacárido de Haemophilus influenzae B, (f) un antígeno sacárido de Streptococcus aglactiae, (g) un lipopolisacárido de Vibrio cholerae, o (h) un polisacárido capsular de Salmonella typhi. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido de glucano tiene un peso molecular de menos de 100 kDa (por ejemplo, menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20 o 15 kDa). En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido tiene 60 o menos (por ejemplo, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4) unidades de monosacáridos. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el polisacárido puede conjugarse directa o indirectamente con la proteína portadora. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con cualquiera de las realizaciones anteriores, el conjugado de polisacárido comprende además un adyuvante.

Otro aspecto de la divulgación proporciona componentes de vacuna que comprenden el conjugado de polisacárido de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones.

Otro aspecto más de la divulgación proporciona vacunas que comprenden el componente de vacuna del aspecto anterior. En determinadas realizaciones, la vacuna comprende además un adyuvante. En determinadas realizaciones que pueden combinarse con la realización anterior, la vacuna comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado de entre: un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno de E. coli adicional, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, un antígeno de Shigella y un antígeno de Klebsiella. En determinadas realizaciones preferentes que pueden combinarse con la realización anterior, la vacuna comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado de una bacteria asociada con infecciones nosocomiales, que puede incluir: un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Candida albicans, un antígeno de Clostridium difficile, o un antígeno de Pseudomonas aeruginosa. Otro aspecto más de la divulgación proporciona procedimientos para inducir una respuesta inmunitaria mejorada en un sujeto mamífero a un polisacárido que comprende administrar al sujeto mamífero el conjugado de polisacárido de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones, el componente de vacuna de acuerdo con el aspecto anterior, o la vacuna de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones.

Otro aspecto de la divulgación proporciona usos del conjugado de polisacárido de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones, el componente de vacuna de acuerdo con el aspecto anterior, o la vacuna de acuerdo con el aspecto anterior en cualquiera de sus realizaciones para inducir una respuesta inmunitaria mejorada en un sujeto mamífero al polisacárido.

Descripción detallada

Los polisacáridos puros son a menudo inmunógenos pobres y, por lo tanto, deben conjugarse con un polipéptido portador. Incluso cuando un polisacárido tiene suficiente inmunogenicidad, la conjugación con una proteína portadora puede mejorar la inmunogenicidad, de modo que se necesita entregar menos polisacárido. Además, para una eficacia protectora en los muy jóvenes, a menudo se requiere la conjugación con un polipéptido portador. El uso de la conjugación con proteínas portadoras con el fin de mejorar la inmunogenicidad de los antígenos de carbohidratos es bien conocido (véase, por ejemplo, Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2: S28-36, Buttery & Moxon (2000) JR Coll Physicians Lond 34:163-8, Ahmad y Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am13:113-33, vii, Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567, el documento EP-B-0477508, la patente de los EE.UU. n.° 5.306.492, el documento WO98/42721, Dick y col. en Conjugate Vaccines (eds. Cruse y col.) Karger, Basel, 1989, vol. 10, 48-1 14, Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego CA (1996), etc.); y se usa en particular para vacunas pediátricas (Ramsay y col. (2001) Lancet 357 (9251):195-6). Los inventores han descubierto sorprendentemente que tres antígenos de E. coli pueden actuar como polipéptidos portadores: la proteína precursora del factor de colonización accesorio D (AcfD) (polipéptido orf3526), la proteína antígeno 43 de la gripe (polipéptido orf1364) y la proteína de venta que contiene repeticiones (polipéptido upec-5211).

Por lo tanto, un aspecto de la divulgación proporciona un conjugado de polisacárido que comprende un polisacárido conjugado con una proteína portadora y, opcionalmente, un adyuvante (como se define a continuación).

El polipéptido portador puede conjugarse covalentemente con el polisacárido directamente o mediante un engarce. Se puede usar cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier engarce adecuado cuando sea necesario. La unión del polisacárido al polipéptido portador se realiza preferentemente a teavés de un grupo -NH², por ejemplo, a través de la(s) cadena(s) lateral(es) de uno o más restos de lisina o de uno o más restos de arginina en el polipéptido portador. Cuando el polisacárido tiene un grupo aldehído libre, este grupo puede reaccionar con una amina en el polipéptido portador para formar un conjugado por aminación reductiva. La unión al portador también puede ser a través de un grupo -SH, por ejemplo, a través de la(s) cadena(s) lateral(es) de uno o más restos de cisteína en el polipéptido portador. Como alternativa, el polisacárido puede unirse a la proteína portadora a través de una molécula enlazadora.

El polisacárido típicamente se activará o funcionalizará antes de la conjugación. La activación puede implicar, por ejemplo, reactivos de cianilación tales como CDAP (tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio). Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU (véasepor ejemplo, la introducción al documento WO98/42721).

Los enlaces directos al polipéptido portador pueden comprender la oxidación del polisacárido seguido de una aminación reductiva con el polipéptido portador, como se describe, por ejemplo, en la patente de los EE.UU. n.° 4.761.283 y la patente de los EE.UU. n.° 4.356.170.

Los enlaces a través de un grupo enlazador se pueden realizar usando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos descritos en la patente de los EE.UU. n.° 4.882.317 y la patente de los EE.UU. n.° 4.695.624. Típicamente, el engarce se une a través de un carbono anomérico del polisacárido. Un tipo preferente de enlace es un engarce de ácido adípico, que puede formarse acoplando un grupo -NH2 libre (por ejemplo, introducido en un polisacárido por aminación) con ácido adípico (usando, por ejemplo, activación de diimida), y luego acoplando una proteína al intermedio sacárido-ácido adípico resultante (véase, por ejemplo, el documento ^eP-B-0477508, Mol. Immunol., (1985) 22, 907-919, y el documento EP-A-0208375). Un tipo de enlace preferente similar es un engarce de ácido glutárico, que puede formarse acoplando un grupo NH-libre con ácido glutárico de la misma manera. Los engarces de ácido adípido y glutárico también pueden formarse por acoplamiento directo al polisacárido, es decir, sin introducción previa de un grupo libre, por ejemplo, un grupo -NH libre, al polisacárido, seguido de acoplamiento de una proteína al intermedio sacárido-ácido adípico/glutárico resultante. Otro tipo preferente de enlace es un engarce carbonilo, que puede formarse por reacción de un grupo hidroxilo libre de un polisacárido modificado con CDI (Bethell GS y col. (1979) J. Biol Chem 254, 2572-4 y Hearn MTW (1981). J. Chromatogr 218, 509-18); seguido de la reacción con una proteína para formar un enlace carbamato. Otros engarces incluyen p-propionamido (documento WO00/10599), nitrofenil-etilamina (Gever y col. (1979) Med Microbiol Immunol 165, 171-288), haluros de haloacilo (patente de los EE.UU. n.° 4.057.685), enlaces glicosídicos (patente de los EE.UU. n.° 4.673.574; 4.761.283; y 4.808.700), ácido 6-aminocaproico (patente de los EE.UU. n.° 4.459.286), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SpDP) (patente de los EE.UU n.° 5.204.098), dihidrazida del ácido adípico (ADH) (patente de los EE.u U n.° 4.965.338), restos C⁴a C¹²(patente de los EE.UU n.° 4.663.160), etc. También se puede usar la condensación de carbodiimida (documento WO2007/000343).

Se puede usar un engarce bifuncional para proporcionar un primer grupo para el acoplamiento a un grupo amina en el polisacárido (por ejemplo, introducido en el polisacárido por aminación) y un segundo grupo para el acoplamiento al portador (típicamente para el acoplamiento a una amina en el portador). Como alternativa, el primer grupo es capaz de acoplarse directamente al polisacárido, es decir, sin la introducción previa de un grupo, por ejemplo, un grupo amina, al polisacárido.

En algunas realizaciones, el primer grupo en el engarce bifuncional es capaz de reaccionar luego con un grupo amina (-NH2) en el polisacárido. Esta reacción implicará típicamente una sustitución electrófila del hidrógeno de la amina. En otras realizaciones, el primer grupo en el engarce bifuncional es capaz de reaccionar directamente con el polisacárido. En ambos conjuntos de realizaciones, el segundo grupo en el engarce bifuncional es típicamente capaz de reaccionar con un grupo amina en el polipéptido portador. Esta reacción implicará de nuevo típicamente una sustitución electrófila de la amina.

Cuando las reacciones con el polisacárido y la proteína portadora involucran aminas, entonces se prefiere usar un engarce bifuncional. Por ejemplo, se puede usar un engarce homobifuncional de fórmula XLX en la que: los dos grupos X son iguales entre sí y pueden reaccionar con las aminas; y en la que L es un resto enlazante en el engarce. De forma similar, se puede usar un engarce heterobifuncional de fórmula XLX, en la que: los dos grupos X son diferentes y pueden reaccionar con las aminas; y en la que L es un resto enlazante en el engarce. Un grupo X preferente es N-oxisuccinimida. L tiene preferentemente la fórmula L'-L2-L', en la que L' es carbonilo. Los grupos L2 preferentes son alquilos de cadena lineal con 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, C¹, C², C³, C⁴, C⁵, C6, C⁷, Ce, C⁹, C¹⁰) por ejemplo, -(CH²)⁴- o -(CH2)3-.

Otros grupos X para su uso en los engarces bifuncionales descritos en el párrafo anterior son aquellos que forman ésteres cuando se combinan con HO-L-OH, como norborano, ácido p-nitrobenzoico y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Otros engarces bifuncionales para su uso con la divulgación incluyen haluros de acriloilo (por ejemplo, cloruro) y haluros de haloacilo.

El engarce generalmente se añadirá en exceso molar al polisacárido durante el acoplamiento al polisacárido.

Los conjugados pueden tener exceso de portador (p/p) o exceso de polisacárido (p/p), por ejemplo, en el intervalo de relación de 1:5 a 5:1. Los conjugados con exceso de proteína portadora son típicos, por ejemplo, en el intervalo de 0,2:1 a 0,9:1, o pesos iguales. El conjugado puede incluir pequeñas cantidades de portador libre (es decir, no conjugado). Cuando una proteína portadora dada está presente tanto en forma libre como conjugada en una composición de la divulgación, la forma no conjugada es preferentemente no más del 5 % de la cantidad total de la proteína portadora en la composición en su totalidad, y más preferentemente está presente en menos del 2 % (en peso).

La composición también puede comprender proteína portadora libre como inmunógeno (documento WO96/40242). Después de la conjugación, los polisacáridos libres y conjugados se pueden separar. Hay muchos procedimientos adecuados, por ejemplo, cromatografía hidrófoba, ultrafiltración tangencial, diafiltración, etc. (véase también Lei y col. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264 y el documento WO00/38711). Se prefiere la ultrafiltración de flujo tangencial.

El resto polisacárido en el conjugado es preferentemente un polisacárido de bajo peso molecular, como se define a continuación (véase la sección sobre glucanos). Los oligosacáridos típicamente se dimensionarán antes de la conjugación.

El conjugado proteína-polisacárido es preferentemente soluble en agua y/o en un tampón fisiológico.

Para algunos polisacáridos, la inmunogenicidad puede mejorarse si hay un espaciador entre el polisacárido y la proteína portadora. En este contexto, un "espaciador" es un resto que es más largo que un enlace covalente único. Este espaciador puede ser un engarce, como se describe anteriormente. Como alternativa, puede ser un resto unido covalentemente entre el polisacárido y un engarce. Típicamente, el resto se unirá covalentemente al polisacárido antes de acoplarlo al engarce o portador. Por ejemplo, el espaciador puede ser el resto Y, en el que Y comprende un alquilo de cadena lineal con 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo C¹, C², C³, C⁴, C⁵, Ce, C⁷, C8, C⁹, C¹⁰), típicamente 1 a 6 átomos de carbono (por ejemplo, C¹, C², C³, C⁴, C⁵, Ce). Los inventores han descubierto que un alquilo de cadena lineal con 6 átomos de carbono (es decir, (CH²)e) es particularmente adecuado, y puede proporcionar mayor inmunogenicidad que las cadenas más cortas (por ejemplo, -(CH²)²). Típicamente, Y se une al carbono anomérico del polisacárido, generalmente a través de un enlace -O-. Sin embargo, Y puede estar unido a otras partes del polisacárido y/o a través de otros enlaces. El otro extremo de Y está unido al engarce por cualquier enlace adecuado. Típicamente, Y termina con un grupo de aminas para facilitar el enlace a un engarce bifuncional como se describe anteriormente. En estas realizaciones, Y está, por lo tanto, unida al engarce mediante un enlace -NH-. En consecuencia, un conjugado con la siguiente estructura se contempla específicamente para su uso en la presente divulgación: en la que n 2 está en el intervalo de 2-60, por ejemplo, entre 10-50 o entre 2-40. Preferentemente, n 2 está en el intervalo de 25-30 u 11-19, por ejemplo, 13-17. Los inventores han descubierto que n 2 = 15 es adecuado. Y es como se describe anteriormente.

En un aspecto, la divulgación proporciona un procedimiento para fabricar un polisacárido conjugado con una proteína portadora, en el que la etapa de conjugación se lleva a cabo en un tampón fosfato con fosfato > 10 mM; y a un conjugado obtenido por este procedimiento. Los inventores han descubierto que el fosfato de sodio es una forma adecuada de fosfato para el tampón. El pH del tampón se puede ajustar entre 7,0-7,5, en particular, 7,2. La etapa de conjugación se lleva a cabo típicamente en un tampón de fosfato con fosfato entre 20-200 mM, por ejemplo, 50-150 mM. En particular, los inventores han descubierto que un tampón fosfato con fosfato 90-110 mM, por ejemplo, aproximadamente 100 mM, es adecuado. La etapa de conjugación se lleva a cabo generalmente a temperatura ambiente. De forma similar, la etapa de conjugación se lleva a cabo generalmente a presión ambiente. Típicamente, el polisacárido se une a un engarce como se describe anteriormente antes de la etapa de conjugación. En particular, el polisacárido puede unirse a un engarce bifuncional como se describe anteriormente. El extremo libre del engarce puede comprender un grupo para facilitar la conjugación con la proteína portadora. Por ejemplo, los inventores han descubierto que el extremo libre del engarce puede comprender un grupo éster, por ejemplo, un grupo éster N-hidroxisuccinimida.

Los conjugados de polisacáridos desvelados en el presente documento pueden incluir además un portador farmacéuticamente aceptable.

Los conjugados de polisacáridos desvelados en el presente documento pueden incluir además un adyuvante. El adyuvante puede comprender uno o más de los adyuvantes descritos a continuación.

Los conjugados de polisacáridos también pueden usarse en procedimientos para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero (o ave), que comprende administrar al mamífero (o ave) una composición de la divulgación.

Inmunógenos polisacáridos

Cualquier polisacárido capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un mamífero o un ave (ya sea solo o conjugado con una proteína portadora) puede usarse en los conjugados de polisacáridos como se desvela en el presente documento (es decir, un inmunógeno polisacárido). Preferentemente, el polisacárido es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un patógeno de interés. El polisacárido puede ser ramificado o lineal.

Se pueden usar polisacáridos de bajo peso molecular, particularmente aquellos con un peso molecular de menos de 100 kDa (por ejemplo, menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20 o 15 kDa). También es posible usar oligosacáridos que contengan, por ejemplo, 60 o menos (por ejemplo, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51,50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4) unidades de monosacáridos. Dentro de este intervalo, se prefieren los oligosacáridos con entre 10 y 50 o entre 20 y 40 unidades de monosacáridos.

Los inmunógenos polisacáridos ejemplares se detallan a continuación.

Polisacáridos de glucano: Los glucanos son polisacáridos que contienen glucosa y se encuentran, entre otros patógenos, en las paredes celulares de los hongos. Los p-glucanos incluyen uno o más enlaces a entre las subunidades de glucosa, mientras que los p-glucanos incluyen uno o más enlaces p entre las subunidades de glucosa. El glucano usado de acuerdo con la divulgación incluye enlaces p, y puede contener solo enlaces p (es decir, sin enlaces a).

El glucano puede comprender uno o más enlaces p-1,3 y/o uno o más enlaces p-1,6. también puede comprender uno o más enlaces p-1,2 y/o enlaces p-1,4, pero normalmente sus únicos enlaces p serán enlaces p-1,3 y/o enlaces El glucano puede ser ramificado o lineal.

Los p-glucanos nativos de longitud completa son insolubles y tienen un peso molecular en el intervalo de megadalton. Se prefiere usar glucanos solubles en composiciones inmunogénicas de la divulgación. La solubilización se puede lograr mediante la fragmentación de glucanos insolubles largos. Esto se puede lograr por hidrólisis o, más oportunamente, por digestión con una glucanasa (por ejemplo, con una p-1,3-glucanasa o una p-I , 6-glucanasa). Como alternativa, los glucanos cortos se pueden preparar sintéticamente uniendo bloques de construcción de monosacáridos.

Se prefieren los glucanos de bajo peso molecular, particularmente aquellos con un peso molecular de menos de 100 kDa (por ejemplo, menos de 80, 70, 60, 50, 40, 30, 25, 20 o 15 kDa). También es posible usar oligosacáridos que contengan, por ejemplo, 60 o menos (por ejemplo, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51,50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, I I , 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4) unidades de monosacáridos de glucosa. Dentro de este intervalo, se prefieren los oligosacáridos con entre 10 y 50 o entre 20 y 40 unidades de monosacáridos.

El glucano puede ser un glucano fúngico. Generalmente un "glucano fúngico" se obtendrá a partir de un hongo pero, cuando se encuentra una estructura de glucano particular en hongos y no hongos (por ejemplo, en bacterias, plantas inferiores o algas), entonces el organismo no fúngico se puede usar como una fuente alternativa. Por lo tanto, el glucano se puede obtener de la pared celular de una Candida, tal como C. albicans, o de Coccidioides immitis, Trichophyton verrucosum, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Saccharomyces cerevisiae, Paracoccidioides brasiliensis, o Pythiumn insidiosum. Las fuentes ejemplares de pglucanos fúngicos se pueden encontrar en el documento WO2009/077854.

En algunas realizaciones, el glucano es un p-1,3 glucano con alguna ramificación p-1,6, como se ve, por ejemplo, en laminarinas. Las laminarinas se encuentran en algas pardas y algas marinas. Las relaciones p (1-3):p (1-6) de laminarinas varían entre diferentes fuentes, por ejemplo, la relación es tan baja como 3:2 en laminaria de Eisenia bicyclis, pero tan alta como 7:1 en laminaria de Laminaria digititata (Pang y col. (2005) Biosci Biotechnol Biochem 69:553-8). Por lo tanto, el glucano usado con la divulgación puede tener una relación p(1-3):p(1-6) de entre 1,5:1 y 7,5:1 (por ejemplo, aproximadamente 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 o 7:1). Opcionalmente, el glucano puede tener una subunidad de manitol terminal, por ejemplo, un resto de manitol con enlace 1,1-a (Read y col. (1996) Carbohydr Res.

281:187-201). El glucano también puede comprender subunidades de manosa.

En otras realizaciones, el glucano tiene enlaces exclusiva o principalmente de p-1,3, como se ve en la curdlana. Los inventores han descubierto que estos glucanos pueden ser más inmunogénicos que los glucanos que comprenden otros enlaces, en particular los glucanos que comprenden enlaces p-1,3 y una mayor proporción de enlaces p-1,6. Por lo tanto, el glucano puede estar compuesto únicamente por restos de glucosa con enlaces p-1,3 (por ejemplo, p-D-glucopiranasas lineales con exclusivamente enlaces 1,3). Opcionalmente, sin embargo, el glucano puede incluir restos de monosacáridos que no son restos de glucosa con enlaces p-1,3, por ejemplo, puede incluir restos de glucosa con enlaces p-1,6. La relación de los restos de glucosa con enlaces p-1,3 a estos otros restos debe ser al menos 8:1 (por ejemplo, > 9:1, > 10:1, > 11:1, >12:1, > 13:1, > 14:1, > 15:1, > 16:1, > 17:1, > 18:1, > 19:1, > 20:1, > 25:1, > 30:1, > 35:1, > 40:1, > 45:1, > 50:1, > 75:1, > 100:1, etc.) y/o hay una o más (por ejemplo, > 1, > 2, > 3, > 4, > 5, > 6, > 7, > 8, > 9, > 10, > 11, > 12, etc.) secuencias de al menos cinco (por ejemplo,> 5, > 6, > 7, > 8, > 9, > 10, > 11, > 12, > 13, > 14, > 15, > 16, > 17, > 18, > 19, > 20, > 30, > 40, > 50, > 60, etc.) restos adyacentes no terminales unidos a otros restos solo por enlaces p-1,3. Por "no terminal" se entiende que el resto no está presente en un extremo libre del glucano. En algunas realizaciones, los restos no terminales adyacentes pueden no incluir ningún resto conjugado con una molécula portadora, engarce u otro espaciador como se describe a continuación. Los inventores han descubierto que la presencia de cinco restos adyacentes no terminales unidos a otros restos solo por enlaces p-1,3 puede proporcionar una respuesta de anticuerpos protectora, por ejemplo, contra C. albicans.

En realizaciones adicionales, una composición puede incluir dos glucanos diferentes, por ejemplo, un primer glucano que tiene una relación p (1-3):p (1-6) de entre 1,5:1 y 7,5:1, y un segundo glucano que tiene exclusivamente o principalmente enlaces p-1,3. Por ejemplo, una composición puede incluir tanto un laminarina glucano como un curdlana glucano.

Los procedimientos ejemplares de preparación de p-glucanos se pueden encontrar en el documento WO2009/077854.

Laminarina y curdlana se encuentran típicamente en la naturaleza como polímeros de alto peso molecular, por ejemplo, con un peso molecular de al menos 100 kDa. A menudo son insolubles en medios acuosos. En sus formas naturales, por lo tanto, no son adecuadas para la inmunización. Por lo tanto, la divulgación puede usar un glucano más corto, por ejemplo, aquellos que contienen 60 o menos unidades de monosacáridos de glucosa (por ejemplo, 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4). Se puede usar un glucano que tiene un número de restos de glucosa en el intervalo de 2-60, por ejemplo, entre 10-50 unidades o entre 20-40 unidades de glucosa. Un glucano con 25-30 restos de glucosa es particularmente útil. Los glucanos adecuados pueden formarse, por ejemplo, por hidrólisis ácida de un glucano natural, o por digestión enzimática, por ejemplo, con una glucanasa, tal como una p-1,3-glucanasa. Un glucano con 11-19, por ejemplo, 13-19 y particularmente 15 o 17, unidades de monosacáridos de glucosa también son útiles. En particular, los glucanos con las siguientes estructuras (A) o (B) están específicamente contemplados para su uso en la presente divulgación:

en la que n 2 está en el intervalo de 2-60, por ejemplo, entre 10-50 o entre 2-40. Preferentemente, n 2 está en el intervalo de 25-30 u 11-19, por ejemplo, 13-17. Los inventores han descubierto que n 2 = 15 es adecuado.

en la que n está en el intervalo de 0-9, por ejemplo, entre 1-7 o entre 2-6. Preferentemente, n está en el intervalo de 3-4 u 1-3. Los inventores han descubierto que n = 2 es adecuado.

El glucano (como se define anteriormente) es preferentemente una especie molecular única. En esta realización, todas las moléculas de glucano son idénticas en términos de secuencia. En consecuencia, todas las moléculas de glucano son idénticas en términos de sus propiedades estructurales, incluido el peso molecular, etc. Típicamente, esta forma de glucano se obtiene por síntesis química, por ejemplo, usando los procedimientos descritos anteriormente. Por ejemplo, Jamois y col. (2005) Glycobiology 15 (4):393-407, describe la síntesis de una única especie con enlaces p-1,3. Como alternativa, en otras realizaciones, el glucano se puede obtener a partir de un glucano natural, por ejemplo, un glucano de L. digitata, Agrobacterium o Euglena como se describe anteriormente, con el glucano purificado hasta que se obtenga la especie molecular única requerida. Los glucanos naturales que se han purificado de esta manera están disponibles en el mercado. Un glucano que es una sola especie molecular puede identificarse midiendo la polidispersidad (Mp/Mn) de la muestra de glucano. Este parámetro puede medirse oportunamente por SEC-MALLS, por ejemplo, como se describe en Bardotti y col. (2008) Vaccine 26:2284-96. Los glucanos adecuados para su uso en esta realización de la divulgación tienen una polidispersidad de aproximadamente 1, por ejemplo, 1,01 o menos.

La solubilidad de los glucanos naturales, como la curdlana, se puede aumentar introduciendo grupos iónicos (por ejemplo, mediante sulfatación, particularmente en O-6 en la curdlana). Dichas modificaciones pueden usarse con la divulgación, pero se evitan idealmente ya que pueden alterarla antigenicidad del glucano.

Cuando los glucanos se aíslan de fuentes naturales, pueden aislarse en combinación con contaminantes. Por ejemplo, los inventores han descubierto que los glucanos pueden estar contaminados con florotanina, que es identificable por espectroscopía ultravioleta-visible (UV/VIS). Este problema es particularmente común cuando el glucano se aísla de un alga parda o de algas marinas. Por ejemplo, el espectro UV de una laminarina disponible en el mercado extraída de Laminaria digitata incluye un pico de absorción resultante de la presencia de contaminación con florotanina. De forma similar, los glucanos extraídos de Artie laminarialis, Saccorhiza dermatodea y Alaria esculenta tienen espectros UV que incluyen un pico de absorción resultante de la contaminación con florotanina.

La presencia de florotanina en una muestra de glucano puede afectar las propiedades biológicas del glucano. En consecuencia, puede ser deseable eliminar la florotanina de la muestra, especialmente cuando el glucano es para uso médico en numerosos aspectos de la presente divulgación. Los procedimientos ejemplares de eliminación de pglucanos se pueden encontrar en el documento WO2009/077854.

N. meningitidis: En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas pueden incluir sacáridos capsulares de al menos dos de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis. En otras realizaciones, dichas composiciones comprenden además un antígeno de uno o más de los siguientes: (a) N. meningitidis; (b) Haemophilus influenzae tipo B; Staphylococcus aureus, Streptococcus de los grupos A y B, E. coli patógena y/o (c) Streptococcus pneumoniae.

En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de H. influenzae tipo B y los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de H. influenzae tipo B y los serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de S. pneumoniae y los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de S. pneumoniae y los serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de H. influenzae tipo B, S. pneumoniae y los serogrupos C, W135 e Y de N. meningitidis. En determinadas realizaciones, las composiciones conjugadas incluyen polisacáridos capsulares de H. influenzae tipo B, S. pneumoniae y los serogrupos A, C, W135 e Y de N. meningitidis.

Streptococcus pneumoniae: los conjugados de polisacáridos de Streptococcus pneumoniae pueden incluir un sacárido (incluido un polisacárido u oligosacárido) y opcionalmente una o más proteínas de Streptococcus pneumoniae. Los antígenos sacáridos pueden seleccionarse de entre los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6 B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, HA, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F y 33F. Los antígenos de proteínas opcionales se pueden seleccionar de una proteína identificada en los documentos WO98/18931 y WO98/18930, la patente de los EE.UU. n.° 6.699.703, la patente de los EE.UU. n.° 6.800.744, y los documentos WO97/43303 y WO97/37026. Las proteínas de Streptococcus pneumoniae pueden seleccionarse entre la familia de la tríada de polihistidina (PhtX), la familia de proteínas de unión a colina (CbpX), truncados de CbpX, familia de LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado CbpX-truncado LytX, neumolisina (Ply), PspA, PsaA, Sp128, SpIOl, Sp130, Sp125 o Sp133.

Staphylococcus aureus: los conjugados de polisacáridos de Staphylococcus aureus pueden incluir 5, 8 y 336 polisacáridos capsulares de tipo S. aureus y sus fragmentos y, opcionalmente, antígenos proteicos procedentes de proteínas de superficie, invasinas (leucocidina, cinasas, hialuronidasa), factores de superficie que inhiben el atrapamiento fagocítico (cápsula, proteína A), carotenoides, producción de catalasa, proteína A, coagulasa, factor de coagulación y/o toxinas que dañan la membrana (opcionalmente desintoxicadas) que lisan las membranas celulares eucariotas (hemolisinas, leucotoxinas, leucocidinas). Los procedimientos de despolimerización ejemplares para generar fragmentos de polisacáridos capsulares de S. aureus se pueden encontrar en el documento U.S. Ser. n.° 61/247.518, titulado "Conjugation of Staphylococcus Aureus Type 5 and Type 8 Capsular Polysaccharides", presentada el 30 de septiembre de 2009, de la página 5, línea 6 a la página 6, línea 23, que se incorpora en el presente documento por referencia para su enseñanza de dichas técnicas de despolimerización.

Haemophilus influenzae B (Hib): los conjugados de polisacáridos Hib pueden incluir antígenos sacáridos Hib. Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B): los conjugados de polisacáridos de Sstreptococcus del grupo B pueden incluir antígenos sacáridos procedentes de los serotipos la, Ib, la/c, II, III, IV, V, VI, Vil y VIII como se identifica en el documento WO04/041157 y opcionalmente uno o más antígenos proteicos, incluyendo, sin limitación, los identificados en los documentos WO02/34771, WO03/093306, WO04/041157 o WO05/002619 (incluyendo a modo de ejemplo las proteínas GBS 80, GBS 104, GBS 276 y GBS 322).

Vibrio cholerae: los conjugados de polisacáridos de V. cholerae pueden incluir LPS, en particular lipopolisacáridos de Vibrio cholerae II, polisacáridos específicos de O1 Inaba O.

Salmonella typhi (fiebre tifoidea): los conjugados de polisacáridos pueden incluir polisacáridos capsulares como Vi. Polipéptidos portadores

Se probaron varios antígenos prometedores de E. coli para determinar su eficacia como polipéptidos portadores. Uno de dichos antígenos se anota como proteína de dominio similar a Ig bacteriana (grupo 1) (también como 'orf405', SEQ ID 809 y 810 en la referencia 1), que también se conoce como: 'orf284' de la cepa E. coli NMEC IHE3034, 'c0415' de la cepa E. coli CFT073 y ecp_0367 de la cepa E. coli 536. Otro antígeno más de este tipo se anota como proteína antígeno 43 de la gripe (también como 'orf1364', SEQ ID 2727 y 2728 en la referencia 1), que también se conoce como: Orf1109 'de la cepa E. coli NMEC IHE3034, 'c1273' de la cepa E. coli CFT073 y ecp_3009 de la cepa E. coli 536. Otro antígeno más de este tipo se anota como proteína precursora del factor de colonización accesorio D (AcfD) (también como 'orf3526', SEQ ID 7051 y 7052 en la referencia 1), que también se conoce como: 'ECP_3050' de la cepa E. coli UPEC 536, 'yghJ' de la cepa E. coli W3110 comensal, 'EcE24377A_3432' de la cepa E. coli ETEC E24377A y 'EcHS_A3142' de la cepa E. coli HS comensal. Otro antígeno más de este tipo se anota como proteína Fimbrial (también como 'orf3613', SEQ ID 7225 y 7226 en la referencia 1), que también se conoce como: 'orf3431' de la cepa E. coli NMEC IHE3034 y 'c3791' de la cepa E. coli CFT073. Otro antígeno más de este tipo se anota como una proteína de venta que contiene repeticiones (también como 'upec-5211', desvelada en la referencia 2 SEQ ID 577) también se conoce como: 'c5321' de CFT073; 'ECED1_5081' de ED1a y 'EFER_4303' de E. fergusonii ATCC 35469. En particular, se demostró que el precursor AcfD (orf3526), la proteína antígeno 43 de la gripe (orf1364) y la proteína de venta que contiene repeticiones (upec-5211) son conjugables, solubles como conjugados y eficaces en la mejora de la respuesta inmunitaria al polisacárido conjugado.

De acuerdo con la invención, el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), o formas de la misma que comprenden una mutación y/o una eliminación como se define en las reivindicaciones. Los polipéptidos portadores usados con la divulgación pueden tomar varias formas (por ejemplo, nativas, fusiones, glicosiladas, no glicosiladas, lipidadas, no lipidadas, fosforiladas, no fosforiladas, miristoiladas, no miristoiladas, monoméricas, multiméricas, particuladas, desnaturalizadas, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de la divulgación puede tener una cisteína N-terminal lipidada.

Los polipéptidos portadores usados con la divulgación pueden prepararse por diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación a partir de cultivo celular, síntesis química, etc.). Se prefieren las proteínas expresadas recombinantemente.

Los polipéptidos portadores usados con la divulgación se proporcionan preferentemente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente libres de otros polipéptidos (por ejemplo, libres de polipéptidos de origen natural), particularmente de otros polipéptidos de células huésped o de E. coli, y generalmente son al menos aproximadamente 50 % puros (en peso), y generalmente al menos aproximadamente 90 % puros, es decir, menos de aproximadamente 50 %, y más preferentemente menos de aproximadamente 10 % (por ejemplo, 5 %) de una composición se compone de otros polipéptidos expresados. Por lo tanto, los antígenos en las composiciones se separan del organismo completo con el que se expresa la molécula. Para evitar dudas, cuando se usa una proteína purificada o sustancialmente portadora conjugada con un polisacárido como componente de una vacuna, la proteína portadora todavía está "purificada" o "sustancialmente purificada" a pesar de la presencia de otros antígenos proteicos y componentes celulares (por ejemplo, otros polisacáridos, vesículas de membrana externa, etc.).

Los polipéptidos portadores usados con la divulgación son preferentemente polipéptidos de E. coli. Dichos polipéptidos pueden seleccionarse adicionalmente de polipéptidos de E. coli NMEC, APEC, UPEC, EAEC, EIEC, EPEC y ETEC.

El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado de forma natural o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, como la conjugación con un componente de marcaje. También se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden aparecer como cadenas simples o cadenas asociadas.

La divulgación también incluye polipéptidos portadores que comprenden una secuencia -PQ- o -QP-, en la que: -P-es una secuencia de aminoácidos como se define anteriormente y -Q- no es una secuencia como se define anteriormente, es decir, la divulgación proporciona proteínas de fusión. Cuando el codón del extremo N de -P- no es ATG, pero este codón no está presente en el extremo N de un polipéptido, se traducirá como el aminoácido convencional para ese codón en lugar de como un Met. Sin embargo, cuando este codón se encuentre en el extremo N de un polipéptido, se traducirá como Met. Ejemplos de restos -Q-, incluyen, pero sin limitación, etiquetas de histidina (es decir, Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), una proteína de unión a maltosa, o glutatión-S-transferasa (GST).

La divulgación también incluye proteínas oligoméricas que comprenden un polipéptido portador de la divulgación. El oligómero puede ser un dímero, un trímero, un tetrámero, etc. El oligómero puede ser un homo-oligómero o un hetero-oligómero. Los polipéptidos en el oligómero pueden estar asociados covalentemente o no covalentemente. La comparación de la respuesta inmunitaria generada en un sujeto por el polipéptido portador con la respuesta inmunitaria generada por la proteína de longitud completa puede llevarse a cabo por cualquier medio disponible para un experto en la técnica. Un procedimiento simple, como se usa en los ejemplos a continuación, implica la inmunización de un sujeto modelo, como el ratón, y luego el desafío con una dosis letal de E. coli.

Para una comparación adecuada, un experto en la técnica seleccionará naturalmente el mismo adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund. En una prueba de este tipo, los fragmentos de polipéptidos portadores de la presente divulgación generarán una respuesta inmunitaria sustancialmente similar en un sujeto (es decir, proporcionarán sustancialmente la misma protección contra el desafío letal) si, por ejemplo, el polipéptido proporciona al menos el 70 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 80 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 85 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 90 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 95 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, al menos el 97 % de la protección proporcionada por la proteína completa proteína de longitud, al menos el 98 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa, o al menos el 99 % de la protección proporcionada por la proteína de longitud completa.

La divulgación también proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la divulgación, que comprende la etapa de cultivar una célula huésped transformada con ácido nucleico de la divulgación en condiciones que inducen la expresión del polipéptido. El polipéptido puede entonces purificarse, por ejemplo, a partir de sobrenadantes de cultivo.

La divulgación proporciona una célula de E. coli, que contiene un plásmido que codifica un polipéptido portador de la divulgación. El cromosoma de la célula de E. coli puede incluir un homólogo del polipéptido portador, o dicho homólogo puede estar ausente, pero en ambos casos el polipéptido de la divulgación puede expresarse a partir del plásmido. El plásmido puede incluir un gen que codifica un marcador, etc. Estos y otros detalles de plásmidos adecuados se dan a continuación.

Aunque la expresión de los polipéptidos portadores de la divulgación puede tener lugar en una cepa de E. coli, la divulgación generalmente usará un huésped heterólogo para la expresión. El huésped heterólogo puede ser procariótico (por ejemplo, una bacteria) o eucariótico. Los huéspedes adecuados incluyen, pero sin limitación, Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc.

La divulgación proporciona un procedimiento para producir un polipéptido portador de la divulgación, que comprende la etapa de sintetizar al menos parte del polipéptido por medios químicos.

Cualquiera y todas las proteínas, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos anteriores pueden estar en cualquiera de varias formas que incluyen, sin limitación, recombinantes, aisladas o sustancialmente purificadas (de materiales que coexisten con dichas proteínas, polipéptidos, polipéptidos híbridos, epítopos y fragmentos inmunogénicos en su estado natural).

Polipéptido 0rf1364

La proteína antígeno 43 de la gripe se denomina en el presente documento 'orf1364'. El polipéptido 'orf1364' de E. coli NMEC se desvela en la referencia 1 (SEQ ID 2727 y 2728) también se conoce como: 'orf1109' de la cepa E. coli NMEC IHE3034, 'c1273' de CFT073 y 'ecp_3009' de 536.

Cuando se usa de acuerdo con la presente divulgación, el polipéptido orf1364 puede tomar diversas formas. Las secuencias orf1364 prefentes tienen una identidad del 50 % o más (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 87,5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO 1 22. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes, etc. Como alternativa, las secuencias orf1364 cuando se alinean con cualquiera de las SEQ ID NO 1-22 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C (tal como para una alineación que se extiende a los aminoácidos p, en la que p > x, hay p-x 1 de dichas ventanas) tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que: x se selecciona de entre 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de entre 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x • y no es un número entero, entonces se redondea al número entero más cercano.

El algoritmo de alineación por pares preferente es el algoritmo de alineación global de Needleman-Wunsch (3), que usa parámetros predeterminados (por ejemplo, con penalización de apertura de hueco = 10,0 y con penalización de extensión de hueco = 0,5, usando la matriz de puntuación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa oportunamente en la herramienta de aguja en el paquete EMBOSS (4).

Las secuencias de polipéptidos Orf1364 pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (eliminaciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación con las SEQ ID NO 1-22.

Las secuencias de polipéptidos Orf1364, en comparación con cualquiera de las SEQ ID NO 1-22, pueden incluir una o más (por ejemplo,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica.

Las secuencias de polipéptidos Orf1364 pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) eliminaciones de aminoácidos individuales en relación con cualquiera de las SEQ ID NO 1-22. De forma similar, un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con cualquiera de las SEQ ID NO 1-22.

Otras secuencias de orf1364 preferentes comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 1 22, en las que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf1364. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 52 o más) desde el extremo C y/o el extremo N de las SEQ ID NO 1-22. Un fragmento ejemplar se indica con # debajo de la alineación a continuación. El fragmento ejemplar puede comprender menos de 950 aminoácidos, menos de 900 aminoácidos, menos de 850 aminoácidos, menos de 800 aminoácidos, menos de 750 aminoácidos, menos de 700 aminoácidos, menos de 650 aminoácidos, menos de 600 aminoácidos, menos de 550 aminoácidos, menos de 500 aminoácidos, menos de 450 aminoácidos, menos de 440 aminoácidos o menos de 430 aminoácidos de la proteína antígeno 43 de la gripe (orf1364). Además, el fragmento ejemplar puede no comprender al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido), al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido), o al menos los primeros 52 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD (orf3526) de E. coli. Finalmente, el fragmento ejemplar puede no comprender al menos los últimos 50 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (polipéptido orf1364), al menos los últimos 250 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido), al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido), al menos los últimos 325 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido), o al menos los últimos 328 aminoácidos C-terminales en comparación con la proteína antígeno 43 de la gripe de E. coli (orf1364 polipéptido).

Cepa E110019 (SEQ ID NO:1)

Grupo A: cepa Sakai, EDL933, EC508, EC869, EC4024, EC4042, EC4045, EC4076, EC4113, EC4115, EC4196, EC4206, EC4401, EC4486, EC4501 y TW14588 (SEQ ID NO: 2)

cepa B171 (SEQ ID NO: 3)

cepa E22 (SEQ ID NO: 4)

cepa B171 (SEQ ID NO: 5)

cepa B171 (SEQ ID NO: 6)

cepa E24377A y O42 (SEQ ID NO: 7)

cepa E24377A (SEQ ID NO: 8)

Grupo B: cepa UTI89, RS218 y IHE3034 (SEQ ID NO: 9)

cepa E110019 (SEQ ID NO: 10)

cepa E22 (SEQ ID NO: 11)

cepa H10407 (SEQ ID NO: 12)

cepa F11 y 536 (SEQ ID NO: 13)

cepa SECEC (SEQ ID NO: 14)

cepa H10407 (SEQ ID NO: 15)

cepa W3110 y DH10B (SEQ ID NO: 16)

cepa MG1655 (SEQ ID NO: 17)

cepa O42 (SEQ ID NO: 18)

cepa B7A (SEQ ID NO: 19)

cepa CFT073 (SEQ ID NO: 20)

cepa O42 (SEQ ID NO: 21)

cepa CFT073 (SEQ ID NO: 22)

1 50

Polipéptido Upec-5211

La proteína de venta que contienen repeticiones se denomina en el presente documento 'upec-5211'. El polipéptido 'upec-5211' de E. coli también se conoce como: 'c5321' de CFT073; 'ECED1_5081' de ED1a y 'EEK_4303' de E. fergusonii ATCC 35469.

Cuando se usa de acuerdo con la presente divulgación, el polipéptido upec-5211 puede tomar diversas formas. Las secuencias upec-5211 preferentes tienen una identidad del 50 % o más (por ejemplo, 60%, 65%, 70%, 75%, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con las SEQ ID NO 23-25. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes etc).

Como alternativa, las secuencias upec-5211 cuando se alinean con cualquiera de las SEQ ID NO 23-25 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C (tal como para una alineación que se extiende a los aminoácidos p, en la que p > x, hay p-x 1 de dichas ventanas) tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que: x se selecciona de entre 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de entre 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x • y no es un número entero, entonces se redondea al número entero más cercano.

Las secuencias de polipéptidos Upec-5211 pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (eliminaciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación con las SEQ ID NO 23-25.

Las secuencias de polipéptidos Upec-5211, en comparación con cualquiera de las SEQ ID NO 23-25, pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica.

Las secuencias de polipéptidos Upec-5211 pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) eliminaciones de aminoácidos individuales en relación con cualquiera de las SEQ ID NO 23-25. De forma similar, un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con cualquiera de las SEQ ID NO 23-25.

Otras secuencias de upec-5211 preferentes comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NO 23-25, en las que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de upec-5211. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde el extremo C y/o el extremo N de las SEQ ID NO 23-25.

Cepas CFT073 y 83972 (SEQ ID NO: 23)

Cepa ED1a (SEQ ID NO: 24)

Escherichia fergusonii ATCC 35469 (SEQ ID NO: 25)

Polipéptido Orf3526

La proteína precursora del factor de colonización accesorio D (AcfD) se denomina en el presente documento "orf3526". El polipéptido 'orf3526' E. coli NMEC se desvela en la referencia 1 (SEQ ID NO: 7051 y 7052) también se conoce como: 'eCp_3050' de la cepa E. coli UPEC 536, 'yghJ' de la cepa E. coli W3110 comensal, 'EcE24377A_3432' de la cepa E. coli ETEC E24377A y 'EcHS_A3142' de la cepa E. coli HS comensal.

Cuando se usa de acuerdo con la presente divulgación, el polipéptido orf3526 puede tomar diversas formas. Las secuencias orf3526 preferentes tienen una identidad del 50 % o más (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 87,5 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con las SEQ ID NO 26 40. Esto incluye variantes (por ejemplo, variantes alélicas, homólogos, ortólogos, parálogos, mutantes etc).

Las formas de orf3526 para su uso de acuerdo con la invención son las definidas en las reivindicaciones. Como alternativa, las secuencias orf3526 cuando se alinean con cualquiera de las SEQ ID NO 26-40 usando un algoritmo de alineación por pares, cada ventana móvil de x aminoácidos desde el extremo N al extremo C (tal como para una alineación que se extiende a los aminoácidos p, en la que p > x, hay p-x 1 de dichas ventanas) tiene al menos x • y aminoácidos alineados idénticos, en la que: x se selecciona de entre 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de entre 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x • y no es un número entero, entonces se redondea al número entero más cercano.

Las secuencias de polipéptidos Orf3526 pueden tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (eliminaciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en ubicaciones separadas o pueden ser contiguas, en comparación con las SEQ ID NO 26-40.

Las secuencias de polipéptidos Orf3526, en comparación con cualquiera de las SEQ ID NO 26-40, pueden incluir una o más (por ejemplo,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) sustituciones de aminoácidos, tales como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido con otro que tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares sin carga, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante en la actividad biológica.

Las secuencias de polipéptidos Orf3526 pueden incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) eliminaciones de aminoácidos individuales en relación con cualquiera de las SEQ ID NO 26-40. De forma similar, un polipéptido puede incluir una o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) en relación con cualquiera de las SEQ ID NO 26-40.

Otras secuencias de orf3526 preferentes comprenden al menos n aminoácidos consecutivos de las SEQ ID NOs 26 40, en las que n es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Los fragmentos preferentes comprenden un epítopo o fragmento inmunogénico de orf3526. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) desde el extremo C y/o el extremo N de las SEQ ID NO 26-40. La extensión de la región gly-ser se indica con "G" debajo de la alineación a continuación. La extensión de la repetición rica en prolina N-terminal se indica con "P" debajo de la alineación a continuación. Tres fragmentos preferentes indicados orf3526A, orf3526B, y orf3526C se indican por 'A', 'B' o 'C', respectivamente debajo de la alineación.

Cepa EAEC 101-1 (IG: 83587587) (SEQ ID NO: 26)

cepa UPEC 536 (IG: 110643204) (SEQ ID NO: 27)

cepa AEC O42 (SEQ ID NO: 28)

cepa EPEC E2348/69 (SEQ ID NO: 29)

cepa EIEC 53638 (IG: 75515237) (SEQ ID NO: 30)

cepa comensal W3110 (IG: 89109748) (SEQ ID NO: 31)

cepa ETEC B7A (IG: 75227618) (SEQ ID NO: 32)

cepa EPEC E22 (IG: 75259912) (SEQ ID NO: 33)

cepa ETEC E24377A (IG: 157156747) (SEQ ID NO: 34)

cepa ETEC H10407 (SEQ ID NO: 35)

cepa EPEC E110019 (IG: 75239450) (SEQ ID NO: 36)

cepa comensal HS (IG: 157162442) (SEQ ID NO: 37)

cepa resistente a antibióticos SECEC (SEQ ID NO: 38)

cepa NMEC IHE3034 (SEQ ID NO: 39)

cepa UPEC F11 (IG: 75241179) (SEQ ID NO: 40)

En determinadas realizaciones, el polipéptido portador que comprende un polipéptido AcfD de E. col/(orf3526) tendrá una mutación relaiva a la proteína AcfD de E. col/ (orf3526) que disminuye la toxicidad del polipéptido portador en comparación con la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), como se define en las reivindicaciones. Las mutaciones ejemplares que disminuyen la toxicidad incluyen una eliminación de todo o una parte del dominio de la metaloproteasa de cincina y una mutación puntual en el dominio de metaloproteasa de cincina que reduce la actividad de la proteasa. En determinados casos, la mutación puntual es una mutación de un resto de unión a cinc o una mutación de un resto catalítico. Una mutación puntual preferente es la sustitución del número de aminoácido 1305 basado en la alineación con la SEQ ID NO:39.

Las eliminaciones ejemplares tales como para orf3526A incluyen la eliminación de al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 300 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 400 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 500 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 600 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 700 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 750 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), o al menos los últimos 758 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), o tal como para orf3526B no comprende al menos los primeros 100 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 200 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 300 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 400 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 500 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 600 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 700 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los primeros 750 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), o al menos los primeros 760 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526).

Los fragmentos ejemplares tales como orf3526C no comprenden al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), o al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. col/ (orf3526), y opcionalmente no comprende al menos los primeros 10 aminoácidos N terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526).

Los polipéptidos portadores anteriores pueden contener además una eliminación relativa a la proteína AcfD de E. coli (orf3526) que aumenta la solubilidad del polipéptido portador en comparación con la proteína AcfD de E. coli de longitud completa (orf3526) como se define en las reivindicaciones, mientras que el polipéptido portador todavía genera una respuesta inmunitaria sustancialmente similar al polisacárido conjugado en un sujeto como la proteína AcfD de E. coli (orf3526) de longitud completa.

Las eliminaciones ejemplares que aumentan la solubilidad incluyen la eliminación de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta la región del gl-ser, la eliminación de todo o parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambas. Además, la eliminación puede incluir la eliminación de al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526).

Además de mejorar la solubilidad y disminuir la toxicidad, las eliminaciones son más fáciles de purificar después de la expresión en cepas de E. coli comensales que tienen una proteína AcfD endógena (orf3526).

Composiciones inmunogénicas y medicamentos

Los conjugados de polisacáridos de la divulgación son útiles como principios activos (inmunógenos) en composiciones inmunogénicas, y dichas composiciones pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas de acuerdo con la divulgación pueden ser profilácticas (es decir, para evitar la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero típicamente serán profilácticas.

Las composiciones inmunogénicas serán farmacéuticamente aceptables. Por lo general, incluirán componentes además de los antígenos; por ejemplo, típicamente incluyen uno o más portadores farmacéuticos, excipientes y/o adyuvantes. Un análisis detallado de portadores y excipientes está disponible en la ref. 100. Los análisis exhaustivos sobre los adyuvantes de vacunas están disponibles en las refs. 5 y 6.

Las composiciones generalmente se administrarán a un mamífero en forma acuosa. Antes de la administración, sin embargo, la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, luego se llenan, se distribuyen y se administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento de su uso. Por lo tanto, una composición de la divulgación puede secarse, tal como una formulación liofilizada.

La composición puede incluir conservantes tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo se prefiere que la vacuna esté sustancialmente libre de material mercurial (es decir, menos de 5 pg/ml), por ejemplo, libre de tiomersal. Las vacunas que no contienen mercurio son más preferentes. Las vacunas sin conservantes son particularmente preferentes.

Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura.

Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), que puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente 10 ± 2 mg/ml de NaCl. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrógeno fosfato de potasio, fosfato de disodio deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.

Las composiciones generalmente tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente entre 240-360 mOsm/kg, y más preferentemente pertenecerán al intervalo de 290-310 mOsm/kg.

Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM.

El pH de una composición estará generalmente entre 5,0 y 8,1, y más típicamente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.

La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirogénica, por ejemplo, contiene <1 UE (unidad de endotoxinas, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 UE por dosis. La composición está preferentemente libre de gluten.

La composición puede incluir material para una única inmunización, o puede incluir material para múltiples inmunizaciones (es decir, un kit "multidosis"). La inclusión de un conservante se prefiere en arreglos multidosis. Como una alternativa (o además) de incluir un conservante en composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tiene un adaptador aséptico para la eliminación de material.

Las vacunas para humanos se administran típicamente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque se puede administrar una media dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml) a los niños.

Las composiciones inmunogénicas de la divulgación también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante TH1 y/o un adyuvante TH2, como se analiza a continuación.

Los adyuvantes que se pueden usar en las composiciones de la divulgación incluyen, pero sin limitación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio (o mezclas de las mismas). Las sales de calcio incluyen fosfato de calcio (por ejemplo, las partículas "CAP" descritas en la ref. 7). Las sales de aluminio incluyen hidróxidos, fosfatos, sulfatos, etc., tomando las sales cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.). Se prefiere la adsorción a estas sales. Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica (8).

Se pueden usar los adyuvantes conocidos como hidróxido de aluminio y fosfato de aluminio. Estos nombres son convencionales, pero se usan solo por conveniencia, ya que tampoco es una descripción precisa del compuesto químico real que está presente (por ejemplo, véase el capítulo 9 de la referencia 5). La divulgación puede usar cualquiera de los adyuvantes "hidróxido" o "fosfato" que se usan en general como adyuvantes. Los adyuvantes conocidos como "hidróxido de aluminio" son típicamente sales de oxihidróxido de aluminio, que generalmente son al menos parcialmente cristalinas. Los adyuvantes conocidos como "fosfato de aluminio" son típicamente hidroxifosfatos de aluminio, que a menudo también contienen una pequeña cantidad de sulfato (es decir, sulfato de hidroxifosfato de aluminio). Pueden obtenerse por precipitación, y las condiciones de reacción y las concentraciones durante la precipitación influyen en el grado de sustitución de fosfato por hidroxilo en la sal.

Una morfología fibrosa (por ejemplo, como se observa en micrografías electrónicas de transmisión) es típica de los adyuvantes de hidróxido de aluminio. El pH de los adyuvantes de hidróxido de aluminio es típicamente aproximadamentede 11, es decir, el propio adyuvante tiene una carga superficial positiva a pH fisiológico. Se han indicado capacidades de adsorción de entre 1,8-2,6 mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para los adyuvantes de hidróxido de aluminio.

Los adyuvantes de fosfato de aluminio tienen en general una relación molar de PO^Al de entre 0,3 y 1,2, preferentemente entre 0,8 y 1,2, y más preferentemente 0,95 ± 0,1. El fosfato de aluminio será generalmente amorfo, particularmente para sales de hidroxifosfato. Un adyuvante típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO^Al de entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg Al3+/ml. El fosfato de aluminio generalmente será en partículas (por ejemplo, morfología de tipo placa como se observa en las micrografías electrónicas de transmisión). Los diámetros típicos de las partículas están en el intervalo de 0,5-20 pm (por ejemplo, aproximadamente 5-10 pm) después de cualquier adsorción de antígeno. Se han indicado capacidades de adsorción de entre 0,7-1,5mg de proteína por mg de Al+++ a pH 7,4 para los adyuvantes de fosfato de aluminio.

El punto de carga cero (PZC) del fosfato de aluminio está inversamente relacionado con el grado de sustitución del fosfato por el hidroxilo, y este grado de sustitución puede variar según las condiciones de reacción y la concentración de los reactivos usados para preparar la sal por precipitación. El PZC también se altera cambiando la concentración de iones de fosfato libres en la solución (más fosfato = más PZC ácido) o añadiendo un tampón como un tampón de histidina (hace que el PZC sea más básico). Los fosfatos de aluminio usados de acuerdo con la divulgación tendrán generalmente un PZC de entre 4,0 y 7,0, más preferentemente entre 5,0 y 6,5, por ejemplo, aproximadamente 5,7. Las suspensiones de sales de aluminio usadas para preparar las composiciones de la divulgación pueden contener un tampón (por ejemplo, un fosfato o una histidina o un tampón Tris), pero esto no siempre es necesario. Las suspensiones son preferentemente estériles y libres de pirógenos. Una suspensión puede incluir iones fosfato acuoso libres, por ejemplo, presentes en una concentración entre 1,0 y 20 mM, preferentemente entre 5 y 15 mM, y más preferentemente aproximadamente de 10 mM. Las suspensiones también pueden comprender cloruro de sodio. La divulgación puede usar una mezcla de un hidróxido de aluminio y un fosfato de aluminio. En este caso, puede haber más fosfato de aluminio que hidróxido, por ejemplo, una relación en peso de al menos 2:1, por ejemplo, >5:1, >6:1, >7:1, >8:1, >9:1, etc.

La concentración de Al+++ en una composición para la administración a un paciente es preferentemente inferior a 10 mg/ml, por ejemplo, > 5 mg/ml, >4 mg/ml, >3 mg/ml, >2 mg/ml, >1 mg/ml, etc. Un intervalo preferente es entre 0,3 y 1 mg/ml. Se prefiere un máximo de 0,85 mg/dosis.

B. Emulsiones de aceite

Las composiciones de emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59™ (capítulo 10 de la ref. 5; véase también la ref. 9) (5 % de escualeno, 0,5 % TWEEN 80™) y 0,5 % SPAN 85™, formulado en partículas submicrónicas usando un microfluidizador). También se puede usar el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA).

Se conocen diversos adyuvantes de emulsión de aceite en agua, y típicamente incluyen al menos un aceite y al menos un tensioactivo, siendo el aceite o los aceites y el tensioactivo o los tensioactivos biodegradables (metabolizables) y biocompatibles. Las gotitas de aceite en la emulsión generalmente tienen menos de 5 pm de diámetro, e idealmente tienen un diámetro inferior al micrómetro, logrando estos pequeños tamaños con un microfluidizador para proporcionar emulsiones estables. Se prefieren gotitas con un tamaño inferior a 220 nm, ya que pueden someterse a esterilización por filtración.

La emulsión puede comprender aceites tales como los de un animal (como el pescado) o una fuente vegetal. Las fuentes de aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nueces. El aceite de jojoba se puede usar por ejemplo obtenido del grano de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero también se puede usar el aceite de otros granos de cereales como el trigo, la avena, el centeno, el arroz, el teff, el triticale y similares. Los ésteres de glicerol de ácidos grasos de 6-10 carbonos y el 1,2-propanodiol, aunque no se producen de forma natural en los aceites de semillas, pueden prepararse por hidrólisis, separación y esterificación de los materiales adecuados a partir de los aceites de nueces y semillas. Las grasas y los aceites de la leche de mamíferos son metabolizables y, por lo tanto, pueden usarse en la práctica de esta divulgación. Los procedimientos de separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica. La mayoría de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado de bacalao, los aceites de hígado de tiburón y el aceite de ballena, como el espermaceti, ejemplifican varios de los aceites de pescado que se pueden usar en el presente documento. Un número de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El aceite de hígado de tiburón contiene un terpenoides insaturados ramificados conocido como escualeno, 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno, que es particularmente preferente en el presente documento. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también es un aceite preferente. Los aceites de pescado, incluidos el escualeno y el escualano, están fácilmente disponibles a partir de fuentes comerciales o pueden obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica. Otros aceites preferentes son los tocoferoles (véase a continuación). Se pueden usar mezclas de aceites.

Los tensioactivos se pueden clasificar por su 'HLB' (equilibrio hidrófilo/lipófilo). Los tensioactivos preferentes de la divulgación tienen un HLB de al menos 10, preferentemente al menos 15, y más preferentemente al menos 16. La divulgación se puede usar con tensioactivos que incluyen, pero sin limitación: los tensioactivos de los ésteres de polioxietileno sorbitán (comúnmente denominados Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (OE), óxido de propileno (OP) y/u óxido de butileno (OB), comercializados con el nombre comercial DOWFAX™, como los copolímeros de bloques lineales OE/OP; los octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos etoxi (oxi-1,2-etanodiílo) repetitivos, siendo octoxinol-9 (Triton X-100 o toctilfenoxipolietoxietanol) de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630 / NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); etoxilatos de nonilfenol, tales como la serie Tergitol™ NP; éteres grasos de polioxietileno procedentes de alcoholes laurilo, cetilo, estearilo y oleilo (conocidos como tensioactivos Brij), tales como éter monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como SPAN), como el trioleato de sorbitán (SPAN 85™) y monolaurato de sorbitán. Se prefieren los tensioactivos no iónicos. Los tensioactivos preferentes para incluir en la emulsión son TWEEN 80™ (monooleato de polioxietileno sorbitán), SPAN 85™ (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.

Se pueden usar mezclas de tensioactivos, por ejemplo, mezclas TWEEN 80™/SPAN 85™. También es adecuada una combinación de un éster de polioxietileno sorbitán, tal como monooleato de polioxietileno sorbitán (TWEEN 80™) y un octoxinol, tal como t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100). Otra combinación útil comprende laureth 9 más un éster de polioxietileno sorbitán y/o un octoxinol.

Las cantidades preferentes de tensioactivos (% en peso) son: ésteres de polioxietileno sorbitán (tales como TWEEN 80™) de 0,01 a 1 %, en particular aproximadamente 0,1 %; octil o nonilfenoxi polioxietanoles (como Triton X-100 u otros detergentes de la serie Triton) de 0,001 a 0,1 %, en particular 0,005 a 0,02 %; éteres de polioxietileno (tales como laureth 9) de 0,1 a 20 %, preferentemente 0,1 a 10 % y en particular 0,1 a 1 % o aproximadamente 0,5 %. Los adyuvantes de emulsión preferentes tienen un tamaño medio de gotitas de < 1 |jm, por ejemplo, < 750 nm, <500 nm, <400 nm, <300 nm, <250 nm, <220 nm, <200 nm, o menor. Estos tamaños de gotita pueden lograrse oportunamente mediante técnicas tales como microfluidización.

Los adyuvantes de emulsión de aceite en agua específicos útiles con la divulgación incluyen, pero sin limitación: • Una emulsión submicrónica de escualeno, TWEEN 80™ y SPAN 85™. La composición de la emulsión en volumen puede ser de aproximadamente 5 % de escualeno, aproximadamente 0,5 % de polisorbato 80 y aproximadamente 0,5 % de SPAN 85™. En términos de peso, estas relaciones se convierten en 4,3 % de escualeno, 0,5 % de polisorbato 80 y 0,48 % de SPAN 85™. Este adyuvante se conoce como 'MF59™' (10-11), como se describe con más detalle en el capítulo 10 de la ref. 12 y el capítulo 12 de la ref. 13. La emulsión MF59™ incluye ventajosamente iones de citrato, por ejemplo, tampón de citrato de sodio 10 mM.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y TWEEN 80™. La emulsión puede incluir solución salina tamponada con fosfato. También puede incluir SPAN 85™ (por ejemplo, al 1 %) y/o lecitina. Estas emulsiones pueden tener de 2 a 10 % de escualeno, de 2 a 10 % de tocoferol y de 0,3 a 3 % de TWEEN 80™, y la relación en peso de escualeno:tocoferol es preferentemente <1 ya que esto proporciona una emulsión más estable. El escualeno y TWEEN 80™ pueden estar presentes en una relación de volumen de aproximadamente 5:2. Una emulsión de este tipo se puede fabricar disolviendo TWEEN 80™ en PBS para obtener una solución al 2 %, luego mezclando 90 ml de esta solución con una mezcla de (5 g de DL-a-tocoferol y 5 ml de escualeno), luego microfluidizando la mezcla. La emulsión resultante puede tener gotitas de aceite submicrónico, por ejemplo, con un diámetro medio de entre 100 y 250 nm, preferentemente aproximadamente de 180 nm.

• Una emulsión de escualeno, un tocoferol y un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100). La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La emulsión puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión que comprende un polisorbato (por ejemplo, polisorbato 80), un detergente Triton (por ejemplo, Triton X-100) y un tocoferol (por ejemplo, un succinato de a-tocoferol). La emulsión puede incluir estos tres componentes en una relación de masa de aproximadamente 75:11:10 (por ejemplo, 750 jg/ml de polisorbato 80, 110 jg/ml de Triton X-100 y 100 jg/ml de succinato de a-tocoferol), y estas concentraciones deben incluir cualquier contribución de estos componentes a partir de antígenos. La emulsión también puede incluir escualeno. La emulsión también puede incluir un 3d-MPL (véase a continuación). La fase acuosa puede contener un tampón fosfato.

• Una emulsión de escualano, polisorbato 80 y poloxámero 401 ("PLURONIC™ L121"). La emulsión puede formularse en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4. Esta emulsión es un vehículo de entrega útil para los dipéptidos de muramilo, y se ha usado con treonil-MDP en el adyuvante "SAF-1" (14) (0,05-1 % Thr-MDP, 5 % de escualano, 2,5 % de PLURONIC™ L121) y 0,2 % de polisorbato 80). También se puede usar sin el Thr-MDP, como en el adyuvante "AF" (15) (5 % de escualano, 1,25 % de PLURONIC™ L121 y 0,2 % de polisorbato 80). Se prefiere la microfluidización.

• Una emulsión que comprende escualeno, un disolvente acuoso, un tensioactivo no iónico hidrofílico de éter alquílico de polioxietileno (por ejemplo, éter cetoestearílico de polioxietileno (12) y un tensoactivo no iónico hidrófobo (por ejemplo, un éster de sorbitán o éster de manida, como monoleato de sorbitán o SPAN 80 (TM)'). La emulsión es preferentemente termorreversible y/o tiene al menos el 90 % de las gotitas de aceite (en volumen) con un tamaño inferior a 200 nm (16). La emulsión también puede incluir uno o más de: alditol; un agente crioprotector (por ejemplo, un azúcar, tal como dodecilmaltosido y/o sacarosa); y/o un alquilpoliglicósido. Dichas emulsiones pueden ser liofilizadas.

• Una emulsión de escualeno, poloxámero 105 y Abil-Care (17). La concentración final (peso) de estos componentes en las vacunas adyuvadas es 5 % de escualeno, 4 % de poloxámero 105 (poliol plurónico) y 2 % de Abil-Care 85 (Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 dimeticona; triglicérido caprílico/cáprico).

• Una emulsión que tiene de 0,5-50 % de un aceite, de 0,1 a 10 % de un fosfolípido y de 0,05 a 5 % de un tensioactivo no iónico. Como se describe en la referencia 18, los componentes de fosfolípidos preferentes son fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, esfingomielina y cardiolipina. Los tamaños de gotita de submicrónicos son ventajosos.

• Una emulsión submicrónica de aceite en agua de un aceite no metabolizable (como el aceite mineral ligero) y al menos un tensioactivo (como la lecitina, TWEEN 80 (TM) o SPAN 80 (TM)). Se pueden incluir aditivos, tales como QuilA saponina, colesterol, un conjugado saponina-lipófilo (como GPI-0100, descrito en la referencia 19, producido por la adición de amina alifática a la desacilsaponina a través del grupo carboxilo del ácido glucurónico), bromuro de dimetidiocitadecilaminio y/o N,N-dioctadecil-N,N-bis(2-hidroxietil)propanodiamina. • Una emulsión en la que una saponina (por ejemplo, QuilA o QS21) y un esterol (por ejemplo, un colesterol) se asocian como micelas helicoidales (20).

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado lipofílico no iónico y un tensioactivo hidrofílico no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) (21).

• Una emulsión que comprende un aceite mineral, un alcohol graso etoxilado hidrofílico no iónico y un tensiaoctivo lipófilo no iónico (por ejemplo, un alcohol graso etoxilado y/o copolímero de bloque de polioxietilenopolioxipropileno) (21).

En algunas realizaciones, una emulsión se puede mezclar con el antígeno de manera extemporánea, en el momento de la entrega, y por lo tanto, el adyuvante y el antígeno se pueden mantener por separado en una vacuna embalada o distribuida, lista para la formulación final en el momento de su uso. En otras realizaciones, una emulsión se mezcla con antígeno durante la fabricación y, por lo tanto, la composición se embala en forma líquida adyuvada. El antígeno generalmente estará en una forma acuosa, de modo que la vacuna se prepare finalmente mezclando dos líquidos. La relación de volumen de los dos líquidos para mezclar puede variar (por ejemplo, entre 5:1 y 1:5) pero generalmente es de aproximadamente 1:1. Cuando se dan concentraciones de componentes en las descripciones anteriores de emulsiones específicas, estas concentraciones son típicamente para una composición no diluida, y la concentración después de la mezcla con una solución de antígeno disminuirá de este modo.

Cuando una composición incluye un tocoferol, se puede usar cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 6, £ o ,^ pero se prefieren los a-tocoferoles. El tocoferol puede tomar varias formas, por ejemplo, diferentes sales y/o isómeros. Las sales incluyen sales orgánicas, tales como succinato, acetato, nicotinato, etc. Se pueden usar tanto D-a-tocoferol como DL-a-tocoferol. Los tocoferoles se incluyen ventajosamente en vacunas para su uso en pacientes ancianos (por ejemplo, de 60 años o más) porque se ha informado que la vitamina E tiene un efecto positivo en la respuesta inmunitaria en este grupo de pacientes (22). También tienen propiedades antioxidantes que pueden ayudar a estabilizar las emulsiones (23). Un a-tocoferol preferente es DL-a-tocoferol, y la sal preferente de este tocoferol es el succinato. Se ha descubierto que la sal de succinato coopera con ligandos relacionados con TNF in vivo.

C. Formulaciones de saponina (capítulo 22 de la referencia 5)

Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la divulgación. Las saponinas son un grupo heterogéneo de glicósidos de esterol y glicósidos triterpenoides que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso las flores de una amplia gama de especies de plantas. La saponina de la corteza del árbol de Quillaia saponaria Molina se ha estudiado ampliamente como adyuvantes. La saponina también se puede obtener en el mercado de Smilax ornata (sarsaprilla), Gypsophilla paniculata (velo de novias) y Saponaria officianalis (raíz de jabón). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípidos, tales como ISCOM. QS21 se comercializa como Stimulon™.

Las composiciones de saponina se han purificado usando HPLC y RP-HPLC. Las fracciones purificadas específicas que usan estas técnicas han sido identificadas, incluyendo QS7, QS17, QS18, QS21, Qh-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. Un procedimiento de producción de QS21 se desvela en la ref. 24. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, como el colesterol (25).

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para formar partículas distintas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (capítulo 23 de la ref. 5). Los ISCOM también incluyen típicamente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Cualquier saponina conocida puede usarse en ISCOM. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen con más detalle en las ref. 25-26. Opcionalmente, el ISCOM puede carecer de detergente adicional (27).

Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina se puede encontrar en las refs. 28 y 29.

D. Virosomas y partículas similares a virus

Los virosomas y partículas similares a virus (VLP) también se pueden usar como adyuvantes en la divulgación. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Generalmente no son patógenos, no se replican y generalmente no contienen ninguno del genoma viral nativo. Las proteínas virales pueden producirse de forma recombinante o aislarse de virus completos. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas procedentes del virus de la influenza (como HA o NA), virus de la hepatitis B (como las proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E. virus del sarampión, virus de Sindbis, rotavirus, y virus de la enfermedad del pie y de la boca, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos Qp (como las proteínas de la cubierta), fagos de GA, fagos fr, fagos AP205 y Ty (como la proteína Ty de retrotransposón p1). Las VLP se analizan más a fondo en las refs. 30-31. Los virosomas se analizan más a fondo, por ejemplo, en la ref. 32

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la divulgación incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacáridos (LPS) enterobacterianos, derivados de lípidos A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ADP-ribosilación y derivados desintoxicados de los mismos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen lípido A monofosforilado (MPL) y MPL 3 des-O-acilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla del lípido A monofosforilado 3 des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferente del lípido A monofosforilado 3 des-O-acilado se describe en la ref. 33. Dichas "pequeñas partículas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 |jm (33). Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen imitadores de lípidos A monofosforilados, como los derivados de aminoalquil glucosaminida fosfato, por ejemplo, RC-529 (34,35).

Los derivados de lípidos A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en las refs. 36 y 37.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia de dinucleótidos que contiene una citosina no metilada unida por un enlace fosfato a una guanosina). También se ha demostrado que los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 38, 39 y 40 desvelan posibles sustituciones análogas, por ejemplo, reemplazo de guanosina con 2'-deoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza con más detalle en las refs. 41-42.

La secuencia CpG puede dirigirse a TLR9, como el motivo GTCGTT o TTCGTT (43). La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmunitaria Th1, tal como una ODN CpG-A, o puede ser más específica para inducir una respuesta de linfocitos B, tal como una ODN CpG-B. Los ODN de CpG-A y CpG-B se analizan en las refs. 44-45. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótidos CpG pueden unirse en sus extremos 3' para formar "inmunómeros". Véase, por ejemplo, las refs. 43 y 46-47.

Un adyuvante CpG útil es CpG7909, también conocido como ProMune™ (Coley Pharmaceutical Group, Inc.). Otro es CpGl826. Como alternativa, o además del uso de secuencias CpG, pueden usarse secuencias TpG (48), y estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. El oligonucleótido inmunoestimulante puede ser rico en pirimidina. Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de timidina consecutivo (por ejemplo, TTTT, como se desvela en la ref. 48), y/o puede tener una composición de nucleótidos con > 25 % de timidina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Por ejemplo, puede comprender más de un nucleótido de citosina consecutivo (por ejemplo, CCCC, como se desvela en la ref. 48), y/o puede tener una composición de nucleótidos con> 25 % de citosina (por ejemplo, > 35 %, > 40 %, > 50 %, > 60 %, > 80 %, etc.). Estos oligonucleótidos pueden estar libres de motivos CpG no metilados. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes típicamente comprenderán al menos 20 nucleótidos. Pueden comprender menos de 100 nucleótidos.

Un adyuvante particularmente útil basado en oligonucleótidos inmunoestimulantes se conoce como IC-31™ (49). Por lo tanto, un adyuvante usado con la divulgación puede comprender una mezcla de (i) un oligonucleótido (por ejemplo, entre 15-40 nucleótidos) que incluye al menos uno (y preferentemente múltiples) motivos Cpl (es decir, una citosina unida a una inosina para formar un dinucleótido), y (ii) un polímero policatiónico, como un oligopéptido (por ejemplo, entre 5-20 aminoácidos) que incluye al menos una (y preferentemente múltiples) secuencia(s) de tripéptido Lys-Arg-Lys. El oligonucleótido puede ser un desoxinucleótido que comprende la secuencia 26-mer 5'-(IC)i3-3' (SEQ iD NO:51). El polímero policatiónico puede ser un péptido que comprende la secuencia de aminoácidos 11-mer KLKLLLLLKLK (SEQ ID NO:52).

Las toxinas ribosilantes de ADP bacteriana y sus derivados desintoxicados se pueden usar como adyuvantes en la divulgación. Preferentemente, la proteína se obtiene de E. coli (E. coli enterotoxina lábil al calor "LT"), cólera ("CT") o tos ferina ("PT"). El uso de toxinas ribosilantes de ADP desintoxicadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 50 y como adyuvantes parenterales en la ref. 51. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación desintoxicante; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante LT desintoxicado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso de toxinas ribosilantes de ADP y sus derivados desintoxicados, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes, se puede encontrar en las refs. 52-53. Un mutante de CT útil es CT-E29H (54). La referencia numérica para las sustituciones de aminoácidos se basa preferentemente en las alineaciones de las subunidades A y B de las toxinas ribosilantes de ADP expuestas en la ref. 55, específicamente incorporadas por referencia en su totalidad únicamente con el fin de la alineación y la numeración de aminoácidos en la misma.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen citocinas, tales como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (56), etc.) (57), interferones (por ejemplo, interferón-Y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral. Un inmunomodulador preferente es IL-12.

G. Bioahdesivos y mucoadhesivos

Los bioadhesivos y mucoadhesivos también pueden usarse como adyuvantes en la divulgación. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado (58) o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), poli(alcohol vinílico), polivinilpirolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosán y sus derivados también se pueden usar como adyuvantes en la divulgación (59).

H. Micropartículas

Las micropartículas también pueden usarse como adyuvantes en la divulgación. Las micropartículas (es decir, una partícula de DlOOnm a Dl50^m de diámetro, más preferentemente de 200nm a D30^m de diámetro, y lo más preferentemente de ~500nm a ~10^m de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicolida) son preferentes, se tratan opcionalmente para tener una superficie cargada negativamente (por ejemplo, con SDS) o una superficie cargada positivamente (por ejemplo, con un detergente catiónico, como el CTAB).

I. Liposomas (capítulos 13 y 14 de la ref. 5)

Ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes se describen en las refs. 60-61. J. Formulaciones de éter de polioxietileno y éster de polioxietileno

Los adyuvantes adecuados para su uso en la divulgación incluyen éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno (62). Dichas formulaciones incluyen además tensioactivos de éster de polioxietileno sorbitán en combinación con un octoxinol (63), así como éteres alquílicos de polioxietileno o tensioactivos de éster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional tal como un octoxinol (64). Los éteres de polioxietileno preferentes se seleccionan de entre el siguiente grupo: polioxietileno-9-lauril éter (laureth 9), polioxietileno-9-esteoril éter, polioxietileno-8-esteoril éter, polioxietileno-4-lauril éter, polioxietileno-35-lauril éter, y polioxietileno-23-lauril éter.

K. Fosfacenos

Se puede usar un fosfaceno, tal como poli(di(carboxilatofenoxi)fosfaceno) ("PCPP") como se describe, por ejemplo, en las referencias 65 y 66.

L. Péptidos muramilos

Ejemplos de péptidos muramilos adecuados para su uso como adyuvantes en la divulgación incluyen N-acetilmuramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (no m DP), y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE). M. Compuestos de imidazoquinolona.

Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para usar adyuvantes en la divulgación incluyen Imiquimod ("R-837") (67,68), Resiquimod ("R-848") (69) y sus análogos; y sales de los mismos (por ejemplo, las sales de clorhidrato). Se pueden encontrar más detalles sobre las imidazoquinolinas inmunoestimulantes en las referencias 70 a 71.

N. Ureas sustituidas

Las ureas sustituidas útiles como adyuvantes incluyen compuestos de fórmula I, II o III, o sales de los mismos: como se define en la referencia 72, como 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', ER 803022 o 'ER 804057' por ejemplo:

O. Adyuvantes adicionales

Otros adyuvantes que pueden usarse con la divulgación incluyen:

• Un derivado de aminoalquil glucosaminida fosfato, como RC-529 (73,74).

• Un compuesto de tiosemicarbazona, como los desvelados en la referencia 75. Los procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos activos también se describen en la referencia 75. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

• Un compuesto de triptantrina, como los desvelados en la referencia 76. Los procedimientos de formulación, fabricación y selección de compuestos activos también se describen en la referencia 76. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares humanas de sangre periférica para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

• Un análogo de nucleósido, como: (a) isatorabina (ANA-245; 7-tia-8-oxoguanosina):

y profármacos de las mismas; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) los compuestos desvelados en las referencias 77 a 78 Loxoribina (7-alil-8-oxoguanosina) (79).

• Los compuestos desvelados en la referencia 80, que incluyen: compuestos de acilpiperazina, compuestos de indolediona, compuestos de tetrahidraisoquinolina (THIQ), compuestos de benzociclodiona, compuestos de aminoazavinilo, compuestos de aminobenzimidazol quinolinona (ABIQ) (81, 82), compuestos de hidraftalamida, compuestos de benzofenona, compuestos de isoxazol, compuestos de esterol, compuestos de quinazilinona, compuestos de pirrol (83), compuestos de antraquinona, compuestos de quinoxalina, compuestos de triazina, compuestos de pirazalopirimidina y compuestos de benzazol (84).

• Los compuestos que contienen lípidos unidos a una estructura acíclica que contiene fosfato, como el antagonista de TLR4 E5564 (85, 86):

• Un polímero de polioxidonio (87, 88) u otro derivado de polietileno-piperazina N-oxidado.

• Metilinosina 5'-monofosfato ("MIMP") (89).

• Un compuesto de pirrolizidina polihidroxilado (90), tal como uno que tiene la fórmula:

en la que R se selecciona de entre el grupo que comprende hidrógeno, acilo lineal o ramificado, no sustituido o sustituido, saturado o insaturado, alquilo (por ejemplo, cicloalquilo), alquenilo, alquinilo y grupos arilo, o una sal o derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos. Ejemplos incluyen, pero sin limitación: casuarina, casuarina-6-a-D-glucopiranosa, 3-epi-casuarina, 7- epi-casuarina, 3,7-diepi -casuarina, etc.

• Un ligando CD1d, como una a-glicosilceramida (91-92) ( por ejemplo, a-galactosilceramida), fitoesfingosina que contiene a-glicosilceramidas, OCH, KRN7000 ((2S, 3S, 4R)-1-O-(a-D-galactopiranosil)-2-(N-hexacosanoilamino)-1,3,4-octadecanetriol), CRONY-101, 3"-O-sulfo-galactosilceramida, etc.

• Una inulina gamma (93) o un derivado de la misma, tal como algamulina.

Combinaciones de adyuvantes

La divulgación también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes se pueden usar en la divulgación: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua (94); (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) (95); (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) (96); (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (97); (6) SAF, que contiene un 10 % de escualano, un 0,4 % de TWEEN 80™, un 5 % de PLURONIC™ (TM)-polímero de bloque L121 y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión submicrónica o con agitado con formación de vórtice para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula. (7) Sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene 2 % de escualeno, 0,2 % TWEEN 80 (TM), y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de la ref. 5.

El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio es particularmente preferente, y los antígenos generalmente se adsorben en estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferente. Otras combinaciones de adyuvantes preferentes incluyen combinaciones de adyuvantes Th1 y Th2 tales como CpG y alumbre o resiquimod y alumbre. Se puede usar una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL.

Las composiciones de la divulgación pueden provocar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria preferentemente inducirá anticuerpos de larga duración (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente ante la exposición al patógeno inmunizado.

En general, se cree que dos tipos de linfocitos T, células CD4 y CD8, son necesarias para iniciar y/o mejorar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Las células T CD8 pueden expresar un co-receptor de CD8 y se conocen comúnmente como linfocitos T citotóxicos (CTL). Las células T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos mostrados en moléculas MHC de clase I.

Las células T CD4 pueden expresar un co-receptor de CD4 y se conocen comúnmente como linfocitos T auxiliares. Las células T CD4 son capaces de reconocer péptidos antigénicos unidos a moléculas MHC de clase II. Tras la interacción con una molécula MHC de clase II, las células CD4 pueden secretar factores como las citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T auxiliares o las células CD4+ se pueden dividir adicionalmente en dos subgrupos funcionalmente diferentes: fenotipo TH1 y fenotipos TH2 que difieren en su función de citocina y efector. Las células TH1 activadas mejoran la inmunidad celular (incluido un aumento en la producción de CTL específicos de antígeno) y, por lo tanto, son de particular valor para responder a las infecciones intracelulares. Las células TH1 activadas pueden segregar uno o más de IL-2, IFN-y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales al activar macrófagos, células NK (asesinas naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (CTL). Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar para expandir la respuesta inmunitaria al estimular el crecimiento de los linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados con TH1 pueden segregar IgG2a.

Las células TH2 activadas aumentan la producción de anticuerpos y, por lo tanto, son valiosas para responder a las infecciones extracelulares. Las células TH2 activadas pueden segregar uno o más de IL-4, IL-5, IL-6 y IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para una futura protección.

Una respuesta inmunitaria mejorada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria TH1 mejorada y una respuesta inmunitaria TH2.

Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento en los CTL, un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (como IL-2, IFN-^yy TNF-p), un aumento en macrófagos activados, un aumento en la actividad NK, o un aumento en la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH1 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.

Se puede provocar una respuesta inmunitaria TH1 usando un adyuvante TH1. Un adyuvante TH1 generalmente provocará niveles aumentados de producción de IgG2a en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes TH1 adecuados para su uso en la divulgación pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similares a virus, derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como los oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son adyuvantes TH1 preferentes para su uso en la divulgación.

Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un aumento en una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), o un aumento en la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH2 mejorada incluirá un aumento en la producción de IgG1.

Se puede provocar una respuesta inmunitaria TH2 usando un adyuvante TH2. Un adyuvante TH2 generalmente provocará niveles aumentados de producción de IgG1 en relación con la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes TH2 adecuados para su uso en la divulgación incluyen, por ejemplo, las composiciones que contienen minerales, las emulsiones de aceite y toxinas ADP-ribosilación y los derivados desintoxicados de los mismos. Las composiciones que contienen minerales, como las sales de aluminio son adyuvantes TH2 preferentes para su uso en la divulgación.

Preferentemente, la divulgación incluye una composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y un adyuvante TH2. Preferentemente, dicha composición provoca una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada, es decir, un aumento en la producción tanto de la producción de IgG1 como de IgG2a en relación con la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante TH1 y TH2 provoca un aumento de las respuestas inmunitarias TH1 y/o un aumento de las respuestas inmunitarias TH2 en relación con la inmunización con un solo adyuvante (es decir, en relación con la inmunización con un adyuvante de TH1 solo o a la inmunización con un adyuvante TH2 solo).

La respuesta inmunitaria puede ser uno o ambos de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona uno o ambos de una respuesta TH1 mejorada y una respuesta TH2 mejorada.

La respuesta inmunitaria mejorada puede ser uno o ambos de una respuesta inmunitaria sistémica y de mucosa. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona uno o ambos de una respuesta inmunitaria sistémica mejorada y una respuesta inmunitaria mejorada de la mucosa. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de la mucosa es una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria de la mucosa incluye un aumento en la producción de IgA.

Composiciones farmacéuticas

Un aspecto de la divulgación incluye composiciones farmacéuticas que comprenden (a) un conjugado de polisacárido como se desvela en el presente documento, (b) un portador farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente (c) un adyuvante como se describe en la sección anterior.

Las composiciones de la divulgación se pueden preparar en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición congelada por pulverización). La composición puede prepararse para la administración tópica, por ejemplo, como una pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como una pulverización o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio o pesario. La composición puede prepararse para la administración nasal, auditiva u ocular, por ejemplo, en forma de gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñada de tal manera que una composición combinada se reconstituya justo antes de la administración a un paciente. Dichos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Cuando una composición se ha de preparar de manera extemporánea antes de su uso (por ejemplo, cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa precargada y un vial, con el contenido de la jeringa que se usa para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de antígeno(s) (por ejemplo, el polisacárido y/o la proteína portadora), así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es efectiva para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y la condición física del individuo que se va a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un intervalo relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas habituales. Procedimientos de tratamiento y administración de la vacuna

La divulgación también proporciona un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad efectiva de una composición de la divulgación. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferentemente involucra anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

La divulgación también proporciona un polipéptido de la divulgación para su uso como un medicamento, por ejemplo, para su uso en la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La divulgación también proporciona el uso de un polipéptido de la divulgación en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero.

La divulgación también proporciona un dispositivo de entrega precargado con una composición inmunogénica de la divulgación.

Debido a que los glucanos (y los p-glucanos en particular) son un componente polisacárido esencial y principal de casi todos los hongos patógenos, particularmente aquellos involucrados en infecciones en sujetos inmunocomprometidos, y también en patógenos bacterianos y protozoos, la inmunidad anti-glucano puede tener eficacia contra un amplio intervalo de patógenos y enfermedades. Por ejemplo, el suero anti-glucano producido después de la inmunización con S. cerevisiae es reactivo cruzado con C. albicans. La inmunidad de amplio espectro es particularmente útil porque, para estos agentes fúngicos infecciosos humanos, la quimioterapia es escasa, la resistencia a los fármacos antifúngicos está apareciendo y la necesidad de vacunas preventivas y terapéuticas es cada vez más reconocida.

Por lo tanto, cuando el inmunógeno polisacárido de los conjugados de polisacárido desvelados en el presente documento son glucanos, los usos y procedimientos de los conjugados de polisacárido de glucano desvelados en el presente documento son particularmente útiles para tratar/proteger contra infecciones de: especies de candida, como C. albicans; especies de criptococos, como C. neoformans; especies de enterococos, como E. faecalis; especies de estreptococos, como S. pneumoniae, S. mutans, S. agalactiae y S. pyogenes; especies de leishmania, como L. major; especies de acanthamoeba, como A. castellani; especies de aspergillus, como A. fumigatus y A. flavus; especies de pneumocistis, como P. carinii; especies de micobacterias, como M. tuberculosis; especies de pseudomonas, como P. aeruginosa; Especies de estafilococos, como S. aureus; especies de salmonella, como S. typhimurium; especies de coccidioides como C. immitis; especies de tricofiton tales como T. verrucosum; especies de blastomices tales como B. dermatidis; especies dehistoplasmas tales como H. capsulatum; especies paracocidioides tales como P. brasiliensis; especies pitio tales como P. insidiosum; y especies de escherichia, como E. coli.

Los usos y procedimientos son particularmente útiles para evitar/tratar enfermedades que incluyen, pero sin limitación: candidiasis (incluyendo candidiasis hepatosplénica, candidiasis invasiva, candidiasis mucocutánea crónica y candidiasis diseminada); candidemia; aspergilosis, criptococosis, dermatomicosis, esporotirosis y otras micosis subcutáneas, blastomicosis, histoplasmosis, coccidiomicosis, paracoccidiomicosis, neumocistosis, afta, tuberculosis, micobacteriosis, infecciones respiratorias, fiebre escarlata, neumonía, impétigo, fiebre reumática, sepsis, septicemia, leishmaniasis cutánea y visceral, acantamebiasis de la córnea, fibrosis quística, fiebre tifoidea, gastroenteritis y síndrome hemolítico urémico. La actividad anti-C. albicans es particularmente útil para tratar infecciones en pacientes con SIDA.

La eficacia de la inmunización se puede probar controlando las respuestas inmunitarias contra el p-glucano (por ejemplo, anticuerpos anti-p-glucano) después de la administración de la composición. La eficacia del tratamiento terapéutico puede probarse controlando la infección microbiana después de la administración de la composición de la divulgación.

Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero puede protegerse contra la infección por el patógeno del cual se obtiene (o imita) el inmunógeno polisacárido, así como de la infección por E. coli debido a la proteína portadora de E. coli, incluidas las cepas ExPEC y no ExPEC. La divulgación es particularmente útil para proporcionar una amplia protección contra E. coli patógena, incluyendo patotipos intestinales como los patotipos EPEC, EAEC, EIEC, ETEC y DAEC. Por lo tanto, el mamífero puede estar protegido contra enfermedades que incluyen, pero sin limitación, peritonitis, pielonefritis, cistitis, endocarditis, prostatitis, infecciones del tracto urinario (ITU), meningitis (especialmente meningitis neonatal), sepsis (SIRS), deshidratación, neumonía, diarrea (infantil, de los viajeros, aguda, persistente, etc.), disentería bacilar, síndrome urémico hemolítico (SUH), pericarditis, bacteriuria, etc.

El mamífero es preferentemente un ser humano, pero puede ser, por ejemplo, una vaca, un cerdo, un gato o un perro, ya que la enfermedad por E. coli también es problemática en estas especies. Si bien la memoria descriptiva se refiere a mamíferos y sujetos mamíferos, los conjugados de polisacáridos desvelados en el presente documento también son útiles para especies aviares tales como pollos y patos y, por lo tanto, cuando se mencionan mamíferos o mamíferos en el presente documento, también se pueden incluir aves. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc.

Una forma de verificar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar la infección por E. coli después de la administración de las composiciones de la divulgación. Una forma de verificar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunitarias, sistémicamente (como controlar el nivel de producción de IgG1 e IgG2a) y/o mucosamente (como controlar el nivel de producción de IgA), contra los antígenos en las composiciones de la divulgación después de la administración de la composición. Típicamente, las respuestas de anticuerpos séricos específicos de antígeno se determinan después de la inmunización, pero antes del desafío mientras que las respuestas de anticuerpos de la mucosa específicas de antígeno se determinan después de la inmunización y después del desafío.

Otra forma de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente divulgación es expresar las proteínas de forma recombinante para seleccionar el suero del paciente o las secreciones de la mucosa mediante inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmunitaria a la proteína en cuestión. Este procedimiento también se puede usar para identificar antígenos y/o epítopos inmunodominantes dentro de los antígenos.

La eficacia de las composiciones de vacuna también puede determinarse in vivo desafiando modelos animales de infección por E. coli, por ejemplo, cobayas o ratones, con las composiciones de vacuna. Se describe un modelo murino de ExPEC y sepsis letal en la referencia 98. Se desvela un modelo de rata de algodón en la ref. 99.

Las composiciones de la divulgación generalmente se administrarán directamente a un paciente. La administración directa puede llevarse a cabo mediante inyección parenteral (por ejemplo por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, o al espacio intersticial de un tejido), o por vía mucosa, como la administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra mucosa. Las novedosas formas de entrega directa también pueden incluir la expresión transgénica de los polipéptidos desvelados en el presente documento en alimentos, por ejemplo, la expresión transgénica en una patata.

La divulgación puede usarse para provocar inmunidad sistémica y/o de mucosa, preferentemente para provocar una inmunidad sistémica y/o de mucosa potenciada.

Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o de mucosa mejorada se refleja en una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 mejorada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mejorada incluye un aumento en la producción de IgG1 y/o IgG2a y/o IgA.

La dosificación puede ser por un programa de dosis única o un programa de dosis múltiple. Se pueden usar dosis múltiples en un programa de inmunización primario y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples las diversas dosis pueden administrarse por la misma o diferentes vías, por ejemplo un refuerzo de mucosa y de inducción parenteral, un refuerzo parenteral y de inducción de la mucosa, etc. Las dosis múltiples se administrarán típicamente al menos con 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).

Las vacunas de la divulgación se pueden usar para tratar tanto a niños como a adultos. Por lo tanto, un paciente humano puede tener menos de 1 año, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años, o al menos 55 años. Los pacientes preferentes para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, > 50 años, >60 años, y preferentemente >65 años), los jóvenes (por ejemplo, < 5 años), los pacientes hospitalizados, los trabajadores de la salud, las fuerzas armadas y el personal militar, las mujeres embarazadas, los enfermos crónicos o los pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y se pueden usar de manera más general en una población.

Las vacunas de la divulgación son particularmente útiles para pacientes que esperan una operación quirúrgica u otros pacientes hospitalizados. También son útiles en pacientes que serán cateterizados. También son útiles en mujeres adolescentes (por ejemplo, de 11-18 años) y en pacientes con infecciones crónicas del tracto urinario. Las vacunas de la divulgación se pueden administrar a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta médica o visita a un profesional de la salud o centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna contra el sarampión, una vacuna contra las paperas, una vacuna contra la rubéola, una vacuna MMR, una vacuna contra varicela, una vacuna MMRV, una vacuna contra la difteria, una vacuna contra el tétanos, una vacuna contra la tos ferina, una vacuna contra la DTP, una vacuna conjugada contra el virus de la H. influenzae tipo B conjugado, una vacuna contra la polimielitis inactivada, una vacuna contra el virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada contra el meningococo (como la vacuna tetravalente AC-W135-Y), una vacuna contra el virus sincitial respiratorio, etc.

General

La práctica de la presente divulgación empleará, a menos que se indique de otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, las referencias 100-101, etc.

La expresión "que comprende" abarca "que incluye" así como "que consiste", por ejemplo, una composición que "comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x 10 %.

La numeración "IG" se usa en el presente documento. Un número IG, o "identificador de genInfo", es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por NCBI cuando las secuencias se añaden a sus bases de datos. El número IG no se parece al número de referencia del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para corrección, o para añadir más anotaciones o

información) entonces recibe un nuevo número IG. Por lo tanto, la secuencia asociada con un número IG dado nunca se cambia.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia pueden determinarse usando programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 102. Una alineación preferente está determinada por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización de apertura de huecos de 12 y una penalización de extensión de huecos de 2, matriz de BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la ref. 103.

Un experto en la técnica entenderá que "aislado" significa alterado "por la mano del hombre" de su estado natural, es decir, si se produce en la naturaleza, se ha cambiado o eliminado de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un organismo vivo no está "aislado" cuando, excepto el mismo polinucleótido o polipéptido separado de los materiales coexistentes de su estado natural está "aislado" en dicho organismo vivo, como se usa el término en esta divulgación. Además, se entendería que un polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo por transformación, manipulación genética o por cualquier otro procedimiento recombinante está "aislado" incluso si todavía está presente en dicho organismo, organismo que puede estar vivo o no, excepto cuando dicha transformación, manipulación genética u otro procedimiento recombinante produce un organismo que no se puede distinguir del organismo de origen natural.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 (A) muestra un SDS-Page (4-12 % de gradiente) con lo siguiente (de izquierda a derecha): (1) orf405B antes de la conjugación, (2) orf405B después de la conjugación, (3) upec-5211 antes de la conjugación, y (4) upec-5211 después de la conjugación; y (B) muestra una SDS-Page (gradiente de 4-12 %) con lo siguiente (de izquierda a derecha): marcadores de peso molecular, (1) upec-5211 antes de la conjugación, (2) upec-5211 después de la conjugación, (3) orf3526 antes de la conjugación, (4) orf3526 después de la conjugación, (5) orf1364 antes de la conjugación, y (6) orf1364 después de la conjugación.

La Figura 2 muestra los resultados del primer estudio de inmunización de proteínas portadoras. El eje y muestra la inducción de IgG anti-laminarina después de la inmunización medida por ELSA. El eje x muestra los resultados de ELISA para los siguientes conjugados (de izquierda a derecha): laminarina conjugada con CRM¹⁹⁷, laminaria conjugada con orf405B y laminaria conjugada con upec-5211.

La Figura 3 muestra los resultados del segundo estudio de inmunización de proteínas portadoras. El eje y muestra la inducción de IgG anti-laminarina después de la inmunización medida por ELSA. El eje x muestra los resultados de ELISA para los siguientes conjugados (de izquierda a derecha): laminarina conjugada con CRM¹⁹⁷, laminaria conjugada con orf3526 y laminaria conjugada con orf1364.

Breve descripción de la lista de secuencias

(continuación)

Ejemplos

Procedimiento de conjugación

Se compararon cinco proteínas recombinantes diferentes de diferentes cepas de E. coli patógenas extraintestinales por su capacidad para actuar como proteínas portadoras del inmunógeno polisacárido (usando laminarina como inmunógeno polisacárido ejemplar): orf3613 (SEQ ID NO: 46), upec-5211 (SEQ ID NO: 48), orf3526 (SEQ ID NO: 50), orf1364 (SEQ ID NO: 44) y orf405B (SEQ ID NO: 42). Orf3526 se usa de acuerdo con la invención.

El conjugado de orf3613 demostró ser insoluble, por lo que no se probó más. Después de la conjugación con laminarina, cada uno de los cuatro conjugados restantes se comparó con un conjugado laminaria-CRMw dado que CRM ¹⁹⁷está bien caracterizado por su uso como proteína portadora para inmunógenos de polisacáridos.

Estos conjugados se prepararon a partir de una solución adecuada de cada proteína y laminarina activada, preparados por el procedimiento descrito en Torosantucci y col. (2005) J. Exp. Med. 202(5):597-606. En resumen, antes de la conjugación, el sacárido se activó con un diéster de ácido adípico N-hidroxisuccinimida. A continuación, la reacción de conjugación para upec-5211 y orf405B se llevó a cabo en NaH2PO450 mM, NaCl 150 mM, guanidina HCl ⁶M a pH 7,6 usando una relación molar de grupos de éster de polisacárido a proteína de 30 y una concentración de proteína de 1,2-1,4 mg/ml. Los resultados de estas reacciones de conjugación se ejecutaron en un gradiente de SDS-Page (4-12 %) como se muestra en la Figura 1 (A).

En un conjunto separado de reacciones de conjugación, la reacción de conjugación para upec-5211 (nuevamente), orf3526 y orf1364 se llevó a cabo en PBS usando una relación molar de grupos de éster de polisacárido a proteína de 30 y una concentración de proteína de 5 mg/ml.

Las mezclas de reacción en cada una de las cinco reacciones se mezclaron a temperatura ambiente y se dejaron durante una noche.

Los conjugados resultantes se purificaron mediante cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC), un procedimiento de separación bien conocido para la purificación de proteínas (véase, por ejemplo, las refs. 1 y 2). La purificación se realizó con placas HIS MULTITRAP HP (TM) (GE Healthcare), placas de filtro de 96 pocillos rellenadas previamente para la purificación a pequeña escala de proteínas marcadas con histidina, con el uso de una fuente de vacío.

Las placas se rellenaron previamente con matriz de IMAC NI SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE (TM) (GE Healthcare), que consiste en perlas de 34 pm de agarosa altamente reticulada a las que se conjuga covalentemente los grupos de ácido iminodiacético. Los grupos de ácido minodiacético se cargaron con Ni2+ con el fin de proporcionar un grupo con afinidad por la proteína portadora con grupos de histidina expuestos en el conjugado. Los conjugados, preparados en solución como se describió anteriormente, se unieron a la matriz IMAC. La matriz de IMAC se lavó luego para eliminar el sacárido libre. Después del lavado, los conjugados purificados se eluyeron finalmente.

Purificación:

1. La matriz de la placa HIS MULTITRAP HP (TM) se lavó con 0,5 ml de agua destilada, y luego se equilibró dos veces con 0,5 ml de tampón de unión, que consiste en guanidina HCl 6 M, NaPO⁴20 mM, a pH 7,6).

2. Los conjugados (aproximadamente 200 pl/pocillo para 250 pg/pocillo de proteína) se cargaron en la placa y la placa se dejó en una plataforma oscilante durante 1 hora a temperatura ambiente para permitir que la proteína marcada con his se uniera a la matriz IMAC. La placa se lavó luego dos veces con 0,5 ml de tampón de unión para eliminar el sacárido libre de los conjugados unidos.

3. Los conjugados se recuperaron mediante la adición a la matriz de 0,2 ml de tampón de elución guanidina HCl 6 M, NaPO⁴20 mM, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM, a pH 7,6. La placa se incubó durante 10 minutos y se recogió el eluato que contenía los conjugados. Este procedimiento de elución se repitió una vez. Las dos fracciones de elución se combinaron y se dializaron frente a NaPO⁴10 mM pH 7,2 o NaPO⁴10 mM, NaCl 100 mM, a pH 7,2 o PBS con espectros por membrana, punto de corte de 6-8 kDa.

Los conjugados purificados de la divulgación se caracterizaron por SDS-Page 4-12 % (véase las Figuras 1 (A) y 1 (B)), por MicroBCA para cuantificar la cantidad de proteína, y por HPAEC-PAD para cuantificar la cantidad de sacárido. La Tabla 1 resume las eficiencias de conjugación determinadas por MicroBCA y HPAEC-PAD.

TABLA 1

Estudio de inmunización de proteínas portadoras-proteína de E. coli probada como portadora en conjugados de laminarina

Los ratones Balb/c a las 4-6 semanas de edad se inmunizaron en los días 0, 14 y 28 mediante inyección subcutánea con una dosis de 5 pg de inmunógeno de polisacárido en un volumen de inyección de 150 pl. Los ratones se sangraron los días 0, 27 y 42.

Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de seis ratones para el primer estudio de inmunización y ocho ratones para el segundo estudio de inmunización.

En el primer estudio de inmunización, los ratones fueron inyectados con laminarina conjugada con: upec-5211 (preparada a través del primer protocolo anterior), orf405B y (como un control positivo fuerte) CRM¹⁹⁷.

Los resultados muestran que upec-5211 como proteína portadora indujo una respuesta de anticuerpos aceptable contra la porción de polisacárido (aproximadamente dos tercios de la respuesta inducida por CRM¹⁹⁷), mientras que orf405B como proteína portadora no indujo respuesta de anticuerpo a la porción de polisacárido (véase la Figura 2). En el segundo estudio de inmunización, los ratones fueron inyectados con laminarina conjugada con: orf3526, orf1364 y (como un control positivo fuerte) CRM¹⁹⁷.

Los resultados muestran que orf3526 como proteína portadora indujo una fuerte respuesta de anticuerpos contra la porción de polisacárido (comparable o ligeramente mayor que la de CRM¹⁹⁷), mientras que orf1364 proporciona una respuesta más baja, pero aún aceptable (aproximadamente un tercio de la respuesta inducida por CRM¹⁹⁷) (véase la Figura 3).

Es especialmente notable que la capacidad de inducir una respuesta de anticuerpos a un conjugado de polisacárido no esté relacionada con la capacidad de la proteína transportadora para inducir una respuesta inmunitaria protectora contra sí misma. La Tabla 2 resume los experimentos previos usando fragmentos similares (o en el caso de upec-5211, orf1364 y orf405B, la misma secuencia exacta) de la misma proteína para inocular ratones mostró una respuesta muy diferente en el modelo de sepsis. Cada uno de upec-5211, orf1364 y orf405B proporcionó respuestas inmunitarias relativamente similares, mientras que cada uno proporciona grados de inducción de una respuesta inmunitaria muy diferentes a un polisacárido conjugado.

TABLA 2

Immunogenicidad: orf3526A, orf3526B y orf3526C

Para confirmar que los tres fragmentos preferentes descritos en la alineación anterior tenían sustancialmente la misma inmunogenicidad que la AcfD de longitud completa (orf3526), los fragmentos basados en la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 39 se purificaron. Los fragmentos purificados se usaron en experimentos de inmunización en ratones, adyuvados con adyuvante completo de Freund (orf3526A y orf3526B) o con alumbre (orf3526C). Los ratones inmunizados luego fueron desafiados con una dosis letal de E. coli. Los resultados del desafío se muestran en la Tabla 3 a continuación.

Por lo tanto, los fragmentos generan respuestas inmunitarias sustancialmente similares en ratones y, por lo tanto, se esperará que proporcionen una mejora sustancialmente similar de la respuesta inmunitaria a un polisacárido conjugado como el orf3526 de longitud completa.

Se entenderá que la divulgación se ha descrito únicamente a modo de ejemplo.

REFERENCIAS

[1] Documento WO2006/089264.

[2] Documento WO2006/091517.

[3] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453.

[4] Rice y col. (2000) Trends Genet 16:276-277.

[5] Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[6] Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O'Hagan.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un conjugado de polisacárido que comprende un inmunógeno de polisacárido conjugado con un polipéptido portador, en el que el polipéptido portador es la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526).

2. Un conjugado de polisacárido que comprende un inmunógeno de polisacárido conjugado con la proteína polipéptido portador precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), en el que el polipéptido portador comprende una mutación que reduce la toxicidad y/o una eliminación que mejora la purificación en comparación con la proteína precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526) de la SEQ ID NO:39; en el que (a) la mutación se selecciona de una eliminación de todo o una parte del dominio de la metaloproteasa de cincina y una mutación puntual en el dominio de metaloproteasa de cincina que reduce la actividad de la proteasa; o (b) el polipéptido portador no comprende al menos los últimos 100 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 125 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 150 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 175 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 200 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los últimos 210 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los últimos 217 aminoácidos C-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), y opcionalmente no comprende al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales de la proteína AcfD de E. coli (orf3526).

3. Un conjugado de polisacárido que comprende un inmunógeno de polisacárido conjugado con la proteína polipéptido portador precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), en el que el polipéptido portador comprende: (a) la secuencia de aminoácidos seleccionada de entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO:26-40.

4. Un conjugado de polisacárido que comprende un inmunógeno de polisacárido conjugado con la proteína polipéptido portador precursora AcfD de E. coli (polipéptido orf3526), en el que el polipéptido portador contiene además una eliminación relativa a la proteína AcfD de E. coli (orf3526) que aumenta la solubilidad del polipéptido portador en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526); en el que (a) la eliminación es la eliminación de sustancialmente todos los aminoácidos N-terminales hasta a la región gly-ser, la eliminación de todo o parte de la repetición rica en prolina N-terminal, o ambas; o (b) en el que la eliminación es la eliminación de al menos los primeros 10 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 20 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 30 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 33 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 40 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 50 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 60 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 70 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 80 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), al menos los primeros 90 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526), o al menos los primeros 94 aminoácidos N-terminales en comparación con la proteína AcfD de E. coli (orf3526).

5. El conjugado de polisacárido de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el polisacárido se selecciona de entre la lista que comprende:

(a) un glucano,

(b) un sacárido capsular de al menos uno de los serogrupos A, C, W135 e Y de Neisseria meningitidis,

(c) un antígeno sacárido de Streptococcus pneumoniae,

(d) un polisacárido capsular de Staphylococcus aureus,

(e) un polisacárido de Haemophilus influenzae B,

(f) un antígeno sacárido de Streptococcus aglactiae,

(g) un lipopolisacárido de Vibrio cholerae, o

(h) un polisacárido capsular de Salmonella typhi.

6. Un componente de vacuna que comprende el conjugado de polisacárido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.

7. Una vacuna que comprende el componente de vacuna de la reivindicación 6.

8. La vacuna de la reivindicación 7 que comprende además un componente de vacuna adicional seleccionado de entre: un antígeno de Neisseria meningitidis, un antígeno de Streptococcus pneumoniae, un antígeno de Streptococcus pyogenes, un antígeno de Moraxella catarrhalis, un antígeno de Bordetella pertussis, un antígeno de Staphylococcus aureus, un antígeno de Staphylococcus epidermis, un antígeno de Clostridium tetani, un antígeno de Cornynebacterium diphtheriae, un antígeno de Haemophilus influenzae tipo B (Hib), un antígeno de Pseudomonas aeruginosa, un antígeno de Legionella pneumophila, un antígeno de Streptococcus agalactiae, un antígeno de Neiserria gonorrhoeae, un antígeno de Chlamydia trachomatis, un antígeno de Treponema pallidum, un antígeno de Haemophilus ducreyi, un antígeno de Enterococcus faecalis, un antígeno de Enterococcus faecium, un antígeno de Helicobacter pylori, un antígeno de Staphylococcus saprophyticus, un antígeno de Yersinia enterocolitica, un antígeno de E. coli adicional, un antígeno de Bacillus anthracis, un antígeno de Yersinia pestis, un antígeno de Mycobacterium tuberculosis, un antígeno de Rickettsia, un antígeno de Listeria monocytogenes, un antígeno de Chlamydia pneumoniae, un antígeno de Vibrio cholerae, un antígeno de Salmonella typhi, un antígeno de Borrelia burgdorferi, un antígeno de Porphyromonas gingivalis, un antígeno de Shigella y un antígeno de Klebsiella.

9. El conjugado de polisacárido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el componente de vacuna de la reivindicación 6, o la vacuna de las reivindicaciones 7-8 para su uso en medicina.

10. El conjugado de polisacárido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el componente de vacuna de la reivindicación 6, o la vacuna de las reivindicaciones 7-8 para su uso en la inducción de una respuesta inmunitaria mejorada en un sujeto mamífero al polisacárido.

11. Uso del conjugado de polisacárido de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, el componente de vacuna de la reivindicación 6, o la vacuna de las reivindicaciones 7-8 para la fabricación de un medicamento de inducción de una respuesta inmunitaria mejorada en un sujeto mamífero al polisacárido.